MXPA00002881A - Rantes truncadas en el extremo amino como antagonistas de la quimiocina - Google Patents
Rantes truncadas en el extremo amino como antagonistas de la quimiocinaInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a RANTES amino-terminalmente truncada, que carece de los aminoácidos NH2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1, 1-2, 1-3ó1-4 de la RANTES de origen natural y que tienen actividad antagonista de la quimiocina, asícomo las secuencias de ADNc que las codifican, su uso en terapia y/o en diagnóstico de enfermedades, en las cuales se requiere una actividad antagonista de los efectos de la quimiocina y las composiciones farmacéuticas que las incluyen.
Description
RANTES TRUNCADAS EN EL EXTREMO AMINO COMO ANTAGONISTAS DE LA QUIMIOCINA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a las RANTES truncadas en el extremo amino, que carecen de los aminoácidos ?H2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1, 1-2, 1-3 ó 1-4 de la RANTES de oxigen natural, y que tienen actividad antagonista de la quimiocina, asi como las secuencias de AD?c que las codifican, su uso en terapia y/o en el diagnóstico de enfermedades, en las cuales se requiere una actividad antagonista de los efectos de la quimiocina, y las composiciones farmacéuticas que las contienen.
ANTECEDENTE S DE LA INVENC IÓN
Las quimiocinas constituyen una familia de citocinas pro-inflamatorias pequeñas con propiedades quimiotácticas y activadoras de leucocitos. Dependiendo de la posición de las primeras cisteínas, la familia de quimiocinas puede ser dividida en las quimiocinas C-C, C-X-C y C-X3-C (Baggiolini M. et al.,
1994; Baggiolini M. et al., 1997 y Taub D. et al., 1996) . Muchas quimiocinas C-X-C tales como la interleucina 8 (IL-8) son quimiotácticas para los neutrófilos, mientras que las quimiocinas C-C, tales como la proteina 3 quimiotáctica de monocitos (MCP-3), son activas sobre una variedad de leucocitos incluyendo monocitos, linfocitos, eosinófilos, basófilos, células NK y células dendríticas. El dominio ?H2-terminal de las quimiocinas está involucrado en el enlace al receptor y el procesamiento ?H2-terminal puede activar las quimiocinas, reducir su actividad de quimiocina o hacer a las quimiocinas completamente inactivas. La proteína básica de plaquetas de quimiocina
C-X-C se vuelve un péptido quimiotáctico de neutrófilos (?AP-2) únicamente después del retiro de los 24 residuos ?H2-terminales ( alz A. et al., 1989 y Van Damme J. et al., 1990). La supresión de hasta 8 residuos ?H2-terminales de IL-8, da como resultado una actividad quimiotáctica aumentada, pero la escisión posterior de la porción Glu-Leu-Arg, la cual está localizada en frente de la primera Cys en todas las quimiocinas
C-X-C quimiotácticas de neutrófilos, provoca la inactivación completa (Clark-Lewis I. et al., 1991) . La proteólisis NH2-terminal similar (hasta 8 aminoácidos) de otra quimiocina C-X-C, la proteína 2 quimiotáctica de granulocitos (GCP-2), no tiene efecto sobre la actividad quimiotáctica de - nentrófilos
(Proost P. et al, 1993a) . RANTES (es un acrónimo para "Regulada sobre la Activación, Normalmente Expresada por T, y presumiblemente Secretada") es una quimiocina C-C, cuyo clon de ADNc ha sido aislado de una genoteca de ADNc enriquecida para las secuencias específicas de las células T (Schall T. J. et al, 1988) . Las quimiocinas C-C sintéticas MCP-1, MCP-3 y RANTES que carecen de los 8 a 9 aminoácidos ?H2-terminales son inactivas sobre monocitos y son útiles como antagonistas de receptores (Gong J. et al., 1996; y Gong J. et al., 1995) . La extensión de RANTES con una metionina da como resultado la inactivación completa de la molécula y Met-RA?TES se comporta como un antagonista para la RANTES auténtica (Proudfoot A.E. et al., 1996).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El objetivo principal de la presente invención es las RA?TES truncadas en el extremo amino, que carecen de los aminoácidos ?H2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1, 1-2, 1-3 ó 1-4 de las RANTES de origen natural, y que tienen actividad antagonista de la quimiocina. Un objetivo particular de la -presente invención es RA?TES (3-68), la cual es RA?TES que carece de los primeros 2 aminoácidos, como se muestra en la Figura 1 y en la SEQ ID ?O.: 2. La RA?TES truncada en el extremo amino de la* invención, puede estar en una forma glucosilada o no glucosilada. El término "antagonista de quimiocina" significa 'que actúa como antagonista para las quimiocinas de origen natural, de longitud completa, maduras' . Otro objetivo más de la invención son las moléculas de AD? que comprenden las secuencias de AD? que codifican para las RA?TES truncadas en el extremo amino o amino-terminalmente truncadas de la invención, incluyendo las secuencias nucleotídicas, sustancialmente iguales. La secuencia de AD?c de la
RANTES intacta se describe en Schall T.J. et al. (1988) y el AD?c de la RANTES truncada puede ser fácilmente deducido. "Secuencias nucleotídicas sustancialmente iguales" incluye todas las otras secuencias de ácido nucleico las cuales, en virtud de la degeneración del código genético, también codifican para las secuencias dadas de aminoácidos. La invención también incluye los vectores de expresión que comprenden los AD?s anteriores, las células huésped transformadas con tales vectores y un proceso de preparación de tal RA?TES truncada en el extremo amino, de la invención, a través del cultivo en medios de cultivo apropiados de dichas células transformadas. La secuencia de AD? que codifica para las proteínas de la invención puede ser insertada y ligada dentro de un plásmido adecuado. Una vez formado, el vector de expresión es introducido dentro de una célula huésped adecuada, la cual luego expresa el o los vectores para producir la proteína deseada. La expresión de cualquiera de las proteínas recombinantes de la invención como se menciona en la presente, puede ser efectuada en células eucarióticas (por ejemplo, células de levadura, de insecto o de
mamífero) o células procarióticas, utilizando los vectores de expresión apropiados. Puede ser empleado cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican para las proteínas obtenidas mediante cualquiera de los métodos anteriores son insertadas en vectores de expresión apropiadamente construidos mediante técnicas bien conocidas en la materia (ver Sambrook et al, 1989) . El ADNc de doble hebra es enlazado a los vectores plasmídicos mediante adición homopolimérica en la cola o mediante enlace de restricción que involucra el uso de enlazadores de ADN sintético o técnicas de ligadura de extremo romo. Las ADN-ligasas son utilizadas para ligar las moléculas de ADN —y la unión o empalme no deseada es evitada mediante el tratamiento con fosfatasa alcalina. Con el fin de ser capaz de expresar la proteína deseada, un vector de expresión debe también comprender secuencias nucleotídicas específicas que contienen información reguladora de la transcripción y de la traducción, enlazada al ADN que codifica para la prot-e-í-na deseada, de una manera tal como para permitir la expresión de un gen y la producción de la proteína. Primeramente en el orden para que sea transcrito el gen, éste debe ser precedido por un promotor
