SK286495B6

SK286495B6 - RANTES skrátené na aminokonci, DNA molekuly, expresný vektor, hostiteľská bunka, rekombinantný spôsob jeho prípravy, farmaceutický prostriedok s jehoobsahom a jeho použitie

Info

Publication number: SK286495B6
Application number: SK451-2000A
Authority: SK
Inventors: Paul Proost; Sofie Struyf; Damme Jo Van
Original assignee: Laboratoires Serono Sa
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2008-11-06
Also published as: CA2305017A1; KR100560275B1; KR100542934B1; US6905676B2; PT1439231E; JP2001518297A; UA73080C2; CZ20001147A3; CN1490049A; PT1021541E; JP4233214B2; NO20001584L; PL196427B1; BG104267A; HK1032426A1; CN1233415C; EP0905240A1; US20030124677A1; EA003940B1; ZA988675B

Abstract

RANTES skrátené na aminokonci, ktorým chýbajú NH2-koncové aminokyseliny zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 1 až 2 prirodzene sa vyskytujúcich RANTES, a majú chemokínový antagonistický účinok, ďalej sa vynález týka aj cDNA sekvencií, ktoré ich kódujú, ich použitia na liečbu a/alebo diagnostiku ochorení, pri ktorých je nutná antagonistická aktivita proti účinkom chemokínov a farmaceutický prostriedok s ich obsahom.

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka RANTES skrátených na aminokonci, ktorým chýbajú NH₂-koncové aminokyseliny zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 1 až 2 prirodzene sa vyskytujúcich RANTES, a majú chemokínový antagonistický účinok, ako aj cDNA sekvencii, ktoré ich kódujú, ich použitia na liečbu a/alebo diagnostiku ochorení, pri ktorých je nutná antagonistická aktivita proti účinkom chemokínov a farmaceutických prostriedkov s ich obsahom.

Doterajší stav techniky

Chemokíny predstavujú rodinu malých prozápalových cytokínov s leukocytovými chemotaktickými a aktivačnými vlastnosťami. V závislosti od polohy prvých cysteínov, je možné chemokínovú rodinu rozdeliť na C-C, C-X-C a C-X₃-C chemokíny (Baggiolini M. a ďalší, 1994; Baggiolini M. a ďalší, 1997 a Taub D. a ďalší, 1996).

Mnohé C-X-C chemokíny, ako interleukín-8 (IL-8) sú chemotaktické pre neutrofily, zatiaľ čo C-C chemokíny, ako monocytový chemotaktický proteín-3 (MCP-3) majú vplyv na rôzne leukocyty vrátane monocytov, lymfocytov, eozinofilov, bazofilov, NK buniek a dentrických buniek.

NH₂-koncová doména chemokínov sa podieľa na viazaní receptora a spracovanie NH₂-konca môže buď aktivovať chemokíny, znižovať ich chemokínový účinok alebo chemokíny úplne inaktivovať.

C-X-C chemokínový trombocytový základný proteín sa stáva neutrofilným chemotaktickým peptidom (NAP-2) až po odstránení 24 NH₂-koncových zvyškov (Walz A. a ďalší, 1989 a Van Damme J. a ďalší, 1990).

Výsledkom odstránenia až 8 NH₂-koncových zvyškov z IL-8 je posilnenie chemotaktickej aktivity, ale ďalšie štiepenie Glu-Leu-Arg motívu, ktorý je umiestený pred prvým Cys vo všetkých neutrofilných chemotaktických C-X-C chemokínoch, spôsobuje úplnú inaktiváciu (Clark-Lewis I a ďalší, 1991).

Podobná NH₂-koncová proteolýza (do 8 aminokyselín) iného C-X-C chemokinu, granulocytového chemotaktického proteínu-2 (GCP-2), nemá žiadny vplyv na neutrofilný chemotaktický účinok (Proost P. et al, 1993a).

RANTES (je skratka odvodená od „prostredníctvom aktivácie regulovaný, normálne exprimovaný T bunkami a pravdepodobne vylučovaný“ - „Regulated úpon Activation, Normally T Expressed, and presumably Secreted“) je C-C chemokín, ktorého cDNA kloň bol izolovaný z cDNA knižnice obohatenej o špecifické sekvencie T buniek (Shall TJ. a ďalší, 1988).

Syntetické C-C chemokíny MCP-1, MCP-3 a RANTES, ktorým chýba 8 až 9 NH₂-koncových aminokyselín, nemajú účinok na monocyty a sú užitočné ako antagonisty receptorov (Gong J. a ďalší, 1996; a Gong J. a ďalší, 1995).

Výsledkom predĺženia RANTES o jeden metionín je úplná inaktivácia molekuly a Met-RANTES sa správa ako antagonista autentického RANTES (Proudfoot A. E. a ďalší, 1996).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je RANTES skrátený na aminokonci, ktorému chýbajú NH₂-koncové aminokyseliny zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 1 až 2 prirodzene sa vyskytujúceho RANTES, a ktorý má antagonistický účinok proti chemokínom.

Podľa jedného uskutočnenia je poskytnutý RANTES(3-68), ktorý je RANTES bez prvých dvoch aminokyselín, ako je znázornené na obrázku 1 a v sekvencii. č. 2.

RANTES podľa vynálezu môže byť v glykozylovanej alebo v neglykozylovanej forme.

Výraz „antagonista chemokinu“ znamená činidlo, „ktoré účinkuje ako antagonista na zrelé, kompletné, prirodzene sa vyskytujúce chemokíny“.

Ďalším predmetom vynálezu sú DNA molekuly, ktoré obsahujú DNA sekvencie kódujúce RANTES skrátené na aminokonci podľa vynálezu vrátane v podstate rovnakých nukleotidových sekvencii. cDNA sekvencia neporušeného RANTES je opísaná v Schall T. J. a ďalší (1988) a cDNA skráteného RANTES je možné jednoducho odvodiť.

„V podstate rovnaké nukleotidové sekvencie“ zahŕňajú všetky iné sekvencie nukleových kyselín, ktoré vďaka degenerácii genetického kódu tiež kódujú dané aminokyselinové sekvencie.

Vynález zahŕňa aj expresné vektory, ktoré obsahujú uvedené DNA, hostiteľské bunky transformované takýmito vektormi a spôsob prípravy takéhoto RANTES skráteného na aminokonci podľa vynálezu, prostredníctvom kultivácie uvedených transformovaných buniek vo vhodnom kultivačnom médiu.

DNA sekvencia kódujúca proteíny podľa vynálezu môže byť začlenená a ligovaná do vhodného plazmidu. Keď sa vytvorí expresný vektor, začlení sa do vhodnej hostiteľskej bunky, ktorá potom exprimuje vektor (vektory), čím sa vytvorí požadovaný proteín.

Expresia ktoréhokoľvek z rekombinantných proteínov podľa vynálezu, ako bolo uvedené, sa môže uskutočňovať v eukaryotických bunkách (napr. kvasinkách, hmyzích alebo cicavčích bunkách) alebo v prokaryotických bunkách, použitím príslušných expresných vektorov. Je možné použiť akúkoľvek metódu známu z doterajšieho stavu techniky.

DNA molekuly kódujúce proteíny, ktoré boli získané ktorýmkoľvek z uvedených spôsobov, sa napríklad začlenia do príslušne skonštruovaných expresných vektorov technikami známymi v oblasti (pozri Sambrook a ďalší, 1989). Dvojvláknová cDNA sa spája s plazmidovými vektormi spájaním homopolymémych koncov alebo reštrikčným spájaním zahŕňajúcim použitie syntetických DNA spojovníkov alebo technikami ligácie zatupených koncov. Na ligáciu DNA sú použité DNA ligázy a nežiaducemu spájaniu sa predchádza ošetrením alkalickou fosfatázou.

