ES2215324T3 - Mcp-2 amino-terminalmente truncadas como antagonistas de la quimioquina. - Google Patents
Mcp-2 amino-terminalmente truncadas como antagonistas de la quimioquina.Info
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Abstract
Proteína 2 quimiotáctica para monocitos (MCP- 2) humana amino-ter-minalmente truncada, que carece de los aminoácidos NH2-terminales que corresponden a los restos 1- 5 de aminoácido de la proteína 2 quimiotáctica para monocitos humana presente en la naturaleza, y que tiene actividad antagónica de quimioquinas.
Description
MCP-2
amino-terminalmente truncadas como antagonistas de
la quimioquina.
El presente invento se refiere a
MCP-2 amino-terminalmente truncada,
que carece de los aminoácidos NH_{2}-terminales
que corresponden a los restos 1-5 de aminoácido de
la MCP-2 presente en la naturaleza, y que tiene
actividad antagónica de quimioquinas, así como a secuencias de cDNA
que la codifican, su uso en la terapia y/o en el diagnóstico de las
enfermedades en que se requiere una actividad antagónica de los
efectos de quimioquinas, y composiciones farmacéuticas que la
comprenden.
Las quimioquinas constituyen una familia de
pequeñas citoquinas proinflamatorias con propiedades quimiotácticas
y activantes de leucocitos. Dependiendo de la posición de las
primeras cisteínas, la familia de las quimioquinas puede ser
dividida en quimioquinas C-C,
C-X-C y
C-X_{3}-C (M. Baggiolini et
al., 1.994; M. Baggiolini et al., 1.997; y D. Taub et
al., 1.996).
Muchas quimioquinas
C-X-C, tal como la interleuquina 8
(IL-8), son quimiotácticas para neutrófilos,
mientras que las quimioquinas C-C, tal como la
proteína 3 quimiotáctica para monocitos (MCP-3; del
inglés, monocyte chemotactic
protein-3), son activas sobre una diversidad
de leucocitos, incluyendo monocitos, linfocitos, eosinófilos,
basófilos, células NK y células dendríticas.
El dominio NH_{2}-terminal de
las quimioquinas está implicado en la unión a receptores, y un
procesamiento NH_{2}-terminal puede activar las
quimioquinas o volver completamente inactivas a las
quimioquinas.
La proteína básica de plaquetas, una quimioquina
C-X-C, se vuelve un péptido
quimiotáctico para neutrófilos (NAP-2; del inglés,
neutrophil activating-pepti-
de-2) sólo después de la escisión de los 24 restos
NH_{2}-terminales (A. Walz et al., 1.989; y
J. Van Damme et al., 1.990).
La supresión de hasta 8 restos
NH_{2}-terminales de IL-8 da lugar
a una actividad quimiotáctica potenciada, pero la escisión
adicional del motivo Glu-Leu-Arg,
que está situado delante de la primera Cys en todas las
quimioquinas C-X-C quimiotácticas
para neutrófilos, causa una inactivación completa (I.
Clark-Lewis et al., 1.991).
Una proteolisis NH_{2}-terminal
similar (hasta 8 aminoácidos) de otra quimioquina
C-X-C, la proteína 2 quimiotáctica
para granulocitos (GCP-2; del inglés,
granulocyte chemotactic
protein-2), no produce efecto alguno sobre
la actividad quimiotáctica sobre neutrófilos (P. Proost et
al., 1.993a).
Las quimioquinas C-C sintéticas
MCP-1, MCP-3 y RANTES que carecen de
los 8 a 9 aminoácidos NH_{2}-terminales son
inactivas sobre monocitos y son útiles como antagonistas de
receptores (J. Gong et al., 1.996; y J. Gong et al.,
1.995).
La prolongación de RANTES con una metionina da
lugar a una inactivación completa de la molécula, y
Met-RANTES actúa como un antagonista del RANTES
auténtico (A. E. Proudfoot et al., 1.996).