reconocible por la ARN-polimeras a, a la cual se enlaza la polimerasa y de este modo inicia el proceso de transcripción. Existen una variedad de tales promotores en uso, los cuales funcionan con diferentes eficiencias (promotores fuertes y débiles) . Para células eucarióticas, se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción, dependiendo de la naturaleza del huésped. Estas pueden ser derivadas de fuentes virales, tales como adenovirus, virus del papiloma bovino, virus Símico o similares, donde las señales reguladoras están asociadas con un gen particular el cual tiene un alto nivel de expresión. Los ejemplos son el promotor TK del virus del herpes, el promotor SV40 temprano, el promotor del gen gal4 de levadura, etc. Las señales reguladoras del inicio de la transcripción pueden ser seleccionadas, las cuales permitan la represión y la activación, de modo que pueda ser modulada la expresión de los genes. La molécula de AD? que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína de la invención está insertada dentro del o los vectores, teniendo las señales reguladoras de la transcripción y de la traducción, operablemente enlazadas, el cual es
capaz de integrar las secuencias génicas -leseadas dentro de las célula huésped. Las células que han sido establemente transformadas por el ADN introducido pueden ser seleccionadas también mediante la introducción de uno o más marcadores los cuales permiten la selección de las células huésped que contienen el vector de expresión. El marcador puede también proporcionar fototrofía a un huésped auxotrópico, resistencia a biocidas, por ejemplo a antibióticos, o a metales pesados tales como el cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede estar ya sea directamente enla-zado a las secuencias génicas de ADN que van a ser expresadas, o introducido dentro de la misma célula mediante cotransfección. Pueden también ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de las proteinas de la invención. Los factores de importancia en- la selección de un plásmido particular o vector viral incluyen: la facilidad con la cual las células recipientes, que contienen el vector, pueden ser reconocidas y seleccionadas de aquellas células recipientes que no contienen el vector; el número de copias del vector que - se desean en un huésped particular; y si es
deseable ser capaz o no de "lanzar" el vector entre las células huésped de diferentes especies. Una vez que el o los vectores o la secuencia de ADN que contiene la o las construcciones han sido preparados para la expresión, la o las construcciones de ADN pueden ser introducidas dentro de una célula huésped apropiada mediante cualquiera de una variedad de medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, etc. Las células huésped pueden ser ya sea procarióticas o eucarióticas. Los huéspedes preferidos son eucarióticos, por ejemplo, células de mamífero, tales como células humanas, de mono, de ratón y de ovario de hámster Chino (CHO) , debido a que éstas proporcionan modificaciones post-traduccionales a las moléculas de proteína, incluyendo el plegamiento o la glucosilación correcta en los sitios correctos. También, las células de levadura pueden llevar a cabo las modi icaciones peptídicas post-traduccionales incluyendo la glucosilación. Existe un número de estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y alto número de copias de plásmidos que pueden ser utilizados para la
producción de las proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce la secuencia guía sobre los productos génicos de mamífero, clonados y secreta los péptidos que poseen secuencias guía (por ejemplo, pre-péptidos) . Después de la introducción del o de los vectores, las células huésped son desarrolladas en un medio selectivo, el cual selecciona el desarrollo de las células que contienen el vector. La expresión de la o las secuencias génicas clonadas, da como resultado la producción de las proteínas deseadas. Las RANTES truncadas en el extremo amino de la invención pueden ser preparadas mediante cualquier otro procedimiento bien conocido en la técnica, en particular, mediante los procedimientos de síntesis química bien establecidos, utilizando sintetizadores peptídicos en fase sólida, automatizados, seguido por la purificación cromatográfica. Las quimiocinas de la invención pueden, por ejemplo, ser sintetizadas mediante Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) , tBoc (t-butoxicarbonilo) o cualquier otra síntesis química comparable con o sin grupos protectores de cadena lateral, apropiados sobre los diferentes aminoácidos. Los aminoácidos con o sin los grupos protectore- de cadena lateral, apropiados,
son preactivados, por ejemplo con HBTU/HOBt [hexafluorofosfato de 2- ( lH-benzotriazol-1-il) -1,1,3, 3-tetrametil-uronio/l-hidroxibenzotriazol ) , y acoplados a la cadena peptídica en crecimiento. Antes de la adición del siguiente residuo, el grupo de protección (por ejemplo Fmoc) es eliminado del grupo a-amino. Después de la síntesis, todos los grupos protectores son eliminados, los péptidos intactos de longitud completa son purificados, y química o enzimáticamente plegados (incluyendo la formación de puentes disulfuro entre las cisteínas) dentro de las quimiocinas correspondientes de la invención. La purificación de las proteínas naturales, sintéticas o recombinantes se lleva a cabo mediante cualquiera de los métodos conocidos para este propósito, por ejemplo, cualquier procedimiento convencional que involucre la extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o similares (ver por ejemplo Proost P. et al., 1996) . Un procedimiento de purificación adicional que puede ser utilizado de preferencia para la purificación de la proteína de la invención es la cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos monoclonales, o afinidad para heparina, los cuales se enlazan a la proteína objetivo y los cuales son producidos e
inmovilizados sobre una matriz de gel contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que contienen las proteínas se hacen pasar a través de la columna. La proteína será enlazada a la columna mediante el anticuerpo específico, mientras que las impurezas pasarán a través de ésta. Después del lavado, la proteína es eluida a partir del gel mediante un cambio en el pH o en la fuerza iónica. Las RANTES truncadas en el extremo amino, de la invención, son útiles en terapia y/o diagnóstico de las enfermedades en las cuales se requiere una actividad antagonista de los efectos de las quimiocinas. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen: enfermedades inflamatorias, enfermedades relacionadas a la angiogénesis y a la hematopoyesis, tumores, enfermedades infecciosas, incluyendo VIH, enfermedades autoinmunes, ateroesclerosis, enfermedades pulmonares y enfermedades de la piel. El uso preferido es en el campo de la infección por VIH. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de la proteína de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas .
