JP2000516912A

JP2000516912A - エキセンジン類似体、それらの製造方法およびそれらを含有する製剤

Info

Publication number: JP2000516912A
Application number: JP10500235A
Authority: JP
Inventors: ホフマン，アイク; ゲーク，リューディゲル; ゲーク，ブルクハルト―ヨハネス
Original assignee: ロシュダイアグノスティクスゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1997-06-05
Publication date: 2000-12-19
Also published as: AU723694B2; KR100600457B1; KR20050085920A; US6767887B1; CA2257119A1; CN1227567A; WO1997046584A1; EP0915910B1; HK1022701A1; JP2006176532A; DE59712555D1; DK0915910T3; ATE316100T1; PT915910E; TR199802789T2; CN1183158C; AU3173297A; BR9710452A; EP0915910A1; ES2256888T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、真正糖尿病の治療に使用することができる新規なエキセンジン類似体、その製造方法及びそれらを含有する医薬製剤に関する。上記エキセンジン類似体は次の配列に由来する。

Description

【発明の詳細な説明】エキセンジン類似体、それらの製造方法およびそれらを含有する製剤本発明は、真性糖尿病の治療において使用できる新規なエキセンジン(exendin )類似体、それらの製造方法およびそれらを含有する製剤に関する。発明の背景小腸と外分泌膵臓との間の機能的接続は、血漿中のインスリンの精確な測定が可能となった後、1960年代に証明された。経口グルコース投与後のインスリンの応答は、グルコースの同一血漿レベルに到達した場合でさえ、静脈内グルコース投与後よりも、非常にいっそう強い。この「内分泌作用」は、腸−島軸の機能的組合わせにより説明される。腸のホルモンは、この作用の原因となり、食事後に小腸から放出され、増加する測定可能なレベルで血漿の中を循環し、グルコース誘導インスリン放出を増幅する。古典的内分泌ホルモンに加えて、胃の阻害性ポリペプチドＩ（GIP）、現在グルカゴン様ペプチド−１（GLP−１）は、現在主要な重要性を有する。比較的短い時間で、GLP−１は生理学的に最も興味ある内分泌ホルモンの候補から真性糖尿病II型の治療のための潜在的代替物に成熟した。本発明は、天然に存在するGLP−１分子の作用をまねる、新規な物質を記載する。これらの新規な物質は、安定性の増加と同時に効能の維持により特徴づけられる。抗糖尿病誘発作用 GLP−１の注入および皮下注射は、真性糖尿病II型の患者において、インスリン分泌をかなり増加し、そしてグルカゴン放出を阻害する（Gutnia k，M．（1992）；Kreymann，B．（1987）；Nathan，D．M．（1992）；Nauck，M ．A．（1993ａ＆ｂ））。双方は治療的重要性を有し、GLP−１の血糖低下作用に関係する：インスリンはその標的組織によるグルコースの吸収を促進し、糖新生を阻害する。さらに、GLP−１類似体は、末梢におけるグルコースの吸収を増加することが期待されるであろう。グルカゴン分泌の阻害は間接的GLP−１作用と見なさなくてはならない。なぜなら、グルカゴン産生Ａ細胞はGLP−１レセプターを発現しないからである（Komatsu，R．(1989)）。反対に、インスリンおよびソマトスタチンの放出の増加は決定的因子であるように見える。双方のホルモンはグルカゴン放出のインヒビターとして知られている。２つの分子のメカニズムは、真性糖尿病II型におけるGLP−１誘発インスリン放出に確かに寄与する。グルコース誘発インスリン放出の直接的増幅に加えて、 GLP−１はＢ細胞のサブグループを主要な刺激「グルコース」に向けて感作し（F ehmann，H．C．（1991））そして、また、多分それ以上の刺激因子に向けて感作するので、全体のより多いＢ細胞はインスリンを分泌する。このプライミング作用は、GLP−１がその比較的短い半減期にかかわらずインスリンの放出の延長に導くという事実の、最も可能性の高い説明である。この作用はグルコースレベルの増加（＞108mg／dl）に依存する独立してインスリン分泌に影響を及ぼすスルホニル尿素とGLP−１とを基本的に区別する。グルコース値が108mg／dlより減少する場合、GLP−１の静脈内注入でさえインスリン分泌は枯渇する。それゆえ、GLP−１を治療的に使用するとき、低血糖症はめったに期待されないであろう。事実、低血糖症は、また、従来の臨床的研究において記載されてきていない。しかしながら、GLP−１の薬理動態特性が問題となる。作用期間は、その非常に短い半減期により制限される。治療の観点から、安定な、強く有効なGLP−１ペプチド類似体の合成は、いずれの場合においても、望ましい。今回、ペプチド類似性は、真性糖尿病の治療のための作用期間の増加して、分解に対する安定である、改良された治療剤を開発する目的で、エキセンジン分子をベースとして合成された。エキセンジン分子は、トカゲの毒液から独創的に単離された。これらのペプチドはGLP−１と同一の薬理学的作用を有するが、驚くべきことにはかなり長い半減期を有する。本発明の主題である新規なペプチド配列はインスリン合成およびインスリンの放出およびに対してある影響を有し、そしてインスリンに対する作用は、標的組織、筋肉および脂肪組織の中へのグルコースの吸収、ならびに胃を空にすることに特に影響を与える。本発明の主題本発明は、エキセンジン−３およびエキセンジン−４の配列、すなわち、ヘロデルマ・ホリヅム（Heloderma horridum）またはヘロデルマ・ススペクツム(Hel oderma suspectum)の分泌産生物から単離されたペプチド、をベースとする（Eng ．J．et al.，(1990，1992)）。２つのペプチドのアミノ酸の配列および膵臓に対する作用は、幾人かの著者らにより既に発表された（Eng．J．et al.，（1990 ） 993)）。本発明の主題は、エキセンジン−３−（１〜３）またはエキセンジン− ４−（１〜３０）のアミノ酸の置換からなる新規なトランケートエキセンジンフラグメントであり、ここでこれらの配列のＣ−末端は３アミノ酸まで、好ましくは最大１アミノ酸だけ短縮されることができ、そしてＮ−末端は２アミノ酸まで、好ましくは最大１アミノ酸だけ短縮されることができる。驚くべきことには、アミノ酸の置換は短縮されているが、これらのエキセンジンフラグメントは生物学的に活性である。短縮されたアミノ酸の置換は比較的より長い配列よりも、製造がいっそう経済的である。それゆえ、下記の配列を有するペプチドのフラグメント、特にエキセンジン−３ −（１〜30）をベースとするペプチドのフラグメントは特に好ましい（配列識別 NO：１）：エキセンジン−３をベースとする配列識別NO：１エキセンジン−４をベースとする配列識別NO：２ここで位置１，２，28，29または30におけるアミノ酸は、所望の鎖長に依存して配列の一部分であることができる。ペプチドはＮ−末端からＣ−末端までを通して番号を付されている。Ｘ₁はグリシン以外のプロテオジェニックまたは非プロテオジェニックのアミノ酸である。１〜27の鎖長を有するエキセンジンおよびエキセンジン類似体は好ましく、特に１〜30の鎖長を有するものは好ましい。Ｃ−末端のカルボキシル基COR₃は遊離の形態（Ｒ₃＝OH）で存在するか、あるいは生理学的に許容されるアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩の形態であることができる。また、カルボキシル基を第一級、第二級または第三級アルコール、例えば、メタノール、分枝鎖状もしくは直鎖状のＣ₁−Ｃ₆アルキルアルコール、特にエチルアルコールまたはｔ−ブタノールでエステル化することができる。しかしながら、カルボキシ基を、また、第一級または第二級アミン、例えば、アンモニア、分枝鎖状もしくは直鎖状のＣ₁−Ｃ₆アルキルアミンまたはＣ₁− Ｃ₆ジアルキルアミン、特にメチルアミンまたはジメチルアミンでアミド化することができる。Ｎ−末端におけるアミノ酸のアミノ基NR₁R₂は、遊離の形態（Ｒ₁，Ｒ₂＝Ｈ）で、あるいは生理学的に許容される塩、例えば、塩化物または酢酸塩の形態で存在することができる。また、アミノ基を酸でアセチル化することができるので、Ｒ₁＝ＨかつＲ₂＝アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチルであるか、あるいはペプチド化学の慣用のアミノ保護基、例えば、Fmoc，Z，Boc，Allocで保護することができるか、あるいはＲ₁および／またはＲ₂＝Ｃ₁−Ｃ₆アルキルまたはＣ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであるようにＮ−アルキル化することができる。アルキル残基は、直鎖状、分枝鎖状または必要に応じて環状のアルキル残基、好ましくはメチル、エチル、イソプロピルおよびシクロヘキシルとして理解される。すべてのエキセンジンのフラグメントは、完全にまたは部分的に保護された誘導体として存在することができる。本発明の他の主題は、下記の（ａ）〜（ｐ）に記載する修飾の少なくとも１つであるが、最大11が追加的に実施されている、前述の性質および配列の長さを有するエキセンジンのフラグメントである。下記の（ａ）〜（ｐ）に記載する修飾の最大９つを有するエキセンジンのフラグメントは好ましく、最大５つを有するものは特に好ましい。