MXPA00002880A - Mcp-2 truncadas en el extremo amino como antagonistas de la quimiocina - Google Patents
Mcp-2 truncadas en el extremo amino como antagonistas de la quimiocinaInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a MCP-2 amino-terminalmente truncadas, que carecen de los aminoácidos NH2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1, 1-2, 1-3, 1-4ó1-5 de la MCP-2 de origen natural y que tienen actividad antagonista de la quimiocina, asícomo las secuencias de ADNc que las codifican, su uso en terapia y/o en diagnóstico de enfermedades, en las cuales se requiere una actividad antagonista de los efectos de la quimiocina, y las composiciones farmacéuticas que las incluyen.
Description
MCP-2 TRUNCADAS EN EL EXTREMO AMINO COMO ANTAGONISTAS DE LA QUIMIOCINA
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a las MCP-2 truncadas en el extremo amino, que carecen de los aminoácidos NH2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1, 1-2, 1-3, 1-4 ó 1-5 de las MCP-2 de origen natural, y que tienen actividad antagonista de la quimiocina, así como las secuencias de ADNc que las codifican, su uso en terapia y/o en el diagnóstico de enfermedades, en las cuales se requiere una actividad antagonista de los efectos de la quimiocina, y las composiciones farmacéuticas que las contienen.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las quimiocinas constituyen una familia de citocinas pro-inflamatorias pequeñas con propiedades quimiotácticas y activadoras de leucocitos. Dependiendo de la posición de las primeras cisteínas, la familia de quimiocinas puede ser dividida en las quimiocinas C-C, C-X-C y C-X3-C (Baggiolini M. et al., 1994; Baggiolini M. et al., 1997 y Taub D. et al., 1996) . Muchas quimiocinas C-X-C tales como la interleucina 8 (IL-8) son quimiotácticas para los neutrófilos, mientras que las quimiocinas C-C, tales como la proteína 3 quimiotáctica de monocitos (MCP-3), son activas sobre una variedad de leucocitos incluyendo monocitos, linfocitos, eosinófilos, basófilos, células NK y células dendríticas. El dominio NH2-terminal de las quimiocinas está involucrado en el enlace al receptor y el procesamiento NH2-terminal puede activar las quimiocinas, reducir su actividad de quimiocina o hacer a las quimiocinas completamente inactivas. La proteína básica de plaquetas de quimiocina C-X-C se vuelve un péptido quimiotáctico de neutrófilos (NAP-2) únicamente después del retiro de los 24 residuos NH2-terminales (Walz A. et al., 1989 y Van Dam e J. et al., 1990) . La supresión de hasta 8 residuos NH2-terminales de IL-8, da como resultado una actividad quimiotáctica aumentada, pero la escisión posterior de la porción Glu-Leu-Arg, la cual está localizada en frente de la primera Cys en todas las quimiocinas C-X-C quimiotácticas de neutrófilos, provoca la inactivación completa (Clark-Lewis I. et al., 1991) . La proteólisis NH2-terminal similar (hasta 8 aminoácidos) de otra quimiocina C-X-C, la proteína 2 quimiotáctica de granulocitos (GCP-2), no tiene efecto sobre la actividad quimiotáctica de neutrófilos (Proost P. et al, 1993a) . Las quimiocinas de C-C sintéticas, MCP-l, MCP-3 y RANTES que carecen de los 8 a 9 aminoácidos NH2-terminales son inactivos sobre los monocitos y son útiles como antagonistas del receptor (Gong J. et al., 1996; y gong J. et al., 1995) . La extensión de RANTES con una metionina da como resultado la inactivación completa de la molécula y Met-RANTES se comporta como un antagonista para la RANTE S auténtica (Proudfoot A. E. et al., 1996) . El clon de MCP-2 humano (Proteína 2 Quimioatrayente de Monocitos) ha sido aislada mediante selección de genoteca diferencial con sondas de AD?c derivadas de linfocitos de sangre periférica estimulados versus en reposo (PBL) (ésta fue inicialmente llamada "HC14", Chang H.C. et al., 1989). La secuencia de proteína derivada del AD?c fue idéntica a aquella del MCP-2 natural purificado; sin embargo, ha sido también aislada una variante alélica putativa, en la cual Gln 46 reemplaza a Lys 46 (Van Coillie et al., 1997) . MCP-2 ha sido también sintetizada por química en fase sólida (Proost P. et al., 1995) .
