JP2009520469A - アルブミンと治療薬との前もって形成された抱合体の産生のための方法 - Google Patents
アルブミンと治療薬との前もって形成された抱合体の産生のための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009520469A JP2009520469A JP2008546063A JP2008546063A JP2009520469A JP 2009520469 A JP2009520469 A JP 2009520469A JP 2008546063 A JP2008546063 A JP 2008546063A JP 2008546063 A JP2008546063 A JP 2008546063A JP 2009520469 A JP2009520469 A JP 2009520469A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- albumin
- recombinant
- compound
- conjugate
- recombinant albumin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 title claims abstract description 590
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 title claims abstract description 590
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 183
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000003814 drug Substances 0.000 title description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 135
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims abstract description 57
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 54
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000012619 Butyl Sepharose® Substances 0.000 claims abstract description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 141
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 71
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 62
- 108010004546 mercaptoalbumin Proteins 0.000 claims description 61
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 57
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 56
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 54
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 54
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 53
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 51
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 claims description 50
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 49
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 49
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 claims description 41
- JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N chembl1210015 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N[C@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO[C@]3(O[C@@H](C[C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C3)C(O)=O)O2)O)[C@@H](CO)O1)NC(C)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 JUFFVKRROAPVBI-PVOYSMBESA-N 0.000 claims description 41
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 claims description 38
- 108010011459 Exenatide Proteins 0.000 claims description 37
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 claims description 37
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 claims description 35
- 229960001519 exenatide Drugs 0.000 claims description 34
- LMHMJYMCGJNXRS-IOPUOMRJSA-N exendin-3 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@H](C)O)[C@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 LMHMJYMCGJNXRS-IOPUOMRJSA-N 0.000 claims description 33
- 108010015174 exendin 3 Proteins 0.000 claims description 30
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 25
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 25
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 22
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 21
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 21
- -1 succinimidyl Chemical group 0.000 claims description 20
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 18
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 16
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 16
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 16
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 16
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 claims description 14
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 12
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 12
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 11
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 9
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 9
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 claims description 8
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 6
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 claims description 4
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 claims description 4
- 102400000667 Brain natriuretic peptide 32 Human genes 0.000 claims description 4
- 101800000407 Brain natriuretic peptide 32 Proteins 0.000 claims description 4
- 101800002247 Brain natriuretic peptide 45 Proteins 0.000 claims description 4
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 4
- HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N nesiritide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CO)C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 HPNRHPKXQZSDFX-OAQDCNSJSA-N 0.000 claims description 4
- QGOKIEUFWNCGFO-UHFFFAOYSA-N propanoic acid;pyrrole-2,5-dione Chemical group CCC(O)=O.O=C1NC(=O)C=C1 QGOKIEUFWNCGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000680806 Blastobotrys adeninivorans Species 0.000 claims description 3
- YNXLOPYTAAFMTN-SBUIBGKBSA-N C([C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 YNXLOPYTAAFMTN-SBUIBGKBSA-N 0.000 claims description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 claims description 3
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 claims description 3
- 108010088847 Peptide YY Proteins 0.000 claims description 3
- 102100029909 Peptide YY Human genes 0.000 claims description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 4
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 claims 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 86
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 abstract description 77
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 99
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 62
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 55
- 102100040918 Pro-glucagon Human genes 0.000 description 36
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 32
- 108010004903 glycosylated serum albumin Proteins 0.000 description 32
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 230000002473 insulinotropic effect Effects 0.000 description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 18
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 16
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 16
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 15
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 15
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 15
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 13
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 13
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 12
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 12
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 12
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 11
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 11
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 11
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 11
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 10
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 10
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 8
- 230000006325 deglycation Effects 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 229960005480 sodium caprylate Drugs 0.000 description 8
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 101800004295 Glucagon-like peptide 1(7-36) Proteins 0.000 description 7
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 7
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 7
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 7
- NGJOFQZEYQGZMB-KTKZVXAJSA-N (4S)-5-[[2-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[2-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S,3S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[2-[[(1S)-4-carbamimidamido-1-carboxybutyl]amino]-2-oxoethyl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-carboxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-3-carboxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-2-oxoethyl]amino]-4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 NGJOFQZEYQGZMB-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 6
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 6
- 108091005996 glycated proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101800004266 Glucagon-like peptide 1(7-37) Proteins 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 5
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 230000003578 releasing effect Effects 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- YZGQDNOIGFBYKF-UHFFFAOYSA-N Ethoxyacetic acid Chemical compound CCOCC(O)=O YZGQDNOIGFBYKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 4
- 108010058003 Proglucagon Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- ILOJFJBXXANEQW-UHFFFAOYSA-N aminooxy(phenyl)borinic acid Chemical compound NOB(O)C1=CC=CC=C1 ILOJFJBXXANEQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 4
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 125000000250 methylamino group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 4
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical group 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 4
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HXMVNCMPQGPRLN-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyputrescine Chemical compound NCCC(O)CN HXMVNCMPQGPRLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 3
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 3
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000051325 Glucagon Human genes 0.000 description 3
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 3
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000930455 Ovis aries Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000035554 Proglucagon Human genes 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LGEQQWMQCRIYKG-DOFZRALJSA-N anandamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCO LGEQQWMQCRIYKG-DOFZRALJSA-N 0.000 description 3
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N boronic acid Chemical compound OBO ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 3
- 150000001944 cysteine derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000013022 formulation composition Substances 0.000 description 3
- UKVFVQPAANCXIL-FJVFSOETSA-N glp-1 (1-37) amide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 UKVFVQPAANCXIL-FJVFSOETSA-N 0.000 description 3
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000003914 insulin secretion Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 3
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QZGLLONPRSPJNS-UHFFFAOYSA-N 1-(3-benzoyl-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C1C(=O)NC(=O)C1(N1C(C=CC1=O)=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 QZGLLONPRSPJNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- GNRLUBOJIGSVNT-UHFFFAOYSA-N Aminoethoxyacetic acid Chemical compound NCCOCC(O)=O GNRLUBOJIGSVNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N D-arginine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 101000693911 Equus caballus Albumin Proteins 0.000 description 2
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 108010088406 Glucagon-Like Peptides Proteins 0.000 description 2
- 101800000221 Glucagon-like peptide 2 Proteins 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 101000825742 Homo sapiens Somatoliberin Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010090665 Mannosyl-Glycoprotein Endo-beta-N-Acetylglucosaminidase Proteins 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XRICQUGWKQNRNJ-UHFFFAOYSA-N [2-(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)acetyl]sulfanyl acetate Chemical compound CC(=O)OSC(=O)CN1C(=O)CCC1=O XRICQUGWKQNRNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 2