Aby bol expresný vektor schopný exprimovať požadovaný proteín, mal by obsahovať aj špecifické nukleotidové sekvencie, ktoré obsahujú transkripčné a translačné regulačné informácie spojené s DNA kódujúcou požadovaný proteín takým spôsobom, že dovoľujú expresiu génu a výrobu proteínu. Aby sa gén transkriboval, musí byť pred ním promótor, ktorý môže rozoznať RNA polymerázu, a na ktorý sa polymeráza viaže a tak iniciuje transkripčný proces. Existuje množstvo takýchto promótorov, ktoré sa používajú, a ktoré pracujú s rozličnou účinnosťou (silné a slabé promótory).

Pre eukaryotických hostiteľov môžu byť použité rôzne transkripčné a translačné regulačné sekvencie, v závislosti od povahy hostiteľa. Môžu byť odvodené od vírusových zdrojov, ako napríklad adenovírusov, hovädzieho papiloma vírusu, opičieho vírusu alebo podobne, pri ktorých sú regulačné signály spojené s konkrétnym génom, ktorý má vysokú hladinu expresie. Príkladmi sú TK promótor Herpes vírusu, SV40 skorý promótor, kvasinkový gal4 génový promótor, atď. Môžu sa vybrať transkripčné iniciačné regulačné signály, ktoré umožňujú reprimovanie a aktiváciu, takže je možné modulovať expresiu génov.

DNA molekula obsahujúca nukleotidovú sekvenciu, ktorá kóduje proteín podľa vynálezu, sa začleňuje do vektora (vektorov), ktorý má operačne spojené transkripčné a translačné regulačné signály, ktoré sú schopné interagovať s požadovanými génovými sekvenciami, do hostiteľskej bunky.

Bunky, ktoré boli stabilne transformované zavedením DNA, sa môžu vybrať zavedením aj jedného alebo viacerých markerov, ktoré umožňujú výber hostiteľských buniek, ktoré obsahujú expresný vektor. Marker môže poskytovať fototrofiu auxotrofickému hostiteľovi, biocídnu rezistenciu, napríklad proti antibiotikám alebo ťažkým kovom, ako napríklad medi a podobne. Gén selektovateľného markera môže byť buď priamo spojený s DNA génovými sekvenciami, ktoré sa majú exprimovať, alebo môže byť zavedený do rovnakej bunky kotransfekciou. Na optimálnu syntézu proteínu podľa vynálezu môžu byť potrebné aj ďalšie elementy.

Dôležité faktory pri výbere konkrétneho plazmidového alebo vírusového vektora zahŕňajú: jednoduchosť, s ktorou sa recipientné bunky, ktoré obsahujú vektor, dajú rozoznať a odselektovať od tých recipientných buniek, ktoré neobsahujú vektor; množstvo kópií vektora, ktoré je potrebné pre konkrétneho hostiteľa; a či sa požaduje prenos vektora medzi hostiteľskými bunkami rôznych druhov.

Po príprave vektora (vektorov) alebo DNA sekvencie, ktorá obsahuje konštrukt (konštrukty) môže byť táto zavedená na expresiu DNA konštruktu (konštruktov) do hostiteľskej bunky ktorýmkoľvek z rôznych vhodných prostriedkov, transformáciou, transfekciou, konjugáciou, fúziou protoplastov, elektroporáciou, precipitáciou s fosforečnanom vápenatým, priamou mikroinjekciou atď.

Hostiteľské bunky môžu byť buď prokaryotické alebo eukaryotické. Výhodní sú eukaryotickí hostitelia, napr. cicavčie bunky, ako ľudské, opičie, myšie a bunky vajíčok čínskeho škrečka (CHO), pretože poskytujú proteínovým molekulám post-translačné modifikácie vrátene správneho vyformovania alebo glykozylácie na správnych miestach. Tiež kvasinkové bunky uskutočňujú post-translačné peptidové modifikácie vrátane glykozylácie. Existuje množstvo rekombinantných DNA stratégií, ktoré využívajú silné promótorové sekvencie a plazmidy s vysokým počtom kópií, ktoré môžu byť použité na výrobu požadovaných proteínov v kvasinkách. Kvasinky rozoznávajú vedúce sekvencie klonovaných cicavčích génových produktov a vylučujú peptidy obsahujúce vedúce sekvencie (tzn. pre-peptidy).

Po zavedení vektora (vektorov) rastú hostiteľské bunky v selekčnom médiu, ktoré je selektívne pre rast buniek obsahujúcich vektor. Výsledkom expresie klonovanej génovej sekvencie (sekvencii) je výroba požadovaných proteínov.

RANTES skrátený na aminokonci podľa vynálezu môže byť pripravený akýmkoľvek iným postupom známym v oblasti, najmä dobre zavedenými postupmi chemickej syntézy, využívajúcej automatizované peptidové syntezátory na tuhej fáze a následne chromatografickou purifikáciou.

Chemokíny podľa vynálezu môžu byť syntetizované napríklad prostredníctvom Fmoc (9-fluorenylmetoxykarbonyl), tBoc (terc-butoxykarbonyl) alebo inou porovnateľnou chemickou syntézou s alebo bez príslušných ochranných skupín bočných reťazcov na rôznych aminokyselinách. Aminokyseliny s alebo bez príslušných ochranných skupín bočných reťazcov sú vopred aktivované - napr. s HBTU/HOBt [2-(lH-benzo triazol-lyl)-l,l,3,3-tetrametyl-uronium hexafluórfosfát/l-hydroxybenzotriazol)] - a pripájajú sa na rastúci peptidový reťazec. Pred pridaním nasledujúceho zvyšku sa odstráni ochranná skupina (napr. Fmoc) z a-amino-skupiny. Po syntéze sa odstránia všetky ochranné skupiny a intaktné kompletné peptidy sa purifikujú a chemicky alebo enzymaticky formujú (vrátane vytvárania disulfidových mostíkov medzi cysteínmi) na zodpovedajúce chemokíny podľa vynálezu.

Puriftkácia prirodzených, syntetických alebo rekombinantných proteínov sa uskutočňuje ktorýmkoľvek zo spôsobov známych na tento účel, tzn. akýmkoľvek bežným postupom vrátane extrakcie, precipitácie, chromatografie, elektroforézy alebo podobne (pozri napríklad Proost P. a ďalší, 1996). Ďalším purifikačným postupom, ktorý môže byť výhodne použitý na purifikáciu proteínu podľa vynálezu, je afinitná chromatografia s využitím monoklonálnych protilátok alebo afinity ku heparínu, ktorý viaže cieľový proteín, a ktorý sa vytvára a je imobilizovaný na gélovej matrici nachádzajúcej sa vnútri kolóny. Nečisté prípravky obsahujúce proteíny prechádzajú kolónou. Proteín sa naviaže na kolónu prostredníctvom heparínu alebo prostredníctvom špecifickej protilátky, zatiaľ čo nečistoty prejdú. Po premytí sa proteín eluuje z gélu zmenou pH alebo zmenou iónovej sily.

