JP2001518296A - ケモカインアンタゴニストとしてのアミノ末端切除型mcp−2 - Google Patents
ケモカインアンタゴニストとしてのアミノ末端切除型mcp−2Info
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Abstract
Description
たは1−5に相当するNH2-末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタゴニスト活
性を有するアミノ末端切除型MCP−2、ならびにそれらをコードするcDNA
配列、ケモカイン効果へのアンタゴニスト活性を必要とする疾病の治療および/
または診断でのそれらの使用、およびそれらを含む医薬組成物、に関する。発明の背景 ケモカインは、白血球走化性および活性化の性質と共に、小さい前炎症性サイ
トカインファミリーを構成する。第一のシステインの位置によって、サイトカイ
ンファミリーは、C−C、C−X−CおよびC−X3 −Cケモカインに分けるこ
とができる(Baggiolini M.ら、1994;Baggiolini
M.ら、1997およびTaub D.ら、1996)。
好中球に対して走化性であるが、単球走化性タンパク質−3(MCP−3)(mon
ocyte chemotactic protein-3)の様なC−Cケモカインは、単球、リンパ球、好
酸球、好塩基球、NK細胞および樹状突起細胞を含む、様々な白血球に活性であ
る。
ロセシングは、ケモカインを活性化できる場合もあるが、ケモカインを完全に不
活性化する場合もある。
去後のみ、好中球走化性ペプチド(NAP−2)(neutrophil chemotactic pept
ide)になる(Walz A.ら、1989およびVan Damme J.ら、
1990)。
強化するが、すべての好中球走化性C−X−Cケモカインの最初のCysの前に
位置するGlu−Leu−Argモチーフのさらなる切断は、完全な不活性化の
原因となる。(Clark−Lewis I.ら、1991)。
nulocyte chemotactic protein-2) の同様のNH2-末端のタンパク質分解(最大
で8アミノ酸)は、好中球走化性活性に影響を与えなかった(Proost,P
.ら、1993a)。
3およびRANTESは、単球に不活性であるが、レセプターアンタゴニストと
しては有用である(Gong J.ら、1995およびGong J.ら、19
95)。
が、Met−RANTESは、標準のRANTESのアンタゴニストとして働く
。(Proudfoot A.E.ら、1996)。
lood lymphocytes)(最初はHC14と呼ばれた、Chang,H.C.ら、1 989)から誘導されたcDNAプローブでの差異ライブラリースクリーニング
によって単離された。cDNA−誘導タンパク質は、精製された天然のそれと同
一であったが、Gln46がLys46で置換された推定アレレ変異体もまた、
単離された(Van Coillieら、1997)。
P.ら、1995)。発明の説明 本発明の主な目的は、天然発生MCP−2のアミノ酸残基1、1−2、1−3
、1−4または1−5に相当するNH2-末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタ
ゴニスト活性を有する、アミノ末端切除型MCP−2である。
4に示す、1−5のNH2-末端のアミノ酸を欠くMCP−2である、MCP−2
(6−76)である。
とも、または非グリコシル化型であることもできる。
に対してアンタゴニストとして作用する」ことを意味する。
るDNA配列を含むDNA分子であって、実質的に同一のヌクレオチド配列を含
む前記DNA配列である。
られたアミノ酸配列をコードするその他のすべての核酸配列を含む。
トランスフォームされた宿主細胞、および、上記の形質転換細胞の適当な培養基
内での培養を通して本発明のそのようなアミノ末端切除型MCP−2を調製する
方法、を含む。
連結することができる。できあがったならば、発現ベクターを適当な宿主細胞内
に導入し、次にベクター(類)を発現させ、所望のタンパク質を得ることができ
る。
現ベクターを用いて、真核生物細胞(例えば酵母、昆虫または哺乳動物細胞)ま
たは原核生物細胞内で達成することができる。この技術分野で既知の任意の方法
を用いることができる。
子を、この技術分野で周知の技術によって、適当に構築された発現ベクター内に
挿入する(Sambrookら、1989を参照のこと)。二本鎖cDNAを、
ホモポリマーテイリングによって、または合成DNAリンカーまたはブラントエ
ンド連結反応技術を含む制限連結法によって、プラスミドベクターに連結し:D
