UA73081C2 - Amino-terminally truncated mcp-2 as chemokine antagonists - Google Patents

Description

Опис винаходу

Цей винахід стосується вкорочених на аміно-кінці МСР-2, у яких відсутні МН 2-кінцеві амінокислоти, що відповідають амінокислотним залишкам 1, 1-2, 1-3, 1-4 або 1-5 природного МОР-2, і які мають антагоністичну активність проти хемокінів; а також кКДНК-послідовностей, що кодують такі МОР-2, їх застосування для лікування мМабо діагностики захворювань, при яких потрібна антагоністична активність проти дії хемокінів. і фармацевтичних композицій, що містять вказані МСР-2.

Хемокіни - це родина малих про-запальних цитокінів, що мають властивості, які стимулюють хемотаксис і 70 активацію лейкоцитів. В залежності від положення перших цистеїнів, ця родина хемокінів може бути розділена на

Сб-сб-, б-Х-С- і С-Хз С-хемокіни (Ваддіоїїпі М. еї аї., 1994; Ваоддіоїїпі М. еї: її., 1997 і Таць 0. ега!., 1996).

Багато С-Х-С-хемокінів, такі, як інтерлейкін-8 (І/-8) є чинниками, що викликають хемотаксис нейтрофілів, тоді як С-С-хемокіни, такі, як моноцитарний хемотаксичний білок-3 (МСР-3), є активними стосовно ряду лейкоцитів, включно з моноцитами, лімфоцитами, еозинофілами, базофілами, МК-клітинами і дендритними 79 клітинами.

МНе»-кінцевий домен хемокінів, що бере участь у зв'язуванні з рецептором і МН о-кінцевому процесинзі, може або активувати хемокіни, або робити хемокіни повністю неактивними.

Основний тромбоцитарний білок С-Х-С-хемокіну стає хемотаксичним пептидом для нейтрофілів (МАР-2) тільки після видалення 24 МНо-кінцевих залишків (УМаї: А. еї а!ї., 1989 і Мап ОСатте .). еї аі., 1990).

Делеція аж до 8 МН о-кінцевих залишків в І/-8 приводить до збільшення хемотаксичної активності, але додаткове відщепчення мотиву СіШ-Їеи-Аг9о, що розташований перед першим Суз у всіх нейтрофільних хемотаксичних С-Х-С-. хемокінах, приводить до їх повної інактивації (Сіагк-І еміз І. еї аї., 1991).

Аналогічний МНз-кінцевий протеоліз (аж до 8 амінокислот) іншого С-Х-С-хемокіну, гранулоцитарного хемотаксичного протеїиу-2 (ЗСР-2), не справляє впливу на хемотаксичну активність нейтрофілів (Ргоові Р. еї с а1., 1993а). о

Синтетичні С-С-хемокіни МСОСР-1, МСР-З і КАМТЕ5З, у яких відсутні 8-9 МН о-кінцевих амінокислот, є неактивними стосовно моноцитів і можуть бути використані як антагоністи рецепторів (Сопад 4). еї аї., 1996; і бопа .. еї аї,, 1995).

Подовження КАМТЕ5 на один метионін приводить до повної інактивації молекули, і Ме-КАМТЕЗ починає - діяти як антагоніст для автентичного КАМТЕЗ (РгоцагооіА.Е. ейа!., 1996). с

Клон людського МСР-2 (моноцитарний хємотаксичний білок-2) був виділений шляхом диференціального скринінгу бібліотеки кКДНК-зондами, що походять від стимульованих, але не таких, що перебувають у спокої, о лімфоцитів периферійної крові (ЛІК) (раніше називаних "НС14", Снапд Н.С. еї аї.. 1989). Послідовність білка, се що походить від кДНК, була ідерггачна послідовності очищеного природного МСР-2; однак був також виділений 3о передбачуваний алільний варіант, в якому І уз 46 був замінений на біп 46 (Мап Соїйне еї а!., 1997) в

МСР-2 був також синтезований методом твердофазного хімічного синтезу (Ргоозі Р. еї аї., 1995).

Головною метою цього винаходу є одержання вкорочених на аміно-кінці МСР-2, у яких відсутні МН »-кінцеві амінокислоти, що відповідають амінокислотним залишкам 1, 1-2, 1-3, 1-4 або 1-5 природного МОР-2 і які мають « антагоністичну активність проти хемокінів. З 50 Конкретніше, однією з цілей цього винаходу є одержання МСОСР-2 (6-76), у якого відсутні 1-5 1ЧН »-кінцеві с амінокислоти, як показано на Фіг. 1 і в БЕО ІЮО Мо: З або 5ЕО ІЮ Мо:4.

Із» Такий вкорочений на аміно-кінці МСР-2 цього винаходу може бути присутнім в глікозилованій або в неглікозилованій формі.

Термін "антагоніст хемокінів" означає "антагоніст, що справляє антагоністичну дію назрілі повнорозмірні природніхемокіни". це. Іншою метою цього винаходу є одержання ДНК-молекул, що містять ДНК-послідовності, які кодують оз вкорочений на аміно-кінці МСР-2 цього винаходу, включно з нуклеотидними послідовностями, які кодують в основному той самий МСР-2. о Термін "нуклеотидні послідовності, що кодують в основному той самий МОР-2" означає всі інші нуклеотидні о 20 послідовності, які, внаслідок виродженості генетичного коду, також кодують дані амінокислотні послідовності. що Цей винахід також стосується експресуючих векторів, що містять вищевказані ДНК; клітин-хазяїв, трансформованих такими векторами; і способу одержання вказаних вкорочених на аміно-кінці МСР-2 цього винаходу шляхом культивування зазначених трансформованих клітин у відповідних культуральних середовищах. 52 ДНК-послідовність, що кодує білки цього винаходу, може бути вбудована і лігована у відповідну плазміду.

