CN105829339B

CN105829339B - 胰高血糖素-glp-1-gip三重激动剂化合物

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Publication number: CN105829339B
Application number: CN201480061187.4A
Authority: CN
Inventors: 拉斯穆斯·贾斯特; 迪特·里贝尔; 安妮·佩妮莱·托福腾·谢尔顿; 托本·奥斯特尔隆德; 凯特·汉森; 莱内·耶森
Original assignee: Zealand Pharma AS
Current assignee: Zealand Pharma AS
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2014-11-06
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2034-11-06
Also published as: MX369770B; EA201690629A1; EP3066117A1; US11111285B2; CA2929107C; WO2015067716A1; CA2929107A1; BR112016009995A2; TR201902516T4; JP2020045362A; BR112016009995B1; MX2016005560A; KR102310392B1; US20160257729A1; AU2014345570A1; CN105829339A; KR20160074008A; US10131702B2; EP3066117B1; AU2014345570B2

Abstract

本发明涉及对胰高血糖素、GIP和GLP‑1受体具有激动剂活性的化合物，及其在治疗代谢紊乱中的用途。

Description

胰高血糖素-GLP-1-GIP三重激动剂化合物

技术领域

本发明涉及对胰高血糖素、GIP和GLP-1受体具有激动剂活性的化合物，及其在治疗代谢紊乱中的用途。

背景技术

糖尿病和肥胖是全球逐渐增加的健康问题，并与多种其他疾病，特别是心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)、阻塞性睡眠呼吸暂停、卒中、外周动脉疾病、微血管并发症和骨关节炎有关。全世界有2.46亿人患糖尿病，并且到2025年，估计将有3.8亿人患糖尿病。很多人有另外的心血管风险因素，包括高/异常LDL和甘油三酯及低HDL。心血管疾病占糖尿病患者死亡率的约50％，并且与肥胖和糖尿病有关的发病率和死亡率强调用于有效治疗方案的医疗需要。

前胰高血糖素原(pre-proglucagon)是158个氨基酸的前体多肽，其在不同组织中被加工而形成许多不同的胰高血糖素原衍生肽，包括胰高血糖素、胰高血糖素样肽-1(GLP-1或GLP1)、胰高血糖素样肽-2(GLP-2)和胃泌酸调节素(oxyntomodulin，OXM)，他们参与很多种生理功能，包括葡萄糖内稳态、胰岛素分泌、胃排空和肠生长，以及食物摄取调节。胰高血糖素是29个氨基酸的肽，其对应于前胰高血糖素原的33至61位氨基酸，而GLP-1作为37个氨基酸的肽产生，所述肽对应于前胰高血糖素原的72至108位氨基酸。

当血糖开始下降时，胰高血糖素(由胰腺产生的一种激素)向肝脏发信号以分解糖原和释放葡萄糖，引起血糖水平向正常水平上升。除了控制葡萄糖内稳态之外，胰高血糖素可能通过抑制食物摄取和刺激能量消耗和/或脂类分解减轻体重。与胰高血糖素相比，GLP-1具有不同的生物活性。其作用包括刺激胰岛素合成和分泌、抑制胰高血糖素分泌和抑制食物摄取。GLP-1已经显示出降低糖尿病患者的高血糖(升高的血糖水平)。毒晰外泌肽-4(Exendin-4)(来自蜥蜴毒液的与GLP-1具有约50％氨基酸同一性的肽)激活GLP-1受体并同样地已显示出降低糖尿病患者的高血糖。

葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(Glucose-dependent insulinotropicpolypeptide，GIP)是42个氨基酸的胃肠调节肽，如同GLP-1，在血糖水平升高的情况下刺激胰岛素从胰腺β细胞中分泌出来。其是通过蛋白酶解加工从133个氨基酸的前体preproGIP得到。

有趣的是，新胰高血糖素-GLP-1双重作用受体激动剂目前正处于临床前开发中(参见，例如，WO2011/006497)。与GLP-1类似物相比，胰高血糖素-GLP-1双重激动剂在掌握血糖控制改善的动物模型中与更深度且持久的体重降低相关。因此，基于胰高血糖素的药物可具有用于治疗2型糖尿病和/或肥胖的前景。

肠促胰岛素(Incretin)是通过增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌来调节血糖的胃肠激素(Drucker，DJ和Nauck，MA，Lancet 368：1696-705(2006))。上述提到的肽中的两种被称为肠促胰岛素：GLP-1和GIP。肠促血糖素的发现导致了用于治疗糖尿病的两类新药的开发。因此，可注射GLP-1受体激动剂及小分子化合物(口服DPP-4抑制剂)目前在售(GLP-1受体激动剂：Byetta^TM、Bydureon^TM、Lixisenatide^TM和Liraglutide^TM，以及DPP-4抑制剂：Januvia^TM、Galvus^TM、Onglyza^TM和Trajenta^TM)，所述小分子化合物抑制内源性GLP-1和GIP二者的酶失活。除了GLP-1和GIP对胰岛素分泌的急性作用之外，所述两种肽还具有长期效果。多个实验室的证据表明，GLP-1R激动剂通过抑制细胞凋亡和增加繁殖来保护胰腺β细胞。例如，Farilla等的研究表明，GLP-1在人胰岛中具有抗凋亡作用(Farilla，L，Endocrinology144：5149-58(2003))。直到最近还未报道GIP的这种作用。在2010年，Weidenmaier等报道了DPP-4抗性GIP类似物具有抗凋亡作用(Weidenmaier，SD，PLOS One 5(3)：e9590(2010))。有趣的是，在糖尿病和肥胖的小鼠模型中，与用利拉鲁肽(Liraglutide)或GIP类似物单独治疗相比，GLP-1受体激动剂利拉鲁肽和酰化的GIP类似物的组合显示出优异的效果(Gault，VA，Clinical Science 121：107-117(2011))。

用GLP-1受体激动剂进行慢性治疗在糖尿病患者中引起显著的体重降低。有趣的是，在相似患者中长时间使用DPP-4抑制剂不始终改变体重。证据表明(Matthias

在ADA(American Diabetes Association)上的口头演讲，2011)，当共同施用GLP-1和GIP时增强与GLP-1激动剂治疗相关的体重降低。在啮齿类动物中，与GLP-1单独治疗相比，共同施用GLP-1和GIP导致更大的体重降低(Finan，Sci Transl Med.2013；5(209)：209ra151.Irwin N等，2009，Regul Pept；153：70-76.Gault等，2011，Clin Sci；121：107-117)。因此，除了改善血糖，GIP也增强GLP-1介导的体重降低。在相同的演讲中，还显示结合胰高血糖素、GLP-1和GIP受体激动剂在DIO小鼠中导致进一步的体重降低。

在本发明的新型肽中，通过组合胰高血糖素、GLP-1和GIP受体激动剂，预期可以实现优异的血糖控制和体重降低。这样的肽由于GLP-1和GIP组分而有可能具有强的肠促血糖素作用和改善的β细胞保护，并且由于所有三种组分而通过刺激能量消耗、脂类分解和减少食物摄取具有改善的体重降低。

发明概述

概括地说，本发明涉及胰高血糖素-GLP-1-GIP三重激动剂(在本说明书中称为“三重激动剂”)，其与野生型胰高血糖素相比包含一个或更多个替换，并且其可具有改变的特性，优选增加的GIP和GLP-1受体活性，例如，如在体外效力测定中所评估的。在本发明中，已经发现胰高血糖素-GLP-1-GIP三重作用受体激动剂优于现存和市售的GLP-1类似物，原因是所述三重激动剂提供改善的血糖控制、可能的胰岛和β细胞保护以及增强的体重降低。所述胰高血糖素-GLP-1-GIP三重激动剂可用作2型糖尿病、肥胖和相关病症的治疗剂。

本发明提供了具有通式I的三重激动剂或其可药用盐或溶剂化物：

R¹-Tyr-X2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-X10-Ser-X12-X13-Leu-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-X23-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-Y1-R² (I)