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
El principal objetivo de la presente invención son las MCP-2 truncadas en el extremo amino, que carecen de los aminoácidos NH2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1, 1-2, 1-3, 1-4 ó 1-5 de la MCP-2 natural y que tienen actividad antagonista de la quimiocina. Más particularmente, un objetivo de la presente invención es MCP-2 (6-76), la cual es MCP-2 que carece de los 1 a 5 aminoácidos NH -terminales , como se muestra en la Figura 1 y en la SEQ ID NO.: 3 o SEQ ID NO. : 4. Tal MCP-2 truncado en el extremo amino, de la invención, puede ser una forma glucosilada o no glucosilada . El término "antagonista de quimiocina" significa que actúa como antagonista para las quimiocinas de origen natural, de longitud completa, maduras' .
Otro objetivo de la invención son las moléculas de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican para la MCP-2 truncada en el extremo amino, de la invención incluyendo las secuencias nucleotídicas sustancialmente iguales. "Secuencias nucleotídicas sustancialmente iguales" incluye todas las otras secuencias de ácido nucleico las cuales, en virtud de la degeneración del código genético, también codifican para las secuencias dadas de aminoácidos. La invención también incluye los vectores de expresión que comprenden los ADNs anteriores, las células huésped transformadas con tales vectores y un proceso de preparación de tal RANTES truncada en el extremo amino, de la invención, a través del cultivo en medios de cultivo apropiados de dichas células transformadas . La secuencia de ADN que codifica para las proteínas de la invención puede ser insertada y ligada dentro de un plásmido adecuado. Una vez formado, el vector de expresión es introducido dentro de una célula huésped adecuada, la cual luego expresa el o los vectores para producir la proteína deseada. La expresión de cualquiera de las proteínas recombinantes de la invención como se menciona en la presente, puede ser efectuada en células eucarióticas (por ejemplo, células de levadura, de insecto o de mamífero) o células procarióticas, utilizando los vectores de expresión apropiados. Puede ser empleado cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las moléculas de ADN que codifican para las proteínas obtenidas mediante cualquiera de los métodos anteriores son insertadas en vectores de expresión apropiadamente construidos mediante técnicas bien conocidas en la materia (ver ?ambrook et al, 1989) . El ADNc de doble hebra es enlazado a los vectores plasmídicos mediante adición homopolimérica en la cola o mediante enlace de restricción que involucra el uso de enlazadores de ADN sintético o técnicas de ligadura de extremo romo. Las ADN-ligasas son utilizadas para ligar las moléculas de ADN y la unión o empalme no deseada es evitada mediante el tratamiento con fosfatasa alcalina. Con el fin de ser capaz de expresar la proteína deseada, un vector de expresión debe también comprender secuencias nucleotídicas específicas que contienen información reguladora de la transcripción y de la traducción, enlazada al ADN que codifica para la proteína deseada, de una manera tal como para permitir la expresión de un gen y la producción de la proteína.
Primeramente en el orden para que sea transcrito el gen, éste debe ser precedido por un promotor reconocible por la ARN-polimerasa, a la cual se enlaza la polimerasa y de este modo inicia el proceso de transcripción. Existen una variedad de tales promotores en uso, los cuales funcionan con diferentes eficiencias (promotores fuertes y débiles) . Para células eucarióticas, se pueden emplear diferentes secuencias reguladoras de la transcripción y de la traducción, dependiendo de la naturaleza del huésped. Estas pueden ser derivadas de fuentes virales, tales como adenovirus, virus del papiloma bovino, virus Símico o similares, donde las señales reguladoras están asociadas con un gen particular el cual_ tiene un alto nivel de expresión. Los ejemplos son el promotor TK del virus del herpes, el promotor SV40 temprano, el promotor del gen gal4 de levadura, etc. Las señales reguladoras del inicio de la transcripción pueden ser seleccionadas, las cuales permitan la represión y la activación, de modo que pueda ser modulada la expresión de los genes. La molécula de ADN que comprende la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína de la invención está insertada dentro del o los vectores, teniendo las señales reguladoras de la transcripción y de la traducción, operablemente enlazadas, el cual es capaz de integrar las secuencias génicas deseadas dentro de las célula huésped. Las células que han sido establemente transformadas por el ADN introducido pueden ser seleccionadas también mediante la introducción de uno o más marcadores los cuales permiten la selección de las células huésped que contienen el vector de expresión. El marcador puede también proporcionar fototrofía a un huésped auxotrópico, resistencia a biocidas, por ejemplo a antibióticos, o a metales pesados tales como el cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede estar ya sea directamente enlazado a las secuencias génicas de ADN que van a ser expresadas, o introducido dentro de la misma célula mediante cotransfección . Pueden también ser necesarios elementos adicionales para la síntesis óptima