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N cysteic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CS(O)(=O)=O XVOYSCVBGLVSOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- IXZISFNWUWKBOM-ARQDHWQXSA-N fructosamine Chemical compound NC[C@@]1(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O IXZISFNWUWKBOM-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N glucagon-like peptide 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 TWSALRJGPBVBQU-PKQQPRCHSA-N 0.000 description 2
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Chemical group OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000001421 hyperglycemia Diseases 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229940021182 non-steroidal anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 2
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 2
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical group OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)butanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCN1C(=O)C=CC1=O PVGATNRYUYNBHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDFAOVXKHJXLEI-GSVOUGTGSA-N (2r)-2-(methylamino)propanoic acid Chemical compound CN[C@H](C)C(O)=O GDFAOVXKHJXLEI-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(tert-butylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(C)(C)C MRTPISKDZDHEQI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N (2s)-2-amino-3,3-dimethylbutanoic acid Chemical compound CC(C)(C)[C@H](N)C(O)=O NPDBDJFLKKQMCM-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- WTKQMHWYSBWUBE-UHFFFAOYSA-N (3-nitropyridin-2-yl) thiohypochlorite Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CN=C1SCl WTKQMHWYSBWUBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DDYAPMZTJAYBOF-ZMYDTDHYSA-N (3S)-4-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-5-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3R)-1-[[(2S)-6-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S)-4-amino-1-[[(2S,3S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-3-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-5-carbamimidamido-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxohexan-2-yl]amino]-3-hydroxy-1-oxobutan-2-yl]amino]-1,4-dioxobutan-2-yl]amino]-4-methylsulfanyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-1,5-dioxopentan-2-yl]amino]-3-methyl-1-oxobutan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-3-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]hexanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical class [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O DDYAPMZTJAYBOF-ZMYDTDHYSA-N 0.000 description 1
- ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N (n-propan-2-yloxycarbonylanilino) acetate Chemical compound CC(C)OC(=O)N(OC(C)=O)C1=CC=CC=C1 ODIGIKRIUKFKHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWQORQURWIFIRD-UHFFFAOYSA-N 1-(4-benzoylphenyl)pyrrolidine-2,5-dione Chemical compound C=1C=C(N2C(CCC2=O)=O)C=CC=1C(=O)C1=CC=CC=C1 QWQORQURWIFIRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDNSLPICAWKNAG-UHFFFAOYSA-N 2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(C)N1C(=O)C=CC1=O MDNSLPICAWKNAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CQWXKASOCUAEOW-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(carboxymethoxy)ethoxy]acetic acid Chemical compound OC(=O)COCCOCC(O)=O CQWXKASOCUAEOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QLILRKBRWXALIE-UHFFFAOYSA-N 3-nitropyridine Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CN=C1 QLILRKBRWXALIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- YELWNIMQOUETBV-UHFFFAOYSA-N 4-azido-2-hydroxy-n-[2-(pyridin-2-yldisulfanyl)ethyl]benzamide Chemical compound OC1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C(=O)NCCSSC1=CC=CC=N1 YELWNIMQOUETBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101000825768 Bos taurus Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100335894 Caenorhabditis elegans gly-8 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N D-alanine Chemical compound C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 229930028154 D-arginine Natural products 0.000 description 1
- 125000002038 D-arginyl group Chemical group N[C@@H](C(=O)*)CCCNC(=N)N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100297529 Drosophila melanogaster pho gene Proteins 0.000 description 1
- 108010065372 Dynorphins Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N Exenatide Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 HTQBXNHDCUEHJF-XWLPCZSASA-N 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102000015611 Hypothalamic Hormones Human genes 0.000 description 1
- 108010024118 Hypothalamic Hormones Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 229940122199 Insulin secretagogue Drugs 0.000 description 1
- 238000007696 Kjeldahl method Methods 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ULEBESPCVWBNIF-BYPYZUCNSA-N L-arginine amide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N ULEBESPCVWBNIF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000003231 Lowry assay Methods 0.000 description 1
- 238000009013 Lowry's assay Methods 0.000 description 1
- IGRMTQMIDNDFAA-UWVGGRQHSA-N Lys-His Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 IGRMTQMIDNDFAA-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N Lys-Tyr Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 MYTOTTSMVMWVJN-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N Naproxen Natural products C1=C(C(C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001621 Natriuretic Peptide Proteins 0.000 description 1
- 102000004571 Natriuretic peptide Human genes 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 102100024622 Proenkephalin-B Human genes 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000825738 Rattus norvegicus Somatoliberin Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000018673 SEC Translocation Channels Human genes 0.000 description 1
- 108010091732 SEC Translocation Channels Proteins 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 108091003202 SecA Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101000895926 Streptomyces plicatus Endo-beta-N-acetylglucosaminidase H Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010059705 Urocortins Proteins 0.000 description 1
- 102000005630 Urocortins Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 1
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 1
- 125000000088 alpha-mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 235000020244 animal milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004198 anterior pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003579 anti-obesity Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229910001423 beryllium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000012219 cassette mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000012461 cellulose resin Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- KFGRVLINLVVMJA-MITYVQBRSA-N chembl440262 Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 KFGRVLINLVVMJA-MITYVQBRSA-N 0.000 description 1
- 239000007806 chemical reaction intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002009 diols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000006274 endogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000006277 exogenous ligand Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000003163 gonadal steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000004007 growth hormone secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000003345 hyperglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000601 hypothalamic hormone Substances 0.000 description 1
- 229940043650 hypothalamic hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 108010056929 lyticase Proteins 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N naproxen Chemical compound C1=C([C@H](C)C(O)=O)C=CC2=CC(OC)=CC=C21 CMWTZPSULFXXJA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960002009 naproxen Drugs 0.000 description 1
- 239000000692 natriuretic peptide Substances 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- ODUCDPQEXGNKDN-UHFFFAOYSA-N nitroxyl Chemical group O=N ODUCDPQEXGNKDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000005474 octanoate group Chemical group 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920002523 polyethylene Glycol 1000 Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000000541 pulsatile effect Effects 0.000 description 1
- FFISLTWEISOMFC-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-yl propanedithioate Chemical compound CCC(=S)SC1=CC=CC=N1 FFISLTWEISOMFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000007958 sleep Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 108010056001 somatotropin releasing hormone (1-29) Proteins 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N thioacetamide Natural products CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZFEAMMNVDPDEGE-LGRGJMMZSA-N tifuvirtide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(C)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZFEAMMNVDPDEGE-LGRGJMMZSA-N 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000000777 urocortin Substances 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N vinorelbine Chemical compound C1N(CC=2C3=CC=CC=C3NC=22)CC(CC)=C[C@H]1C[C@]2(C(=O)OC)C1=CC([C@]23[C@H]([C@]([C@H](OC(C)=O)[C@]4(CC)C=CCN([C@H]34)CC2)(O)C(=O)OC)N2C)=C2C=C1OC GBABOYUKABKIAF-GHYRFKGUSA-N 0.000 description 1
- 229960002066 vinorelbine Drugs 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000004271 weak anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57545—Neuropeptide Y
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/57563—Vasoactive intestinal peptide [VIP]; Related peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/605—Glucagons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
- C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本発明は、前もって形成されたアルブミン抱合体の製造のための方法を提供する。特に、本発明は、組換えアルブミンに対する治療的化合物のインビトロでの抱合のための方法であって、反応基を含む治療的化合物を溶液中で組換えアルブミンに接触させて抱合体を形成する、前記方法を提供する。本方法は、均質性を増加してアルブミン種に対する抱合を提供する。生じる抱合体は、クロマトグラフィー、特にフェニルセファロース及びブチルセファロースクロマトグラフィーを含む疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製される。
【選択図】 図18
【選択図】 図18
Description
本出願は、2005年12月22日に出願された米国仮出願第60/753,680号の優先権の利益を主張する。この内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。
(1. 技術分野)
本発明は、前もって形成されたアルブミン抱合体の産生のための方法を提供する。特に、本発明は、組換えアルブミンに対する治療的化合物のインビトロでの抱合のための方法であって、反応基を含む治療的化合物を溶液中で組換えアルブミンに接触させて抱合体を形成する、前記方法を提供する。
(1. 技術分野)
本発明は、前もって形成されたアルブミン抱合体の産生のための方法を提供する。特に、本発明は、組換えアルブミンに対する治療的化合物のインビトロでの抱合のための方法であって、反応基を含む治療的化合物を溶液中で組換えアルブミンに接触させて抱合体を形成する、前記方法を提供する。
(2. 発明の背景)
治療的分子は、ヒトに使用されるためには、厳密な基準を満たさなければならない。安全かつ有効であることに加えて、これらは、人体において十分な時間有効であるために、十分な量で利用できなければならない。残念なことに、多くの提唱された治療的分子は、人体から、除去され、若しくは分解されるかのいずれか、又は両方により、治療のためのこれらの有効性が制限されている。多くの提唱されたペプチド治療薬は、このような薬物動態の欠陥が欠点となる。
治療的分子は、ヒトに使用されるためには、厳密な基準を満たさなければならない。安全かつ有効であることに加えて、これらは、人体において十分な時間有効であるために、十分な量で利用できなければならない。残念なことに、多くの提唱された治療的分子は、人体から、除去され、若しくは分解されるかのいずれか、又は両方により、治療のためのこれらの有効性が制限されている。多くの提唱されたペプチド治療薬は、このような薬物動態の欠陥が欠点となる。
いくつかの提唱された治療薬の薬物動態においては、これらをアルブミンなどのキャリア分子に共有結合で連結することによって、ブレークスルーが達成された。実際に、いくつかのアルブミン抱合体が、ヒトにおける臨床試験中である。
従って、このようなアルブミン抱合体の産生及び精製のための効率的かつ有効な方法が必要とされる。
従って、このようなアルブミン抱合体の産生及び精製のための効率的かつ有効な方法が必要とされる。
(3. 発明の要旨)
本発明は、前もって形成されたアルブミンの抱合体の製造のための方法を提供する。特定の態様において、本発明は、宿主細胞におけるアルブミンを産生するための方法であって、反応基とアルブミンのシステイン34との間で共有結合を形成することができる条件下で、アルブミンを治療基と反応基とを含む化合物と接触させること、及びこれにより形成された生じる抱合体を精製することを含む、前記方法を提供する。
本発明は、前もって形成されたアルブミンの抱合体の製造のための方法を提供する。特定の態様において、本発明は、宿主細胞におけるアルブミンを産生するための方法であって、反応基とアルブミンのシステイン34との間で共有結合を形成することができる条件下で、アルブミンを治療基と反応基とを含む化合物と接触させること、及びこれにより形成された生じる抱合体を精製することを含む、前記方法を提供する。