El clon de la proteína 2 quimioatrayente para
monocitos [MCP-2; del inglés, monocyte
chemoattractant protein-2 (fue llamada
inicialmente "HC14"; H. C. Chang et al., 1.989)] humana
ha sido aislado mediante la exploración diferencial de bancos con
sondas de cDNA procedentes de linfocitos de sangre periférica (PBL;
del inglés, peripheral blood lymphocytes)
estimulados frente a aquellos en reposo. La secuencia proteica
derivada del cDNA era idéntica a la de la MCP-2
natural purificada; sin embargo, también ha sido aislada una
supuesta variante alélica en que Gln 46 sustituye a Lys 46 (Van
Coillie et al., 1.997).
La MCP-2 ha sido también
sintetizada mediante química en fase sólida (P. Proost et
al., 1.995).
E. Van Coillie et al. (Genomics, volumen
40, páginas 323-331, 1.997) presentan la clonación
del gen de MCP-2 humano, el análisis de la
secuencia del mismo, su expresión tisular y la asignación al contig
del gen de las quimioquinas CC del cromosoma 17q11.2.
El objeto principal del presente invento es una
MCP-2
amino-terminal-mente truncada, que
carece de los aminoácidos NH_{2}-terminales que
corresponden a los restos 1-5 de aminoácido de la
MCP-2 presente en la naturaleza, y que tiene
actividad antagónica de quimioquinas.
Más particularmente, un objeto del presente
invento es MCP-2(6-76), que
es una MCP-2 que carece de los 1-5
aminoácidos NH_{2}-terminales, como se muestra en
la Figura 1 y en la ID. SEC. nº 3 o la ID. SEC. nº 4.
Dicha MCP-2
amino-terminalmente truncada del invento puede estar
en forma glicosilada o no glicosilada.
La expresión "antagonista de quimioquinas"
significa "que actúa como antagonista con respecto a las
quimioquinas maduras de longitud completa presentes en la
naturaleza".
Otro objeto del invento son las moléculas de DNA
que comprenden la secuencia de DNA que codifica la
MCP-2 amino-terminalmente truncada
del invento, incluyendo secuencias de nucleótidos sustancialmente
iguales.
"Secuencias de nucleótidos sustancialmente
iguales" incluye todas las demás secuencias de ácido nucleico
que, en virtud de la degeneración del código genético, también
codifican las secuencias de aminoácidos dadas.
El invento también incluye vectores de expresión
que comprenden los anteriores DNAs, células huésped transformadas
con dichos vectores, y un procedimiento para la preparación de
dicha MCP-2 amino-terminalmente
truncada del invento por medio del cultivo, en medios de cultivo
apropiados, de dichas células transformadas.
La secuencia de DNA que codifica la proteína del
invento puede ser insertada y ligada en un plásmido adecuado. Una
vez formado, el vector de expresión es introducido en una célula
huésped adecuada, la cual expresa entonces el(los)
vector(es) para producir la proteína deseada.
La expresión de la proteína recombinante del
invento, como aquí se menciona, puede ser efectuada en células
eucarióticas (por ejemplo, levaduras o células de insecto o
mamífero) o células procarióticas usando los vectores de expresión
apropiados. Puede emplearse cualquier método conocido en la
técnica.
Por ejemplo, las moléculas de DNA que codifican
la proteína obtenida mediante cualquiera de los métodos anteriores
son insertadas en vectores de expresión apropiadamente construidos,
mediante técnicas bien conocidas en este campo técnico (véase
Sambrook et al., 1.989). cDNA de doble cadena es enlazado a
vectores plasmídicos por adición de colas de homopolímeros o
mediante enlace de restricción que implica el uso de conectores de
DNA sintéticos o técnicas de ligación de extremos romos: se usan
DNA ligasas para ligar las moléculas de DNA y se evita la unión
indeseable por tratamiento con fosfatasa alcalina.
Con objeto de poder hacer que se exprese la
proteína deseada, un vector de expresión debería comprender también
secuencias de nucleótidos específicas que contuvieran información
reguladora de la transcripción y traducción enlazadas al DNA que
codifica la proteína deseada, de tal modo que permitieran la
expresión génica y la producción de la proteína. En primer lugar,
con objeto de que se transcriba el gen, debe ir precedido de un
promotor reconocible por RNA polimerasa al cual se une la
polimerasa, iniciándose de este modo el proceso de transcripción.
Hay una diversidad de tales promotores en uso que actúan con
diferentes eficacias (promotores fuertes y débiles).