de las proteínas de la invención. Los factores de importancia en la selección de un plásmido particular o vector viral incluyen: la facilidad con la cual las células recipientes, que contienen el vector, pueden ser reconocidas y seleccionadas de aquellas células recipientes que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desean en un huésped particular; y si es deseable ser capaz o no de "lanzar" el vector entre las células huésped de diferentes especies. Una vez que el o los vectores o la secuencia de ADN que contiene la o las construcciones han sido preparados para la expresión, la o las construcciones de ADN pueden ser introducidas dentro de una célula huésped apropiada mediante cualquiera de una variedad de medios adecuados: transformación, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, etc. Las células huésped pueden ser ya sea procarióticas o eucarióticas. Los huéspedes preferidos son eucarióticos, por ejemplo, células de mamífero, tales como células humanas, de mono, de ratón y de ovario de hámster Chino (CHO) , debido a que éstas proporcionan modificaciones post-traduccionales a las moléculas de proteina, incluyendo el plegamiento o la glucosilación correcta en los sitios correctos. También, las células de levadura pueden llevar a cabo las modificaciones peptídicas post-traduccionales incluyendo la glucosilación. Existe un número de estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias promotoras fuertes y alto número de copias de plásmidos que pueden ser utilizados para la 1
producción de las proteínas deseadas en levadura. La levadura reconoce la secuencia guía sobre los productos génicos de mamífero, clonados y secreta los péptidos que poseen secuencias guía (por ejemplo, pre-péptidos) . Después de la introducción del o de los vectores, las células huésped son desarrolladas en un medio selectivo, el cual selecciona el desarrollo de las células que contienen el vector. La expresión de la o las secuencias génicas clonadas, da como resultado la producción de las proteínas deseadas. Las MCP-2 truncadas en el extremo amino de la invención pueden ser preparadas mediante cualquier otro procedimiento bien conocido en la técnica, en particular, mediante los procedimientos de síntesis química bien establecidos, utilizando sintetizadores peptídicos en fase sólida, automatizados, seguido por la purificación cromatográfica . Las quimiocinas de la invención pueden, por ejemplo, ser sintetizadas mediante Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonilo) , tBoc (t-butoxicarbonilo) o cualquier otra síntesis química comparable con o sin grupos protectores de cadena lateral, apropiados sobre los diferentes aminoácidos. Los aminoácidos con o sin los grupos protectores de cadena lateral, apropiados, son preactivados , por ejemplo con HBTU/HOBt [hexafluorofosfato de 2- ( lH-benzotriazol-1-il) -1,1,3, 3-tetrametil-uronio/ 1-hidroxibenzotriazol) , y acoplados a la cadena peptídica en crecimiento. Antes de la adición del siguiente residuo, el grupo de protección (por ejemplo Fmoc) es eliminado del grupo a-amino. Después de la síntesis, todos los grupos protectores son eliminados, los péptidos intactos de longitud completa son purificados, y química o enzimáticamente plegados (incluyendo la formación de puentes disulfuro entre las cisteínas) dentro de las quimiocinas correspondientes de la invención. La purificación de las proteínas naturales, sintéticas o recombinantes se lleva a cabo mediante cualquiera de los métodos conocidos para este propósito, por ejemplo, cualquier procedimiento convencional que involucre la extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o similares (ver por ejemplo Proost P. et al., 1996) . Un procedimiento de purificación adicional que puede ser utilizado de preferencia para la purificación de la proteína de la invención es la cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos monoclonales, o afinidad para heparina, los cuales se enlazan a la proteína objetivo y los cuales son producidos e inmovilizados sobre una matriz de gel contenida dentro de una columna. Las preparaciones impuras que contienen las proteínas se hacen pasar a través de la columna. La proteína será enlazada a la columna mediante heparina o mediante el anticuerpo específico, mientras que las impurezas pasarán a través de ésta. Después del lavado, la proteína es eluida a partir del gel mediante un cambio en el pH o en la fuerza iónica. Las MCP-2 truncadas en el extremo amino, de la invención, son útiles en terapia y/o diagnóstico de las enfermedades en las cuales se requiere una actividad antagonista de los efectos de las quimiocinas. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen: enfermedades inflamatorias, enfermedades relacionadas a la angiogénesis y a la hematopoyesis, tumores, enfermedades infecciosas, incluyendo VIH, enfermedades autoinmunes, ateroesclerosis, enfermedades pulmonares y enfermedades de la piel. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de la proteína de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas . El medicamento es presentado preferentemente en la forma de una composición farmacéutica que flechas indican los primeros aminoácidos de la MCP-2 (6-76) truncada en el extremo amino de la invención. Subrayado está el aminoácido, el cual es diferente en la variante MCP-2.