ГФ) Після її продукування експресуючий вектор вводять до відповідної клітини-хазяїна, яка потім експресує вектор(и) з одержанням потрібного білка. о Експресія будь-якого рекомбінантного білка цього винаходу, що згадується в даному описі, може бути здійснена в еукаріотичних клітинах (наприклад, в клітинах дріжджів, комах або ссавців), або в прокаріотичних 60 клітинах з використанням відповідних експресуючих векторів. В цих цілях може бути використаний будь-який метод, відомий фахівцям.

Наприклад, ДНК-молекули, кодуючі білки, отримані будь-яким з вищевказаних методів, вбудовують у відповідним чином сконструйовані експресуючі вектори способами, добре відомими фахівцям (див. Затьгоок еї аІ.,, 1989). Дволанцюгову КДНК зшивають з плазмідними векторами шляхом гомополімерного нарощування або бо шляхом рестрикційного лі гупання, включно з методами з використанням синтетичних ДНК-лінкерів або методами лігування на тупих кінцях, тобто для лігування ДНК-молекул використовують ДНК-лігази, а небажаному зв'язуванню запобігають шляхом обробки лужною фосфатазою.

Для експресії потрібного білка експресуючий вектор повинен також мати в своєму складі специфічні нуклеотидні послідовності, що містять транскрипційні і трансляційні регуляторні елементи, приєднані до ДНК, що кодує потрібний білок таким чином, щоб забезпечувалась експресія гена і продукування білка. Спочатку для того, щоб відбувалася транскрипція гена, необхідно, щоб йому передував промотор, який розпізнається

РНК-полімеразою і з яким зв'язується ця полімераза, що таким чином приводить до ініціації процесу транскрипції. Існує ряд придатних для використання промоторів, що діють з різною ефективністю (сильні і 70 слабкі промотори).

Для еукаріотичних хазяїв можуть бути використані різні транскрипційні і трансляційні регуляторні послідовності, в залежності від виду хазяїна. Вони можуть бути отримані з вірусних джерел, таких, як аденовірус, вірус коров'ячої папіломи, мавп'ячий вірус тощо, де вказані регуляторні сигніши асоційовані з конкретним геном, що має високий рівень експресії. В якості прикладів можуть служити промотор ТК вірусу /5 Герпеса, ранній промотор 5М40, промотор гена да! 4 дріжджів і т.п. Можуть бути обрані регуляторні сигнали ініціації транскрипції, що забезпечують пригнічення й активацію так, щоб експресія генів могла бути модульована.

ДНК-молекулу, що містить нуклеотидну послідовність, яка кодує білок цього винаходу, вбудовують у вектор(и), що містить(ять) правильно приєднані сигнали регуляції транскрипції і трансляції, і здатний(і) 2о інтегрувати потрібні генні послідовності в клітину-хазяїна.

Клітини, що були стабільно трансформовані введеною ДНК, можуть бути відібрані за допомогою введення одного або кількох маркерів, що дозволяють проводити відбір клітин-хазяїв, які містять цей експресуючий вектор. Зазначений маркер може також наділяти ауксотрофного хазяїна фототрофією, резистентністю до біоцидів, наприклад, до антибіотиків, або до важких металів, таких, як мідь і т.п. Ген селективного маркера сч ов Може бути безпосередньо приєднаний до ДНК-послідовності експресованого гена або введений у ту ж саму клітину шляхом котрансфекції. Для оптимального синтезу білків цього винаходу можуть бути також використані і) додаткові елементи.

Важливими чинниками при доборі конкретного плазмідного або вірусного вектора є легкість, з якою клітини-реципієнти, що містять зазначений вектор, мажуть бути ідентифіковані і відділені від тих «- зо Клітин-реципієнтів, що не містять зазначеного вектора; число копій вектора, що повинно бути присутнім в даному хазяїні; і вимоги до здатності даного вектора резплікуватись в клітинах-хазяях різних видів. со

Після одержання вектора(ів) або ДНК-послідовності, що містить конструкцію(ї), призначену(і) для о експресії, ця ДНК-конструкція(ї) може(уть) бути введенаїй(і) у відповідну клітину-хазяїна різними відповідними методами, такими, як трансформація, трансфекція, кон'югування, злиття протопластів, електропорація, ме) преципітація фосфатом кальцію, пряма мікроін'єкція і т.п. ї-

Клітини-хазяї можуть бути прокаріотичними або еукаріотичними. Перевагу слід надавати еукаріотичним хазяям, наприклад, клітинам ссавців, таким, як клітини людини, мавпи, миші і клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО), оскільки вони дозволяють вносити поет-транеляційні модифікації в молекули білка, включно з відповідним укладанням або глікозилуванням в потрібних сайтах. Дріжджові клітини також можуть вносити « пост-трансляційні пептидні модифікації, включно з глікозилуванням. Існує ряд технологій рекомбінантних ДНК, з с де використовуються послідовності сильних промоторів і висококопійне число плазмід, що можуть бути використані для продукування потрібних білків в дріжджах. Дріжджі розпізнають лідерні послідовності на ;» клонованих продуктах генів ссавців і секретутоть пептиди, що несуть лідерні послідовності (тобто, пре-пептиди).