RANTES skrátené na aminokonci podľa vynálezu sú užitočné na liečbu a/alebo diagnostiku chorôb, pri ktorý je potrebný antagonistický vplyv na účinok chemokínov. Príklady takýchto ochorení zahŕňajú: zápalové ochorenia, ochorenia týkajúce sa angiogenézy a hematopoézy, nádory, infekčné ochorenia vrátane HIV, autoimunitné ochorenia, artériosklerózu, pľúcne ochorenia a kožné poruchy.

Preto ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu predstavuje použitie proteínu podľa vynálezu na výrobu liečiva na liečbu uvedených ochorení.

Liečivo je výhodne vo forme farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje proteíny podľa vynálezu spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo vehiklami. Takéto farmaceutické prostriedky predstavujú ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu.

Ďalším uskutočnením vynálezu je spôsob liečby uvedených ochorení, ktorý zahŕňa podávanie farmakologicky účinného množstva RANTES skráteného na aminokonci podľa vynálezu, jedincom, u ktorých je riziko rozvinutia takýchto ochorení alebo jedincom, ktorí už vykazujú takého patológie.

Zistilo sa tiež, že CD26/DPP IV je schopný in vitro generovať RANTES skrátené na NH₂-konci. RANTES ie prvým cytokínom, o ktorom je známe, že jeho biologický účinok môže byť modifikovaný prostredníctvom CD26/DPP IV.

Preto je ďalším predmetom predloženého vynálezu použitie CD26/DPP IV na liečbu a/alebo diagnostiku chorôb, pri ktorých je potrebný antagonistický vplyv na účinky chemokínov, so zameraním najmä na zápalové, imunitné a infekčné ochorenia.

Keďže to predstavuje prvý príklad identifikácie mechanizmu endogénne regulovanej modifikácie chemokínu na antagonistu, ktorý je podobný fyziologickému procesu, aleje sprostredkovaný inými faktormi (proteázami), tento vynález zahŕňa aj použitie takýchto faktorov (proteáz) na liečbu a/alebo diagnostiku uvedených ochorení.

Vynález bude teraz opísaný prostredníctvom nasledujúcich príkladov, ktoré nemajú byť považujúce za príklady akýmkoľvek spôsobom obmedzujúce predložený vynález. Príklady sa budú odvolávať na opísané obrázky'.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 znázorňuje aminokyselinovú sekvenciu RANTES. Signálne sekvencie sú znázornené kurzívou, zatiaľ čo C-zvyšky sú vytlačené tučné. Šípky označujú prvé aminokyseliny RANTES skráteného na aminokonci podľa vynálezu, tiež nazývaného RANTES(3-68).

Obrázok 2: Chemotaktické účinky intaktných, na NH₂-konci skrátených foriem prirodzených alebo rekombinantných RANTES na monocytové THP-1 bunky sa porovnávali v teste v Boydenovej mikrokomôrke: prirodzený RANTES(l-68) (A), prirodzený, skrátený RANTES(3-68) intaktný rekombinantný RANTES(1-68) (A) a rekombinantný RANTES(3-68) štiepený s CD26/DPP IV (). Výsledky predstavujú priemerný chemotaktický index ± SEM štyroch alebo viacerých nezávislých experimentov.

Obrázok 3 znázorňuje účinok prirodzeného RANTES(3-68) (), prirodzeného RANTES (1-68) (Δ), rekombinantného RANTES(3-68) ošetreného s CD26/DPP IV () na koncentráciu [Ca²⁷]; v THP-1 bunkách. Výsledky predstavujú priemerné zvýšenie koncentrácie [Ca²⁷], + SEM troch alebo viacerých nezávislých experimentov.

Obrázok 4 znázorňuje zníženie vplyvu Ca²⁺-mobilizačného účinku intaktného recRANTES(l-68) prostredníctvom RANTES(3-68). THP-1 bunky sa najprv stimulovali tlmivým roztokom alebo rôznymi koncentráciami rekombinatných RANTES(l-68) alebo RANTES(3-68). Výsledky predstavujú priemer ± SEM (troch alebo viacerých nezávislých experimentov) zvýšenia koncentrácie [Ca²⁺]j ako odpoveď na 30 ng/ml intaktného rekombinantného RANTES ako druhého stimulantu.

SK 286495 Β6

Obrázok 5 znázorňuje porovnanie chemotaktického účinku skráteného RANTES(3-68) s intaktným RANTES(l-68). Chemotaktický účinok prirodzeného (nat) a rekombinantného (rec) skráteného RANTES, intaktného RANTES a syntetického MCP-3 na eozinofilné granulocyty sa stanovil mikrokomôrkovým testom. Výsledky predstavujú priemerný chemotaktický index (Cl) ± SEM dvoch alebo viacerých nezávislých experimentov (každý sa uskutočnil trojmo).

Obrázok 6 znázorňuje zníženie vplyvu na mobilizáciu vápnika prostredníctvom intaktného RANTES v CCR transfektantoch. Experimenty týkajúce sa mobilizácie vápnika sa uskutočnili v HOS bunkách transfekovaných s CD4 a CC chemokínovými receptormi CCR1 alebo CCR5. Bunky sa najprv stimulovali rôznymi koncentráciami intaktného alebo skráteného RANTES, následne sa stimulovali 100 ng/ml intaktného RANTES. Znázornené je percento inhibície zvýšenia koncentrácie [Ca²⁺]j, ktorá je indukovaná druhým stimulom. Toto percento sa vypočítalo porovnaním odpovede na 100 ng/ml intaktného RANTES po pridaní RANTES(l-68) alebo RANTES(3-68) s odpoveďou po stimulácii s tlmivým roztokom (100 %). Výsledky predstavujú priemerné percento inhibície ± SEM dvoch alebo viacerých experimentov.

Obrázok 7 znázorňuje potencionálny inhibičný účinok RANTES(3-68) na infekciu mononukleárnych buniek HIV-1. PHA-aktivované PBMC sa infikovali s M-tropic HIV-1 Ba-L kmeňom v prítomnosti rôznych koncentrácií RANTES(l-68) alebo RANTES(3-68) (0 až 1 000 ng/ml sa pridalo v čase infekcie). Po desiatich dňoch sa monitoroval výťažok vírusov v supematante prostredníctvom p-24 Ag ELISA (znázornený je jeden reprezentatívny experiment zo štyroch).

Obrázok 8 znázorňuje účinky RANTES(l-68) a RANTES(3-68) na infekciu prostredníctvom HIC1SF162 kmeňa v PHA-aktivovaných PBMC. Výťažky vírusov sa monitorovali 10 dní po infekcii prostredníctvom p24 Ag ELISA na bunkový supematant. Znázornené sú výsledky jedného reprezentatívneho experimentu z troch. *Nižší ako detekčný limit p24 Ag ELISA (<5 pg/ml).

Obrázok 9 znázorňuje expresiu CD26 na HOS.CD4.CCR5 bunkách, U87.CD4.CCR5 bunkách a čerstvo izolovaných PBMC. V každom histograme je uvedené percento (%) CD26 pozitívnych buniek.