Fiqura 2: SDS-PAGE de MCP-2 (6-76) truncada en el extremo amino: Banda 1: MCP-2 natural (1-76, 100 ng/banda); Banda 2: MCP-2 natural (1-76, 30 ng/banda); Banda 3: MCP-2 natural (6-76, 30 ng/banda); y Banda 4: MCP-2 sintético (1-76, 60 ng/banda); Se corrieron geles bajo condiciones reductoras y las proteínas se tiñeron con plata.
Figura 3 : Esta muestra una comparación de la' potencia quimiotáctica de las formas MCP-2 modificadas. MCP-2 (1-76) natural (nat) y sintética (sint), intactas, MCP-2 (6-76) natural truncada en el extremo NH2 y MCP-2 (1-74) sintética, truncada en el extremo COOH se probaron para la actividad quimiotáctica sobre células THP-1. Los resultados representan la Cl media ± SEM a partir de cuatro o más experimentos independientes.
comprende las proteínas de la invención, junto con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones farmacéuticas forman un aspecto adicional de la presente invención. Una modalidad adicional de la invención es el método para el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas, que comprende el administrar una cantidad farmacológicamente activa de las MCP-2 truncadas en el extremo amino, de la invención, a sujetos en riesgo de desarrollar tales enfermedades, o a sujetos que ya muestran tales patologías . La invención será ahora descrita por medio de los siguientes Ejemplos, los cuales no deben ser considerados de ningún modo como limitantes de la presente invención. Los Ejemplos se referirán a las Figuras especificadas más adelante en la presente.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Esta muestra la secuencia de aminoácidos de MCP-2 y de su variante conocida. Las secuencias de señal son reportadas en i táli cas , mientras que los residuos de C están en negritas. Las Figura 4: MCP-2 natural es un agonista más débil que MCP-l para movilizar el calcio en los monocitos. MCP-2 intacta (15, 50 y 150 ng/ml) incrementa de una manera dependiente de la dosis el [Ca2t]a en las células THP-1. Se muestra el resultado de un experimento representativo de dos.
EJEMPLOS
EJEMPLO 1: MCP-2 truncado en el extremo amino
Ma terial es y métodos Quimi ocina e inmunoensayo
Se sintetizó MCP-2 y se purificó como se describió al principio (Proost P. et al., 1995) . Los anticuerpos anti-MCP-2 humanos específicos, fueron obtenidos de ratones y purificados por afinidad sobre una columna de Sefarosa a la cual se acopló MCP-2 sintética utilizando las condiciones proporcionadas por el fabricante (Sefarosa 4B activada por CNBr, Pharmacia, Uppsala, Suecia) . Las placas de ELISA fueron recubiertas con el anticuerpo anti-MCP-2 humano purificado por afinidad y se utilizó el anticuerpo anti-MCP-2, biotinilado, como el anticuerpo de captura. La detección se realizó con estreptavidina marcada con peroxidasa, y TMB. El límite de detección para la ELISA de MCP-2 fue de aproximadamente 0.1 ng/ml.