Після введення зазначеного(их) вектора(ів) клітини-хазяї культивують в селективному середовищі, що забезпечує селективний ріст клітин, які містять вектори. Експресія клонованої(их) генної(их) -І послідовності(ей) приводить до продукування потрібних білків.

Вкорочений на аміно-кінці МСР-2 цього винаходу може бути отриманий будь-якими іншими добре відомими о методами, і, зокрема, добре розробленими методами хімічного синтезу з використанням автоматичних о синтезаторів для твердофазного пептидного синтезу з наступною хроматографічною очисткою.

Хемокіни цього винаходу можуть бути, наприклад, синтезовані з використанням груп Етос со (9-флуоренілметовсикарбошлу) і Ї-«Вос (т-бутоксикарбонілу), або будь-яким іншим аналогічним методом хімічного

Кк синтезу з використанням або без використання відповідних бокових захисних груп на різних амінокислотах.

Амінокислоти з відповідними боковими захисними групами, або без них, попередньо активують, наприклад, групами н в тОшнОВві (2-Ін-бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію гексафторфосфат/1-гідроксибензотриазол)), і приєднують до зростаючого пептидного ланцюга. Перед додаванням наступного залишку захисну групу (наприклад, Етос) віддеплюють від ф-аміно-групи. Після іФ) синтезу усі захисні групи видаляють, інтактні повнорозмірні пептиди очищають і хімічно або ферментативно ко укладають (зокрема, з утворенням дисульфідних місточків між цистеїнами) з одержанням відповідних хемокінів цього винаходу. во Очистку природних, синтетичних або рекомбінантних білків здійснюють будь-яким з добре відомих методів, використовуваних дія цих цілей, тобто будь-яким стандартним методом, зокрема методами екстракції, преципітації, хроматографії, електрофорезу і т.п. (див., наприклад, Ргоові еї аї., 1996). Додатковою процедурою очищення, якій варто надати перевагу для очищення білка цього винаходу, є афінна хроматографія з використанням моноклональних антитіл або афінності до гепарину, де вказані антитіла або гепарин зв'язуються б5 З цільовим білком, і де їх продукують та імобілізують на гелевій матриці, що знаходиться в колонці.

Препарати, що містять білки з домішками, пропускають через колонку. Цей білок зв'язується з колонкою за допомогою гепарину або за допомогою специфічного антитіла, а домішки проходять через колонку. Після промивання білок елюють з гелю шляхом зміни рН або іонної сили.

Вкорочені на аміно-кінці МСР-2 цього винаходу можуть бути використані для лікування і/або діагностики захворювань, при яких потрібна антагоністична активність проти дії хемокінів. Прикладами таких захворювань є: запальні захворювання; захворювання, асоційовані з ангіогенезом і гемопоезом; пухлини; інфекційні захворювання, зокрема ВІЛ-інфекціл, аутоїмунні захворювання, атеросклероз, легеневі захворювання і шкірні хвороби.

Тому, в іншому своєму аспекті, цей винахід стосується застосування білка цього винаходу для виготовлення 7/0 лікарського засобу для лікування вищезгаданих захворювань.

Перевагу слід надати виготовленню лікарського засобу в формі фармацевтичної композиції, що містить білки цього винаходу в поєднанні з одним або кількома фармацевтично прийнятними носіями і/або наповнювачами.

Такі фармацевтичні композиції входять до ще одного аспекту цього винаходу.

Іншим варіантом здійснення цього винаходу с спосіб лікування вищезгаданих захворювань, що передбачає /5 введення фармакологічно активної кількості вкорочених по аміно-кінці МСР-2 цього винаходу пацієнтам з ризиком розвитку таких захворювань або пацієнтам, у котрих уже є зазначені патології.

Цей винахід описаний в нижченаведених прикладах, що не повинні розглядатися як певне обмеження цього винаходу. Нижче подано конкретний опис креслень.

На Фіг.1 показана амінокислотна послідовність МОСР-2 і його відомий варіант. Сигнальні послідовності 2о зазначені курсивом, а С-залишки зазначені жирним шрифтом. Стрілками показані перші амінокислоти вкороченого на аміно-кінці МСР-2(6-76) цього винаходу. Амінокислота, що відрізняється у варіанті МОСР-2, підкреслена.

На Фіг.2 проілюстровано електрофорез у ПААГ з ДСН вкороченого на аміно-кінці МСР-2(6-76):

Доріжка 1: природний МСР-2 (1-76, 10Онг/доріжку); сч

Доріжка 2: природний МСР-2 (1-76, ЗОнг/доріжку);

Доріжка 3: природний МСОСР-2 (6-76, ЗОнг/доріжку); і і)

Доріжка 4: синтетичний МСР-2 (1-76, бОонг/доріжку). Гелі пропускали у відновлювальних умовах і білки забарвлювали сріблом.