其中，

R¹是H-(即，氢)、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基、三氟乙酰基或pGlu；

X2是Aib、Gly、Ala、D-Ala、Ser、N-Me-Ser、Ac3c、Ac4c或Ac5c；

X10是Tyr或Leu；

X12是Lys、Ile或Ψ；

X13是Ala、Tyr或Aib；

X15是Asp或Glu；

X16是Ser、Glu、Lys或Ψ；

X17是Lys或Ψ

X19是Gln或Ala；

X20是Lys、His、Arg或Ψ；

X21是Ala、Asp或Glu；

X23是Val或Ile；

X24是Asn、Glu或Ψ；

X27是Leu、Glu或Val；

X28是Ala、Ser、Arg或Ψ；

X29是Aib、Ala、Gln或Lys；

X30是Lys、Gly或不存在；

Y1是Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser、LyS-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser、Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser或不存在。

Ψ是其中侧链与亲脂性取代基缀合的Lys、Arg、Orn或Cys残基；

并且

R²是-NH₂或-OH。

在一些实施方案中，Ψ存在于位置X12、X16和X17之一。

在一些实施方案中，所述化合物仅包含一个残基Ψ，其可存在于位置X12、X16、X17、X20、X24或X28中的任一个。例如，其可以存在于X12、X16和X17中之一。

在一些实施方案中，化合物可具有以下残基组中的一组或更多组：

K12和Y13；I12和Y13；K12和A13；I12和A13；或Ψ12和Y13；

D15和S16；D15和E16；E15和K16；D15和Ψ16；E15和S16；或E15和Ψ16；

A19、H20和D21；A19、K20和D21；A19、R20和D21；Q19、K20和E21；A19、K20和E21；或Q19、R20和A21；但特别是A19、H20和D21；A19、R20和D21或Q19、R20和A21；

I23和E24；V23和E24；或V23和N24；

L27、R28和A29；L27、S28和A29；L27、A28和Q29；E27、S28和A29；或V27和A28和Aib29；

E15和K17；

E15和Ψ17；

E15和Ψ17和Q19；

Q19和E24；

E16和Ψ17和Q19；和/或

K16和Ψ17和Q19。

这些残基组中的任一组或其组合可与以下结合：

Aib2、Ser2或Ac4c2，特别是Aib2；和/或

Tyr10或Leu10，特别是Tyr10。

位置1至29可具有如下序列：

YSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA；

YSQGTFTSDYSKYLDΨKAAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLESKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDKKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSΨAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDSΨAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKALDSKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSKAAKDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEKAAKDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAARDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKKAQKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLEKKAQKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKALDEKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKΨAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEΨKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSΨYLEKKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSKAAHDFVNWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDLSIALEKΨAQRAFVEWLLAQ；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDEΨAAKDFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAKDFVEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAKDFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAKEFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLFA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSKAAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSΨAAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKΨAQRAFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALDKΨAQRAFVNWLVA-Aib；

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIYLDEΨAAKEFIEWLESA；

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIALEKΨAQRAFVEWLLAQ；或

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIYLDKΨAQRAFVEWLLAQ。

或者，在式I的约束下，位置1至29与以上所示任何特定序列可在最多4个位置上(例如，在1、2、3或4个位置上)不同。

例如，位置1至29与如下序列之一可在最多4个位置上(例如，在1、2、3或4个位置上)不同：

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKΨAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAHDFVEWLLSA；或

Y-Aib-QGTFTSDYSIALEKΨAQRAFVEWLLAQ。

位置1至29可具有如下序列：

YSQGTFTSDYSKYLD-K(十六烷酰基-isoGlu)-KAAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDE-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDS-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEK-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLE-K(十六烷酰基-isoGlu)-KAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYS-K(十六烷酰基-isoGlu)-YLEKKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEK-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEK-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEK-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDK-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQ；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDK-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu)-AQRAFVEWLLAQ；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDK-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQ；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLD-K(二十烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQ；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALEK-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQ；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALEK-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQ；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALE-K([19-羧基-十九烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQ；

Y-Aib-QGTFTSDLSIALE-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQ；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKDFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDE-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKDFVEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDE-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKDFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDE-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AAKEFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDE-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AAKEFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDS-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLE-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRA FVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLE-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALD-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVNWLVAAib；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALD-K(十八烷酰基-Dapa-Peg3-Peg3)-AQRAFVNWLVA-Aib；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALDK-K([19-羧基-十九烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVNWLVA-Aib；

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIYLDE-K([19-羧基-十九烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AAKEFIEWLESA；

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIALE-K([19-羧基-十九烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQ；或

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIYLDK-K(19-羧基-十七烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQ。

式I的肽骨架可具有如下序列：

YSQGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA；

YSQGTFTSDYSKYLDΨKAAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSKAAHDFVEWLLSAGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLESKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDKKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSΨAAHDFVEWLLSAGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDSΨAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKALDSKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLESKAAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSKAAKDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEKAAKDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAARDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKKAQKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLEKKAQKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKALDEKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKΨAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEΨKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSΨYLEKKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKΨAAKEFVEWLLSAGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSKAAHDFVNWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDKΨAQRAFVEWLLAQGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALEKΨAQRAFVEWLLAQK；

Y-Aib-QGTFTSDLSIALEKΨAQRAFVEWLLAQK；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDEΨAAKDFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAKDFVEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAKDFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAKEFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDSKAAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSKAAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDSΨAAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKΨAQRAFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALDKΨAQRAFVNWLVA-Aib-KPSSGAPPPS；

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIYLDEΨAAKEFIEWLESA；

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIALEKΨAQRAFVEWLLAQK；Y

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIYLDKΨAQRAFVEWLLAQGPSSGAPPPS；或

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIYLDKΨAQRAFVEWLLAQGPSSGAPPPS。

或者，在式I的约束下，所述肽骨架序列与以上所示序列之一可在最多5个位置上不同。为避免疑义，将满足Y1定义的序列认为是单个位置。通常，化合物与参考序列仅在X1至X29中的4个位置上不同。因此，如果化合物与参考序列在5个位置上不同，则那些位置之一通常是X30或Y1。

特别地，肽骨架序列与如下序列之一可在最多5个位置上不同：

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEKΨAAKEFVEWLLSAGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDEΨAAHDFVEWLLSA；或

Y-Aib-QGTFTSDYSIALEKΨAQRAFVEWLLAQK。

式I的肽骨架可具有如下序列：

YSQGTFTSDYSKYLD-K(十六烷酰基-isoGlu)-KAAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDE-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDS-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAHDFVEWLLSAGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDS-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAHDFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEK-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLE-K(十六烷酰基-isoGlu)-KAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYS-K(十六烷酰基-isoGlu)-YLEKKAAKEFVEWLLSA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEK-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKEFVEWLLSAGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEK-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AAKEFVEWLLSAGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLEK-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AAKEFVEWLLSAGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDK-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDK-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu)-AQRAFVEWLLAQGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDK-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLD-K(二十烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQGPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALEK-K([17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQK；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALEK-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQK；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALE-K([19-羧基-十九烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQK；

Y-Aib-QGTFTSDLSIALE-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQK；

Y-Aib-QGTFTSDYSKYLDE-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKDFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDE-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKDFVEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDE-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAKDFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDE-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AAKEFIEWLESA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLDS-K(十六烷酰基-isoGlu)-AAHDFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIYLE-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLRA；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALD-K(十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVNWLVA-Aib-KPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALD-K(十八烷酰基-Dapa-Peg3-Peg3)-AQRAFVNWLVA-Aib-KPSSGAPPPS；

Y-Aib-QGTFTSDYSIALDK-K([19-羧基-十九烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVNWLVA-Aib-KPSSGAPPPS；

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIALE-K([19-羧基-十九烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQK；或

Y-Ac4c-QGTFTSDYSIYLDK-K(19-羧基-十七烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3)-AQRAFVEWLLAQGPSSGAPPPS。

某些Y1基团当存在时可在体内(例如在血清中)提供增加的稳定性，并因此可提高GIP类似物的半衰期。不希望受到理论的束缚，认为这些基团可有助于使分子的三维构象稳定和/或对蛋白质降解提供抵抗。

例如，Y1序列Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser、Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser、Lys-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser、Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser和Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser与毒晰外泌肽-4分子的C端部分具有同源性，并且似乎有助于该分子的稳定性而不伴随提供显著水平的GLP-1激动剂活性。

本发明还提供了编码肽的核酸，所述肽具有式I的序列X1-X30。还提供了表达构建体(也称为表达载体)，其包含与合适调控元件可操作连接的本发明的核酸以引导肽表达，例如，转录和翻译。本发明还提供了宿主细胞，其包含核酸或表达构建体并且能够表达和任选地分泌所述肽。