Para huéspedes eucarióticos, pueden emplearse
diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y traducción
dependiendo de la naturaleza del huésped. Pueden proceder de
fuentes víricas, tales como adenovirus, virus del papiloma bovino,
virus de simios y similares, cuyas señales reguladoras están
asociadas con un gen concreto que presenta un elevado nivel de
expresión. Son ejemplos el promotor de TK del herpesvirus, el
promotor precoz del virus 40 de simios, el promotor del gen gal4 de
levadura, etc. Pueden seleccionarse señales reguladoras de la
iniciación de la transcripción que permitan la represión y la
activación, de modo que pueda modularse la expresión de los
genes.
La molécula de DNA que comprende la secuencia de
nucleótidos que codifica la proteína del invento es insertada en
un(os) vector(es) que tiene(n) las señales
reguladoras de la transcripción y traducción operativamente
enlazadas, que es(son) capaz(es) de integrar las
secuencias génicas deseadas en la célula huésped.
Las células que han sido establemente
transformadas por el DNA introducido pueden ser seleccionadas al
introducir además uno o más marcadores que permitan la selección de
las células huésped que contienen el vector de expresión. El
marcador puede también proporcionar fototrofismo a un huésped
auxotrofo, resistencia a biocidas, por ejemplo, a antibióticos, o
metales pesados tales como cobre, o similares. El gen del marcador
seleccionable puede ser directamente enlazado a las secuencias
génicas de DNA que se van a expresar o puede ser introducido en la
misma célula por cotransfección. Además, puede que sean necesarios
elementos adicionales para la síntesis óptima de proteínas del
invento.
Los factores importantes a la hora de seleccionar
un vector plasmídico o viral particular incluyen: la facilidad con
que las células receptoras que contienen el vector pueden ser
reconocidas y seleccionadas frente a aquellas células receptoras
que no contienen el vector, el número de copias del vector que se
desea en un huésped particular, y si es deseable poder
"transportar" el vector entre células huésped de especies
diferentes.
Una vez que el(los) vector(es) o la
secuencia de DNA que contiene(n) la(s)
construcción(es) se ha(n) preparado para expresión,
la(s) construcción(es) de DNA puede(n) ser
introducida(s) en una célula huésped apropiada mediante
cualquiera de diversos medios adecuados: transformación,
transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación,
precipitación con fosfato cálcico, microinyección directa, etc.
Las células huésped pueden ser procarióticas o
eucarióticas. Se prefieren huéspedes eucarióticos, tales como, por
ejemplo, células de mamífero tales como células de ser humano,
mono, ratón, y ovario de hámster chino (CHO; del inglés,
chinese hamster ovary), ya que proporcionan
modificaciones postraduccionales a moléculas proteicas, incluyendo
una plegadura correcta o glicosilación en sitios correctos. Además,
las células de levadura pueden llevar a cabo modificaciones
peptídicas postraduccionales, incluyendo glicosilación. Existen
diversas estrategias de DNA recombinante en que se utilizan
secuencias promotoras fuertes y elevado número de copias de
plásmidos que pueden utilizarse para la producción de las proteínas
deseadas en levadura. La levadura reconoce secuencias líder en
productos génicos de mamífero clonados y secreta péptidos que
llevan secuencias líder (es decir, prepéptidos).
Después de la introducción del(de los)
vector(es), las células huésped son cultivadas en un medio
selectivo que selecciona el crecimiento de las células que
contienen vector. La expresión de la(s) secuencia(s)
génica(s) clonada(s) da lugar a la producción de las
proteínas deseadas.
La MCP-2
amino-terminalmente truncada del invento puede ser
preparada mediante cualquier otro procedimiento bien conocido de la
técnica, en particular, mediante los procedimientos de síntesis
química bien establecidos, utilizando sintetizadores automatizados
de péptidos en fase sólida seguidos de purificación
cromatográfica.
