CZ20001147A3

CZ20001147A3 - Amino-terminálně zkrácený RANTES jako antagonista chemokinů

Info

Publication number: CZ20001147A3
Application number: CZ20001147A
Authority: CZ
Inventors: Paul Proost; Sofie Struyf; Damme Jo Van
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N. V.
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2000-09-13
Also published as: CA2305017A1; KR100560275B1; KR100542934B1; US6905676B2; PT1439231E; JP2001518297A; UA73080C2; CN1490049A; PT1021541E; JP4233214B2; NO20001584L; PL196427B1; BG104267A; HK1032426A1; CN1233415C; EP0905240A1; US20030124677A1; EA003940B1; ZA988675B; ES2287601T3

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká amino-terminálně zkráceného RANTES, který nemá NH^-terminální aminokyseliny odpovídající aminokyselinovým zbytkům l, 1-2, 1-3 nebo 1-4 přirozeného RANTES a který má antagonistickou aktivitu vzhledem k tomuto chemokinu, dále se týká cDNA sekvence kódující tento zkrácený chemokin, jeho použití v terapii a/nebo diagnostice onemocnění, u kterých je žádoucí antagonistická aktivita chemokinu, a farmaceutických prostředků obsahujících tento chemokin.

Dosavadní stav techniky

Chemokiny tvoří rodinu malých prozánětlivých cytokinů s chemotaktickými a aktivačními vlastnostmi pro leukocyty. Podle pozice prvních cysteinů může být rodina chemokinů dělena na C-C, C-X-C a C-X -C chemokiny (Baggiolini M. et al., 1994; Baggiolini M. et al., 1997; a Taub, D. et al., 1996).

Mnoho C-X-C chemokinů, jako je interleukin 8 (IL-8), jsou chemotaktické faktory pro neutrofily, zatímco C-C chemokiny, jako je monocytový chemotaktický protein 3 (MCP-3) , jsou aktivní na různé leukocyty, včetně monocytů, lymfocytů, eosinofilů, bazofilů, NK buněk a dendritických buněk.

NH_z-koncová doména chemokinů se účastní vazby na receptor a zpracování NH₂ konce může aktivovat chemokiny, může redukovat aktivitu chemokinu nebo může zcela inaktivovat chemokin.

Z C-X-C chemokinu destičkového bazického proteinu se stává neutrofilový chemotaktický peptid (NAP-2) pouze po odstranění 24 • · · · • ·

9 9

NH₂-koncových zbytků (Walz A. et al., 1989 a Van Damme J. et al., 1990) .

Delece až 8 NH₂-koncových zbytků z IL-8 vede k vyšší chemotaktické aktivitě, ale další štěpení Glu-Leu-Arg motivu, který je umístěn před prvním Cys ve všech chemotaktických C-X-C chemokinech, způsobuje kompletní inaktivaci (Clark-Lewis I. et al., 1991) .

Podobně, NH₂-koncová proteolýza (až 8 aminokyselin) jiného C-X-C chemokinů, granulocytového chemotaktického proteinu 2 (GCP-2), nemá žádný vliv na chemotaktickou aktivitu neutrofilů (Proost, P. et al., 1993a).

RANTES (což je akronym pro Regulated upon Activation, Normally T Expressed, and Presumably Secreted) je C-C chemokin, jehož cDNA klon byl izolován z cDNA knihovny bohaté na sekvence specifické pro T buňky (Schall T.J. et al., 1988).

Syntetické C-C chemokiny MCP-1, MCP-3 a RANTES bez 8-9 NH₂-koncových aminokyselin jsou inaktivní pro monocyty a jsou použitelné jako antagonisté receptorů (Gong J. et al., 1996; a Gong J. et al., 1995).

Prodloužení RANTES o jeden methionin vede ke kompletní inaktivaci molekuly a Met-RANTES se chová jako antagonista vzhledem ke skutečnému RANTES (Proudfoot A.E. et al., 1996).

Podstata vynálezu

Hlavním předmětem předkládaného vynálezu je amino-zkrácený RANTES, jemuž chybí NH₂-koncové aminokyseliny odpovídající aminokyselinovým zbytkům 1, 1-2, 1-3 nebo 1-4 přirozeného RANTES a který má antagonistickou aktivitu vzhledem k chemokinů.

Přesněji je předmětem předkládaného vynálezu RANTES (3-68), což je RANTES, kterému chybí první 2 aminokyseliny, jak je uveden na obr. 1 a v SEQ ID NO: 2.

Amino-terminálně zkrácený RANTES podle předkládaného vynálezu může být v glykosylované nebo v neglykosylované formě.

Termín antagonista chemokinů znamená působící antagonisticky vzhledem k přirozenému kompletnímu chemokinů.

Jiným předměetm předkládaného vynálezu je molekula DNA obsahující DNA sekvenci kódující amino-koncově zkrácený RANTES podle předkládaného vynálezu, včetně v podstatě stejných nukleotidových sekvencí. cDNA sekvence intaktního RANTES je popsána v Schall T.J. et al. (1988) a cDNA zkráceného RANTES může být snadno odvozena z této sekvence.

Termín v podstatě stejná nukleotidová sekvence zahrnuje všechny další nukleotidová sekvence, které - z důvodů degenerace genetického kódu - také kódují danou aminokyselinovou sekvenci.

Vynález také obsahuje expresní vektory obsahující výše uvedené DNA, hostitelské buňky transformované takovými vektory a způsob přípravy takových amino-terminálně zkrácených RANTES podle předkládaného vynálezu pomocí kultivace uvedených transformovaných buněk ve vhodném kultivačním mediu.

DNA sekvence kódující proteiny podle předkládaného vynálezu může být insertována a ligována do vhodného plasmidu. Po přípravě je expresní vektor vložen do vhodné hostitelské buňky, která potom exprimuje vektor za zisku požadovaného proteinu.

*·♦· «· • · • · ·· ··

Exprese jakéhokoliv rekombinantního proteinu podle předkládaného vynálezu, jak je zde popsána, může být provedena v eukaryotických buňkách (například v kvasinkách, hmyzích nebo v savčích buňkách), nebo v prokaryotických buňkách, za použití vhodných expresních vektorů. Může být použita jakákoliv v oboru známá technika.

Například, DNA molekuly kódující proteiny získané jakýmkoliv výše uvedeným způsobem jsou insertovány do vhodně konstruovaných expresních vektorů technikami známými v oboru (viz Sambrook et al., 1989). Dvouřetězcová cDNA je navázána na plasmidové vektory homopolymerním napojením nebo restrikční vazbou vyžadující použití syntetických DNA linkerů nebo technik ligace lepivých konců: DNA ligasy jsou použity pro ligaci DNA molekul a nežádoucí vazbě je zabráněno reakcí s alkalickou fosfatasou.

Pro umožnění exprese požadovaného proteinu by měl expresní vektor také obsahovat specifické nukleotidové sekvence obsahující transkripční a translační regulační sekvence navázané na DNA kódující požadovaný protein takovým způsobem, aby umožňovaly expresi genu aprodukci proteinu. Za prvé, před genem, který má být transkribován, musí být umístěn promotor rozpoznávaný RNA polymerasou, na který se tato polymerasa naváže a tak iniciuje proces transkripce. Používá se mnoho takových promotorů, které pracují s různou účinností (silné a slabé promotory).