El medicamento es presentado preferentemente en -la forma de una composición farmacéutica que comprende las proteínas de la invención, junto con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones farmacéuticas forman un aspecto adicional de la presente invención. Una modalidad adicional de la invención es el método para el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas, que comprende el administrar una cantidad farmacológicamente activa de las RANTES truncadas en el extremo amino, de la invención, a sujetos en riesgo de desarrollar tales enfermedades, o a sujetos que ya muestran tales patologías . Se ha encontrado también que CD26/DPP IV es capaz de generar RA?TES truncadas en el extremo amino, in vi tro . La RA?TES es la primera citocina reportada cuya actividad biológica puede ser modificada por CD26/DPP IV. Por lo tanto, otro objetivo más de la presente invención es el uso de CD26/DPP IV en la terapia y/o el diagnóstico de las enfermedades, en las cuales se requiere una actividad antagonista de los efectos de las quimiocinas, con enfoque particular a las enfermedades inflamatorias, inmunes e infecciosas.
Ya que esto representa el primer ejemplo de un mecanismo identificado para la modificación de la quimio?ina endógenamente regulada, en un antagonista, el procesamiento fisiológico es similar, pero mediado por otros factores (proteasas) . El uso de tales factores (proteasas) en la terapia y/o diagnóstico de las enfermedades anteriores es también incluido en esta invención. La invención será ahora descrita por medio de los siguientes ejemplos, los cuales no deben ser considerados de ningún modo como limitantes de la presente invención. Los Ejemplos se referirán a las Figuras especificadas más adelante en la presente.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Esta muestra la secuencia de aminoácidos de RA?TES. Las secuencias de señal son reportadas en letras i táli cas , donde los residuos C están en negritas. Las flechas indican los primeros aminoácidos de las RANTES truncadas en el extremo amino, de la invención, también denominadas RA?TES (3-68) .
Figura 2: Las potencias qui iotácticas de las formas intactas y truncadas en el extremo amino de las RANTES naturales o recombinantes para las células THP-1 monocíticas, fueron comparadas en el ensayo de microcámara de Boyden: RANTES ( 1-68 ) Natural (?) , RANTES (3-68) natural, truncada, (D), RANTES (1-68) recombinante intacta (A) y RANTES recombinante escindida por CD26/DPP IV (3-68) ( ------- ) . Los resultados representan el índice quimiotáctico medio ± SEM de cuatro o más experimentos independientes.
Figura 3: Efecto de RANTES (3-68) natural
(D) , RA?TES (1-68) natural (?) , RA?TES (1-68) recombinante (A) y RA?TES (3-68) tratado con CD26/DPP
IV recombinante (----) sobre [Ca2t]. en células THP-1.
Los, resultados representan el incremento medio en [Ca ] _. ± SEM de tres o más experimentos independientes .
Figura 4 : Muestra la desensibilización dé la actividad de movilización de Ca2+ de recRANTES ( 1-68 ) intacto por RANTES (3-68 ) . Las células THP-1 fueron primero estimuladas con amortiguador o diferentes concentraciones de RA?TES (1-68) recombinante o RA?TES (3-68) . Los resultados representan la media ±
SEM (tres o más experimentos independientes) del incremento en [Ca2+]-_ en respuesta a 30 ng/ml de RANTES reco-mbinante intacta como un segundo estímulo.
Figura 5: Comparación de la potencia quimiotáctica de RANTES (3-68) truncada con RA?TES (1-68) intacta. La actividad quimiotáctica de granulocitos eosinófilos de RA?TES natural (nat) y recombinante (rec) truncada, RA?TES intacta y MCP-3 sintética, se determinó en el ensayo de microcámara. Los resultados representan el índice quimiotáctico medio (Cl) ± SEM de dos o más experimentos independientes (cada uno realizado por triplicado) .
Figura 6: Desensibilización de la movilización de calcio por RA?TES intacta en transfectantes CCR. Los experimentos de movilización de calcio fueron realizados en células HOS transfectadas con CD4 y los receptores CCR1 o CCR5 de quimiocina CC . Las células fueron primeramente estimuladas con diferentes concentraciones de RA?TES intacta o truncada, seguida por la estimulación con 100 nanogramos/ml de RANTES intacta. Es también mostrado la inhibición porcentual del incremento de [Ca .2+ ] inducido por el segundo estímulo Este
porcentaje fue calculado mediante la comparación de la respuesta de 100 ng/ml de RANTES intacta después de la adición de RANTES (1-68) o RANTES (3-68) con la respuesta después de la estimulación -con amortiguador (100%) . Los resultados representan la inhibición porcentual media ± SEM de dos o más experimentos.
Figura 7: _ Efecto inhibitorio potente _de RANTES ( 3-68 ) sobre la infección de células mononucleares por VIH-1. Las PBMC activadas por PHA fueron infectadas con la cepa Ba-L del VIH-1 M-trópico en presencia de diversas concentraciones de RANTES (1-68) o RANTES (3-68) (0 a 1,000 ng/ml agregado al tiempo de la infección) . Después de 10 días los productos virales fueron verificados en el sobrenadante celular por un ensayo de ELISA del antígeno p-24 (se muestra un experimento representativo de cuatro) .
Figura 8: Efectos de RA?TES (1-68) y RANTES (3-68) sobre la infección por la cepa SF162 del VIH-1 en PBMC activadas con PHA. Los rendimientos virales fueron verificados 10 días después de la infección por un ensayo de ELISA de antígeno p24 sobre el sobrenadante celular. Los resultados de un experimento representativo de tres, son mostrados.
*Debajo del límite de detección del ensayo de ELISA de antígeno p24 (<5 pg/ml) .
Figura 9: Expresión de CD26 sobre_ células HOS.CD4.CCR5, células U87.CD4.CCR5 y PBMC recién aisladas. El porcentaje (%) de células positivas a CD26 se indica en cada histograma.