NAリガーゼを用いて、DNA分子を連結し、非所望の結合をアルカリホスファ
ターゼ処理により除去する。
の発現およびタンパク質の生成を許すような方法で所望のタンパク質をコードす
るDNAと連結した翻訳および翻訳調節情報を含む特異的ヌクレオチド配列も含
まねばならない。最初に、遺伝子が転写されるためには、RNAポリメラーゼに
よって認識されうるプロモーターが先行しなければならず、それにポリメラーゼ
が結合し、それによって転写プロセスが開始される。用いられるそのようなプロ
モーターは様々であり、異なる効率(強いプロモーターおよび弱いプロモーター
)で働く。
いることができる。それらは、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サル
ウイルスまたはその類似ウイルス等のような、ウイルス源より誘導することがで
き、その中の調節シグナルは、高レベルで発現する特定の遺伝子と関連している
。例として、ヘルペスウイルスのTKプロモーター、SV40早期プロモーター
、酵母gal4遺伝子プロモーター等があげられる。抑制および活性化を可能に
する、転写開始調節シグナルを選択することができ、そうすることによって遺伝
子の発現を調節することができる。
し得るように連結された転写および翻訳調節シグナルを持ち、宿主細胞に所望の
遺伝子配列を組み込む能力を持つ、ベクター内に挿入する。
ーを含む宿主細胞の選択を可能にする一つ以上のマーカーを導入することによっ
て、選択することができる。また、マーカーは、独立栄養宿主への光栄養性、生
命破壊耐性、例えば抗生物質あるいは銅のような重金属、またはその類似物を提
供することができる。選択可能マーカー遺伝子を、発現されるDNA遺伝子配列
に直接連結させるか、または同時トランスフェクションにより同一細胞内に導入
することができる。さらなるエレメントもまた、本発明のタンパク質の最適な合
成に必要とされるであろう。
を含むレシピエント細胞を、ベクターを含まないそのようなレシピエント細胞か
ら識別し選択できる平易さ;特異的宿主に望ましいベクターのコピー数;および
、異なる種の宿主細胞間をベクターがシャトルできることが望ましいか否か:が
含まれる。
製されると、DNA構築物(類)を、任意の様々な適当な方法:トランスフォー
メーション、トランスフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポ
レーション、リン酸カルシウム沈殿、直接ミクロインジェクション等;によって
、適当な宿主細胞内に導入することができる。
り畳み又は正しい位置でのグリコシル化を含む翻訳後修飾をタンパク質分子に提
供するためには、真核生物宿主、例えば、ヒト、サル、マウスおよびチャイニー
ズハムスター卵巣(CHO)細胞のような哺乳動物細胞が好ましい。酵母細胞も
また、グリコシル化を含む翻訳後ペプチド修飾を遂行することができる。酵母内
での所望のタンパク質の生成に利用することのできる、強力なプロモーター配列
および高いコピー数のプラスミドを利用する、数多くの組換えDNAストラテジ
ーが存在する。酵母は、クローン化された哺乳動物遺伝子生成物上のリーダー配
列を認識し、リーダー配列を持つペプチド(即ちプレペプチド)を分泌する。
の増殖について選択する。クローン化された遺伝子配列(類)の発現は、結果と
して、所望のタンパク質を生成する。
方法によって、特に、自動固相ペプチドシンセサイザー、次にクロマトグラフ精
製を用いる、良く確立された化学合成方法によって調製することができる。
ニル)、tBoc(t−ブトキシカルボニル)、または、異なるアミノ酸上に適
当な側鎖保護基を持つ或いは持たない、任意のその他の類似の化学合成法によっ
ても、合成することができる。適当な側鎖保護基を持つまたは持たないアミノ酸
を、例えばHBTU/HOBt[2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)
−1,1,3,3−テトラメチル−ウロミウム ヘキサフルオロホスフェート/
1−ヒドロキシベンゾチアゾール)−で、前活性化し、成長するペプチド鎖に結
合する。次の残基を加える前に、保護基(例えばFmoc)をα−アミノ基から
除去する。合成後、すべての保護基を除去し、完全な全長ペプチドを精製し、本
発明の相当するケモカインに化学的または酵素的に折り畳まれる(その中にはシ
ステイン間のジスルフィド架橋の形成が含まれる)。
の方法、即ち、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、電気泳動、またはその類似法
(例えばProost P.ら、1996を参照のこと)を含む任意の慣用的方