На Фіг.З показано порівняння хемотаксичної здатності модифікованих форм МОР-2. Інтактний природний (паї -" де зо і синтетичний (зуп) МСР-2 (1-76), вкорочений на МНо-кінці природний МОР-2(6-76) і вкорочений на кінці СООН синтетичний МСР-2(1-74) тестували на хемотаксичну активність на клітина". ТНР-1. Результатами є середнє Хі со середньо-.кв. похибка з чотирьох і більше незалежних експериментів. о

На Фіг.4 показано, що природний МСР-2 є слабшим агоністом, ніж МСР-1 стосовно мобілізації кальцію в моноцитах, Інтактний МОСР-2 (15, 50 і 15Онг/мл) сприяє дозо-залежному збільшенню |Са ?"|ЇЇ в клітинах о

ТНР-1.Наведено результат одного репрезентативного експерименту з двох проведених експериментів. -

Приклади

Приклад 1: Вкорочені на аміно-кінці МСР-2

Хемокін і імуноаналіз «

МСР-2 синтезували й очищали методом, описаним раніше (Ргоозі Р. еї а!., 1995).

Були отримані специфічні мишачі антитіла проти МСР-2 людини і очищені на колонці з сефарозою, з якою /щ- с були пов'язані синтетичні МСР-2 з використанням умов, вказаних виробником (СМВг-активована сефароза 48, ц Рпагтасіа, Оррзаїа, Зм'едеп). ,» ЕПІЗА-планшети покривали афінноочищеним антитілом проти МСР-2 людини, і біотинільоване антитіло проти МСР-2 використовували для захоплення антитіл (АБ). Детектування здійснювали з використанням міченого пероксидазою стрептавидину і ТМВ. Межа детекції для МСР-2 у ЕГІЗА складав приблизно 0,нг/мол. - І Продукування й очистка МСР-2 с Моноцитарні хемотаксичні білки виділяли з середовища, кондиціонованого мононуклеарними клітинами периферичної крові, взятої від 132 донорів і отриманої з Центру переливання крові в Антверпені й у Льовені (ав) (Ргоозі Р. еї а!., 1996).

Еритроцити і гранулоцити видаляли шляхом седиментації в гідроксиетильова-ному крохмалі (ЕРгезепіив АОС,

Со Вай Нотриго, Септапу) і шляхом градієнтного центрифугування в розчині метризоату натрію (ГутрПоргер; - М Муедаага, Овіо Могмау).

Мононуклеарні клітини (60 х 109 клітин) інкубували (5 х 10бкл./мл) з 1Омкг/мл Соп А і 2мкг/мл ЛПС. Через 48 і 120 год. кондиціоноване середовище збирали і зберігали при -202С аж до очищення. оо Природний МСР-2 очищали з використанням чотирьох стадій очищення, як описано раніше (Ргоові Р. еї

Ге! аІ./1996).

Коротше, кондиціоноване середовище концентрували на склі з регульованим розміром пор або з ю використанням кремнієвої кислоти і частково очищали за допомогою афінної хроматографії на колонці з гепарин-сефарозою (РНапгтасіа). 60 Фракції що мають імунореактивність МОСП-2, додатково очищали на катіонообмінній колонці Мопо 5 (Рпагтасіа) і елюювали в градієнті масі при рН 4,0.

Природний МСР-2 очищали до гомогенності за допомогою ОФ-ВЕРХ на колонці з С-8 Адиароге КР-300 (Регкіп-ЕІтег, Мопглиак СТ), що врівноважується 0,1 96 трифтороцтовою кислотою (ТЕА)). Білюи елюювали в ірадієнті ацетонітрилу. б5 Біохімічна характеризація МСР-форм за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН, аналіз амінокислотної послідовності і мас-спектрометрія.

Чистоту колонкових фракцій визначали за допомогою електрофорезу в ПААГ з ДСН (ПААГ-ДСН) у відновлювальних умовах на Тріс/трицингелях (Ргоові Р. еї аІЇ., 1996). Білки забарвлювали сріблом, а потім використовували відносні маркери молекулярних мас (Мг) : ОМА (Мг 45000), карбонат-дегідрогеназу (Мг 31000), соєвий інгібітор трипсину (Мг 21500), (Р-дактоглобулін (Мг 18400), лізоцим (Мг 14000) і апротинін (Мг 6500).

МН»е-кінцеву послідовність очищених хемокінів визначали шляхом деградації за Едманом на імпульсному рідинному секвенаторі 477А/120А для секвенування білків (Регкіп ЕІтег) з використанням М-метилпіперидину в якості зв'язувальної основи. Блоковані білки розщіплювали на ділянці між Авр і Рго в 7595 мурашиній кислоті протягом 50 годин. Гідролізат мурашиної кислоти секвенували без додаткового очищення. 70 Маркер (Міг) для МСР-2 визначали за допомогою мас-спектрометрії, проведеної методом лазерної десорбційної іонізації на матриці/за часом пролітання (МАГ О/ТОБЕ-М5) (Місготазз ТоїЗрес, Мапспевзіег. ОК). В якості матриці і внутрішнього стандарту використовували альфа-ціано-4-гідроксикоричну кислоту і цитохром С відповідно.

Детекція хемотаксичної активності

МСР-2 тестували на його хемотаксичну здатність стосовно свіжовиділених моноцитів (2 х 109 клітин/мл) або моноцитів ТНР-1 (0,5 х 109 клітин/мл, через 2 дні після субкультивування) в мікрокамері Бойдена з використанням оброблених полівінілпіролідоном полікарбонатних мембран з розміром пор 5мкм.

Зразки і клітини розводили в НВ5З (І їе (ееппоіо-діев/зірсо ВК, Раївзіеу, ЗсоМапа), в який було додано 1 мг/мл сироваткового альбуміну людини (Кей Сгозз Веїдішт). Після 2-годинного інкубування при 37 С клітини фіксували й забарвлювали розчинами для фарбування Оій-Оціск (Нагіесо, сіррвіом/п, МУ), і клітини, які мігрували через мембрани, підраховували в десяти полях на мікроскопі з масляною імерсією і з 500-кратним збільшенням.