（ａ）位置１におけるα−アミノ酸は、Ｄ−His，Ala，Ｄ−Ala，Gly，LysまたはＤ−Lysであり、それらのうちのAla，GlyまたはLysは特に好ましい；あるいは（ｂ）位置２におけるα−アミノ酸は、Ser，Ｄ−Ser，Thr，Ｄ−Thr，Gly，Ala ，Ｄ−Ala，Ile，Ｄ−Ile，Val，Ｄ−Val，LeuまたはＤ−Leu、好ましくはSer， Thr，Gly，Ala，Val，IleまたはLeuである；あるいは（ｃ）位置３におけるアミノ酸は、Glu，Ｄ−Glu，Asp，Ｄ−Asp，AlaまたはＤ −Ala、好ましくはGlu，AspまたはAlaである；あるいは（ｄ）位置４におけるアミノ酸は、Ala，Ｄ−Alaまたはβ−Ala、好ましくはAla である；あるいは（ｅ）位置５におけるα−アミノ酸は、Ser，TyrまたはAlaである；あるいは（ｆ）位置６におけるα−アミノ酸は、Ala，Ile，Val，Leu，ChaまたはTyr、好ましくはAla，Ile，Val，LeuまたはTyrである；あるいは（ｇ）位置７におけるα−アミノ酸は、Ala，Ｄ−Ala，Tyr，Ｄ−Tyr，Ser，Ｄ −SerまたはＤ−Tyr、好ましくはAla，TyrまたはSerである；あるいは（ｈ）位置８におけるα−アミノ酸は、Ala，TyrまたはThrである；あるいは（ｉ）位置９におけるα−アミノ酸は、Ala，Ｄ−Ala，Glu，Ｄ−GluまたはＤ− Asp、好ましくはAlaまたはGluである；あるいは（ｊ）位置10，11，12，15，16，17，18，19，20，21，24，28，29 におけるアミノ酸は、互いに独立して、プロテイノジェニックまたは非プロテイノジェニックのＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくはプロテイノジェニックのＬ −アミノ酸である；あるいは（ｋ）位置13におけるα−アミノ酸は、中性のＬ−アミノ酸、好ましくは中性のプロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；あるいは（ｌ）位置14におけるα−アミノ酸は、Ｌ−ロイシン以外の中性のＤ−またはＬ −アミノ酸、好ましくはNle，Ｄ−Nle，Ala，Ｄ−Ala，Ile，Ｄ−Ile，ValまたはＤ−Valにより置換されており、ここでIle，ValまたはAlaは特に好ましい；あるいは（ｍ）位置22におけるα−アミノ酸は、Ｄ−Phe，Tyr，Ｄ−Tyr，Leu，Ｄ−Leu ，Val，Ｄ−Val，Ｌ−Cha，Ｄ−Cha，β−１−Nal，β−２−Nalまたはβ−１− Ｄ−Nalであり、ここでTyr，LeuまたはValは好ましい；あるいは（ｎ）位置23におけるα−アミノ酸は、Leu，Ｄ−Leu，Ｄ−Ile，Val，Ｄ−Val ，Ｌ−Cha，Ｄ−Cha，Tyr，Ｄ−Tyr，PheまたはＤ−Pheであり、それらのうちの Leu，Val，TyrまたはPheは好ましい；あるいは（ｏ）位置25，26または27におけるα−アミノ酸は、中性のＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくは中性の、プロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；あるいは（ｐ）位置30におけるα−アミノ酸は、グリシン以外のプロテイノジェニックまたは非プロテイノジェニックのＤ−またはＬ−アミノ酸であり、好ましくはArg ，Ｄ−Arg，TyrまたはＤ−Tyr，ArgまたはTyrは特に好ましい。新規なエキセンジンのフラグメントの中で、既に述べた性質および配列の長さに加えて、位置10にアミノ酸ロイシンおよび／または位置19にアミノ酸バリン、位置14におけるメチオニンの代わりにアミノ酸イソロイシンまたはアラニンおよび位置30にアルギニンを含有するものは特に好ましい。また、位置10，14，19および30における前記特に好ましいアミノ酸に加えて、プロテイノジェニックのＬ−アミノ酸が位置２に存在する、エキセンジンのフラグメントの修飾は特に好ましい。好ましいエキセンジン類似体は、位置３または14に、特に好ましくは位置２に位置基を有し、特に好ましくは、エキセンジン類似体はプロテイノジェニックのアミノ酸のみを含有する。新しい短縮されかつ安定化されたエキセンジン−３およびエキセンジン−４の類似体に加えて、本発明は、また、これらの類似体を製造する方法に関し、この方法において、配列でカップリングされかつ類似体中のアミノ酸に相当し、そして天然のエキセンジンペプチドの中に天然に存在しない対応するアミノ酸で必要に応じて補充された、類似体の中に含有された保護されたアミノ酸から、固相合成において類似体を製造する。エキセンジン−３またはエキセンジン−４の配列の位置におけるグリシンを、他のプロテオジェニックまたは非プロテオジェニックのアミノ酸で置換して、合成の間においてアミノ末端の保護基の切断後のジケトピペラジンの形成を回避する。エキセンジン−（１〜30）の類似体およびフラグメントは、エキセンジン−１ −（１〜30）に比較して有利である。なぜなら、これらの類似体のより短い配列はより高い収率でいっそう容易な合成を可能とするからである。使用するアミノ酸の略号および定義は、Pure Appl．Chem．31，639-45(1972) および前掲、40，277-90（1974）において推奨されているものであり、そしてPC Tルールに相当する(WIPO stndard st. 23：Recommendation for the Presentation of Nucleotide and Amino Acid Seq uences in Patent Applications and in Published Patent Documents)。１文字または３文字のコードは下記の通りである：アミノ酸の略号アミノ酸３文字のコード１文字のコードアニラン Ala Ａアルギニン Arg Ｒアスパラギン Asn Ｎアスパラギン酸 Asp Ｄシステイン Cys Ｃグルタミン Gln Ｑグルタミン酸 Glu Ｅグリシン Gly Ｇヒスチジン His Ｈイソロイシン Ile Ｉロイシン Leu Ｌリジン Lys Ｋメチオニン Met Ｍフェニルアラニン Phe Ｆプロリン Pro Ｐセリン Ser Ｓスレオニン Thr Ｔトリプトファン Trp Ｗチロシン Tyr Ｙバリン Val Ｖ他のアミノ酸 Xaa ＸＤ−またはＤ，Ｌ−として特記しない限り、略号はＬ−アミノ酸を表す。Ｄ− アミノ酸は１文字コードにおいて小文字で書かれる。ある種の天然のアミノ酸ならびに非天然のアミノ酸はアキラルであり、例えば、グリシンである。表示において、すべてのペプチドのＮ−末端は左側であり、そしてＣ−末端は右側である。非プロテイノジェニックのアミノ酸の例を、それらの略号と一緒に下に記載する： β−アラニン β−Ala ｏ−アミノ安息香酸 Oab ｍ−アミノ安息香酸 Mab ｐ−アミノ安息香酸 Pab ω−アミノヘキサン酸 Ahx ω−アミノヘプタン酸 Ahp ω−アミノオクタン酸 Aoc ω−アミノドデカン酸 Ade ω−アミノテトラデカン酸 Atd シトルリン Cit シクロヘキシルアラニン Cha α，γ−ジアミノ酪酸 Dab α，β−ジアミノプロピオン酸 Dap メチオニンスルホキシド Met（Ｏ）Ｃ^α−メチル−アラニン Aib Ｎ−メチル−グリシン（サルコシン） Sar ナフチルアラニン Nal ノルロイシン Nle オルニチン Orn １，２，３，４−テトラヒドロ Tic イソキノリン３−カルボン酸アミノ酸は、それらの物理化学的性質に従い下記の３つの主要なクラスに分割することができる：酸性：アミノ酸は水溶液中で生理学的pHにおいてプロトンを解放し、結局負の電荷を有する。塩基性：アミノ酸は水溶液中で生理学的pHにおいてプロトンを受取り、結局正の電荷を有する。中性：アミノ酸は非水溶液中で生理学的pHにおいて非帯電状態である。定義「正／負の電荷を有する」または「非帯電状態である」は、統計学的に平均して、あるクラスのアミノ酸の有意な数（少なくとも25％）が前記状態であるときにおいてのみ適用される。タンパク質の中へのその組込みが遺伝暗号の情報によりコントロールされる20 のいわゆるプロテイノジェニックのアミノ酸に加えて、非プロテイノジェニックアミノ酸は、また、記載する合成法によりペプチド配列の中に組込まれることができる。プロテイノジェニックのアミノ酸のリストおよび前述の３クラスへのそれらの分類を表１に記載する。非プロテイノジェニックのアミノ酸は遺伝的にコードされない。非プロテイノジェニックのアミノ酸の例および酸性、塩基性および中性のアミノ酸へのそれらの分類を表１に記載する。表１本発明の主題であるエキセンジン類似体は、好都合な治療的性質を有する。それゆえ、それらは内分泌膵臓からのインスリン放出の刺激に導き、インスリンの生合成の増加に導き、そして末梢グルコース利用の増加に導く。血糖レベルが同時に増加するときにのみ、これらの作用は観測することができるので、低血糖症はそれらの投与後に起こることは期待されないであろう。さらに、エキセンジン類似体は内分泌膵臓からのグルカゴン放出を阻害し、糖新生の減少に導く。非インスリン依存性真性糖尿病(NIDDM)において、エキセンジン類似体は代謝の状況をかなり改善する。特に、筋肉および脂肪の組織の中に吸収されるグルコースは、インスリン分泌作用に対して独立して増加する。グルカゴン放出に対する阻害作用のために、また、インスリン依存性真性糖尿病においてエキセンジン類似体を投与することは適当である。グルカゴン様ペプチド１（GLP−１）および既知のエキセンジン−３およびエキセンジン−４の配列に比較して、本発明によるエキセンジン類似体は、驚くべきことには、種々の試験系においてより高い効能を有するので、それらはGLP−１、エキセンジン−３またはエキセンジン−４よりも治療的応用のためにいっそう適する。新規なエキセンジン類似体の利点は、特に次の通りである：分解および代謝に対するより高い安定性、作用のより長い期間、より低い投与量における有効性。特に長い作用期間または特に低い投与量における有効性を示す、エキセンジン−３をベースとする類似体は特に好ましい。固相および液相の合成はペプチドを合成する慣用の方法である。特定の生成物を合成する方法を粗製の生成物の純度および収率に関して最適化するために、方法のパラメーターおよび使用する物質、例えば、支持物質、基を反応させる試薬、反応すべきではない基をブロックする物質またはブロックする物質を切断する試薬を、合成すべき生成物、合成すべき中間体および出発物質に対して適合させることが必要である。方法の多数のパラメーターの相互依存性に関して、この適合は簡単ではない。慣用の補助剤物質および添加剤に加えて、本発明によるペプチドを個々に含有するか、あるいは活性物質と一緒に含有する製剤は、好ましくは非経口的（皮下、筋肉内または静脈内）に投与される。しかしながら、すべての他の普通の投与形態、例えば、経口、直腸、経頬（舌下を包含する）、肺、経皮、イオン導入、経膣および鼻内の投与が考えられる。薬剤はインスリン調節作用を有し、これにより好都合な方法において血糖レベルの補償を促進する。20〜50pmol／lの血液レベルを達成するとき、薬剤を使用することは好都合である。