一つの態様において、本発明は、前もって形成されたアルブミンの抱合体の製造のための方法であって、宿主細胞においてアルブミンを産生する工程;アルブミン産物を部分的に精製して、宿主タンパク質、抗原、内毒素などを減少させる工程;アルブミンのシステイン34と化合物の反応基との間に抱合を促進する条件下でアルブミンを化合物と接触させる工程;及び生じる抱合体を1つ以上の疎水性相互作用クロマトグラフィー工程、任意に続いて限外濾過及び製剤によって精製する工程を含む、前記方法を提供する。
従って、本発明の一つの実施態様は、前もって形成されたアルブミンの抱合体を製造するための方法であって:
(a)宿主細胞において組換えアルブミンを産生する工程;
(b)宿主細胞から組換えアルブミンを精製する工程;
(c)反応基が組換えアルブミンのCys34チオールを共有結合で結合して抱合体を形成することができる反応条件下で、精製した組換えアルブミンを化合物と接触させる工程であって、前記化合物は、反応基を含む前記工程;及び、
(d)疎水性相互作用クロマトグラフィー、任意に続いて限外濾過及び製剤によって抱合体を精製する工程、
を含む、前記方法を提供する。
(a)宿主細胞において組換えアルブミンを産生する工程;
(b)宿主細胞から組換えアルブミンを精製する工程;
(c)反応基が組換えアルブミンのCys34チオールを共有結合で結合して抱合体を形成することができる反応条件下で、精製した組換えアルブミンを化合物と接触させる工程であって、前記化合物は、反応基を含む前記工程;及び、
(d)疎水性相互作用クロマトグラフィー、任意に続いて限外濾過及び製剤によって抱合体を精製する工程、
を含む、前記方法を提供する。
特定の実施態様において、本方法は、工程(c)の抱合反応の前に、メルカプトアルブミン、すなわち遊離及び反応性のシステイン34で構成されるアルブミンの濃縮を更に含む。任意の特定の作用理論によって拘束されることは意図しないが、システイン、グルタチオン、金属イオン又はその他の付加物によるアルブミンのシステイン34チオールの酸化又は「キャッピング」により、化合物の反応基に対する抱合の特異性を減少させることができると考えられる。従って、メルカプトアルブミンは、キャップされたアルブミン-Cys34をアルブミン-Cys34-SHに変換することができることが当該技術分野において公知の薬剤と接触させることにより、還元型及び酸化型アルブミンの不均一なプールから濃縮することができる。特定の実施態様において、メルカプトアルブミンは、アルブミンをチオグリコール酸(FGA)と接触させることによって濃縮することができる。特定の実施態様において、メルカプトアルブミンは、アルブミンをジチオスレイトール(DTT)と接触させることによって濃縮することができる。一部の実施態様において、メルカプトアルブミンは、フェニル若しくはブチルセファロース又はこれらの組み合わせを使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーにアルブミンを供することによって濃縮される。その他の実施態様において、メルカプトアルブミンは、TGA又はDTTとアルブミンを接触させること、続いてフェニル若しくはブチルセファロース樹脂又は両方を使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製することによって濃縮される。
特定の実施態様において、本方法は、工程(c)の抱合反応の前に、糖化されたアルブミンの減少を更に含む。アルブミンの非酵素的に糖化された形態の減少は、糖化されたアルブミンを減少させるための当業者に公知の任意の技術によって実施してもよい。一部の実施態様において、非酵素的に糖化されたアルブミンは、例えばアミノフェニルホウ酸アガロース樹脂若しくはコンカナバリンAセファロース又はこれらの組み合わせを使用して、アフィニティークロマトグラフィーに溶液を供することによって、アルブミン溶液から減少させてもよい。
本発明の第二の実施態様は、前もって形成されたアルブミンの抱合体の製造のための方法であって、組換えアルブミンが、培養液からの組換えアルブミンの精製を邪魔することなく、液体培地中で宿主細胞によって産生された組換えアルブミンを化合物と接触させて抱合体を形成することによって製造される、前記方法を提供する。従って、本発明の実施態様は、前もって形成されたアルブミンの抱合体を製造するための方法であって、該方法は:
(a)宿主細胞において組換えアルブミンを産生する工程であって、宿主細胞が液体培地中で培養される、前記工程;
(b)反応基がその中に含まれる組換えアルブミンのCys34チオールに共有結合で結合して抱合体を形成することができる反応条件下で、液体培地を化合物と接触させる工程であって、前記化合物は反応基を含む、前記工程;及び、
(c)疎水性相互作用クロマトグラフィー、任意に続いて限外濾過及び製剤によって抱合体を精製する工程を含む、前記方法を提供する。
(a)宿主細胞において組換えアルブミンを産生する工程であって、宿主細胞が液体培地中で培養される、前記工程;
(b)反応基がその中に含まれる組換えアルブミンのCys34チオールに共有結合で結合して抱合体を形成することができる反応条件下で、液体培地を化合物と接触させる工程であって、前記化合物は反応基を含む、前記工程;及び、
(c)疎水性相互作用クロマトグラフィー、任意に続いて限外濾過及び製剤によって抱合体を精製する工程を含む、前記方法を提供する。
特定の実施態様において、本方法は、工程(b)の抱合反応の前に、宿主細胞を溶解して細胞内に貯蔵されたアルブミンの放出を促進する工程を更に含む。特定の実施態様において、本方法は、液体培地から、無処置又は溶解されたかにかかわらず、宿主細胞を分離し、こうして工程(b)の抱合反応のための粗製上清を提供する工程を更に含む。
当業者に公知の任意の組換えアルブミンを本発明の方法に従って抱合体を形成するために使用してもよい。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、例えばマウス、ラット、ウシ、ヒツジ又はヒトアルブミンなどの哺乳動物アルブミンである。好ましい実施態様において、アルブミンは、ヒト組換えアルブミンである。一部の実施態様において、アルブミンは、ヒト組換えアルブミンの断片、変異体又は誘導体である。一部の実施態様において、アルブミンは、治療的ペプチドに対して遺伝的に融合された組換えアルブミンを含むアルブミン誘導体である。
更に、当業者に公知の任意の治療的化合物を、本発明の方法に従って、抱合体を形成するために使用してもよい。一部の実施態様において、化合物の治療的部分は、ペプチド、タンパク質、有機分子、RNA、DNA及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施態様において、化合物は、30kDa未満の分子量を有する治療的ペプチド又はその誘導体を含む。例示的な治療的ペプチドには、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)、エキセンディン-3及びエキセンディン-4などのインスリン分泌性ペプチド;並びに成長ホルモン放出因子(GRF)を含む。特定の実施態様において、治療的部分は、グルカゴン様ペプチド1又はその誘導体である。特定の実施態様において、化合物の治療的部分は、エキセンディン-3又はその誘導体である。特定の実施態様において、化合物の治療的部分は、エキセンディン-4又はその誘導体である。特定の実施態様において、治療的部分は、ヒトGRF又はその誘導体である。
特定の実施態様において、化合物は、治療的部分に対して、直接又は連結基を介しての、いずれかで付着された反応基を含む。一部の実施態様において、反応基は、マイケルアクセプター、スクシンイミジル含有基、マレイミド含有基又は求電子性アクセプターである。一部の実施態様において、反応基は、ジスルフィド交換ができる化学部分である。一部の実施態様において、反応基は、遊離チオールを含む。特定の実施態様において、反応基は、システイン残基である。反応基の間接的な付着のための連結基には、(2-アミノ)エトキシ酢酸(AEA)、エチレンジアミン(EDA)及び2-[2-(2-アミノ)エトキシ)]エトキシ酢酸(AEEA)を含むが、限定されない。治療的部分がペプチドである場合、反応基は、ペプチドの任意の残基に付着されていてもよい。有用な付着の部位には、アミノ末端、カルボキシ末端及びアミノ酸側鎖を含む。
特定の本発明の方法によれば、組換えアルブミンは、宿主細胞において産生される。外来組換えタンパク質を産生することができる任意の宿主細胞が、本明細書に記述された方法のために有用であろう。一部の実施態様において、宿主細胞は、組換えアルブミンを産生するように形質転換された酵母、細菌、植物、昆虫、動物又はヒト細胞であることができる。一部の実施態様において、宿主は、液体培地中で培養される。特定の実施態様において、宿主は、細菌株、例えば大腸菌(Escherichia coli)及び枯草菌(Bacillus subtilis)であることができる。その他の実施態様において、宿主は、サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)及びハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)などの酵母株であることができる。特定の実施態様において、宿主は、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)である。
さらなる本発明の方法によれば、粗製又は部分的に精製した組換えアルブミン溶液を、反応基が組換えアルブミンに共有結合で結合して抱合体を形成するができる反応条件下で、反応基を含む化合物と接触させる。一部の実施態様において、反応条件は、1〜37℃の間又はより好ましくは20〜25℃の間の反応温度を含む。特定の実施態様において、組換えアルブミンを低から中性pHを含む溶液中で化合物と接触させる。一部の実施態様において、pHは、約4.0〜7.0の間である。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも30分の期間にわたって、化合物の滴下によって化合物と接触させる。一部の実施態様において、化合物対組換えアルブミンの最終モル比は、0.1:1〜1:1の間にある。一部の実施態様において、化合物対組換えアルブミンの最終モル比は、0.5:1〜0.9:1の間である。特定の実施態様において、化合物対組換えアルブミンの最終モル比は、約0.7:1である。
更に本発明の方法によれば、抱合体は、精製した疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって精製される。一つの実施態様において、第1の精製工程は、抱合反応をフェニルセファロースクロマトグラフィーに供することを含む。特定の実施態様において、この工程は、遊離又は抱合型であるかにかかわらず、非抱合化合物をアルブミン種から分離する。特定の実施態様において、フェニルセファロースカラムは、比較的低い塩分及び中性のpHを有する緩衝液、例えば5mMオクタン酸ナトリウム及び5mM硫酸アンモニウムを含むpH 7.0のリン酸緩衝液において平衡化される。これらの条件下で、非抱合型化合物は、樹脂に結合することができるが、一方で抱合体は、カラムを通って流れることができる。
特定の実施態様において、抱合体の精製には、非Cys34アルブミン抱合体を含む任意の副反応物を減少させ、又は不安定にするために、フェニルセファロースクロマトグラフィーに続いて穏和な分解工程を更に含む。分解は、更に精製を進行する前に、7日までの間、室温にてフェニルセファロースフロースルーをインキュベートすることによって達成してもよい。特定の実施態様において、穏和な分解工程は、抱合体から分解生成物、すなわち非抱合化合物を更に分離するために、フェニルセファロースに対する第2の適用を伴う。
特定の実施態様において、抱合体の精製は、フェニルセファロースフロースルーをブチルセファロースクロマトグラフィーに供して非抱合アルブミン、二量体の非抱合アルブミン及び残留する非抱合化合物から抱合体を更に単離する第2のHIC工程を更に含む。特定の実施態様において、ブチルセファロースカラムは、5mMオクタン酸ナトリウム及び750mM硫酸アンモニウムを含む中性のpHで、又はその近くで、緩衝液中で平衡化される。特定の実施態様において、化合物の分子量が比較的低い、例えば2kDa以下の場合、塩条件及び勾配を変化させてもよい。例えば、1.5 Mの開始硫酸アンモニウム濃度が選択される。特定の実施態様において、溶出は、直線的若しくは段階的に塩濃度を減少させる勾配又はこれらの組み合わせを使用して達成してもよく、非抱合アルブミンは、750mM硫酸アンモニウムで溶出させ、二量体非抱合アルブミンは、550mM硫酸アンモニウムで溶出させ、化合物-アルブミン抱合体は、100mM硫酸アンモニウムで溶出させ、並びに非抱合化合物及びその他の種は、水で溶出させる。これらの種には、例えば二量体、三量体若しくは重合体のアルブミン抱合体又は1:1を越える化合物対組換えアルブミンの化学量論を含むアルブミン抱合体産物を含むであろう。
特定の実施態様において、抱合体の精製は、HICに続く限外濾過によって抱合体を洗浄して、濃縮することを更に含む。一部の実施態様において、滅菌水、生理食塩水又は緩衝液を使用して、精製された抱合体から硫酸アンモニウム及び緩衝液成分を除去してもよい。
(5. 本発明の詳細な説明)
(5.1 定義)
本明細書に使用される、「アルブミン」は、当業者に公知の任意の血清アルブミンをいう。アルブミンは、起源の種に応じて、その単量体の形態でおよそ65〜67キロダルトンの間の分子量を有する血漿中で最も豊富なタンパク質である。「アルブミン」という用語は、「血清アルブミン」と同義的に使用され、また本発明の方法に従った抱合体を形成するアルブミンの供与源を定義することは意味しない。
(5.1 定義)
本明細書に使用される、「アルブミン」は、当業者に公知の任意の血清アルブミンをいう。アルブミンは、起源の種に応じて、その単量体の形態でおよそ65〜67キロダルトンの間の分子量を有する血漿中で最も豊富なタンパク質である。「アルブミン」という用語は、「血清アルブミン」と同義的に使用され、また本発明の方法に従った抱合体を形成するアルブミンの供与源を定義することは意味しない。
本明細書に使用される「治療的ペプチド」は、下記に定義したように、治療的活性をもつ2〜50アミノ酸の間のアミノ酸鎖である。それぞれの治療的ペプチドは、アミノ末端(N-末端又はアミノ末端アミノ酸ともいわれる)、カルボキシル末端(C末端、カルボキシル末端アミノ酸ともいわれる)及びアミノ末端とカルボキシ末端との間に位置する内部アミノ酸を有する。アミノ末端は、遊離αアミノ基をもつ治療的ペプチド鎖のアミノ酸のみによって定義される。カルボキシル末端は、遊離αカルボキシル基をもつ治療的ペプチド鎖のアミノ酸のみによって定義される。いくつかの形態において、カルボキシル末端は、アミド化されていてもよい。
(5.2 本発明の実施態様)
本発明は、前もって形成されたアルブミン抱合体の製造のための方法を提供する。特に、本発明は、組換えアルブミンに対する治療的化合物のインビトロでの抱合のための方法であって、反応基を含む治療的化合物を溶液中で組換えアルブミンに接触させて抱合体を形成する、前記方法を提供する。
本発明は、前もって形成されたアルブミン抱合体の製造のための方法を提供する。特に、本発明は、組換えアルブミンに対する治療的化合物のインビトロでの抱合のための方法であって、反応基を含む治療的化合物を溶液中で組換えアルブミンに接触させて抱合体を形成する、前記方法を提供する。
本方法は、多様な不均一性の程度を有するアルブミン溶液においてアルブミンに対するインビトロでの抱合を提供する。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、宿主生物に由来する液体培地である。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、液体培養である。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、粗製可溶化液である。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、澄んだ可溶化液である。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、精製されたアルブミン溶液である。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、メルカプトアルブミンが濃縮された精製されたアルブミン溶液である。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、精製された脱糖化されたアルブミン溶液である。
生じる抱合体は、クロマトグラフィー、例えばフェニルセファロース及びブチルセファロースクロマトグラフィーを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー、任意に続く限外濾過によって精製される。
生じる抱合体は、クロマトグラフィー、例えばフェニルセファロース及びブチルセファロースクロマトグラフィーを含む疎水性相互作用クロマトグラフィー、任意に続く限外濾過によって精製される。
(5.3 治療的化合物)
(5.3.1 治療的基)
本明細書に記述した方法によって形成される抱合体は、治療的基及び反応性部分を含む化合物に共有結合で結合された組換えアルブミンを含む。一部の実施態様において、当業者に公知の任意の治療的分子には、化合物の治療的基を含み得る。一部の実施態様において、治療的分子は、ペプチド、タンパク質、有機分子、RNA DNA及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施態様において、治療的分子は、ビノレルビン、ゲムシタビン、ドキソルビシン又はパクリタキセルなどの小分子である。
(5.3.1 治療的基)
本明細書に記述した方法によって形成される抱合体は、治療的基及び反応性部分を含む化合物に共有結合で結合された組換えアルブミンを含む。一部の実施態様において、当業者に公知の任意の治療的分子には、化合物の治療的基を含み得る。一部の実施態様において、治療的分子は、ペプチド、タンパク質、有機分子、RNA DNA及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。一部の実施態様において、治療的分子は、ビノレルビン、ゲムシタビン、ドキソルビシン又はパクリタキセルなどの小分子である。
本発明の詳細な実施態様において、治療的分子は、治療的ペプチド又はタンパク質である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、30kDa未満の分子量を有するペプチドを含む。例示的な治療的ペプチドは、抗肥満症ペプチド、例えば米国特許出願番号第11/067,556号(公開番号US2005/176643)に記述されたペプチドYYを含み、その内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、ナトリウム利尿のペプチド、例えば心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)又は脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)であり、これらの両方ともが米国特許出願番号第10/989,397号(公開番号US2005/089514)に記述されており、その内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、米国特許出願番号第10/203,809号(公開番号US 2003/073630)に記述された成長ホルモン放出因子(GRF)であり、その内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、抗融合性ペプチド、例えばT-20、C34又はT-1249である。その他の有用なペプチドには、インスリン、ダイノルフィン、Kringle 5、TPO、T-118及びウロコルチンを含む。
詳細な実施態様において、治療的ペプチドは、インスリン分泌性ペプチドである。インスリン分泌性ペプチドには、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)、エキセンディン-3及びエキセンディン-4、並びにこれらの前駆体、誘導体及び断片を含む。このようなインスリン分泌性ペプチドは、米国特許第6.514,500号;第6,821,949号;第6,887,849号;第6,849,714号;第6,329,336号;第6,924.264号及び第6,593,295号、並びに国際公開公報番号WO03/103572に開示されたものを含み、これらの内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、GLP-1である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、GLP-1誘導体である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、エキセンディン-3である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、エキセンディン-3誘導体である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、エキセンディン-4である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、エキセンディン-4誘導体である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、エキセンディン-4(1-39)である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、エキセンディン-4(1-39)Lys40である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、GRFである。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、GRF誘導体である。一部の実施態様において、治療的ペプチドは独立して、又は組み合わせて以下の突然変異を含む、天然のGRFペプチド配列(1-29)又は(1-44)である:位置2にてD-アラニン;位置8にてグルタミン;位置11にてD-アルギニン;位置12にて(N-Me)Lys;位置15にてアラニン;及び位置27にてロイシン。一部の実施態様において、治療的ペプチドは、GRF(D-ala2 gly8 ala15 leu27)Lys30である。
特定の実施態様において、治療的ペプチドの誘導体は、天然型ペプチドに存在しない1つ以上のアミノ酸置換、欠失及び/又は付加を含む。好ましくは、置換される、欠失され、又は付加されるアミノ酸の数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10アミノ酸である。一つの実施態様において、このような誘導体は、ペプチドのアミノ末端及び/又はカルボキシ末端にて1つ以上のアミノ酸欠失、置換又は付加を含む。別の実施態様において、このような誘導体は、ペプチドの長さの範囲内の任意の残基に1つ以上のアミノ酸欠失、置換又は付加を含む。
特定の実施態様において、アミノ酸置換は、保存的又は非保存的アミノ酸置換であってもよい。保存的アミノ酸置換は、含有アミノ酸残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び/又は両親媒性の性質の類似性に基づいて行われる。例えば、無極性(疎水性)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含み;極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含み;正に荷電した(塩基性)アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンを含み;並びに負に荷電した(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。加えて、グリシン及びプロリンは、鎖の配向に影響を及ぼし得る残基である。非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを別のクラスのものに交換することを伴うであろう。
特定の実施態様において、アミノ酸置換は、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体での置換であってもよい。非古典的アミノ酸には、共通のアミノ酸のD-異性体、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロアミノ酸、β-メチルアミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸(designer amino acid)、及び一般のアミノ酸類似体を含むが、限定されない。
特定の実施態様において、治療的ペプチドの誘導体は、少なくとも75%、少なくとも85%又は少なくとも95%のペプチドと全体的配列相同性を共有する。この文脈におけるパーセント相同性は、配列を整列させ、必要に応じて、最大パーセント配列相同性を達成するためにギャップを導入した後に、ペプチドの対応するアミノ酸残基に対して同一(すなわち、整列における特定の位置にてアミノ酸残基が、同じ残基である)又は同様(すなわち、上で議論したように、整列における特定の位置にてアミノ酸置換は、保存的置換である)である候補配列におけるアミノ酸残基の割合を意味する。特定の実施態様において、治療的ペプチドの誘導体は、ペプチドとのそのパーセント配列同一性又はパーセント配列類似性によって特徴づけられる。配列同一性及び類似性の割合を含む配列相同性は、当該技術分野において周知の配列整列技術を、好ましくは本目的のためにデザインされたコンピュータアルゴリズムを使用して、前記コンピュータアルゴリズムのデフォルトパラメーター又はこれらを含むソフトウェアパッケージを使用して決定される。