Pro eukaryotické hostitele mohou být použity různé transkripční a translační regulační sekvence, které jsou vybrané podle vlastností hostitele. Mohou být získány z virových zdrojů, jako jsou adenoviry, hovězí papiloma-viry, Simian virus a podobně, kde tyto regulační signály jsou asociovány s určitým genem, který má vysokou úroveň exprese. Příklady jsou TK promotor Herpes viru, SV40 časný promotor, kvasinkový gal4 promotor, atd.

Transkripční iniciační regulační signály mohou být vybrány tak, že umožňují represi a aktivaci a tím modulování exprese genů.

DNA molekula obsahující nukleotidovou sekvenci pro protein podle předkládaného vynálezu je insertována do vektoru obsahuj ícího operativně navázané transkripční a translační regulační signály, který může integrovat vybranou genovou sekvenci do hostitelské buňky.

Buňky, které byly stabilně transformované vloženou DNA mohou být selektovány tak, že je do nich zároveň vložen jeden nebo více markérů umožňujících selekci hostitelské buňky obsahující expresní vektor. Markér může také udělovat fototrofii auxotrofnímu hostiteli, může způsobovat bioresistenci na biocidy, například na antibiotika nebo těžké kovy jako je měď, a podobně. Vybraný markerový gen může být navázán přímo na exprimovanou DNA sekvenci, nebo může být vložen do stejné buňky současnou transfekci. Pro optimální syntézu proteinů podle předkládaného vynálezu mohou být také nutné další elementy.

Mezi významné faktory při výběru určitého plasmidů nebo virového vektoru patří: schopnost rozpoznání a selekce hostitelských buněk obsahujících vektor od hostitelských buněk neobsahujících vektor; počet kopií vektoru, které jsou nutné v určitém hostiteli; a to, zda je požadováno, aby se jednalo o kyvadlový vektor pro hostitelské buňky různých druhů.

Po přípravě vektoru nebo DNA sekvence osbahující konstrukt pro expresi, může být DNA konstrukt vložen do vhodné hostitelské buňky jakoukoliv vhodnou technikou: transformací, transfekci, konjugací, protoplastovou fúsí, elektroporací, srážením fosforečnanem vápenatým, přímou mikroinjekcí, atd.

Hostitelské buňky mohou být prokaryotické nebo eukaryotické.

• · « · * · · · • · • ···

Výhodné jsou eukaryotické buňky, například savčí buňky, jako jsou lidské, myší buňky a ovariální buňky čínského křečka (CHO), protože umožňují post-translační modifikace proteinových molekul, včetně správného skládání a nebo glykosylace ve správných pozicích. Také kvasinky mohou provádět post-translační modifikace peptidu včetně glykosylace. Existuje mnoho rekombinantních DNA strategií, které využívají sekvence silných promotorů a vysokého počtu kopií plasmidu, které mohou být použity pro produkci požadovaných proteinů ve kvasinkách. Kvasinka rozpoznává vedoucí sekvenci na klonovaném savčím genovém produktu a secernuje peptidy obsahující vedoucí sekvenci (t.j. prepeptidy).

Po vložení vektoru jsou hostitelské buňky kultivovány v selektivním mediu, ve kterém selektivně rostou buňky obsahující vektor. Exprese sekvence klonovaného genu vede k produkci požadovaných proteinů.

Amino-koncově zkrácený RANTES podle předkládaného vynálezu může být připraven jakýmkoliv jiným postupem známým v oboru, konkrétně dobře známými postupy chemické syntézy, využívajícími automatických syntezátorů na pevné fázi, po které následuje chromatografické přečištění.

Chemokiny podle předkládaného vynálezu mohou být, například, syntetizovány Fmoc (9-fluorenylmethoxykarbobnyl), tBoc (t-butoxykarbonyl) nebo jinou podobnou chemickou syntézou s nebo bez vhodných chránících skupin pro vedlejší řetězce na různých aminokyselinách. Aminokyseliny s nebo bez vhodných chránících skupin pro vedlejší řetězce jsou preaktivovány - například HBTU/HOBt (2-(ΙΗ-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluromiumhexafluorfosfat/l-hydroxybenztriazolem)

- a jsou navázány na rostoucí peptidový řetězec. Před adicí dalšího zbytku je z -amino skupiny odstraněna chránící skupina « · · · · · » · (například Fmoc). Po syntéze jsou všechny chránící skupiny odstraněny a intaktní kompletní peptidy jsou přečištěny a chemicky nebo enzymaticky skládány (včetně tvorby disulfidových můstků mezi cysteiny) na příslušné chemokiny podle předkládaného vynálezu.

Přečištění přirozených, syntetických nebo rekombinantních proteinů je provedeno jakoukoliv v oboru známou metodou, t.j. konvenčními postupy obsahujícími extrakci, srážení, chromatografií, elektroforesu a podobně (viz například Proost P. et al., 1996).Dalším přečištěním, které může být použito pro přečištění proteinů podle předkládaného vynálezu, je afinitní chromatografie využívající monoklonálních protilátek nebo afinitity pro heparin, které se váží na cílový protein a které jsou připraveny a imobilizovány na gelové matrici obsažené v koloně. Surové přípravky obsahující proteiny jsou vneseny do kolony. Protein se naváže na kolonu prostřednictvím specifické protilátky, zatímco nečistoty procházejí kolonou. Po promytí se protein eluuje z gelu změnou pH nebo iontové síly.

Amino-terminálně zkrácený RANTES podle předkládaného vynálezu je užitečný pro terapii a/nebo diagnostiku onemocnění, při který je požadována antagonizace aktivity chemokinu. Příklady takových onemocnění jsou: zánětlivá onemocnění, onemocnění související s angiogenesí a hematopoesou, nádorová onemocnění, infekční onemocnění, včetně HIV, autoimunitní onemocnění, atherosklerosa, onemocnění plic a onemocnění kůže. Výhodné použití je v oblasti infekce HIV.

Proto předkládaný vynález v dalším aspektu obsahuje použití proteinu podle předkládaného vynálezu při výrobě léku pro léčbu výše uvedených onemocnění.

• ·

Lék je výhodně připraven ve formě farmaceutického prostředku obsahujícího protein podle předkládaného vynálezu spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči a/nebo přísadami. Takové farmaceutické prostředky jsou ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob léčby výše uvedených onemocnění obsahující podání farmakologický aktivního množství amino-terminálně zkráceného RANTES podle předkládaného vynálezu jedinci, u kterého existuje riziko vzniku takového onemocnění nebo jedinci, u kterého již existuje takové onemocnění.

Také bylo zjištěno, že CD26/DPP IV může vytvořit NH₂-terminálně zkrácený RANTES in vitro. RANTES je prvním cytokinem, u kterého bylo popsáno, že jeho biologická aktivita může být modifikována CD26/DPP IV.

Proto je dalším předmětem vynálezu použití CD26/DPP IV v terapii a/nebo diagnostice onemocnění, u kterých je žádoucí antagonizace účinků chemokinu, zejména při léčbě zánětlivých, imunitních a infekčních onemocnění.

Předkládaný vynález představuje první příklad identifikovaného mechanismu pro modifikaci endogenní regulace chemokinů pomocí antagonistického, podobného fyziologického zpracování, které je zprostředkované jinými faktory (proteasami). Použití takových faktorů (proteas) v terapii a/nebo diagnostice výše uvedených onemocnění je také zahrnuto v předkládaném vynálezu.

