CN1183158C - Exendin类似物,其制备方法及含有它们的药物制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的可用于治疗糖尿病Exendin类似物，其制备方法及含有它们的药物制剂。exendin类似物衍生自序列号见右式。

Description

Exendin类似物，其制备方法及含有它们的药物制剂
本发明涉及可用于治疗糖尿病的exendin类似物，包括其制备及含有其的药用制剂。
发明背景
小肠和外分泌胰腺的功能联系在60年代可以精确测定血浆中胰岛素含量后被证明。口服葡萄糖的胰岛素反应比静脉给葡萄糖达到相同的血浆葡萄糖水平要强烈。这种“内分泌效果”可用肠-胰岛轴的功能结合来解释。进食后从小肠分泌的肠激素为此结果负责，以增长的可检测水平在血浆中循环并放大葡萄糖诱导的胰岛素分泌。除了经典的内分泌激素胃抑制多肽(GIP)，胰高血糖素样多肽1(GLP-1)目前引起人们很大兴趣。在相对短的时间内GLP-1从最有兴趣的生理水平内分泌激素候选物变为治疗II型糖尿病的潜在候选物。本发明描述了模仿天然发生的GLP-1分子效果的新物质。这些新物质的特点是保持效果的同时增加稳定性。
抗-糖尿病源的作用
灌注和皮下注射GLP-1可引起II性糖尿病人胰岛素分泌的显著增加和胰高血糖素的分泌抑制(Gutniak，M.(1992)；Kreymann，B.(1987)；Nathan，D.M.(1992)；Nauck，N.A.(1993a&b)).两者都有治疗学的价值并涉及GLP-1的降低血糖的效果：胰岛素促进靶组织摄取葡萄糖并抑制葡萄糖生成。进一步可预期GLP-1类似物增加外周的葡萄糖摄取。由于产生胰高血糖素的A细胞不表达GLP-1受体，胰高血糖素分泌抑制可认为是GLP-1的间接效果(Komatsu，R.(1989))。相反，胰岛素的增加和生长抑素释放是决定性因素。两种激素都是胰高血糖素释放的抑制剂。
两种机制对II型糖尿病中GLP-1诱导的胰岛素释放有意义。除直接增加葡萄糖诱导的胰岛素释放外，GLP-1使一亚群B细胞对关键刺激物“葡萄糖”(Fehmann，H.C.(1991))及其它可能的进一步刺激敏感以便所有的B细胞分泌胰岛素。这种引发效果是对GLP-1导致的胰岛素分泌延长的事实最可能的解释尽管它具有相对短的血浆半衰期。
该效应依赖于升高的葡萄糖水平(108mg/dl)(Goke，R.(1993a))。它与GLP-1的根本不同在于不依赖于葡萄糖的血清水平而影响胰岛素分泌的磺酰脲。如果葡萄糖值降低至低于108mg/dl，尽管皮内注射GLP-1，胰岛素的分泌会耗竭。因此当GLP-1用作治疗时很难见到低血糖。事实上在目前的临床研究中也未描述。然而，GLP-1的药动学性质还是有问题的。其作用的维持时间被其很短的半衰期所限制。
从治疗角度来看，合成稳定且强有效的GLP-1肽类似物是任何情况下所期望的。肽类似物现已基于分子exendin被合成，后者最初由蜥蜴的毒液分离而得，旨在发展对降解稳定且有较长作用时间的治疗糖尿病的改善的治疗制剂。这些肽与GLP-1有相同的药理效应，但令人惊奇的是它们具有相对长的半衰期。
被描述为本发明主题的这些新肽的序列对胰岛素的合成和释放有效应，而且对胰岛素的效应尤其是葡萄糖被靶组织，肌肉和脂肪组织吸收以及清空胃有作用。
发明主题
本发明基于exendin-3和exendin-4的序列，这些肽是从Heloderma horridum或Heloderma suspectum(Eng.J.等(1990，1992))的分泌产物中分离得到的。这两个肽氨基酸序列及其对胰腺的作用已有多个作者描述(Eng，J.等(1990)；Raufman，J.P.(1992)；Joke，R(1993b)；Thorens，B.(1993))。本发明的主题是一些新的截断的exendin片段，包括exendin-3-(1-30)或exendin-4-(1-30)的氨基酸序列，其中这些序列的C末端可缩短最多可达3个氨基酸，优选最多缩短1个氨基酸，N末端可缩短最多可达2个氨基酸，优选最多缩短1个氨基酸。令人惊奇的是尽管氨基酸序列缩短了，这些exendin片段具有生物活性。缩短的氨基酸序列的生产与相对长的序列比较更经济。因此，特别优选具有以下序列的肽片段；尤其是具有Exendin-3-(1-30)的肽片段(序列号1)：
序列号：1基于Exendin-3
1       5         10        15
H S D G T F T S D L S K Q M E E E A V
20        25        30
R L F I E W L K N G X
序列号：2基于Exendin-4
1       5         10        15
H G E G T F T S D L S K Q M E E E A V
20        25        30
R L F I E W L K N G X1
其中在位置1，2，28，29，或30的氨基酸根据期望的链长度可以是序列的部分。肽从N末端到C末端编号。X1代表除甘氨酸外的蛋白产生(proteogene)或非蛋白产生的氨基酸。
优选链长度为1-27的exendin及exendin类似物，特别是那些链长度为1-30的。
C末端氨基酸的羧基COOR3可以游离形式存在(R3＝OH)或以生理耐受的碱或碱土盐形式存在，如钠，钾，或钙盐。羧基也可以被一级，二级或三级醇酯化，如甲醇，分支或不分支的C1-C6-烷基醇，特别是乙醇或叔丁醇。然而，羧基也可以又一级或二级胺酰胺化，如氨水，分支或不分支的C1-C6-烷基胺或C1-C6-二烷基胺，尤其是甲胺或二甲胺。
N末端氨基酸的氨基NR1R2可以游离形式存在(R1，R2＝H)或以生理耐受的盐存在，如盐酸盐或乙酸盐。氨基也可被酸酰化，从而R1＝H，R2＝乙酰基，三氟乙酰基，adamantyl或以肽化学中常规的氨基保护基保护的形式存在，如Fmoc，Z，Boc，Alloc或N-烷基化，其中R1和/或R2＝C1-C6烷基或C2-C6烯基或C7-C9芳烷基。
烷基残基可以是直链，支链或任选的环状烷基残基，优选，甲基，乙基，异丙基及环己基。
所有的exendin片段可以全部或部分保护的衍生物存在。
本发明的进一步的主题是有上述性质和序列长度的exendin片段，其中进行了至少1个但至多11个以下(a)到(p)所列的修饰。优选有至多9个，更优选有以下(a)到(p)所列的修饰的至多5个修饰的exendin片段。
(a)位置1的α-氨基酸是D-His，Ala，D-Ala，Gly，Lys，D-Lys，其中特别优选Ala，Gly，Lys；或
(b)位置2的α-氨基酸是Ser，D-Ser，Thr，D-Thr，Gly，Ala，D-Ala，Ile，D-Tle，Val，D-Val，Leu，D-Leu优选Ser，Thr，Gly，Ala，Ile，Val，Leu；或
(c)位置3的α-氨基酸是Glu，D-Glu，Asp，D-Asp，Ala，D-Ala，优选Glu，Asp，Ala；或
(d)位置4的氨基酸是Ala，D-Ala，β-Ala，优选Ala；或
(e)位置5的α-氨基酸是Ser，Tyr，Ala；或
(f)位置6的α-氨基酸是Ala，Ile，Val，Leu，Cha或Tyr优选Ala，Ile，Val，Leu，或Tyr；或
(g)位置7的α-氨基酸是Ala，D-Ala，Tyr，D-Tyr，Ser，D-Ser或D-Thr，优选Ala，Tyr或Ser；或
(h)位置8的α-氨基酸是Ala，Tyr或Thr；或
(i)位置9的α-氨基酸是Ala，D-Ala，Glu，D-Glu或D-Asp，优选Ala或Glu；或
(j)位置10，11，12，15，16，17，18，19，20，21，24，28，29，独立地是一个蛋白产生或非蛋白产生的D-或L-氨基酸，优选蛋白产生的L-氨基酸；或
(k)位置13的α-氨基酸是天然L氨基酸，优选天然蛋白产生的氨基酸；或
(l)位置14的α-氨基酸是，为稳定的目的，为除L-亮氨酸外的天然L-或D-氨基酸取代，优选Nle，D-Nle，Ala，D-Ala，Ile，D-Ile，Val或D-Val，其中特别优选Ile，Val，或Ala；或
(m)位置22的α-氨基酸是D-Phe，Tyr，D-Tyr，Leu，D-Leu，Val，D-Val，L-Cha，D-Cha，β-1-Nal，β-2-Nal或β-1-D-Nal，其中优选Tyr，Leu，或Val；或
(n)位置23的α-氨基酸是Leu，D-Leu，D-Ile，Val，D-Val，L-Cha，D-Cha，Tyr，D-Tyr，Phe或D-Phe，其中优选Leu，Val，Tyr或Phe；或
(o)位置25，26或27的α-氨基酸是天然L-或D-氨基酸，优选天然蛋白产生L-氨基酸；或
(p)位置30的α-氨基酸是甘氨酸以外的蛋白产生或非蛋白产生D-或L-氨基酸，优选Arg，D-Arg，Tyr或D-Tyr，特别优选Arg或Tyr。
在这些新exendin片段中，特别优选除以上提到的性质和序列长度外，在位置10含氨基酸亮氨酸和/或位置19含氨基酸缬氨酸，位置14含氨基酸异亮氨酸或丙氨酸而不是蛋氨酸，在位置30含精氨酸的那些。还特别优选那些exendin片段的修饰物，其中除已描述特别优选的位于位置10，14，19和30的氨基酸外，20个已知的蛋白产生的L-氨基酸之一位于位置2。
优选的exendin类似物在位置3或14有取代，特别优选在位置2，而且尤其优选exendin类似物只包含蛋白产生氨基酸。
除了这些新的，缩短的和稳定的exendin-3和exendin-4外，本发明还涉及产生这些类似物的方法，其中类似物由类似物中所含的、保护的氨基酸由固相合成制备，这些氨基酸依次偶联，与类似物中的氨基酸对应，非强制性地，以相应的在天然exendin肽中不存在的氨基酸补充。