このために、0.4 〜1.2pmol／kg／分の注入速度が必要である。皮下または経頬投与の場合において、ガレヌス製剤の形態および意図する作用期間に依存する、５〜500nmolの量の物質が必要である。本発明によるエキセンジン類似体またはその薬学上許容される塩は、好ましくは、無菌の凍結乾燥物として貯蔵し、投与前に、適当な等張溶液と混合される。次いで類似体をこの形態において注射し、注入するか、あるいは必要に応じて粘膜を通して吸収させることもできる。注入溶液のための普通の添加剤、例えば、安定剤および可溶化剤を含有する、注射または注入に適当な慣用の等張水性系を溶媒として使用することができる。この場合において、生理食塩水または必要に応じて緩衝剤で等張とした溶液は好ましい。添加剤は、例えば、酒石酸塩またはクエン酸塩の緩衝剤、エタノール、錯化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸またはその無毒の塩）、粘度調節用の高分子量ポリマー（例えば、液状ポリエチレンオキシド）である。注射溶液のための液体担体物質は無菌でなくてはならず、好ましくはアンプルの中に充填される。固体状担体物質は、例えば、澱粉、ラクトース、マンニトール、メチルセルロース、タルク、高分散ケイ酸、高分子量脂肪酸（例えば、ステアリン酸）、ゼラチン、寒天、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、動物または植物の脂肪、固体状高分子量ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）である。経口投与に適当な製剤は、必要に応じて、香味剤または甘味剤を含有することができる。鼻の投与のために、界面活性剤、例えば、コール酸、タウロコール酸、ケノデキシコール酸、グリコール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸およびシクロデキストリンを添加して、鼻の粘膜を通す吸収を改良することができる。投与すべき１日量は150〜500nmolの範囲である。生物学的活性の測定は、グルカゴン様ペプチド−１の慣用の試験方法において、グルカゴン様ペプチド−１、エキセンジン−３またはエキセンジン−４の国際基準製剤と比較した測定値に基づく。本発明によるエキセンジン類似体は、例えば、下記の文献に記載されているペプチド合成における慣用法により製造することができる：固相合成について、J ．M．StewardおよびJ．D．Young“Soli d Phase Peptide Synthesis”、第２版、Pierce Chemical Co.，Rockford，Illi nois(1984)およびJ．Meienhofer Hormonal Proteins and Peptides，Vol．2 Aca demic Press，New York(1973)、および液相合成について、E．SchroderおよびK ．Lubke“The Peptides”，Vol．1，Academic Press，New York（1965）。ペプチド合成の一般的方法一般に保護されたアミノ酸を、ペプチドの合成のために、生長するペプチド鎖に付加する。第１アミノ酸の側鎖中のアミノ基またはカルボキシル基ならびに反応性基を保護する。この保護されたアミノ酸を不活性支持体にカップリングするか、あるいはそれを溶液中で使用することもできる。ペプチド配列中の次のアミノ酸をアミド結合の形成に好適な条件下に適当に保護し、第１のアミノ酸に付加する。すべての所望のアミノ酸が正しい配列でカップリングされた後、保護基および必要に応じて支持相を切断する。得られる粗製のポリペプチドを再沈降させ、好ましくはクロマトグラフィーにより精製して最終生成物を形成する。 40より少ないアミノ酸を有する生理学的に活性なポリペプチドの類似体を合成する好ましい方法は、固相ペプチド合成からなる。この方法において、α−アミノ官能（Ｎ^α）および反応性側鎖を酸不安定性基または塩基不安定性基で保護する。使用する保護基はアミド結合を結合するの条件下に安定であるべきであるが、形成したポリペプチド鎖を損傷しないで、保護基を容易に切断可能であるべきである。α−アミノ官能に適当な保護基は下記の基を包含するが、これらに限定されない：ｔ−ブトキシカルボニル(Boc)、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル（Amoc）、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシ−ベンジルオキシカルボニル、ｏ−ニトロスルフェニル、２−シクロ−ｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル(Dde)およびその他。Ｎ^α−保護基として、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）を使用することが好ましい。適当な側鎖の保護基は下記のものを包含するが、これらに限定されない：アセチル、アリル(All)、アリルオキシカルボニル(Alloc)、ベンジル(Bzl)、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、ｔ−ブトキシカルボニル(Boc)、ベンジルオキシメチル(Bom)、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブチル(tBu)、ｔ−ブチルジメチルシリル、２−クロロベンジル、２−クロロベンジルオキシカルボニル (２−CIZ)、２，６−ジクロロベンジル、シクロヘキシル、シクロペンチル、１ −（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ−１−イリデン）エチル (Dde)、イソプロピル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンジルスルホニル(Mtr)、２，３，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル(Pmc) 、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トシル(Tos)、２，４，６−トリメトキシベンジル、トリメチルシリルおよびトリチル(Trt)。固相合成において、Ｃ−末端のアミノ酸を第１として適当な支持物質にカップリングする。適当な支持物質は、試薬および段階的縮合および切断反応のための条件に対して不活性でありかつ使用する除去媒質中に溶解しない物質である。商業的に入手可能支持物質の例は下記のものを包含する：反応性基で変性されたスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーおよび／またはポリエチレングリコールおよび、また、クロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼンのコポリマー、ヒドロキシメチル化またはアミノメチル化スチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーおよびその他。４−ベンジルオキシベンジルアルコール（Wang−アンカー（Wang，S．S．1973））または２−クロロトリチルクロライド(Barlos，K ．et al.，1989)で誘導化された、ポリスチレン（１％）−ジビニルベンゼンまたはTentagel 合、好ましい。ペプチドアミドの場合において、５−（４’−アミノメチル）− ３’，５’−ジメトキシフェノキシ）バレリン酸(PAL−アンカー)(Albericio，F ．et a.，1987)またはｐ−（２，４−ジメトキシフェニル−アミノメチル）−フェノキシ基（Rink-Amidアンカー(Rink，H．1987)）は好ましい。ポリマーの支持体への結合は、Ｃ−末端のFmoc保護アミノ酸を支持物質と、活性化試薬を添加して、エタノール、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチルピロリドンまたはDMF中の同様な溶媒中で、室温または高温、例えば、40℃〜60℃、好ましくは室温において、２〜72時間、好ましくは約２×２時間の反応時間の間、反応させることによって達成することができる。 PAL，WangまたはRinkアンカーへのＮ^α保護されたアミノ酸、好ましくはFmoc アミノ酸のカップリングは、カップリング試薬、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカーボジイミド(DCC)、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカーボジイミド(DIC) または他のカーボジイミド、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（TBTU）または他のウロニウム塩、ｏ−アシル−尿素、ベンゾトリアゾール−１−イル−トリス −ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩(PyBOP)または他のホスホニウム塩、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、他のＮ−ヒドロキシイミドまたはオキシムの助けにより、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールまたは１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールの存在において、また、非存在において、実施することができ、好ましくはTBTUの助けによりHOBTを添加して、塩基、例えば、ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）、トリエチルアミンまたはＮ−メチルピロリドン、好ましくはジイソプロピルエチルアミンを添加するか、あるいは添加しないで、２〜72時間、好ましくは３時間の反応時間において、1.5〜３倍過剰のアミノ酸およびカップリング試薬を使用して、好ましくは２倍過剰において、約10℃〜50℃の温度において、溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドンまたはジクロロメタン、好ましくはジメチルホルムアミド中で実施することができる。