Předkládaný vynález bude nyní popsán v následujících příkladech, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

V příkladech jsou uvedeny odkazy na obrázky uvedené dále.

• ••ti titi • · ti ti ti ti ·· ·· • · · · · · · • · ··· ti titi · • · ··· titi · • · · titititi ·· ··· ·· titi

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 ukazuje aminokyselinovou sekvenci RANTES. Signální sekvence jsou uvedeny kurzívou, zatímco C-zbytky jsou tučným písmem. Šipky ukazují první aminokyseliny amino-terminálně zkráceného RANTES podle předkládaného vynálezu, který je také označen jako RANTES(3-68).

Obr. 2. Chemotaktické vlastnosti intaktního a NH -terminálně 2 zkrácených forem přirozeného a nebo rekombinantního RANTES pro monocytární THP-1 buňky byly srovnávány v Boydenově testu v mikrokomůrce: Přirozený RANTES(1-68) (Δ), přirozený, zkrácený RANTES (3-68) (tl) , intaktní rekombinantní RANTES(l-68) (4) , a CD26/DPP IV štěpený rekombinantní RANTES(3-68) (a).

Výsledky představují průměrný chemotaktický index SEM pro čtyři nebo více nezávislých pokusů.

Obr. 3. Účinek přirozeného RANTES(3-68) (Q), přirozeného

RANTES(1-68) (A), rekombinantního RANTES(1-68 (A) a rekombinantního CD26/DPP IV zpracovaného RANTES(3-68) (β) na (Ca²*) v THP-1 buňkách. Výsledky jsou uvedeny jako průměrné zvýšení (Ca²*).. SEM pro tři nebo více nezávislé pokusy.

Obr. 4 ukazuje desensitizaci Ca²*-mobilizační aktivity intaktního recRANTES(1-68) za použití RANTES(3-68). THP-1 buňky byly nejprve stimulovány pufrem nebo různými koncentracemi rekombinantního RANTES(1-68) nebo RANTES(3-68). Výsledky jsou uvedeny jako průměrné SEM (ze tří nebo více nezávislých pokusů) zvýšení (Ca²*) v odpovědi na 30 ng/ml intaktního rekombinantního RANTES jako druhého stimulu.

Obr. 5. Srovnání chemotaktické účinnosti zkráceného RANTES(3-68) s intaktním RANTES(1-68). Chemotaktická aktivita přirozeného • · • 9 ► 9 · · ·

Φ · • ··· (nat) a rekombinantního (rec) zkráceného RANTES, intaktního RANTES a synetického MCP-3 pro eosinofilní granulocyty byla stanovena v mikrokomůrkovém testu. Výsledky jsou uvedeny jako průměrný chemotaktický index (Cl) SEM ze dvou nebo více nezávislých pokusů (každý byl proveden třikrát).

Obr. 6. Inhibice mobilizace vápníku za použití intaktního RANTES v CCR transfektantech. Pokusy testující mobilizaci vápníku byly provedeny na HOS buňkách transfektováných CD4 a receptory pro CC chemokiny CCR1 nebo CCR5. Buňky byly nejprve stimulovány různými koncentracemi intaktního nebo zkráceného RANTES a potom byly stimulovány 100 ng/ml intaktního RANTES. Je uvedeno procento inhibice zvýšení (Ca²'^t)_i indukovaného druhým stimulem. Toto procento bylo vypočítáno srovnáním odpovědi na 100 ng/ml intaktního RANTES po adici RANTES(1-68 nebo RANTES(3-68) s odpovědí po stimulaci pufrem (100%). Výsledky jsou uvedeny jako průměrná procentuální inhibice SEM pro dva nebo více pokusů.

Obr. 7. Silný inhibiční účinek RANTES(3-68) na infekci mononukleárních buněk HIV-1. PHA-aktivované PBMC byly infikovány M-tropickým HIV-1 Ba-L kmenem za přítomnosti různých koncentrací RANTES(1-68) nebo RANTES(3-68) (0 až 1000 ng/ml přidaných v době infekce). Po deseti dnech bylo stanoveno množství viru v buněčném supernatantu pomocí p24 Ag ELISA (je uveden jeden representativní pokus ze čtyř provedených).

Obr. 8. Efekty RANTES(1-68) a RANTES(3-68) na infekci HIV-1 SF162 kmenem v PHA-aktivovaných PBMC. Množství viru bylo stanoveno v buněčném supernatantu 10 dnů po infekci za použití p24 Ag ELISA. Jsou uvedeny výsledky jednoho reprezentativního pokusu ze tří provedených. * pod detekčním limitem p24 Ag ELISA ( 5 pg/ml).

• · * · ·«

Obr. 9 . Exprese CD26 na HOS . CD4 . CCR5 buňkách, U87 . CD4 . CCR5 buňkách a čerstvě izolovaných PBMC. Procento (%) CD26 pozitivních buněk je uvedeno v každém histogramu.

Obr. 10. Efekt RANTES(1-68), RANTES(l-68) plus SCD26 (50 U/l) a RANTES(3-68) na infekci HOS-CD4.CCR5 buněk HIV-1 BaL kmenem. Obsah viru byl stanoven v buněčném supernatantu 8 dnů po infekci za použití p24Ag ELISA. Jsou uvedeny výsledky jednoho reprezentativního pokusu ze tří provedených.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Amino-terminálně zkrácený RANTES

Materiál a metody

Činidla

Přirozený lidský RANTES byl produkován lidskými buňkami Malavu hepatosarkomu, buňkami MG-63 osteosarkomu nebo leukocyty periferní krve (Blood transfusion centers of Antwerp and Leuven) a byl přečištěn dříve popsaným způsobem (Proost P. et al. , 1996 a Proost P. et al., 1993). MCP-2, MCP-3 a GCP-2 byly syntetizovány Fmoc postupem (Proost P. et al., 1995, a Wuyts A. et al·., 1997), rekombinantní lidský RANTES byl získán od Peprotech (Rocky Hill, NJ) a rekombinantní MCP-1 byl získán od Dr. J.J. Oppenheim (NCI-NIH, Frederick, MD) .

Lidské osteosarkomové (HOS) buňky transfektované CD4 a jedním z receptorů pro CC chemokiny CCR1, CCR3 nebo CCR5 (Deng, H. et al., 1996) byly kultivovány v DMEM s glutamaxem. Puromycin (1 g/ml) byl přidán do media jako selekční činidlo. Všechna kultivační media (Gibco BRL/Life Technologies, Paisley, UK) byla •444 • * · · · · 4 4 • ·»· obohacena 10% FCS.

Lidský CD26/DPP IV byl získán z prostasomů, organel získaných z prostaty, které se vyskytují volně v seminální plasmě. Enzym byl přečištěn do homogenity způsobem popsaným dříve za použití iontoměniče a potom afinitní chromatograf i e na adenosindeaminase (De Meester I. et al., 1996).

Inkubace chemokinů s CD26/DPP IV a detekce proteolytického zpracování

100 až 1000-násobný molární nadbytek chemokinu byl inkubován přes noc s CD26/DPP IV v 100 mM Tris/HCl pH 7,7. Chemokiny byly separovány od CD26/DPP IV SDS-PAGE na Tris/Tricin gelovém systému způsobem, který byl popsán dříve (Proost, P. et al., 1996) .