La quimioquina del invento puede ser sintetizada,
por ejemplo, mediante Fmoc
(9-fluorenilmetoxicarbonilo), tBoc
(t-butoxicarbonilo) o cualquier otra síntesis
química comparable con o sin grupos para protección de cadenas
laterales apropiados sobre los diferentes aminoácidos. Los
aminoácidos con o sin grupos para protección de cadenas laterales
apropiados son preactivados, por ejemplo, con HBTU/HOBt
[hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,
3-tetrametiluronio/1-hidroxibenzotri-azol],
y son copulados con la cadena peptídica que se desarrolla. Antes
de la adición del resto siguiente, el grupo de protección (por
ejemplo, Fmoc) es separado del grupo \alpha-amino.
Después de la síntesis, todos los grupos de protección son
eliminados y los péptidos de longitud completa intactos son
purificados y son química o enzimáticamente plegados (incluyendo la
formación de puentes disulfuro entre cisteínas) hasta las
correspondientes quimioquinas del invento.
La purificación de las proteínas naturales,
sintéticas o recombinantes es llevada a cabo mediante cualquiera de
los métodos conocidos para este fin, es decir, cualquier
procedimiento convencional que implica extracción, precipitación,
cromatografía, electroforesis o similar (véase, por ejemplo, P.
Proost et al., 1.996). Un procedimiento de purificación más
que puede ser usado preferentemente para purificar la proteína del
invento es la cromatografía de afinidad usando anticuerpos
monoclonales, o afinidad por heparina, que se unen a la proteína
diana y que son producidos e inmovilizados sobre una matriz de gel
contenida en una columna. Las preparaciones impuras que contienen
las proteínas son hechas pasar a través de la columna. La proteína
se unirá a la columna por la heparina o por el anticuerpo
específico, mientras que las impurezas atravesarán la columna.
Después de un lavado, la proteína es eluida del gel mediante un
cambio de pH o de fuerza iónica.
La MCP-2
amino-terminalmente truncada del invento es útil en
la t terapia y/o diagnóstico de las enfermedades en que se requiere
una actividad antagónica de los efectos de quimioquinas. Los
ejemplos de tales enfermedades incluyen: enfermedades
inflamatorias, enfermedades relacionadas con angiogénesis y
hematopoyesis, tumores, enfermedades infecciosas, incluyendo por
VIH, enfermedades autoinmunes, aterosclerosis, enfermedades
pulmonares y trastornos cutáneos.
Por lo tanto, en un aspecto más, el presente
invento proporciona el uso de la proteína del invento en la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de las
enfermedades anteriormente mencionadas.
El medicamento se presenta preferiblemente en
forma de una composición farmacéutica que comprende las proteínas
del invento junto con uno o más vehículos y/o excipientes
farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones farmacéuticas
forman aún un aspecto más del presente invento.
Una cantidad farmacológicamente activa de la
MCP-2
amino-terminal-mente truncada del
invento es adecuada para el tratamiento de las enfermedades
anteriormente mencionadas cuando se administra a sujetos con riesgo
de desarrollar dichas enfermedades o a sujetos que ya muestran
dichas patologías.
El invento será ahora descrito por medio de los
ejemplos siguientes, los cuales no deben ser considerados en modo
alguno restrictivos del presente invento. Los ejemplos se referirán
a las figuras especificadas más adelante.
Figura 1: muestra la secuencia de aminoácidos de
MCP-2 y de su variante conocida. Las secuencias
señal se presentan en cursiva, mientras que los restos C están en
negrita. Las flechas indican los primeros aminoácidos de la
MCP-2(6-76)
amino-termi-nalmente truncada del
invento. Está subrayado el aminoácido que es diferente en la
variante de MCP-2.
Figura 2: electroforesis en gel de
poliacrilamida-dodecilsulfato sódico
(SDS-PAGE; del inglés, sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis), de la
MCP-2(6-76)
amino-terminalmente truncada:
carril 1: MCP-2 natural
(1-76, 100 ng/carril)
carril 2: MCP-2 natural
(1-76, 30 ng/carril)
carril 3: MCP-2 natural
(6-76, 30 ng/carril), y
carril 4: MCP-2 sintética
(1-76, 60 ng/carril).
Los geles fueron desarrollados bajo condiciones
reductoras, y las proteínas fueron teñidas con plata.