exendin-3或exendin-4位置30的甘氨酸以别的蛋白产生的氨基酸或非蛋白产生的氨基酸取代，以避免合成中氨基末端保护基切割后二酮哌嗪的产生。
exendin-(1-30)类似物和片段与exendin-1-(1-39)相比具有优越性，因为这些类似物较短的序列使更简单而产率更高的合成成为可能。
使用氨基酸的缩写及定义在纯化学和应用化学31，639-45(1972)及同书40，277-90(1974)中推荐，与PCT规则对应(WIPO标准st.23：专利应用和发表的专利论文中核苷酸和氨基酸序列表示法的推荐)。一个和三个字母编码如下：
                        氨基酸缩写
氨基酸            三字母代码        一字母编码
丙氨酸               Ala                 A
精氨酸               Arg                 R
天冬酰胺             Asn                 N
天冬氨酸             Asp                 D
半胱氨酸             Cys                 C
谷氨酰胺             Gln                 Q
谷氨酸               Glu                 E
甘氨酸               Gly                 G
组氨酸               His                 H
异亮氨酸             Ile                 I
亮氨酸               Leu                 L
赖氨酸               Lys                 K
蛋氨酸               Met                 M
苯丙氨酸             Phe                 F
脯氨酸               Pro                 P
丝氨酸               Ser                 S
苏氨酸               Thr                 T
色氨酸               Trp                 W
酪氨酸               Tyr                 Y
缬氨酸               Val                 V
其它氨基酸           Xaa                 X
若不特别限定如D-或D，L-，缩写代表L-氨基酸。D-氨基酸写作一个字母编码的小写字母。一些天然及非天然氨基酸是非手性的令人甘氨酸。表示中所有肽的N末端在左且C末端在右。
非蛋白产生氨基酸的例子及其缩写在以下列出：
β-丙氨酸                          β-Ala
对-氨基苯甲酸                      Oab
间-氨基苯甲酸                      Mab
邻-氨基苯甲酸                      Pab
间-氨甲基苯甲酸                    Amb
ω-氨基己酸                        Ahx
ω-氨基庚酸                        Ahp
ω-氨基辛酸                        Aoc
ω-氨基癸酸                        Ade
ω-氨基十四烷酸                    Atd
瓜氨酸                             Cit
环己基丙氨酸                       Cha
α，γ-二氨基丁酸                  Dab
α，β-二氨基丙酸                  Dap
磺化蛋氨酸                         Met(O)
Cα-甲基-丙氨酸                    Aib
N-甲基-甘氨酸(肌氨酸)              Sar
萘基丙氨酸                         Nal
正亮氨酸                           Nle
乌氨酸                             Orn
1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧酸       Tic
根据其物理化学性质，所有的氨基酸可分为以下三类：
酸性：在水溶液和生理pH值下，氨基酸释放一个质子，故而带一个负电荷。
碱性：在水溶液和生理pH值下，氨基酸得到一个质子，故而带一个正电荷。
中性：在水溶液和生理pH值下，氨基酸处于不带电荷的状态状态。
术语“带一个正/负电荷”或“处于不带电荷状态”是指在统计学平均上相当数目的一类氨基酸(至少25％)处于所述状态。
除20个所谓的蛋白产生氨基酸插入蛋白受基因编码信息控制以外，非蛋白产生氨基酸也可通过所述合成过程插入肽序列。蛋白产生氨基酸的清单及它们归入上述三类氨基酸在表1中给出。非蛋白产生氨基酸不是基因编码的。非蛋白产生氨基酸的示例及其归类于酸性，碱性或中性氨基酸在表1中给出。
表1
        蛋白产生的 非蛋白产生的
酸性碱性中性 Asp，GluArg，His，LysAla，Asn，Cys，Gln，Gly，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr，Val Dab，Dap，Ornβ-Ala，Aib，Cit，Cha，Oab，Mab，Pab，Amb，Ahx，Ahp，Aoc，Ade，Atd，Nal，Nle，Sar，Tic
作为本发明主题的exendin类似物具有优越的治疗性质。因此它们导致胰岛素由内分泌胰腺释放的刺激，还导致胰岛素生物合成的增加及外周葡萄糖利用的增加。由于这些效应，只有在血糖水平同时增加的时候才能观察到，给药后将不会产生低血糖。而且，exendin类似物抑制内分泌胰腺释放胰高血糖素，导致葡萄糖异生的降低。非胰岛素依赖的糖尿病(NIDDM)中，exendin类似物导致代谢显著改善。特别是肌肉和脂肪组织对葡萄糖的吸收不依赖于胰岛素分泌效应增加。由于对胰高血糖素释放的抑制作用，在胰岛素依赖的糖尿病中给exendin类似物也是正确的。与胰高血糖素样肽1(GLP-1)和已知的exendin-3，exendin-4序列相比，本发明的exendin类似物在各种检测系统中具有令人惊讶的较高的效能，因此它们比GLP-1，exendin-3，exendin-4更适合于治疗应用。这些新的exendin类似物的优越性尤其在于：对降解和代谢的高稳定性，更长的作用时间，低剂量下的有效性。更优选基于Exendin-3的类似物，它们显示更长的作用时间，更低剂量下的有效性。
固相和液相合成是合成肽的传统方法。为了最优化粗品的纯度和产率，为选择一个特定产品合适的合成方法，有必要将合成过程的常数及所用材料，例如支持物，使基团反应的试剂，阻断不应反应基团的材料或降解保护基的试剂，针对所合成的产物或所合成的中间产物及起始物进行修改。考虑到许多过程常数的相互依赖性，这一修改并不简单。
仅包含本发明肽的药物制剂或本发明的肽作为活性成分与传统的辅剂和添加物一起组成的药物制剂优选胃肠道外(皮下，肌内或静脉内)给药。而其它普通的给药方式也可以考虑，例如口服，直肠，颊部(包括舌下)，肺部，透皮，离子透入，阴道及鼻内给药。药物具有调节胰岛素的效应从而以优越的方式促进血糖水平补偿。当血糖水平达到20-50pmol/L间时使用药物具有优越性。0.4-1.2pmol/kg/min的注入速度对此是必要的。在皮下或颊部给药时依赖于盖仑制剂形式和期望的作用时间，5-500nmol的量是必需的。
本发明的exendin类似物或其可药用的盐优选以无菌冻干物储存，在给药前与合适的等渗溶液混合。然后类似物可以注射，注入或也可通过粘膜以这种形式吸收。传统的适于注射或注入的等渗水系统，其中含有用于注射液的普通添加物如稳定剂和促溶剂可用作溶剂。这种情况下优选生理盐水或通过缓冲液调成等渗的溶液。
添加物为，例如，酒石酸盐或枸椽酸盐缓冲液，乙醇，复合制剂(例如乙二胺四乙酸及其无毒盐)高分子聚合物(如液态聚乙烯氧化物)来调节粘稠度。用于注射液的液态载体物质必须是无菌的，优选装入安瓿中。固态载体物质如淀粉，乳糖，甘露糖，甲基纤维素，滑石粉，高分散的硅酸，高分子脂肪酸(如硬脂酸)，明胶，琼脂-琼脂，磷酸钙，硬脂酸镁，动物或植物脂肪，固态高分子聚合物(如聚乙二醇)；如果需要口服给药的合适制剂可含有芳香剂或甜味剂。鼻腔给药可加入表面活性剂来改善鼻粘膜吸收，如胆酸，牛黄胆酸，鹅脱氧胆酸，乙醇酸，脱氢胆酸，脱氧胆酸和环糊精。
每日的给药剂量在150-500nmol范围内。比较在胰高血糖素样肽-1的常规实验程序中，生物活性的测定基于对胰高血糖素样肽1，exendin-3，exendin-4国际参考制剂的测量。
根据本发明的exendin类似物可通过常规的肽合成方法制备，如实施例中固相合成参考J.M.Steward和J.D.Young“固相肽合成”，第二版，Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois(1984)和J.Meienhofer激素蛋白和肽，2卷Academic Press，纽约(1973)，且液相合成参考E.Schroder和K.Lubke“肽”，1卷，AcademicPress，纽约(1965)。
肽合成的基本程序