Obrázok 10 znázorňuje účinky RANTES(l-68), RANTES(l-68) plus sCD26 (50 U/L) a RANTES(3-68) na infekciu HOS.CD4.CCR5 buniek HIV-1 BaL kmeňom. Výťažky vírusov sa monitorovali v bunkovom supematante 8 dní po infekcii prostredníctvom p24Ag ELISA. Znázornené sú výsledky jedného reprezentatívneho experimentu z troch.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

RANTES skrátený na aminokonci

Materiály a metódy

Indikátory

Prirodzený ľudský RANTES sa produkoval ľudskými Malavu hepatosarkómovými bunkami, MG-63 osteosarkómovými bunkami alebo periférnymi krvnými leukocytmi (Blood transfusion centers of Antwerp and Leuven) a purifíkoval sa, ako bolo predtým opísané (Proost P. a ďalší, 1996 a Proost P. a ďalší, 1993). MCP2, MCP-3 a GCP-2 sa syntetizovali Fmoc chemickými technikami (Proost P. a ďalší, 1995 a Wuyts A. a ďalší, 1997), rekombinantný RANTES sa získal od Peprotech (Rocky Hill, NJ) a rekombinantný MCP-1 bol dar od Dr. J.J. Oppenheima (NCI-NIH, Frederick, MD).

Ľudské osteosarkómové (HOS) bunky transfekované s CD4 a jedným s CC chemokínových receptorov CCR1, CCR3 alebo CCR5 (Deng H., a ďalší, 1996) rástli v DMEM s glutamaxom. Ako selekčné činidlo sa do média pridal puromycín (1 pg/ml). Všetky rastové médiá (Gibco BRL/Life Technologies, Paisley, UK) sa obohatili 10 % FCS.

Ľudské CD26/DPP IV sa získali z prostazómov, organel odvodených od prostaty, ktoré sa nachádzajú voľne v seminálnej plazme. Enzýmy sa purifikovali, až kým neboli homogénne, ako je opísané, použitím iónovej výmennej a následne afinitnej chromatografie na adenozín deamináze (De Meester I. a ďalší, 1996).

Inkubovanie chemokinov s CD26/DPP IV a detekcia proteolytického spracovania

100 až 1000 molámy nadbytok chemokínu sa inkuboval cez noc v CD26/DPP IV v 100 mM Tris/HCl pH 7,7. Chemokíny sa oddelili od CD26/DPP IV prostredníctvom SDS-PAGE na Tris/Tricine gélovým systémom, ktorý bol opísaný (Proost P. a ďalší, 1996).

Proteíny sa preniesli elektroblotom na PVDF (polyvinylidénfluoridové) membrány (Problott, Perkin Elmer, Foster City, CA) a farbili sa Coomassie briliant modrou R250. Po odfarbení sa membrány premyli najmenej 5-krát ultračistou vodou (Milli Y; Millipore, Bedford, MA).

Aby sa získali dostatočné množstvá čistého skráteného chemokínu pre biologické testy, ošetrilo sa približne 50 pg rekombinantného chemokínu s CD26/DPP IV a produkt štiepenia sa okyslil s 0,1 % kyselinou trifluórooctovou (TFA). Tween 20 (0,01 %) sa pridal, aby sa predišlo lepeniu chemokinov na skúmavky.

Chemokíny sa oddelili od CD26/DPP IV v acetonitrilovom gradiente na C-8 Aquapore RP-300 kolóne (1 x 50) (Perkin Elmer). Frakcie obsahujúce proteíny sa analyzovali prostredníctvom SDS-PAGE a farbením striebrom, ako bolo opísané.

Chemokíny ošetrené s CD26/DPPIV, purifikované prostredníctvom RP-HPLC alebo vystrihnuté z PVDF blotov, sa NH₂-terminálne sekvenovali prostredníctvom Edmanovej degradácie na pulznom kvapalnou fázovom 477A/120A proteínovom sekvenátore (perkin Elmer) použitím N-metylpiperidínu ako spájacej bázy.

Detekcia chemotaktického účinku

Chemokíny sa testovali z hľadiska ich chemotaktickej potencie na čerstvo izolovaných periférnych krvných neutrofilných granulocytoch (10⁶ buniek/ml) alebo kultivovaných monocytových THP-1 bunkách (0,5 x 10⁶ buniek/ml) v Boydenovej mikrokomôrke (Proost P. a ďalší, 1996 a Proost P. a ďalší, 1993).

Po 45 minútach (granulocyty) alebo dvoch hodinách (THP-1 bunky) inkubovania pri 37 °C sa bunky fixovali a farbili. Bunky, ktoré prechádzali cez polykarbonátové membrány s veľkosťou pórov 5 pm, sa mikroskopicky spočítavali v desiatich olejových imerzných poliach.

Chemotaktický index (Cl) vzorky (trojmo v každej komôrke) sa vypočítal ako počet buniek, ktoré migrovali do vzorky, delený počtom buniek, ktoré migrovali do kontrolného média. V experimentoch na znižovanie účinku sa bunky inkubovali s biologicky neúčinnými chemokínovými variantami počas 10 minút pri 37 °C pred tým, ako boli prenesené do komôrky.

Na stanovenie zníženia účinku chemotaxie sa vypočítalo percento inhibície C.I. získané znížením účinku HBSS-ošetrených kontrolných buniek.

Detekcia vnútrobunkových Ca²⁺ koncentrácií

Vnútrobunkové koncentrácie vápnika ([Ca²⁺]i) sa merali tak, ako už bolo opísané (Wuyts A. a ďalší, 1997). V stručnosti: purifikované bunky' sa inkubovali s indikátorom fluorescencie fora-2 (fiira-2/ΑΜ 2,5 μΜ; Molecular Probes Európe BV, Leiden, Holandsko) a 0,01 % Pluronic F-127 (Sigma, St Louis MO).

Po 30 minútach sa bunky dvakrát premyli a znovu sa rozsuspendovali v HBSS s 1 mM Ca²⁺ a inkubovali sa 10 minút pri 37 °C pred tým, ako sa merala fura-2 fluorescencia v LS50B luminiscenčnom spektrofotometri (Perkin Elmer). Po excitácii pri 340 a 380 nm sa detegovala fluorescencia pri 510 nm. [Ca²⁺]i sa vypočítal z Grynkiewiczovej rovnice (Grynkiewicz a ďalší, 1985).

Na stanovenie R_max sa bunky lyžovali s 50 μΜ digitonínu. Následne sa nastavila hodnota pH na 8,5 20 mM Tris a R_m;_n sa získala pridaním 10 mM EGTA do lyzovaných buniek. Použitá K_d bola 224 nM. Pri experimentoch na znižovanie vplyvu sa bunky najprv stimulovali tlmivým roztokom alebo chemokínom v rôznych koncentráciách. Ako druhý stimulant sa pridali chemokíny v koncentrácii indukujúcej významný nárast koncentrácie [Ca²⁺]i po predchádzajúcej stimulácii tlmivým roztokom. Vypočítalo sa percento inhibície zvýšenia koncentrácie [Ca²⁺], ako odpovede na druhý stimulant predstimuláciou.

Inhibícia HIV-1 infekcie

HIV-1 M-tropic kmene BaL a SF162 sa získali prostredníctvom MRC AIDS indikátorového projektu (Herts, UK). Periférne krvné mononukleáme bunky (PBMC) zo zdravých darcov sa izolovali centrifugáciou v hustotnom gradiente (5,23) a stimulovali sa s 1 pg/ml PHA (Sigma, Bomem, Belgicko) počas 3 dní pri 37 C. Aktivované bunky (PHA-stimulované vzorky) sa trikrát premyli s PBS a infikovali vírusom, ako bolo opísané (Schols D. a ďalší, 1997). HIV-1 infikované alebo negatívnou kontrolu infikované PHA stimulované vzorky sa kultivovali v prítomnosti 25 U/ml IL-2 a rôznych koncentrácií RANTES(l-68) alebo RANTES(3-68). Na desiaty deň sa bunky supematantu zozbierali a analyzoval sa antigén jadra HIV-1 v supernatante prostredníctvom p-24 Ag ELISA kitu (DuPont/NEN Life Science Products, Brussels, Belgicko).