カップリング試薬の代わりに、また、活性エステル（例えば、ペンタフルオロフェニル、ｐ−ニトロフェニルまたはその他）、Ｎ^α−Fmoc−アミノ酸の対称無水物、その酸塩化物または酸フッ化物を前述の条件下に使用することができる。Ｎ^α−保護アミノ酸、好ましくはFmocアミノ酸を好ましくは２−クロロトリチル樹脂に、ジクロロメタン中でDIEAを添加して10〜120分、好ましくは20分の反応時間において、カップリングさせるが、この溶媒およびこの塩基に限定されない。保護されたアミノ酸の連続的カップリングは、ペプチド合成において慣用の方法に従い、典型的には自動化ペプチド合成装置において、実施することができる。固相上のカップリングされたアミノ酸のＮ^α−Fmoc保護基をピペリジン（10％〜50％）でジメチルホルムアミド中で５〜20分間処理して、好ましくは２×２分間20％のピペリジンでDMF中で処理して切断した後、３〜10倍過剰、好ましくは1 0倍過剰の次の保護されたアミノ酸を前のアミノ酸に、不活性、非水性、極性溶媒、例えば、ジクロロメタン、DMFまたは２つの混合物、好ましくはDMF中で、約10℃〜50℃の温度、好ましくは25℃において、カップリングさせる。PAL，WangまたはRinkアンカーへの第１Ｎ^α−Fmocアミノ酸のカップリングについて既に述べた試薬は、カップリング試薬として適当である。代替物として、保護されたアミノ酸の活性エステル、またはその塩化物またはフッ化物または対称無水物を使用することもできる。固相合成の終わりにおいて、ペプチドを支持物質から切断すると同時に側鎖の保護基を切断する。切断は、トリフルオロ酢酸または他の強く酸性の媒質を使用して、５％〜20％ｖ／ｖの掃去剤、例えば、ジメチルサルファイド、エチルメチルサルファイド、チオアニソール、チオクレゾール、ｍ−クレゾール、アニソールエタンジチオ、フェノールまたは水を添加して、好ましくは15％ｖ／ｖのジメチルサルファイド／エタンジチオール／ｍ−クレゾール１：１：１を添加して、 0.5〜３時間、好ましくは２時間の間、実施することができる。２−クロロトリチルアンカーを氷酢酸／トリフルオロエタノール／ジクロロメタン２：２：６で切断することによって、完全に保護された側鎖をもつペプチドが得られる。保護されたペプチドをシリカゲルのクロマトグラフィーにより精製することができる。ペプチドをWangアンカーを介して固相に結合する場合かつＣ−末端がアルキルアミド化されたペプチドを製造しようとする場合、アルキルアミンまたはフルオロアルキルアミンを使用するアミノリシスにより、切断を実施することができる。アミノリシスは、−10℃〜50℃、好ましくは約25℃の温度において、約12〜24 時間、好ましくは約18時間の反応時間において実施される。さらに、ペプチドを支持体から、例えば、メタノールを使用して、再エステル化により、切断することもできる。得られた酸性溶液を３〜20倍の量のエーテルまたはｎ−ヘキサン、好ましくは 10倍過剰のジエチルエーテルと混合して、ペプチドを沈澱させ、それゆえ、エーテル中に残留する掃去剤および切断された保護基を分離する。氷酢酸からペプチドを数回再沈澱させることによって、それ以上の精製を実施することができる。得られる沈澱を水またはｔ−ブタノールまたは２つの溶媒の混合物、好ましくはｔ−ブタノール／水の１：１混合物の中に取り、そして凍結乾燥する。得られたペプチドを下記のクロマトグラフィー法のあるものまたはすべてにより精製することができる：酢酸塩の形態の弱く塩基性の樹脂のイオン交換クロマトグラフィー；非誘導化ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマーの疎水性吸着クロマトグラフィー(例えば、Amberlite^R XAD)；シリカゲルの吸着クロマトグラフィー；例えば、カルボキシメチルセルロースの、イオン交換クロマトグラフィー；例えば、Sehpadex^R Ｇ−25の、分配クロマトグラフィー；向流分配クロマトグラフィー；または高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）、特にオクチルまたはオクタデシルシリルシリカ(ODS)相の逆相HPLC。要約すると、本発明の一部分は、ポリペプチドの製造およびそれらの製剤学的に有用な塩を包含する。これらの方法は、前述の好ましい鎖長および修飾を有するエキセンジン−３またはエキセンジン−４の生理学的に活性な短縮された相同体および類似体に導き、適当な支持物質上に保護されたアミノ酸の順次の縮合の方法、支持体および保護基を切断する方法および得られた粗製のペプチドを精製する方法を包含する。アプライド・バイオシステムス・カンパニー（Applied Biosystems Company）（Weiterstadt）からのアミノ酸分析装置420Ａを使用して、アミノ酸分析を実施した。50〜1000pmolの分析すべき試料を10〜40μｌの溶液中で試料の担体に適用し、引き続いて気相中で１60℃において90分間６Ｎ塩酸で完全に自動的に加水分解し、フェニルイソチオシアネートで誘導化し、微小孔HPLCによりオンラインで分析した。API III三重−四重質量分析計（SCIEX；Th ornhill，Canada）(イオンスプレーのイオン源を装備する)で、質量スペクトル分析検査を実施した。保護されたアミノ酸の誘導体は、例えば、ノババイオケム社（Novabiochem Gm bH）(Bad Soden)から入手可能である。下記の実施例は本発明の例示的選択のみを表すが、本発明の主題を限定するものと解釈すべきではない。実施例１ HGEGTFTSDLSKQ−Nle−EEEAVRLFIEWLKNGR−NH₂（配列番号：3）［Nle¹⁴，Arg³⁰］−エキセンジン-4-（1-30）−NH₂ 実施例１を、Multisyn Tech Company（Bochum）から販売されている多重自動ペプチド合成機ＳｙＲｏＩＩでの、５−（４’−アミノメチル）−３’，５’ −（ジメトキシフェノキシ）バレリアニル−アラニル−アミノメチル−ポリスチレン（１％）ジビニルベンゼン（装填率：０．５ｍｍｏｌ／ｇ）に関する固相法により０．０２ｍｍｏｌバッチで合成した。アミノ酸のα−アミノ官能基を９− フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）で保護した。側鎖保護基は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ及びＴｈｒに関してはｔ−ブチル（ｔＢｕ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＨｉｓに関してはトリチル（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ及びＴｒｐに関してはｔ− ブチルオキシ−カルボニル（Ｂｏｃ）並びにＡｒｇに関しては２，２，５，７，８−ペンタ−メチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）であった。保護化アミノ酸を、４０分の継続時間を２回の二重カップリングを用いて１０倍以上に、そして活性化試薬としてＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド／１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾールを用いて、継続的に結合させた。１５％エタンジチオール／ジメチルスルフィド／ｍ−クレゾール（１：１：１ｖ／ｖ／ｖ）の存在下で、室温で１２０分間、トリフルオロ酢酸（８５％）中の保護基を同時に切断しながら、ペプチドを高分子支持体から切断した。次に、ペプチドを無水ジエチルエーテルで沈殿させた後、無水ジエチルエーテルで数回洗浄して、チオールを完全に除去した。水／ｔｅｒｔ−ブタノル（１：１）から沈殿物を凍結乾燥して、６２ｍｇの粗製ペプチドを得た。３７％〜４２％アセトニトリル／０．９％ＴＦＡの勾配を用いて逆相ＨＰＬＣにより、粗製ペプチドを３０分以内に精製した。溶出液を蒸発させ、凍結乾燥して、≧９７％の純度の白色固体を収量２９ｇで得た。アミノ酸分析：Ａｌａ１，０８（１）；Ａｓｘ１，９１（２）；Ｇｌｘ６，１０（６）；Ｐｈｅ１，７８（２）；Ｇｌｙ３，１０（３）；Ｈｉｓ１，００（１）；Ｉｌｅ０，８８（１）；Ｌｙｓ２，０２（２）；Ｌｅｕ３，２４（３）；Ｎｌｅ１，１０（１）；Ａｒｇ１，９８（２）；Ｓｅｒ２，０４（２）；Ｔｈｒ１，９９（２）；Ｖａｌ０，９１（１）；Ｔｒｐ０，８７（１）．ＥＳＩ−ＭＳ：３４８８，２実施例２ HGEGTFTSDLSKQ-Nle-EEEAVRLFIEWLKNGY-NH₂（配列番号：4）［Nle¹⁴，Tyr³⁰］−エキセンジン-4-（1-30）−NH₂ 実施例２を、Multisyn Tech Company（Bochum）から販売されている多重自動ペプチド合成機ＳｙＲｏＩＩでの、Ｒｉｎｋ−アミドアンカー（４−（２’，４’−ジメトキシフェニルーアミノメチル）−フェノキシ基）で誘導されたＴｅｎｔａＧｅｌ（Rapp Polyn ers，Tubingen）（装填率：０．１８ｍｍｏｌ／ｇ）に関する固相法により０．００７６ｍｍｏｌバッチで合成した。使用した保護化アミノ酸は、実施例１と同様であった。保護化アミノ酸を、40℃で４０分の継続時間の単一カップリングで８倍以上に、攪拌しながら、継続的に結合させた。２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）／１ −ヒドロキシベンゾトリアゾールを活性化試薬として用い、ジイソプロピルエチルアミンを付加した。ペプチドを切断し、実施例１と同様に精製した。＞９５％の純度の白色固体１８．１ｇを得た。アミノ酸分析：Ａｌａ１，０３（１）；Ａｓｘ１，９０（２）；Ｇｌｘ６，２４（６）；Ｐｈｅ１，９４（２）；Ｇｌｙ３，１２（３）；Ｈｉｓ１，０２（１）；Ｉｌｅ１，０９（１）；Ｌｙｓ２，０１（２）；Ｌｅｕ３，０６（３）；Ｎｌｅ１，０８（１）；Ａｒｇ０，９７（１）；Ｓｅｒ１，９８（２）；Ｔｈｒ１，８０（２）；Ｖａｌ０，９３（１）；Ｔｒｐ１，０１（１）；Ｔｙｒ０，９０（１）．ＥＳＩ−ＭＳ：３４９４，８実施例３ HSDGTFTSDLSKQ-Nle−EEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂（配列番号：5）［Nle¹⁴，Arg³⁰］−エキセンジン-3-（1-30）−NH₂ 実施例３を、実施例２に関して記載した方法と同様に合成した。≧９９％の純度の白色固体１７．６ｍｇを得た。