通常肽的合成是将保护的氨基酸加入不断延长的肽链。第一个氨基酸的氨基或羧基或其侧链中任何活性基团被保护。这个保护的氨基酸或偶联到一惰性支持物上或用于溶液中。肽序列中下一个氨基酸在有利于酰胺键形成的条件下适当保护，加入前者中。当所有的期望氨基酸以正确的顺序偶联后，除去保护基及支持物，所得的粗品肽再沉淀，优选通过柱层析纯化来形成最终产物。
合成少于40氨基酸的生理活性肽的类似物的优选方法包括固相肽合成。该方法中α氨基(Nα)及任何活性侧链以酸敏感或碱敏感基团保护。所用保护基应该在偶联酰胺键的条件下稳定，但它应该在不损害所形成肽的条件下易于脱除。合适的α氨基保护基包括下列基团，但不局限于此：叔丁氧羰基(Boc)，苄氧羰基(Z)，对氯苄氧羰基，二苯基异丙氧羰基，叔戊氧羰基(Amoc)，α，α-二甲基-3，5-二甲氧基-苄氧羰基，对硝基亚磺酰基，2-氰基叔丁氧羰基，9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)，1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环己-1-基二烯)乙基(Dde)等。9-芴基-甲氧羰基(Fmoc)优选用作Nα保护基。
合适的侧链保护基包括下列但不局限于此：乙酰基，烯丙基(All)，烯丙氧羰基(Alloc)，苯基，苄氧羰基(Z)，叔丁氧羰基(Boc)，苄氧甲基(Bom)，对溴苄氧羰基，叔丁基(tBu)，叔丁基二甲基硅，2-氯苄基，2-氯苄氧羰基(2-CIZ)，2，6-二氯苄基，环己基，环戊基，1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环己-1-基二烯)乙基(Dde)，异丙基，4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯基-磺酰基(Mtr)，2，3，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)，新戊基，四氢吡喃-2-基，甲磺酰基(Tos)，2，4，6-三甲氧基苯基，三甲基硅及三苯甲基(Trt)。
固相合成中，C末端的氨基酸第一个与合适的支持物材料偶联。合适的支持物材料是那些对逐步缩合和脱保护反应的试剂及反应条件惰性的材料，并且不溶于所用反应介质中。可买到的支持物材料的示例包括已用活性基团修饰的苯乙烯/二乙烯苯共聚体和/或聚乙二醇以及氯甲基化的苯乙烯/二乙烯苯共聚体，羟甲基化或氨甲基化的苯乙烯/二乙烯苯共聚体等。如果想制备肽的游离酸优选使用以4-苄氧苄醇(Wang骨架(Wang，S.S.1973))或2-氯代三苯甲游基氯化物(Barlos，K.等1989)衍生的苯乙烯(1％)-二乙烯苯或TentaGel(Rapp聚合物，Tubingen)。若制备肽的酰胺，优选以5-(4’-氨甲基)-3’，5’-二甲氧基-苯氧基)戊酸(PAL-骨架)(Albericio，F.等1987)或O-(2，4-二甲氧基苯基-氨甲基)-苯氧基(Rink-Amid骨架(Rink，H.1987))衍生的苯乙烯(1％)-二乙烯苯或TentaGel.
与聚合体支持物的连接可通过C末端Fmoc保护的氨基酸与支持物材料的反应实现，将活化试剂加入乙醇，乙晴，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，二氯甲烷，四氢呋喃，N甲基吡咯烷酮或类似试剂，优选在DMF中，室温下或升温，如在40-60℃间，优选室温下，反应时间2-72小时，优选2×2小时。
Nα保护氨基酸，优选Fmoc氨基酸，与PAL，Wang或Rink支持物的偶联，可在偶联试剂如N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)或其它碳二亚胺，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)或其它脲盐，0-酰基脲，苯并三唑-1-基-3吡咯啉酮-磷酸盐六氟磷酸盐(PyBOP)或其它磷酸盐，N-羟琥珀酰亚胺，其它的N-羟基亚胺或oximes，在1-羟基苯并三唑或1-羟基-7-氮杂苯并三唑的存在下或不存在下，优选有TBTU的帮助加入HOBt，加或不加碱如二异丙基乙基胺(DIEA)，三乙胺或N-甲基吗啡啉，优选二异丙基乙基胺，反应时间2-72小时，优选3小时，1.5-3倍过量于氨基酸及偶联试剂，优选2倍过量，在10-50℃间的温度，优选25℃，在溶剂如二甲基甲酰胺，N-甲基吡咯烷酮或二氯甲烷，优选二甲基甲酰胺。除偶联试剂外，也可用活泼酯(如5氟苯酯，对硝基苯酯等)，Nα-Fmoc-氨基酸的对称酸酐，其酰氯或酸的氟化物在上述条件下进行。
Nα保护氨基酸，优选Fmoc氨基酸，与2-氯三苯甲基树脂的偶联优选在二氯甲烷中加入DIEA反应时间10-120分钟，优选20分钟，但不局限于用此溶剂及此碱。
接下来的保护氨基酸的偶联可按照肽合成，尤其是自动肽合成仪中的常规方法进行。固相上偶联的氨基酸的Nα-Fmoc保护基以哌啶(10-50％)在二甲基甲酰胺处理5-20分钟，优选2×2分钟50％DMF中的哌啶和1×15分钟20％DMF中的哌啶脱去保护基后，下一个氨基酸以1-10倍过量，优选10倍过量与前一氨基酸在一惰性，非水，极性溶剂中偶联，如二氯甲烷，DMF或二者混合物，优选DMF，在10-50℃间，优选25℃。已提及的将第一个Nα-Fmoc氨基酸与PAL，Wang或Rink支持物偶联的试剂可作为偶联试剂。保护氨基酸的活泼酯，或氯化物或氟化物或其对称酸酐也可用作选择。
在固相合成的最后肽从支持物上切割下来，同时脱除侧链保护基。切割可在三氟乙酸或其它强酸介质中进行，加入5-20％v/v阳离子捕捉剂，如二甲基硫醚，乙基甲基硫醚，硫代茴香醚，甲苯硫酚，间-甲酚，茴香醚乙烷-二硫醇，苯酚或水，优选15％v/v二甲基硫醚/乙烷二硫醇/间甲酚1∶1∶1，在0.5-3小时内，优选2小时。具有全保护侧链的肽可通过以冰乙酸/三氟乙醇/二氯甲烷2∶2∶6脱除2-氯三苯甲基支持物得到。保护的肽可在硅胶上层析纯化。如果肽通过Wang支持物连于固相及如果欲获得肽的C末端烷基酰胺化，可用烷基胺或氟代烷基胺氨解进行切割。氨解在-10-50℃进行，优选25℃，反应时间12-24小时，优选18小时。另外肽也可从支持物上通过再酯化，如与甲醇，而脱除。
所得酸性溶液与3-20倍量的冷醚或正己烷混合，优选10过量的乙醚，以沉淀肽，从而分离存在于醚中的阳离子捕捉剂及降解下来的保护基。进一步的纯化可通过在冰乙酸中再沉淀肽多次进行。所得沉淀物在水或叔丁醇或二者混合物中得到，优选叔丁醇/水的1∶1混合物，冷冻干燥。
所得肽可通过部分或全部的下述色谱方法纯化：以乙酸盐形式在弱碱性树脂上的离子交换；在未衍生的聚苯乙烯/二乙烯苯基共聚物(如Amberlite XAD)疏水性吸附色谱；硅胶上的吸附色谱；离子交换色谱如在羧甲基纤维素上；分配色谱如在Sephadex G25；逆流分散色谱；或高效液相色谱，尤其是在辛基或十八烷基硅(ODS)相上的反向HPLC。
本发明的总结部分包括制备肽及其可药用盐的过程。这些导致具有生理活性的缩短的，并具有上述乙烯链长度及修饰的exendin-3或exendin-4的同源物或类似物的过程包括在合适的支持物上依次缩合保护氨基酸的方法，降解支持物和脱保护基的方法，及纯化缩短粗产品肽的方法。
氨基酸分析以来自应用生物系统公司(Weiterstadt)的氨基酸分析仪420A进行。将分析的50-1000pmol样品以10-40μ溶液装入载样器，然后气相160℃用6N盐酸完全自动水解90分钟，以苯基异硫氰酸酯衍生，用微孔HPLC在线分析。质谱检测在装备有离子喷射离子源API III三-四孔质谱仪(SCIEX；Thornhill，加拿大)上进行。
保护的氨基酸衍生物可由如Nova Biochem Gmbh(Bad Soden)获得。
下述实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。
实施例1
HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH2(序列号3)
[Nle14，Arg30]-Exendin-4-(1-30)-NH2
实施例1以0.02mmol批量合成，通过在5-(4’-氨甲基)-3’，5’-二甲氧基苯氧基戊酸基-丙氨酰-氨甲基-聚苯乙烯(1％)二乙烯基苯(载样量：0.5mmol/g)在购自MultiSyn Tech公司的多重自动肽合成仪SyRoII上通过固相方法合成。氨基酸的α氨基用9-芴基甲氧羰基(Fmoc)保护。侧链保护基对Asp，Glu，Ser及Thr为叔丁基，对Asn，Gln及His为三苯甲基(Trt)，对Lys及Trp为叔丁氧羰基(Boc)，对Arg为2，2，5，7，8，-5-甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)。保护的氨基酸10倍过量依次偶联，以N，N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑作为活化试剂，两次偶联每次40分钟。肽以三氟乙酸(85％)，在15％乙二硫醇/二甲硫醚/茴香醚(1∶1∶1 v/v/v)存在下，室温反应120分钟，从聚合体支持物上切割下来，同时脱除保护基。接着无水乙醚沉淀肽，然后一无水乙醚多次洗涤，充分除去硫醇。冷冻干燥水/叔丁醇(1∶1)中的沉淀，得到62mg粗肽。粗肽在30分钟内以反向HPLC纯化，以37-42％乙晴/0.9％TFA梯度进行。洗脱液浓缩，冻干，得到纯度≥97％的29mg白色固体。
氨基酸分析：Ala 1,08(1)；Asx 1,91(2)；Glx 6,10(6)；Phe1,78(2)；Gly 3,10(3)；His 1,00(1)；Ile 0,88(1)；Lys 2,02(2)；Leu 3,24(3)；Nle 1,10(1)；Arg 1,98(2)；Ser 2,04(2)；Thr 1,99(2)；Val 0,91(1)；Trp 0,87(1).