Хемотаксичний індекс (ХІ) зразку (потрійні дуплікати в кожній камері) підраховували як число клітин, що мігрували в зразок, у відношенні до числа клітин, що мігрували в контрольне середовище (Мап Юатте | егаі,, СУ 1992). (5)

Для експериментів на десенсибілізацію клітини інкубували з біологічно інактивованими варіантами хемокінів протягом 10 хвилин при 372С, а потім додавали у верхню лунку мікрокамери Бойдена. 95 інгібування Хі обчислювали з використанням Хі від НВЗ5-оброблених клітин стосовно зразка з відомим значенням.

Детекція внутрішньоклітинних концентрацій Са?" -

Внутрішньоклітинні концентрації кальцію (Си |) вимірювали так, як описано раніше (МУцуїв А еї аї., со 1997). Очищені моноцити або клітини ТНР-1 (10'клітин/мл) інкубували в мінімальному підтримуючому середовищі Голка (ЕМЕМ, бірсо) ж 0,5 95 ЕС5, що містить флуоресцентний індикатор фура-2 (Тига-2/АМ, 2,5 мкм; о молекулярні зонди. МоіІесціаг Ргобез Ецйгоре ВУ, І еідеп, Те МеїШепапаз) і 0,0195 плюронік Е-127 (Зідта. БІ со

Ї оці МО).

Після витримування протягом 30 хвилин при 37 2С клітини два рази промивали і ресуспендували при 105 - клітин/мл в НВ5З з їмМ Са?" і 0,1 956 ЕС5 (забуференого 10ММ Нерез/МмаонН при рН 7,4). Ці ютітини врівноважували при 372С протягом 1Охв., а потім вимірювали фура-2-флуоресценцію в люмінесцентному спектрофотометрі І 5508 (Регкіп ЕІтег). « 20 Після збудження при 340 і З8Онм, флуоресценцію детектували при 51Онм. Величину Са 27) обчислювали за - с рівнянням Гринкевича (Сгупкем/іс: еї аі!., 1985). Для визначення К пах кліІтИиНИ лізували 50мМкМ дигітоніном. Потім рН доводили до 8,5 з використанням 20мММ Трісу, і величину К пах одержували при додаванні 1мММ ЕСТА до :з» лізованих клітин. Використовувана величина Ку складала 224нМ.

Для експериментів на десенсибілізацію моноцити або клітини ТНР спочатку стимулювали буфером, хемокіном або антагоністом хемокіну в різних концентраціях, В якості другого стимулятора використовували -І МСР-2 при концентрації, що індукує значне збільшення Са") після попередньої стимуляції буфером. Другий стимулятор вносили через 2 хвилини після додавання першого стимулятора. Обчислювали відсоток збільшення о інгібування (Са 7), у відповідь на введення другого стимулятора шляхом порівняння сигналу, індукованого після («в попередньої стимуляції хемокіном або антагоністом хемокіну, з сигналом, індукованим після додавання буфера.

Результати

Ме Виділення посттрансляційно модифікованих форм МСР-2 - Для виявлення різних форм МСР-2, продукованих мононуклеарними клітинами периферичної крові, стимульованими мітогеном і ендотоксином, використовували специфічний і чутливий ЕЕГ ІЗА.

Кондиціоноване середовище очищали стандартними методами виділення (Ргоові Р. еї аі., 1996), зокрема методами адсорбції на поверхні скла з регульованим розміром пор і хроматографії на гепарині-сефарозі.

Після цього проводили очищення за допомогою катіонообмінної хроматографії на топо З (РЕХБ), а потім о здійснювали додаткову стадію очищення за допомогою ОФ-ВЕРХ з С-8. Молекулярні маси вимірювали за ко допомогою ДСН-ПААГ і за допомогою МА! Бі/ТОог-М5.

Були виділені й інші форми МеСР-2: крім автентичного 7,5 кДа-МСР-2(1-76), вкорочена на МнНаео-кінці 60 7кДа-форма МСР-2, в якій були відсутні п'ять залишків «"«(МСР-2(6-76)), була очищена до гомогенності за допомогою ОФ-ВЕРХ і ідентифікована за допомогою аналізу амінокислотної послідовності (Фіг.2). В результаті мае-спектроскопії МАГ ОІ/ТОЕ-М5 (Таблиця 1) для інтактного МСР-2 одержували молекулярну масу 8881Да (теоретичний Мг 8893Да), а молекулярна маса МСР-2(6-76) складала 8365Да, що підтверджувало делецію п'яти

Шеь-кінцевих амінокислот (теоретично Мг 8384Да), Функціональне порівняння цих природних форм МОСР-2 в 65 аналізі на хемотаксис ТНР-1 показало, що інтактний МСР-2 зберігає активність при 5нг/мл, тоді як вкорочений

МСР-2 (6-76) втрачає хемотаксичну активність при тестуванні в межах концентрацій від 0,6 до бонг/мл (Фіг.3).

Також проводили порівняння активності інтактного природного МСР-2 з активністю синтетичного МСР-2(1-76) і вкороченою на СООН-кінці синтетичною формою (Ргоозі Р. еї аіІ., 1995), в якій були відсутні два залишки

ІМСР-2(1-74)).