所述肽本身可以是本发明的化合物，例如，当所述肽仅包含天然存在的氨基酸(即蛋白氨基酸)，不包含残基Ψ，并且其中R¹和R²分别是H和-OH时。或者，所述肽可以是本发明化合物的前体。

本发明还提供了包含如本文中所述的三重激动剂的药物组合物，或其可药用盐或溶剂化物，在与载体的混合物中，优选可药用载体。所述三重激动剂可以例如是可药用酸加成盐。

所述药物组合物可配制成适合于通过注射或输注施用的液体，或其被配制以引起所述三重激动剂的缓慢释放。

本发明还提供了包含如本文中所述三重激动剂的治疗药盒以及包含如本文中所述三重激动剂的装置。

本发明还提供了如本文中所述的三重激动剂、或其可药用盐或溶剂化物以供医疗方法使用，例如，供治疗和/或预防代谢紊乱使用。

本发明还提供了如本文中所述的三重激动剂、或其可药用盐或溶剂化物在制备用于治疗和/或预防代谢紊乱的药物中的用途。

本发明还提供了在对象中预防和/或治疗代谢紊乱的方法，其包括向所述对象施用如本文中所述的三重激动剂、或其可药用盐或溶剂化物。

代谢紊乱可以是糖尿病或糖尿病相关病症，或肥胖症或肥胖相关病症。肥胖和糖尿病之间的关系是公知的，因此，这些病症未必是分离的或互相排斥的。

糖尿病相关病症包括胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、空腹血糖升高、前驱糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病高血压、血脂异常、骨相关病症及其组合。

糖尿病相关病症还包括动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病和卒中；或血脂紊乱、血压升高、高血压、血栓前状态、促炎症状态和致动脉粥样硬化性血脂异常的相关病症。

骨相关病症包括但不限于骨质疏松症和提高的骨折风险。

血脂紊乱可选自高甘油三酯、低HDL胆固醇、高LDL胆固醇和斑块在动脉壁中积聚或其组合。

血栓前状态可选自血液中高纤维蛋白原水平和血液中高纤溶酶原活化剂抑制剂-1水平。

促炎症状态可以是血液中C-反应蛋白水平升高。

肥胖相关病症包括肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病和肥胖引起的睡眠呼吸暂停，或者可与选自以下的病症相关：致动脉粥样硬化性血脂异常、血脂紊乱、血压升高、高血压、血栓前状态和促炎症状态或其组合。

发明详述

除非本文另有定义，否则本申请中所使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。通常，本文所述的与化学、分子生物学、细胞和癌症生物学、免疫学、微生物学、药理学以及蛋白质和核酸化学关联使用的术语和方法是本领域中公知和常用的。

定义

除非另有说明，否则对于在以上书面描述中所使用的特定术语给出如下定义。

在整个本说明书中，单词“包含”或其变化形式将理解为暗示包含所述整体(或组分)或一组整体(或组分)，但不排除任何其他整体(或组分)或其他组整体(或组分)。

除非上下文另有明确说明，否则没有数量词修饰的对象包括多个所述对象。

术语“包括”用于表示“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换使用。

术语“患者”、“对象”和“个体”可互换使用并且是指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物如人；灵长类；家畜动物(例如牛、猪)；伴侣动物(例如犬、猫)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。

在本发明的上下文中的术语“溶剂化物”是指在溶质(这里指的是根据本发明的肽缀合物或其可药用盐)与溶剂之间形成的确定化学计量的复合物。在这一点上，所述溶剂可以例如是水、乙醇或其他可药用的代表性小分子有机物，例如但不限于乙酸或乳酸。当上述溶剂是水时，这样的溶剂化物通常被称为水合物。

在本发明的上下文中所使用的术语“激动剂”是指激活所述受体类型的物质(配体)。

在整个说明书和权利要求书中，使用天然(或“蛋白原”)氨基酸的常规单字母和三字母代码，以及其他(非天然或“非蛋白原”)α-氨基酸的普遍接受的三字母代码，例如，Aib(α-氨基异丁酸)、Orn(鸟氨酸)和D-Ala(D-丙氨酸)。除非明确指出，否则本发明的肽中的所有氨基酸残基优选为L-构型。

本文中所公开的序列是在序列的氨基端(N端)上并入“H-”部分的序列，以及在序列的羧基端(C端)上并入“-OH”部分或“NH₂”部分的序列。在这样的情况下，除非另有说明，否则所述序列的N端上的“H-”部分表示氢原子(即R¹＝H-)，对应于在N端上存在游离的伯氨基或仲氨基，而在所述序列的C端上的“-OH”或“-NH₂”部分(即R²＝-OH或-NH₂)分别表示C端上的羧基(-COOH)或酰胺基(-CONH₂)。

N端上可能存在其他R¹基团，包括焦谷氨酸(pGlu；(S)-(-)-2-吡咯烷酮-5-羧酸)、C_1-4烷基、乙酰基、甲酰基、苯甲酰基和三氟乙酰基。

受体激动剂活性

如上所述，本文中所述的化合物是胰高血糖素-GIP-GLP1双重受体激动剂。也就是说，其对胰高血糖素受体、GIP受体和GLP-1受体全部三种均具有激动剂活性。

在本发明的上下文中使用的术语“激动剂”是指这样的物质(配体)，其能够与特定受体结合并通过所述受体激活信号传导。因此，GIP受体激动剂能够与GIP受体(指定为GIP-R)结合并通过该受体激活信号传导，例如，通过产生cAMP或诱导Ca²⁺释放。因此，对GIP受体的激动剂活性可通过评估GIP受体信号传导来测定，例如，所述激动剂活性可通过cAMP产生或Ca²⁺释放来测定。

编码人GIP受体的cDNA序列具有基因库(GenBank)登录号no.BC101673.1(GI：75516688)。所编码的氨基酸序列(包括信号肽)是：

(基因库AAI01674.1GI：75516689)。这可应用于任何测定中来测定GIP信号传导。

类似地，所述化合物对GLP-1受体(GLP-1-R)具有激动剂活性，即，其能够与GLP-1受体结合并通过所述受体激活信号传导，例如，通过产生cAMP或诱导Ca²⁺释放。因此，对GLP-1受体的激动剂活性可通过评估GLP-1受体信号传导来测定，例如，所述激动剂活性可通过cAMP产生或Ca²⁺释放来测定。

GLP-1受体可具有人胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)的序列，所述人胰高血糖素样肽1受体具有原始登录号P43220。前体蛋白质(包括信号肽)具有原始登录号NP_002053.3；GI：166795283，并具有如下序列：

类似地，所述化合物对胰高血糖素受体(Glu-R)具有激动剂活性，即，其能够与胰高血糖素受体结合并通过该受体激活信号传导，即，通过产生cAMP或诱导Ca²⁺释放。因此，对胰高血糖素受体的激动剂活性可通过评估胰高血糖素受体信号传导来测定，例如，所述激动剂活性可通过cAMP产生或Ca²⁺释放来测定。

胰高血糖素受体可具有人胰高血糖素受体(Glu-R)的序列，所述人胰高血糖素受体具有原始登录号P47871。前体蛋白质(包括信号肽)具有原始登录号NP_000151.1；GI：4503947，并具有如下序列：

在其中涉及前体蛋白质序列的所有情况下，当然应当理解，测定可使用缺少信号序列的成熟蛋白质。

本发明的化合物具有至少一种GIP、一种胰高血糖素以及一种GLP-1生物活性，特别是在代谢疾病(如糖尿病和肥胖)的治疗中。例如，这可以在如实施例中所述的体内测定中进行评估，其中在已处理测试动物或将其暴露于三重激动剂之后测定血糖水平或另一种生物活性。特别地，当将本发明的化合物施用于糖尿病对象时，其能够改善血糖控制。另外地或替代地，当将本发明的化合物施用于超重或肥胖对象时，其能够减轻体重。不论哪种情况，当按照可比较的给药方案给药时，效果可优于在可比较对象中用同等量(以质量或摩尔比计)野生型人GIP或GLP-1获得的效果。