ESI-MS：3488,2
实施例2
HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGY-NH2(序列号4)
[Nle14，Tyr30]-Exendin-4-(1-30)-NH2
实施例2为0.0076mmol批量合成，在TentaGel(Rapp聚合物，Tubingen)上以购自MultiSyn Tech公司的多重自动肽合成仪SyRo II通过固相方法合成，前者以Rink-酰胺骨架(4-(2’，4’-二甲氧基苯基-氨甲基)-苯氧基)衍生。使用保护氨基酸与实施例1类似。保护的氨基酸8倍过量依次偶联，40℃搅拌下一次偶联40分钟。以2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-四氟硼酸脲(TBTU)/1-羟基苯并三唑作为活化试剂，并加入二异丙基乙基胺。肽的切割和纯化与实施例1类似。得到纯度＞95％18.1mg白色固体。
氨基酸分析Ala 1,03(1)；Asx 1,90(2)；Glx 6,24(6)；Phe1,94(2)；Gly 3,12(3)；His 1,02(1)；Ile 1,09(1)；Lys 2,01(2)；Leu 3,06(3)；Nle 1,08(1)；Arg 0,97(1)；Ser 1,98(2)；Thr 1,80(2)；Val 0,93(1)；Trp 1,01(1)；Tyr 0,90(1).
ESI-MS：3494,8
实施例3
HSDGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH2(序列号5)
[Nle14，Arg30]-Exendin-3-(1-30)-NH2
实施例3以实施例2描述的方法类似的合成。获得17.6mg白色固体纯度大于99％。
氨基酸分析：Ala 0,99(1)；Asx 2,98(3)；Glx 5,16(5)；Phe2,08(2)；Gly 2,16(2)；His 0,95(1)；Ile 1,03(1)；Lys 2,04(2)；Leu 2,91(3)；Nle 1,05(1)；Arg 1,04(1)；Ser 3,00(3)；Thr 2,05(2)；Val 1,01(1)；Trp 1,18(1)；Tyr 0,98(1).
ESI-MS：3504,4
实施例4
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGR-NH2(序列号6)
[Arg30]-Exendin-4-(1-30)-NH2
实施例4以实施例1描述的方法类似的合成。获得17.9mg白色固体纯度大于96％。
氨基酸分析：Ala 0,96(1)；Asx 2,01(2)；Glx 6,00(6)；Phe1,80(2)；Gly 3,21(3)；His 0,96(1)；Ile 1,07(1)；Lys 1,92(2)；Leu 2,98(3)；Met 1,06(1)；Arg 1,90(2)；Ser 1,91(2)；Thr 2,09(2)；Val 0,97(1)；Trp 0,84(1).
ESI-MS：3508,4
实施例5
GEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGR-NH2(序列号7)
[Nle14，Arg30]-Exendin-4-(2-30)-NH2
实施例5以实施例2描述的方法类似的合成。获得13.2mg白色固体纯度大于97％。
氨基酸分析：Ala 1,04(1)；Asx 1,98(2)；Glx 6,08(6)；Phe1,86(2)；Gly 2,91(3)；Ile 0,96(1)；Lys 1,84(2)；Leu 2,98(3)；Nle 1,04(1)；Arg 1,90(2)；Ser 1,94(2)；Thr 1,92(2)；Val 0,96(1)；Trp 0,85(1).
ESI-MS：3350,8
实施例6
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKNGR-NH2(序列号8)
[Ala21，Arg30]-Exendin-4-(1-30)-NH2
实施例6以实施例1描述的方法类似的合成。获得11.1mg白色固体纯度大于95％。
氨基酸分析：Ala 2,08(2)；Asx 1,93(2)；Glx 6,07(6)；Phe1,74(2)；Gly 2,97(3)；His 0,98(1)；Ile 0,87(1)；Lys 2,15(2)；Leu 2,02(2)；Met 0,96(1)；Arg 2,13(2)；Ser 1,87(2)；Thr 2,07(2)；Val 1,04(1)；Trp 0,87(1).
ESI-MS：3466,3
实施例7
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKAGR-NH2(序列号9)
[Ala28，Arg30]-Exendin-4-(1-30)-NH2
实施例7以实施例1描述的方法类似的合成。获得15.0mg白色固体纯度大于97％。
氨基酸分析：Ala 1,98(2)；Asx 0,98(1)；Glx 6,22(6)；Phe1,92(2)；Gly 3,03(3)；His 0,99(1)；Ile 1,03(1)；Lys 2,05(2)；Leu 3,03(3)；Met 0,96(1)；Arg 1,84(2)；Ser 1,98(2)；Thr 2,09(2)；Val 1,01(1)；Trp 0,72(1).
ESI-MS：3465,4
实施例8
HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKAGR-NH2(序列号10)
[Ala21，28，Arg30]-Exendin-4-(1-30)-NH2
实施例8以实施例2描述的方法类似的合成。获得18.4mg白色固体纯度大于95％。
氨基酸分析：Ala 3,12(3)；Asx 0,99(1)；Glx 6,04(6)；Phe1,80(2)；Gly 3,00(3)；His 0,96(1)；Ile 1,02(1)；Lys 1,84(2)；Leu 1,97(2)；Met 0,98(1)；Arg 2,03(2)；Ser 1,91(2)；Thr 1,88(2)；Val 0,99(1)；Trp 0,99(1).
ESI-MS：3423,3
实施例9
以类似方法高纯度制备以下exendin衍生物是可能的.(Ex-4＝exendin-4，Ex-3＝exendin-3)
Exendin-衍生物                               Seq.序列
[A14，R30]-Ex-4-(1-30)-OH            11    HGEGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-OH
Ac-[Ile14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2     12    Ac-
                                             HGEGTFTSDLSKQIleEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[Nle14]-Ex-4-(1-27)-NH2              13    HGEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                             K-NH2
[A14.29，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2        14    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NAR-NH2
[A14.27，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2        15    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLA
                                              NGR-NH2
[A14.26，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2        16    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWAK
                                              NGR-NH2
[A2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2   17    HAEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLIEWL
                                              KNGR-NH2
[C2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2   18    HCEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                              KNGR-NH2
[D2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2   19    HDEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                              KNGR-NH2
[E2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2   20    HEEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                              KNGR-NH2
[F2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2   21    HFEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLK
                                              NGR-NH2
[H2Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2     22    HHEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                              KNGR-NH2
[I2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            23    HIEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLK
                                                       NGR-NH2
[K2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            24    HKEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[L2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            25    HLEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[M2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            26    HMEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[N2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            27    HNEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[P2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            28    HPEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLK
                                                       NGR-NH2
[Q2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            29    HQEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[R2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            30    HREGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[S2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            31    HSEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLK
                                                       NGR-NH2
[T2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            32    HTEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[V2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            33    HVEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[W2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            34    HWEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[Y2，Nle14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2            35    HYEGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                       KNGR-NH2
[A2.24，G16，E21，K20.28，Q17，R30，S12，   36    HADGTFTSDLSSYMEGQAVKEEFLAWL
V27，Y13]-Ex-3-(1-30)-NH2                           VKGR-NH2
[A14.25，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2                  37    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEALKN
[E3，A14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    38    HSEGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLKN
                                             GR-NH2
[A1，V14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    39    ASDGTFTSDLSKQVEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A3.14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2        40    HGAGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A5.14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2        41    HGEGAFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A14，R30，Y5]-Ex-4-(1-30)-NH2    42    HGEGYFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A14，R30，Y6]-Ex-4-(1-30)-NH2    43    HGEGTYTSDLSKQAEEEAVRLFLEWLK
                                             NGR-NH2
[A14，I6，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2    44    HGEGTTTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLKN
                                             GR-NH2
[A14，R30，S7]-Ex-4-(1-30)-NH2    45    HGEGTFSSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A14，R30，Y7]-Ex-4-(1-30)-NH2    46    HGEGTFYSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A14，R30，T8]-Ex-4-(1-30)-NH2    47    HGEGTFTTDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A14，R30，Y8]-Ex-4-(1-30)-NH2    48    HGEGTTFTYDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A14，E9，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2    49    HGEGTFTSELSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A10.14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2       50    HGEGTFTSDASKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A11.14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2       51    HGEGTFTSDLAKQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A12.14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2       52    HGEGTFTSDLSAQAEEEAVRLFIEWLK
                                             NGR-NH2
[A13.14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2       53    HGEGTFTSDLSKAAEEEAVRLFIEWLK
                                              NGR-NH2
[A14.15，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2         54    HGEGTFTSDLSKQAAEEAVRLFIEWLK
                                              NGR-NH2
[A14.16，G1，R30，S5]-Ex-3-(1-30)-   55    GSDGSFTSDLSKQAEAEAVRLFIEWLK
NH2                                          NGR-NH2
[A14.17，K1，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2    56    KGEGTFTSDLSKQAEEAAVLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，L18，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2     57    HGEGTFTSDLSKQAEEELVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，I19，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2     58    HGEGTFTSDLSKQAEEEAIRLFIEWLKN
                                               GR-NH2
[A14.20，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2         59    HGEGTFTSDLSKQAEEEAVALFIEWIK
                                              NGR-NH2
[A14，R30，Y22]-Ex-3-(1-30)-NH2     60    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVRLYIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，R30，V23]-Ex-4-(1-30)-NH2     61    HGEGIFISDLSKQAEEEAVRLFVEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，L24，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2     62    HGEGTFTSDLSKQAEEEAVRLFILWLK
                                               NGR-NH2
[A14.25，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2         63    HGEGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEALKN
                                              GR-NH2
[A14.26，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2         64    HGEGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWAK
                                              NGR-NH2
[A14.27，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2         65    HGEGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLA
                                              NGR-NH2