Figura 10: Efectos de RANTES ( 1- 68 ) , RANTES (1-68) más sCD26 (50 U/L), y RANTES (3-68) sobre la infección de células HOS.CD4.CCR5 por la cepa BaL de VIH-1. Los rendimientos virales fueron verificados periódicamente en el sobrenadante celular 8 días después de la infección por un ensayo de ELISA de antígeno p24. Se muestran los resultados de un experimento representativo de tres.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: RANTES truncada en el extremo amino
Materiales y Métodos Reactivos
RANTES humano natural fue producido por célu-1-as de hepatosarcoma Malavu humano, células de osteosarcoma MG-63 o leucocitos de sangre periférica
(centros de la transfusión sanguínea de Antwerp y
Leuven) y se purificaron como se describe previamente
(Proost P. et al., 1996 y Proost P. et al., 1993). MCP-2, MCP-3 y GCP-2 se sintetizaron mediante la química de Fmoc (Proost P. et al., 1995 y Wuyts A. et al., 1997), el RANTES humano recombínante se obtuvo de Preprotech (Rocky Hill, ?J) y MCP-1 recombinante fue una donación del Dr. J. J. Oppenheim (?CI-?IH, Frederick, md) . Células de osteosarcoma (HOS) transfectadas con CD4 y uno de los receptores CCR1, CCR3 o CCR5 de la quimiocina CC (Deng H., y colaboradores, 1996) se desarrollaron en DMEM con glutamax. Se agregó puromicina (1 µg/ml) al medio, como un agente de
selección. Todos los medios de desarrollo (Gibco BRL/Life Technologies, Paisley, Reino Unido) fueron enriquecidos con FCS al 10%. Se obtuvo CD26/DPP IV humano de prostasomas, organelos derivados de la próstata, los cuales aparecen libremente en el plasma seminal. La enzima fue purificada hasta la homogeneidad como se describe anteriormente utilizando intercambio de iones seguido por cromatografía de afinidad sobre adenosina-desaminasa (De Meester I. et al., 1996) .
Incubaci ón de quimi ocinas con CD26/DPPIV y detecci ón del procesami ento proteolí ti co
Un exceso de 100 a 1000 molar de quimiocina fue incubado toda la noche con CD26/DPP IV en Tris/HCl 100 -mM pH 7.7. Las quimiocinas se " separaron de CD26/DPP IV mediante SDS-PAGE sobre un sistema de Tris/Tricina como se describe previamente (Proost P. y colaboradores, 1996) . Las proteínas fueron electrotransferidas sobre membranas de PVDF (fluoruro de polivinilideno) (Problott, Perkin Elmer, Foster City, CA) y teñidas con azul brillante de coomassie R250. Después de desteñirse, las membranas fueron enjuagadas al menos 5
veces con agua ultrapura (Milli Q; Millipore, Bedford, MA) . Para obtener cantidades suficientes de quimíocina pura truncada para los ensayos biológicos, se trataron aproximadamente 50 µg de quimiocina recombinante con CD26/DPP IV y el producto de escisión se acidificó con ácido trifluoroacético (TFA) al 0.1%. Se agregó Tween 20 al 0.01% para prevenir que las quimiocinas se adhirieran a los tubos . Las quimiocinas fueron separadas del CD26/DPP
IV en un gradiente de acetonitrilo sobre una columna C-8 Aquapore RP-300 (1 x 50 mm) (Perkin Elmer) . Las fracciones que contenían las proteinas fueron analizadas mediante SDS-PAGE y se tiñeron con plata como se describe anteriormente. Las quimiocinas tratadas con CD26/DPP IV, purificadas por RP-HPLC o extirpadas de las manchas de PVDF, se secuenciaron NH2-terminalmente mediante degradación de Edman sobre un secuenciador de proteínas 477A/120A de fase líquida pulsada (Perkin Elmer) utilizando N-metilpiperidina como una base de acoplamiento .
Detección de la actividad quimi otáctica
Las quimiocinas fueron probadas -por su potencia quimiotáctica sobre granulocitos neutrófilos de sangre periférica, recién aislados (106 células/ml) o células THP-1 monocíticas cultivadas "(0.5 x 106 células/ml) en la microcámara de Boyden (Proost P. et al., 1996 y Proost P. et al., 1993). Después de 45 minutos (granulocitos) o 2 horas (células THP-1) de incubación a 37°C, las células se fijaron y se tiñeron. Las células que migraron a través de las membranas de policarbonato de tamaño de poro de 5 µm fueron contadas microscópicamente en diez campos de inmersión en aceite. El índice quimiotáctico (C.l.) de una muestra (triplicados en cada cámara) se calculó como el número de células que migraron hacia la muestra de prueba dividida por el número de células que migraron al medio de control. En los experimentos de desensibilización, las células fueron incubadas con variantes de quimiocina biológicamente inactivadas por 10 minutos a 37 °C antes de la transferencia a la cámara.
La inhibición porcentual del C.l. obtenido mediante desensibilización con las células control tratadas con HBSS, se calculó para la evaluación de la desensibilización a la quimiotaxis.
Detección de concentraciones de Ca2+ intracelular
Las concentraciones intracelulares de Ca2+ ([Ca2t]i) se midieron como se describe previamente (Wuyts A., et al., 1997) . En resumen, las células purificadas fueron incubadas con el indicador fluorescente fura-2 (2.5 µM de fura-2/AM, Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda) y Pluronic F-127 al 0.01% (Sigma, Saint Louis, MO) . Después de 30 minutos, las células fueron lavadas dos veces, resuspendidas en HBSS con Ca2+ 1 mM e incubadas por 10 minutos a 37 °C antes de que se midiera la fluorescencia de fura-2 en un espectrofotómetro de luminiscencia LS50B (Perkin Elmer) . Después de la excitación a 340 y 380 nm, la fluorescencia se detectó a 510 nm. El [Ca2+]? fue calculado a partir de la ecuación de Grynkiewicz (Grynkiewicz G et al., 1985) . Con el fin de determinar Rmax, las células fueron usadas con digitonina 50 µM .
Subsecuentemente, el pH se ajustó a 8.5 con Tris 20 mM, y se obtuvo Rm?n mediante la adición de EGTA 10 mM a las células usadas. La Kd utilizada para la calibración fue 224 nM. Para los experimentos de sensibilización, las células fueron primeramente estimuladas con amortiguador o quimiocina a diferentes concentraciones. Como un segundo estímulo, se agregaron quimiocinas a una concentración que induce un incremento significativo en el [Ca2+]-- después de la pre-estimulación con amortiguador. Se calculó la inhibición porcentual del incremento de [Ca2+]1 en respuesta al segundo estímulo por la pre-estimulación de las células.