Figura 3: muestra una comparación de la potencia
quimiotáctica de formas modificadas de MCP-2. Se
analizaron MCP-2(1-76)
natural (nat) y sintética (syn) intactas,
MCP-2(6-76) natural
NH_{2}-terminalmente truncada y
MCP-2(1-74) sintética
COOH-ter-minalmente truncada, en
cuanto a su actividad quimiotáctica sobre células
THP-1. Los resultados representan el índice
quimiotáctico (CI; del inglés, chemotactic index)
medio \pm error estándar de la media, de cuatro o más
experimentos independientes.
Figura 4: la MCP-2 natural es un
agonista más débil que la MCP-1 en cuanto a
movilizar calcio en monocitos. La MCP-2 intacta (15,
50 y 150 ng/ml) aumenta la [Ca^{2+}]_{i} en células
THP-1 de un modo dependiente de la dosis. Se
muestra el resultado de un experimento representativo de dos.
La MCP-2 fue sintetizada y
purificada del modo previamente descrito (P. Proost et al.,
1.995).
Se obtuvieron anticuerpos (Ab; del inglés,
antibody) anti-MCP-2
humana específicos en ratones y se purificaron por afinidad en una
columna de Sepharose a la que se había copulado
MCP-2 sintética usando las condiciones
proporcionadas por el fabricante (Sepharose 4B activada con CNBr,
Pharmacia, Uppsala, Suecia).
Se revistieron placas para ensayos de
inmunosorción con enzimas ligadas (ELISA; del inglés,
enzyme-linked immunosorption assay) con
anti-MCP-2 humana purificado por
afinidad y se usó anti-MCP-2
biotinilado como Ab de captura. La detección se llevó a cabo con
estreptavidina marcada con peroxidasa, y
3,3',5,5'-tetrame-tilbencidina
(TMB). El límite de detección para el ELISA de
MCP-2 era aproximadamente 0,1 ng/ml.
Proteínas quimiotácticas para monocitos fueron
purificadas de un medio acondicionado derivado de células
mononucleares de sangre periférica, procedente de 132 donaciones
sanguíneas obtenidas de Centros de Transfusión de Sangre de Antwerp
y Leuven (P. Proost et al., 1.996).
Se separaron los eritrocitos y granulocitos por
sedimentación en
hidroxi-etil-almidón (Fresenius AG,
Bad
Homburg, Alemania) y por centrifugación en gradiente en una disolución de metrizoato sódico (Lymphoprep;
Nyegaard, Oslo, Noruega).
Homburg, Alemania) y por centrifugación en gradiente en una disolución de metrizoato sódico (Lymphoprep;
Nyegaard, Oslo, Noruega).
Se incubaron células mononucleares (60x10^{9}
células; 5x10^{6} células/ml) con 10 \mug/ml de concanavalina A
(Con A) y 2 \mug/ml de lipopolisacárido (LPS). Después de 48 a
120 horas, el medio acondicionado fue recogido y fue mantenido a
-20ºC hasta su purificación.
La MCP-2 natural fue purificada
mediante un procedimiento de purificación de cuatro operaciones,
del modo previamente descrito (P. Proost et al., 1.996).
En resumen, el medio acondicionado fue
concentrado sobre ácido silícico o vidrio con tamaño de poro
controlado y fue parcialmente purificado por cromatografía de
afinidad en una columna de heparina-Sepharose
(Pharmacia).
Las fracciones que contenían inmunorreactividad
relativa a MCP-2 fueron adicionalmente purificadas
por cromatografía de intercambio catiónico en una columna Mono S
(Pharmacia), eluyéndose con un gradiente de NaCl en un pH de
4,0.
La MCP-2 natural fue purificada
hasta homogeneidad por cromatografía líquida de alta eficacia en
fase inversa (RP-HPLC; del inglés, reverse
phase-high performance liquid
chromatography) usando una columna C-8
Aquapore RP-300 (Perkin Elmer, Norwalk, Connecticut,
EE.UU.) equilibrada con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%. Las
proteínas fueron eluidas con un gradiente de acetonitrilo.
La pureza de las fracciones de columna fue
examinada por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras
en geles de Tris/tricina (P. Proost et al., 1.996). Se
tiñeron las proteínas con plata y se usaron los siguientes
marcadores de masa molecular relativa (M_{r}): ovoalbúmina
(OVA; M_{r}: 45.000), anhidrasa carbónica (M_{r}:
31.000), inhibidor de tripsina, de soja (M_{r}: 21.500),
\beta-lactoglobulina (M_{r}: 18.400),
lisozima (M_{r}: 14.400) y aprotinina (M_{r}:
6.500).