アミノ酸分析：Ａｌａ０，９９（１）；Ａｓｘ２，９８（３）；Ｇｌｘ５，１６（５）；Ｐｈｅ２，０８（２）；Ｇｌｙ２，１６（２）；Ｈｉｓ０，９５（１）；Ｉｌｅ１，０３（１）；Ｌｙｓ２，０４（２）；Ｌｅｕ２，９１（３）；Ｎｌｅ１，０５（１）；Ａｒｇ１，０４（１）；Ｓｅｒ３，００（３）；Ｔｈｒ２，０５（２）；Ｖａｌ１，０１（１）；Ｔｒｐ１，１８（１）；Ｔｙｒ０．９８（１）．ＥＳＩ−ＭＳ：３５０４，４実施例４ HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGR-NH₂（配列番号：6）［Arg³⁰］−エキセンジン-4-（1-30）−NH₂ 実施例４を、実施例１に関して記載した方法と同様に合成した。≧９６％の純度の白色固体１７．９ｍｇを得た。アミノ酸分析：Ａｌａ０，９６（１）；Ａｓｘ２，０１（２）；Ｇｌｘ６，００（６）；Ｐｈｅ１，８０（２）；Ｇｌｙ３，２１（３）；Ｈｉｓ０，９６（１）；Ｉｌｅ１，０７（１）；Ｌｙｓ１，９２（２）；Ｌｅｕ２，９８（３）；Ｍｅｔ１，０６（１）；Ａｒｇ１，９０（２）；Ｓｅｒ１，９１（２）；Ｔｈｒ２，０９（２）；Ｖａｌ０，９７（１）；Ｔｒｐ０，８４（１）．ＥＳＩ−ＭＳ：３５０８，４実施例５ GEGTFTSDLSKQ-Nle−EEEAVRLFIEWLKNGR−NH₂（配列番号：7）［Nle¹⁴，Arg³⁰］−エキセンジン-4-（2-30）−NH₂ 実施例５を、実施例２に関して記載した方法と同様に合成した。≧９７％の純度の白色固体１３．２ｍｇを得た。アミノ酸分析：Ａｌａ１，０４（１）；Ａｓｘ１，９８（２）；Ｇｌｘ６，０８（６）；Ｐｈｅ１，８６（２）；Ｇｌｙ２，９１（３）；Ｉｌｅ０，９６（１）；Ｌｙｓ１，８４（２）；Ｌｅｕ２，９８（３）；Ｎｌｅ１，０４（１）；Ａｒｇ１，９０（２）；Ｓｅｒ１，９４（３）；Ｔｈｒ１，９２（２）；Ｖａｌ０，９６（１）；Ｔｒｐ０，８５（１）．ＥＳＩ−ＭＳ：３３５０，８実施例６ HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKNGR-NH₂（配列番号：8）［Ala²¹，Arg³⁰］−エキセンジン-4-（1-30）−NH₂ 実施例６を、実施例１に関して記載した方法と同様に合成した。≧９５％の純度の白色固体１１．１ｍｇを得た。アミノ酸分析：Ａｌａ２，０８（２）；Ａｓｘ１，９３（２）；Ｇｌｘ６，０７（６）；Ｐｈｅ１，７４（２）；Ｇｌｙ２，９７（３）；Ｈｉｓ０，９８（１）；Ｉｌｅ０，８７（１）；Ｌｙｓ２，１５（２）；Ｌｅｕ２，０２（２）；Ｍｅｔ０，９６（１）；Ａｒｇ２，１３（２）；Ｓｅｒ１，８７（２）；Ｔｈｒ２，０７（２）；Ｖａｌ１，０４（１）；Ｔｒｐ０，８７（１）．ＥＳＩ−ＭＳ：３４６６，３実施例７ HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKAGR-NH₂（配列番号：9）［Ala²⁸，Arg³⁰］−エキセンジン-4-（1-30）−NH₂ 実施例７を、実施例１に関して記載した方法と同様に合成した。≧９７％の純度の白色固体１５．０ｍｇを得た。アミノ酸分析：Ａｌａ１，９８（２）；Ａｓｘ０，９８（１）；Ｇｌｘ６，２２（６）；Ｐｈｅ１，９２（２）；Ｇｌｙ３，０３（３）；Ｈｉｓ０，９９（１）；Ｉｌｅ１，０３（１）；Ｌｙｓ２，０５（２）；Ｌｅｕ３，０３（３）；Ｍｅｔ０，９６（１）；Ａｒｇ１，８４（２）；Ｓｅｒ１，９８（２）；Ｔｈｒ２，０９（２）；Ｖａｌ１，０１（１）；Ｔｒｐ０，７２（１）．ＥＳＩ−ＭＳ：３４６５，４実施例８ HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRAFIEWLKAGR-NH₂（配列番号：10）［Ala^21,28，Arg³⁰］−エキセンジン-4-（１-30）−NH₂ 実施例８を、実施例１に関して記載した方法と同様に合成した。≧９５％の純度の白色固体１８．４ｍｇを得た。アミノ酸分析：Ａｌａ３，１２（３）；Ａｓｘ０，９９（１）；Ｇｌｘ６，０４（６）；Ｐｈｅ１，８０（２）；Ｇｌｙ３，００（３）；Ｈｉｓ０，９６（１）；Ｉｌｅ１，０２（１）；Ｌｙｓ１，８４（２）；Ｌｅｕ１，９７（２）；Ｍｅｔ０，９８（１）；Ａｒｇ２，０３（２）；Ｓｅｒ１，９１（２）；Ｔｈｒ１，８８（２）；Ｖａｌ０，９９（１）；Ｔｒｐ０，９９（１）．ＥＳＩ−ＭＳ：３４２３，３実施例９同様の方法で、以下のエキセンジン誘導体を高純度で調製することができた（Ｅｘ−４＝エキセンジン−４、Ｅｘ−３＝エキセンジン−３）。以下の実施例を、アミノメチルポリスチレン（１％）ジビニルベンゼンがＲｉｎｋ−アミドアンカー（４−（２’，４’−ジメトキシフェニルーアミノメチル）−フェノキシ基）により誘導されるＲＡＭ樹脂（Rapp Polymers，Tubingen）に関する固相法により０．０２ｍｍｏｌバッチで合成した（装填率：０．５ｍｍｏｌ／ｇ）。使用した保護化アミノ酸は、実施例１と同様であった。保護化アミノ酸を、攪拌しながら、４０℃で４０分の継続時間の単一カップリングで５倍以上に、継続的に結合させた。ジイソプロピルエチルアミンを付加した２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）を活性化試薬として用いた。ペプチドの切断及び精製を、実施例１と同様に実行した。前記のようにして合成されたペプチドの収量、純度及び分析データを、以下の２つの表に列挙する。実施例１０：薬理学的データエクトペプチダーゼ製剤又は腎臓微小絨毛膜標本におけるペプチド代謝背景エクトペプチダーゼの１群は、ペプチドホルモンの分泌後代謝に関与する。これらの酵素は、種々の種類の細胞の原形質膜と結合する。それらの活性部位は、細胞外間隙に向けて配向される。さらに、これらの酵素は近位腎細管の刷子縁膜中に高濃度で存在する。したがって、腎刷子縁微小絨毛膜（ＢＢＭ）は関連するエクトペプチダーゼの適切な供給源であり、合成ペプチドの代謝安定性に関する in vitro試験として用い得る。あるいは、エクトペプチダーゼ製剤を用いることもできる。ヒト中性エンドペプチダーゼ２４．１１、並びにジペプチジルペプチダーゼＩＶは、ＧＬＰ−１がこれらの両エクトペプチダーゼの基質であるために、例として用いられた。刷子縁微小絨毛膜の調製ラット及びブタ腎臓皮質の微小絨毛膜を、示差的遠心分離法を用いた非細胞分別により単離した（Booth and Kenny（1975））。膜の純度の程度及び収量を査定するために、４つの刷子縁エクトペプチダーゼを蛍光定量的に検査し、その他のマーカーは比色定量的に測定した。エクトペプチダーゼ製剤精製ヒト中性エンドペプチダーゼ２４．１１はGenentech（San Francisco，US A）から組換え体形態で入手し、ジペプチジルペプチダーゼＩＶはCalbiochem（B ad Soden）からヒト胎盤からの単離物として入手した。インキュベーションプロトコール微小絨毛膜（０．５〜１μｇタンパク質）又はそれぞれのエクトペプチダーゼ製剤（６０〜３００ｎｇ）を、５０ｍＭＮａＣｌを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）１００μｌ中の１０μｇのペプチド（約３ｎｍｏｌ）とともにインキュベートした。沸騰により、予定時間（１時間まで）で反応を終結させた。その後、試料を遠心分離（１０，０００ｘｇ）し、０．１％ＴＦＡ１５０μｌで希釈して、逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣにより分析した。各試料を二重に測定した。ＨＰＬＣ分析下記の成分を有する系をＨＰＬＣ分析に用いた：Ａ２２４８低圧ポンプ（Phar macia-LKB，Freiburg）；ＷＩＳＰ１０Ｂ自動注入器（Gynkotec，Berlin）；低圧混合系（Pharmacia-LKB，Freiburg）；及びプログラムマネジャーソフトウエアコントロールPharmacia-LKB，Freiburg）。移動溶媒Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びＢ：アセトニトリル：水：ＴＦＡ（７０：２９：０．１）を用いた二成分勾配によりＬｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒＣ−８，５μ，４ｘ１２４ｍｍ（Merck，Darmstadt）上で分離を実行した。移動溶媒Ａで平衡させたカラム上に試料溶液２４４μｌを注入後、インキュベーション生成物を８０分で０％〜８０％Ｂの線状勾配で溶離し、２１５ｎｍＵＶ吸収で検出した。タンパク質分解速度の計算各ペプチドのインキュベーション中に２つの測定を実行し、基質ピークの平均ピーク高を時間に対してプロットした。例としてＧＬＰ−１を用いて、ピーク高が試料溶液中のペプチドの量と線状に比例することを示すことができた。さらに、時間に伴うピーク高の線状低減が、微小絨毛膜又はペプチダーゼとのインキュベーションの１時間以内に観察された。それゆえ、タンパク質分解速度は基質ピークの高さの低減から確定され、［基質μｍｏｌ／タンパク質ｍｇ／分］と表される。エキセンジン類似体の分解安定性ヒト中性エンドペプチダーゼ２４．１１ｂとのインキュベーション［Ｎｌｅ¹⁴，Ａｒｇ³⁰］−エキセンジン−４−（１−３０）−ＮＨ₂（配列番号：３）を前記のように中性エンドペプチダーゼ２４．１１と一緒にインキュベートし、分解速度を確定した。ＧＬＰ−１−（７−３６）ＮＨ₂は対照として役立った。結果を表３に示す。ジペプチジルペプチダーゼＩＶとのインキュベーション表４に列挙したペプチドを、前記のようにジペプチジルペプチダーゼ（ＤＤＰ −ＩＶ）と一緒にインキュベートした。ＧＬＰ−１−（７−３６）−ＮＨ₂が５０％加水分解を示した時点で各インキュベーションを終結させた。基質ピークの各ペプチドをｒｐＨＰＬＣ行程から収集し、切形生成物を除外するために、質量分光により検査した。刷子縁微小絨毛膜とのインキュベーション前記のプロトコールにより刷子縁微小絨毛膜（ＢＢＭ）とのインキュベーション後に算出されたタンパク質分解速度を、表５に示す。ＧＬＰ−１−（７−３６）ＮＨ₂は対照として役立った。単離島細胞によるインスリン分泌器官除去麻酔（０．３〜０．５ｍｌネンブタール／等張食塩溶液１：４腹腔内投与）マウスの腹部を正中切開及び二側切開により開存し、腹膜を固定して、横隔膜に沿って肋骨弓で切り開いた。全器官を膨張させ、左心室に中性赤を注入して赤色に染色した。膵臓を、胃及び十二指腸に沿って腸間膜まで、注意深く除去した。消化まで、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＢＳ）及び２〜３滴の中性赤を人れた氷冷ペトリ皿中に膵臓を置いた。