体外测定中的活性也可用作化合物活性的量度。通常，所述化合物对胰高血糖素、GLP-1和GIP受体(分别指定为GCG-R、GLP-1-R和GIP-R)具有活性。EC₅₀值可用作激动剂对给定受体效力的数值量度。EC₅₀值是在特定测定中实现化合物最大活性一半时所需的化合物浓度的测量值。因此，例如在特定测定中，EC₅₀[GLP-1R]比天然GIP的EC₅₀[GLP-1R]低的化合物可被认为与GIP相比对GLP-1R具有更高的效力。在本发明的一些实施方案中，例如，当使用实施例2中所述的测定法进行评估时，EC₅₀GLP-1-R和/或EC₅₀GIP-R和/或EC₅₀GCG-R小于1.0nM、小于0.9nM、小于0.8nM、小于0.7nM、小于0.6nM、小于0.5nM、小于0.4nM、小于0.3nM、小于0.2nM、小于0.1nM、小于0.09nM、小于0.08nM、小于0.07NM、小于0.06nM、小于0.05nM、小于0.04nM、小于0.03nM、小于0.02nM、小于0.01nM、小于0.009nM、小于0.008nM、小于0.007nM、小于0.006nM或小于0.005nM。

亲脂性基团

本发明的化合物可包含残基Ψ，即选自Lys、Arg、Orn和Cys的残基，在所述残基中侧链与亲脂性取代基缀合。

不希望受到任何特定理论的束缚，认为所述取代基与血流中的血浆蛋白质(例如白蛋白)结合，从而保护本发明化合物不被酶促降解和肾清除，并因此提高所述化合物的半衰期。所述取代基还可调节所述化合物例如对GIP受体、胰高血糖素受体和/或GLP-1受体的效力。

取代基在侧链的远离α-碳的末端与官能团缀合。因此，通过存在所述取代基，可降低或完全消除Lys、Arg、Orn或Cys侧链参与由官能团介导的相互作用(例如，分子内和分子间相互作用)的正常能力。因此，所述化合物的总体性质可对作为残基Ψ存在的实际氨基酸的变化相对不敏感。因此，认为任何残基Lys、Arg、Orn和Cys可存在于其中允许Ψ的任何位置。然而，在某些实施方案中，Ψ的氨基酸组分为Lys可能是有利的。

因此，Ψ是其中侧链与取代基缀合的Lys、Arg、Orn或Cys残基，所述取代基具有式-Z¹或-Z²-Z¹。

-Z¹是在末端以-X-与Ψ或Z²连接的脂肪链；

其中，

-X-是键、-CO-、-SO-或-SO₂-；

以及，任选地，Z¹在链的远离连接-X-的末端具有极性基团；所述极性基团包括羧酸或羧酸生物电子等排体、膦酸或磺酸基；

并且其中-Z²-如果存在的话是将Z¹与Ψ相连接的下式的间隔物：

其中：

每个Y独立地为-NH、-NR、-S或-O，其中R是烷基、保护基团或者与间隔物Z²的另一部分形成连接；

每个X独立地为键、CO-、SO-或SO₂-；

前提条件是当Y是-S时，与其结合的X是键；

每个V独立地为连接Y和X的二价有机部分；

并且n是1至10。

基团Z¹

Z¹是具有至Ψ或至Z²的在本文中称为-X-的连接的脂肪链。-X-可以是例如键、酰基(-CO-)、亚磺酰基(-SO-)或磺酰基(-SO₂-)。当Z¹与Ψ直接结合时，即，当Z²不存在时，优选地，-X-是酰基(-CO-)、亚磺酰基(-SO-)或磺酰基(-SO₂-)。最优选地，-X-是酰基(-CO-)。

Z¹还可具有极性基团，所述极性基团位于链的远离连接-X-的末端。换句话说，所述连接相对于所述极性基团位于ω位置。所述极性基团可直接与脂肪链的末端结合，或者可以通过连接基团结合。

优选地，所述极性基团是酸性或弱酸性基团，例如，羧酸或羧酸生物电子等排体、膦酸盐/酯或磺酸盐/酯。所述极性基团在水中的pK_a可为-2至12，更优选1至7，更优选3至6。某些优选的极性基团的pK_a为4至5。

例如，但并不限于，所述极性基团可包括羧酸(-COOH)或羧酸生物电子等排体、膦酸(-P(O)(OH)₂)或磺酸(-SO₂OH)基团。

优选地，所述极性基团如果存在的话包括羧酸或羧酸生物电子等排体。合适的羧酸生物电子等排体是本领域中已知的。优选地，所述生物电子等排体具有pK_a与相应羧酸相似的质子。合适的生物电子等排体的实例可以包括但不限于四唑、酰基磺酰胺、酰基羟胺和方酸衍生物，如下所示(---表示连接点)：

R是例如Me、CF₃

本文中所使用的脂肪链是指包含碳原子链的部分，所述碳原子主要被氢或类氢原子(例如烃链)取代。尽管可以理解，取代可改变整个分子的亲脂性，但这样的脂肪链通常被称为是亲脂性的。

所述脂肪链可以是脂肪族的。其可以是完全饱和的或者可包含一个或更多个双键或三键。每个双键如果存在的话可以是E或Z构型。所述脂肪链在其长度上也可具有一个或更多个环亚烷基或杂环亚烷基部分，并且另外地或者替代地在其长度上可具有一个或更多个亚芳基或杂亚芳基部分。例如，所述脂肪链可在其长度上并入例如如下所示的亚苯基或亚哌嗪基部分(其中---表示链内的连接点)。

所述脂肪链可以衍生自脂肪酸，例如，其可衍生自具有6至12个碳原子的脂肪族尾的中链脂肪酸(medium-chain fatty acid，MCFA)；具有13至21个碳原子的脂肪族尾的长链脂肪酸(long-chain fatty acid，LCFA)；或具有22或更多个碳原子的脂肪族尾的非常长链脂肪酸(LCFA)。线性饱和脂肪酸的实例包括十三(十三烷)酸、肉豆蔻(十四烷)酸、十五烷(十五烷)酸、棕榈(十六烷)酸和十七(十七烷)酸，从所述线性饱和脂肪酸中可以得到合适的脂肪链。线性不饱和脂肪酸的实例包括肉豆蔻油酸、棕榈油酸、杉皮酸(sapietic acid)和油酸，从所述线性不饱和脂肪酸中可以得到合适的脂肪链。

所述脂肪链可通过酰胺键、亚磺酰胺键、磺酰胺键，或者通过酯键，或者醚、硫醚或胺键与Ψ或与Z²连接。因此，所述脂肪链可具有至Ψ或至Z²的键或者酰基(-CO-)、亚磺酰基(-SO-)或磺酰基(-SO₂-)基团。优选地，所述脂肪链具有含有酰基(-CO-)的末端，并通过酰胺或酯键与Ψ或Z²连接。

在一些实施方案中，Z¹为下式的基团：

A-B-Alk-X-

其中，

A是氢或羧酸、羧酸生物电子等排体、膦酸或磺酸基；

B是键或连接基团；

X是键、酰基(-CO-)、亚磺酰基(-SO-)或磺酰基(-SO₂-)；并且

Alk是可任选地被一个或更多个取代基取代的脂肪链。所述脂肪链优选是6至28个碳原子长(例如，C_6-28亚烷基)，更优选地，12至26个碳原子长(例如，C_12-26亚烷基)，更优选地，16至22个碳原子长(例如，C_16-22亚烷基)，并且可以是饱和或不饱和的。优选地，Alk是饱和的，即，优选Alk为亚烷基。

脂肪链上的任选取代基可独立地选自氟、C_1-4烷基，优选甲基；三氟甲基、羟甲基、氨基、羟基、C_1-4烷氧基，优选甲氧基；氧代和羧基，并且可独立地位于沿着链的任何点。在一些实施方案中，每个任选的取代基选自氟、甲基和羟基。在存在多于一个取代基的情况下，取代基可以相同或不同。优选地，取代基的数目是0至3；更优选地，所述脂肪链是未被取代的。

B可以是键或连接基团。当B是连接基团时，其可以是环亚烷基、杂环亚烷基、C₆亚芳基或C_5-6杂亚芳基、或C₆亚芳基-O-或-C_5-6杂亚芳基-O-。

当B是亚苯基时，其可以例如选自1，2-亚苯基、1，3-亚苯基、1，4-亚苯基，优选1，4-亚苯基(使得A-B-是4-苯甲酸取代基或4-苯甲酸生物电子等排体)。当B是亚苯基-O-时，其可以例如选自1，2-亚苯基-O-、1，3-亚苯基-O-、1，4-亚苯基-O-，优选1，4-亚苯基-O。B的每个亚苯基可以任选地被选自以下的一个或更多个取代基取代：氟、甲基、三氟甲基、氨基、羟基、和C_1-4烷氧基，优选甲氧基。应当理解，可以选择取代基同一性和位置以精细地改变极性基团的pK_a。合适的诱导或内消旋吸电子或供电子基团及其位置效应是本领域中已知的。在一些实施方案中，B可以是C_5-6杂亚芳基，例如，亚吡啶基或亚噻吩基，并且可如描述的任选地被取代。