Було також встановлено, що мінімальна ефективна хемотаксична концентрація цих форм складає 5нг/мл (Фіг.3), незважаючи на те, що в аналізі на хемотаксис природні інтактні МСР-1 і МСР-2 мають порівняльну специфічну активність (Мап ЮОатте І, еї аї., 1992), здатність МСР-2 до мобілізації кальцію ще залишається предметом обговорення.

Однак в експериментах на мобілізацію Са? мінімальна ефективна доза як для природного, так і для 70 синтетичного МСР-2( 1-76) в 10 разів перевищувала дозу природного інтактного МСР-1(1-76) (Фіг.4), тоді як

МСР-2(6-76) залишався неактивним.

Проте інтактний МСР-2 (5Онг/мл) був здатний до десенсибілізації МСР-2 (15нг/мл) Її МСР-З (1Онг/мл), що приводило до 52595 і 45 95-го інгібування хемотаксису відповідно.

Завдяки такій зниженій хемотаксичній активності МСР-2 в аналізі на Са 7. десенсибілізацію хемотаксису 75 МеОР-2 (6-76) здійснювали в мікрокамері Боидена.

Оскільки повідомлялося, що МСР-2 піддається перехресній десенсибілізації активними МСР-1, МОР-2 і

МСР-3 в аналізі на хемотаксис моноцитів (5о272апі 5, еї ап, 1994), авторами було проведене дослідження з метою виявлення, чи може природний неактивний МСР-2(6-76) бути також десенсибілізований МСР-1, МОР-2,

МСР-З і МОСР-2 (Таблиця ІІ). Попереднє інкубування клітин ТНР-1 10Онг/мл інактивованого МСР-2(6-76) повинно вже значно інгібувати хемотаксис, індукований 1Онг/мл МОР-ЇІ (63905), 5нг/імл МОСР-2 (7590), ЗОнг/мл МСР-З (62965) і 10Онг/мл МОСР-2 (7590). Більше того, хемотаксис, індукований у відповідь на в З рази менші концентрації відповідних МУР, цілком (91-10095) інгібувався 10О0нг/мл МСР-2(2-76). Крім того, при концентрації щонайменше 1Онг/мл. МСР-2(2-76) був ще здатним до значного інгібування хемотаксичної активності, індукованої МСР-1 (Знг/мл), МСР-2 (1,5нг/мл) або МСР-З3 (1Онг/мл) їі КАМТЕ5З (ЗОнг/мл). В цілому можна зробити висновок, що с МСР-2(6-76), продукований в природних умовах, с: не активним як хемоатрактант, і є антагоністом деяких о

С-С-хемокінів, тобто справляє дію, яка найчастіше спостерігається для МСР-3. - зо (ДСН-ПААГ ї МАСО/ТОБ-М5) і теоретичних Мг для С-8-0Ф-ВЕРХ-очищених природник МСР-ізоформ со 11111100 теоретич, нетіювилов | ДОНлААГ | омлібутоєМе | о о і - « 4 1 ви онмамовювт 10000000 З є і вв 10003105 5:15 г» 001 1000вю300010000я00 з їх вон 11011101 306 с тю 1зоюв10005юз00100000т60 («в) 1 ве0ооюмамовавту 10000000 со а твою 90 нин и и Ес НИ ся т ПО З: НН зв о 11111306 м 011 ва 1000гвно00100000081600

Й

Ь верхні лунки мікрокамери заповнювали клітинами ТНР-1, що були попередньо інкубовані з МСР-2(6-76) або з буфером с середнє значення ХІ - середньо.-кв. похибка з З незалежних експериментів

Список літератури 65 Ваоддіоїїпі М. еї а!.. Апп. Кеу. Іттипо)., 55, 97-179, 1994.

Ваоддіоїїпі М. Ки., Апп. Кеу. Іттипої., 15, 675-705, 1997.

Спапо Н. С еї аї., ІпіЇегпайопаї! Іттипоіоду, 1(4), 388-397, 1989.

Сіагк-І емуз І. ега|.,7. ВіоЇ. Спет., 266, 23128-23134. 1991.

Бе Меезіег І. еї аї, 9. Іттипої. Мейїподз 189, 99-10526, 1996. епа Н. еї аії., Майиге., 381, 661-666, 1996. бопа .. еї а). 9). Ехр. Мед, 181, 631-640, 1995. бопа .. еї аї., 9. Віої. Спет. 271, 10521-10527. 1996.

СгупКіем/іс: 0. еї аї., 9. Віої. Спет., 160, 3440, 1985.

Ргоові Р.евйа;. Віоспетівігу, 32, 10170-10177, 1993а. 70 Ргоозі Р. еї аї., У. Іттипої., 150. 1000-1010, 1993,

Ргоозві Р. еїга!., Суюкіпе, 1, 97-104, 1995.

Ргоозві Р. еї аі., Меїпоав: А сотрапіоп о Меїйод3з іп Епгутої, 10, 82, 1996.

Ргоцайоої А. Е. еї аї., У. Віої. Спет., 271, 2599-2603, 1996.

Затьгоок еї аі. Моіесшаг Сіопіпд: А Іарогаюгу Мапиа/!." Соїа ргіпд Нагрог

І арогаюгу, Соїа Зргіпд Нагрог, МУ, 1989.

Зепоїв О. еї аї.. У. Ехр. Меа, 186. 1383-1388, 1997. 5.о27апі 5. еї аї., У. ІттипоЇї, 152, 3615, 1994.