[A14.29，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2         66    HGEGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                              NAR-NH2
[A14，R30]-Ex-4-(1-30)-NH2           67    HGEGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[R30]-Ex-3-(1-30)-NH2                 68    HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLK
                                              NGR-NH2
[Nle14，Y30]-Ex-3-(1-30)-NH2         69    HSDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                              KNGY-NH2
[Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-OH            70    HSDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                KNGR-OH
[A14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2            71    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                                NGR-NH2
[Nle14，R30]-Ex-3-(2-30)-NH2          72    SDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLK
                                                NGR-NH2
[Nle14，R30]-Ex-3-(3-30)-NH2          73    DGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLKN
                                                GR-NH2
Ac-[Nle14，R30]-Ex-3-(2-30)-NH2       74    Ac-
                                                SDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFTEWLK
                                                NGR-NH2
Ac-[Nle14，R30]-Ex-3-(3-30)-NH2       75    Ac-
                                                DGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLKN
                                                GR-NH2
[Nle14]-Ex-3-(1-27)-NH2                76    HSDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                K-NH2
[K2，P3，A14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2  77    HKPGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                                NGR-NH2
[A2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2     78    HADGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                KNGR-NH2
[C2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2     79    HCDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                KNGR-NH2
[D2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2     80    HDDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                KNGR-NH2
[E2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2     81    HEDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                KNGR-NH2
[F2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2     82    HFDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                KNGR-NH2
[G2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2     83    HGDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                                KNGR-NH2
[H2Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2       84    HHDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFTEWL
                                                KNGR-NH2
[I2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2     85    HIDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLIEWLK
                                               NGR-NH2
[K2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2     86    HKDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
[L2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    87    HLDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
[M2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    88    HMDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLTIEWL
                                               KNGR-NH2
[N2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    89    HNDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
[P2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    90    HPDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
[Q2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    91    HQDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
[R2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    92    HRDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
[T2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    93    HIDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
[V2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    94    HVDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLIEWL
                                               KNGR-NH2
[W2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    95    HWDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
[Y2，Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    96    HYDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
[A3.14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2          97    HSAGTFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A5.14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2          98    HSDGAFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，R30，Y5]-Ex-3-(1-30)-NH2      99    HSDGYFTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，R30，Y6]-Ex-3-(1-30)-NH2      100   HSDGTYTSDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，I6，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2      101   HSDGTITSDLSKQAEEEAVLFIEWLKN
                                               GR-NH2
[A14，R30，S7]-Ex-3-(1-30)-NH2     102    HSDGTFSSDLSKQAEEEAVRLFIEWLKN
                                               GR-NH2
[A14，R30，Y7]-Ex-3-(1-30)-NH2     103    HSDGTFYSDLSKQAEEEAVRLFTEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，R30，T8]-Ex-3-(1-30)-NH2     104    HSDGTFTTDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，R30，Y8]-Ex-3-(1-30)-NH2     105    HSDGTFTYDLSKQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，E9，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2     106    HSDGTFTSELSKQAEEEAVRLFIEWLKN
                                               GR-NH2
[A10.14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2        107    HSDGTFTSDASKQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A11.14，R30]-Ex-3(1-30)-NH2         108    HSDGTFTSDLAKQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A12.14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2        109    HGEGTFTSDLSAQAEEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A13.14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2        110    HSDGTFTSDLSKAAEEEAVRLFLEWLK
                                               NGR-NH2
[A14.15，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2        111    HSDGTTFTSDLSKQAAEEAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14.17，K1，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2   112    KSDGTFTSDLSKQAEEAAVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，L18，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    113    HSDGTFTSDLSKQAEEELVRLFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，I19，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    114    HSDGTFTSDLSKQAEEEAIRFIEWLKN
                                               GR-NH2
[A14.20，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2        115    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVALFIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，R30，Y22]-Ex-3-(1-30)-NH2    116    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVRLYIEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，R30，V23]-Ex-3-(1-30)-NH2    117    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVRLFVEWLK
                                               NGR-NH2
[A14，L24，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2    118    HSDGTFTSDLSKQAEEEAVRLFILWLK
                                               NGR-NH2
Suc-Nle14，R30]-Ex-3-(3-30)-NH2     119    Suc-
                                               DGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWLKN
                                               GR-NH2
[Nle14，R30]-Ex-3-(1-30)-NH2        120    HSDGTFTSDLSKQNleEEEAVRLFIEWL
                                               KNGR-NH2
以下实施例以0.02mmol的批量合成，在Ram树脂(Rapp聚合物Tubingen)上，其中氨甲基-聚苯乙烯(1％)二乙烯基苯(载样量：0.5mmol/g)以Rink酰胺骨架(4-(2’，4’-二甲氧基苯基-氨甲基)-苯氧基)衍生，以购自MultiSyn Tech公司的多重自动肽合成仪SyRo II上通过固相方法合成。所用保护氨基酸与实施例1类似。保护的氨基酸5倍过量依次偶联，40℃搅拌下一次偶联40分钟。以2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基-四氟硼酸脲(TBTU)作为活化试剂，并加入二异丙基乙基胺。肽的切割和纯化与实施例1类似。上述合成的肽的产率，纯度及分析数据列于以下两表中。
表2
Seq.ID        收率[mg]    纯度[％]        ESI-MS
36             6,0           99           3343,3
38            12,8           99           3477,4
68            14,2           99           3523,4
69            14,1          ＞99          3512,1
70            18,0           95           3506,0
71            22,4           95           3463,6
72             6,6          ＞99          3368,0
73            17,8          ＞99          3281,1
75            12,0           99           3323,1
76            14,0           99           3178,1
77             7,2           99           3486,6
78            23,8           95           3488,1
79            19,0           95           3520,1
80            15,2           95           3531,9
81             8,6          ＞99          3545,9
82            23,6               98           3563,9
83            25,4               95           3475,6
84            10,4              ＞99          3554,1
85             8,2              ＞99          3530,1
86            10,4               95           3545,3
87             9,2              ＞99          3530,1
88            13,6              ＞99          3548,1
89            10,6              ＞99          3531,0
90             9,4               96           3514,9
91             6,0              ＞99          3545,4
92            15,4              ＞99          3574,9
93            10,1              ＞99          3519,7
94             9,4              ＞99          3517,7
95            12,0              ＞99          3604,7
96             9,8               95           3581,8
120            8,5               95           3505,6
表3
氨基酸分析
Seq.   Ala    Arg    Asx    Glx    Gly    His    Ile    Leu    Lys    Nle    Phe    Ser    Thr    Trp    Val
ID
36a   3,18   0,99   1,95   3,04   2,94   0,89   1,03   2,14   2,09          1,95   3,06   1,88   0,99   1,94
       (3)    (1)    (2)    (3)    (3)    (1)    (1)    (2)    (2)           (2)    (3)    (2)    (1)    (2)
38     2,08   2,10   2,00   6,06   2,04   0,81   1,01   3,25   2,13          1,96   3,08   1,82   0,94   1,02
       (2)    (2)    (2)    (6)    (2)    (1)    (1)    (3)    (2)           (2)    (3)    (2)    (1)    (1)
68b   1,02   2,14   3,16   5,06   1,71   0,93   1,02   3,21   2,08          1,93   3,00   1,88   0,98   1,02
       (1)    (2)    (3)    (5)    (2)    (1)    (1)    (3)    (2)           (2)    (3)    (2)    (1)    (1)
69c   1,02   1,12   2,99   4,94   1,81   0,77   1,12   3,26   2,12   1,04   1,99   2,91   1,81   1,06   1,03
       (1)    (1)    (3)    (5)    (2)    (1)    (1)    (3)    (2)    (1)    (2)    (3)    (2)    (1)    (1)
70     1,08   2,15   2,96   5,07   1,84   0,85   1,06   3,23   2,06   0,92   1,99   2,01   1,84   1,05   1,04