Proteiny byly elektricky přeneseny na PVDF (polyvinylidenfluoridové) membrány (Problott, Perkin Elmer,

Foster City, CA) a byly barveny Coomassie brilantovou modří R250. Po odbarvení byly membrány promyty alespoň 5-krát ultračistou vodou (Milli Q; Millipore, Bedford, MA) .

Pro získání dostatečných množství čistého zkráceného chemokinu pro biologické testy bylo přibližně 50 g rekombinantního chemokinu zpracováno CD26/DPP IV a produkt štěpení byl okyselen 0,1% kyselinou trifluoroctovou (TFA). Pro zabránění adhese chemokinů na stěny zkumavky byl přidán Tween 20 (0,01%).

Chemokiny byly separovány od CD26/DPP IV v acetonitrilovém gradientu na C-8 Aquapore RP-300 koloně (1x50 mm) (Perkin Elmer). Frakce obsahující proteiny byly analyzovány SDS-PAGE a byly barveny stříbrem, jak bylo popsáno dříve.

β φ φ

• φ φ φφ φφ

Chemokiny zpracované CD26/DPP IV, které byly přečištěny RP-HPLC nebo které byly excidovány z PVDF blotů, byly sekvencovány na NH₂-konci za použití Edmanovi degradace na pulsním kapalinovém 477A/120A sekvenátoru proteinů (Perkin Elmer) za použití N-methylpiperidinu jako kopulační baze.

Detekce chemotaktické aktivity

Chemokiny byly testovány na svou chemotaktickou účinnost pro čerstvě izolované neutrofilní granulocyty periferní krve (10⁶buněk/ml) nebo pro kultivované monocytární THP-1 buňky (0,5 x 10⁶ buněk/ml) v Boydenově mikrokomůrce (Proost, P. et al.,

1996 a Proost, P. et al., 1993).

Po 45 minutách (granulocyty) nebo po 2 hodinách (THP-1 buňky) inkubace při 37 °C byly buňky fixovány a barveny. Buňky, které migrovaly přes polykarbonatové membrány s velikostí pórů 5 m byly počítány mikroskopicky v deseti imersních olejových polích.

Chemotaktický index (C.I.) vzorku (trojí provedení pro každou komůrku) byl vypočítán jako počet buněk migrujících do testovaného vzorku dělený počtem buněk migrujících do kontrolního media. V pokusech desensitizace byly buňky inkubovány s biologicky inaktivními variantami chemokinů po dobu 10 minut při 37 °C před tím, než byly vloženy do komůrky.

Procento inhibice C.I. získané inhibici s HBSS-zpracovanými kontrolními buňkami bylo vypočítáno pro hodnocení inhibice chemotaxe.

Detekce intracelulárních koncentrací Ca²*

Intracelulární koncentrace Ca²* ({Ca²*)J byla měřena způsobem • · · • · · « · ♦ • · 9

popsaným dříve (Wuyts A: et al., 1997). Stručně, přečištěné buěky byly inkubovány s fluorescentním indikátorem fzura-2 (2,5 M fura-2/AM, Molecular Probes Europe BV, Leiden, the Netherlands) a 0,01% Pluronic F-127 (Sigma, St. Louis, MO).

Po 30 minutách byly buňky dvakrát promyty, byly resuspendovány v HBSS s 1 mM Ca²* a byla provedena inkubace po dobu 10 minut při 37 °C před tím, než byla měřena fluorescence fura-2 pomocí LS50B luminiscentního spektrofotometru (Perkin Elmer). Po excitaci při 340 a 380 nm byla fluorescence detekována při 510 nm. (Ca²*)_± byl stanoven z Grynkiewiczovi rovnice (Grynkiewicz G. et al., 1985).

Pro stanovení byly buňky lyžovány za použití 50 M digitoninu. Potom bylo za použití 20 mM Tris upraveno pH na 8,5 a hodnota R_min byla získána po adici 10 mM EGTA k lyžovaným buňkám. Hodnota K^ů použitá pro kalibraci byla 224 nM. Pro desenzitizační pokusy byly buňky nejprve stimulovány pufrem nebo chemokinem v různých koncentracích. Jako druhý stimul byl přidán chemokin v koncentraci indukující významné zvýšení (Ca²*)± po prestimulaci pufrem. Bylo vypočítáno procento inhibice zvýšení (Ca²*)± v reakci na druhý stimul způsobené prestimulaci.

Inhibice HIV-1 infekce

HIV-1 M-tropické kmeny BaL a SF162 byly získány od MRC AIDS reagens project (Herts, UK). Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) od zdravých dárců byly izolovány centrifugací podle hustotního gradientu (5,23) a byly stimulovány PHA v koncentraci 1 g/ml (Sigma, Bornem, Belgium) po dobu 3 dnů při 37 °C. Aktivované buňky (PHA-stimulované blasty) byly promyty třikrát PBS a byly infikovány virem způsobem, který byl popsán dříve (Schols, D. et al., 1997). HIV-1 infikované neb o falešně infikované PHA-stimulováné blasty byly kultivovány za přítomnosti

U/ml IL-2 a různých koncentrací RANTES(1-68) nebo

RANTES(3-68) . Buněčný supernatant byl odebrán v den 10 a jaderný antigen HIV-1 v supernatantu byl stanoven za použití p-24 Ag ELISA kitu (DuPontNEN Life Sciences Products, Brussels, Belgium).

Výsledky

Identifikace a biologická charakterizace přirozeného,

NH -terminálně zkráceného RANTES 2

Různé NH₂-terminálně zkrácené formy lidského GCP-2 byly izolovány dříve (Proost, P. et al., 1993). Poslední zkrácená forma GCP-2 byla štěpena za Pro v předposlední pozici (GCP-2(3-75)) . Za použití podobných standardních technik přečištění byl C-C chemokin RANTES přečištěn z leukocytů periferní krve nebo ze sarkomových buněk (Proost, P. et al., 1996) .

Přesněji, kondicionované medium z MG-63 nebo Malavu sarkomových buněk indukovaných směsí cytokinů bylo frakcionováno pro izolaci přirozených variant chemokinů. Chemokiny byly potom přečištěny postupně protilátkovou nebo heparinovou afinitní chromatografii, kationtovou iontoměničovou chromatografii (mono S FPLC) a RP-HPLC a imunoreaktivní formy byly detekovány ELISA specifickou pro chemokiny. Na kationtové iontoměničové koloně bylo zjištěno, že IL-8 eluuje v těsné blízkosti RANTES (mezi 0,7 a 0,75 NaCl) . Nicméně, oba chemokiny byly od sebe separovány RP-HPLC (RANTES a IL-8 eluovaly při 27,5% a 30% acetonitrilu, v příslušném pořadí). Analýza aminokyselinové sekvence čistých proteinů potvrdila, že IL-8 existuje v jiných NH₂-terminálně zkrácených formách, které byly identifikovány dříve na základě jejich chemotaktické aktivity (VanDamme J. et al., 1989) . Nicméně, pro RANTES byla izolována pouze jedna forma, která *·9· 4* «

• 9 * « · • · 9 • 9

·*♦· • 99 postrádala dva NH₂-terminální zbytky ve srovnání s intaktním RAŇTES. Vzhledem k převládajícímu výskytu byl tento RANTES(3-68) analyzován podrobněji pro potvrzení jeho chemotaktické aktivity pro monocyty a eosinofily. Přesněji, RANTES(3-68) byl testován na chemotaktickou aktivitu a/nebo aktivitu uvolňující Ca²⁺ a jeho biologická účinnost byla srovnávána s účinností příslušných inaktivních chemokinů.