コンピュータアルゴリズム及びこのようなアルゴリズムを組み込んでいるソフトウェアパッケージの非限定の例には、以下を含む。BLASTファミリーのプログラムは、2つの配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定的な例を例証する(例えば、Karlin & Altschulの論文、1990, Proc. Nail. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (Karlin & Altschulの論文、1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873- 5877において改正)、Altschulらの論文、1990, J. Mol. Biol. 215:403-410,(NBLAST及びXBLASTを記述)、Altschulらの論文、1997. Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (Gapped BLAST及びPSI- Blastを記述)。別の好ましい例は、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれ、かつGCG配列整列ソフトウェアパッケージの一部として利用できるMyers及びMiller(1988 CABlOS 4:11-17)のアルゴリズムである。また、好ましくは、Wisconsin Sequence Analysis Packageの一部として利用できるFASTAプログラム(Pearson W.R.及びLipman D.J.の論文、Proc. Nat Acad. Sci. USA、85:2444-2448(1988))である。さらなる例には、BFSTFITと、これは、使用する2つの配列間の類似性の最適な単一領域を見いだすために、Smith及びWaterman (Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981)の「局部的相同性」アルゴリズムを使用し、また比較される2つの配列が長さの異なる場合に好ましく;GAPとを含み、これは、Neddleman及びWunsch(J. Mol. Biol. 48:443-354, 1970)のアルゴリズムに従って「最大類似性」を見いだすことによって2つの配列を整列させ、また2つの配列がおおよそ同じ長さで、かつ整列が全長にわたって予想される場合に好ましい。
特定の実施態様において、治療的ペプチドの誘導体は、ギャップなしで、ペプチドと少なくとも55%、少なくとも65%、少なくとも75%又は少なくとも85%の配列の全長にわたって一次アミノ酸配列相同性を共有する。好ましい実施態様において、治療的ペプチドの誘導体は、ギャップなしで、ペプチドと、少なくとも90%又は少なくとも95%の配列の全長にわたって一次アミノ酸配列相同性を共有する。
好ましい実施態様において、パーセント同一性又は類似性は、アミノ酸の領域にわたる同一(パーセント同一性について)又は保存された(パーセント類似性について)アミノ酸の数を決定することによって決定され、該領域は、比較される2つのペプチドの最も短いものの全長(又は両方の配列の大きさが同一である場合、両方の全長)と同じである。別の実施態様において、パーセント同一性又は類似性は、BLASTアルゴリズムを使用して、デフォルトパラメーターで、決定される。
(5.3.1.1 GLP-1及びGLP-1誘導体)
ホルモングルカゴンは、当業者に公知の任意の方法に従って合成することができる。一部の実施態様において、これは、高分子量の前駆体分子として合成され、これをその後に3つのペプチド:グルカゴン、GLP-1及びグルカゴン様ペプチド2(GLP-2)にタンパク質分解で切断する。GLP-1は、配列番号:1(HDEFERH AEG TFTSD VSSYL EGQAAKEFIA WLVKGRG)に示すように、そのプロセスされていない形態で37アミノ酸を有する。プロセスされていないGLP-1は、本質的にインスリン生合成の誘導を媒介することができない。しかし、プロセスされていないGLP-1ペプチドは、GLP-1のアミノ酸7-37(「GLP-l(7-37)」)配列番号:2(HAEG TFTSDVSSYL EGQAAKEFIA WLVKGRG)を有する31アミノ酸長のペプチド(7-37ペプチド)に自然に変換される。また、GLP-1(7-37)は、C末端のグリシンのタンパク分解性除去によってさらなるプロセシングを受けてGLP-l(7-36)を生じることができ、これもまた、主にアルギニンアミド(GLP-1(7-36)アミド)としてアミド化された形態でC末端残基アルギニンを伴って存在する。このプロセシングは、小腸において、及びより少ない程度であるが、膵臓において生じて、GLP-l(7-37)のインスリン分泌活性をもつポリペプチドを生じる。
ホルモングルカゴンは、当業者に公知の任意の方法に従って合成することができる。一部の実施態様において、これは、高分子量の前駆体分子として合成され、これをその後に3つのペプチド:グルカゴン、GLP-1及びグルカゴン様ペプチド2(GLP-2)にタンパク質分解で切断する。GLP-1は、配列番号:1(HDEFERH AEG TFTSD VSSYL EGQAAKEFIA WLVKGRG)に示すように、そのプロセスされていない形態で37アミノ酸を有する。プロセスされていないGLP-1は、本質的にインスリン生合成の誘導を媒介することができない。しかし、プロセスされていないGLP-1ペプチドは、GLP-1のアミノ酸7-37(「GLP-l(7-37)」)配列番号:2(HAEG TFTSDVSSYL EGQAAKEFIA WLVKGRG)を有する31アミノ酸長のペプチド(7-37ペプチド)に自然に変換される。また、GLP-1(7-37)は、C末端のグリシンのタンパク分解性除去によってさらなるプロセシングを受けてGLP-l(7-36)を生じることができ、これもまた、主にアルギニンアミド(GLP-1(7-36)アミド)としてアミド化された形態でC末端残基アルギニンを伴って存在する。このプロセシングは、小腸において、及びより少ない程度であるが、膵臓において生じて、GLP-l(7-37)のインスリン分泌活性をもつポリペプチドを生じる。
化合物は、それがホルモンインスリンの合成又は発現を刺激し、又は刺激を生じさせることができる場合、「インスリン分泌活性」を有するといわれる。GLP-1(7-37)及びGLP-1(7-36)のホルモン活性は、それがインスリンの生合成を誘導するように見える場合に、膵臓β細胞に対して特異的であるようである。グルカゴン様ペプチドホルモンは、インスリン分泌の動態が異常である高血糖によって特徴づけられる状態である成人発症真性糖尿病の病原の研究に有用である。更に、グルカゴン様ペプチドは、本症の療法及び治療に、並びに高血糖の療法及び治療に有用である。
ペプチド部分(断片)は、ヒトGLP-Lの決定されたアミノ酸配列から選択することができる。「ペプチド断片」及び「ペプチド部分」という同義的用語は、合成の、及び天然に存在するアミノ酸配列に由来するか、又は組換え平均を使用して産生される天然に存在するアミノ酸配列の両方を含むことが意味される。
GLP-1のためのアミノ酸配列は、数人の研究者によって報告されている。Lopez, L. C.らの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5485-89 (1983); Bell, G. I.らの論文、Nature 302:716-718 (1983); Heinrich, G.らの論文、Endocrinol. 115:21 76-81 (1984)を参照されたい。これらの内容は、引用により組み込まれている。プレプログルカゴンmRNA及びその対応するアミノ酸配列の構造は、周知である。前駆体遺伝子産物であるプログルカゴンのグルカゴン及び2つのインスリン分泌性ペプチドへのタンパク分解性プロセシングが特徴づけられている。本明細書に使用されるGLP-1(1-37)の表示法は、1(N末端)から37(C末端)までの全てのアミノ酸を有するGLP-1ポリペプチドをいう。同様に、 GLP-1(7-37)は、7(N末端)から37(C末端)までの全てのアミノ酸を有するGLP-1ポリペプチドをいう。同様に、GLP-1(7-36)は、番号7(N末端)から番号36(C末端)までの全てのアミノ酸を有するGLP-1ポリペプチドをいう。
一つの実施態様において、GLP-1(7-36)及びそのペプチド断片は、下記の詳述したように、従来の手段によって、Merrifieldの論文、Chem. Soc. 85:21491962 (1962)、並びにStewart及びYoungの論文、Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman, San Francisco, 1969. pp. 27-66によって記述された周知の固相ペプチド合成などによって合成される。これらの内容は、引用により本明細書に組み込まれている。しかし、例えばタンパク質分解酵素を使用して、天然に存在するアミノ酸配列を断片化することによって、プログルカゴンポリペプチドの、又はGLP-1の断片を得ることもできる。更に、Maniatis, T.らの論文、Molecular Biology: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor. N.Y. (1982)によって開示されたような組換えDNA技術を用いることにより、プログルカゴンペプチドの、又はGLP-1の所望の断片を得ることができる。これらの内容は、引用により本明細書に組み込まれている。
本明細書に記述した方法のための有用なペプチドは、GLP-1(1-37)及びGLP-1(7-36))などのGLP-1に由来するものを含む。ペプチドは、それが天然に存在する配列を分解することによって得ることができる場合、又はそれが天然に存在するアミノ酸配列の、又はこの配列をコードする遺伝物質(DNA又はRNA)の配列の知識に基づいて合成することができる場合、「天然に存在するアミノ酸配列に由来する」といわれる。
また、GLP-1(1-37)及び特にGLP-1(7-36)などのGLP-1の「誘導体」であるといわれる分子も有用である。このような「誘導体」は、以下の特徴を有する:(1)それがGLP-1又はGLP-1の同じような大きさの断片と実質的相同性を共有する:(2)それがインスリン分泌性ホルモンとして機能することができる;及び(3)誘導体がGLP-1のインスリン分泌活性の少なくとも0.1%、1%、5%、10%、15%、25%、50%、75%、100%又は100%を超えるインスリン分泌活性を有する。
GLP-1の誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が少なくとも75%、少なくとも80%及びより好ましくは少なくとも90%及び最も好ましくは少なくとも95%、GLP-l(l-37)のものと同じである場合、GLP-1と「実質的相同性」を共有するといわれる。
GLP-1の誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が少なくとも75%、少なくとも80%及びより好ましくは少なくとも90%及び最も好ましくは少なくとも95%、GLP-l(l-37)のものと同じである場合、GLP-1と「実質的相同性」を共有するといわれる。
また、有用な誘導体には、天然に存在するGLP-1のものと実質的に相同的である配列を含むことに加えて、ペプチドがこれらのアミノ末端及び/若しくはこれらのカルボキシル末端にて、又は前記配列の内部にて1つ以上の追加のアミノ酸を含んでいてもよいGLP-1誘導体を含む。従って、有用な誘導体には、天然に存在するGLP-1配列に存在しなくてもよい1つ以上のアミノ酸を含んでいてもよいGLP-1のポリペプチド断片を含むが、ただしこのようなポリペプチドは、GLP-1のインスリン分泌活性の少なくとも0.1%、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%又は100%を超えるインスリン分泌活性を有することを条件とする。追加の付加アミノ酸は、D-アミノ酸若しくはL-アミノ酸又はこれらの組み合わせであってもよい。
また、有用なGLP-1断片には、天然に存在するGLP-1ペプチドのものと実質的に相同的である配列を含むが、GLP-1ペプチドで天然に見いだされるこれらのアミノ末端及び/又はこれらのカルボキシ末端にて、1つ以上のアミノ酸を欠いているものを含む。従って、GLP-1の有用なポリペプチド断片は、通常天然に存在するGLP-1配列に存在する1つ以上のアミノ酸を欠いていてもよいが、ただしこのようなポリペプチドは、GLP-1のインスリン分泌活性の少なくとも0.1%、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%又は100%を超えるインスリン分泌活性を有することを条件とする。特定の実施態様において、ポリペプチド断片は、天然に存在するGLP-1配列に通常存在する1つのアミノ酸を欠いている。一部の実施態様において、ポリペプチド断片は、天然に存在するGLP-1配列に通常存在する2つのアミノ酸を欠いている。一部の実施態様において、ポリペプチド断片は、天然に存在するGLP-1配列に通常存在する3つのアミノ酸を欠いている。一部の実施態様において、ポリペプチド断片は、天然に存在するGLP-1配列に通常存在する4つのアミノ酸を欠いている。
また、重要でないアミノ酸置換を有する(及び、従って天然の配列のものとは異なるアミノ酸配列を有する)上記の断片の明らかな、又は自明の変異体が、有用であるが、ただしこのような変異体が上記のGLP-1誘導体のものと実質的に同一であるインスリン分泌活性を有することを条件とする。
インスリン分泌活性をもつこれらのGLP-1誘導体に加えて、細胞によるグルコース摂取を刺激するが、インスリン発現又は分泌を刺激しないGLP-1誘導体も、本明細書に記述した方法に有用である。このようなGLP-1誘導体は、米国特許第5,574,008号に記述されており、これは、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。
本明細書に記述した方法における使用を見いだす、細胞によるグルコース摂取を刺激するが、インスリン発現又は分泌を刺激しないGLP-1誘導体には:
R1-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa-Gly-Arg-R2(配列番号:3)
式中、R1は、以下から選択される:
a)H2N;b)H2N-Ser;c)H2N-Val-Ser;d)H2N-Asp-Val-Ser:e)H2N-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:4);f)H2N-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:5);g)H2N-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:6);h)H2N-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:7);i)H2N-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:8);j)H2N-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:9);及びk)H2N-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:10);l)H2N-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:11):m)H2N-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:12)。ペプチドにおいて、Xaaは、Lys及びArgから選択され、かつR2は、NH2、OH、Gly-NH2及びGly-OHから選択される。
これらのペプチドは、インスリン分泌活性を有さないが、それにもかかわらず、米国特許第5,574,008号(これは、その全体が引用により本明細書に組み込まれている)に記載されているように糖尿病及び高血糖性状態を治療するために有用であるC末端のGLP-1断片である。
R1-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa-Gly-Arg-R2(配列番号:3)
式中、R1は、以下から選択される:
a)H2N;b)H2N-Ser;c)H2N-Val-Ser;d)H2N-Asp-Val-Ser:e)H2N-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:4);f)H2N-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:5);g)H2N-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:6);h)H2N-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:7);i)H2N-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:8);j)H2N-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:9);及びk)H2N-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:10);l)H2N-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:11):m)H2N-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(配列番号:12)。ペプチドにおいて、Xaaは、Lys及びArgから選択され、かつR2は、NH2、OH、Gly-NH2及びGly-OHから選択される。
これらのペプチドは、インスリン分泌活性を有さないが、それにもかかわらず、米国特許第5,574,008号(これは、その全体が引用により本明細書に組み込まれている)に記載されているように糖尿病及び高血糖性状態を治療するために有用であるC末端のGLP-1断片である。
(5.3.1.2 エキセンディン-3及びエキセンディン-4ペプチド並びにこれらの誘導体)
エキセンディン-3及びエキセンディン-4ペプチドは、当業者に公知の任意のエキセンディン-3又はエキセンディン-4ペプチドであることができる。エキセンディン-3及びエセンディン-4は、GLP-1に対しておよそ53%相同である39アミノ酸ペプチド(残基2及び3が異なる)であり、かつインスリン分泌薬としての使用を見いだす。
天然のエキセンディン-3配列は、HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(配列番号:13)であり、及びエキセンディン-4配列は、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(配列番号:14)である。
エキセンディン-3及びエキセンディン-4ペプチドは、当業者に公知の任意のエキセンディン-3又はエキセンディン-4ペプチドであることができる。エキセンディン-3及びエセンディン-4は、GLP-1に対しておよそ53%相同である39アミノ酸ペプチド(残基2及び3が異なる)であり、かつインスリン分泌薬としての使用を見いだす。
天然のエキセンディン-3配列は、HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(配列番号:13)であり、及びエキセンディン-4配列は、HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(配列番号:14)である。
また、アミノ酸配列を含むエキセンディン-4:エキセンディン-4(1-31)(配列番号:15)HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY及びエキセンディン-4(1-31)(配列番号:16)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGYのインスリン分泌性断片も、本明細書に記述した方法に有用である。
また、アミノ酸配列:エキセンディン-4(9-39)(配列番号:17)DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSを含む天然のエキセンディン-4の阻害断片も、有用である。
また、アミノ酸配列:エキセンディン-4(9-39)(配列番号:17)DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSを含む天然のエキセンディン-4の阻害断片も、有用である。
また、本明細書に記述した方法に有用なペプチドは、天然に存在するエキセンディン-3及びエキセンディン-4ペプチドに由来するペプチドを含む。ペプチドは、それが天然に存在する配列を断片化することによって得ることができる場合、又はそれが天然に存在するアミノ酸配列の、又はこの配列をコードする遺伝物質(DNA又はRNA)の配列の知識に基づいて合成することができる場合、「天然に存在するアミノ酸配列に由来する」といわれる。
また、本明細書に記述した方法に有用な分子には、エキセンディン-3及びエキセンディン-4の「誘導体」であるといわれるものを含む。このような「誘導体」は、以下の特徴を有する:(1)それがエキセンディン-3若しくはエキセンディン-4、又はエキセンディン-3若しくはエキセンディン-4の同じような大きさの断片と実質的相同性を共有する:(2)それがインスリン分泌性ホルモンとして機能することができる;及び(3)誘導体がエキセンディン-3又はエキセンディン-4のインスリン分泌活性の少なくとも0.1%、1%、5%、10%、15%、25%、50%、75%、100%又は100%を超えるインスリン分泌活性を有する。
エキセンディン-3又はエキセンディン-4の誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が少なくとも75%、少なくとも80%及びより好ましくは少なくとも90%及び最も好ましくは少なくとも95%、エキセンディン-3又はエキセンディン-4のいずれかのものと同じであるである場合、エキセンディン-3又はエキセンディン-4と「実質的相同性」を共有するといわれる。
また、有用な誘導体には、天然に存在するエキセンディン-3又はエキセンディン-4のものと実質的に相同的である配列を含むことに加えて、ペプチドがこれらのアミノ末端及び/若しくはこれらのカルボキシル末端にて、又は前記配列の内部にて1つ以上の追加のアミノ酸を含んでいてもよいエキセンディン-3又はエキセンディン-4断片を含む。従って、有用な誘導体には、天然に存在するエキセンディン-3又はエキセンディン-4配列に存在しなくてもよい1つ以上のアミノ酸を含み得るエキセンディン-3又はエキセンディン-4のポリペプチド断片を含むが、ただしこのようなポリペプチドは、エキセンディン-3又はエキセンディン-4のいずれかのインスリン分泌活性の少なくとも0.1%、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%又は100%を超えるインスリン分泌活性を有することを条件とする。
同様に、有用な誘導体には、天然に存在するエキセンディン-3又はエキセンディン-4ペプチドのものと実質的に相同的である配列を含むが、エキセンディン-3又はエキセンディン-4ペプチドで天然に見いだされるこれらのアミノ末端及び/又はこれらのカルボキシ末端にて1つ以上のアミノ酸を欠いているエキセンディン-3又はエキセンディン-4断片を含む。従って、有用な誘導体には、通常天然に存在するエキセンディン-3又はエキセンディン-4配列に存在する1つ以上のアミノ酸を欠いていてもよいが、ただしこのようなポリペプチドは、エキセンディン-3又はエキセンディン-4のいずれかのインスリン分泌活性の少なくとも0.1%、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%又は100%を超えるインスリン分泌活性を有することを条件とするエキセンディン-3又はエキセンディン-4のポリペプチド断片を含む。
また、有用な誘導体には、重要でないアミノ酸置換を有する(及び、従って天然の配列のものとは異なるアミノ酸配列を有する)上記の断片の明らかな、又は自明の変異体を含むが、ただしこのような変異体が上記のエキセンディン-3又はエキセンディン-4誘導体のものと実質的に同一であるインスリン分泌活性を有することを条件とする。
(5.3.1.3 GRF及びGRF誘導体)
成長ホルモン(GH)は、ソマトトロピンとしても知られ、下垂体前葉において成長ホルモン分泌細胞と呼ばれる細胞によって合成され、かつ分泌される約190アミノ酸のタンパク質ホルモンである。これは、成長及び代謝の制御の主要な関係物である。また、これは、ヒト及び動物の両方に使用するための医薬製品としてかなりの関心が持たれている。GHの産生は、ストレス、栄養、睡眠及びGH自体を含む多くの因子によって調整される。しかし、その主な制御因子は、2つの視床下部ホルモン:GHの合成及び分泌を刺激する44アミノ酸配列である成長ホルモン放出因子(GRF又はGHRH);及び、GRFに応答してGH放出を阻害するソマトスタチン(SS)である。
成長ホルモン(GH)は、ソマトトロピンとしても知られ、下垂体前葉において成長ホルモン分泌細胞と呼ばれる細胞によって合成され、かつ分泌される約190アミノ酸のタンパク質ホルモンである。これは、成長及び代謝の制御の主要な関係物である。また、これは、ヒト及び動物の両方に使用するための医薬製品としてかなりの関心が持たれている。GHの産生は、ストレス、栄養、睡眠及びGH自体を含む多くの因子によって調整される。しかし、その主な制御因子は、2つの視床下部ホルモン:GHの合成及び分泌を刺激する44アミノ酸配列である成長ホルモン放出因子(GRF又はGHRH);及び、GRFに応答してGH放出を阻害するソマトスタチン(SS)である。