       (1)    (2)    (3)    (5)    (2)    (1)    (1)    (3)    (2)    (1)    (2)    (3)    (2)    (1)    (1)
71     1,98   2,06   3,14   4,98   1,95   0,85   1,01   3,20   2,08          1,94   3,09   1,90   1,03   0,96
       (2)    (2)    (3)    (5)    (2)    (1)    (1)    (3)    (2)           (2)    (3)    (2)    (1)    (1)
72     1,02   2,12   3,06   5,02   1,94          1,02   3,25   2,11   0,95   1,98   2,92   1,88   1,02   1,03
       (1)    (2)    (3)    (5)    (2)           (1)    (3)    (2)    (1)    (2)    (3)    (2)    (1)    (1)
73     1,01  2,04  3,02  5,03  1,83        0,99  3,19  2,07  1,06  1,98  2,00  1,87  0,97  1,03
       (1)   (2)   (3)   (5)   (2)         (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
75     1,09  2,21  3,10  5,18  1,75        1,16  3,26  2,10  1,08  1,95  2,10  2,04  1,28  0,88
       (1)   (2)   (3)   (5)   (2)         (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
76     1,03  1,06  2,05  4,90  0,94  0,88  1,03  3,18  2,01  1,03  1,95  3,02  1,86  0,98  1,03
       (1)   (1)   (2)   (5)   (1)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (3)   (2)   (1)   (1)
77d   2,07  2,00  2,10  5,07  1,78  0,93  1,01  3,14  3,12        1,93  2,05  1,93  1,01  1,01
       (2)   (2)   (2)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (3)         (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
78     2,11  2,17  3,14  5,01  1,92  0,90  1,06  3,25  2,06  1,05  1,99  2,06  1,90  1,00  1,05
       (2)   (2)   (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
79c   1,16  2,10  3,07  5,07  1,78  0,66  1,08  3,30  2,06  0,96  1,93  2,02  1,87  1,06  1,05
       (1)   (2)   (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
80     1,07  2,13  3,78  5,03  1,82  0,84  1,05  3,20  2,04  0,92  1,97  1,99  1,82  1,05  1,03
       (1)   (2)   (4)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
81     1,04  2,06  3,08  5,96  2,01  0,82  1,02  3,17  2,08  0,95  2,04  2,05  1,89  1,01  0,96
       (1)   (2)   (3)   (6)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
82     1,09  1,96  3,01  4,99  1,89  1,02  1,02  3,14  2,04  0,91  2,74  1,98  1,85  0,98  0,99
       (1)   (2)   (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (3)   (2)   (2)   (1)   (1)
83     1,08  2,22  3,09  5,01  2,85  0,83  1,11  3,23  2,13  1,12  1,99  2,09  1,86  0,99  1,03
       (1)   (2)   (3)   (5)   (3)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
84     1,01  1,98  3,09  5,01  1,71  1,69  1,07  3,18  2,07  0,94  1,99  1,90  1,84  0,98  1,01
       (1)   (2)   (3)   (5)   (2)   (2)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
85     1,07  2,12  3,11  5,03  1,88  0,93  1,83  3,23  2,11  1,11  1,97  2,03  1,94  0,97  1,02
       (1)   (2)   (3)   (5)   (2)   (1)   (2)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
86     1,03   2,11    3,07  5,03  2,10  0,88  1,11  3,21  3,00  0,98  1,97  2,05  1,88  1,01  0,99
       (1)    (2)     (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (3)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
87     1,11   2,16    3,13  5,03  1,94  0,89  1,09  4,05  2,23  0,93  1,97  2,07  1,92  0,95  1,00
       (1)    (2)     (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (4)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
88f   1,03   2,14    3,16  5,07  1,71  0,93  1,02  3,21  2,09  0,94  1,93  2,01  1,88  0,99  1,02
       (1)    (2)     (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
89     1,08   1,97(2) 3,89  5,06  1,95  0,88  1,03  3,19  2,08  0,92  1,94  2,03  1,87  0,99  0,97
       (1)            (4)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
90g   1,00   2,09    3,18  5,04  1,97  0,86  1,02  3,23  2,10  1,01  1,96  2,09  1,92  1,04  0,97
       (1)    (2)     (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)1  (2)   (2)   (1)   (1)
91     1,04   2,08    3,07  5,73  1,87  0,80  1,05  3,21  2,10  1,05  1,93  1,95  1,79  1,11  1,06
       (1)    (2)     (3)   (6)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
92     1,01   3,11    3,02  5,03  1,83  0,82  0,99  3,19  2,07  1,06  1,97  2,00  1,87  0,97  1,03
       (1)    (3)     (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
93     1,05   2,12    3,02  5,04  1,98  0,82  1,02  3,28  2,14  1,00  1,96  2,06  2,75  0,95  1,03
       (1)    (2)     (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (3)   (1)   (1)
94     1,07   2,17    3,04  5,08  1,72  0,82  1,14  3,20  2,06  1,06  1,92  2,06  2,00  1,26  1,72
       (1)    (2)     (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (2)
95     1,05   2,18    3,04  5,04  1,84  0,80  1,04  3,31  2,14  0,95  1,96  2,02  1,88  1,76  1,14
       (1)    (2)     (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (2)   (1)
96h   1,03   2,25    3,03  5,00  1,84  0,78  1,14  3,30  2,15  1,05  2,02  1,96  1,84  1,07  1,05
       (1)    (2)     (3)   (5)   (2)   (1)   (1)   (3)   (2)   (1)   (2)   (2)   (2)   (1)   (1)
120    1,11   1,98    3,05  5,06  1,91  1,03  1,03  3,18  2,07  0,93  1,95  2,94  1,88  0,99  1,00
(1)  (2)  (3)  (5)  (2)  (1)  (1)  (3)  (2)  (1)  (2)  (3)  (2)  (1)  (1)
a蛋氨酸    0,96(1)；酪氨酸  0,86(1)
b蛋氨酸    0,94(1)
c酪氨酸    0,82(1)
d脯氨酸    1,02(1)
e在给出水解条件下，检测不到半胱氨酸
f蛋氨酸    0,93(1)
g脯氨酸  0,86(1)
h酪氨酸  0,87(1)
实施例10：药理数据
外切肽酶制品或肾微绒毛膜制品中的代谢
背景
一组外切肽酶对肽激素的分泌后代谢有影响。这些酶结合于不同细胞株的质膜。它们的活性位点指向胞外。另外，这些酶以高浓度存在于邻近肾小管的刷缘膜(Brstensaum Membranen)。因此肾的刷缘绒毛膜(BBM)是相关外切蛋白酶的适当来源，可被用于合成肽代谢稳定性的体外检测，或者也可用外切肽酶制剂。人类中性内切肽酶24.11和二肽肽酶IV用作示例，因为GLP-1是这两种外切肽酶的底物。
刷缘微绒毛膜的制备
大鼠和猪肾皮质的微绒毛膜通过用差速离心方法通过亚细胞抽提分离得到(Booth和Kenny(1975))。4刷缘外切肽酶荧光检测，其它标记酶比色测定，以估计膜的纯度和产量。
外切肽酶制剂
纯化的人类中性内切肽酶24.11以重组形式由Genentech(Sanfrancisco，USA)得到，二肽肽酶4以人类胎盘分离物形式从Calbiochem(Bad Soden)得到。
孵育方法
微绒毛(0.5-1μg蛋白)或各自外切肽酶制剂(60-300ng)与10μg肽(约3nmol)在100μl含50mMNaCl的HEPEs缓冲液(50mM，pH7.4)中孵育。在预定的时间(持续达1小时)通过沸腾终止反应。然后样品离心(10,000×g)，以150μ10.1％TFA稀释，通过反向HPLC分析。每个样品测两次。
HPLC分析
具有以下组分的系统用作HPLC分析：A2248低压泵(Pharmacia-LKB，Freibugrg)，WISP 10B自动注射器(Millipore-Waters，Eschborn)，UV检测仪SP-4(Gynkotec，Berlin)，低压混合系统(Pharmacia-LKB，Freibugrg)及程序管理软件控制(Pharmacia-LKB，Freibugrg)。分离在Lichrospher C-8，5(，4×124mm(Merck，Darmstadt)上进行，用两相梯度流动相，溶剂A：0.1％三氟乙酸(TFA)，B：乙晴∶水∶TFA(70∶29∶0.1)。将244μl样品溶液注入以流动相溶剂A平衡的柱中后，孵育产物以0-80％B的线性梯度80分钟内洗脱，215nmUV吸收处检测。
蛋白水解速度计算
对每一肽的每段孵育时间进行两次测量，底物峰的平均峰高对时间作图。以GLP-1为例，峰高线性正比于样品溶液中肽的量。而且在与微绒毛膜或肽酶孵育的第一个小时内观察到峰高随时间的线性降低。因此蛋白水解速度由底物峰高的降低测定，表示为[μmol/mg蛋白/分钟]。
exendin类似物的降解稳定性
与人类中性内切肽酶24.11b孵育
[Nle14，Arg30]-exendin-4-(1-30)-NH2(序列号3)与中性内切肽酶24.11b如上所述孵育，测定降解速度。GLP-1-(7-36)-NH2作为对照。结果列于表4
表4
                                       降解速度
                                       [mM/100ng/ml NEP24.11/min]
GLP1-(7-36)-NH2                       0,0586
[Nle14，Arg30]-Ex-4-(1-30)-NH2Bsp.1  0,0083
与二肽肽酶IV孵育
表5中所列肽如上所述与二肽肽酶IV(DDP-IV)孵育。每一个孵育都在GLP-1-(7-36)-NH2水解50％时终止。每个肽的底物峰都从rpHPLC上收集，质谱检测，以除去截断的产物。
表5
类似物                                    Seq.ID   DDP-IV底物
[Ala2，Nle14，Arg30]-Ex-3-(1-30)-NH2  78       无蛋白水解
GLP1-(7-36)-NH2                                   50％蛋白水解
与刷缘微绒毛膜孵育
与刷缘微绒毛膜BBM通过上述方法孵育后所计算得到的蛋白水解速度列于表6，GLP-1-(7-36)-NH2作为对照。
表6
类似物                                    Seq.ID   降解速度
                                                   [ng肽/min/mg BBM]
GLP1-(7-36)-NH2                                    880,00
[Lys2，Nle14，Arg30]-Ex-3-(1-30)-NH2  86        2,05
胰岛素由分离岛细胞分泌
器官切除
通过一个中央切口和两个侧切口打开麻醉(0.3-0.5ml戊巴比妥钠/等渗盐水溶液1∶4 i.p.)小鼠的腹部，固定腹膜并沿膈在肋弓处切开。通过向左心室注射中性红溶液膨胀染色各器官。将胰沿着胃和十二指肠小心移开至肠系膜。胰放入冰冷的petri dish中的Hank’s平衡盐溶液(HBBS)和几滴中性红中直至消化。
岛制备
用纤维素涂抹两个胰，装入试管，加入5ml新制备的胶原酶溶液(胶原酶(Cl.histolyticum)0.74U/mg，Serva，2mg/ml于HBBS/水1∶9，pH7.4)，并在37℃振摇孵育18分钟。接着以1000rpm离心1分钟。弃去上清。再次消化时，5ml胶原酶溶液(1mg/ml)孵育4分钟，振摇，沉淀未消化组织。倒出上清，整个过程重复4-5次。然后将上清1000rpm离心1分钟，弃去胶原酶溶液。剩余沉淀与冰冷的HBBS振摇，冰上沉淀约10分钟。这一清洗过程再重复3次。在立体放大镜下从洗过的沉淀中调出纤粉红色染色的岛，转移至培养基(100mlRPMI1640(Gibco)，1ml谷氨酰胺，1ml青霉素，1ml Cibiobay antibiotic(Bayer)，10ml胎牛血清，2mlHEPE’s缓冲液1M)。
岛的刺激
培养基中的岛细胞分散于含200ml刺激缓冲液的eppendorff管中(118mM NaCl，0.2mM NaH2PO4，0.565mM MgCl2，1.25mM CaCl2，4.7mMKCl，10mM Hepes，1％BSA，3.3mM 葡萄糖，pH 7.4)，量为每管10个岛，37℃孵育箱中放1小时。接着加入待测肽，加刺激缓冲液至500ml，37℃孵育1小时。100rpm离心岛1分钟。用胰岛素-RIA(DPC Biermann，Nauheim)测定上清中C-肽的量。每个检测物质测4次。
exendin类似物的活性
在分离的岛细胞上如上所述测定了一些exendin类似物的胰岛素分泌活性。数据作为示例列于下表。
一小时后，在10mM葡萄糖存在下从分离的胰岛中胰岛素的释放[mIU/h/10岛]：
表7
                   对照    GLP1-(7-36)-NH2 Seq.ID 84
10 mM葡萄糖        30，21
10-7(10mM葡萄糖)          53，52           48，94
10-8(10mM葡萄糖)          42，78           41，72
10-9(10mM葡萄糖)          29，99           38，76
10-10(10mM葡萄糖)                          35，05
内分泌胰腺B细胞中胞质钙浓度增长的测定(克隆B细胞株INS-1)
INS-1-细胞的培养(Asfari，M.，1992)：
INS-1细胞在含10％FCS，10m MHEPES缓冲液(pH7.4)，2mM L-谷氨酰胺，100 i.u.青霉素/1，100μg链霉素/ml，1mM丙酮酸(钠盐)和50μM 2-巯基乙醇中RPMI1640培养基中，37℃，95％空气和5％CO2培养。在塑料细胞培养板上生长6-8天后，用PBS(磷酸-缓冲盐)洗一次后，亚汇合细胞通过37℃和等渗盐溶液中的0.025％胰酶及0.27mM EDTA孵育4分钟从基部分离。
制备用于钙测定的细胞：
分离的细胞重悬于Spinner培养基(培养基如上，但含有5％FCS和25mMHEPES)并在Spinner瓶中搅拌孵育2.5小时。然后离心去除培养基，细胞重悬与Spinner培养基。37℃和2μM Fura-2/乙酸甲酯在上述条件下孵育30分钟。通过用Sprinner培养基洗细胞(室温)一次终止细胞负载Fura。然后细胞在室温重悬于Spinner培养基(2x107细胞/ml)。细胞接着移出此悬液用于钙测定。
胞质钙浓度的测定：
测定于37℃，含136mM Nacl，4.8mM CaCl2，1.2mM MgSO4，1.2mMKH2PO4，5mM NaHCO3，10mM葡萄糖，250μM亚磺酰吡唑酮(抑制Fura-2流出培养基)和25mM HEPES缓冲液(用NaOH调节pH至7.4)的改进Krebs-Ringer缓冲液(KRBH)中进行。细胞浓度是1-2×106/ml。测定在以搅拌子搅拌的容器中用荧光光度计在37℃用1.5ml细胞悬液进行。激发波长是340nm，发射波长为505nm。在测定的末尾加入50μM MnCl2然后加入100μM DTPA(二乙基三胺五乙酸盐)以通过暂时终止细胞外Fura的荧光来测定细胞外荧光指示剂相对于测定荧光的比例。加入DTPA后，整个Fura首先转变为钙饱和，然后转变为无钙状态，从而测定每次测量的校准值Fmax(钙饱和)及Fmin(无钙)。为实现该目的，加入0.1％Triton X-100裂解细胞。通过以高细胞外钙浓度接触，用钙饱和染料。然后加入5mM EGTA(乙二(氧-乙晴)-四乙酸盐)和20mMTris溶液，以将染料转化成完全无钙状态。
胞浆钙离子浓度按照R.Tsien及其同事介绍的公式计算(Grynkiewicz，G.，1985)：
[Ca2+]cyt＝((F-Fmin)/(Fmax-F))×KD
(F：每个测量点的荧光；KD：Fuira-2的钙复合物的解离常数，225nM(Grynkiewicz，G.，1985))。
(计算前，先进行细胞外Fura存在的一个补偿。为此通过加入锰测得的荧光量(细胞外Fura)首先测定点的荧光值中减去。然后Fmax减去这个量得以校正。最后测得Fmin的校正值。为此目的，通过加入锰测得的荧光量被2.24除。2.24被定为仪器内部激发波长340nm处钙饱和和无钙间Fura-2的荧光比例因子(以未酯化的，游离Fura-2测定)。这样得到的校正值从Fmin中减去)。
所测肽以1000倍浓KRBH溶液(10-5M)加入，不含CaCl2和葡萄糖。
Exendin类似物的活性
在INS-1细胞上进行了如上所述的钙试验，测定了几个exendin类似物的生物活性。数据作为示例列于图1和表7中。
表8
SEQ.ID Nr.  肽浓度10-8M                               A[Ca2+]cyt
                                                        ±SD(n＝4)
6           [Arg30]-Exendin-(1-30)-NH2               64±8 nM
3           [Nle14，Arg30]-Exendin-(1-30)-NH2       63±8 nM
8           [Ala21，Arg30]-Exendin-(1-30)-NH2       61±11 nM
9           [Ala28，Arg30]-Exendin-(1-30)-NH2       65±15 nM
10          [Ala21，28，Arg30]-Exendin-(1-30)-NH2    69±30 nM
            对照
            GLP-1-(7-36)酰胺                           65±10 nM
内分泌胰腺B细胞中与GLP-1-(7-36)-NH2的竞争(克隆B细胞株INS-1)
INS-1-细胞的培养(Asfari，M.，1992)
见钙浓度的测定。
竞争试验
将分离的细胞悬浮于Krebs-Ringer缓冲液中(25mM Tris，120mMNaCl，1.2mM MgSO4，5mM KCl，1mM Na-EDTA，15mM CH3COONa，调PH至7.4，补充以1％HSA和0.1％杆菌肽)。每次从悬浮液中取走250ml，与20ml标记物(125I-GLP-1-(7-36)-NH2，20,000cpm)和30ml待测肽在相应溶剂中混合，作为反应混合物。然后37℃孵育30分钟，13,000rpm离心4分钟，缓冲液洗3次，测定结合于粒子(γ-计数)的放射性。通过与10个不同的待测肽稀释液孵育得到竞争曲线(10-10-10-6M，Krebs-Ringer缓冲液中)。
Exendin类似物的受体亲和性
数据作为示例列于表9，GLP-1-(7-36)-NH2作为标准。
表9
Seq.       肽                         KdGLP1±SD Kd±SD      Kd/KdGLP1
ID                                    [nM]        [nM]
69  [Nle14，Tyr30]-Ex3-(1-30)-NH2  1,04±0,05  0,56±0,08  0,5