Inhibi ci ón de l a infecci ón por VIH
Las cepas BaL y SF162 M-trópicas del VIH-1 fueron obtenidas a través del proyecto de reactivo de SIDA MRC (Herts, Reino Unido) . Células mononucleares de sangre periférica (PBMC) provenientes de donadores saludables fueron aisladas mediante centrifugación en gradiente de densidad (5,23) y estimuladas con PHA a 1 µg/ml (Sigma, Bornem, Bélgica) por 3 días a 37°C. Las células activadas (blastos estimulados con PHA) se lavaron tres veces con PBS, y se infectaron con un
virus como se describe previamente (Schols D. et al., 1997) . Los blastos estimulados con PHA, infectados con VIH-1 y pseudo- nfectados, fueron infectados en presencia de 25 U/ml de IL-2 y concentraciones variantes de RANTES (1-68) o RA?TES (3-68 ) . El sobrenadante celular se recolectó en el día 10 y el antígeno nuclear del VIH-1 en el sobrenadante fue analizado mediante un equipo de ELISA de antígeno p24 (DuPont/?E? Life Science Products, Bruselas, Bélgica) .
Resul ados
Identificaci ón y caracterizaci ón biológi ca de RANTES truncada en el extremo NE2, na t ural
Una forma truncada en el extremo ?H2, diferente de GCP-2 humana ha sido previamente aislada (Proost P. et al., 1993) . La for-ma GCP-2 menos truncada fue escindida más allá de Pro en la penúltima posición [GCP-2 ( 3-75) ] . Utilizando un procedimiento de purificación estándar, similar, la quimiocina RANTES CC fue purificada de leucocitos de sangre periférica o de células de sarcoma (Proost P. y colaboradores, 1996) .
En particular, los medios condicionados provenientes de células de sarcoma MG-63 o Malavu inducidos con una mezcla de citocina fueron fraccionados para aislar las variantes de quimiocina natural. Las quimiocinas fueron purificadas mediante la cromatografía de afinidad de anticuerpo o de heparina, subsecuente, cromatografía de intercambio catiónico (mono S FPLC) y RP-HPLC (cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa) , y las formas inmunorreactivas fueron detectadas mediante ELISAs de quimiocina, específicos. En la columna de intercambio catiónico, se encontró que IL-8 eluye en estrecha proximidad de RANTES (entre 0.7 y 0.75 M de NaCl) . No obstante, ambas quimiotcinas fueron separadas una de la otra por RP-HPLC (RANTES e IL-8 que eluyen a 27.5% y 30% de acetonitrilo, respectivamente) . El análisis de las secuencias de aminoácidos de las proteínas puras confirmó que IL-8 apareció en diferentes formas NB-2-terminalmente truncadas, las cuales fueron previamente aisladas con base en su actividad quimiotáctica (Van Da me J. y colaboradores, 1989) . o obstante, para RANTES únicamente se aisló una forma simple, a la cual le faltaban dos residuos ?H2-terminales en comparación a RANTES intacta. En vista de su apariencia
predominante, esta RANTES (3-68) fue analizada con más detalle para verificar su actividad quimiotáctica para monscitos y eosinófilos. En particular, RA?TES (3-68) fue probada para la actividad quimiotáctica y/o liberadora de Ca2* intracelular, y su potencia biológica fue comparada con aquella de las quimiocinas intactas respectivas. La supresión ?H2-terminal de los residuos de RANTES dio como resultado actividades quimiotáctica de monocitos y de liberación de Ca2+, considerablemente disminuidas. En comparación a la RANTES natural intacta (dosis efectiva mínima de 3 a 10 ng/ml), la RA?TES (3-68) natural fue totalmente inactiva cuando se probó a concentraciones tan altas como de 300 ng/ml en la microcámara de Boyden (Figura 2) . Además, concentraciones 10 veces más altas de RA?TES (3-68) natural, en comparación a RA?TES (1-68), fueron necesarias para obtener una respuesta a Ca2+ similar (Figura 3) .
CD26/DPP IV elimina l os dipépti dos NHz- terminal es de las quimi ocinas
Con el fin de investigar si la aminopeptidasa CD26/DPP IV podría ser responsable para el
truncamiento NH2-terminal de RANTES, la quimiocina intacta fue incubada toda la noche con CD26/DPP IV, transferida a membranas PVDF, teñida con azul de Coomassie y sujeta a degradación automática de Edman. El tratamiento con CD26/DPP IV de RANTES dio como resultado la eliminación de los dipéptidos ?H2-terminales . La incubación en paralelo de la quimiocina con amortiguador sin CD26/DPP IV no tuvo efecto . Ya que otras quimiocinas contenían la secuencia de consenso para la escisión por CD26/DPP IV y ya que el extremo ?H2 de los MCPs se mostró que es crucial para la actividad biológica (Gong J. y colaboradores, 1996 y Gong J. y colaboradores, 1995) , MCP-1, MCP-2 y MCP-3 fueron también incubadas con CD26/DPP IV. Después del tratamiento, las MCPs fueron transferidas sobre membranas de PVDF y teñidas con azul de Coomassie para confirmar que fuera recuperada una cantidad suficiente de proteína para la degradación de Edman. ?o obstante, no pudo ser detectada secuencia ?H2-terminal, indicando que CD26/DPP IV no altera el extremo ?H2 de las MCPs, el cual es bloqueado por la degradación de Edman por un ácido piroglutámico .
Comparaci ón de la acti vi dad biológi ca de RANTES intacto y tratado con CD26/DPP IV
Similar a RANTES ( 3-68 ) , la RANTES recombinante tratada con CD26/DPP IV purificada por RP-HPLC C-8, fue inactiva en los experimentos de quimiotaxis en microcámara de Boyden cuando se utilizó a concentraciones hasta de 1 µg/ml, mientras que la respuesta quimiotáctica de monocitos, significativa, fue detectada con RANTES recombinante intacta desde 30 hasta 100 ng/ml (Figura 2) . Cuando el efecto de truncamiento fue probado en el ensayo de movilización de Ca2+, RANTES (3-68) indujo un incremento bajo pero significativo a 100 ng/ml. RANTES intacta, no obstante, fue ya activa a 10 ng/ml (Figura 3) . En conclusión, aunque únicamente fueron eliminados dos residuos del extremo NH2, la potencia quimiotáctica y movilizadora de Ca2+ de los monocitos, de RANTES, disminuyó de 10 a 100 veces.