島標本２個の膵臓にセルロースを張り付け、試験管に入れて、新たに調製したコラゲナーゼ溶液（ＨＢＢＳ／水１：９，ｐＨ７．４中にコラゲナーゼ（Ｃｌ，組織溶解）０．７４Ｕ／ｍｇ、Ｓｅｒｖａ２ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌを付加して、それらを振盪しながら３７℃で１８分間インキュベートした。その後、１０００ｒｐｍで１分間、遠心分離を実行した。上清を捨てた。二次消化工程で、コラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）５ｍｌを４分間インキュベートし、振盪して、未消化組織を沈殿させた。上清をデカントし、全工程を４〜５回反復した。次に上清を１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、コラゲナーゼ溶液を捨てた。残留ペレットを氷冷ＨＢＢＳと一緒に振盪し、氷上で約１０分間沈殿させた。この洗浄工程をさらに３回反復した。立体拡大鏡下で薄桃色に染色された島を洗浄ペレットから抜き取り、培地（１００ｍｌのＲＰＭＩ１６４０（Gibco）、１ｍｌのグルタミン、１ｍｌのペニシリン、１ｍｌのＣｉｂｒｏｂａｙ抗生物質（Bayer）、１０ｍｌのウシ胎仔血清、２ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝液１Ｍ）に移した。純粋に近い培養を得るために、島を２〜３回抜き取って、新鮮な培地に移した。島の刺激培地からの島細胞を、エッペンドルフ容器当たり島１０個の量で２００ｍｌの刺激緩衝液（１１８ｍＭＮａＣｌ、０．２ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄、０．５６５ｍＭＭｇＣｌ₂、１．２５ｍＭＣａＣｌ₂、４．７ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１％ＢＳＡ、３．３ｍＭグルコース；ｐＨ７．４）を含入するエッペンドルフ容器中に分配し、３７℃で１時間、インキュベーターに入れた。その後、試験すべきペプチドを付加し、刺激緩衝液を５００ｍｌまで満たし、３７℃で１時間インキュベートした。島を１０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。Ｃ−ペプチドの量を、インスリン−ＲＩＡ（DPC Biermann，Nauhei m）を用いて上清中で測定した。各試験物質を四重に確定した。エキセンジン類似体の活性いくつかのエキセンジン類似体を、インスリン分泌活性に関して単離された島細胞で、上記のように試験した。データを一連として下記の表に示す。１０ｍＭグルコース存在下での１時間後の単離島からのインスリン放出（ｍＩＵ／時間／１０島）内分泌膵臓のＢ細胞（クローンＢ細胞株ＩＮＳ−１）中の細胞質ゾルカルシウム濃度の増大の測定ＩＮＳ−１細胞の培養（Asfari，M.，1992）：９５％空気及び５％ＣＯ₂の大気中で、１０％ＦＣＳ、１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、２ｍＭＬ−グルタミン、１００ＩＵペニシリン／ｍｌ、１００μｇストレプトマイシン／ｍｌ、１ｍＭピルビン酸塩（ナトリウム塩）及び５０μＭ２−メルカプトエタノールを含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で、ＩＮＳ−１細胞を培養した。プラスチック細胞培養プレート上で６〜８日間増殖させた後、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で１回洗浄して、等張食塩溶液中の０．０２５％トリプシン及び０．２７ｍＭＥＤＴＡと一緒に３７℃で４分間インキュベートすることにより、亜融合性細胞を底から剥がした。カルシウム測定のための細胞の調製：剥離細胞を、Spinner培地（前期と同様であるが、５％ＦＣＳ及び２５ｍＭＨＥＰＥＳを含有する培地）中に再懸濁し、攪拌棒で攪拌しながらSpinner瓶中で２．５時間インキュベートした。その後、遠心分離により培地を除去し、細胞をSpinner培地中に再懸濁した。次にそれらを、前記と同様の条件下で２μＭＦｕｒａ−２／アセトキシメチルエステルと一緒に３７℃で３０分間インキュベートした。細胞のＦｕｒａ負荷は、細胞をSpinner培地で１回洗浄する（室温で）ことにより終結させた。その後、細胞を室温で、Spinner培地中に再懸濁した（２ｘ１０⁷細胞／ｍｌ）。次に、カルシウム測定のために、細胞をこの懸濁液から取り出した。細胞質ゾルカルシウム濃度の測定：１３６ｍＭＮａＣｌ、４．８ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂、１．２ｍＭＭｇＳＯ₄、１．２ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、５ｍＭＮａＨＣＯ₃、１０ｍＭグルコース、２５０μＭスルフィンピラゾン（培地中へのＦｕｒａ−２流出を阻止するために）及び２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）を含有する変法クレブスーリンガ一緩衝液（ＫＲＢＨ）中で、３７℃で測定を実行した。細胞濃度は１〜２ｘ１０⁶／ｍｌであった。１．５ｍｌの細胞懸濁液を用いて、３７℃で分光蛍光計で、攪拌棒で攪拌しながらキュベット中で、測定を実行した。励起波長は３４０ｎｍ、発光波長は５０５ｎｍであった。細胞外Ｆｕｒａの蛍光を一時的に抑制することにより、測定された蛍光に対する細胞外蛍光指示体の割合を確定するために、測定終了時に、５０μＭＭｎＣｌ₂を付加し、その後１００μｍＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタアセテート）を付加した。ＤＴＰＡ付加後、全Ｆｕｒａを先ずカルシウム飽和状態に、次にカルシウム無含有状態に転換して、それぞれの測定値に関する較正値Fmax（カルシウム飽和）及びFmin（カルシウム無含有）を確定した。このために、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を付加して細胞を溶解した。高濃度の細胞外カルシウムと接触させることにより、染料をカルシウムで飽和させた。その後、染料をカルシウム無含有形態に完全に転換するために、５ｍＭＥＧＴＡ（エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）−テトラアセテート）及び２０ｍＭＴｒｉｓ溶液を付加した。 Tsienと同僚（Grynkiewicz，G.，1985）により紹介された算法にしたがって、細胞質ゾルカルシウムイオン濃度を算出した：［Ｃａ²⁺］cyt＝（（Ｆ−Fmin）／（Fmax−Ｆ））ｘKD （式中、Ｆ：それぞれの測定点の蛍光；ＫＤ：Ｆｕｒａ，２５０ｎＭのカルシウム錯体の解離定数（Grynkiewicz，G.，1985））。（この計算の前に、細胞外Ｆｕｒａの存在に関して補償を実行する。このために、マンガン付加により確定される蛍光量（細胞外Ｆｕｒａ）を先ず測定点の蛍光値から差し引く。次に、この量を差し引くことによりＦmaxを修正する。最後に、Fminに関する修正値を確定する。このために、マンガン付加により確定される蛍光量を２．２４で割る。２．２４という値は、励起波長３４０ｎｍ（非エステル化、Ｆｕｒａ無含有で測定）でのカルシウム飽和及びカルシウム無含有Ｆｕｒａの蛍光の間の固有の計器比例因子として確定された。この方法で得られた修正値をFminから差し引いた）。検査したペプチドは、ＣａＣｌ₂及びグルコースを含有しないＫＲＢＨ中の１０００倍濃縮溶液（１０^-5Ｍ）として付加された。エキセンジン類似体の活性その生物学的活性に関して、前記のようなＩＮＳ−１細胞におけるカルシウム検定で、いくつかのエキセンジン類似体を試験した。データは、一例として図ｌ並びに表７に示す。内分泌膵臓のＢ細胞（クローンＢ細胞株ＩＮＳ−１）におけるＧＬＰ−１−（７−３６）−ＮＨ₂との競合ＩＮＳ−１−細胞の培養（Asfari，M.，1992）カルシウム濃度の測定参照。競合実験剥離細胞を取り出し、クレブスーリンガー緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ、１２０ｍＭＮａＣｌ、１．２ｍＭＭｇＳＯ₄、５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＮａ −ＥＤＴＡ、１５ｍＭＣＨ₃ＣＯＯＮａ、ｐＨ７．４に調整し、１％ＨＳＡ及び０．１％バシトラシンを補充）中に懸濁した。反応混合物様にこの懸濁液から各時点で２５０ｍｌを取り出して、２０ｍｌのトレーサー（¹²⁵Ｉ−ＧＬＰ−１ −（７−３６）−ＮＨ₂、２０，０００ｃｐｍ）及び３０ｍｌの検査すべきペプチドと対応する希釈液中で混ぜ合わせた。その後、３７℃で３０分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、緩衝液で３回洗浄して、ペレットと結合した放射能を測定した（γ−計数器）。試験すべきペプチドの１０種類の異なる希釈液（クレブスーリンガー緩衝液中１０^-10〜１０^-6Ｍ）と一緒にインキュベートすることにより、競合曲線を観察した。エキセンジン類似体の受容体親和性データを一例として表８に示す。ＧＬＰ−１−（７−３６）−ＮＨ₂は標準として役立った。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年４月２１日（１９９８．４．２１）【補正内容】請求の範囲１．配列１または２配列識別NO：１配列識別NO：２（式中、Ｘはグリシン以外の表１からの20のプロテイノジェニック１つまたは非プロテイノジェニックのアミノ酸であり、位置１，２，28，29または30におけるアミノ酸は、所望の鎖長に依存して、前記配列の一部分であることができ、そしてＮ−末端はNR₁R₂により表され、ここでＲ₁は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、Ｒ₂は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₄−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、そしてＣ−末端はCOR₃により表され、Ｒ₃はOR₄またはNR₄R₅であり、ここでＲ₄は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルであり、Ｒ₅は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルである）を有するペプチド、ならびにその生理学的に許容される塩およびエステル。