Výsledky

Izolácia a biologická charakterizácia prirodzeného RANTES skráteného na NH₂-konci

Predtým už boli izolované rôzne formy ľudského GCP-2 skrátené na NH₂-konci (Proost P. a ďalší, 1993). Najmenej skrátená GCP-2 forma sa štiepila za Pro v koncovej polohe [GCP-2(3-75)j. Použitím podobného štandardného purifikačného postupu sa purifikoval C-C chemokín RANTES z periférnych krvných leukocytov alebo sarkómových buniek (Proost P. a ďalší, 1996).

Konkrétne, upravené médium z MG-63 alebo Malavu sarkómových buniek indukované zmesou cytokínov sa frakcionovalo, aby sa izolovali chemokínové varianty. Chemokíny sa purifikovali následnou protilátkovou alebo heparínovou afinitnou chromatografiou, katiónovou výmennou chromatografiou (mono S FPLC) a RP-HPLC a imunoreaktívne formy sa detegovali špecifickými chemokínovými ELISA. Zistilo sa, že na katiónovej výmennej kolóne IL-8 eluuje v blízkosti RANTES (medzi 0,7 a 0,75 M NaCl). Napriek to

SK 286495 Β6 mu boli oba chemokíny navzájom oddelené prostredníctvom RP-HPLC (RANTES eluuje pri 27,5 % acetonitrile a IL-8 v 30 % acetonitrile). Analýza aminokyselinovej sekvencie čistých proteínov potvrdila, že IL-8 sa vyskytuje v rôznych na NH₂-skrátených formách, ktoré boli predtým izolované na základe ich chemotaktickej aktivity (Van Damme J. a ďalší, 1989). Ale RANTES bol izolovaný len v jednej forme, ktorej chýbajú v porovnaní s intaktným RANTES NH₂-koncové zvyšky. Vzhľadom na jeho prevládajúci výskyt bol tento RANTES(3-68) analyzovaný podrobnejšie, aby sa overil jeho chemotaktický vplyv na monocyty a eozinofily. Konkrétne sa RANTES(3-68) testoval z hľadiska chemotaktického vplyvu a/alebo vplyvu na vnútrobunkové vylučovanie Ca a jeho biologický účinok sa porovnával s účinkami zodpovedajúcich intaktných chemokínov.

Výsledkom NH₂-koncovej delécie dvoch zvyškov z RANTES bol značný pokles monocytového chemotaktického účinku a vplyvu na vylučovanie Ca²⁺. V porovnaní s intaktným prirodzeným RANTES (minimálna účinná dávka 3 až 10 ng/ml), prirodzený RANTES(3-68) bol úplne neaktívny, keď sa testoval v koncentráciách v množstve až 300 ng/ml v Boydenovej mikrokomôrke (obrázok 2). Navyše, na získanie podobnej Ca²⁺ odpovede boli potrebné desaťnásobne vyššie koncentrácie prirodzeného RANTES(3-68) v porovnaní s RANTES(l-68) (obrázok 3).

CD26/DPP IV odstraňuje NH₂-koncové dipeptidy chemokínov

Aby sa preskúmalo, či by mohla byť za skrátenie RANTES na NH₂-konci zodpovedná aminopeptidáza CD26/DPP IV, inkuboval sa intaktný chemokín cez noc s CD26/DPP IV. Blotom sa preniesol na PVDF membrány, farbil sa Coomassie modrou a podrobil sa automatickej Edmanovej degradácii. Výsledkom pôsobenia CD26/DPP IV na RANTES bolo odstránenie NH₂-koncových dipeptidov. Paralelná inkubácia chemokínu s tlmivým roztokom bez CD26/DPPIV nemala žiadny účinok.

Keďže iné chemokíny obsahujú konsenzus sekvenciu pre CD26/DPP IV štiepenie, a pretože sa ukázalo, že NH₂-koniec MCPs je nevyhnutný pre biologickú aktivitu (Gong J. a ďalší, 1996 a Gong J. a ďalší, 1995), aj MCP-1, MCP-2 a MCP-3 sa inkubovali s CD26/DPPIV.

Po ukončení pôsobenia sa MCPs preniesli blotom na PVDF membrány a farbili sa Coomassie modrou, aby sa potvrdilo, že sa izolovalo dostatočné množstvo proteínu pre Edmanovú degradáciu.

Avšak nebolo možné detegovať žiadnu NH₂-koncovú sekvenciu, z čoho vyplýva, že CD26/DPP IV nemení NH₂-koniec MCPs, ktorý je na Edmanovú degradáciu blokovaný kyselinou pyroglutámovou.

Porovnanie biologického účinku intaktného RANTES a RANTES ošetreného s CD26/DPP IV

Podobne, ako prirodzený RANTES(3-68), bol rekombinantný RANTES, ktorý bol purifikovaný na C-8 RP-HPLC a pôsobilo sa naň CD26/DPP IV, neaktívny v chemotaktických testoch v Boydenovej mikrokomôrke, keď sa použil v koncentráciách do 1 pg/ml, zatiaľ čo sa detegovala významná monocytová chemotaktická odpoveď pri intaktnom rekombinantnom RANTES v koncentrácii od 30 do 100 ng/ml (obrázok 2).

Keď sa testoval účinok skrátenia v Ca²⁺-mobilizačnom teste, indukoval RANTES(3-68) nízke, ale významné zvýšenie v koncentrácii 100 ng/ml. Ale intaktný RANTES bol účinný už pri 10 ng/ml (obrázok 3). Z toho vyplýva, že hoci sa odstránili len dva NH₂-koncové zvyšky, znížila sa schopnosť RANTES mobilizovať Ca²⁺ 10- až 100-krát.

RANTES(3-68) je prirodzený chemotaktický antagonista intaktného RANTES

Vzhľadom na neaktívnosť RANTES(3-68) v monocytových chemotaktických experimentoch, testovali sme, či tento skrátený RANTES môže účinkovať ako antagonista. RANTES(3-68) v množstve 1 pg/ml skoro úplne (82 %) znižuje vplyv chemotaktického účinku 100 ng/ml intaktného RANTES (tabuľka 1).

Keď sa do vrchnej priehradky pridal RANTES(3-68) v trojnásobnom nadbytku, inhibovala sa chemotaxia THP-1 buniek v porovnaní s intaktným RANTES o približne 50 až 70 %. RANTES(3-68) v množstve 300 ng/ml mohol ešte inhibovať približne 30 % chemotaktickej odpovede v porovnaní s rovnakou koncentráciou intaktného RANTES.

V Ca²⁺-mobilizačných experimentoch s THP-1 bunkami (obrázok 4) mohlo 30 ng/ml intaktného RANTES znížiť vplyv účinku 30 ng/ml intaktného RANTES na 39 ± 5 %. Na dosiahnutie rovnakého zníženia vplyvu boli potrebné desaťnásobne vyššie koncentrácie RANTES(3-68). Ale 300 ng/ml samotného RANTES(3-68) vykazovalo významnú Ca²⁺-odpoveď v porovnaní s odpoveďou dosiahnutou s 30 ng/ml intaktného RANTES.