法、によって遂行される。本発明のタンパク質を精製するため優先的に用いるこ
とのできるさらなる精製方法は、標的タンパク質と結合する、および生成されて
カラム内に含まれるゲルマトリックス上に固定化される、モノクローナル抗体ま
たはヘパリンアフィニティーを用いるアフィニティークロマトグラフィーである
。タンパク質を含む不純な調製物をカラムに通す。タンパク質は、ヘパリンによ
って、または特異的抗体によって、カラムに結合されるが、不純物は通過するで
あろう。洗浄後、pHまたはイオン強度を変化させることにより、タンパク質を
ゲルから溶出する。
性を必要とする、疾病の治療および/または診断に有用である。そのような疾病
の例として、炎症性疾患、脈管形成−および造血−関連疾患、腫瘍、HIVを含
む感染症、自己免疫病、アテローム性動脈硬化症、肺動脈疾患、および皮膚障害
、 ;が含まれる。
の本発明のタンパク質の使用を提供する。
のキャリヤーおよび/または賦形剤と共に含む、医薬組成物の形で存在する。そ
のような医薬組成物は、本発明のさらなる態様を形成する。
たはそのような病理を既に示している患者に、薬理学的に活性な量の本発明のア
ミノ末端切除型MCP−2を投与することを含む、上記の疾病の治療方法である
。
発明を制限するものとして解釈すべきではない。実施例は以下に示す図に言及す
ることになる。実施例 実施例1:アミノ末端切除型MCP−2 材料および方法 ケモカインおよびイムノアッセイ 以前に報告されている方法(Proost,P.ら、1995)に従って、M
CP−2を合成し精製した。
た条件を用いて、合成MCP−2を結合させたSepharoseカラム(CN
Br活性化Sepharose4B、Pharmacia,Uppsala,S
weden)上で、アフィニティー精製した。
ビオチニル化抗MCP−2を捕獲用Abとして用いた。ペルオキシダーゼ標識化
ストレプタビジンおよびTMBで検出した。MCP−2 ELISAの検出限界
は、約0.1ng/mlであった。MCP−2の生成および精製 単球走化性タンパク質を、Blood Transfusion Cente
rs of Antwerp and Leuvenから得られた132の血液
寄贈品から、末梢血液単核細胞誘導順化培地から、精製した(Proost,P
.ら、1996)。
G,Bad Homburg,Germany)沈降、およびメトリゾエートナ
トリウム溶液(Lymphoprep;Nyegaard,Oslo Norw
ay)の勾配遠心分離により、除去した。
mlのLPSと共にインキュベートをインキュベートした(5x106 細胞/m
l)。48から120時間後、順化培地を集め、精製するまで−20゜Cに保っ
た。
、1996)。
)またはケイ酸で濃縮し、ヘパリン−Sepharoseカラム(Pharma cia)のアフィニティクロマトグラフィーによって部分精製した。
acia)カチオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製し、pH4.0の
NaCl勾配で溶出した。
Aquapore RP−300カラム(Perkin Elmer,Nor
walk CT)のRP−HPLCを通して、均一になるまで精製した。タンパ
ク質をアセトニトリル勾配で溶出した。SDS−PAGE、アミノ酸配列分析およびマススペクトロメトリーによる、M CP型の生化学的性質決定 カラムフラクションの純度を、還元条件下、トリス/トリシンゲルのSDS−
PAGEによって試験した(Proost P.ら、1996)。タンパク質を
銀染色し、以下の比較分子(Mr)マーカー:OVA(Mr45,000)、カ
ルボニックアンヒドラーゼ(Mr31,000)、大豆トリプシンインヒビター
(Mr21,500)、β−ラクトブロブリン(Mr18,400)、リソザイ
ム(Mr14,400)およびアプロチニン(Mr6,500):を用いた。
用いて、パルス液体477A/120Aタンパク質シークエンサー(Perki
n Elmer)でエドマン分解して、決定された。ブロックされたタンパク質
を、75%ギ酸で50時間、AspとProの間で切断した。ギ酸消化物は、さ
らに精製することなく配列決定した。
行時間型マススペクトロメトリー(MALDI/TOF−MS)(matrix-assist
ed laser desorption ionization/time of flight-mass spectrometry)(Mic
romass Tof Spec,Manchester,UK)によって決定
した。α−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸およびシトクロムCを、それぞれマ