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序列表：
(1)一般信息：
(i)申请者：
(A)姓名：BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
(B)街道：Sandhofer Str.116
(C)城市：Mannheim
(E)国家：Deutschland
(F)邮政编码：D-68305
(G)电话：0621/759-3197
(H)传真：0621/759-4457
(ii)发明题目：Exendin类似物，其制备方法及含有它们的药物制剂
(iii)序列数目：118
(iv)计算机可读类型：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30B(EPA)
(2)SEQ ID NO：1信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：30
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表除Gly外的所有氨基酸″
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：1：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Xaa
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：2信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：30
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表除Gly外的所有氨基酸＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：2：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Xaa
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：3信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：3：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：4信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：4：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Tyr
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：5信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：5：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：6信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：6：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：7信息：
(i)序列特征：
(A)长度：29氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：13
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：7：
Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln xaa Glu Glu Glu
l               5                   10                  15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25
(2)SEQ ID NO：8信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：8：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Ala Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：9信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：9：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：10信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：10：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Ala Phe Ile Glu Trp Leu Lys Ala Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：11信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：11：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：12信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：12：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ile Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：13信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：13：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys
            20                  25
(2)SEQ ID NO：14信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：14：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：15信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：15：
     Glu Ala Val Arg Lesp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala
Glu Glu
     1               5                   10                  15
0：3：
(i)SEQUENZKENNZEIle Glu Trp Leu Ala Asn Gly Arg
           20                  25                        30
(2)SEQ ID NO：16信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle″
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：16：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ala Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：17信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：17：
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：18信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：18：
His Cys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：19信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：19：
His Asp Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：20信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：20：
His Glu Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：21信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：21：
His Phe Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：22信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：22：
His His Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：23信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：23：
His Ile Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：24信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：24：
His Lys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：25信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：25：
His Leu Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：26信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：26：
His Met Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：27信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：27：
His Asn Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：28信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：28：
His Pro Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：29信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：29：
His Gln Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：30信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：30：
His Arg Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：31信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：31：
His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：32信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：32：
His Thr Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：33信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：33：
His Val Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：34信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：34：
His Trp Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：35信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle″
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：35：
His Tyr Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：36信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：36：
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1               5                   10                  15
Gln Ala Val Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：37信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：37：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Ala Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：38信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
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1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
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(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
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1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
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(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(ii)分子类型：肽
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His Gly Ala Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
l               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
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(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
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(ii)分子类型：肽
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1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：42信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
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(ii)分子类型：肽
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His Gly Glu Gly Tyr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：43信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
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His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
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(i)序列特征：
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1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
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(i)序列特征：
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(C)链类型：单链
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(ii)分子类型：肽
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1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
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(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
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His Gly Glu Gly Thr Phe Tyr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Aan Gly Arg
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(i)序列特征：
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(i)序列特征：
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(ii)分子类型：肽
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Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
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(i)序列特征：
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(ii)分子类型：肽
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(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
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(ii)分子类型：肽
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(2)SEQ ID NO：51信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(ii)分子类型：肽
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1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：52信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(ii)分子类型：肽
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Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：53信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
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(ii)分子类型：肽
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Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：54信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：54：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Ala Glu
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Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：55信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO55：
Gly Ser Asp Gly Ser Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Ala
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：56信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：56：