Producci ón y purifi caci ón de MCP-2
Las proteínas quimiotácticas de monocitos fueron purificadas a partir de medio condicionado derivado de células mononucleares de sangre periférica, a partir de 132 donaciones sanguíneas obtenidas de los Centros de la Transfusión Sanguínea de Antwerp y Leuven (Proost P. et al., 1996) . Los eritrocitos y los granulocitos fueron removidos mediante sedimentación en hidroxietilalmidón (Fresenius AG, Bad Homburg, Alemania) y por centrifugación en gradiente en una solución de metrizoato de sodio (Ly phoprep; Nyegaard, Oslo Noruega) . Las células mononucleares (60xl09 células) fueron incubadas (5xl06 células/ml) con 10 µg/ml de Con A y 2 µg/ml de LPS. Después de 48 horas a 120 horas, el medio condicionado fue recolectado y mantenido a -20°C hasta la purificación.
MCP-2 natural fue purificada en un procedimiento de purificación de cuatro pasos como se describe previamente (Proost P. et al., 1996) . En resumen, el medio condicionado fue concentrado sobre vidrio de poro controlado o ácido silícico y parcialmente purificado mediante cromatografía de afinidad sobre una columna de heparina-Sefarosa (Pharmacia) . Las fracciones que contienen la inmunorreactividad de MCP-2 fueron además purificadas mediante cromatografía de intercambio catiónico Mono S
(Pharmacia) y eluidas en un gradiente de NaCl a pH
4.0. Las MCP-2 naturales fueron purificadas hasta la homogeneidad a través de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) en una columna C-8 Aquapore RP-300 (Perkin Elmer, Norwalk CT) equilibrada con ácido trifluoroacético (TFA) . Las proteínas fueron eluidas en un gradiente de acetonitrilo .
Caracteri zaci ón bi oquími ca de formas MCP median te SDS-PAGE, análi sis de la secuencia de aminoácidos y espectrometrí a de masa
La pureza de las fracciones de la columna fue examinada mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras sobre geles de Tris/tricina (Proost P. et al., 1996) . Las proteínas fueron teñidas con plata y se utilizaron los siguientes marcadores moleculares relativos (Mr) : OVA {Mr 45,000), anhidrasa carbónica ( Mr 31,000), inhibidor de tripsina de soya (Mr 21,500), ß-lactoglobulina [Mr 18,400), lisozima (Mr 14,400) y aprotinina (Mr 6,500). La secuencia NH2-terminal de las quimiocinas purificadas ' fue determinada mediante degradación de Edman sobre un secuenciador de proteínas 477A/120A de líquido pulsado (Perkin Elmer) con N-metilpiperidina como una base de acoplamiento. Las proteínas bloqueadas fueron escindidas entre Asp y Pro en ácido fórmico al 75% por 50 horas. La digestión con ácido fórmico fue secuenciada sin purificación adicional. El Mr de MCP-2 fue determinado mediante ionización de desorción de láser ayudado por matriz/tiempo de espectrometría de masa en serie
(MALDI/TOF-MS) (Micromas TofSpec, Manchester, UK) . El ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico y el citrocromo C fueron utilizados como la matriz y el estándar interno, respectivamente.
Detección de l a activi dad quimi otáctica
MCP-2 fue probado para su potencia quimiotáctica sobre monocitos recién purificados (2xl06 células/ml) o células THP-1 monocíticas (0.5xl06 células/ml; 2 días después del subcultivo) en la microcámara de Boyden utilizando membranas de policarbonato tratadas con polivinilpirrolidona con tamaño de poro de 5 µm. Las muestras y las células fueron diluidas en HBSS (Life Techologies/Gibco BRL, Paisley, Escocia) suplementadas con 1 mg/ml de albúmina sérica humana
(Cruz Roja de Bélgica) . Después de 2 horas de incubación a 37°C, las células fueron fijadas y teñidas con soluciones de tinción Diff-Quick (Harleco, Gibbstown, NJ) y las células que migraron a través de las membranas fueron contadas microscópicamente en diez campos de inmersión en aceite a una amplificación de 500 X. El índice quimiotáctico (Cl) de una muestra
(triplicados en cada cámara) se calculó como el número de células que migraron hacia la muestra sobre el número de células que migraron al medio control (Van Damme J. et al., 1992) . Para experimentos de desensibilización, las células fueron incubadas con variantes de quimiciona biológicamente inactivas por 10 minutos a 37°C, antes de que éstas fueran agregadas al pozo superior de la microcámara de Boyden. El % de inhibición del Cl fue calculado utilizando el Cl a partir de las células tratadas con HBSS hacia la muestra como un valor de referencia .