NH₂-terminální delece dvou zbytků z RANTES vedla k významnému snížení chemotaktické aktivity a Ca²-uvolňuj ící aktivity pro monocyty. Při srovnání s intaktním přirozeným RANTES (minimální účinná dávka 3-10 ng/ml) byl přirozený RANTES(3-68) zcela inaktivní při testování v koncentracích až 300 ng/ml v Boydenově mikrokomůrce (obr. 2) . Kromě toho, pro získání podobné Ca² reakce byly nutné 10-krát vyšší koncentrace přirozeného RANTES(3-68) než přirozeného RANTES(l-68) (obr. 3).

CD26/DPP IV odstraňuje NH₂-terminální dipeptidy chemokinů

Pro stanovení toho, zda může být aminopeptidasa CD26/DPP IV odpovědná za NH₂-koncové zkrácení RANTES, byl intaktní chemokin inkubován přes noc s CD26/DP IV, byl přenesen na PVDF membrány, byl barven Coomassie modří a byl podroben automatické Edmanově degradaci. Zpracování RANTES CD26/DPP IV vedlo k odstranění NH₂terminálních dipeptidů. Paralelní inkubace chemokinů s pufrem bez CD26/DPP IV neměla žádný účinek.

Protože jiné chemokiny obsahují konvenční sekvenci pro CD26/DPP IV štěpení a protože bylo prokázáno, že NH₂~konec MCP je zásadní pro biologickou aktivitu (Gong J. et al., 1996 a Gong J. et al., 1995), byly MCP-1, MCP-2 a MCP-3 také inkubovány s CD26/DPP IV.

··*·

• · ·· ···

Pó inkubaci byly MCP přeneseny na PVDF membrány a byly barveny Coomassie modří pro potvrzení toho, že bylo získáno dostatečné množství proteinu pro Edmanovu degradaci.

Nicméně, žádné NH₂-terminální sekvence nemohly být detekovány, což naznačuje, že CD26/DPP-IV nealteruje NH₂-konec MCP, který je blokován pro Edmanovu degradaci kyselinou pyroglutamovou.

Srovnání biologické aktivity intaktního RANTES a RANTES zpracovaného CD26/DPP IV

Podobné jako přirozený RANTES(3-68) byl C-8 RP-HPLC přečištěný rekombinantní RANTES zpracovaný CD26/DPP IV inaktivní v pokusech chemotaxe v Boydenově komůrce, když byl použit v koncentracích až do 1 g/ml, zatímco významná chemotaktická odpověď monocytů byla detekována při použití intaktního rekombinantního RANTES v koncentraci od 30 do 100 ng/ml (obr. 2).

Když byl efekt zkrácení testován v testu mobilizace Ca²*, indukoval RANTES(3-68) nízké, ale signifikantní zvýšení při 100 ng/ml. Intaktní RANTES byl nicméně aktivní již při 10 ng/ml (obr. 3). Ačkoliv byly odstraněny pouze dva NH₂-terminální zbytky, byl chemotaktický potenciál pro monocyty a Ca²*-mobilizační potenciál RANTES sníežn 10 až 100-krát.

RANTES(3-68) je přirozený antagonista chemotaxe pro intaktní RANTES

Vzhledem k inaktivitě RANTES(3-68) v pokusech chemotaxe monocytů jsme testovali, zda může tento zkrácený RANTES působit jako antagonista. RANTES (3-68) v koncentraci 1 g/ml takřka kompletně (82%) inhiboval chemotaktický účinek intaktního RANTES v koncentraci 100 ng/ml (tabulka l).

···· φ« • · #···

Když byl 3-násobný nadbytek RANTES (3-68) přidán do horní jamky, tak byla chemotaxe THP-1 buněk k intaktnímu RANTES inhibována o přibližně 50-70%. RANTES(3-68) při koncentraci 300 ng/ml může stále ještě inhibovat přibližně 30% chemotaktické odpovědi vyvolané stejnými koncentracemi intaktního RANTES.

V testech mobilizace Ca²* provedených na THP-1 buňkách (obr. 4) může inhibovat 30 ng/ml intaktního RANTES efekt 30 ng/ml intaktního RANTES o 39 5%. Přibližně 10-krát vyšší koncentrace

RANTES(3-68) byly nutné pro získání stejné úrovně inhibice. Nicméně, RANTES (3-68) v koncentraci 300 ng/ml vyvolává signifikantní Ca²* odpověď. Tato Ca²* reakce je srovnatelná s reakcí získanou při použití 30 ng/ml intaktního RANTES.

Tabulka 1: RANTES(3-68) inhibuje chemotaxi monocytů indukovanou RANTES (1-68) ^x

Chemokin (ng/ml)	Chemotaktické odpověď (CI)

—- norni jamka	uoj.ni jamka		%inhibice
RANTES (1-68)	RANTES (3-68)	A	B	C	D	- průměr SEM	průměr SEM
300	1000	12.5	7.5	27.5	50.5	25 ± 10	67 ±8
	300	22.0	20.5	72.5	79.5	49 ±16	31 ±13
	0	41.0	46.0	71.5	97.0	64 ±1 3	0
100	1000	4.0	3.0	13.5	11.0	8 ±3	82 ±4
	300	7.5	7.0	29.0	33.0	19±7	53 ±11
	0	24.0	21.5	50.0	44.5	35 ±7	0

^x Výsledek představuje chemotaktický index (C.I.) čtyř (A až D) nezávislých pokusů (včetně průměrů SEM) a procenta (%) inhibice (průměr SEM % inhibice čtyř pokusů) chemotaktické reakce k RANTES(1-68) po preinkubaci THP-1 buněk s inaktivním

RANTES(3-68) nebo s pufrem.

»000 0· • ·

Narušená chemotaktická aktivita RANTES(3-68) pro lidské monocyty a eosinofily *♦ 0000 • 0 < 000 *0 • 0 0 • 0 0 • 0 ·0

0 0

00

V tabulce 2je chemotaktická účinnost přirozeného RANTES(3-68) srovnávána s účinnosti monocytárního chemotaktického proteinu MCP-3 a intaktního RANTES(1-68). Je zřejmé, že MCP-3 a RANTES(1-68) jsou stále ještě chemotaktické pro čerstvě izolované monocyty periferní krve při koncentracích 3 ng/ml a 30 ng/ml, v příslušném pořadí, zatímco přirozený RANTES(3-68) zůstává inaktivní i při 100 ng/ml.

Redukovaná chemotaktická účinnost této přirozené varianty byla potvrzena s rekombinantním RANTES(3-68). I přes slabou chemotaktickou aktivitu pro monocyty (při l g/ml) vykazoval přečištěný rekombinantní RANTES(3-68) specifickou aktivitu, která je 10-krát nižší než aktivita intaktního rekombinantního RANTES.