Lys Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Ala Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：57信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：57：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：58信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：58：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Ile Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：59信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：59：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Ala Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：60信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：60：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Tyr Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：61信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：61：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Val Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：62信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：62：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Leu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：63信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：63：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Ala Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：64信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：64：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Ala Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：65信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：65：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Ala Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：66信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：66：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：67信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：67：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：68信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：68：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：69信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：69：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Tyr
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：70信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：70：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：71信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：71：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：72信息：
(i)序列特征：
(A)长度：29氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：13
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：72：
Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu Glu
1               5                   10                  15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25
(2)SEQ ID NO：73信息：
(i)序列特征：
(A)长度：28氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：12
(C)其它信息：/产物＝＂Xaa代表Nle＂
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：73：
Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu Glu Ala
1               5                   10                  15
Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25
(2)SEQ ID NO：74信息：
(i)序列特征：
(A)长度：29氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：13
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：74：
Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu Glu
1               5                   l0                  15
Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25
(2)SEQ ID NO：75信息：
(i)序列特征：
(A)长度：28氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：12
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：75：
Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu Glu Ala
1               5                   10                  15
Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25
(2)SEQ ID NO：76信息：
(i)序列特征：
(A)长度：27氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：76：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys
            20                  25
(2)SEQ ID NO：77信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：77：
His Lys Pro Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：78信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：78：
His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
l               5                   10                  15
Glu Ala Val Leg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：79信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：79：
His Cys Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：80信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：80：
His Asp Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：81信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：81：
His Glu Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：82信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：82：
His Phe Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：83信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：83：
His Gly Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：84信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：84：
His His Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：859信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：85：
His Ile Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：86信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：86：
His Lys Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：87信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：87：
His Leu Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：88信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：88：
His Met Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：89信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：89：
His Asn Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：90信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：90：
His Pro Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：91信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：91：
His Gln Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
                20               25               30
(2)SEQ ID NO：92信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：929：
His Arg Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：93信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：939：
His Thr Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：94信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：94：
His Val Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：95信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：95：
His Trp Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：96信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名字/关键词：肽
(B)位置：14
(C)其它信息：/产物＝“Xaa代表Nle”
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：96：
His Tyr Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Xaa Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：97信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：97：
His Ser Ala Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：98信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：98：
His Ser Asp Gly Ala Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：99信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：99：
His Ser Asp Gly Tyr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：100信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：100：
His Ser Asp Gly Thr Tyr Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：101信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：101：
His Ser Asp Gly Thr Ile Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：102信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：102：
His Ser Asp Gly Thr Phe Ser Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：103信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：103：
His Ser Asp Gly Thr Phe Tyr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：104信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：104：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Thr Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：105信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：105：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Tyr Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：106信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：106：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Glu Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：107信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：107：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Ala Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：108信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：108：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ala Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：109信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：109：
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ala Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：110信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：110：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Ala Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：111信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：111：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Ala Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：112信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：112：
Lys Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Ala Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：113信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：113：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：114信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：114：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Ile Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：115信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：115：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Ala Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：116信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：116：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Tyr Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：117信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：117：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Val Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30
(2)SEQ ID NO：118信息：
(i)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列的详细情况：SEQ ID NO：118：
His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Ala Glu Glu
1               5                   10                  15
Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Leu Trp Leu Lys Asn Gly Arg
            20                  25                  30

Claims (9)

1.肽及其修饰物，及其生理耐受的盐或其酯，所说的肽具有序列1或2
序列号：1
1       5         10        15
H S D G T F T S D L S K Q M E E E A V             (I)
20        25        30
R L F I E W L K N G X
序列号：2
1       5         10        15
H G E G T F T S D L S K Q M E E E A V             (II)
20        25        30
R L F I E W L K N G X
其中X表示Arg或Tyr，位置1，2，28，29或30的氨基酸可以独立地存在或不存在，且N末端表示为NR1R2其中
R1  代表氢或乙酰基
R2  代表氢，或
R1和R2共同代表琥珀酰基，
且C末端表示为COR3，其中
R3等于OH或NH2
在肽的修饰物中，其氨基酸链具有1-10处如下(a)到(o)的修饰：
(a)位置1的α-氨基酸是D-His，Ala，D-Ala，Gly，Lys，或D-Lys；
(b)位置2的α-氨基酸是D-Ser，Thr，
   D-Thr，Ala，D-Ala，Ile，D-Ile，Val，D-Val，Leu，
   D-Leu，Cys，D-Cys，Asp，D-Asp，Glu，D-Glu，Phe，
   D-Phe，His，D-His，Lys，D-Lys，Met，D-Met，Asn，
   D-Asn，Pro，D-Pro，Gln，D-Gln，Arg，D-Arg，Trp，
   D-Trp，Tyr  或D-Tyr；
(c)位置3的α-氨基酸是D-Glu，D-Asp，Ala，或D-Ala；
(e)位置5的α-氨基酸是D-Thr，Ser，D-Ser，Tyr，D-Tyr、Ala或D-Ala；
(f)位置6的α-氨基酸是D-Phe，Ile，D-Ile，Tyr或D-Tyr；
(g)位置7的α-氨基酸是Tyr，D-Tyr，Ser，D-Ser或D-Thr；
(h)位置8的α-氨基酸是D-Ser，Tyr，D-Tyr，Thr或D-Thr；
(i)位置9的α-氨基酸是Glu，D-Glu或D-Asp；
(j)位置10，11，12，15，16，17，18，19，20，21，24，28，29，相互独立的表示Ala，D-Ala，Ser，D-Ser，Gly，D-Gly，Gln，D-Gln，Leu，D-Leu，Ile，D-Ile，Lys，D-Lys，Glu，D-Glu，Val，D-Val，Arg，D-Arg，Asn，D-Asn或Gly；
(k)位置13的α-氨基酸是D-Gln，Tyr，D-Tyr，Ala或D-Ala；
(l)位置14的α-氨基酸是D-Met，Nle，D-Nle，Ala，D-Ala，Ile，D-Ile，Val或D-Val；
(m)位置22的α-氨基酸是D-Phe，Tyr或D-Tyr；
(n)位置23的α-氨基酸是D-Ile，Val或D-Val；且
(o)位置25，26或27的α-氨基酸是Ala，D-Ala，Val，D-Val，D-Trp，D-Leu或D-Lys。
2.权利要求1的肽，其与序列1或2相比，位置2的氨基酸被取代，该取代如权利要求1所定义。
3.权利要求1的肽，其与序列1或2相比，位置14的氨基酸被取代，该取代如权利要求1所定义。
4.权利要求1的肽，其与序列1或2相比，位置3的氨基酸被取代，该取代如权利要求1所定义。
5.权利要求1的肽，具有序列3-120之一。
6.权利要求5的肽，其具有序列5，68，69，71，78-82或84-91之一。
7.权利要求1-6之一的肽在制备用于糖尿病治疗的药物中的应用。
8.含有至少一种权利要求1-6的肽和常规载体及助剂的药物制剂。
9.权利要求1-6之一的肽生产用于治疗糖尿病的药物组合物的应用。
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