La secuencia NH_{2}-terminal de
las quimioquinas purificadas fue determinada por degradación de
Edman en un secuenciador 477A/120A de proteínas por fase líquida
impulsada (Perkin Elmer), con N-metilpiperidina como
base de copulación. Las proteínas bloqueadas fueron escindidas
entre Asp y Pro en ácido fórmico al 75% durante 50 horas. El
producto de digestión en ácido fórmico fue secuenciado sin una
purificación ulterior.
La M_{r} de MCP-2 fue
determinada por espectrometría de masas con ionización/desorción
mediante láser asistida por matriz y analizador de tiempo de vuelo
(MALDI/TOF-MS; del inglés,
matrix-assisted laser desorption
ionization/time of flight-mass
spectrometry) (Micromass TofSpec, Manchester, Gran Bretaña).
Se utilizaron ácido
alfa-ciano-4-hidroxicinámico
y citocromo C como matriz y patrón interno, respectivamente.
Se analizó la MCP-2 en cuanto a
su potencia quimiotáctica sobre recién purificados monocitos
(2x10^{6} células/ml) o células monocíticas THP-1
(0,5x10^{6} células/ml; 2 días después de subcultivo) en la
microcámara de Boyden usando membranas de policarbonato tratado con
polivinilpirrolidona, con un tamaño de poro de 5 \mum.
Las muestras y las células fueron diluidas en
medio HBSS (Life Technologies/Gibco BRL, Paisley, Escocia, Gran
Bretaña) complementado con 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (Red
Cross Belgium). Después de 2 h de incubación a 37ºC, las células
fueron fijadas y teñidas con disoluciones
Diff-Quick para tinción (Harleco, Gibbstown, New
Jersey, EE.UU.), y las células que migraban a través de las
membranas fueron contadas microscópicamente en diez campos de
inmersión en aceite, con un aumento de 500 veces.
El índice quimiotáctico (CI) de una muestra
(triplicados de cada cámara) fue calculado como el número de
células que migraban a la muestra con respecto al número de células
que migraban al medio testigo (J. Van Damme et al.,
1.992).
Para experimentos de insensibilización, las
células fueron incubadas con variantes quimioquínicas
biológicamente inactivas durante 10 min a 37ºC, antes de que fueran
añadidas al pocillo superior de la microcámara de Boyden. El % de
inhibición del CI fue calculado usando el CI de células tratadas con
HBSS hacia la muestra como valor de referencia.
Se midieron concentraciones de calcio
intracelular ([Ca^{2+}]_{i}) del modo previamente
descrito (A. Wuyts et al., 1.997). Monocitos o células
THP-1 (10^{7} células/ml) purificados fueron
incubados en medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, Gibco) + suero
de ternera fetal (FCS; del inglés, fetal calf
serum) al 0,5% con el indicador fluorescente
fura-2 (fura-2/AM 2,5 \muM;
Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda) y Pluronic
F-127 (Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.) al
0,01%.
Después de 30 min a 37ºC, las células fueron
lavadas dos veces y fueron resuspendidas en HBSS con Ca^{2+} 1 mM
y FCS al 0,1% (tamponado con Hepes 10 mM/NaOH a un pH de 7,4) hasta
una concentración de 10^{6} células/ml. Las células fueron
equilibradas a 37ºC durante 10 min antes de que se midiera la
fluorescencia de fura-2 en un espectrofotómetro
LS50B de luminiscencia (Perkin Elmer).
Tras excitación a 340 y 380 nm, se detectó
fluorescencia a 510 nm. La [Ca^{2+}]_{i} fue calculada a
partir de la ecuación de Grynkiewicz (Grynkiewicz et al.,
1.985). Con objeto de determinar la R_{max}, las células
fueron lisadas con digitonina 50 \muM. Posteriormente, se ajustó
el pH a 8,5 con Tris 20 mM y se obtuvo la R_{min} por
adición de EGTA 10 mM a las células lisadas. La K_{d}
usada fue 224 nM.