Таць 0. еї аі., СуюкКіпе 5 Сгомій Расіог Кеміємув, 7, 335-76. 1996.

Мап Сойе Е. еї аі., Віоспет. Віорпуз. Кев. Соттип., 231, 726-730, 1997.

Мап Оатте .). еї аі., Ешиг. 9. Віоспет, 181. 337-344, 1989.

Мап Оатте .). ег аії, Еиг. У). Іттипої, 20, 2113-8, 1990

Мап Оатте .. еї а!., У. Ехр. Меа, 176, 59, 1992.

УУаїг А. ейа|.,, Віоспет. Віорпуз. Кев. Соттип., 159, 969-75, 1989.

УУцуїв А., ейа!).. Віоспетівігу 26,2716-2723, 1997 Га

Список послідовностей (3) Загальна інформація: (ї) Заявник: і9) (А) Назва: Арріїеа Кезеагсп Зузіетв Агз Ноїдіпо М. М. (В) Вулиця: 14 Хдопп В. Согвігажед (С) Місто: Сигасао «ч- (Е) Країна: Тпне Ме(пегіапаз АпіШев (Р) Поштовий індекс (2ІР): немає со (б) Телефон: 639300 (Н) Телефакс: 614129 ав! (ії) Назва винаходу: Вкорочені на аміно-кінці МСР-2 як антагоністи хемокінів (ії) Число послідовностей: 4 о (м) Форма комп'ютерного зчитування: - (А) Тип носія: гнучкий диск (В) Комп'ютер: ПК, сумісний з ІВМ (С) Операційна система: РО-ЮОЗ/М5-БО5 « (0) Програмне забезпечення: Раїепіїп КеіІєазе 5 1.0, Мегвіоп 41.30 (ЕРО) (2) Дані послідовності ЗЕО ІЮ Мо: 1: (І) Характеристики послідовності: - с (А) Довжина: 99 амінокислоти ц (В) Тип: амінокислотна "» (С) Ланцюговість: -І (95) («в) о 50 -

Ф) іме) 60 б5

(2) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: білок " (ій) Гіпотетичність: немає (іх) Відмітна ознака: 170 (А) Ім'я/ключ: Білок (В) Локалізація- 1..76 79. (хі) Опис послідовності БЕО ІО Мо: 1:

Ме Гуз Ма! ет Аа АІв І еп І.еи Су І.еи Т.еи Тем Меї Аа Аа ТАг -20 -15 І -15

Ре 5ег Рго Сіп Су І.сп Аа Сіл Рго Ар бег Уаї бег Пе Рго Пе ! -5 І 5

Тік Суз Су Ре Азп Ма! Пе Авл Аге Суб Пе Рго Це Сіп Агро Гей

ІО 15 20 25

Он бет Туг ТЕГ Агро Це ТНг Азп Пе Сів Суз Рго Гуз Сп Аа Уа с м 30 35 40 о

Пе Ріє Гуз ТВ Гуз Ате Сіу Муз СЛУ Маї Сув Аа Авр Рго Гуз Си 45 50 5А

Агв Тр Уа! Аг Ар бет Ме уз Ніз Тем Азр Сі Пе Рве Сів Аби «- 60 65 70 со

Ген ув Ріо 75 («в») зв (2) Дані послідовності БЕО 10 Мо: 2: ча (і) Характеристикі: послідовності: (А) Довжина 9Оамінокислоти « ' - с (В) Тип: амінокислотна ;» , (С) Ланцюговість; 45: бі іих - (0) Топологія: лінійна мні (11) Тип молекули: білок о ! бо о (ін) Гіпотетичність: немає т (іх) Відмітна ознака: (А) Ім'я/ключ: Білок (Ф) ко бо б5

(В) Локалізація; 1..76 й (хі) Опис послідовності ЗХЕО 10 Мо: 2:

Ме Гуз Маї бег Аїа АїЇа І. еи Тени Су Ге І.еп 1 еи Меї Аа іа Тит -20 -15 -10

Ре 5ег Рго Сп Сіу Сей Аа Сп Рго Авр бет Ма! бет Це Рго Пе 70 -5 І 5

Тік Суз Суз Рпе Аз Ма! Пе Авп Атге ух Пе Рео Це Сіп Агро Ге

Іо 15 20 25

Сім бет Туг Тлг Агр Це Тв Авп Це Сп Сує Рго Гуз Сім АДа Уаї ! 30 35 40 29 Меркне Іув Тву Сіп Аге С1у Гуз Ов Уа! Суз Аа Авр Ріс Гуз Сі 45 50 55

Аге Тр Уа! Аге Авр бег Меї Гуз Ні І.ги Азр Сів Пе Рбе Сів Ав бо 65 79 20 еп Гуз Рго 75 (2уДані послідовності 560 10 Мо: 3: сч щі (і) Характеристики послідовності; і) (А) Довжина: 71 амінокислота «- 30 (В) Тип: аменокислотна со (С) Ланцюговість: о ! со 35 (2) Топологія: лінійна ! м (11) Тип молекули: білок сих й « "(й) Гіпотетичвість, немає 40 ! ' - с (іх) Опис послідовності 5ЕО ІЮ Мо: 3: :» бет Це Рго Пе Тіт Су Су Ріе Азп Уаі Пе Ап Агро І.ув Пе Рго 1 5 ю 15 - Пе Сп Аго Гей Си ех Тут Тіт Агр Пе Вт Авп Пе Сів Су Рго о 20 25 30