Na závěr byla chemotaktická účinost RANTES(3-68) potvrzena na lidských eosinofilech, které stále ještě reagovaly na 100 ng/ml intaktního RANTES a 30 ng/ml MCP-3 (obr. 5) Podobně jako pro monocyty byla migrace eosinofilů stimulována pouze RANTES(3-68) v koncentraci l g/ml.

00 • 9 9 0 «0 Φ

0 0 0 » 0 0

00

Tabulka 2: Srovnání chemotaktické aktivity pro monocyty

RANTES(3-68) s aktivitou RANTES(1-68) a MCP-3

0000 0«

4 9 · • 0 ·0· • 0·· «

0 0 0 ·· 0000 * 0 • · * · « 0 0 ·

000

Monocytární chemotaktická aktivita**³

	MCP-3	natRÁNTES	recRANTES	recRANTES
		(3-68)	(1-68)	(3-68)
(ng/ml)	*
1000	_w		3.6 ±0.8 (6)	3.3 (1)
300	6.0 ±1.2 (6)	—	—	—
100	—	1.1 ±0.1 (3)	3.3 ±0.4 (6)	1.0(1)
30	6.9 ±1.0 (6)	1.7 ±0.2 (3)	—	—
10	—	1.9 + 0.6(3)	1.9 + 0.4 (6)	<i.o(i)
3	4.1 ±0.4 (6)	—	—	—

^a průměrný chemotaktický index Cl) SEM (n) pro čerstvě izolované monocyty periferní krve.

^to není stanoveno.

RANTES (3-68) působí přes CCR5 a inhibuje RANTES(1-68) prostřednictvím CCR5, ale ne přes CCR1 a CCR3

Pro objasnění snížené chemotaktické aktivity RANTES(3-68) byla testována kapacita vazby a signalizace této chemokinové varianty na různé znémé receptory pro RANTES.

HOS buňky trans fektované chemokinovými receptory CCRl, CR3 nebo CCR5 byly použity v signálním testu měřícím zvýšení koncentrace intracelulárního vápníku. Při koncentracích do 300 ng/ml RANTES(3-68) nezvyšoval (Ca²-)± v HOS buňkách transfektovaných CCRl (tabulka 3) nebo CCR3 (data nejsou uvedena), zatímco koncentrace 30 ng/ml a 100 ng/ml intaktního RANTES byly dostatečné pro zvýšení (Ca²⁺)i v CCRl a CCR3 transfektantech, v příslušném pořadí.

Nicméně, jak intaktní, tak zkrácený RANTES byly schopné indukovat významné zvýšení (Ca²*) v CCR5 transfektantech

• » · · • · e * • · ♦ « · * · · · · v koncentraci 30 ng/ml. Dále, preinkubace CCR5 transfektováných buněk s 3-10-násobným nadbytekm but RANTES(3-68), nebo intaktního RANTES vedla k stejné inhibici (přibližně 75%) zvýšení (Ca²*)_± po následné expozici intaktnímu RANTES (obr. 6).

Naopak, koncentrace 300 ng/ml RANTES(3-68) pouze marginálně inhibovala vápníkovou reakci CCR1 a CCR3 trans fekt ováných buněk na 100 ng/ml intaktního RANTES, zatímco 3-násobný nadbytek intaktního RANTES jako prvního stimulu téměř kompletně inhiboval elevaci (Ca²·)., v těchto buňkách následně přidaným RANTES (1-68) . Musí být učiněn závěr, že odstranění dvou NH₂-terminálních zbytků z RANTES má signifikantní vliv na přenos signálu v tom, že chemokínové receptory CCR1 a CCR3 nejsou nadále funkčně rozpoznávány. Proto může být narušená chemotaktická účinnost RANTES(3-68) vysvětlena jeho neschopností působit prostřednictvím CCR1 a CCR3. Naopak, RANTES (3-68) si plně uchovává CCR5 signalizační charakteristiky intaktního RANTES. RANTES(3-68) může působit protizánětlivé tím, že kompetuje s intaktním RANTES, ale může stále ještě působit jako HIV inhibitor proto, že si uchovává kapacitu vazby na CCR5.

Φ· ·· • · · ···· ·· • · · ·· ···· • · • ···

9 9 9

99 • ΦΦ • · · · • · · · • · 9 9

99

Tabulka 3: Mobilizace vápníku působením forem RANTES v CCR1 a CCR5 transfektantech------konc. zvýšeni [Ca²*]; ' (ng/mi) (nM)^a)

CCR1 CCR5

RANTES(l-68) 300

100

RANTES(3-68) 300

100 30 je uvedeno průměrné zvýšení více pokusech.

133 ± 5 (3)	96 ±1 (2)
100 ±28 (3)	60 ±4 (2)
25 ± 8 (3)	24 ±2 (2)
<15 (2)	<15(1)
19 ± 9 (3)	119 db 5 (2)
<15 ±0(3)	76 ±4 (2)
<15 (2)	56 ± 13 (2) <15 (1)
(Ca²*)_± v nM	SEM ve dvou

Inhibice CC chemokiny indukované chemotaxe za použití

RANTES(3-68) v lidských monocytárních buňkách.

Pro potvrzení toho, zda inhibice signalizace CC chemokinů za použití RANTES(3-68) probíhá také v monocytech, byly provedeny pokusy nan THP-1 buňkách. Bylo dokázáno, že RANTES(3-68) vykazuje 10-násobné snížení schopnosti vyvolat zvýšení (Ca²*)_±v monocytech ve srovnání s intaktním RANTES (data nejsou uvedena). Kromě toho, chemotaktický účinek intaktního RANTES (30 ng/ml) na monocyty byl inhibován (71%) inkubací testovaných buněk s 300 ng/ml RANTES(3-68), jak je uvedeno v tabulce 4.

Dále, RANTES (3-68) redukoval chemotakt ickou odpověď na jiné CC chemokiny, včetně monocytárního chemotaktického proteinu 3 (MCP-3) (67%), makrofágového inflamatorního proteinu la (MIP-l ) (61%) a MIP-1 (80%).

• · • ♦ « ♦ ♦ · · · ·

Tato zjištění ilustrují, že RANTES(3-68) působí jako širokospektry inhibitor migrace monocytů indukované jinými CC chemokiny.

Tabulka 4: Inhibice chemotaxe monocytů k CC chemokinů za použití RANTES(3-68) __________

chemokin' '		¹ Inhibice chemotaxe THP-l buněk ^1S
konc. (ng/ml)	pufrr^M	RANTES(3-68)^m	%inhibxcei
RANTES	30	19.0 ±6.6	3.7 ±0.6	71 ±16
MCP-3	30	48.5 ±9.3	24.9 ±2.0	45 ± 10
MCP-3	3	7.6 ±2.5	3.1 ±0.8	67 ± 13
MIP-1 α	30	6.2 ±2.4	3.0 ±1.1	61 ±22
ΜΊΡ-1β	300	4.3 ± 1.0	1.9 ±0.6	80 ± 12
kontrola		1.5 ±0.5	1.0 ±0.5

RANTES, MCP-3, MIP-1 , MIP-1 a pufr byly přidány jako chemoatraktanty do spodních jamek mikrokomůrky.

horní jamky mikrokomůrky byly naplněny THP-l buňkami preinkubovanými (10 min., 37 °C) s 300 ng/ml RANTES (3-68) nebo s pufrem.

průměrný Cl SEM pro čtyři nezávislé pokusy.

inhibice migrace indukované intaktními chemokiny za přítomnosti RANTES(3-68) v koncentraci 300 ng/ml.