Tabuľka 1

RANTES(3-68) znižuje vplyv chemotaxie monocytov indukovanej prostredníctvom RANTES(l-68)‘

Chemokín (ng/ml)	Chemotaktická odpoveď (Cl)
Dolná priehradka	Horná priehradka		% inhibície
RANTES (1-68)	RANTES (3-68)	A	B	C	D	priemer ± SEM	priemer ± SEM
300	1000	12,5	7,5	27,5	50,5	25 ± 10	67 ±8

Chemokin (ng/ml)	Chemotaktická odpoveď (Cl)
Dolná priehradka	Horná priehradka		% inhibície
RANTES (1-68)	RANTES (3-68)	A	B	C	D	priemer ± SEM	priemer ± SEM
	300	22,0	20,5	72,5	79,5	49 ± 16	31 ± 13
	0	41,0	46,0	71,5	97,0	64 + 13	0
100	1000	4,0	3,0	13,5	11,0	8 + 3	82 ±4
	300	7,5	7,0	29,0	33,0	19 ±7	53 ±11
	0	24,0	21,5	50,0	44,5	35 ±7	0

Výsledky predstavujú chemotaktický index (Cl) štyroch (A až D) nezávislých experimentov (vrátane priemeru + SEM) a percenta (%) inhibície (priemer + SEM % inhibície štyroch experimentov) chemotaktickej odpovede v porovnaní s RANTES(l-68) po preinkubovani THP-1 buniek s neaktívnym RANTES(3-68) alebo tlmivým roztokom.

Narušená chemotaktická aktivita RANTES(3-68) proti ľudským monocytom a eozinofilom

V tabuľke 2 je porovnávaný chemotaktický potenciál prirodzeného RANTES(3-68) s potenciálom monocytového chemotaktického proteínu MCP-3 a intaktného RANTES(l-68). Je možné vidieť, že MCP-3 a RANTES(l-68) majú chemotaktický účinok v čerstvo izolovaných periférnych krvných monocytoch ešte v koncentrácii 3 ng/ml, respektíve 30 ng/ml, pričom RANTES(3-68) ostáva neaktívny pri 100 ng/ml.

Znížený chemotaktický potenciál tohto prirodzeného variantu sa potvrdil s rekombinantným RANTES(3-68). Purifikovaný rekombinantný RANTES(3-68), hoci bol slabo chemotaktický pre monocyty (v množstve 1 pg/ml), vykazoval špecifický účinok, ktorý bol desaťkrát nižší ako účinok intaktného rekombinantného RANTES.

Nakoniec sa overoval chemotaktický potenciál RANTES(3-68) na ľudské eozinofili, ktoré reagovali ešte na 100 ng/ml intaktného RANTES a 30 ng/ml MCP-3 (obrázok 5). Podobne ako pri monocytoch, bola migrácia eozinofilov stimulovaná len prostredníctvom RANTES(3-68) v množstve 1 pg/ml.

Tabuľka 2

Porovnanie monocytovej chemotaktickej aktivity RANTES(3-68) s RANTES(l-68) a MCP-3

monocytová chemotaktická aktivita³’
kone, (ng/ml)	MCP-3	natRANTES (3-68)	recRANTES (1-68)	recRANTES (3-68)
1000	b)	-	3,6 ± 0,8(6)	3,3(1)
300	6,0 ± 1,2(6)	-	-	-
100	-	1,1 ±0,1(3)	3,3 ± 0,4(6)	1,0(1)
30	6,9+1,0(6)	1,7 ±0,2(3)	-	-
10	-	1,9 ±0,6(3)	1,9 ±0,4(6)	<1,0(1)
3	4,1 v 0,4(6)	-	-	-

a) priemerný chemotaktický index (Cl) ± SEM (n) na čerstvo izolovaný periférne krvné monocyty

b) nie je stanovené

RANTES(3-68) vysiela signály a znižuje účinok RANTES(l-68) prostredníctvom CCR5, ale nie prostredníctvom CCR1 a CCR3

Na vysvetlenie zníženia chemotaktickej aktivity RANTES(3-68) overovala sa schopnosť chemokinovej varianty viazať sa a signalizovať prostredníctvom známych receptorov použitím RANTES.

HOS bunky transfekované chemokínovými receptormi CCR1, CCR3 alebo CCR5 sa použili v signalizačnom teste, v ktorom sa merali zvýšenia vnútrobunkovej koncentrácie vápnika. V koncentráciách do 300 ng/ml RANTES(3-68) nezvyšoval koncentráciu [Ca²⁺]_: v HOS bunkách transfekovaných s CCR1 (tabuľka 3) alebo CCR3 (údaje nie sú uvedené), zatiaľ čo 30 ng/ml a 100 ng/ml intaktného RANTES bolo postačujúce na indukciu zvýšenia koncentrácie [Ca²⁺]i v CCR1, respektíve CCR3 transfektantoch.

Ale tak intaktný, ako aj skrátený RANTES boli schopné indukovať významné zvýšenie koncentrácie [Ca²⁺]; v CCR5 transfektantoch pri 30 ng/ml. Navyše prostredníctvom preinkubácie CCR5-transfckovaných buniek s 3 až 10-násobným nadbytkom buď RANTES(3-68) alebo intaktného RANTES sa dosiahla rovnaká inhibíca (približne 75 %) zvýšenia koncentrácie [Ca²⁺]; prostredníctvom následnej stimulácie s intaktným RANTES (lOOng/ml) (obrázok 6).

Naproti tomu 300 ng/ml RANTES(3-68) len okrajovo znižuje účinok vápnikovej reakcie CCR1 a CCR-3-transfekovaných buniek na 100 ng/ml intaktného RANTES, zatiaľ čo trojnásobný nadbytok intaktného RANTES ako prvého stimulu skoro úplne inhibuje zvyšovanie [Ca²⁺], v týchto bunkách prostredníctvom ná sledného pôsobenia RANTES(l-68). Z toho vyplýva, že odstránenie NH₂-koncových zvyškov z RANTES má významný vplyv na prenos signálu v tom, že chemokínové receptory CCR1 a CCR3 už viac nie sú funkčne rozoznávané. Preto porušený chemotaktický potenciál RANTES(3-68) môže byť vysvetlený jeho neschopnosťou fungovať prostredníctvom CCR1 a CCR3. Naopak, RANTES(3-68) si úplne zachováva CCR5 signálne vlastnosti intaktného RANTES. RANTES(3-68) môže byť protizápalový prostredníctvom kompetície s intaktným RANTES, ale môže ešte účinkovať ako HlV-inhibítor prostredníctvom zachovania si svojej schopnosti viazať CCR5.

Tabuľka 3

Mobilizácia vápnika prostredníctvom foriem RANTES v CCR1 a CCR5 trans-fektantoch

Chemokín	kone, (ng/ml)	zvýšenie [Ca²⁴]; (nM)^a>
		CCR1	CCR5
RANTES(l-68)	300	133 ±5(3)	96 ±1(2)
	100	100 ±28(3)	60 ± 4(2)
	30	25 ± 8(3)	24 ± 2(2)
	10	<15(2)	<15(1)
RANTES(3-68)	300	19 + 9(3)	119 + 5(2)
	100	<15 ±0(3)	76 ±4(2)
	30	<15(2)	56 ± 13(2)
	10		<15(1)

^a) uvedené je priemerné zvýšenie [Ca²⁴]i v nM ± SEM dvoch alebo viacerých nezávislých experimentov

Inhibícia CC chemokínom indukovanej chemotaxie prostredníctvom RANTES(-68) v ľudských monocytových bunkách

Aby sa overilo, že inhibícia CC chemokínovej signalizácie prostredníctvom RANTES(3-68) nastáva aj v monocytových bunkách, uskutočnili sa inhibičné experimenty v THP-1 bunkách. Dokázalo sa, že RANTES(3-68) vykazuje desaťnásobné zníženie schopnosti zvýšiť [Ca²⁴]; v monocytových bunkách v porovnaní s intaktným RANTES (údaje nie sú uvedené). Navyše chemotaktický účinok intaktného RANTES (30 ng/ml) na monocytové bunky sa inhĺboval (71 %) inkubovanim testovaných buniek s 300 ng/ml RANTES(3-68), ako je uvedené v tabuľke 4.