RANTES (3- 68) es un an tagoni sta na tural de l a quimi otaxi s r para RANTES intacta
En vista de la inactividad de RANTES (3-68) en los experimentos de quimiotaxis de monocitos, se probó
si esta RANTES truncada podía actuar como un antagonista. RANTES (3-68), a 1 µg/ml, se desensibilizó casi completamente (82%) para el efecto quimiotáctico de 100 ng/ml de RANTES intacta (Tabla I) . Cuando se agregó un exceso de 3 veces de RANTES (3-68) al pozo superior, la quimiotaxis de las células THP-1 hacia RA?TES intacta fue inhibida por aproximadamente 50 a 70%. RA?TES (3-68) a 300 ng/ml pudo todavía inhibir aproximadamente 30% de la respuesta quimiotáctica hacia una concentración igual de RANTES intacta. En los experimentos de movilización de Ca2+ con células THP-1 (Figura 4) , 30 ng/ml de RA?TES intacta podría desensibilizar para el efecto de 30 ng/ml de RA?TES intacta por 39 ± 5%. Fueron necesarias concentraciones aproximadamente diez veces más altas de RA?TES (3-68) para obtener la misma cantidad de desensibilización. ?o obstante, a 300 ng/ml, RA?TES (3-68) por sí misma dio una respuesta de Ca2+ significativa. — Esta respuesta de Ca2+ fue comparable a la respuesta obtenida con 30 ng/ml de RANTES intacta.
TABLA I
RANTES (3-68) desensibiliza la quimiotaxis de monocitos inducida por RANTES (1-68)1
Los resultados representan el índice quimiotáctico
(C.l.) de cuatro experimentos independientes (A al D)
(incluyendo la media ± SEM) y la inhibición porcentual
(%) (media ± SEM de la inhibición porcentual de los cuatro experimentos) de la respuesta quimiotáctica hacia RA?TES (1-68) después de la preincubación de las células THP-1 con RA?TES (3-68) inactiva o amortiguador.
Actividad quimi otácti ca deteri orada de RANTES (3-68) para monoci tos y eosinófil os humanos
En la Tabla II la potencia quimiotáctica de RANTES (3-68) natural es comparada con aquella de la proteína quimiotáctica de monocitos, MCP-3 y RA?TES (1-68) intacta. Se puede observar que MCP-3 y RA?TES (1-68) son todavía quimiotácticas para monocitos de sangre periférica recién aislados a 3 ng/ml y a 30 ng/ml, respectivamente, mientras que RANTES (3-68) natural permaneció inactiva a 100 ng/ml. La potencia qnimiotáctica reducida de esta variante natural, fue confirmada con RANTES (3-68) recombinante . Aunque débilmente quimiotáctica para los monocitos (a 1 µg/ml), la RA?TES (3-68) recombinante, purificada mostró una actividad específica que es 10 veces menor que aquella de RA?TES recombinante intacta. Finalmente, la potencia quimiotáctica de RANTES (3-68) fue verificada sobre eosinófilos humanos, los cuales todavía respondieron a 100 ng/ml de RA?TES intacta, y a 30 ng/ml de MCP-3 (Figura 5) . Similar a los monocitos, la migración de los eosinófilos fue únicamente estimulada por RANTES (3-68) a 1 µg/ml.
Tabla II
Comparación de la actividad quimiotáctica de monocitos de RANTES (3-68) con RANTES (1-68) y MCP- 3 Actividad — quimiotáctica de monocitos3' Conc. MCP-3 natRANTES recRAN-TES recRANTES (ng/ml) (3-68) (1-68) (3-68)
1000 b) 3.6+0.8 (6) 3.3(1)
300 6.011.2(6) 100 1.110.1(3) 3.310.4(6) 1.0(1)
6.911.0(6) 1.710.2(3) 10 1.910.6(3) 1.9+0.4(6) <1.0 (i;
3 4.110.4(6) a! índice quimiotáctico medio (Cl) i SEM (n) sobre monocitos de sangre periférica recién aislados. b) no determinado
RANTES (3-68) señala y desensibiliza a RANTES (1-68) a través de CCR5 , pero no a través de CCR1 y CCR3
Para explicar la actividad quimiotáctica reducida de RANTES (3-68), se verificó la capacidad de esta variante de quimiocina para enlazarse y señalar a
través de los receptores conocidos utilizados por RANTES. Las células HOS transfectadas con los receptores de CCR1, CCR3 o CCR5 fueron utilizadas en un ensayo de señalización que mide los incrementos en la concentración de calcio intracelular. A concentraciones hasta de 300 ng/ml, RANTES (3-68) no incrementó el [Ca2*]-. en células HOS transfectadas con CCR1 (Tabla III) o CCR3 (datos no mostrados), mientras que 30 ng/ml y 100 ng/ml de RANTES intacta fue suficiente para inducir un incremento en [Ca2+]_. en transfectantes de CCR1 y CCR3, respectivamente. No obstante, RANTES intacta y truncada fueron caparees de inducir una elevación significativa en [Ca2+]± en transfectantes de CCR5 a 30 ng/ml. Además, mediante pre-incubación de las células transfectadas con CCR5 con un exceso de 3 a 10 veces ya sea de RANTES (3-68) o RANTES intacta, fue obtenida una inhibición igual (aproximadamente 75%) de la elevación de [Ca2+]? por un reto subsecuente con RA?TES intacta (100 ng/ml) (Figura 6) . En contraste, 300 ng/ml de RA?TES (3-68) únicamente desensibilizaron marginalmente la respuesta al calcio de las células transfectadas con CCR1 y CCR3 a 100 ng/ml de RA?TES intacta, mientras que un exceso
de 3 veces de RANTES intacta como primex estímulo casi inhibió completamente la elevación de [Ca2+]_. en estas células por RANTES (1-68) subsecuente. Se debe concluir que el retiro de los dos residuos NH2-terminales de RANTES tiene un impacto significativo sobre la transducción de la señal ya que los receptores quimiotácticos CCR1 y CCR3 ya no son funcionalmente reconocidos. Por lo tanto, la potencia quimiotáctica deteriorada de RA?TES (3-68) puede ser explicada por su incapacidad para funcionar a través de CCR1 y CCR3. En contraste, RA?TES (3-68) retuvo completamente las características de señalización de CCR5 de RA?TES intacta. RA?TES (3-68) puede ser antiinflamatoria al competir con RA?TES intacta, pero puede todavía funcionar como un inhibidor del VIH al retener su capacidad para enlazarse a CCR5.
Tabla III
Movili za ci ón de cal cio por formas de RANTES en trans ectantes de CCR1 y CCR5 Quimiocina Conc. (ng/ml) Incremento en [Ca2+]i (nM) CCR1 CCR5
RANTE S (1-68) 300 13315 (3) 9611 (2) 100 100128 (3) 6014 (2)
2518 (3) 2412 (2) 10 15 (2) <15(1)
RANTE S (3-68 300 1919 (3) 11915 (2) 100 <1510 (3) 7614 (2) 30 <15 (2) 56+13 (2 10 <15(1) a) es mostrado el incremento medio en [Ca ] ± en nM + SEM de dos o más experimentos independientes.