２．アミノ酸鎖の下記の修飾（ａ）〜（ｏ）の少なくとも１つであるが、最大 10により請求項１に記載のペプチドを得ることができるペプチド：（ａ）位置１におけるα−アミノ酸は、Ｄ−His，Ala，Ｄ−Ala，Gly，LysまたはＤ−Lysであり、それらのうちのAla，GlyまたはLysは特に好ましい；（ｂ）位置２におけるα−アミノ酸は、Ser，Ｄ−Ser，Thr，Ｄ−Thr，Ala，Ｄ −Ala，Ile，Ｄ−Ile，Val，Ｄ−Val，LeuまたはＤ−Leu、好ましくはThr，Ala ，Val，IleまたはLeuである；（ｃ）位置３におけるアミノ酸は、Ｄ−Glu，Ｄ−Asp，AlaまたはＤ−Ala、好ましくはAlaである；（ｄ）位置４におけるアミノ酸は、Ala，Ｄ−Alaまたはβ−Ala、好ましくはAla である；（ｅ）位置５におけるα−アミノ酸は、Ser，TyrまたはAlaである；（ｆ）位置６におけるα−アミノ酸は、Ala，Ile，Val，Leu，ChaまたはTyr、好ましくはAla，Ile，Val，LeuまたはTyrである；（ｇ）位置７におけるα−アミノ酸は、Ala，Ｄ−Ala，Tyr，Ｄ−Tyr，Ser，Ｄ −SerまたはＤ−Tyr、好ましくはAla，TyrまたはSerである；（ｈ）位置８におけるα−アミノ酸は、Ala，TyrまたはThrである；（ｉ）位置９におけるα−アミノ酸は、Ala，Ｄ−Ala，Glu，Ｄ−GluまたはＤ− Asp、好ましくはAlaまたはGluである；（ｊ）位置10，11，12，15，16，17，18，19，20，21，24，28，29におけるアミノ酸は、互いに独立して、配列識別NO：１または配列識別NO：２中のそれぞれの位置に既に存在するアミノ酸と異なる、表１の20のプロテイノジェニックのアミノ酸の１つであるか、あるいは非プロテイノジェニックのＤ−またはＬ−アミノ酸であり、好ましくはプロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；（ｋ）位置13におけるα−アミノ酸は、Glnと異なる中性のＬ−アミノ酸、好ましくは表１の中性のプロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；（ｌ）位置14におけるα−アミノ酸は、MeｔまたはＬ−ロイシン以外の中性のＤ −またはＬ−アミノ酸、好ましくはNle，Ｄ−Nle，Ala，Ｄ−Ala，Ile，Ｄ−Ile ，ValまたはＤ−Valにより置換されており、それらのうちのIle，ValまたはAla は特に好ましい；（ｍ）位置22におけるα−アミノ酸は、Ｄ−Phe，Tyr，Ｄ−Tyr，Leu，Ｄ−Leu ，Val，Ｄ−Val，Ｌ−Cha，Ｄ−Cha，β−１−Nal，β−２−Nalまたはβ−１− Ｄ−Nalであり、ここでTyr，LeuまたはValは好ましい；（ｎ）位置23におけるα−アミノ酸は、Leu，Ｄ−Leu，Ｄ−Ile，Val，Ｄ−Val ，Ｌ−Cha，Ｄ−Cha，Tyr，Ｄ−Tyr，PheまたはＤ−Pheであり、ここでLeu，Val ，TyrまたはPheは好ましい；および（ｏ）位置25，26または27におけるα−アミノ酸は、位置25についてTrp 、位置26についてLeuおよび位置27についてLys以外の、中性のＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくは表１の中性の、プロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である。３．位置30におけるα−アミノ酸が、Arg，Ｄ−Arg，TyrまたはＤ−Tyr、特に好ましくはArgまたはTyrである、請求項１または２に記載のペプチド。４．表１のプロテイノジェニックのアミノ酸のみを含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。５．アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置２において起こっている、請求項２〜４のいずれか一項に記載のペプチド。６．アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置14において起こっている、請求項２〜５のいずれか一項に記載のペプチド。７．アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置３において起こっている、請求項２〜６のいずれか一項に記載のペプチド。８．Ｎ−末端がNR₁R₂により表され、ここでＲ₁は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、Ｒ₂は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₄−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、そしてＣ−末端はCOR₃により表され、Ｒ₃はOR₄またはNR₄R₅であり、ここでＲ₄は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルであり、Ｒ₅は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルである、配列５，68，69，71，78〜82または84〜91の１つを有するプペチド、ならびにその生理学的に許容される塩およびエステル。９．インスリンの放出を刺激する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。 10．慣用の担体および補助物質に加えて、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１つを含有する製剤。 11．糖尿病の治療のための医薬組成物を製造するための請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドの使用。【手続補正書】【提出日】平成１２年７月５日（２０００．７．５）【補正内容】請求の範囲１．配列番号１または２配列番号：１配列番号：２（式中、Ｘは下記の表：からの、グリシン以外の20のプロテイノジェニックアミノ酸の１つまたは非プロテイノジェニックのアミノ酸の１つであり、位置１，２，28，29または30におけるアミノ酸は、所望の鎖長に依存して、前記配列の一部分であることができ、そしてＮ−末端はNR₁R₂により表され、ここでＲ₁は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−C₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、Ｒ₂は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₄−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、そしてＣ−末端はCOR₃により表され、Ｒ₃はOR₄またはNR₄R₅であり、ここでＲ₄は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルであり、Ｒ₅は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルである）を有するペプチド、ならびにその生理学的に許容される塩およびエステル。２．アミノ酸鎖の下記の修飾（ａ）〜（ｏ）の１〜10個により請求項１に記載のペプチドから得ることができるペプチド：（ａ）位置１におけるα−アミノ酸が、Ｄ−His，Ala，Ｄ−Ala，Gly，LysまたはＤ−Lysであり、好ましくはAla，GlyまたはLysである；（ｂ）位置２におけるα−アミノ酸が、Ser，Ｄ−Ser，Thr，Ｄ−Thr，Ala，Ｄ−Ala，Ile，Ｄ−Ile，Val，Ｄ−Val，LeuまたはＤ−Leuであり、好ましくはT hr，Ala，Val，IleまたはLeuである；（ｃ）位置３におけるα−アミノ酸が、Ｄ−Glu，Ｄ−Asp，AlaまたはＤ−Ala であり、好ましくはAlaである；（ｄ）位置４におけるアミノ酸が、Ala，Ｄ−Alaまたはβ−Alaであり、好ましくはAlaである；（ｅ）位置５におけるα−アミノ酸が、Ser，TyrまたはAlaである；（ｆ）位置６におけるα−アミノ酸が、Ala，Ile，Val，Leu，ChaまたはTyrであり、好ましくはAla，Ile，Val，LeuまたはTyrである；（ｇ）位置７におけるα−アミノ酸が、Ala，Ｄ−Ala，Tyr，Ｄ−Tyr，Ser，Ｄ−SerまたはＤ−Tyrであり、好ましくはAla，TyrまたはSerである；（ｈ）位置８におけるα−アミノ酸が、Ala，TyrまたはThrである；（ｉ）位置９におけるα−アミノ酸が、Ala，Ｄ−Ala，Glu，Ｄ−GluまたはＤ −Aspであり、好ましくはAlaまたはGluである；（ｊ）位置10，11，12，15，16，17，18，19，20，21，24，28，29におけるアミノ酸は、互いに独立して、配列番号：１または配列番号：２中のそれぞれの位置に既に存在するアミノ酸と異なる、前記表中の20のプロテイノジェニックのアミノ酸の１つであるか、あるいは非プロテイノジェニックのＤ−またはＬ−アミノ酸であり、好ましくはプロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；（ｋ）位置13におけるα−アミノ酸が、Glnと異なる中性のＬ−アミノ酸であり、好ましくは前記表中の中性のプロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；（ｌ）位置14におけるα−アミノ酸が、MetまたはＬ−ロイシン以外の中性のＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくはNle，Ｄ−Nle，Ala，Ｄ−Ala，Ile，Ｄ−I le，ValまたはＤ−Valにより置換されており、それらのうちのIle，ValまたはAl aが特に好ましい；（ｍ）位置22におけるα−アミノ酸が、Ｄ−Phe，Tyr，Ｄ−Tyr，Leu，Ｄ−Le u，Val，Ｄ−Val，Ｌ−Cha，Ｄ−Cha，β−１−Nal，β−２−Nalまたはβ−１ −Ｄ−Nalであり、ここでTyr，LeuまたはValが好ましい；（ｎ）位置23におけるα−アミノ酸が、Leu，Ｄ−Leu，Ｄ−Ile，Val，Ｄ−Va l，Ｌ−Cha，Ｄ−Cha，Tyr，Ｄ−Tyr，PheまたはＤ−Pheであり、ここでLeu，Va l，TyrまたはPheが好ましい；および（ｏ）位置25，26または27におけるα−アミノ酸が、位置25についてTrp、位置26についてLeuおよび位置27についてLys以外の、中性のＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくは前記表中の中性の、プロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である。