Para experimentos de insensibilización, se
estimularon primero monocitos o células THP-1 con
tampón, quimioquina o antagonista de quimioquina en diferentes
concentraciones. Como segundo estímulo, se usó MCP-2
en una concentración que provocaba un aumento significativo de la
[Ca^{2+}]_{i} después de la preestimulación con tampón.
El segundo estímulo se aplicó 2 min después de la adición del
primer estímulo. El porcentaje de inhibición del aumento de
[Ca^{2+}]_{i} en respuesta al segundo estímulo fue
calculado comparando la señal después de la preestimulación con
quimioquina o antagonista de quimioquina, con la señal después de la
adición de tampón.
Se usó un ELISA específico y sensible para
localizar diferentes formas de MCP-2 producidas por
células mononucleares de sangre periférica estimuladas con mitógeno
y endotoxina.
El medio acondicionado fue purificado de acuerdo
con un procedimiento de aislamiento estándar (P. Proost et
al., 1.996), incluyendo adsorción por vidrio con tamaño de poro
controlado y cromatografía en
heparina-Sepharose.
Posteriormente, se llevó a cabo una purificación
mediante cromatografía de resolución rápida por intercambio
catiónico en una columna Mono S, y luego se aplicó una operación de
purificación más por RP-HPLC en una columna
C-8. Las masas moleculares se midieron mediante
SDS-PAGE y mediante
MALDI/TOF-MS.
Se aislaron diferentes formas de
MCP-2: además de la
MCP-2(1-76) auténtica de 7,5
kDa, una forma NH_{2}-terminalmente truncada de
MCP-2, de 7 kDa, que carecía de cinco restos
[MCP-2(6-76)] fue purificada
hasta homogeneidad mediante RP-HPLC y fue
identificada mediante el análisis de la secuencia de aminoácidos
(Figura 2). La MALDI/TOF-MS (Tabla I) proporcionó
una masa molecular de 8.881 Da para la MCP-2
intacta (M_{r} teórica de 8.893 Da), mientras que se midió
una masa molecular de 8.365 Da para la
MCP-2(6-76), lo que confirma
la deleción de los cinco aminoácidos
NH_{2}-terminales (M_{r} teórica de
8.384 Da). Una comparación funcional de estas formas naturales de
MCP-2 en el ensayo de quimiotaxis de
THP-1 mostró que la MCP-2 intacta es
todavía activa en una concentración de 5 ng/ml, mientras que la
MCP-2(6-76) truncada sigue
desprovista de actividad quimiotáctica cuando se prueba en un
intervalo de concentración de 0,6 a 60 ng/ml (Figura 3). La
MCP-2 natural intacta fue también comparada, en
cuanto a potencia, con la
MCP-2(1-76) sintética y una
forma sintética COOH-terminalmente truncada (P.
Proost et al., 1.995) que carece de dos restos
[MCP-2(1-74)].
También se halló que la concentración
quimiotáctica eficaz mínima de estas formas es 5 ng/ml (Figura 3).
Aunque, en ensayos de quimiotaxis, las actividades específicas de
las MCP-1 y MCP-2 naturales intactas
son comparables (J. Van Damme et al., 1.992), la capacidad
de MCP-2 para movilizar calcio es aún un asunto
controvertido.
Sin embargo, en experimentos de movilización de
Ca^{2+}, la dosis eficaz mínima de la
MCP-2(1-76) tanto natural
como sintética era 10 veces mayor que la de la
MCP-1(1-76) natural intacta
(Figura 4), mientras que la
MCP-2(6-76) permanecía
inactiva.
No obstante, la MCP-2 intacta (50
ng/ml) era capaz de insensibilizar para MCP-2 (15
ng/ml) y MCP-3 (10 ng/ml), produciendo una
inhibición de quimiotaxis de 52% y 45%, respectivamente.