トリックスおよび内部標準として用いた。走化性活性の検出 5μmポアサイズのポリビニルピロリドン処理ポリカルボネート膜を用いたB
oydenミクロチャンバー内で、新たに精製した単球(2x106 細胞/ml
)または単球THP−1細胞(0.5x106 細胞/ml;継代培養後2日)へ
のその走化性能力について、MCP−2を試験した。
を追加したHBSS(Life technologies/Gibco BR
L,Paisley,Scotland)で、サンプルおよび細胞を希釈した。
37゜Cで2時間インキュベーションした後、細胞を、Diff−Quick染
色溶液(Harleco,Gibbstown,NJ)で固定染色し、膜を通し
て移動した細胞を、10倍の油浸場内、500倍拡大の顕微鏡で計数した。
で3通り)は、[サンプルに移動する細胞数]/[対照培地に移動する細胞数]
として計算された(Van Damme J.ら、1992)。
で10分間インキュベートし、その後、Boydenミクロチャンバーの上方の
穴に細胞を加えた。参考値としてサンプルに対するHBSS処理細胞からのCI
を用いて、CIの%阻害を計算した。細胞内Ca2+濃度の検出 細胞内カルシウム濃度([Ca2+]i )を、前記の方法に従って、測定した(
Wuyts A.ら、1997)。精製された単球またはTHP−1細胞(10 7 細胞/ml)を、経口指示薬fura−2(fura−2/AM 2.5μM
;Molecular Probes Europe BV,Leiden,T
he Netherlands)および0.01%のPluronic F−1
27(Sigma,St Louis MO)を含むイーグルの最少必須培地(
EMEM,Gibco)+0.5% FCS内でインキュベートした。
CS(10mM Hepes/NaOHでpH7.4に緩衝化)を含むHBSS
中に106 細胞/mlになるように再縣濁した。細胞を37゜Cで10分間平衡
化した後、fura−2蛍光をLS50B発光分光光度計(Perkin El
mer)で測定した。
a2+]i を、Grynkiewicz方程式から計算した(Grynkiewi
czら、1985)。Rmax を測定するため、細胞50μMジギトニンで溶解し
た。次に、20mM TrisでpHを8.5に調整し、溶解細胞に10mM
EGTAを加えることによって、Rmin を得た。用いられたKd は224nMで
あった。
ー、ケモカインまたはケモカインアンタゴニストで刺激した。第二の刺激として
、バッファーで前刺激した後、[Ca2+]i の有意の増加を誘導する濃度で、M
CP−2を用いた。第二の刺激を、第一の刺激付加2分後に適用した。第二の刺
激に応答する[Ca2+]i 増加阻害率(%)は、ケモカインまたはケモカインア
ンタゴニストでの前刺激後のシグナルをバッファー付加後のシグナルと比較して
、計算した。結果 翻訳後修飾型MCP−2の単離 特異的感受性ELISAを用いて、マイトジェンおよびエンドトキシンで刺激
された末梢血液単球細胞によって生成された異なる型のMCP−2を追跡した。
oseクロマトグラフィーを含む標準単離法(Proost P.ら、1996
)に従って、精製した。
いで、C−8 RP HPLCのさらなる精製段階を適用した。SDS−PAG
Eによって、およびMALDI/TOF−MSによって、分子質量を測定した。
1−76)に加えて、5残基を欠くNH2-末端切除型7kDa型のMCP−2[
MCP−2(6−76)]をRP−HPLCにより均一になるまで精製し、アミ
ノ酸配列分析によって同定した(図2)。MALDI/TOS−MS(表I)で
は、完全なMCP−2(理論的にはMr8893Da)の分子質量が8881D
aと得られたが、これに対して、MCP−2(6−76)の分子質量は8365
Daと測定され、5つのNH2-末端アミノ酸の欠損が確認された(理論的にはM
r8384Da)。THP−1走化性アッセイでのこれらの天然MCP−2の機
能的比較から、完全なMCP−2は5mg/mlでも未だ活性であるが、切除型
MCP−2(6−76)は、0.6−60ng/mlの濃度範囲で試験した場合
も、走化性活性は欠けた状態のままであることが示された(図3)。また、完全
な天然MCP−2を、合成MCP−2(1−76)および2つの残基を欠くCO
OH−末端切除型合成形[MCP−2(1−74)](Proost P.ら、
1995)とも、機能性について比較した。
3)。走化性アッセイでは、天然の完全なMCP−1とMCP−2の比活性は比
較できる(Van Damme J.ら、1992)が、MCP−2のカルシウ
ム移動能力については、未だ検討事項のままである。