GRF(1-44)の生物活性は、ペプチドのN-終末部にあることが示された。また、完全な固有の活性及び能力は、インビトロ及びインビボの両方においてGRF(1-29)で証明された。更にまた、GRFの持続的投与により、通常の生理学的条件下と同じ脳下垂体からのGHの脈状分泌パターンを誘導する。従って、GRFは、成長ホルモンが示される例において優れた治療的有用性を有する。例えば、これは、GH産生異常のための低下垂体萎縮症、糖尿病の治療及び加齢過程の遅延に使用されるであろう。GRFの内因性産生若しくは放出からの利益を得ている多くのその他の疾患又は状態を下記に列挙してある。更に、GRFは、農業分野において有用である。農業使用の例には、より早期の出荷を可能にするための、ブタ、ウシ又はその他の肉産生の増強を含む。また、GRFは、乳牛における乳産生を刺激することが公知である。その他の例示的な適用は、米国特許出願番号第10/203,809号(公開番号US2003/073630)に記述されている。これらの内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。
従って、特定の実施態様において、治療的ペプチドとしてGRFを含む抱合体は、本発明の方法によって形成してもよい。また、有用なペプチドには、天然に存在するGRFペプチドのものと実質的に相同的である配列を含むが、GRF天然のペプチドで天然に見いだされるこれらのアミノ末端及び/又はこれらのカルボキシル末端にて1つ以上の更なるアミノ酸を欠いていてもよいGRF誘導体を含む。従って、有用なペプチドには、通常天然に存在するGRF配列に存在する1つ以上のアミノ酸を欠いていてもよいGRFのポリペプチド断片を含むが、ただしこのようなポリペプチドは、GRFの成長ホルモン放出活性の少なくとも0.1%、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%又は100%を超える成長ホルモン放出活性を有することを条件とする。
GRFの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が少なくとも75%、少なくとも80%及びより好ましくは少なくとも90%及び最も好ましくは少なくとも95%、GRFのものと同じであるである場合、GRFと「実質的相同性」を共有するといわれる。
また、本明細書に記述した方法に有用なペプチドは、重要でないアミノ酸置換を有する(及び、従って天然の配列のものとは異なるアミノ酸配列を有する)上記の類似体又は断片の明らかな、又は自明の変異体を含むが、ただしこのような変異体がGRFの成長ホルモン放出活性の少なくとも0.1%、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%又は100%を超える成長ホルモン放出活性を有することを条件とする。
また、本明細書に記述した方法に有用なペプチドは、重要でないアミノ酸置換を有する(及び、従って天然の配列のものとは異なるアミノ酸配列を有する)上記の類似体又は断片の明らかな、又は自明の変異体を含むが、ただしこのような変異体がGRFの成長ホルモン放出活性の少なくとも0.1%、1%、5%、10%、25%、50%、75%、100%又は100%を超える成長ホルモン放出活性を有することを条件とする。
特定の実施態様において、本明細書に記述した方法に有用なGRFペプチド配列は、以下の配列である:
A1-A2-Asp-A4-Ile-Phe-A7-A8-A9-Tyr-A11-A12-A13-Leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala-A20-A21-A22-Leu-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30
式中、
A1は、Tyr、N-Ac-Tyr、His、3-MeHis、desNH2His、desNH2Tyr、Lys-Tyr、Lys-His又はLys-3-MeHisであり;
A2は、Val、Leu、He、Ala、D-Ala、N-メチル-D-Ala、(N-メチル)-Ala、Gly、Nle又はNvalであり:
A4は、Ala又はGlyであり;
A5は、Met又はIleであり:
A7は、Asn、Ser又はThrであり;
A8は、Asn、Gln、Lys又はSerであり、:
A9は、Ala又はSerであり;
A11は、Arg、D-Arg、Lys又はD-Lysであり:
A12は、Lys、(N-Me)Lys又はD-Lysであり;
A13は、Val又はLeuであり;
A15は、Ala、Leu又はGlyであり;
A18は、Ser又はThrであり;
A20は、Arg、D-Arg、Lys又はD-Lysであり;
A21は、Lys、(N-Me)Lys又はAsnであり:
A22は、Tyr又はLeuであり;
A24は、Gln又はHisであり;
A25は、Ser又はAspであり;
A26は、Leu又はIleであり;
A27は、Met、Ile、Leu又はNleであり;
A28は、Ser、Asn、Ala又はAspであり;
A29は、Lys又はArgであり;かつ
A30は、なし、X又はX-Lysであり、式中Xは、なしか、又は配列Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu若しくはこれらの断片であり、式中断片は、C末端のから1〜15アミノ酸まで減少され;及び断片からの1つのアミノ酸残基は、リジン残基と任意に置換することができ;及びC末端は、遊離カルボン酸又は対応するアミドであることができる、
ただし、A2がAlaである場合、断片は、5〜8アミノ酸まで減少された断片ではないことを条件とする。
A1-A2-Asp-A4-Ile-Phe-A7-A8-A9-Tyr-A11-A12-A13-Leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala-A20-A21-A22-Leu-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30
式中、
A1は、Tyr、N-Ac-Tyr、His、3-MeHis、desNH2His、desNH2Tyr、Lys-Tyr、Lys-His又はLys-3-MeHisであり;
A2は、Val、Leu、He、Ala、D-Ala、N-メチル-D-Ala、(N-メチル)-Ala、Gly、Nle又はNvalであり:
A4は、Ala又はGlyであり;
A5は、Met又はIleであり:
A7は、Asn、Ser又はThrであり;
A8は、Asn、Gln、Lys又はSerであり、:
A9は、Ala又はSerであり;
A11は、Arg、D-Arg、Lys又はD-Lysであり:
A12は、Lys、(N-Me)Lys又はD-Lysであり;
A13は、Val又はLeuであり;
A15は、Ala、Leu又はGlyであり;
A18は、Ser又はThrであり;
A20は、Arg、D-Arg、Lys又はD-Lysであり;
A21は、Lys、(N-Me)Lys又はAsnであり:
A22は、Tyr又はLeuであり;
A24は、Gln又はHisであり;
A25は、Ser又はAspであり;
A26は、Leu又はIleであり;
A27は、Met、Ile、Leu又はNleであり;
A28は、Ser、Asn、Ala又はAspであり;
A29は、Lys又はArgであり;かつ
A30は、なし、X又はX-Lysであり、式中Xは、なしか、又は配列Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu若しくはこれらの断片であり、式中断片は、C末端のから1〜15アミノ酸まで減少され;及び断片からの1つのアミノ酸残基は、リジン残基と任意に置換することができ;及びC末端は、遊離カルボン酸又は対応するアミドであることができる、
ただし、A2がAlaである場合、断片は、5〜8アミノ酸まで減少された断片ではないことを条件とする。
成長ホルモンの内因性産生又は放出を促進することに加えて、本GRF誘導体は、GRFペプチド「バックボーン」の1つ以上の部位にアミノ酸置換を組み込んでいてもよく、又はC末端及び/又はN末端が1つ以上の塩基性残基の付加によって変化されているか、又はインビボにおける望まれない生物化学的攻撃及び分解からペプチド末端を保護するためのペプチド化学の技術分野において従来法で使用される種類のブロック基を組み込むように修飾されているGRF種の変異体である。従って、本GRF誘導体は、その配列が多くの著者によって報告されているヒトGRF、ウシGRF、ラットGRF、ブタGRFなど含むが、限定されない任意のGRF種の状況におけるアミノ酸置換を組み込む。より好ましい実施態様では、リジン残基が、GRFペプチド配列のC末端又はN末端に付加される。
(5.4 反応基)
好ましい実施態様において、本明細書に記述した方法によって形成される抱合体には、反応基を介して組換えアルブミンに共有結合で連結された治療的分子を含む。反応基は、例えばアルブミン上の1つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基と反応することにより、アルブミンと安定な共有結合を形成するその能力について選択する。好ましくは、反応基は、アルブミン上の1つのアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基のみと反応する。好ましくは、反応基は、アルブミンの特定のアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基と反応する。一部の実施態様において、本明細書に記述した方法によって形成される抱合体には、アルブミン上のアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基と反応基の反応を介してアルブミンに共有結合で結合された治療的ペプチド又はその修飾された誘導体を含む。従って、本発明の方法によって形成される抱合体には、反応基がアルブミンに対する共有結合を形成した治療的ペプチド又はその修飾された誘導体を含んでもよい。更により好ましくは、反応基は、アルブミンのCys34チオールと共有結合を形成する。
好ましい実施態様において、本明細書に記述した方法によって形成される抱合体には、反応基を介して組換えアルブミンに共有結合で連結された治療的分子を含む。反応基は、例えばアルブミン上の1つ以上のアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基と反応することにより、アルブミンと安定な共有結合を形成するその能力について選択する。好ましくは、反応基は、アルブミン上の1つのアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基のみと反応する。好ましくは、反応基は、アルブミンの特定のアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基と反応する。一部の実施態様において、本明細書に記述した方法によって形成される抱合体には、アルブミン上のアミノ基、ヒドロキシル基又はチオール基と反応基の反応を介してアルブミンに共有結合で結合された治療的ペプチド又はその修飾された誘導体を含む。従って、本発明の方法によって形成される抱合体には、反応基がアルブミンに対する共有結合を形成した治療的ペプチド又はその修飾された誘導体を含んでもよい。更により好ましくは、反応基は、アルブミンのCys34チオールと共有結合を形成する。
タンパク質上の官能基と共有結合を形態するためには、化学的反応基として、多種多様な活性カルボキシル基、特にエステルを使用してもよい。カルボキシル基は、通常、タンパク質上のアミン、チオール及びヒドロキシル官能性による攻撃に対して感受性のN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)又はマレイミドなどの反応中間体に変換される。ペプチドへのNHS及びマレイミド反応基の導入は、マレイミド-ベンゾイル-スクシンイミド(MBS)、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシンイミドエステル(GMBS)、ジチオビス-N-ヒドロヒスクシンイミドプロプロピオナート(DTSP)、スクシンイミジル3(2-ピリジルジチオプロピオナート)(SPDP)、スクシンイミジルtrans-4-(マレイミジルメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシラート(SMCC)、スクシンイミジルアセチルチオアセテート(SATA)、ベンゾフェノン4-マレイミド、N-((2-ピリジルジチオ)エチル)-4-アジドサリチルアミド(PEAS;AET)などの二官能性の連結剤を使用して行うことができる。このような二官能性リンカーは、保護基の選択に基づいて、ペプチド上のカルボキシ基又はアミノ基を活性化するだろう。
或いは、ペプチドに対するマレイミドの付加は、マレイミドプロピオン酸、[2-[2-[2-マレイミドプロピオンアミド(エトキシ)エトキシ]酢酸のような誘導体を活性化するためにN,N,ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、1-エチル-3-{3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド、ヒドロクロリド(EDAC)などのカップリング剤を使用し、その後にペプチド上のアミンと反応することによって行うことができる。DCC及びEDACのような同様の薬剤を使用して、ペプチド上のカルボキシ部分にマレイミドアルキルアミンのような誘導体を付加することができるであろう。
一級アミンは、NHSエステルに対する主要な標的である。タンパク質のN末端上に存在する利用可能なε-アミン基は、NHSエステルと反応する。しかし、タンパク質上のε-アミノ基は、NHSカップリングには望ましくなく、又は利用できないであろう。5つのアミノ酸が、これらの側鎖に窒素を有するが、リジンのε-アミンのみがNHSエステルと有意に反応する。NHSエステル抱合反応により、一級アミンと反応し、放出するN-ヒドロキシスクシンイミドを放出するときに、アミド結合を形成することができる。これらのスクシンイミジル含有反応基は、本明細書においてスクシンイミジル基という。
詳細な実施態様において、アルブミン上の官能基は、アミノ酸残基34(Cys34)に位置する単一の遊離チオール基であり、化学的に反応基は、MPAなどのマレイミド含有基である。MPAは、マレイミドプロピオン酸又はマレイミドプロピオナートを表す。このようなマレイミド含有基は、本明細書において、マレイミド基という。
一部の実施態様において、本明細書に記述した方法によって形成される抱合体は、治療的ペプチド上のスクシンイミジル又はマレイミド基に共有結合で連結されたアルブミンを含む。一部の実施態様において、アルブミンアミノ、ヒドロキシル又はチオール基は、治療的ペプチド上のスクシンイミジル又はマレイミド基に共有結合で連結される。一部の実施態様において、アルブミンシステイン34チオールは、治療的ペプチドのリジンのイプシロンアミノ上の[2-[2-[2-マレイミドプロピオンアミド(エトキシ)エトキシ]アセトアミドリンカーに共有結合で連結される。
特定の実施態様において、反応基は、単一の定義されたアミノ酸にて、任意に連結基を介して、ペプチドに付着された単一のMPA反応基であり、かつMPAは、アルブミンの単一のアミノ酸残基、好ましくはシステイン34にてアルブミンに共有結合で付着される。好ましい実施態様において、アルブミンは、組換えヒトアルブミンである。
特定の実施態様において、反応基、好ましくはMPAは、1つ以上の連結基、好ましくはAEEA、AEA又はオクタン酸を介してペプチドに付着される。反応基、好ましくはMPAが、2以上の連結基を介してペプチドに付着される特定の実施態様の例において、それぞれの連結基は、好ましくはAEA((2-アミノ)エトキシ酢酸)、AEEA([2-(2-アミノ)エトキシ)]エトキシ酢酸)及びオクタン酸からなる群から独立して選択することができる。一つの実施態様において、反応基、好ましくはMPAは、0、1、2、3、4、5又は6個の直列に配置されたAEEA連結基を介してペプチドに付着される。別の実施態様において、反応基、好ましくはMPAは、0、1、2、3、4、5又は6個の直列に配置されたオクタン酸連結基を介してペプチドに付着される。特定の実施態様において、連結基は、例えば、0〜30原子又は0〜20原子又は0〜10原子の鎖を含むことができる。特定の実施態様において、連結基には、例えば0〜30原子又は0〜20原子又は0〜10原子の鎖からなることができる。これらの原子は例えば、C、N、O、S、Pからなる群から選択することができる。
特定の実施態様において、反応基は、このような反応基の付着のために適した治療的ペプチドの任意の残基に付着することができる。残基は、ペプチドの末端残基又は内部残基であることができる。特定の実施態様において、反応基は、ペプチドのカルボキシ末端又はアミノ末端に付着することができる。有利な実施態様において、反応基は、ペプチドの単一の部位に付着される。これは、当業者に公知の保護基を使用して達成することができる。特定の実施態様において、治療的ペプチドの誘導体には、反応基の付着のために組み込まれた残基を含むことができる。付着のための有用な残基には、リジン残基、アスパラギン酸残基及びグルタミン酸残基を含むが、限定されない。残基は、ペプチドの内部又は末端に、例えば遊離α-アミノ末端を経てN末端のアミノ酸残基に組み込むことができる。特定の実施態様において、反応基は、内部リジン残基に付着される。特定の実施態様において、反応基は、末端リジン残基に付着される。特定の実施態様において、反応基は、アミノ末端リジン残基に付着される。特定の実施態様において、反応基は、カルボキシ末端リジン残基、例えばGLP-1、GLP-l(7-37)又はエキセンディン-4のカルボキシ末端のリジン残基に付着される。
その他の実施態様において、活性化されたジスルフィド結合基は、選択的チオール活性化スキームに基づいた分子間ジスルフィド結合の優先的形成のための方法を介して、治療的ペプチドシステイン又はシステイン類似体に結合してもよい。タンパク質又はペプチド間で選択的に非対称ジスルフィド結合を形成するための、1つのチオールの活性基での選択的活性化、続く第2の遊離チオールとの反応に基づいた方法は、対称ジスルフィド結合形成による収率の減少の問題を軽減することが記述されている。D. Andreuらの論文、「分子生物学の方法(Methods in Molecular Biology)」(M. W. Pennington 及び B. M. Dunn編). Vol.35, p. 91. Humana Press. Totowa. N .J., (1994)を参照されたい。この内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。好ましくは、このような活性基は、ピリジンスルフェニル基に基づいたものである(M. S. Bernatowiczらの論文、Int. J. Pept. Protein Res. 28: 107(1986))。好ましくは、2,2'-ジチオジピリジン(DTDP)(Carlssonらの論文、Diυchem. J. 173: 723(1978); L. H. Kondejewskiらの論文、Bioconjugate Chem. 5:602(1994) 又は2.2'-ジチオビス(5-Nitropyridine)(NPYS)(J. Org. Chem. 56: 6477(1991))が使用される。加えて、5,5'ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(エルマン試薬)又は6,6'-ジチオジニコチン酸を活性基として使用してもよい。
これらの方法によれば、ジスルフィド結合活性化基は、最初に過剰の活性化基の条件下でシステイン又はシステイン類似体を含む治療的ペプチドと反応させる。これらの条件では、本質的にジスルフィド結合するペプチドホモ二量体を産生することなく、活性化されたジスルフィド基とカップリングした治療的ペプチドを含む治療的化合物の形成を高度に促進する。カップリング反応後に生じるペプチド化合物は、逆相-HPLCなどによって精製される。第2の遊離チオールとの反応は、ペプチド化合物が血液成分、好ましくは血清アルブミンと反応して治療的化合物と血清アルブミンとの間の抱合体を形成するときに生じる。
治療的ペプチドシステイン又はシステイン類似体は、亜硫酸分解反応スキームを介してS-スルホナートを有するように変換される。このスキームでは、最初に治療的ペプチドを合成的に、又は組換えで合成する。次いで、亜硫酸分解反応を使用して、S-スルホナートをそのシステインを介して治療的ペプチド又はシステイン類似体チオールに対して付着させる。亜硫酸分解反応に続いて、治療的ペプチド化合物を勾配カラムクロマトグラフィーなどによって精製する。次いで、S-スルホナート化合物を使用して、治療的ペプチド化合物と血液成分、好ましくは血清アルブミンとの間の抱合体を形成する。
治療的ペプチドをアルブミンに対する抱合のための反応基で修飾する様式は、治療的ペプチドを含む種々のエレメントの性質に応じて、広く変化するであろう。合成手順は、単純であり、高収率をもたらし、かつ産物を高度に精製することができるように選択されるであろう。通常、化学的に反応性の基、例えばカルボキシル基では、活性エステルを形成するためのエステル化は、ペプチド合成の最後の段階にて行われるであろう。修飾されたインスリン分泌性ペプチドの産生のための具体的方法は、米国特許第6,329,336号、第6,849,714号又は第6,887,849号に記述されている。これらの内容は、これらの全体が引用により本明細書に組み込まれている。
(5.5 アルブミン)
当業者に公知の任意のアルブミンを使用して、本発明の方法に従った抱合体を形成してもよい。一部の実施態様において、アルブミンは、宿主種から単離され、抱合体の形成に使用するために精製された血清アルブミンである。血清アルブミンは、。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヒツジ、ウマ又はヒトアルブミン含むが、限定されない当業者に公知の任意の哺乳動物血清アルブミンでもよい。一部の実施態様において、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。
当業者に公知の任意のアルブミンを使用して、本発明の方法に従った抱合体を形成してもよい。一部の実施態様において、アルブミンは、宿主種から単離され、抱合体の形成に使用するために精製された血清アルブミンである。血清アルブミンは、。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヒツジ、ウマ又はヒトアルブミン含むが、限定されない当業者に公知の任意の哺乳動物血清アルブミンでもよい。一部の実施態様において、アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。
本発明の方法を利用して、血清又はゲノムの供与源などの多数の供与源由来のアルブミンを含むアルブミン抱合体を形成することができるが、本方法は、特に組換えアルブミンとの抱合体を形成するために適用できる。組換えアルブミンは、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヒツジ、ウマ又はヒトアルブミンを含むが、限定されない当業者に公知の任意の哺乳動物アルブミンであってもよい。好ましい実施態様において、組換えアルブミンは、組換えヒトアルブミン、特に組換えヒト血清アルブミン(rHSA)である。
ヒト血清アルブミン(HSA)は、血清の浸透圧のかなりの比率を担い、更には内因性及び外来性リガンドの担体として機能する。その成熟形態において、HSAは、約66kDの分子量に対応する585アミノ酸の非グリコシル化単量体タンパク質である。その球状構造は、連続した一連の9個の二重ループを生じる17個のジスルフィド架橋によって維持される。
Brown. J. R.の文献、アルブミン構造、機能及び使用(Albumin Structure, Function and Uses)、Rosenoer, V.M.らの (編集)、Pergamon Press. Oxford (1977)を参照されたい。これらの内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。従って、アルブミンの成熟形態と共に形成された抱合体は、本明細書に記述した方法の範囲内である。
Brown. J. R.の文献、アルブミン構造、機能及び使用(Albumin Structure, Function and Uses)、Rosenoer, V.M.らの (編集)、Pergamon Press. Oxford (1977)を参照されたい。これらの内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。従って、アルブミンの成熟形態と共に形成された抱合体は、本明細書に記述した方法の範囲内である。
一部の実施態様において、本発明の方法によって形成された抱合体には、アルブミン前駆体を含む。ヒトアルブミンは、肝臓肝細胞において合成去れ、次いで血流に分泌される。この合成では、第一に、新生ポリペプチドを分泌経路に向ける18アミノ酸のシグナル配列を含む前駆体のプレプロ-HSAを生じる。従って、アルブミン前駆体と共に形成された抱合体も、本明細書に記述した方法の範囲内である。
特定の実施態様において、本発明の方法によって形成された抱合体には、アルブミンの分子変異体を含む。アルブミンの変異体には、ヒト集団におけるアルブミンの多型から生じる天然の変異体を含んでいてもよい。ヒト血清アルブミンの30を超える明らかに異なる遺伝的変異体が、種々の条件下での電気泳動的解析によって同定されてきた。例えば、Weitkampらの論文、Ann. Hum. Genet, 36(4):381-92 (1973); Weitkampの論文、Isr. J. Med. Sci, 9(9): 1238-48 (1973);. Fineらの論文、Biomedicine, 25(8):291-4 (1976); Fineらの論文、Rev. Fr. Transfus. Immunohematol, 25(2): 149- 63. (1982); Rochuらの論文、Rev. Fr. Transfus. Immunohematol. 31(5):725-33 (1988); Araiらの論文、Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A 86(2): 434-8 (1989)を参照されたい。これらの内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。従って、アルブミンの分子変異体と共に形成された抱合体も、本明細書に記述した方法の範囲内である。