Navyše RANTES(3-68) znižuje chemotaktickú reakciu na iné CC chemokíny vrátane monocytového chemotaktického proteínu-3 (MCP-3) (67 %), makrofágového zápalového proteínu-la (ΜΙΡ-Ια) (61 %) a ΜΙΡ-1β(80%).

To ilustruje, že RANTES(3-68) funguje ako širokospektrálny inhibítor monocytovej bunkovej migrácie indukovanej inými CC chemokínmi.

Tabuľka 4

Inhibícia monocytovej bunkovej chemotaxie ku CC chemokínom prostredníctvom RANTES(3-68)

Inhibícia chemotaxie THP-1
chemokín^a}	kone, (ng/ml)	tlmivý roztok ^b,c)	RANTES(3-68) ^b'^c)
RANTES	30	19,0 ± 6,6	3,7+0,6	71 ±16
MCP-3	30	48,5 ±9,3	24,9 ± 2,0	45 ±10
MCP-3	3	7,6 + 2,5	3,1 0,8	67 ±13
ΜΙΡ-Ια	30	6,2 ± 2,4	3,0 ± 1,1	61 ±22
ΜΙΡ-1β	300	4,3 ± 1,0	1,9 ±0,6	80 ± 12
kontrola		1,5 ±0,5	1,0 ±0,5

^a) RANTES, MCP-3, ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ a tlmivý roztok sa pridávali ako chemoatraktanty do spodných priehradok mikrokomôrky ^b> horné priehradky mikrokomôrky sa naplnili THP-1 bunkami, ktoré sa predtým inkubovali (10 min, 37 °C) s 300 ng/ml RANTES(3-68) alebo s tlmivým roztokom ^c) priemer Cl ± SEM štyroch nezávislých experimentov ^d) inhibícia migrácie indukovanej intaktnými chemokínmi v prítomnosti 300 ng/ml RANTES(3-68)

CD26-špecifické skrátenie RANTES je nevyhnutné pre jeho antivírusový účinok

Najprv boli stanovené účinky rôznych foriem RANTES proti dvom rôznym M-tropic HIV-1 kmeňom (BaL a SF162) v ľudských PBMC získaných od zdravých darcov krvi. IC₅₀ intaktného RANTES(l-68) proti

BaL kmeňu bolo 3,4 nM a IC_S0 pre RANTES(3-68) bolo 0,39 nM. IC₉₀ hodnota pre RANTES(l-68) bola 71 nM, čo bolo približne desaťnásobkom IC₉₀ pre RANTES(3-98). Vzhľadom na SF162 kmeň bol RANTES(l-68) (IC₅₀: 23 nM; IC₉₀: 95 nM), keď sa stanovoval v PBMC, viac ako desaťnásobne menej účinný ako RANTES(3-68) (IC50: 2 nM; IC₉₀; 8,2 nM) (tabuľka 5). Na obrázku 8 sú znázornené účinky oboch chemokínov v závislosti od koncentrácií, ktoré sú v rozsahu od 133 do 0,2 nM, proti HIV-1 SF 162 replikácii v PBMC. Koncentrácia RANTES(3-68) 5,2nM bola jednoznačne účinná na redukciu vírusovej replikácie, zatiaľ čo RANTES(l-68) bol v tejto koncentrácii neúčinný. Nebol pozorovaný žiadny antivírusový účinok medzi RANTES získanými od PeproTech alebo R&D Systems.

Pozoruhodný rozdiel v antivírusovej aktivite medzi dvoma formami RANTES sa stal ešte zjavncjším, keď sa testoval v ľudských bunkách transfekovaných s CCR5. V U78.CD4.CCR5 bunkách bolo IC₅₀ pre RANTES(l-68) proti BaL kmeňu 21 nM a pre RANTES(3-68) bolo zodpovedajúce IC₅₀ 0,65 nM. IC₉₀ pre RANTES(l-68) bolo viac ako 133 nM, zatiaľ čo IC_9n pre RANTES(3-68) bolo 63 nM. Aj z tabuľky 5 je zrejmé, že RANTES(l-68) v skutočnosti nebolo aktívne v HOS.CD4.CCR5 bunkách (IC₅₀ > 133 nM), zatiaľ čo RANTES(3-68) je účinný inhibítor HIV-1 BaL replikácie v týchto bunkách (IC₅₀: 5,5 nM). V týchto bunkách sa však nedosiahli žiadne IC₉₀ hodnoty pre žiadnu z dvoch foriem RANTES.

Antivrusový účinok RANTES je závislý od prítomnosti na membránu naviazaného alebo rozpustného CD26 (sCD26)

Stanovila sa CD26 expresia na dvoch rozličných CCR5-transfekovaných bunkových líniách a na čerstvo izolovaných PBMC. HOS transfektanty boli negatívne z hľadiska CD26 expresie, čo sa stanovilo prietokovou cytometrickou analýzou, zatiaľ čo U87 transfektanty sa farbili slabo, ale signifikantne pozitívne s antiCD26 monoklonálnou protilátkou (obrázok 9). Navyše sa zistilo, že subpopulácia čerstvo izolovaných PMBC je silne pozitívna z hľadiska CD26 expresie (obrázok 9).

Od koncentrácie závislý účinok RANTES(l-68) a RANTES(3-68) na produkciu vírusového p24 antigénu BaL kmeňom v HOS.CD4.CCR5 transfekovaných bunkách v prítomnosti sCD26 je znázornený na obrázku

10. pridanie sCD26 spolu s RANTES(l-68) na začiatku HIV infekcie významne posilňuje antivírusový účinok intaktného RANTES v HOS.CD4.CCR5 bunkách. Keď sa pridal sCD26 v množstve 50 U/l spolu s RANTES, získala sa pre RANTES IC₅₀ hodnota 13 nM. Pridanie samostatného sCD26 nemalo žiadny vplyv na replikáciu vírusu. Pridanie sCD26 ku RANTES(3-68) tiež nezmenilo antivírusový účinok RANTES(3-68) (údaje nie sú uvedené). Z toho vyplýva, že prítomnosť CD26 je nevyhnutná preto, aby mal intaktný RANTES antivírusový účinok.