例如，在一些实施方案中，A-B-可以选自：

优选地为H-或HOOC-且B为键。

应当理解，当A为氢时，B是键且Alk是未经取代的亚烷基，A-B-Alk-为式H₃C-(CH₂)_n-的烷基链。

在一些实施方案中，Z¹为下式的酰基：

A-B-Alk-(CO)-

或下式的磺酰基：

A-B-Alk-(SO₂)-。

优选地，Z¹为下式的酰基：

A-B-亚烷基-(CO)-

其中A和B如上所定义。

在一些实施方案中，A是-COOH且B是键。因此，某些优选的Z¹来源于式HOOC-(CH₂)_12-22-COOH的长链饱和α，ω-二羧酸，优选在脂肪链中具有偶数个碳原子的长链饱和α，ω-二羧酸。在另一些实施方案中，A是H且B是键。因此，某些优选的Z¹来源于式HOOC-(CH₂)_12-22-CH₃的长链饱和羧酸，优选在脂肪链中具有偶数个碳原子的长链饱和羧酸。

例如，但不限于，Z¹可以是：

A-B-C_16-20亚烷基-(CO)-，其中A是H或-COOH且B是键，例如：

17-羧基十七烷酰基HOOC-(CH₂)₁₆-(CO)-；

19-羧基十九烷酰基HOOC-(CH₂)₁₈-(CO)-；

十八烷酰基H₃C-(CH₂)₁₆-(CO)-；

二十烷酰基H₃C-(CH₂)₁₈-(CO)-；

羧酸基团如果存在的话可被如本文中详述的生物电子等排体取代。

基团Z²

Z²是任选的间隔物，其连接Z¹与Ψ的氨基酸组分的侧链。最通常而言，Z²如果存在的话是在一端结合Y而在另一端结合X的间隔物，所述Y可以是氮、氧或硫原子，所述X可以是键或酰基(-CO-)、亚磺酰基(-SO-)、磺酰基(-SO₂-)或不存在。因此，Z²可以是下式(---表示连接点)的间隔物：

其中：

Y可以是-NH、-NR、-S或-O，其中R可以是烷基、保护基团或者可与所述间隔物的另一部分形成连接，剩余价键形成与Z¹的连接；

X可以是键、CO-、SO-或SO₂-，剩余价键形成与Ψ的氨基酸组分的侧链的连接；

V是连接Y和X的二价有机部分；

并且n可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在n是2或更大的情况下，每个Y、V和X与其余Y、V和X相独立。

因此，根据Y和X的性质以及Z¹和侧链上的相应连接基团，Z²可在每侧通过酰胺、亚磺酰胺、磺酰胺或酯键或通过氨基、醚或硫醚键相结合。在n是2或更大的情况下，每个V也可通过如所描述的键与各个相邻的V结合。优选地，键是酰胺、酯或磺酰胺，最优选酰胺。因此，在一些实施方案中，每个Y是-NH或-NR且每个X是CO-或SO₂-。最优选地，-X-是酰基(-CO-)。

在一些实施方案中，Z²是式-S_A-、-S_B-、-S_A-S_B-或-S_B-S_A-的间隔物，其中S_A和S_B如下所定义。

在一些实施方案中，Z²选自-S_A-或-S_B-S_A-，即，[侧链]-Z²Z¹是[侧链]-S_A-Z¹或[侧链]-S_B-S_A-Z¹。

基团S_A

S_A可以是单个氨基酸残基或氨基酸衍生物的残基，特别是在C端上用亚磺酰基或磺酰基代替羧基部分的氨基酸衍生物残基。另外地或替代地，单个氨基酸残基可具有在N端上代替氮原子的氧或硫原子。优选地，S_A是单个氨基酸残基。

在一些实施方案中，氨基酸可选自γ-Glu、α-Glu、α-Asp、β-Asp、Ala、β-Ala(3-氨基丙酸)、Dapa(2，3-二氨基丙酸)、Dab(2，4-二氨基丁酸)和Gaba(4-氨基丁酸)。应当理解，在存在多于一个羧酸或氨基部分的情况下，只要合适，连接可以在任何部分上。在残基中不结合的任何羧酸或氨基残基可以是游离的，即，作为游离羧酸或伯胺存在，或者可以是衍生化的。合适的衍生化是本领域中已知的。例如，羧酸部分可作为酯(例如作为甲基酯)存在于S_A氨基酸残基中。氨基部分可作为烷基化的胺(例如，甲基化的)存在，或者可作为酰胺或氨基甲酸酯部分被保护。其他合适的氨基酸包括β-Ala(3-氨基丙酸)和Gaba(4-氨基丁酸)和类似的ω氨基酸。

应当理解，氨基酸可以是D或L，或外消旋或对映富集的混合物。在一些实施方案中，氨基酸是L-氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是D-氨基酸。

在一些优选的实施方案中，S_A具有羧酸取代基，优选γ-Glu、α-Glu、α-Asp和β-Asp及其亚磺酰基和磺酰基衍生物。因此，在一些实施方案中，氨基酸残基是：

其中，-X-是-CO-、-SO-、-SO₂-，优选-CO-，并且a是1或2，优选2。在一些实施方案中，羧酸是酯，并且氨基酸残基是：

其中，-X-是-CO-、-SO-、-SO₂-，优选-CO-，并且a是1或2，优选2，并且R是C_1-4烷基或C₆芳基。优选地，R是C_1-4烷基，优选甲基或乙基，更优选乙基。

优选的具有羧酸的S_A基团是γ-Glu。

优选地，S_A选自Dapa或γ-Glu。最优选地，S_A是γ-Glu。

S_B基团

S_B可以是以下通式的连接基团：

其中P_u是聚合单元，并且n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。连接基团S_B的一端是-NH、-NR、-S或-O，其中R可以是烷基、保护基团或者可与所述聚合单元的另一部分形成连接；而另一端是键或CO-、SO-或SO₂-。因此，根据Y和X的性质以及Z₁、S_A和Lys上的相应连接基团，每个聚合物单元P_U可在每侧通过酰胺、亚磺酰胺、磺酰胺或酯键或通过氨基、醚或硫醚键结合。

在一些实施方案中，每个P_U可独立地为下式的单元：

其中：

Y可以是-NH、-NR、-S或-O，其中R可以是烷基、保护基团或者可与间隔物的另一部分形成连接，剩余价键形成与Z¹的连接；

X可以是键、CO-、SO-或SO₂-，剩余价键形成与Ψ侧链的连接；

并且V是连接Y和X的二价有机部分。

在一些实施方案中，V是天然或非天然氨基酸的α碳，即V是-CHR^AA-，其中R^AA是氨基酸侧链；或者V是任选取代的C_1-6亚烷基，或者V是包含串联的一个或更多个乙二醇单元的链，也称为PEG链，例如，-CH₂CH₂-(OCH₂CH₂)_m-O-(CH₂)_p-，其中m是0、1、2、3、4或5，并且p是1、2、3、4或5；当X是CO-时，p优选是1、3、4或5。任选的亚烷基取代基包括氟、甲基、羟基、羟甲基和氨基。

优选的P_U单元包括：

(i).单个氨基酸残基：P_U ⁱ；

(ii).二肽残基：P_U ⁱⁱ；以及

(iii).氨基-(PEG)_m-羧酸残基：P_U ⁱⁱⁱ，

并且可以任意组合或顺序存在。例如，S_B可以任意顺序包含每个P_U ⁱ、P_U ⁱⁱ和P_U ⁱⁱⁱ中的一个或更多个，或者可仅包含P_U ⁱ、P_U ⁱⁱ和P_U ⁱⁱⁱ中的一个或更多个单元，或者选自P_U ⁱ和P_U ⁱⁱ、P_U ⁱ和P_U ⁱⁱⁱ、或P_U ⁱⁱ和P_U ⁱⁱⁱ的一个或更多个单元。