CD26-specifické zkrácení RANTES je nutné pro jeho antivirovou aktivitu

Účinky různých forem RANTES byly nejprve hodnoceny proti dvěma různým M-tropickým kmenům HIV-1 (BaL a SF162) na lidských PBMC získaných od zdravých dárců krve. IC_so intaktního RANTES(1-68) proti BaL kmenu byl 3,4 nM a pro RANTES(3-68) byl IC_so 0,39 nM.

• ·

Hodnota IC_so pro RANTES (1-68) byla 71 nM, což byl přibližně desetinásobek hodnoty IC_SO pro RANTES(3-68) . Proti SF162 kmenu při testu na PBMC byl RANTES(1-68) (IC : 23 nM; IC : 95 nM) více než 10-krát méně aktivní než RANTES (3-68) (IC : 2 nM;

O

IC_9O ^: 8,2 nM) (tabulka 5). Účinky obou chemokinů v závislosti na koncentraci při koncentracích v rozmezí od 133 do 0,2 nM proti replikaci HIV-1 SF162 v PBMC jsou uvedeny na obr. 8. Koncentrace 5,2 nM RANTES(3-68) byla jasně účinná v redukci replikace viru, zatímco RANTES(1-68) byl při této koncentraci inaktivní. Nebyl pozorován žádný rozdíl v antivirové aktivitě mezi intaktním RANTES získaným od PeproTech nebo d RkD Systems.

Výrazný rozdíl v antivirové aktivitě mezi dvěma formami RANTES se ještě zvýraznil při testování na lidských buňkách transfektováných CCR5. V U78.CD4.CCR5 buňkách byla hodnota IC_sopro RANTES (1-68) a RANTES (3-68) proti BaL kmenu 21 nM a 0,65 nM, v příslušném pořadí. Hodnota IC_gQ pro RANTES (1-68) byla více než 133, zatímco hodnota IC_9o pro RANTES (3-68) byla 63 nM.V tabulce 5 je také uvedeno, že RANTES (1-68) byl v podstatě inaktivní v HOS.CD4.CCR5 buňkách (IC_so > 133 nM), zatímco RANTES(3-68) je účinný inhibitor HIV-l BaL replikace v těchto buňkách (IC_so: 5,5 nM) . Nicméně, žádné IC_QO hodnoty nebyly dosaženy pro obě formy RANTES v těchto buňkách.

Antivirová aktivita RANTES je závislá na přítomnosti membránového nebo solubilního CD26 (sCD26)

Byla hodnocena exprese CD26 na dvou různých CCR5-transfektováných buněčných liniích a na čerstvě izolovaných PBMC. HOS transfektanty byly negativní pro CD26 expresi, jak byl stanoveno analýzou průtokovou cytometrií, zatímco U87 transfektanty se barvily slabě, ale statisticky významně, pozitivně při použití anti-CD26 mAb (obr. 9) . Kromě toho bylo ···· ·· ·· 99t» • · · · · ·

9 9 9 9 99 9 .!······ zjištěno, že subpopula.ee čerstvě izolovaných PBMC je silně pozitivní na expresi CD26 (obr. 9).

Na koncentraci závislý efekt RANTES(1-68) a RANTES(3-68) na virovou p24 Ag produkci BaL kmenem v H0S.CD4.CCR5 transfektováných buňkách za přítomnosti sCD26 je znázorněn na obr. 10. Přidání sCD26, spolu s RANTES(1-68) na počátku HIV infekce, významně zvyšovalo antivirovou aktivitu intaktního RANTES v H0S.CD4.CCR5 buňkách. Když byl SCD26 v koncentraci 50 U/l přidán spolu s RANTES, byla získána pro RANTES hodnota IC_sQ13 nM. Přidání sCD26 samotného nemělo žádný vliv na replikaci viru. Přidání sCD26 k RANTES(3-68) také neměnilo antivirovou aktivitu RANTES(3-68) (data nejsou uvedena). Proto je přítomnost CD26 nutná pro to, aby se intaktní RANTES stal aktivním proti virům.

Amino-terminální zkrácení přirozeného MIP-1 neovlivňuje jeho anti-HIV-1, chemotaktické a Ca²*-mobil i začni aktivity.

Protože většina přirozeného MIP-1 je ve formě s NH₂~terminálním zkrácením (čtyř aminokyselin), zkoumali jsme, zda má tento zkrácený MIP-1 (5-70) změněnou inhibiční kapacitu pro HIV-1. Oproti výsledkům získaným pro RANTES nebyla detekována žádná statisticky významná odlišnost pro IC_so hodnoty intaktního MIP-1 a MIP-1 (5-70) v PBMC nebo CCR5-transfektovaných buňkách (tabulka 5, obr. 8). Dále byly intaktní MIP-1 a zkrácený MIP-1 (5-70) srovnávány v testu chemotaxe a mobilizace intracelulárního Ca²* na THP-l monocytech. Tabulka 6 ukazuje, že minimální účinná dávka MIP-1 (5-70) indukující zvýšení (Ca²*)_±byla pouze o málo nižší než minimální účinná dávka pro MIP-1 . Kromě toho, ačkoliv maximální migrace získaná při 0,13 nM v testu chemotaxe byla vyšší pro intaktní MIP-1 , byly minimální účinné koncentrace obou izoforem MIP-l v podstatě stejné. Dohromady • ·· · tyto výsledky naznačují, že NH^-terminální zpracování MIP-1 pouze minimálně oslabuje zánětlivou a anti-HIV-l aktivitu, což je v protikladu s výsledky získanými pro RANTES.

Tabulka 5: Anti-HIV-1 aktivita RANTES a MIP-1 v PHA-stimulovaných PBMC, U87.CD4,CCR5 buňkách

RANTES	1(1-68)	RANTES(3-68)	ME>-la(l-70)	MIP-la(5-70)
ICso	ICw	ic₅₀	IC90	IC₅₀	IC90	IC50	IC90
PMBC BaL 3.4	71	039	6.9	1.9	62	1.6	13
SF162 23	95	2.0	8.2	3.1	30	3.6	32
U87.CD4.CCR5 BaL 21	>130	0.65	63	ND	ND	ND	ND
HOS.CD4.CCR5 BaL >130	>130	5.5	>130	32	>130	21	>130

Výtěžek viru byl stanoven v buněčném supernatatntu 8-12 dnů po infekci za použití ELISA využívající virového antigenu p24. Jsou uvedeny průměrné IC_so a IC_go v nM. Data představují průměry ze dvou až čtyř nezávislých pokusů. Hodnota označená >130 znamená, že 50% nebo 90% inhibice nebyla dosažena při 130 nM. ND = neprovedeno.