Skrátenie MIP-la na aminokonci neovplyvňuje anti-HIV-1 chemotaxiu ani Ca²⁺-mobiližačný účinok

Keďže väčšina prirodzených MIP-la je skrátených na NH-konci (štyri amino-kyseliny), skúmali sme, či tento skrátený MIP-la(5-70) má zmenenú HIV-1 inhibičnú schopnosť. Na rozdiel od výsledkov získaných pre RANTES, neboli zistené žiadne významné rozdiely pre IC₅₀ hodnoty intaktného MIP-la a MIP-la(5-70) v PMBC alebo CCR5-transfekovaných bunkách (tabuľka 5, obrázok 8). Navyše, sa intaktný MIP-la a skrátený MIP-la(5-70) porovnávali v chemotaktickom teste a v teste Ca²⁺-mobilizácie v THP-1 monocytových bunkách. Z tabuľky 6 je zrejmé, že minimálna účinná dávka MIP-lot(5-70) indukujúca zvýšenie [Ca²]i bola len mierne nižšia ako minimálna účinná dávka intaktného MIP-la. Navyše, hoci maximálna migrácia získaná pri 0,13 nM v teste chemotaxie bola vyššia ako pre intaktný MIP-la, minimálne účinné koncentrácie oboch MIP-la ízoforiem boli dosť podobné. Vzhľadom na uvedené je potrebné zhrnúť, že MIP-la skrátenie na NH₂-konci, na rozdiel od RANTES, len minimálne oslabuje jeho zápalovú a anti-HIV-1 aktivitu.

Tabuľka 5

Anti-HIV-1 aktivita RANTES a MIP-la v PH A-stimulovaných PMBC, U87.CD4CCR5 bunkách

	RANTES(l-68)	RANTES(3-68)	MIP-la(l-70)	MIP-la(5-70)
	IC50	IC₉₀	ic₅₀	IC₉o	IC_5O	IC₉₀	IC50	ic₉₀
PMBC BaL	3,4	71	0,39	6,9	1,9	62	1,6	13
SF 162	23	95	2,0	8,2	3,1	30	3,6	32
U87.CD4.CCR5I BaL	21	>130	0,65	63	ND	ND	ND	ND
HOS.CD4.CCR5 BaL	>130	>130	5,5	>130	32	>130	21	>130

Výťažok vírusov sa monitoroval v bezbunkovom supematante 8 až 12 dní po infekcii prostredníctvom p24 antigénovej ELISA. Znázornený je priemer IC₅₀ a IC₉₀ hodnôt (v nM). Údaje predstavujú priemer dvoch alebo štyroch nezávislých experimentov. Hodnota označená ako „>130“ znamená, že 50 % alebo 90 % inhibícia sa pri 130 nM nedosiahla. ND znamená nebolo uskutočnené.

Tabuľka 6

Chýbanie rozdielu v biologickom potenciáli medzi intaktným a skráteným MIP-Ia

Chemokín	Chemotaxia*	Zvýšenie kone. [Ca²⁺]i⁺
	nM	CI	nM	nM [Ca²],
MIP-la(l-70)	1,3	8,5 + 3,3	3,9	240/195
	0,13	22,2 ± 4,4	0,39	120/195
	0,013	5,7 ± 1,6	0,34	30/14
	0,0013	4,0 ±3,1
MIP-la(5-70)	1,3	14,2 ± 0,4	4,0	196/178
	0,13	11,4 ±2,9	0,4	71/33
	0,013	3,8 ±1,4	0,04	10/<10
	0,0013	2,1	±0,6

* Migrácia monocytových THP-1 buniek cez 5,0 pm póry mikrokomôrky. Výsledky predstavujú priemer ±SEM troch nezávislých experimentov ⁺ Detekcia zvýšenia [Ca²⁺]i v THP-1 bunkách. Znázornené sú výsledky dvoch nezávislých experimentov.

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie:

(i) Prihlasovateľ:

(A) Meno: APPLIED RESEARCH SYSTEMS ARS HOLDING N.V.

(B) Ulica: 14 JOHN B. GORSIRAWEG (C) Mesto: CURACAO (E) Krajina: Holandské Antily (F) Poštový kód (ZIP): žiadny (G) Telefón: 599-9-639300 (H) Telefax: 599-9-614129 (ii) Názov vynálezu: RANTES skrátený na aminokonci ako antagonista chemokínov (iii) Počet sekvencii: 2 (iv) Forma snímateľná počítačom:

(A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (2) Informácie o sekv. č. 1:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) Dĺžka: 91 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien:

(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-sense: nie (ix) Znaky:

(A) Meno/kľúč: Proteín (B) Poloha!.68 (xi) Opis sekvencie: sekv. č. 1:

Met

Lys

Val

Ser -20

Ala

Arg

Leu

Ala -15

Val

íle

Leu

íle

Ala -10

Thr

Ala

Leu

Cys

Ala

Pro

Ala

Ser

Ala

Ser

Pro

Tyr

Ser

Asp

Thr

Pro

-5

1

5

Cys

Phe

Ala

Tyr

íle

Ala

Arg

Pro

Leu

Pro

Arg

Ala

His

íle

Lys

10

15

20

25

Glu

Tyr

Phe

Tyr

Thr

Ser

Gly

Lys

Cys

Ser

Asn

Pro

Ala

Val

Phe

30

35

40

Val

Thr

Arg

Lys

Asn

Arg

Gin

Val

Cys

Ala

Asn

Pro

Glu

Lys

Trp

45

50

55

Val

Arg

Glu

Tyr

íle

Asn

Ser

Leu

Glu

Met

Ser

65 (2) Informácie o sekv. č. 2:

(i) Charakteristiky sekvencie:

(A) DÍžka: 66 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien:

(D) Topológia: lineárna (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: nie (iv) Anti-sense: nie (xi) Opis sekv. č. 2:

Tyr

Ser

Asp

Thr

Pro

Cys

Phe

Ala

Tyr

íle

Ala

Arg

Pro

1

5

10

15

Leu

Pro

Arg

Ala

His

íle

Lys

Glu

Tyr

Phe

Tyr

Thr

Ser

Gly

Lys

Cys

20

25

30

Ser

Asn

Pro

Ala

Val

Phe

Val

Thr

Arg

Lys

Asn

Arg

Gin

Val

Cys

35

40

45

Ala

Asn

Pro

Glu

Lys

Trp

Val

Arg

Glu

Tyr

íle

Asn

Ser

Leu

Glu

55 60

Met Ser

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. RANTES skrátené na aminokonci, ktorým chýbajú NH₂-koncové aminokyseliny zodpovedajúce aminokyselinovým zvyškom 1 až 2 prirodzene sa vyskytujúceho RANTES, a ktoré majú antagonistický účinok proti chemokínom.
2. RANTES skrátený na aminokonci podľa nároku 1, ktorý má amino-kyselinovú sekvenciu rovnakú ako sekvencia č. 2.
3. RANTES skrátené na aminokonci podľa jedného alebo viacerých predchádzajúcich nárokov v glykozylovanej forme.
4. DNA molekuly, ktoré obsahujú DNA sekvencie kódujúce RANTES skrátené na aminokonci podľa jedného alebo viacerých predchádzajúcich nárokov vrátane nukleotidových sekvencií, ktoré vďaka degenerácii genetického kódu tiež kódujú daný proteín.
5. Expresný vektor, ktorý obsahuje DNA molekulu podľa nároku 4.

5
6. Hostiteľská bunka, ktorá obsahuje expresný vektor podľa nároku 5.
7. Rekombinantný spôsob prípravy proteínov podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu buniek podľa nároku 6 v príslušnom kultivačnom médiu.
8. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 spolu s jedným alebo viacerými farmaceutický prijateľnými nosičmi a/alebo vehiku-

10 lamí.
9. Proteín podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 na použitie ako liečivo.
10. Použitie proteínu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3 na výrobu liečiva na liečbu a/alebo diagnostiku chorôb, pri ktorých sa vyžaduje antagonizovanie účinkov chemokinov.
11. Použitie podľa nároku 10 na výrobu liečiva na liečbu zápalových chorôb, HlV-infekcie, chorôb týka15 júcich sa angiogenézy a hematopoézy a nádorov.