Detección de concentraciones intracel ulares de Ca 2 +
Se midieron concentraciones de calcio intracelular ([Ca2+]±) como se describe previamente (Wuyts A. et al., 1997) . Los monocitos purificados o las células THP-1 (107 células/ml) fueron incubadas en Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM, Gibco) + 0.5% de FCS con el indicador fluorescente fura-2 (fura-2/AM 2.5 µM; Molecular Probes Europe BV, Leiden, Holanda) y 0.01% de Pluronic F-127 (Sigma, Saint Louis, MO) . Después de 30 minutos a 37°C las células se lavaron dos veces y se resuspendieron a 106 células/ml en HBSS con Ca2t 1 mM y FCS al 0.1% (amortiguado con Hepes 10 mM/NaOH a pH 7.4) . Las células fueron equilibradas a 37°C por 10 minutos antes de que se midiera la fluorescencia de fura-2 en un espectrofotómetro de luminiscencia LS50B (Perkin Elmer) . Después de la excitación a 340 y 380 nm, la fluorescencia fue detectada a 510 nm. El [Ca2+]? fue calculado a partir de la ecuación de Grynkiewicz (Grynkiewicz et al., 1985) . Con el fin de determinar el Rma? las células fueron Usadas con digitonina 50 µM. Subsecuentemente, el pH fue ajustado a 8.5 con Tris 20 piM y se obtuvo el Rmln mediante la adición de EGTA 10 mM a las células usadas. La Kd utilizada fue de 224 nM. Para los experimentos de desensibilización, los monocitos o las células THP-1 fueron primeramente estimulados con amortiguador, con quimiocina o con antagonista de quimiocina a diferentes concentraciones. Como un segundo estímulo, se utilizó MCP-2 a una concentración que induce un incremento significativo en el [Ca2*]i después de la pre-estimulación con amortiguador. El segundo estímulo fue aplicado 2 minutos después de la adición del primer estímulo. El porcentaje de inhibición del incremento de [Ca2+]?. en respuesta al segundo estímulo fue calculado comparando la señal después de la pre-estimulación con la quimiocina o el antagonista de quimiocina con la señal después de la adición del amortiguador .
Resultados
Ai slami en to de formas MCP-2 post -traducci onalmen te modi icadas
Se utilizó un ensayo de ELISA específico y sensible para rastrear las diferentes formas de MCP-2 por las células mononucleares de sangre periférica estimuladas con mitógeno y endotoxina. El medio condicionado fue purificado de acuerdo a un procedimiento de aislamiento estándar
(Proost P. et al., 1996), incluyendo la absorción a vidrio de poro controlado y cromatografía de heparina- Sefarosa . Subsecuentemente, la purificación mediante cromatografía de intercambio catiónico FPLC mono S se llevó a cabo y luego se aplicó un paso de purificación adicional con RP-HPLC en C-8. Las masas moleculares fueron medidas mediante SDS-PAGE y mediante MALDI/TOF-MS. Se aislaron diferentes formas de MCP-2: además de la MCP-2 (1-76) de 7.5 kDa auténtica, una forma de MCP-2 de 7 kDa truncada en el extremo amino, que carece de los cinco residuos [MCP-2 (6-76)] se purificó hasta la homogeneidad mediante RP-HPLC y se identificó mediante análisis de la secuencia de aminoácidos (Figura 2 ) . MALDI/TOF-MS (Tabla I) produjo una masa molecular de 8881 Da para la MCP-2 intacta (Mr teórico de 8893 Da), mientras que para MCP-2 (6-76) se midió una masa molecular de 8365 Da, confirmando la supresión de los cinco aminoácidos NH2-ter inales (Mr teórica de 8384 Da) . La comparación funcional de estas formas naturales de MCP-2 en el ensayo de quimiotaxis de THP-1 mostró que MCP-2 intacta es todavía activa a 5 ng/ml, mientras que la MCP-2 (6-76) truncada permanece desprovista de actividad quimiotáctica cuando se prueba a un intervalo de concentración de 0.6 a 60 ng/ml (Figura 3) . La MCP-2 natural intacta fue también comparada en potencia con la MCP-2 sintética (1-76) y una forma sintética truncada en el extremo COOH (COOH- terminalmente) (Proost P. et al., 1995) que carecen de los dos residuos [MCP-2 (1-74)].