Inhibi ci ón de quimi otaxi s induci da por quimi ocina CC por RANTES (3- 68) en cél ulas monocí ti cas humanas
Para verificar si la inhibición de la quimiocina CC que señala por RA?TES (3-68) también ocurrió en células monocíticas, se condujeron experimentos de inhibición en células THP-1. Se puso en evidencia que RANTES (3-68) mostró una reducción de 10 veces en la potencia para incrementar el [Ca2+]_. en células monocíticas en comparación a RA?TES intacta (datos no mostrados) . Además, el efecto quimiotáctico de RANTES intacto (30 ng/ml) sobre células monocíticas fue inhibido (71%) al incubar las células de prueba con 300 ng/ml de RA?TES (3-68) como se muestra en la Tabla IV.
Además, RANTES (3-68) redujo la respuesta quimiotáctica a otras quimiocinas CC, incluyendo la proteína 3 quimiotáctica de monocitos (MCP-3) (67%), la proteína la inflamatoria de macrófagos (MlP-la)
(61%) y MlP-lß (80%) . Este ilustra que RANTES (3-68) funciona como un inhibidor de amplio espectro de la migración de las células monocíticas inducida por otras quimiocinas CC .
Tabla IV
Inhibi ci ón de la quimi otaxi s de las cél ulas monocí ti cas hacia las quimi ocinas CC por RANTES (3- 68) Inhibición de la quimiotaxis de células THP-1 Quimiocina Conc. Amortiguador15'c) RANTES % de a (ng/ml) (3-68)b'c) inhibición3
RANTE S 30 19.016.6 3.710.6 71+16 MCP-3 30 48.519.3 24.912.0 45+10 MCP-3 3 7.612.5 3.110.8 67+13 MlP-la 30 6.212.4 3.0+1.1 61+22 MlP-lß 300 4.311.0 1.910.6 80+12 control 1.510.5 1.0+0.5
a) RANTES, MCP-3, MlP-la, MlP-lß y amortiguador fueron agregados como quimioatrayentes a los pozos inferiores de la microcámara. b) los pozos superiores de la microcámara fueron llenados con células THP-1 preincubadas (10 minutos, 37°C) con 300 ng/ml de RANTES (3-68) o con amortiguador. c) media CI+SEM de cuatro experimentos independientes . d) inhibición de la migración inducida por quimiocinas intactas en presencia de RANTES (3-68) a 300 ng/ml.
El truncami ento de RANTES específi co de CD26, es necesari o para su actividad antiviral
Los efectos de las diferentes formas de RANTES fueron primeramente evaluados -contra dos diferentes cepas de VIH-1 M-trópico (BaL y SF162) en PBMC humanas derivadas de donadores sanguíneos saludables. La IC5o de la RANTES (1-68) intacta contra la cepa BaL fue de 3.4 nM y para RA?TES (3-68) la IC50 fue de 0.39 nM . El valor de IC90 para RA?TES (1-68) fue de 71 nM, el cual fue aproximadamente 10 veces la IC90 para RA?TES (3-68) . Contra la cepa SF162 cuando
fue evaluada en PBMC, RANTES (1-68) (IC50: 23 nM; IC30-95 nM) fue más de 10 veces menos activa que RANTES (3-68) (IC5o- 2 nM; IC90: 8.2 nM) (Tabla V) . Los efectos dependientes de la concentración de ambas quimiocinas, a concentraciones en el intervalo de 133 hasta 0.2 nM contra la replicación del VIH-1 SF162 en PBMC, se muestran en la Figura 8. Una concentración de RANTES (3-68) 5.2 nM fue claramente efectiva para reducir la replicación viral, mientras que RANTES (1-68) fue inactiva a esta concentración. ?o se notó ninguna diferencia en la actividad antiviral entre RANTES intacta obtenida de PeproTech o R&D Systems. La diferencia sorprendente e ~ la actividad antiviral entre las dos formas de RANTES se volvió aún más aparente cuando se probó en células humanas transfectadas con CCR5. En células U78. CD4. CCR5, la IC50 para RA?TES (1-68) y RA?TES (3-68) contra la cepa BaL fue de 21 nM y 0.65 nM, respectivamente.— La IC90 para RANTES (1-68) fue mayor de 133 nM, mientras que la IC90 para RANTES (3-68) fue de 63 nM. También en la Tabla V, se muestra que RANTE S (1-68) fue virtualmente inactiva en las células HOS.CD4.CCR5 (IC50 >133 nM) , mientras que RA?TES (3-68) es un potente inhibidor de la replicación del VIH-1 BaL en estas células (IC50: 5.5 nM) . ?o obstante, ninguno de los valores de IC90
fue alcanzado para ambas formas de RANTES en estas células .
La activi dad antiviral de RANTES es dependi ente de la presencia de CD26 (sCD26) enlazado a la membrana o sol ubl e
Se evaluó la expresión de CD26 sobre las dos diferentes líneas celulares transfectadas con CCR5 y sobre PBMC recién aislada. Los transfectantes HOS fueron negativos para la expresión de CD26 como se determina mediante el análisis citométrico de flujo, mientras que los transfectantes U87 se tiñeron débilmente pero fueron significativamente positivos con el anticuerpo monoclonal anti-CD26 (Figura 9) . Además, se encontró que una subpoblación de PBMC recién aislada era fuertemente positiva para la expresión de CD26 (Figura 9) . El efecto dependiente de la concentración, de RANTES (1-68) y RA?TES (3-68) sobre la producción del antígeno p24 viral por la cepa BaL en células transfectadas con HOS.CD4.CCR5 en presencia de sCD26, se muestra en la Figura 10. La adición de sCD26, junto con RANTES (1-68) al comienzo de la infección por el VIH, mejoró significativamente la actividad
antiviral de la RANTES intacta en células
HOS .CD4.CCR5. Cuando SCD26 a 50 U/l fue agregado junto con RANTES , se obtuvo una IC50 de 13 nM de RANTES . La adición de sCD26 solo no tuvo efecto sobre la replicación del virus. La adición de sCD26 a RANTES (3-68) tampoco cambió la actividad antiviral de RANTES (3-68) (datos no mostrados) . De este modo, la presencia de CD26 es esencial para RA?TES intacta, para volverse antiviralmente activa.