A causa de esta menor actividad específica de
MCP-2 en los ensayos de Ca^{2+}, la
insensibilización de la quimiotaxis por
MCP-2(6-76) fue llevada a
cabo en la microcámara de Boyden. Puesto que se ha comunicado que la
MCP-2 intacta presenta insensibilización cruzada
con MCP-1, MCP-2 y
MCP-3 activas en el ensayo de quimiotaxis de
monocitos (S. Sozzani et al., 1.994), se investigó si la
MCP-2(6-76) natural e
inactiva podría insensibilizar también para MCP-1,
MCP-2, MCP-3 y RANTES (Tabla II). La
preincubación de células THP-1 con 100 ng/ml de
MCP-2(6-76) inactiva ya podía
inhibir significativamente la quimiotaxis provocada por 10 ng/ml de
MCP-1 (63%), 5 ng/ml de MCP-2 (75%),
30 ng/ml de MCP-3 (62%) y 100 ng/ml de RANTES
(75%). Además, la quimiotaxis en respuesta a concentraciones 3
veces menores de las respectivas MCPs fue completamente inhibida
(91-100%) por 100 ng/ml de
MCP-2(6-76). Además, en una
concentración tan pequeña como 10 ng/ml, la
MCP-2(6-76) todavía era capaz
de inhibir significativamente la actividad quimiotáctica provocada
por MCP-1 (3 ng/ml), MCP-2 (1,5
ng/ml) o MCP-3 (10 ng/ml) y RANTES (30 ng/ml).
Tomados los resultados en conjunto, la
MCP-2(6-76) es producida
naturalmente, es inactiva como agente quimioatrayente y actúa como
antagonista de varias quimioquinas C-C, siendo el
efecto muy predominante para MCP-3.
| Forma de MCP | Secuencia NH_{2}-terminal | M_{r} (Da) | ||
| teórica no glicosilada | SDS-PAGE | MALDI/TOF-MS | ||
| MCP-2(1-76) | bloqueada | 8.893 | 7.500 | 8.881 |
| MCP-2(6-76) | SIPITCC | 8.384 | 7.000 | 8.365 |
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Biochemistry, 36, 2.716-2.723,
1.997.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 14 JOHN B. GORSIRAWEG
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: CURACAO
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ANTILLAS HOLANDESAS
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: NINGUNO
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 639300
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 614129
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: MCP-2 AMINO-TERMINALMENTE TRUNCADAS COMO ANTAGONISTAS DE QUIMIOQUINAS
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con ordenador personal IBM
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn, licencia nº 1.0, versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 99 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- REPRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...76
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 99 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- REPRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Proteína
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1...76
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID. SEC. nº 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 71 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. SEC. nº 4:
Claims (11)
1. Proteína 2 quimiotáctica para monocitos
(MCP-2) humana
amino-ter-minalmente truncada, que
carece de los aminoácidos NH_{2}-terminales que
corresponden a los restos 1-5 de aminoácido de la
proteína 2 quimiotáctica para monocitos humana presente en la
naturaleza, y que tiene actividad antagónica de quimioquinas.
2. Una MCP-2
amino-terminalmente truncada de acuerdo con la
Reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID.
SEC. nº 3 o la ID. SEC. nº 4.
3. Una MCP-2
amino-terminalmente truncada de acuerdo con una o
más de las reivindicaciones precedentes, en una forma
glicosilada.
4. Moléculas de DNA que comprenden las secuencias
de DNA que codifican la MCP-2
amino-terminalmente truncada del invento de acuerdo
con una o más de las reivindicaciones precedentes, incluyendo
secuencias de nucleótidos sustancialmente iguales.
5. Un vector de expresión que comprende la
molécula de DNA de la Reivindicación 4.
6. Una célula huésped que comprende el vector de
expresión de la Reivindicación 5.
7. Un procedimiento recombinante para preparar
cualquiera de las proteínas de las Reivindicaciones 1 a 4, que
comprende cultivar las células de la Reivindicación 6 en un medio de
cultivo apropiado.
8. Una proteína de acuerdo con cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 3, para uso como un medicamento.
9. Uso de una proteína de acuerdo con cualquiera
de las Reivindicaciones 1 a 3, en la fabricación de un medicamento
para la terapia y/o el diagnóstico de enfermedades en que se
requiere una actividad antagónica de los efectos de
quimioquinas.
10. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 9, en
la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades
inflamatorias, infección por VIH, enfermedades relacionadas con
angiogénesis y hematopoyesis, y tumores.
11. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1 a
3, junto con uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente
aceptables.
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