La concentración quimiotáctica efectiva mínima de estas formas fue también encontrada de 5 ng/ml (Figura 3) . Aunque en los ensayos de quimiotaxis la actividad específica de la MCP-l intacta natural y MCP-2 es comparable (Van Da e J. et al., 1992), la capacidad de movilización de calcio de MCP-2 es todavía un asunto de debate. No obstante, los experimentos de movilización de Ca2+, la dosis efectiva mínima para MCP-2 (1-76) natural o sintética fue 10 veces mayor en comparación a aquella de MCP-l (1-76) intacta natural (Figura 4), mientras MCP-2 (6-76) permaneció inactiva. No obstante, la MCP-2 intacta (50 ng/ml) fue capaz de desensibilizar MCP-2 (15 ng/ml) y MCP-3 (10 ng/ml) produciendo 52% y 45% de inhibición de la quimiotaxis, respectivamente. Debido a esta actividad específica más baja de MCP-2 en ensayos de Ca2+, la desensibilización de quimiotaxis por MCP-2 (6-76) fue realizada en la microcámara de Boyden. Ya que se reporta que MCP-2 intacta desensibiliza cruzadamente con MCP-l, MCP-2 y MCP-3 activas en el ensayo de quimiotaxis de monocitos (Sozzani S. et al., 1994), se investigó si la MCP-2 (6-76) inactiva, natural podría también desensibilizar para MCP-l, MCP-2, MCP-3 y RANTES (Tabla II) . La pre-incubación de las células THP-1 con 10 ng/ml de MCP-2 (6-76) inactiva podría ya inhibir significativamente la quimiotaxis inducida por 10 ng/ml de MCP-l (63%), 5 ng/ml de MCP-2 (75%), 30 ng/ml de MCP-3 (62%) y 100 ng/ml de RANTES (75%) . Además, la quimiotaxis en respuesta a concentraciones tres veces más bajas de las MCPs respectivas fue completamente (91-100%) inhibida por 100 ng/ml de MCP-2 (6-76) . Además, a una concentración tan baja como de 10 ng/ml, MCP-2 (6-76) fue todavía capaz de inhibir significativamente la actividad quimiotáctica inducida por MCP-l (3 ng/ml), MCP-2 (1.5 ng/ml) o MCP-3 (10 ng/ml) y RA?TES (30 ng/ml) . Tomado conjuntamente, MCP-2 (6-76) es producida de manera natural, es inactiva como un quimioatrayente y antagoniza varias quimiocinas C-C, siendo el efecto más predominante para MCP-3.
Tabla I
Caracterización bioquímica de formas naturales de MCP- 2. Análisis de la secuencia de aminoácidos NH2- terminal y comparación de la Mr experimental (SDS-PAGE y MALDI/TOF-MS) y teórica de las isoformas de MCP naturales purificadas por RP-HPLC C-8
Tabla II
MCP-2 (6-76) desensibiliza las respuestas quimiotácticas de monocitos de MCP-l, MCP-2, MCP-3 y RANTES en la microcámara .
MCP-l, MCP-2, MCP-3 o RANTES se agregaron como quimioatrayentes a los pozos inferiores. b los pozos superiores de la microcámara fueron rellenados con células THP-1 pre-incubadas con MCP-2 (6-76) o con amortiguador c media de Cl + SEM de 3 experimentos independientes
REFERENCIAS
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Claims (12)
1. Una MCP-2 truncada en el extremo amino, que carece de los aminoácidos NH2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1, 1-2, 1-3, 1-4 ó 1-5 de la MCP-2 de origen natural y que tiene actividad antagonista de la quimiocina.
2. La MCP-2 truncada amino-terminalmente de conformidad con la reivindicación 1, que carece de los aminoácidos NH2-terminales correspondientes a los residuos de aminoácidos 1-5 de la MCP-2 de origen natural y que tiene una actividad antagonista de la quimiocina .
3. La MCP-2 truncada amino-terminalmente de conformidad con la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO.: 2 o SEQ ID NO. : 4.
4. La MCP-2 truncada amino-terminalmente de conformidad con una o más de las reivindicaciones precedentes, en una forma glucosilada.
5. Las moléculas de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican para la MCP-2 amino-terminalmente truncada de la invención, de conformidad con una o más de las reivindicaciones precedentes, incluyendo las secuencias nucleotídicas sustancialmente iguales.