» 0 • 0

Tabulka 6: Chybění odlišností v biologické účinnosti mezi intaktním a zkráceným MIP-1

Chemokin-	Chemotaxe*	Zvýšení	jčřy nM [Ca²⁺]i
nM	C.I	nM
MIP-la(l-70)	1.3	8.5 ±3.3	3.9	240/195
	0.13	22.2 ±4.4	0.39	120/130
	0.013	5.7 ±1.6	0.34	30/14
	0.0013	4.0 ±3.1
MIP-la(5-70	1.3	14.2 ±0.4	4.0	196/178
	0.13	11.4 ±2.9	0.4	71/33
	0.013	3.8 ±1.4	0.04	10/<10
	0.0013	2.1 ±0.6

* Migrace monocytů THP-1 skrz 5,0 m póry v mikrokomůrce. Výsledky jsou průměr SEM pro tři nezávislé pokusy.

+ Detekce zvýšení (Ca²*)_± v THP-1 buňkách. Jsou uvedeny výsledky dvou nezávislých pokusů.

♦ · • · »· »· *· · ·

Odkazy:

Baggiolini M. et al., Ann. Rev. Immunol., 55, 97-179,1994.

Baggiolini M. et al., Ann. Rev. Immunol., 15, 675-705, 1997.

Clark-Lewis I. et al., J Biol Chem., 266, 23128-23134, 1991.

De Meester I. et al., J. Immunol Methods 189,99-10526, 1996.

Deng H. et al., Nátuře., 381,661-666,1996.

Gong J. et al. J Exp. Med, 181, 631-640, 1995.

Gong J. etal., J.Biol Chem. 271, 10521-10527, 1996.

Grynkiewicz G. etal., J Biol Chem., 260, 3440, 1985.

Proost P.et al., Biochemistry, 32,10170-10177,1993a.

Proost P. et ai., J. Immunol, 150, 1000-1010, 1993.

Proost P. et al., Cytokine, 7, 97-104, 1995.

Proost P. et aL, Methods: A companion to Methods in Enzymol., 10, 82, 1996. Proudfoot A. E. et al., J. Biol Chem., 271,2599-2603, 1996.

Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Schall T. J. et al., J. Immunol, 141, 1918-1025, 1988.

Schols D. et al., J. Exp. Med., 186, 1383-1388, 1997.

Sozzani S. et al., J. Immunol, 152, 3615, 1994.

Taub D. et al., Cytokine & Growth Factor Reviews, 7, 335-76, 1996.

Van Damme J. et al., Eur. J. Biochem., 181,337-344, 1989.

Van Damme J. et al., Eur. J. Immunol., 20,2113-8,1990.

Van Damme J. et al., J. Exp. Med., 176, 59,1992.

Walz A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 969-75, 1989.

Wuyts A., et žL, Biochemistry, 36, 2716-2723, 1997.

• · · · · · • ·

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: Applied Research Systems ARS Holding N.V.

(B) Ulice: 14 Joohn B. Gorsiraweg (C) Město: Curacao (E) Stát: Nizozemské Antily (F) Poštovní kod (ZIP): Ne (G) Telefon: 599-9-639300 (H) Telefax: 599-9-614129 (ii) Název vynálezu: Amino-terminálně zkrácený RANTES jako antagonista chemokinů (iii) Počet sekvencí: 2 (iv) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.00, verze #1.30 (EPO) (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakterisitiky sekvence:

(A) Délka: 91 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: Ne (iv) Protismyslná: Ne (ix) Vlastnosti:

(A) Jmšno/klíč: protein (B) Umístění: 1..68 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

Met

Lys

Val

Ser Ala -20

Ala Arg

Leu

Ala -15

Val

Ile

Leu

Ile

Ala -10

Thr

Ala

Leu

Cys

Ala -5

Pro

Ala

Ser

Ala

Ser 1

Pro

Tyr

Ser

Ser 5

Asp

Thr

Pro

Cys 10

Cys

Phe

Ala

Tyr

Ile 15

Ala

Arg

Pro

Leu

Pro 20

Arg

Ala

His

Ile

Lys 25

Glu

Tyr

Phe

Tyr

Thr 30

Ser

Gly

Lys

Cys

Ser 35

Asn

Pro

Ala

Val

Val 40

Phe

• · · · φ · • * φ · · · φ · Φ · · φ · « · « • β · φ ··· * φ φ · φφ φ · φ φ φ · · φφ φ

ΦΦΦ Φ· φ ·ΦΦΦ • Φ φφ φφφ φφ φφ

Val Thr Arg Lys Asn Arg Gin Val Cys Ala Asn Pro Glu Lys Lys Trp

50 55

Val Arg Glu Tyr Ile Asn Ser Leu Glu Met Ser 60 65 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakterisitiky sekvence:

(A) Délka: 66 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:

(A) Jméno/klíč: protein (B) Umístění: 1..68 (xi) Popis sekvence: SEQ ID

NO: 2:

Tyr 1	Ser	Ser	Asp	Thr 5	Thr	Pro	Cys
Leu	Pro	Arg	Ala 20	His	Ile	Lys	Glu
Ser	Asn	Pro 35	Ala	Val	Val	Phe	Val 40
Ala	Asn 50	Pro	Glu	Lys	Lys	Trp 55	Val

Cys	Phe 10	Ala	Tyr	Ile	Ala	Arg 15	Pro
Tyr 25	Phe	Tyr	Thr	Ser	Gly 30	Lys	Cys
Thr	Arg	Lys	Asn	Arg 45	Gin	Val	Cys
Arg	Glu	Tyr	Ile 60	Asn	Ser	Leu	Glu

Met Ser

Claims

1. Amino-terminálně zkrácený RANTES, kterému chybí

NH_a-terminální aminokyseliny odpovídající aminokyselinovým zbytkům 1, 1-2, 1-3 nebo 1-4 přirozeného RANTES, který má antagonistickou aktivitu k chemokinů.

2. Amino-terminálně zkrácený RANTES podle nároku 1, kterému chybí NH₂-terminální aminokyseliny odpovídající aminokyselinovým zbytkům 1-2 přirozeného RANTES, který má antagonistickou aktivitu k chemokinů.

3. Amino-terminálně zkrácený RANTES podle nároku 1, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.

4. Amino-terminálně zkrácený RANTES podle jakéhokoliv z předchozích nároků v glykosylované formě.

5. DNA molekula obsahující DNA sekvenci kódující amino-terminálně zkrácený RANTES podle jakéhokoliv z předešlých nároků, včetně v podstatě stejných nukleotidovych sekvencí.

6. Expresní vektor obsahující DNA molekulu podle nároku 5.

7. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 6.

8. Rekombinantní způsob přípravy jakéhokoliv proteinu podle nároku laž4vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci buněk podle nároku 7 ve vhodném kultivačním mediu.

9. Protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 pro použití jako lék.

• 999 99 • 9

9 · »9 999 9

9 · • 9 9 9

9« 99 ► »9 β ► 9 9 « » 9 9 4

99 99

10. Použití proteinu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 pro výrobu prostředku pro terapii a/nebo diagnostiku onemocnění, při kterých je vhodné antagonizování účinků chemokinu.

11. Použití podle nároku 10 pro výrobu prostředku pro léčbu zánětlivých onemocnění, HIV infekce, onemocnění souvisejících s angiogenesí a hematopoesou a nádorových onemocnění.

12. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 spolu s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči a/nebo přísadami.

13. Použití CD26/DPP IV v terapii a/nebo diagnostice onemocnění, při kterých je vhodné antagonizování účinků chemokinu.

14. Použití podle nároku 13 pro léčbu zánětlivých, imunitních a infekčních onemocnění.