一部の実施態様において、本発明の方法によって形成された抱合体には、アルブミンと実質的相同性を共有するアルブミンの誘導体を含む。例えば、抱合体は、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%及び最も好ましくは少なくとも95%アルブミンのものと同じアミノ酸配列を有するアルブミン相同体と共に形成されていてもよい。特定の実施態様において、アルブミン相同体は、遊離システインを含む。特定の実施態様において、アルブミン相同体は、単一の遊離システインを含む。一部の実施態様において、アルブミン相同体は、遊離システイン34を含む。
一部の実施態様において、本発明の方法によって形成された抱合体には、アルブミンの構造誘導体を含む。アルブミンの構造誘導体は、アルブミンタイプの活性を有するタンパク質又はペプチド、例えばアルブミンの機能的断片を含んでいてもよい。一部の実施態様において、誘導体は、アルブミンの抗原決定基、すなわち抗アルブミン抗体によって認識され得るポリペプチドの一部である。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、ヒト血清アルブミンをコードする遺伝子の修飾によって得ることができるであろう高い血漿半減期をもつ任意のタンパク質であってもよい。例えば、及び限定されないが、組換えアルブミンは、米国特許第6,787,636号(その内容は、その全体が引用により組み込まれている)に記載されているように、微量金属、例えばニッケル及び/又は銅の結合が減少され、又は除去されるように、アルブミンの微量金属結合領域に挿入又は欠失を含んでいてもよい。アルブミンの微量金属結合の減少は、アルブミン組成物で治療される対象における微量金属に対するアレルギー反応の可能性を減少させるために有利であろう。
アルブミンの構造誘導体は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニン走査及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)突然変異誘発を含むが、限定されない当業者に公知の任意の方法を使用して産生してもよい。部位特異的変異誘発(Carterの論文、Biochem. J. 237: 1-7 (1986); Zoller及びSmithの論文、Methods Enzymol. 154:329-50 (1987)を参照されたい)、カセット突然変異誘発、制限選択突然変異誘発(Wellsらの論文、Gene 34:3 15-323 (1985))又はその他の公知の技術をクローン化されたアルブミンをコードするDNAに対して行って、アルブミン変異体DNA又はアルブミンの構造誘導体をコードする配列を産生することができる(Ausubelらの文献、分子生成物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、John Wiley and Sons、New York(現在の版); Sambrookらの文献、分子クローニング。実験室マニュアル(Molecular Cloning, A Laboratory Manual)、第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor、New York(2001)。これらの内容は、これらの全体が引用により本明細書に組み込まれている。
特定の実施態様において、アルブミン誘導体には、アルブミンタンパク質のインビトロでの修飾によって得られる高血漿半減期をもつ任意の巨大分子を含む。一部の実施態様において、アルブミンは、脂肪酸で修飾される。一部の実施態様において、アルブミンは、金属イオンで修飾される。一部の実施態様において、アルブミンは、アルブミンに対して高親和性を有する小分子で修飾される。一部の実施態様において、アルブミンは、グルコース、ラクトース、マンノース及びガラクトースを含むが、限定されない糖で修飾される。
一部の実施態様において、本明細書に記述した方法によって形成された抱合体は、治療的タンパク質又はその断片若しくは変異体に融合されたアルブミン融合タンパク質、すなわちアルブミン分子又はその断片若しくは変異体を含むことができる。アルブミン融合タンパク質は、アルブミンの全て又は一部をコードするポリヌクレオチドに連結された治療的タンパク質の全て又は一部をコードするポリヌクレオチドを含む核酸の翻訳によって産生してもよい。当業者に公知の任意のアルブミン融合タンパク質を使用して本発明の方法に従った抱合体を形成してもよい。例示的なアルブミン融合タンパク質は、米国特許番号6,548,653号、第6,686,179号、第6,905,688号、第6,994,857号、第7,045,318号、第7,056,701号及び第7,141,547号に記述されている。これらの内容は、これらの全体が引用により本明細書に組み込まれている。一部の実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、米国特許第7,141,547号に記載されているように、グルカゴン様ペプチド1に融合されたアルブミン又はその断片若しくは変異体で構成される。一部の実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、エキセンディン-3又はその断片若しくは変異体に融合されたアルブミン又はその断片若しくは変異体で構成される。一部の実施態様において、アルブミン融合タンパク質は、エキセンディン-4又はその断片もしくは変異体に融合されたアルブミン又はその断片若しくは変異体で構成される。
本発明に従った抱合体を形成するために使用されるアルブミンは、当業者に公知の方法又は材料を使用して得てもよい。例えば、アルブミンは、市販の供与源、例えばNovozymes 社(Davis、CA;サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)に由来する組換えヒトアルブミン);Cortex-Biochem(San Leandro, Calif:血清アルブミン)、Talecris Biotherapeutics(Research Triangle Park、North Carolina;血清アルブミン)、ZLB Behring(King of Prussia. PA)又はNew Century Pharmaceuticals(Hunstsville,Ala.:ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に由来する組換えヒトアルブミン)から得ることができる。
(5.6 宿主細胞における組換えアルブミンの産生)
特定の実施態様において、抱合のための組換えアルブミンを産生するために、アルブミン又はその変異体若しくは誘導体をコードするDNAを適切な宿主細胞に発現させることができる。従って、アルブミンをコードする発現ベクターは、発現ベクターを構築するための当業者に公知の任意の技術に従って構築してもよい。次いで、本明細書に記述した方法によって抱合体を形成するために使用されるアルブミンの発現及び産生のために、ベクターを使用して適切な宿主細胞を形質転換してもよい。
特定の実施態様において、抱合のための組換えアルブミンを産生するために、アルブミン又はその変異体若しくは誘導体をコードするDNAを適切な宿主細胞に発現させることができる。従って、アルブミンをコードする発現ベクターは、発現ベクターを構築するための当業者に公知の任意の技術に従って構築してもよい。次いで、本明細書に記述した方法によって抱合体を形成するために使用されるアルブミンの発現及び産生のために、ベクターを使用して適切な宿主細胞を形質転換してもよい。
(5.6.1 発現ベクター)
一般に、発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチド分子である。発現ベクターは、mRNAの安定な転写及び翻訳を生じるために、適切なプロモーター、複製配列、選択可能なマーカーなどの包含によって原核生物又は真核生物において機能するように容易に適応させることができる。発現ベクターの構築及び発現ベクターを含む細胞における遺伝子の発現のための技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Sambrookらの文献、2001、分子クローニング--実験室マニュアル(Molecular Cloning A Laboratory Manual)第3版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY及びAusubelらの文献、編集、現在の版、分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience. NYを参照されたい。
一般に、発現ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチド分子である。発現ベクターは、mRNAの安定な転写及び翻訳を生じるために、適切なプロモーター、複製配列、選択可能なマーカーなどの包含によって原核生物又は真核生物において機能するように容易に適応させることができる。発現ベクターの構築及び発現ベクターを含む細胞における遺伝子の発現のための技術は、当該技術分野において周知である。例えば、Sambrookらの文献、2001、分子クローニング--実験室マニュアル(Molecular Cloning A Laboratory Manual)第3版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY及びAusubelらの文献、編集、現在の版、分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience. NYを参照されたい。
多様な宿主-ベクター系を利用して、アルブミンをコードする配列を発現させてもよい。これらには、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、その他)に感染させた哺乳動物細胞系:ウイルス(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系:酵母ベクターを含む酵母などの微生物:バクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA又はコスミドDNAで形質転換された細菌;又はプラスミドDNAをトランスフェクトしたヒト株化細胞を含むが、限定されない。ベクターの発現エレメントにより、これらの強度及び特異性が変化する。利用される宿主-ベクター系に応じて、多数の適切な転写及び翻訳エレメントの任意のものを使用してもよい。一部の実施態様において、ヒトアルブミンcDNAが発現される。一部の実施態様において、アルブミンの分子変異体が発現される。一部の実施態様において、アルブミン前駆体が発現される。一部の実施態様において、アルブミンの構造誘導体が発現される。一部の実施態様において、アルブミン融合タンパク質が発現される。
アルブミンの発現は、当該技術分野において公知の任意のプロモーター/エンハンサーエレメントによって制御されていてもよい。特定の実施態様において、プロモーターは、特異的なアルブミンをコードする遺伝子又は核酸配列に異種である(すなわち、天然のプロモーターではない)。哺乳動物細胞におけるアルブミンをコードする遺伝子又は核酸配列の発現を制御するために使用してもよいプロモーターは、SV40前期プロモーター領域(Bernoist及びChambon(Nature 290):304-3 10(1981))、ラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含まれるプロモーター(Yamamotoらの論文、Cell 22:787-797(1980))、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445 (1981))及びメタロチオネイン遺伝子の制御配列(Brinsterらの論文、Nature 296:39-42(1982))を含むが、限定されない。
原核生物の発現ベクターに有用であろうプロモーターには、β-ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroffらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731(1978))又はtatプロモーター(DeBoerらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci.:S.A. 80:2 1-25(1983))を含むが、限定されない。また、Scientific American 242:74-94 (1980)の「組換え細菌由来の有用なタンパク質(Useful Proteins From Recombinant Bacteria)」を参照されたい。これらの内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。
植物発現ベクターに有用であろうプロモーターには、ノパリンシンセターゼプロモーター領域(Herrera-Estrellaらの論文、Nature 303:209-213(1983))、カリフラワーモザイクウィルス35S RNAプロモーター(Gardnerらの論文、Nucleic Acids Res. 9:2871(1981))及び光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター(Herrera-Estrellaらの論文、Nature 310:115-120(1984))を含むが、限定されない。
酵母又はその他の真菌におけるアルブミンの発現のために有用なプロモーターエレメントは、Gal4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター又はAOX1(アルコールオキシダーゼ1)プロモーター(Ellisらの論文、Mol. Cell. Biol. 5:1111-1121(1985))を含む。
酵母又はその他の真菌におけるアルブミンの発現のために有用なプロモーターエレメントは、Gal4プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモーター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター又はAOX1(アルコールオキシダーゼ1)プロモーター(Ellisらの論文、Mol. Cell. Biol. 5:1111-1121(1985))を含む。
宿主細胞の培養液への組換えアルブミンの分泌が要求される本発明の実施態様において、発現ベクターには、アルブミンをコードする配列の上流に、又は適切な場合、転写及び翻訳の開始のための領域とコード配列との間に位置する、新生ポリペプチドを選択された宿主の分泌経路に向ける「リーダー」配列を更に含んでいてもよい。一部の実施態様において、リーダー配列は、ヒト血清アルブミンの天然のリーダー配列であってもよい。その他の実施態様において、リーダー配列は、異種配列である。使用されるリーダー配列の選択は、主に選択される宿主生物によって導かれる。例えば宿主が酵母である場合、異種リーダー配列として、フェロモン因子α、インベルターゼ又は酸性ホスファターゼのものを使用することができる。詳細な実施態様において、リーダー配列は、サッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)α因子プレプロペプチドのものであってもよい。Creggらの論文、Biotechnology 11:905-910(1993):Scorerらの論文、Gene 136:111-119(1993)を参照されたい。その他の実施態様において、宿主が細菌である場合、リーダー配列は、α-アミラーゼamyBamp又は中性プロテアーゼnprBamPであってもよい。枯草菌(Bacillus sublilis)における組換えヒト血清アルブミンの分泌のためのこれらのリーダー配列の使用は、Saundersらの論文、J. Bacteriol 169(7):29 17-25(1987)によって記述されている。これらの内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。或いは、細胞膜周辺腔への組換えアルブミンの輸送のためのSec経路を利用してもよい。Sec転位酵素は、細菌において細胞質膜を横切ってサイトゾルからのタンパク質転位置の主要な経路を提供する。例えば、Pugsley APの論文、Microbiol. Rev., 57(l):50-108 (1993)を参照されたい。SecA ATPaseは、新たに合成されたプレタンパク質の膜横断移動を駆動するためのSecYEG統合膜成分と動的に相互作用する。成熟前タンパク質は、大腸菌(E.coli.)における組換えタンパク質の効率的な分泌生産のための、pelB、ompA及びpho.4などのこれらを細胞質の外側に輸送することができる短いシグナル配列を含む。
(5.6.2 組換えアルブミンを産生するための宿主細胞)
アルブミンをコードする配列を含む発現ベクターを、組換えアルブミンの産生のために宿主細胞に導入してもよい。一部の実施態様において、外来性組換えタンパク質を産生することができる任意の細胞が、本明細書に記述した方法のために有用であろう。
アルブミンをコードする配列を含む発現ベクターを、組換えアルブミンの産生のために宿主細胞に導入してもよい。一部の実施態様において、外来性組換えタンパク質を産生することができる任意の細胞が、本明細書に記述した方法のために有用であろう。
一部の実施態様において、宿主生物は、細菌株、例えば大腸菌(Escherichia coli)及び枯草菌(Bacillus subtilis)であることができる。一部の実施態様において、宿主生物は、酵母株、例えばサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)及びハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)であることができる。特定の実施態様において、宿主生物は、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)である。
一部の実施態様において、組換えアルブミンは、ウイルス、例えばバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞において産生される。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、動物細胞において産生される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、アルブミン又はその変異体若しくは誘導体をコードするベクターで形質転換され、又はウイルスに感染させた哺乳動物細胞によって産生される。特定の実施態様において、哺乳動物細胞は、COS、CHO又はC127細胞である。特定の実施態様において、哺乳動物細胞は、ヒト網膜株化細胞PKR.C6*である
一部の実施態様において、組換えアルブミンは、トランスジェニック非ヒト動物において産生される。動物は、哺乳類、例えば有蹄類(例えば、ウシ、ヤギ又はヒツジ)ブタ、マウス又はウサギであってもよい。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、米国特許第5,648,243号(その内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている)に記載されているように動物の乳に分泌した。その他の実施態様において、組換えアルブミンは、米国特許第6,949,691号(その内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている)に記載されているように、動物の血液に分泌される。その他の実施態様において、組換えアルブミンは、米国特許出願第11/401,390号(その内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている)に記載されているように、動物の尿に分泌される。胚操作及び微量注入を介してトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を産生するための方法は、当該技術分野において従来法である。例えば、米国特許第4,870,009号、第4,736,866号及び第4,873,191号を参照されたい。これらの内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。組換えアルブミンを発現するその他の非マウストランスジェニック動物を同様の方法によって作製してもよい。
一部の実施態様において、宿主生物は、組換えアルブミンを発現するために形質転換された植物細胞である。植物細胞においてヒト血清アルブミンを発現するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Sijmonsらの論文、Biotechnology 8(3):217-21(1990);Farranらの論文、Transgenic Res. 11(4):337-46(2002);Fernandez-San Millanらの論文、Plant Biotechnol. J. 1(2):71-9(2003);Baurらの論文、Plant Biotechnol. J. 3(3):331-40(2005);及び米国特許出願第11/406,522号を参照されたい;これらの内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。
(5.6.3 宿主細胞の形質転換)
発現ベクターは、限定されないが、当業者に公知の任意の方法によって、発現のための宿主細胞に導入することができる。このような方法は、例えば溶液からの細胞による分子の直接の取り込み;又は例えば、リポソーム又は免疫リポソームを使用するリポフェクションを介した促進された取り込み;粒子を媒介したトランスフェクション;などを含むが、限定されない。例えば、米国特許第5,272,065号;Goeddelらの文献、編集、1990、酵素学の方法(Methods in Enzymology)、185巻、Academic Press社、CA; Kriegerの文献、1990.遺伝子導入及び発現-実験室マニュアル(Gene Transfer and Expression-A Laboratory Manual)、Stockton Press, NY; Sambrookらの文献、1989. 分子クローニング-実験室マニュアル(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory. NY;及びAusubelらの文献、編集、現在の版、分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience. NYを参照されたい。
発現ベクターは、限定されないが、当業者に公知の任意の方法によって、発現のための宿主細胞に導入することができる。このような方法は、例えば溶液からの細胞による分子の直接の取り込み;又は例えば、リポソーム又は免疫リポソームを使用するリポフェクションを介した促進された取り込み;粒子を媒介したトランスフェクション;などを含むが、限定されない。例えば、米国特許第5,272,065号;Goeddelらの文献、編集、1990、酵素学の方法(Methods in Enzymology)、185巻、Academic Press社、CA; Kriegerの文献、1990.遺伝子導入及び発現-実験室マニュアル(Gene Transfer and Expression-A Laboratory Manual)、Stockton Press, NY; Sambrookらの文献、1989. 分子クローニング-実験室マニュアル(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor Laboratory. NY;及びAusubelらの文献、編集、現在の版、分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience. NYを参照されたい。
本発明の特定の実施態様において、組換えアルブミンは、酵母細胞において、特にピチア・パストリス(Pichia pastoris)において産生される。ピチア(Pichia)を形質転換するための方法は、当該技術分野において周知である。Hinnenらの論文、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292-3(1978);Creggらの論文、Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385(1985)を参照されたい。例示的な技術には、スフェロプラスト化(spheroplasting)、電気穿孔法、PEG 1000を媒介した形質転換又は塩化リチウムを媒介した形質転換を含むが、限定されない。
(5.6.4 組換えアルブミンの発現)
組換えタンパク質を発現する宿主生物の増幅、誘導及び発酵のための方法は、当該技術分野において周知である。例えばAusubelらの文献、編集、現在の版、分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience. NYを参照されたい。例えば、及び限定されないが、酵母、例えばピチア・パストリス(Pichia pastoris)における組換えタンパク質の発現のための一般的な手順は、以下の通りである:250mlのバッフルフラスコ内の25mlの適切な培養液に単一の組換えコロニーを使用して播種する。細胞が対数増殖期であるOD600=2〜6(およそ16〜18時間)に達するまで、細胞を28〜30℃において振盪培養器(250-300rpm)にて培養する。次いで、細胞を室温で1500〜3000×gにて5分間遠心分離することによって収集してもよい。上清をデカントして、細胞ペレットを、発現を誘導するために適した培養液(およそ100-200ml)中で1.0のOD600に再懸濁する。次いで、培養液を、2層の滅菌ガーゼ又はチーズクロスを備えた1リットルのバッフルフラスコ内に置いて、連続培養のためにインキュベーターに戻してもよい。誘導を維持するために、適切な誘導薬を24時間毎に培養に添加してもよい。培養試料を周期的に採取して(時点(時間):0、 6、12、24(1日)、36、48(2日)、60、72(3日)、84及び96(4日)、収集のための導入後の最適時間を決定するための発現レベルを解析るために使用した。次いで、細胞を卓上マイクロ遠心機において最大速度にて室温で2〜3分間遠心分離してもよい。組換えタンパク質が分泌される場合、上清を分離したチューブへ移してもよい。上清及び細胞ペレットは、アッセイのための準備まで-80℃に貯蔵してもよい。細胞内発現のためには、上清をデカントして、細胞ペレットをアッセイのための準備まで-80℃に貯蔵してもよい。次いで、上清及び細胞ペレットを、例えばクマシー染色SDS-PAGE及びウェスタンブロット又は機能的アッセイ法によって、タンパク質発現についてアッセイしてもよい。