Гуз ОЇш Аа Уа! Це Ріє Гу Тіт Му Аго Су Гуз СЛи Маї Сув АЇа о 35 40 45 ге» ШИ Авр Рго Гуз Си Атгр Ттр Ма! Агр Ар бег Мет Гу Ніз Ге Авр Со га - 50 55 шк;

Пе Ре Сп Азп Г.еи Ту Рго 65 70

Ф) ко 6о 65

(2) Дані послідовності 5ЕО І Мо: 4 (і) Характеристики послідовності: 95 (А) Довжина: 71 амінокислота (В) Тип: амінокислотна "У (С) Ланцюговість; 70 . (ЇХ) Топологія: лінійна (і) Тип молекули: білок (іі) Гіпотетичність: чемає (іт) Опис послідовності ЗЕО 1 Мо: 4:

ЗегПе Рго Пе Тіт Суз Сує Рі Авп Уа! Пе Авп Агро Гує Пе Рго 1 5 10 15 720 Ме бів Агро Геп См Зег Тут Тіт Ат Пе Те Авп Пе біп Суз Рго . 20 25 20

Гуз Сім Аа Уа! Пе Ріє Гу Те біл Аге Сіу Гує ОЇо Ма) Сув Аа 35 40 45

Авр Рго Гув Ой Аге Тер Уа! Агр Ар бег Мей Гуз Ні І ви Авр Сп с 50 55 60 Ге)

Пе Рве Сп Авп Геп Був Ро 65 70 .

МР

-3 тя «-

МКУЗАЛІІСТ, ПІМААТЕУРО СІАОРОВУТІ РГРССЕМУТМ ЕКІРІОДІВ5 УТВІТМІОСР

КВАМІЕКТКА СКЕУСАОРКЕ ВМГУКОЗМКНІ. ПОТЕОМІКР со 76 (ав)

МСР-2 Варіант со -23 і

Зз5 / МКУБААШСЇ, ММААТЕ5РО СІАОРОВУВІ РІТССЕМУТМ ВКІРЮВЕ5 УТВІТМІОСР їм

КЕАМІЕОТКВ. СКЕУСАЮРКЕ ВУГУКО5МКНІ. РОТРОМІКР 76 « ші с Й о ;» -І

Мн Фіг. ! ші кДда

Ге | 250 - : ча 31 - 7 - 18 ча «ь 14

Ф) ' я з - Фо 234 бо

МСр-2

Фі б5

25 ниж ан ан 7

ЩЕ 45 -

І т

Е : б 5 чо | -Щ

Е

Б | у

Ж шк ! ; ні о ЯН й Внісий я Ша й ша ваавгеое вив ба" з па(1-78) лаг (8-76) вуп (1-76) вуп (1-74) - 7.5 кда 75 кд 7.3 кда 7.5 кда

Концентрація МСР-2 (нг/мл) 20 .

І Фіг. З . ваймСР-ЦІ1-76) зю сч р зо . (о) 2 ї. щ« МЮ

ЕЗ

З - - зов : т 10 со уз («в) с ре о со о пит | 100 150 ч-

І час (сак.) паМСР-Ха-76). « 309 . т с ч х 19 и? 5 ! 2 о 45.8 і ач в. х дя АЛУТМОювУ і: дур бід рот сон рел

Фо бю о . пи о . со 10. 152 ть час (сек)

Фіг. 4 іФ)

Claims (10)

Формула винаходу іме)

1. Усічений по амінокінцкю моноцитарний хемотаксичний білок-2 (МСР-2), у якому відсутні МН »-кінцеві 60 амінокислоти, що відповідають амінокислотним залишкам 1-5 природного МОСР-2, і який має антагоністичну активність відносно хемокінів.

2. Усічений по амінокінцю МОР-2 за п.1, що має амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо:З або ЗЕО ІЮ Мо:4.

3. Усічений по амінокінцю МОР-2 за п. 1 або 2 у глікозилованій формі.

4. Усічений по амінокінцю МОР-2 за будь-яким з пп. 1-3, придатний для застосування як лікарський засіб. бо

5. Усічений по амінокінцю МСОСР-2 за будь-яким з пп. 1-3, придатний для виготовлення лікарського засобу для терапії і/або діагностики захворювань, при яких потрібна антагоністична активність відносно хемокінових ефектів.

6. Усічений по амінокінцю МСР-2 за п. 5, придатний для виготовлення лікарського засобу для лікування запальних захворювань, ВІЛ-інфекції, захворювань, асоційованих з ангіогенезом і гемопоезом, і пухлин.

7. Молекула ДНК, яка містить послідовність ДНК, що кодує усічений по амінокінцю МОСР-2 за будь-яким з пп. 1-3, включаючи нуклеотидну послідовність, що кодує по суті той же білок.

8. Експресуючий вектор, що містить молекулу ДНК за п. 7.

9. Клітина-хазяїн, яка містить експресуючий вектор за п. 8.

10. Рекомбінантний спосіб одержання білка за будь-яким з пп. 1-3, що передбачає культивування клітин за п. 9 у відповідному культуральному середовищі. 70 11. Фармацевтична композиція, що містить білок за будь-яким з пп. 1-3 у поєднанні з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями і/або наповнювачами. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 6, 15.06.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і /5 Науки України. с щі 6) «- (ее) «в) (зе) і - -

с . и? -І (95) («в) (ее) - іме) 60 б5