(i).P_U ⁱ单个氨基酸残基

每个P_U ⁱ可独立地选自任何天然或非天然氨基酸残基，并且例如可选自Gly、Pro、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Cys、Phe、Tyr、Trp、His、Lys、Arg、Gln、Asn、α-Glu、γ-Glu、Asp、Ser、Thr、Dapa、Gaba、Aib、β-Ala、5-氨基戊酰基、6-氨基己酰基、7-氨基庚酰基、8-氨基辛酰基、9-氨基壬酰基和10-氨基癸酰基。优选地，P_U ⁱ氨基酸残基选自Gly、Ser、Ala、Thr和Cys，更优选地选自Gly和Ser。

在一些实施方案中，S_B是-(P_U ⁱ)_n-，其中n是1至8，更优选5至7，最优选6。在一些优选的实施方案中，S_B是-(P_U ⁱ)_n-，n是6，并且每个P_U ⁱ独立地选自Gly或Ser，优选序列是-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-。

(ii).P_U ⁱⁱ二肽残基

每个P_U ⁱⁱ可独立地选自任何二肽残基，所述二肽残基包含通过酰胺键结合的两个天然或非天然氨基酸残基。优选的P_U ⁱⁱ二肽残基包括Gly-Gly、Gly-Ser、Ser-Gly、Gly-Ala、Ala-Gly和Ala-Ala，更优选Gly-Ser和Gly-Gly。

在一些实施方案中，S_B是-(P_U ⁱⁱ)_n-，其中n是2至4，更优选3，并且每个P_U ⁱⁱ独立地选自Gly-Ser和Gly-Gly。在一些优选的实施方案中，S_B是-(P_U ⁱⁱ)_n-，n是3，并且每个P_U ⁱⁱ独立地选自Gly-Ser和Gly-Gly，优选序列是-(Gly-Ser)-(Gly-Ser)-(Gly-Gly)。

在P_U ⁱ和P_U ⁱⁱ中具有立构(stereogenic)中心的氨基酸可以是外消旋的、对映富集的或对映纯的。在一些实施方案中，所述或每个氨基酸独立地为L-氨基酸。在一些实施方案中，所述或每个氨基酸独立地为D-氨基酸。

(iii).P_U ⁱⁱⁱ氨基-(PEG)_m-羧酸残基

每个P_U ⁱⁱⁱ可独立地为以下通式的残基：

其中m是0、1、2、3、4或5，优选1或2，p是1、3、4或5，优选1。

在一些实施方案中，m是1且p是1，即，P_U ⁱⁱⁱ是8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(也称为{2-[2-氨基乙氧基]乙氧基}乙酸和H₂N-PEG₃-COOH)的残基。该残基在本文中被称为-PEG₃-。

其他更长的PEG链也是本领域中已知的。例如，11-氨基-3，6，9-三氧杂十一烷酸(也称为H₂N-PEG₄-COOH或-PEG₄-)。

在一些实施方案中，S_B是-(P_U ⁱⁱⁱ)_n-，其中n是1至3，更优选2。

最优选地，S_B是-PEG₃-PEG₃-。

优选的组合

应当理解，上述优选可独立地组合以得到优选的-Z¹和-Z²-Z¹部分。

一些优选的-Z¹和-Z²-Z¹部分如下所示(在每种情况下，---表示与Ψ的氨基酸组分侧链的连接点：

(i)[17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3

(ii)[17-羧基-十七烷酰基]-isoGlu

(iii)十八烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3

(iv)二十烷酰基-isoGlu-Peg3-Peg3

(v)[19-羧基-十九烷酰基]-isoGlu-Peg3-Peg3

(vi)十八烷酰基-Dapa-Peg3-Peg3

(vii)十六烷酰基-isoGlu

本领域技术人员清楚地知道用于制备本发明的上下文中使用的化合物的合适技术。合适的化学反应的实例参见例如WO98/08871、WO00/55184、WO00/55119、Madsen等(J.Med.Chem.2007，50，6126-32)以及Knudsen等2000(J.Med Chem.43，1664-1669)。

临床应用

本发明的化合物可为包括肥胖症和糖尿病(糖尿病)的代谢疾病提供有吸引力的治疗选择。糖尿病包括一类代谢疾病，其特征为由胰岛素分泌、胰岛素作用的缺陷或这二者引起的高血糖。糖尿病的急性症状包括尿产生过多、所导致的补偿性口渴和流体摄入增多、视力模糊、不明原因的体重降低、嗜睡和能量代谢改变。然而，症状往往不严重或可以不存在。糖尿病的长期高血糖与多种器官(特别是眼、肾、神经、心脏和血管)的长期损伤、功能紊乱和衰竭相关。糖尿病根据致病特征分为1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠期糖尿病。1型糖尿病占所有糖尿病病例的5％至10％，其由分泌胰岛素的胰腺β细胞的自身免疫破坏引起。

2型糖尿病占糖尿病病例的90％至95％，其由一系列复杂代谢紊乱引起。然而，症状往往不严重或可以不存在。2型糖尿病是内源性胰岛素产生不足以保持血糖水平低于诊断阈值的结果。

妊娠期糖尿病是指在妊娠期间鉴定出的任何程度的葡萄糖不耐受。

前驱糖尿病包括空腹葡萄糖受损和葡萄糖耐量受损，其是指当血糖水平升高但低于确立的糖尿病临床诊断水平时出现的那些状态。

由于另一些代谢风险因素的高度流行，一大部分2型糖尿病和前驱糖尿病患者的发病和死亡风险升高，所述代谢风险因素包括腹部肥胖(腹部内脏周围过多的脂肪组织)、致动脉粥样硬化性血脂异常(血脂紊乱，包括高甘油三酯、低HDL胆固醇和/或高LDL胆固醇，其促使斑块在动脉壁中积聚)、血压升高(高血压)、血栓前状态(例如，血液中高纤维蛋白原或纤溶酶原活化剂抑制因子-1)和/或促炎症状态(例如，血液中C反应蛋白水平升高)。

相反地，肥胖导致前驱糖尿病、2型糖尿病以及例如某些类型的癌症、阻塞性睡眠呼吸暂停和胆囊疾病的发病风险升高。血脂异常与心血管疾病的风险升高相关。高密度脂蛋白(HDL)具有临床重要性，原因是血浆HDL浓度与动脉粥样硬化疾病的风险之间存在负相关性。存储在动脉粥样硬化斑块中的大多数胆固醇来源于LDL，因此高浓度的低密度脂蛋白(LDL)与动脉粥样硬化密切相关。HDL/LDL比是动脉粥样硬化以及特别是冠状动脉粥样硬化的临床风险指标。

在本发明的上下文中使用的化合物充当胰高血糖素-GIP-GLP1三重激动剂。所述三重激动剂可将胰高血糖素对例如脂质代谢的作用与GIP对改善血糖控制的作用以及GLP-1对例如血糖水平和食物摄取的作用相组合。因此，其可用于加速清除过多的脂肪组织、引起可持续的体重降低以及改善血糖控制。胰高血糖素-GIP-GLP1三重激动剂还可用于降低心血管风险因素，例如高胆固醇和例如高LDL胆固醇。

因此，本发明的三重激动剂化合物可用作(单独或组合)药剂，用于防止体重增长、促进体重降低、减少过重体重或治疗肥胖(例如，通过控制食欲、进食、食物摄取、卡路里摄入和/或能量消耗和脂类分解)，包括病态肥胖以及相关疾病和健康状况，包括但不限于肥胖相关炎症、肥胖相关胆囊疾病和肥胖引起的睡眠呼吸暂停。所述化合物还可用于治疗胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、前驱糖尿病、空腹血糖升高、2型糖尿病、高血压、血脂异常(或这些代谢风险因素的组合)、动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病和卒中。这些是可与肥胖相关的所有病症。然而，在本发明的上下文中使用的化合物的作用可全部或部分地通过对体重的作用来介导，或者可不依赖于对体重的作用。

因此，三重激动剂化合物可用于(单独或组合)治疗和/或预防本文中所述的任何疾病、失调或病症，包括胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受、空腹血糖升高、前驱糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病高血压、血脂异常或其组合。在某些实施方案中，糖尿病相关病症选自动脉粥样硬化、动脉硬化、冠心病、外周动脉疾病和卒中；或者与选自以下的病症有关：致动脉粥样硬化性血脂异常、血脂紊乱、血压升高、高血压、血栓前状态和促炎症状态或其组合。在某些实施方案中，血脂紊乱选自高甘油三酯、低HDL胆固醇、高LDL胆固醇、动脉壁中斑块积聚或其组合。在某些实施方案中，血栓前状态选自血液中高纤维蛋白原水平和血液中高纤溶酶原活化剂抑制剂-1水平。在某些实施方案中，促炎症状态是血液中C反应蛋白水平升高。在某些实施方案中，肥胖相关病症选自肥胖相关炎症、肥胖症相关胆囊疾病和肥胖引起的睡眠呼吸暂停。