6. Un vector de expresión que comprende una molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 5.
7. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 5.
8. Un proceso recombinante para la preparación de cualquiera de las proteínas de la reivindicación 1 a 4, que comprende el cultivo, en un medio de cultivo apropiado, de las células de conformidad con la reivindicación 6.
9. Una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para el uso como medicamento.
10. El uso de una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la fabricación de un medicamento para la terapia y/o diagnóstico de enfermedades, en la cual se requiere una actividad antagonista de los efectos de la quimiocina .
11. El uso de conformidad con la reivindicación 10, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, infección por VIH, enfermedades relacionadas a la angiogénesis y a la hematopoyesis, y tumores.
12. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, junto con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables . LISTADO DE SECUENCIAS 1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V. (B) CALLE: 14 JOHN B. GORSIRAWEG (C) CIUDAD: CURAZAO (E) PAÍS: ANTILLAS HOLANDESAS (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : NINGUNO (G) TELEFONO: 599-9-639300 (H) TELEFAX. 599-9-614129 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: MCP-2 TRUNCADAS EN EL EXTREMO AMINO COMO ANTAGONISTAS DE LA QUIMIOCINA ( Í Ü : NUMERO DE SECUENCIAS: 4 (iv) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) NFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 99 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) LOCALI ZAC ION: 1..76 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. : 1: Met Lya Val Ser Ala Ala Lßu Leu Cys Lßu Leu Leu Met Ala Ala Thr -20 -15 -10 Phß Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ser Val Ser lie Pro lie -5 1 5 Thr Cys Cys Phß Asn Val He Asn Arg Lys He Pro lie Gln Arg Leu 10 15 20 25 Glu Ser Tyr Thr Arg He Thr Aan He Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val He Phß Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu 45 50 55 Arg Trp Val Arg Aap Ser Mßt Lys His Leu Asp Gln He Phß Gln Asn 60 ss 70 Leu Lys Pro 75 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 99 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (li) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) LOCALIZACION: 1..76 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Mßt Ala Ala Thr -20 -15 -10 Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gln Pro Asp Ser Val Ser He Pro He -5 1 5 Thr Cys Cys Phe Asn Val He Asn Arg Lys He Pro He Gln Arg Leu 10 15 20 25 Glu Ser Tyr Thr Arg He Thr Asn He Gln Cys Pro Lys Glu Ala Val 30 35 40 He Phe Lys Thr Gln Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala Asp Pro Lys Glu 45 50 55 Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln He Phe Gln Asn 60 65 70 Leu Lya Pro 75 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 71 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 111 HIPOTÉTICO: NO ixi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO.: 3 Ser He Pro He Thr Cys Cys Phe Asn Val He Asn Arg Lys He Pro 1 5 10 15 He Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg He Thr Asn He Gln Cys Pro 20 25 30 Lys Glu Ala Val He Phe Lys Thr Lys Arg Gly Lys Glu Val Cya Ala 35 40 45 sp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln 50 55 60 INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO. : 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 71 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO. 4 Ser He Pro He Thr Cys Cys Phß Asn Val He Asn Arg Lys He Pro 1 5 10 15 He Gln Arg Leu Glu Ser Tyr Thr Arg He Thr Asn He Gln Cys Pro 20 25 30 Lys Glu Ala Val He Phß Lys Thr Gln Arg Gly Lys Glu Val Cys Ala 35 40 45 Asp Pro Lys Glu Arg Trp Val Arg Asp Ser Met Lys His Leu Asp Gln 50 55 60 1/4 MC7-2 MKVS?ALLCL LLMA?TFSPQ GIAQPDSVSI PITCCFNVIN RKIPIQRLES YTRXTNIQCP KEAVIFKTKR GKEVCADPKE RWVRDSMKHL DQIFQNLKP 76 MCP-2 Variante -23 1 i MKVS?ALLCL LLMA?TFSPQ Gi?QPDSVSI PITCCFNVTN RKIPIQRLES YTRITNIQCP KEAVIFgTKR GKEVCADPKE RVRDSMKHL DQIFQNLKP 76 Figura 1
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP97116863 | 1997-09-29 | ||
EP97122471 | 1997-12-19 | ||
EP98104216 | 1998-03-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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MXPA00002880A true MXPA00002880A (es) | 2001-05-07 |
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