El truncami ento amino-terminal de MlP-la natural no afecta su actividad quimi otácti ca anti -VIH-1 y movili zadora de Caz+
Ya que la mayoría de la MlP-la natural está truncada en el extremo ?H2 (cuatro aminoácidos), se investigó si esta MlP-la truncada (5-70) tenía una capacidad inhibitoria alterada de VIH-1. En contraste con - los resultados obtenidos para RANTES , no se detectaron diferencias significativas para los valores de IC50 de la MlP-la y MlP-la (5-70) intactas en células PMBC o transfectadas con CCR5 (Tabla V, Figura 8) . Además, la MlP-la intacta y MlP-la truncada (5-70) fueron comparadas en la quimiotaxis y en los ensayos de movilización intracelular de [Ca2+]_ sobre
células monocíticas THP-1. La Tabla VI demuestra que la dosis efectiva mínima de MlP-la 85-70) que induce una elevación en el [Ca2+]_. fue solo ligeramente inferior que la MlP-la intacta. Además, aunque la migración máxima obtenida con 0.13 nM en el ensayo de quimiotaxis fue más alto para MlP-la intacta, las concentraciones efectivas mínimas de las isoformas de MlP-la fueron más bien similares. Tomado conjuntamente, se debe concluir que el procesamiento NH2-ferminal de MlP-la en contraste a RANTES, solo debilita mínimamente su actividad inflamatoria y anti-VIH.
Tabla V
Actividad anti-VIH-1 de RANTES y MlP-la en PMBC estimuladas con PHA, células U87.CD4.CCR5 RA?TES RA?TES MlP-la MlP-la (1-68) (3-68) (1-70) (5-70) IC50 ICgo IC50 le 90 IC 50 Ic 90 Ic 50 Ic 90
PMBC BaL 3.4 71 039 6.9 1.9 62 1.6 13
SF162 23 95 2.0 8.2 3.1 30 3.6 32
U87.CD4.CRR5 BaL 21 >130 0.65 63 ND ND ND ?D
HOS.CD4.CCR5 BaL >130 >130 5.5 >130 32 >130 21 >130
El rendimiento del virus fue verificado periódicamente en e-L sobrenadante libre de células, 8 a 12 días después de la infección por el ensayo de ELISA de antígeno p24 viral. Las IC5o e IC90 medias (en- nM) son mostradas. Los datos representan las medias de dos a cuatro experimentos independientes. El valor marcado por ">130" indica que la inhibición de 50% ó 90% no es lograda a 130 nM. ?D, no realizado.
Tabla VI
Falta de dif rencia en la potencia biológica entre MlP-la intacta y truncada Quimiotaxis* Incremento en [Ca2+]_.f
Quimiocina ?M C.l. nM nM [Ca2+3i
MlP-la (1-70) 1.3 8.5+3.3 3.9 240/195 0.13 22.214.4 0.39 120/130 0.013 5.711.6 0.34 30/14
Mip-la (5-70) 1.3 14.210.4 4.0 196/178 0.13 11.4+2.9 0.4 71/33 0.013 3.811.4 0.04 10/<10 0.0013 2.110.6 * Migración de las células monocíticas THP-1 a través de poros de 5 µm en la microcámara. Los resultados son la media + SEM de tres experimentos independientes . f Detección del incremento de [Ca2+]? en células THP-1. Se muestran los resultados de dos experimentos independientes .
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Claims (14)
1. Una RANTES truncada en el extremo amino, que carece de los aminoácidos NH2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1, 1-2, 1-3 ó 1-4 de la RANTES de origen natural y que tiene actividad antagonista de la quimiocina.
2. La RANTES truncada amino-terminalmente de conformidad con la reivindicación 1, que carece de los aminoácidos NH2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1-2 de la RANTES de origen natural y que tiene una actividad antagonista de la quimiocina .
3. La RANTES truncada amino-terminalmente de conformidad con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO . : 2.
. La RA?TES truncada amino-terminalmente de conformidad con una o más de las reivindicaciones precedentes, en una forma glucosilada.
5. Las moléculas de AD? que comprenden las secuencias de AD? que codifican para la RANTES amino- terminalmente truncada de la invención, de conformidad con una o más de las reivindicaciones precedentes, incluyendo las secuencias nucleotídicas sustancialmente iguales.
6. Un vector de expresión que comprende una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 5.
7. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6.
8. Un proceso recombinante para la preparación de cualquiera de las proteínas de la reivindicación 1 a 4, que comprende el cultivo en un medio de cultivo apropiado de las células de conformidad con la reivindicación 7.
9. Una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para el uso como medicamento.
10. El uso de una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la fabricación de un medicamento para la terapia y/o diagnóstico de enfermedades, en la cual se requiere una actividad antagonista de los efectos de la quimiocina .
11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, infección por VIH, enfermedades relacionadas a la angiogénesis y a la hematopoyesis, y tumores.
12. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, junto con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
13. El uso de CD26/DPP IV en la terapia y/o diagnóstico de las enfermedades, en las cuales se requiere una actividad antagonista de los efectos de la quimiocina.
14. El uso de conformidad con la reivindicación 13, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, inmunes e infecciosas. LISTADO DE SECUENCIAS 1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE : APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V. (B) CALLE: 14 JOHN B. GORSIRA EG (C) CIUDAD: CURAZAO (E) PAÍS: ANT ILLAS HOLANDE SAS (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : NINGUNO (G) TELEFONO : 599-9-639300 (H) TELEFAX. 599-9-614129 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN : RANTES TRUNCADAS EN EL EXTREMO AMINO COMO ANTAGONISTAS DE LA QUIMIOCINA (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible ~~ (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) 2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 91 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO ;ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) LOCALIZACION: 1..68 ( xi ) DESCRI PC I ÓN DE LA SECUENC IA : SEQ ID NO . : 1 : Met Lys Val Ser Ala Ala Arg Leu Ala Val lie Leu lie Ala Thr Ala -20 -15 -10 Leu Cys Ala Pro Ala Ser Ala Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro -5 1 5 Cys Cys Phe Ala Tyr lie Ala Arg Pro Leu Pro Arg Ala His lie Lys 10 15 20 25 Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe 30 35 40 Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp 45 50 55 Val Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu Met Ser 60 65 2) INFORMACIÓN PARA LA SFQ ID NO.: 2: ( i : CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 66 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: NO (iv) ANTISENTIDO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.: 2: Tyr Ser Ser Asp Thr Thr Pro Cys Cys Phe Ala Tyr lie Ala Arg Pro 1 5 10 15 Leu Pro Arg Ala His lie Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val Val Phe Val Thr Arg Lys Asn Arg Gln Val Cys 35 40 45 Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp Val Arg Glu Tyr lie Asn Ser Leu Glu 50 55 60 Met Ser 65
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97116863 | 1997-09-29 | ||
| EP97122471 | 1997-12-19 | ||
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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