所述三重激动剂化合物也可用于治疗和/或预防与糖尿病相关骨质疏松症(包括提高的骨折风险)有关的任何疾病、失调或病症。所观察的骨折风险提高可能与骨质受损而不是骨矿物质密度有关。至少部分由于高血糖、神经病和更高的维生素D缺乏症发生率，相关机制尚未完全了解。

本发明提供了所述三重激动剂化合物在制备用于本说明书中描述的任何临床应用的药物的用途。对用于任何此类方法中的化合物的参考都应当相应地解释。

在一些实施方案中，本发明还提供了治疗药盒，其包含任选地与可药用载体组合的本发明的三重激动剂。在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明三重激动剂的装置，用于向对象递送所述三重激动剂。

药物组合物

本发明的三重激动剂化合物或其盐或溶剂化物可配制成用于储存或施用的药物组合物，其通常在可药用载体中包含治疗有效量的本发明上下文中所使用的化合物或其盐或溶剂化物。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制成适合于通过注射或输注施用的液体，或者其被配制以使所述三重激动剂化合物缓慢释放。

本发明化合物的治疗有效量会取决于例如施用途径、接受治疗的哺乳动物的类型和所考虑的具体哺乳动物的身体特征。决定该量的这些因素及其关系是医药领域技术人员公知的。可调整该量和施用方法以实现最佳效力，并且可取决于医药领域技术人员公知的因素，例如体重、饮食、同时用药情况(concurrent medication)等。人用最适剂量大小和给药方案可参考本发明得到的结果，并且可在适当设计的临床试验中验证。

可通过常规方法确定有效剂量和治疗方案，在实验动物中从低剂量开始，然后在提高剂量的同时监测效果，并且还系统地改变给药方案。在确定针对给定对象的最佳剂量时，临床医生可考虑多种因素。这样的考虑是本领域技术人员已知的。术语“可药用载体”包括任何标准药用载体。用于治疗用途的可药用载体是制药领域中公知的，并描述于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编著.1985)中。例如，可使用弱酸性或生理pH下的无菌盐水和磷酸盐缓冲盐水。合适的pH缓冲剂可以是例如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、乳酸盐、马来酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(其在某些实施方案中是优选的缓冲剂)、精氨酸、赖氨酸和醋酸盐，或其混合物。该术语还涵盖在美国药典中列出的用于动物(包括人)的任何试剂。

术语“可药用盐”是指所述化合物的盐。盐包括可药用盐，例如酸加成盐和碱式盐。酸加成盐的实例包括盐酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐。碱式盐的实例包括其中阳离子选自碱金属离子(例如钠离子和钾离子)、碱土金属离子(例如钙离子)和铵离子⁺N(R³)₃(R⁴)的盐，其中R³和R⁴独立地表示任选取代的C_1-6烷基、任选取代的C_2-6烯基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基。可药用盐的其他实例描述于“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，第17版.Alfonso R.Gennaro(编著)，Mark Publishing Company，Easton，PA，U.S.A.，1985及更新的版本中，以及Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology中。

“治疗”是指用于获得有益或期望的临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状缓解、疾病程度减轻、疾病状态稳定(即，不恶化)、疾病发展延后或减缓、疾病状态改善或减轻以及(部分地或全部地)消除(remission)，无论是可检测还是不可检测的。“治疗”还可指与未接受治疗时的预期存活相比延长存活期。“治疗”是以防止疾病发生或改变疾病的病理状况为目的而进行的介入。因此，在某些实施方案中，“治疗”指治疗性治疗以及预防或防护性手段二者。需要治疗的对象包括已患病的对象和待预防疾病发生的对象。“治疗”是指与未治疗相比抑制或减轻病理状况或症状(例如，体重增长、高血糖)的提高，并不必然暗示相关病症的完全终止。

本发明的药物组合物可以是单位剂量形式。在这样的形式中，组合物被分成包含合适量活性组分的单位剂量。单位剂量形式可以是包装的制剂，所述包装包含离散量的制剂，例如盒装片剂、胶囊剂以及小瓶或安瓿中的粉末。单位剂量形式本身还可以是胶囊剂、扁囊剂(cachet)或片剂，或可以是合适数量的任何这些包装形式。其可以单剂量可注射形式提供，例如采用注射笔(pen)的形式。可将组合物配制成适于任何合适的施用途径和方式。可药用载体或稀释剂包括适合于经口、经直肠、经鼻或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内和经皮)施用的制剂中使用的那些。可方便地将所述制剂以单元剂量形式提供，并且可通过药学领域中公知的任何方法来制备。皮下或经皮施用方式可特别适合于本文中所述的某些化合物。

联合治疗

在某些实施方案中，本发明的化合物可作为联合治疗的一部分与至少一种用于治疗糖尿病、肥胖、血脂异常或高血压的其他药剂一起施用。

在这样的情况下，至少两种活性剂可同时施用或分开施用，并作为相同药物制剂的一部分或作为单独的制剂。因此，三重激动剂化合物(或其盐或溶剂化物)可与抗糖尿病药组合使用，所述抗糖尿病药包括但不限于：二甲双胍、磺酰脲类、格列奈类(glinide)、DPP-IV抑制剂、格列酮或胰岛素。在某些实施方案中，所述化合物或其盐或溶剂化物与胰岛素、DPP-IV抑制剂、磺酰脲类或二甲双胍(特别是磺酰脲类或二甲双胍)组合使用，以实现充分的血糖控制。在某些优选的实施方案中，所述化合物或其盐或溶剂化物与胰岛素或胰岛素类似物组合使用以实现充分的血糖控制。胰岛素类似物的实例包括但不限于

和

在某些实施方案中，所述三重激动剂化合物或其盐或溶剂化物还可与一种或更多种抗肥胖药组合使用，所述抗肥胖药包括但不限于胰高血糖素样肽受体1激动剂、肽YY或其类似物、大麻素受体1拮抗剂、脂肪酶抑制剂、黑皮质素受体4激动剂或黑色素浓集激素受体1拮抗剂。

在某些实施方案中，所述三重激动剂化合物或其盐或溶剂化物可与抗高血压剂组合使用，所述抗高血压剂包括但不限于血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻断剂、利尿剂、β阻断剂或钙通道阻断剂。

在某些实施方案中，所述三重激动剂化合物或其盐还可与抗血脂异常剂组合使用，所述抗血脂异常剂包括但不限于他汀类、贝特类(fibrate)、烟酸类和/或胆固醇吸收抑制剂。

核酸、载体和宿主细胞

本发明提供了编码肽的核酸，所述肽具有式I的序列X1-X30。还提供了表达构建体(也称为表达载体)，其包含与合适调控元件可操作地连接的本发明的核酸以引导肽表达，例如，转录和翻译。本发明还提供了宿主细胞，其包含核酸或表达构建体并能够表达和任选地分泌所述肽。

在一些实施方案中，本发明提供了制备本发明化合物的方法，所述方法包括在适合于表达所述化合物的条件下培养上述宿主细胞并纯化由此产生的化合物。

本发明还提供了如上所述的核酸分子、表达载体或宿主细胞以用于医疗方法中，并且特别是用于本说明书其他地方所讨论的代谢紊乱的治疗中。

本发明化合物的合成

核酸分子可编码本发明的化合物、具有式I的氨基酸序列X1-X30的肽或者是本发明化合物的前体的肽。

通常，这样的核酸序列会作为表达构建体提供，其中所述编码核酸与合适的控制序列功能性地连接以指导其表达。所述表达构建体可在能够表达(以及任选地还分泌)所述前体的宿主细胞的环境中或在无细胞表达系统中提供。

本发明提供了制备本发明三重激动剂的方法，所述方法包括表达所述三重激动剂的氨基酸前体并对所述前体进行修饰以提供三重激动剂。所述修饰可包括存在于位置Ψ处的Lys、Arg或Cys的化学修饰以引入亲脂性部分，N端或C端的修饰，和/或分子中任何其他氨基酸侧链的修饰(例如，以引入非天然存在的氨基酸残基)。