組換えタンパク質を発現する宿主生物の増幅、誘導及び発酵のための方法は、当該技術分野において周知である。例えばAusubelらの文献、編集、現在の版、分子生物学の現在のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)、Greene Publishing Associates and Wiley Interscience. NYを参照されたい。例えば、及び限定されないが、酵母、例えばピチア・パストリス(Pichia pastoris)における組換えタンパク質の発現のための一般的な手順は、以下の通りである:250mlのバッフルフラスコ内の25mlの適切な培養液に単一の組換えコロニーを使用して播種する。細胞が対数増殖期であるOD600=2〜6(およそ16〜18時間)に達するまで、細胞を28〜30℃において振盪培養器(250-300rpm)にて培養する。次いで、細胞を室温で1500〜3000×gにて5分間遠心分離することによって収集してもよい。上清をデカントして、細胞ペレットを、発現を誘導するために適した培養液(およそ100-200ml)中で1.0のOD600に再懸濁する。次いで、培養液を、2層の滅菌ガーゼ又はチーズクロスを備えた1リットルのバッフルフラスコ内に置いて、連続培養のためにインキュベーターに戻してもよい。誘導を維持するために、適切な誘導薬を24時間毎に培養に添加してもよい。培養試料を周期的に採取して(時点(時間):0、 6、12、24(1日)、36、48(2日)、60、72(3日)、84及び96(4日)、収集のための導入後の最適時間を決定するための発現レベルを解析るために使用した。次いで、細胞を卓上マイクロ遠心機において最大速度にて室温で2〜3分間遠心分離してもよい。組換えタンパク質が分泌される場合、上清を分離したチューブへ移してもよい。上清及び細胞ペレットは、アッセイのための準備まで-80℃に貯蔵してもよい。細胞内発現のためには、上清をデカントして、細胞ペレットをアッセイのための準備まで-80℃に貯蔵してもよい。次いで、上清及び細胞ペレットを、例えばクマシー染色SDS-PAGE及びウェスタンブロット又は機能的アッセイ法によって、タンパク質発現についてアッセイしてもよい。
(5.7 宿主細胞からの組換えアルブミンの精製)
本発明の一つの態様において、抱合体を産生するための方法には、任意に抱合反応の前に宿主生物から組換えアルブミンを精製することを含む。以下の工程は、連続した順序で示してあるが、当業者であれば、本発明の範囲を越えることなく、いくつかの工程の順序、例えばメルカプトアルブミンの濃縮の工程とアルブミンの脱糖化工程の順序を交換することができることを認識するであろう。特定の実施態様において、分泌された組換えアルブミンに対する抱合は、培養液中で直接生じることが望ましく、以下の精製工程を省略してもよく、また抱合は、下記の節に記載されているように行ってもよいことが理解される。
本発明の一つの態様において、抱合体を産生するための方法には、任意に抱合反応の前に宿主生物から組換えアルブミンを精製することを含む。以下の工程は、連続した順序で示してあるが、当業者であれば、本発明の範囲を越えることなく、いくつかの工程の順序、例えばメルカプトアルブミンの濃縮の工程とアルブミンの脱糖化工程の順序を交換することができることを認識するであろう。特定の実施態様において、分泌された組換えアルブミンに対する抱合は、培養液中で直接生じることが望ましく、以下の精製工程を省略してもよく、また抱合は、下記の節に記載されているように行ってもよいことが理解される。
(5.7.1 培養液からの宿主細胞の分離)
特定の実施態様において、本発明の方法は、宿主細胞が液体培地において培養され、かつ組換えアルブミンがその中に分泌される場合、抱合反応より前の培養液からの宿主細胞の分離を提供する。宿主細胞をその培養液から分離するための当該技術分野において公知の任意の方法を使用してもよい。一部の実施態様において、宿主細胞は、濾過によって培養液から除去してもよい。好ましい実施態様において、宿主細胞は、遠心分離によって培養液から分離してもよい。分離に続いて、生じる上清を更にその中に含まれる組換えアルブミンの精製のために使用してもよい。任意に、抱合が培養上清中で直接生じることが望まれる場合、以下の工程を省略してもよく、かつ抱合を下記の節に記載されているように行ってもよい。
特定の実施態様において、本発明の方法は、宿主細胞が液体培地において培養され、かつ組換えアルブミンがその中に分泌される場合、抱合反応より前の培養液からの宿主細胞の分離を提供する。宿主細胞をその培養液から分離するための当該技術分野において公知の任意の方法を使用してもよい。一部の実施態様において、宿主細胞は、濾過によって培養液から除去してもよい。好ましい実施態様において、宿主細胞は、遠心分離によって培養液から分離してもよい。分離に続いて、生じる上清を更にその中に含まれる組換えアルブミンの精製のために使用してもよい。任意に、抱合が培養上清中で直接生じることが望まれる場合、以下の工程を省略してもよく、かつ抱合を下記の節に記載されているように行ってもよい。
(5.7.2 宿主細胞の溶解)
特定の実施態様において、本発明の方法は、任意に、宿主細胞が液体培地において培養され、かつ組換えアルブミンが主に細胞内に貯蔵される場合、抱合反応より前の宿主細胞の溶解を提供する。当業者に公知の細胞を溶解する任意の方法を使用してもよい。一部の実施態様において、宿主細胞は、機械的方法によって、例えば高速ブレンダー,ボルテックス、ホモジナイザー、フレンチプレス、マントンゴウリン(Menton Gaulin)プレス又は超音波処理器を使用することによって溶解してもよい。
特定の実施態様において、本発明の方法は、任意に、宿主細胞が液体培地において培養され、かつ組換えアルブミンが主に細胞内に貯蔵される場合、抱合反応より前の宿主細胞の溶解を提供する。当業者に公知の細胞を溶解する任意の方法を使用してもよい。一部の実施態様において、宿主細胞は、機械的方法によって、例えば高速ブレンダー,ボルテックス、ホモジナイザー、フレンチプレス、マントンゴウリン(Menton Gaulin)プレス又は超音波処理器を使用することによって溶解してもよい。
宿主生物が酵母である詳細な実施態様において、細胞溶解は、酵母細胞を溶解するための当業者に公知の任意の方法によって達成してもよい。一部の実施態様において、細胞は、最初にリティカーゼ(lyticase)又はザイモラーゼ(zymolase)を含む溶液と接触させることによって、細胞をスフェロプラストに変換し、次いで浸透圧ショック若しくは加圧型細胞破砕装置又はこれらの組み合わせにスフェロプラストを供することによって溶解してもよい。浸透圧ショックは、当業者に公知の任意の低浸透ポテンシャル溶液との接触によって達成してもよい。特定の実施態様において、浸透圧ショックは、スフェロプラストを脱イオン水と接触させることによって達成してもよい。その他の実施態様において、酵母細胞の細胞溶解は、ガラスビーズの存在下においてボルテックスすることによって、細胞の機械的切断によって達成してもよい。
宿主生物が細菌である詳細な実施態様において、細胞溶解は、細菌細胞を溶解するために当業者に公知の任意の方法によって達成してもよい。一部の実施態様において、細胞溶解は、EDTAなどのキレート薬の存在下において細胞をリゾチーム溶液と接触させることによって達成してもよい。
アルブミンが細菌細胞に発現される詳細な実施態様において、抱合のために適切に折り畳まれた組換えアルブミンを得るために、さらなる工程を行うことが必要であってもよい。細菌、特に大腸菌(E. Coli)に大量に発現される真核生物タンパク質は、「封入体」と呼ばれる不溶性凝集体内に沈殿することが多い。Braunらの論文、Proc. Natl Acad. Sci. USA 99:2654-59 (2002)を参照されたい。封入体は、単離して、精製して、変性剤で可溶化し、続いてその後に組成タンパク質の再生を行わなければならない。単純な希釈、マトリックス支援法及び再生緩衝液への溶質の添加を利用するタンパク質再折り畳みの方法論は、当該技術分野において周知である。例えば、Cabritaらの論文、Biotechnol. Annu Rev. 10:31-50 (2004): Mayerらの論文、Methods Mol. Med. 94:239-254 (2004); Middelbergの論文、Trends Biolechnol. 20:437-443 (2002); Clark, Curr. Opin. Biotechnol. 9:157-163 (1998);及びClarkの論文、Curr. Opin. Biotechnol. 12:202-207 (2001)を参照されたい。これらの内容は、これらの全体が引用により本明細書に組み込まれている。従って、細菌に発現された真核生物タンパク質を回収して、再生するための当業者に公知の任意の方法を使用して、細菌に発現される組換えアルブミンを回収して、再生してもよい。
宿主細胞の溶解後、細胞片及び粒子状物質を粗製可溶化液から分離してもよい。粗製可溶化液から細胞片を分離するための当該技術分野において公知の任意の方法を使用してもよい。一部の実施態様において、細胞片及び粒子状物質は、微量濾過によって除去してもよい。好ましい実施態様において、細片及び粒子の除去は、遠心分離によって達成される。生じる透明な可溶化液を、その中に含まれる組換えアルブミンの精製のために更に使用してもよい。任意に、抱合が透明溶解液において直接生じることが望まれる場合、以下の工程を省略してもよく、抱合を下記の第5.8節に記載されているように行ってもよい。
(5.7.3 クロマトグラフィーによる組換えアルブミンの精製)
特定の実施態様において、本発明の方法は、任意に、抱合反応の前に、宿主タンパク質及び抗原を除去するための、クロマトグラフィーによる組換えアルブミン、粒子状物質、内毒素などの精製を提供する。特定の実施態様において、クロマトグラフィーは、タンパク質の精製のために有用な当業者に公知の任意のクロマトグラフィー法であることができる。例えば、及び限定されないが、クロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーであることができる。
特定の実施態様において、本発明の方法は、任意に、抱合反応の前に、宿主タンパク質及び抗原を除去するための、クロマトグラフィーによる組換えアルブミン、粒子状物質、内毒素などの精製を提供する。特定の実施態様において、クロマトグラフィーは、タンパク質の精製のために有用な当業者に公知の任意のクロマトグラフィー法であることができる。例えば、及び限定されないが、クロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー又は疎水性相互作用クロマトグラフィーであることができる。
一部の実施態様において、組換えアルブミンは、イオン交換クロマトグラフィーによって精製される。当業者の判断に従って、アルブミンに結合することができる任意のイオン交換樹脂を使用してもよい。一部の実施態様において、イオン交換体は、ジエチルアミノエチル(DEAE)-セルロースなどの弱い塩基性の陰イオン交換体である。特定の実施態様において、DEAEセルロース樹脂は、10mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0において平衡化される。充填及び樹脂への結合に続いて、アルブミンは、直線的若しくは段階的にいずれかで塩濃度を増加させる勾配又はこれらの組み合わせを適用することによって溶出させてもよい。例えば、アルブミンは、20〜200mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0を含む溶液と樹脂を接触させることによって溶出させてもよい。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を30〜150mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0を含む溶液と接触させることによって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を40〜125mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0と接触させることによって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を50〜100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0と接触させることによって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を約60mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0と接触させることによって溶出される。これらの条件下における組換えアルブミンの例示的な精製を以下の実施例1に提供してある。
その他の実施態様において、イオン交換体は、Qセファロースなどの強塩基性の陰イオン交換体である。特定の実施態様において、Qセファロース樹脂は、20mM Tris-HCl緩衝液、pH 8.0において平衡化される。充填及び樹脂への結合に続いて、アルブミンは、直線的若しくは段階的にいずれかで塩濃度を増加させる勾配又はこれらの組み合わせを適用することによって溶出させてもよい。例えば、アルブミンは、樹脂を0〜2M NaCl pH 8.0を含む溶液と接触させることによって溶出させてもよい。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を0.1〜1M NaCl、pH 8.0を含む溶液と接触させることによって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を200〜900mM NaCl、pH 8.0と接触させることによって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を300〜800mM NaCl pH 8.0と接触させることによって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を約500mMリン酸ナトリウム緩衝液pH 8.0と接触させることによって溶出される。これらの条件下における組換えアルブミンの例示的精製を下記の実施例2に提供してある。
一部の実施態様において、組換えアルブミンは、アフィニティークロマトグラフィーによって精製される。当業者の判断に従って、アルブミンに結合することができるアフィニティークロマトグラフィーリガンドを使用してもよい。一部の実施態様において、リガンドは、例えばHiTrap(商標)Blue HPカラム(GE Healthcare. Piscataway. NJ)に含まれるシバクロンブルーF3G-Aである。特定の実施態様において、リガンドは、20mM Tris-HCl pH 8.0緩衝液において平衡化される。シバクロンブルーF3G-Aは、芳香族陰イオン配位子との静電気的及び/又は疎水性相互作用によってアルブミンに結合するので、溶出は、直線的若しくは段階的にいずれかで塩濃度を増加させて、又はこれらの組み合わせて適用することによって達成してもよい。従って、充填及びリガンドへの結合に続いて、アルブミンの溶出は、例えばリガンドを0〜2M NaCl pH 8.0を含む溶液と接触させることによって達成してもよい。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を0.2〜1.5mM NaCl、pH 8.0と接触させることによって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を0.5〜1.0mM NaCl pH 8.0と接触させることによって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、樹脂を約750mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 8.0と接触させることによって溶出される。これらの条件下における組換えアルブミンの例示的精製を下記の実施例3に提供してある。
一部の実施態様において、組換えアルブミンは、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製される。当業者の判断に従って、アルブミンに結合することができる任意の疎水性の樹脂を使用してもよい。例示的疎水性樹脂には、オクチルセファロース、フェニルセファロース及びブチルセファロースを含むが、限定されない。特定の実施態様において、疎水性樹脂は、フェニルセファロースである。特定の実施態様において、例えば、フェニルセファロース樹脂は、20mMリン酸ナトリウム、5mMカプリル酸ナトリウム及び750mM(NH4)2SO4、pH 7.0を含む緩衝液中で平衡化される。充填及び樹脂への結合に続いて、アルブミンは、直線的若しくは段階的にいずれかで塩濃度を減少させる勾配又はこれらの組み合わせを適用することによって溶出させてもよい。例えば、アルブミンは、0〜750mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出さてもよい。一部の実施態様において、アルブミンは、約300〜500mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、約350〜450mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、約375〜425mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出される。特定の実施態様において、アルブミンは、約400mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出される。これらの条件下における組換えアルブミンの例示的精製は、下記の実施例4に提供してある。
特定の実施態様において、組換えアルブミンを含む溶出液は、低分子量フィルターで濾過して、試料を濃縮し、残留する内毒素などを洗浄してもよい。一部の実施態様において、限外濾過は、Amicon(登録商標)10kDaミリポアフィルター(Millipore Corporation.Bedford, Mass.)で行ってもよい。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、滅菌水で洗浄してもよい。その他の実施態様において、組換えアルブミンは、0.9%の生理食塩水(154mM NaCl)で洗浄してもよい。その他の実施態様において、組換えアルブミンは、無菌の緩衝液で洗浄してもよい。
特定の実施態様において、アルブミン溶液は、約0.5〜25%のアルブミンに対応する約5〜250mg/mlの総タンパク質に濃縮してもよい。一部の実施態様において、アルブミン溶液の終濃度は、約5mg/ml、約10mg/ml、約20mg/ml、約40mg/ml、約80mg/ml、約120mg/ml、約150mg/ml、約175mg/ml、約200mg/ml、約225mg/ml又は約250mg/mlの総タンパク質を含む。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、約0.5%、約1%。約2%、約4%。約8%、約12%、約15%、約17.5%、約20%又は約25%のアルブミンを含む。次いで、アルブミン試料は、所望の製剤組成物に再び製剤化してもよい。
次いで、生じる組換えアルブミン溶液を組換えアルブミンのさらなる精製、例えばメルカプトアルブミンの濃縮若しくは脱糖化又は両方のために使用する。任意に、抱合が部分的に精製されたアルブミン溶液中で直接生じることが望まれる場合、以下の工程を省略してもよく、抱合を下記の第5.8節に記載されているように行ってもよい。
(5.7.4 メルカプトアルブミンのための濃縮)
ヒト血清アルブミンの調製は、血清が引き出され、又は組換えで産生されるかにかかわらず、非メルカプトアルブミン、すなわち「キャップされた」アルブミンとメルカプトアルブミン、すなわち「キャップされていない」アルブミンとの不均質混合物を含んでいてもよい。ヒトアルブミンポリペプチドは、35個のシステイニル残基を含み、そのうちの34個は、17個の安定化するジスルフィド架橋を形成する。メルカプトアルブミンの位置34のシステイン残基には、遊離のSH基を含むが、非メルカプトアルブミンにおける同じ残基には、例えばシステイン又はグルタチオンとの混合ジスルフィドを含むか、又は金属イオン又はその他の添加物による酸化受けており、従って、チオールをより反応性でないか、又は利用できなくさせる。任意の特定の作用の理論によって拘束されることを意図しないが、メルカプトアルブミンについての濃縮により、治療的化合物に対する抱合のために有利な特性を有するアルブミンをもたらすであろうことが考えられる。特に、抱合の特異性は、治療的化合物の反応基に共有結合で結合するためのCys34のチオール基の利用能により、増強される。従って、本発明の好ましい実施例において、精製された組換えアルブミンは、抱合反応を進行する前に、メルカプトアルブミンを濃縮させる。
ヒト血清アルブミンの調製は、血清が引き出され、又は組換えで産生されるかにかかわらず、非メルカプトアルブミン、すなわち「キャップされた」アルブミンとメルカプトアルブミン、すなわち「キャップされていない」アルブミンとの不均質混合物を含んでいてもよい。ヒトアルブミンポリペプチドは、35個のシステイニル残基を含み、そのうちの34個は、17個の安定化するジスルフィド架橋を形成する。メルカプトアルブミンの位置34のシステイン残基には、遊離のSH基を含むが、非メルカプトアルブミンにおける同じ残基には、例えばシステイン又はグルタチオンとの混合ジスルフィドを含むか、又は金属イオン又はその他の添加物による酸化受けており、従って、チオールをより反応性でないか、又は利用できなくさせる。任意の特定の作用の理論によって拘束されることを意図しないが、メルカプトアルブミンについての濃縮により、治療的化合物に対する抱合のために有利な特性を有するアルブミンをもたらすであろうことが考えられる。特に、抱合の特異性は、治療的化合物の反応基に共有結合で結合するためのCys34のチオール基の利用能により、増強される。従って、本発明の好ましい実施例において、精製された組換えアルブミンは、抱合反応を進行する前に、メルカプトアルブミンを濃縮させる。
一般に、メルカプトアルブミンの濃縮は、酸化型又は「キャップされた」アルブミンをメルカプトアルブミンに変換するための当業者に公知の任意の技術使用することにより、及び任意の条件下で行ってもよい。一部の実施態様において、濃縮は、組換えアルブミンを酸化型のアルブミン-Cys34を還元型アルブミン-Cys34に変換することができる任意の薬剤と接触させることによって達成される。特定の実施態様において、薬剤は、ジチオスレイトール(DTT)である。好ましい実施態様において、薬剤は、チオグリコール酸(TGA)である。一部の実施態様において、薬剤は、β-メルカプトエタノール(BME)である。一般に、薬剤は、キャップされたアルブミン-Cys34をメルカプトアルブミンに変換するために適した当業者に公知の条件下で組換えアルブミンと接触される。このような条件は、例えば、適切なpHにて、適切な濃度の薬剤にて、適切な温度にて、及び適切な時間、薬剤と組換えアルブミンを接触させることを含む。一般に、当業者であれば、酸化型状態からアルブミン-Cys34を還元させると共に、アルブミンの内鎖ジスルフィド架橋を保存するための要求を考慮するであろう。
特定の実施態様において、組換えアルブミンは、当業者の判断に従って、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するために適下pHにてTGAと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、約5〜6又は約5.2〜5.8又は約5.3〜5.7のpHにてTGAと接触される。詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、約pH 5.6にてTGAと接触される。
特定の実施態様において、組換えアルブミンは、当業者の判断に従って、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するために適した濃度にてTGAと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、適切な緩衝液中で約1mM、約5mM、約10mM、約20mM、約40mM、約60mM、約80mM、約100mM、約150mM、約200mM、約250mM又は約300mMの濃度にてTGAと接触される。特定の実施態様において、TGAの濃度は、適切な緩衝液中で約1〜300mM、約5〜250mM、約10〜200mM、約20〜150mM、約40〜100mM又は約60〜80mMである。詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、250mM Tris酢酸緩衝液中で75mM TGAと接触される。
特定の実施態様において、組換えアルブミンは、当業者の判断に従って、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するために適した温度にてTGAと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、約0〜8℃、約1〜7℃、約2〜6℃又は約3〜5℃にてTGAと接触される。詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、約4℃約にて、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するために十分な時間TGAと接触される。