6)の両方の最小有効投与量は、天然の完全なMCP−1(1−76)のそれ(
図4)と比較して10倍高いが、これに対してMCP−2(6−76)は不活性
のままである。
15ng/ml)およびMCP−3(10ng/ml)を脱感作する能力を持ち
、それぞれ走化性の52%および45%を阻害した。
6)による走化性の脱感作を、Boydenミクロチャンバーで行った。完全な
MCP−2は、単球走化性アッセイで活性なMCP−1、MCP−2およびMC
P−3と交互脱感作すると報告されている(Sozzani S.ら、1994
)ので、我々は、天然の不活性MCP−2(6−76)が、MCP−1、MCP
−2、MCP−3およびRANTESについて脱感作できるか否かについて、研
究した(表II)。100ng/mlの不活性MCP−2(6−76)を含むTH
P−1細胞のプレインキュベーションは、10ng/mlのMCP−1(63%
)、5ng/mlのMCP−2(75%)、30ng/mlのMCP−3(62
%)および100ng/mlのRANTES(75%)で誘導された走化性を有
意に阻害することができた。その上、それぞれのMCPsより3倍低い濃度での
走化性は、100ng/mlのMCP−2(7−76)によって完全に(91−
100%)阻害された。さらに、10ng/ml程の低さの濃度でも、未だ、M
CP−2(6−76)は、MCP−1(3ng/ml)、MCP−2(1.5n
g/ml)またはMCP−3(10ng/ml)およびRANTES(30ng
/ml)によって誘導された走化性活性を有意に阻害することができる。まとめ
ると、MCP−2(6−76)は、天然でも生成され、化学誘引物質として不活
性であり、様々なC−Cケモカインをアンタゴナイズし、その効果はMCP−3
に対して最も顕著であった。
列をイタリック体で、C−末端を太字で示している。矢印は、本発明のアミノ末
端切除型MCP−2(6−76)の最初のアミノ酸を示している。下線は、MC
P−2変異体で異なるアミノ酸である。
合成(syn)のMCP−2、NH2-末端切除型天然MCP−2(6−76)お
よびCOOH−末端切除型合成MCP−2(1−74)を、THP−1細胞上の
走化性活性について試験した。結果は、4回以上の独立実験からの平均CI±S
EMで表す。
を可動する。完全なMCP−2(15、50および150ng/ml)は、投与
量に依存してTHP−1細胞内の[Ca2+]i を増加する。二回の実験からの一
回の典型的な実験結果を示している。
Claims (12)
- 【請求項1】 天然発生MCP−2のアミノ酸末端1、1−2、1−3、1
−4または1−5に相当するNH2-末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタゴニ
スト活性を有する、アミノ末端切除型MCP−2 - 【請求項2】 天然発生MCP−2のアミノ酸末端1−5に相当するNH2-
末端アミノ酸を欠き、ケモカインアンタゴニスト活性を有する、請求項1記載の
アミノ末端切除型MCP−2 - 【請求項3】 配列番号3または配列番号4のアミノ酸配列を持つ、請求項
1記載のアミノ末端切除型MCP−2。 - 【請求項4】 一つ以上の前記請求項のいずれか一項に記載の、グリコシル
化型のアミノ末端切除型MCP−2。 - 【請求項5】 実質上同一のヌクレオチド配列を含む、一つ以上の前記請求
項のいずれか一項に記載の本発明のアミノ末端切除型MCP−2をコードするD
NA配列を含むDNA分子。 - 【請求項6】 任意の請求項5記載のDNA分子を含む発現ベクター。
- 【請求項7】 請求項5記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 【請求項8】 請求項6記載の細胞を適当な培養基内で培養することを含む
、請求項1から4のいずれか一項に記載の任意のタンパク質を調製するための組
換え方法。 - 【請求項9】 薬として用いるための、請求項1から4のいずれか一項に記
載のタンパク質。 - 【請求項10】 ケモカイン効果へのアンタゴニスト活性を必要とする、疾
病を治療および/または診断するための薬剤製造における、請求項1から4のい
ずれか一項に記載のタンパク質の使用。 - 【請求項11】 炎症性疾病、HIV−感染、脈管形成−および造血−関連
疾病ならびに腫瘍を治療するための薬剤製造における、請求項10記載のタンパ
ク質の使用。 - 【請求項12】 一つ以上の医薬として許容しうるキャリヤーおよび/また
は賦形剤と共に請求項1から4のいずれか一項に記載のタンパク質を含む、医薬
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