本发明的化合物也可如下制备：通过标准肽合成方法，例如，通过标准固相或液相方法；逐步或通过片段组装，并分离和纯化最终的肽化合物产物，或者通过重组和合成方法的任意组合。

可优选通过固相或液相肽合成方法来合成本发明的肽化合物。关于这点，可参考WO 98/11125或尤其是Fields，G.B.等，“Principles and Practice of Solid-PhasePeptide Synthesis”；in：Synthetic Peptides，Gregory A.Grant(编辑)，OxfordUniversity出版社(第二版，2002)以及本文中的合成实施例。

实施例

以下实施例说明了本发明的某些实施方案。然而，应当理解，这些实施例不意味着也不旨在完全限定本发明的条件和范围。这些实施例是使用标准技术来实施的，除非另外详细说明，否则所述标准技术是本领域技术人员公知和常规的技术。以下实施例仅用于说明目的，并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

本文中参考的所有出版物、专利和专利申请在此以相同程度通过引用整体并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体和单独地表明通过引用将其整体并入本文。

实施例1

除非另外清楚指明，否则本发明中所使用的方法描述如下。

酰化三重激动剂的一般合成

使用标准Fmoc化学在CEM Liberty肽合成仪上进行了固相肽合成。在使用之前将TentaGel S Ram树脂(1g；0.25mmol/g)在NMP(10ml)中溶胀，并使用DCM和NMP在管和反应器之间转移。

偶联

向CEM Discover微波装置中的树脂中添加了NMP/DMF/DCM(1∶1∶1；0.2M；5ml)中的Fmoc-氨基酸以及COMU/NMP(0.5M；2ml)和DIPEA/DMF(2.0M；1ml)。将所述偶联混合物加热至75℃持续5分钟，同时用氮气鼓泡通过所述混合物。然后将树脂用DMF(4×10ml)洗涤。

去保护

向树脂中添加了哌啶/NMP(20％；10ml)用于初始脱保护，并将所述混合物通过微波加热(30秒；40℃)。将反应器排干，并添加第二部分的哌啶/DMF(20％；10ml)并再次加热(75℃；3分钟)。然后将树脂用NMP(6×10ml)洗涤。

侧链酰化

将Fmoc-Lys(ivDde)-OH或替代地具有正交侧链保护基团的另一种氨基酸引入到酰化位置。然后在最后的偶联中使用Boc₂O或者替代地通过使用Boc-保护的氨基酸来Boc-保护肽骨架的N端。当肽仍与树脂相连时，使用在NMP中新鲜制备的水合肼(2-4％)选择性地切割所述正交侧链保护基团2×15分钟。未保护的赖氨酸侧链首先与Fmoc-Glu-OtBu或另一个间隔氨基酸偶联，其随后使用如上所述的肽偶联方法用哌啶去保护并用亲脂性部分酰化。所使用的缩写如下：

COMU：1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉

代亚甲基)]甲铵六氟磷酸盐

ivDde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)3-甲基丁基

Dde：1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基

DCM：二氯甲烷

DMF：N，N-二甲基甲酰胺

DIPEA：二异丙基乙胺

EtOH：乙醇

Et₂O：乙醚

HATU：N-[(二甲氨基)-1H-1，2，3-三唑[4，5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基

甲铵六氟磷酸盐N-氧化物

MeCN：乙腈

NMP：N-甲基吡咯烷酮

TFA：三氟乙酸

TIS：三异丙基硅烷。

切割

将树脂用EtOH(3×10ml)和Et₂O(3×10ml)洗涤并在室温(r.t.)下干燥至恒重。通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5；40ml，2小时；r.t.)处理将粗肽从树脂上切割下来。在减压下除去大部分的TFA，使粗肽沉淀并用乙醚洗涤三次，并在室温下干燥至恒重。

粗肽的HPLC纯化

使用配备有C-18柱(5cm；10μm)和级分收集器的PerSeptive Biosystems VISIONWorkstation，用缓冲液A(0.1％TFA，水溶液)和缓冲液B(0.1％TFA，90％MeCN，水溶液)的梯度以35ml/分钟运行，通过制备型反相HPLC将粗肽纯化至大于90％。通过分析型HPLC和MS分析了级分，将相关级分合并并冻干。最终产物通过HPLC和MS进行表征。

表1示出了合成的化合物：

表1.

实施例2

人GIP受体(GIP-R)、GLP-1受体(GLP-1-R)和胰高血糖素受体(GCG-R)活性测定

如下评估了本发明的肽缀合物的体外效果：在通过如本发明中所述的胰高血糖素、GIP、GLP1或这些的类似物刺激各自的受体之后，通过使用来自Perkin-Elmer的

cAMP试剂盒按照说明书测量了cAMP的诱导。简单地说，将表达人GIP R、GLP-1R或GCG R的HEK293细胞系(通过人GIP R、GLP-1R或GCG R的cDNA的转染和挑选稳定的克隆所产生的稳定细胞系)以30,000个细胞/孔接种在涂有0.01％聚L-赖氨酸的96孔微量滴定板上，并在200μl生长培养基(DMEM，10％FCS，青霉素(100IU/ml)，链霉素(100μg/ml))中培养1天。在分析当天，除去生长培养基，并将细胞用150μl台氏缓冲液(Tyrode’sbuffer)(台氏盐(9.6g/l)，10mM HEPES，pH 7.4)洗涤一次。然后在37℃下将细胞在100μl含有浓度递增的对照和测试化合物的测定缓冲液(台氏缓冲液中0.1％W/V碱处理过的酪蛋白和100μM IBMX)中孵育15分钟。除去测定缓冲液，将细胞在每孔80μl裂解缓冲液(0.1％w/vBSA，5mM HEPES，0.3％v/v Tween-20)中裂解。将10μl裂解细胞从每个孔转移到384孔板中并与15μl珠混合物(在测定缓冲液中1单位/15μl抗-cAMP受体珠，1单位/15μl供体珠和1单位/15μl生物素化的cAMP)混合。在使用Envision^TM平板读数器(Perkin-Elmer)进行测量之前，将板混合并在暗处于室温下孵育1小时。

使用在含有0.1％(v/v)DMSO的KRBH缓冲溶液中制备的cAMP标准曲线将结果转化成cAMP浓度。将所得cAMP曲线绘制成相对于log(测试化合物浓度)的绝对cAMP浓度(nM)，并使用曲线拟合程序XLfit进行分析。

描述每种测试化合物对受体的效力和激动剂活性二者的所计算参数为：

EC 50，导致cAMP水平半数最大提高的浓度，反映了测试化合物的效力。结果总结在表2和表2b中。最全面的数据汇总在表2b中。

表2.与对照肽相比分别对GIP-R、GLP1-R和GCG-R的平均EC₅₀值

表2b.与对照肽相比分别对GIP-R、GLP1-R和GCG-R的平均EC₅₀值

NT：未测试

预期本发明的示例性化合物对GCG-R将具有接近于天然胰高血糖素对GCG-R的活性。预期所述化合物将以远低于1nM的EC₅₀显示出强GLP-1-R激活。同样地，预期这些肽也将以低于或刚好高于1nM的EC₅₀显示出强GIP-R活性。

实施例3

选定化合物在小鼠中的药代动力学

方法

向C57BL/6J小鼠(体重为约25g的雄性)单次静脉内(i.v.)推注给予待测试的每种肽。

在施用选定化合物(100或200nmol/kg)之后，在给药后0.08、0.17、0.5、1、4、8、16和24小时抽取了血样。通过舌下出血抽取了血样。给药载剂是含甘露糖醇的磷酸盐缓冲液(pH 7.5)。

在每个取样时间点，从两只小鼠中抽取了样品，即，对于每种化合物包括16只小鼠。在取血样之后，通过颈椎脱臼法立即处死小鼠。在固相萃取(SPE)或通过液相色谱质谱(LC-MS/MS)沉淀之后，对血浆样品进行了分析。利用Phoenix WinNonlin 6.3.未划区方法，使用平均血浆浓度来计算药代动力学参数。血浆最终清除半衰期(T1/2)测定为ln(2)/λz，其中λz是最终阶段期间log浓度对时间曲线的log线性回归的斜率大小。结果总结在表3中。

表3.在i.v.施用选定化合物之后小鼠中的最终清除半衰期(小时)

化合物	T1/2(小时)
		28	7.8
32	4.1