３．位置30におけるα−アミノ酸が、Arg，Ｄ−Arg，TyrまたはＤ−Tyr、特に好ましくはArgまたはTyrである、請求項１または２に記載のペプチド。４．前記表中のプロテイノジェニックのアミノ酸のみを含有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。５．アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置２において起こっている、請求項２〜４のいずれか一項に記載のペプチド。６．アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置14において起こっている、請求項２〜５のいずれか一項に記載のペプチド。７．アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置３において起こっている、請求項２〜６のいずれか一項に記載のペプチド。８．Ｎ−末端がNR₁R₂により表され、ここでＲ₁は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、Ｒ₂は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Bo c，Alloc，Ｃ₄−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、そしてＣ−末端はCOR₃により表され、Ｒ₃はOR₄またはNR₄R₅であり、ここでＲ₄は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルであり、Ｒ₅は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルである、配列５，68，69，71，78〜82または84〜91の１つを有するペプチド、ならびにその生理学的に許容される塩およびエステル。９．インスリンの放出を刺激する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。 10．慣用の担体および補助物質に加えて、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１つを含有する製剤。 11．糖尿病の治療のための医薬組成物を製造するための請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ゲーク，ブルクハルト―ヨハネスドイツ連邦共和国，デー―35637 マールブルク，マリボレルシュトラーセ 22

Claims

【特許請求の範囲】１．配列１または２配列識別NO：１配列識別NO：２（式中、Ｘはグリシン以外のプロテイノジェニックまたは非プロテイノジェニックのアミノ酸であり、位置１，２，28，29または30におけるアミノ酸は、互いに独立して、個々にまたは一緒になって前記配列の一部分であることができ、そしてＮ−末端はNR₁R₂により表され、ここでＲ₁は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、Ｒ₂は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₄−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、そしてＣ−末端はCOR₃により表され、Ｒ₃はOR₄またはNR₄R₅であり、ここでＲ₄は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルであり、Ｒ₅は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルである）を有するペプチド、ならびにその生理学的に許容される塩およびエステル。２．下記の修飾の少なくとも１つであるが、最大11がアミノ酸鎖について実施されている、請求項１に記載のペプチド：（ａ）位置１におけるα−アミノ酸は、Ｄ−His，Ala，Ｄ−Ala，Gly，LysまたはＤ−Lysであり、それらのうちのAla，GlyまたはLysは特に好ましい；あるいは（ｂ）位置２におけるα−アミノ酸は、Ser，Ｄ−Ser，Thr，Ｄ−Thr，Gly，Ala ，Ｄ−Ala，Ile，Ｄ−Ile，Val，Ｄ−Val，LeuまたはＤ−Leu、好ましくはSer， Thr，Gly，Ala，Val，IleまたはLeuである；あるいは（ｃ）位置３におけるアミノ酸は、Glu，Ｄ−Glu，Asp，Ｄ−Asp，AlaまたはＤ −Ala、好ましくはGlu，AspまたはAlaである；あるいは（ｄ）位置４におけるアミノ酸は、Ala，Ｄ−Alaまたはβ−Ala、好ましくはAla である；あるいは（ｅ）位置５におけるα−アミノ酸は、Ser，TyrまたはAlaである；あるいは（ｆ）位置６におけるα−アミノ酸は、Ala，Ile，Val，Leu，ChaまたはTyr、好ましくはAla，Ile，Val，LeuまたはTyrである；あるいは（ｇ）位置７におけるα−アミノ酸は、Ala，Ｄ−Ala，Tyr，Ｄ−Tyr，Ser，Ｄ −SerまたはＤ−Tyr、好ましくはAla，TyrまたはSerである；あるいは（ｈ）位置８におけるα−アミノ酸は、Ala，TyrまたはThrである；あるいは（ｉ）位置９におけるα−アミノ酸は、Ala，Ｄ−Ala，Glu，Ｄ−GluまたはＤ− Asp、好ましくはAlaまたはGluである；あるいは（ｊ）位置10，11，12，15，16，17，18，19，20，21，24，28，29におけるアミノ酸は、互いに独立して、プロテイノジェニックまたは非プロテイノジェニックのＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくはプロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；あるいは（ｋ）位置13におけるα−アミノ酸は、中性のＬ−アミノ酸、好ましくは中性のプロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；あるいは（１）位置14におけるα−アミノ酸は、Ｌ−ロイシン以外の中性のＤ−またはＬ −アミノ酸、好ましくはNle，Ｄ−Nle，Ala，Ｄ−Ala，Ile，Ｄ−Ile，ValまたはＤ−Valにより置換されており、それらのうちのIle，ValまたはAlaは特に好ましい；あるいは（ｍ）位置22におけるα−アミノ酸は、Ｄ−Phe，Tyr，Ｄ−Tyr，Ｌeu，Ｄ−Leu ，Val，Ｄ−Val，Ｌ−Cha，Ｄ−Cha，β−１−Nal，β−２−Nalまたはβ−１− Ｄ−Nalであり、それらのうちのTyr，LeuまたはValは好ましい；あるいは（ｎ）位置23におけるα−アミノ酸は、Leu，Ｄ−Leu，Ｄ−Ile，Val，Ｄ−Val ，Ｌ−Cha，Ｄ−Cha，Tyr，Ｄ−Tyr，PheまたはＤ−Pheであり、それらのうちの Leu，Val，TyrまたはPheは好ましい；あるいは（ｏ）位置25，26または27におけるα−アミノ酸は、中性のＤ−またはＬ−アミノ酸、好ましくは中性の、プロテイノジェニックのＬ−アミノ酸である；あるいは（ｐ）位置30におけるα−アミノ酸は、グリシン以外のプロテイノジェニックまたは非プロテイノジェニックのＤ−またはＬ−アミノ酸であり、好ましくはArg ，Ｄ−Arg，TyrまたはＤ−Tyr，ArgまたはTyrは特に好ましい。３．プロテイノジェニックのアミノ酸のみを含有する、請求項１または２に記載のペプチド。４．アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置２において起こっている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。５．アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置14において起こっている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。６．アミノ酸の置換が配列１または２に比較して位置３において起こっている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。７．Ｎ−末端がNR₁R₂により表され、ここでＲ₁は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₁−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、Ｒ₂は水素、アセチル、トリフルオロアセチル、アダマンチル、Fmoc，Ｚ，Boc ，Alloc，Ｃ₄−Ｃ₆アルキル、Ｃ₂−Ｃ₈アルケニルまたはＣ₇−Ｃ₉アラルキルであり、そしてＣ−末端はCOR₃により表され、Ｒ₃はOR₄またはNR₄R₅であり、ここでＲ₄は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルであり、Ｒ₅は水素またはＣ₁−Ｃ₆アルキルである、配列５，68，69，71，78〜82または84〜91の１つを有するペプチド、ならびにその生理学的に許容される塩およびエステル。９．インスリンの放出を刺激する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチド。 10．慣用の担体および補助物質に加えて、請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１つを含有する製剤。 11．糖尿病の治療のための医薬組成物を製造するための請求項１〜８のいずれか一項に記載のペプチドの使用。