特定の実施態様において、組換えアルブミンは、当業者の判断に従って、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するために適した延べ時間、TGAと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも0.1、1、5、10、15、20、25又は30時間TGAと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、約5〜30時間、約10〜25時間又は約20〜25時間TGAと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、約8、16、24又は32時間TGAと接触される。詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、250mM Tris-アセテート緩衝液、pH 5.6中で約4℃にて約20時間75mM TGAと接触される。
その他の実施態様において、メルカプトアルブミンの濃縮は、組換えアルブミンDTTとを接触させることによって達成される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、当業者の判断に従って、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するために適したpHにてDTTと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、約7〜8又は約7.2〜7.8又は約7.3〜7.7のpHにて、DTTと接触される。詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、約pH 7.6にてDTTと接触される。
特定の実施態様において、組換えアルブミンは、当業者の判断に従って、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するために適した濃度にてDTTと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、適切な緩衝液中で約0.1mM、約0.25mM、約0.5mM、約0.75mM、約1.0mM、約1.5mM、約2.0mM、約2.5mM、約3.0mM、約3.5mM、約4.0mM又は約5.0mMの濃度にてDTTと接触される。特定の実施態様において、DTTの濃度は、適切な緩衝液中で約0.1〜5.0mM、約0.25〜4mM。約0.5〜3.5mM、約0.75〜3.0mM、約1.0〜2.5mM又は約1.5〜2mMである。詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、1mMリン酸カリウム緩衝液中で約2mM DTTと接触される。
特定の実施態様において、組換えアルブミンは、当業者の判断に従って、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するために適した温度にてDTTと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、約15〜40℃、約20〜35℃、約20〜30℃又は約23〜27℃にてDTTと接触される。詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するために十分時間、約23〜27℃にてDTTと接触される。
特定の実施態様において、組換えアルブミンは、当業者の判断に従って、キャップされたアルブミンをメルカプトアルブミンに変換するための適切な延べ時間、DTTと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25又は30分間DTTと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、約1〜30分、約2〜25分又は約5〜10分間DTTと接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、約1、5、10又は30分間DTTと接触される。詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、1mMリン酸カリウム緩衝液中で約23-27℃にて約5分間 2mM DTTと接触される。
別の実施態様において、メルカプトアルブミンは、クロマトグラフィーによってアルブミンから濃縮してもよい。特定の実施態様において、クロマトグラフィーは、タンパク質を精製するために有用であることが当該技術分野において公知の任意のクロマトグラフィー法であることができる。クロマトグラフィーは、独立した濃縮工程として、又は組み合わせて、すなわちTGA若しくはDTT又はこれらの組み合わせとアルブミンの接触直後に使用してもよい。一部の実施態様において、クロマトグラフィー法によるメルカプトアルブミンの濃縮には、イオン交換、親和性、ゲル濾過又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含むが、限定されないアルブミンの精製のための上記の任意のクロマトグラフィー法を含んでいてもよい。
好ましい実施態様において、メルカプトアルブミンは、TGA又はDTT又はこれらの組み合わせとの接触後に、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって、更に濃縮され、及び精製される。例示的な疎水性樹脂には、オクチルセファロース、フェニルセファロース又はブチルセファロースを含むが、限定されない。好ましい実施態様において、樹脂は、フェニルセファロースである。特定の実施態様において、フェニルセファロース樹脂は、例えば20mMリン酸ナトリウム、5mMカプリル酸ナトリウム及び750mM(NH4)2SO4、pH 7.0を含む緩衝液中で平衡化されている。充填及び樹脂に対する結合後、メルカプトアルブミンは、直線的若しくは段階的にいずれかで塩濃度を減少させる勾配又はこれらの組み合わせを適用することによって、キャップされたアルブミン並びにTGA又はDTTから分離してもよい。例えば、メルカプトアルブミンは、0〜750mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、約400〜600mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、約450〜550mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出される。一部の実施態様において、アルブミンは、約475〜525mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出される。特定の実施態様において、アルブミンは、約500mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出される。これらの条件下で、メルカプトアルブミンは、キャップされたアルブミンの前に溶出してもよい。これらの条件下におけるメルカプトアルブミンの例示的精製は、下記の例5に提供してある。
特定の実施態様において、組換えアルブミンを含む溶出液は、低分子量フィルターで濾過して、試料を濃縮し、残留する内毒素などを洗浄してもよい。一部の実施態様において、限外濾過は、Amicon(登録商標)10kDaミリポアフィルター(Millipore Corporation.Bedford, Mass.)で行ってもよい。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、滅菌水で洗浄してもよい。その他の実施態様において、組換えアルブミンは、0.9%の生理食塩水(154mM NaCl)で洗浄してもよい。
特定の実施態様において、アルブミン溶液は、約0.5〜25%のアルブミンに対応する約5-250mg/mlの総タンパク質に濃縮してもよい。一部の実施態様において、アルブミン溶液の終濃度は、約5mg/ml、、約10mg/ml、約20mg/ml、約40mg/ml、約80mg/ml、約120mg/ml、約150mg/ml、約175mg/ml、約200mg/ml、約225mg/ml又は約250mg/mlの総タンパク質を含む。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、約0.5%、約1%。約2%、約4%。約8%、約12%、約15%、約17.5%、約20%又は約25%のアルブミンを含む。次いで、アルブミン試料は、所望の製剤組成物に再び製剤化してもよい。
溶液中のキャップされたアルブミンに対するメルカプトアルブミンの比の特徴付けは、液体クロマトグラフィー/質量分析によって、例えばKleinovaらの論文、Rapid Connmm. Mass Spectrom. 19:2965-73 (2005)に記述された方法によって行われる。その内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。
次いで、生じるメルカプトアルブミンが濃縮されたアルブミン溶液を、抱合反応の前に、さらなる精製、例えばアルブミンの非酵素的糖化種の還元のために、使用してもよい。任意に、抱合が部分的に精製されたアルブミン溶液中で直接生じることが望まれ流場合、以下の工程を省略してもよく、抱合を下記の第5.8節に記載されているように行ってもよい。
(5.7.5 アルブミンの脱糖化)
宿主生物、特にサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)及びピチア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母株における組換えアルブミンの産生に関する本発明の特定の実施態様において、さらなる工程により、組換えアルブミン産物に付随する不純物のレベルを制限してもよい。特に、血清に由来するヒトアルブミンと比較した組換えヒトアルブミンのグリコシル化プロフィールの潜在的な相違は、アルブミン組成物で治療される対象におけるアレルギー及び/又は免疫応答の可能性を上昇させる。例えば、Bosseらの論文、J. Clin. Pharmacol. 45:57-67 (2005)を参照されたい。更に、アルブミンの非酵素的糖化、例えばLys525及びLys548におけるグルコース結合、並びにこれらの残基におけるアマドリ生成物の形成は、局部的タンパク質二次構造における高次構造変化を誘導することができ、これによりアルブミンのリガンド結合及び機能的活性に影響を及ぼす。例えば、Shaklaiらの論文、J. Biol. Chem. 259(6):3812-17 (1984); Wada, J. Mass. Spectrom. 3 1:263-266 (1996); Howardらの論文、J. Biol. Chem. 280(24):22582-89 (2005)を参照されたい。従って、任意の特定の作用の理論によって拘束されることを意図しないが、アルブミン、特に酵母において産生される組換えアルブミンの脱糖化により、それとともに形成された抱合体に関して、有利な耐容性及び安定性を有するアルブミンを生じるであろうと考えられる。従って、本発明の詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、抱合反応を進行する前に、脱糖化させてもよい。
宿主生物、特にサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)及びピチア・パストリス(Pichia pastoris)などの酵母株における組換えアルブミンの産生に関する本発明の特定の実施態様において、さらなる工程により、組換えアルブミン産物に付随する不純物のレベルを制限してもよい。特に、血清に由来するヒトアルブミンと比較した組換えヒトアルブミンのグリコシル化プロフィールの潜在的な相違は、アルブミン組成物で治療される対象におけるアレルギー及び/又は免疫応答の可能性を上昇させる。例えば、Bosseらの論文、J. Clin. Pharmacol. 45:57-67 (2005)を参照されたい。更に、アルブミンの非酵素的糖化、例えばLys525及びLys548におけるグルコース結合、並びにこれらの残基におけるアマドリ生成物の形成は、局部的タンパク質二次構造における高次構造変化を誘導することができ、これによりアルブミンのリガンド結合及び機能的活性に影響を及ぼす。例えば、Shaklaiらの論文、J. Biol. Chem. 259(6):3812-17 (1984); Wada, J. Mass. Spectrom. 3 1:263-266 (1996); Howardらの論文、J. Biol. Chem. 280(24):22582-89 (2005)を参照されたい。従って、任意の特定の作用の理論によって拘束されることを意図しないが、アルブミン、特に酵母において産生される組換えアルブミンの脱糖化により、それとともに形成された抱合体に関して、有利な耐容性及び安定性を有するアルブミンを生じるであろうと考えられる。従って、本発明の詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、抱合反応を進行する前に、脱糖化させてもよい。
一般に、アルブミンの脱糖化は、非酵素的に糖化されたタンパク質の減少のために有用な当業者に公知の任意の技術を使用することにより、及び任意の条件下で行ってもよい。例示的方法は、Miksik J.らの論文、Chromatogr. B . Biomed. Sci. Appl. 699(1 -2):3 11-45 (1997)に記述されており、その内容は、その全体が引用により本明細書に組み込まれている。一部の実施態様において、非酵素的に糖化されたアルブミンは、クロマトグラフィー法によって減少させられてもよい。特定の実施態様において、クロマトグラフィーは、非糖化タンパク質から糖化タンパク質の分離のために有用な当業者に公知の任意のクロマトグラフィーであることができる。例として、及び限定ではなく、クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又はアフィニティークロマトグラフィーであることができる。
一部の実施態様において、糖化アルブミンと非糖化アルブミンとの分離は、サイズ排除クロマトグラフィーによって行われる。特定の実施態様において、糖化アルブミンを非糖化アルブミンから分離することができる任意のサイズ排除ゲルを、当業者の判断に従って使用してもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーは、例えば0.05M リン酸塩、0.15M 塩化ナトリウム、pH 6.8中で平衡化したSuperose(登録商標)6HR(GE Healthcare、Piscataway、NJ)で行ってもよい。一部の実施態様において、溶出が、約0.5ml/分の流速で、平衡緩衝液中で行ってもよい。
特定の実施態様において、サイズ排除クロマトグラフィーは、例えば0.01Mリン酸緩衝液pH 7.2中で平衡化したセファロース(Sepharose)(登録商標)CL-4B(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)で行ってもよい。一部の実施態様において、溶出は、約20ml/時間の流速で、平衡緩衝液中で行われる。特定の実施態様において、個々の画分は、例えば飽和硫酸アンモニウムに対して透析して、沈殿物を0.01M リン酸緩衝液pH 7.2に再融解させる。
別の実施態様において、糖化アルブミンと非糖化アルブミンとの分離は、イオン交換クロマトグラフィーによって行われる。特定の実施態様において、当業者の判断に従って、糖化アルブミンを非糖化アルブミンから分離することができる任意のイオン交換樹脂を使用してもよい。例えば、イオン交換体は、例えば10mMリン酸緩衝液、pH 7.1中で平衡化されたHydropore AX(Rainin、Woburn、MA)などの強塩基性陰イオン交換体であってもよい。一部の実施態様において充填及び樹脂に対する結合後、アルブミンの溶出は、直線的若しくは段階的にいずれかで塩濃度を増加させる勾配又はこれらの組み合わせを適用することによって行われる。例えば、糖化アルブミン及び非糖化アルブミン種は、0〜1M NaClを含む、pH 7.1の溶液との接触によって分離し、かつ溶出してもよい。その他の実施態様において、イオン交換体は、例えば0.01M リン酸塩、pH 7.2中で平衡化したDEAE Sephacel(GE Healthcare、Piscataway、NJ)などのわずかに塩基性の陰イオン交換体であってもよい。一部の実施態様において、溶出は、0〜0.5M NaClの直線的に増加させる勾配によって、4℃にて行われる。
好ましい実施態様において、脱糖化は、アフィニティークロマトグラフィーによって行われる。当業者の判断に従って、糖化アルブミンを非糖化アルブミンから分離することができる任意のアフィニティーリガンドを使用してもよい。任意の特定の理論によって拘束されることを意図しないが、酵母からグルコースリッチな培養液に分泌される組換えアルブミンは、アルブミンのリジン残基にてグルコースの共有結合を引き起こすと考えられる。従って、糖化アルブミンが共有結合で結合したグルコースで構成される非糖化アルブミンからの糖化アルブミンの分離は、ボロナートアフィニティークロマトグラフィーを使用することにより実施される。特定の実施態様において、アミノフェニルボロナート化されたアガロースは、アフィニティーリガンドとして役立つ。特定の実施態様において、樹脂は、0.25M 酢酸アンモニウム、0.05 M塩化マグネシウム、pH 8.5を含む緩衝液で平衡化される。アルブミン試料の充填及び樹脂に対する糖化種の結合に続いて、非糖化種の溶出を平衡緩衝液で行ってもよい。結合した糖化タンパク質は、アミノフェニルボロナート化されたアガロース樹脂を0.2M ソルビトールを含む0.1MのTris-HCl緩衝液、pH 8.5と接触させることによって溶出させらてもよい。大部分の結合したタンパク質を溶出させた後、0.5% 酢酸を使用してカラムを再生し、及びよりしっかりと結合したタンパク質種をを溶出させる。これらの条件下における糖化アルブミンの非糖化アルブミンからの例示的な分離を下記の実施例6に提供してある。
別の好ましい実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーによるアルブミンの脱糖化は、アフィニティーリガンドとしてコンカナバリンA(ConA)を使用することにより行われる。コンカナバリンAは、種々の糖のα-マンノシル基を内部及び非還元末端に特異的に結合する。特定の条件下において、ConAは、問題の糖がグルコース以外のもの、例えばマンノース、ガラクトース、乳糖などである場合、糖化されたアルブミン種に選択的に結合し得る。更にまた、ConAは、より多くの複雑な、すなわちセリン及び/又はスレオニンなどのアミノ酸残基において見いだされる側鎖酸素原子に対する共有結合を介して組換えアルブミンにO連結される高次糖で構成されるアルブミン種に対して首尾よく結合し得る。一部の実施態様において、ConA樹脂は、1M NaCl、1mM MgCl2、1mM MnCl2、1mM CaCl2を含む0.1Mの酢酸緩衝液、pH 6溶液で平衡化される。アルブミン試料の充填及び樹脂に対する脱糖化種の結合後、非糖化種は、直ちに平衡緩衝液に溶出するが、脱糖化されたアルブミン種の溶出は、平衡緩衝液中の0.1M グルコース、0.1Mマンノースでおこなってもよい。これらの条件下における非糖化アルブミンから糖化アルブミンの例示的な分離は、下記の実施例7に提供してある。
特定の実施態様において、脱糖化されたアルブミンを含む溶出液は、低分子量フィルターで濾過して、試料を濃縮し、残留する内毒素などを洗浄してもよい。一部の実施態様において、限外濾過は、Amicon(登録商標)10kDaミリポアフィルター(Millipore Corporation.Bedford, Mass.)で行ってもよい。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、滅菌水で洗浄してもよい。その他の実施態様において、組換えアルブミンは、0.9%の生理食塩水(154mM NaCl)で洗浄してもよい。その他の実施態様において、組換えアルブミンは、無菌の緩衝液で洗浄してもよい。
特定の実施態様において、アルブミン溶液は、約0.5〜25%のアルブミンに対応する約5〜250mg/mlの総タンパク質に濃縮してもよい。一部の実施態様において、アルブミン溶液の終濃度は、約5mg/ml、、約10mg/ml、約20mg/ml、約40mg/ml、約80mg/ml、約120mg/ml、約150mg/ml、約175mg/ml、約200mg/ml、約225mg/ml又は約250mg/mlの総タンパク質を含む。一部の実施態様において、アルブミン溶液は、約0.5%、約1%。約2%、約4%。約8%、約12%、約15%、約17.5%、約20%又は約25%のアルブミンを含む。次いで、アルブミン試料は、所望の製剤組成物に再び製剤化してもよい。
脱糖化の効率の決定は、糖化されたタンパク質の測定のための当該技術分野において公知の任意の方法に従って行ってもよい。一部の実施態様において、脱糖化効率は、糖化されたアルブミンを測定するために有用な技術において公知の任意のアッセイ法によって決定してもよい。一部の実施態様において、糖化されたアルブミンの測定は、米国特許第5,866,352号(その内容はその全体が引用により本明細書に組み込まれている)に記載されているようなフルクトサミンアッセイ法によって行われる。フルクトサミンは、タンパク質のグルコースとアミノ酸残基との間の非酵素的メイラード反応により形成される。一部の実施態様において、糖化されたアルブミンの測定は、Mashibaらの論文、Clin. Chim. Ada 212:3-15 (1992)によって記述されているように、ニトロブルーテトラゾリウムELBIA)比色法によって行われる。この方法は、アルカリ性溶液における糖化されたタンパク質のケトアミン部分によるNBT還元の原理に基づく。一部の実施態様において、糖化されたアルブミンの測定は、Ikedaらの論文、Clin. Chem. 44(2):256-63 (1998)によって記述されているように、酵素結合のボロナート免疫アッセイ(HLBIA)によって行われる。この方法は、ボロン酸とマイクロタイタープレートウェル上に被覆された抗アルブミン抗体によってトラップされた糖化されたアルブミンのシスジオールとの相互作用に依存する。
(5.7.6 アルブミンの脱グリコシル化)
別の実施態様において、アルブミンの脱グリコシル化は、酵素法によって行ってもよい。酵素は、タンパク質から糖を除去することができる当業者に公知の任意の酵素であることができる。一部の実施態様において、酵素は、エンドグリコシダーゼである。一部の実施態様において、酵素は、エンドグリコシダーゼDである。一部の実施態様において、酵素は、エンドグリコシダーゼHである。一部の実施態様において、酵素は、エンドグリコシダーゼFである。一部の実施態様において、アルブミンの脱糖化は、アルブミンを複数のエンドグリコシダーゼと接触させることによって行われる。一般に、糖化されたアルブミンを当業者に公知の任意の糖の除去のために適した条件下で脱糖化された酵素と接触させる。このような条件は、例えば、適切なpHにおいて、適切な酵素濃度にて、適切な温度にて、及び適切な時間、糖化されたアルブミンを酵素と接触させることを含む。特定の実施態様において、酵素の脱グリコシル化は、上記されたようなクロマトグラフィーの脱糖化工程と組み合わせて、すなわち行ってもよい。
別の実施態様において、アルブミンの脱グリコシル化は、酵素法によって行ってもよい。酵素は、タンパク質から糖を除去することができる当業者に公知の任意の酵素であることができる。一部の実施態様において、酵素は、エンドグリコシダーゼである。一部の実施態様において、酵素は、エンドグリコシダーゼDである。一部の実施態様において、酵素は、エンドグリコシダーゼHである。一部の実施態様において、酵素は、エンドグリコシダーゼFである。一部の実施態様において、アルブミンの脱糖化は、アルブミンを複数のエンドグリコシダーゼと接触させることによって行われる。一般に、糖化されたアルブミンを当業者に公知の任意の糖の除去のために適した条件下で脱糖化された酵素と接触させる。このような条件は、例えば、適切なpHにおいて、適切な酵素濃度にて、適切な温度にて、及び適切な時間、糖化されたアルブミンを酵素と接触させることを含む。特定の実施態様において、酵素の脱グリコシル化は、上記されたようなクロマトグラフィーの脱糖化工程と組み合わせて、すなわち行ってもよい。
(5.7.7 アルブミンの非Cys34反応部位の遮断)
所望の場合、組換えアルブミンは、抱合の好ましい特異性のために、すなわち非Cys34抱合体の形成の可能性を減少させるために、更に処理してもよい。好ましい実施態様において、治療的基及び反応基、好ましくはマレイミド基を含む単一化合物を、アルブミン、又はその断片、変異体若しくは誘導体の単一の定義された部位に共有結合で結合する。特に好ましい実施態様において、アルブミンに対する結合の単一の部位は、Cys34のチオール基である。従って、特定の実施態様において、非Cys34アルブミン抱合体の形成は、アルブミン上のその他の潜在的反応部位を遮断することによって減少させてもよい。
所望の場合、組換えアルブミンは、抱合の好ましい特異性のために、すなわち非Cys34抱合体の形成の可能性を減少させるために、更に処理してもよい。好ましい実施態様において、治療的基及び反応基、好ましくはマレイミド基を含む単一化合物を、アルブミン、又はその断片、変異体若しくは誘導体の単一の定義された部位に共有結合で結合する。特に好ましい実施態様において、アルブミンに対する結合の単一の部位は、Cys34のチオール基である。従って、特定の実施態様において、非Cys34アルブミン抱合体の形成は、アルブミン上のその他の潜在的反応部位を遮断することによって減少させてもよい。
一部の実施態様において、組換えアルブミンは、共有結合性付加体形成をヒト血清アルブミンに対して生じることが公知である残基を化学的に遮断する薬剤と接触されてもよい。Cys34以外のアルブミン上の反応部位を遮断することができる技術分野において公知の任意の薬剤を使用してもよい。一部の実施態様において、薬剤は、リジン残基を遮断する。アルブミンは、52個のリジン残基を含み、そのうちの25〜30個は、アルブミンの表面上に位置して、抱合のために利用可能であろう。従って、一部の実施態様において、薬剤は、共有結合性付加物を形成する可能性を有することが当業者に公知のアルブミンの任意のリジン残基を遮断する。一部の実施態様において、化合物を、アルブミンのLys71を遮断する。一部の実施態様において、化合物は、アルブミンのLysl99を遮断する。一部の実施態様において、薬剤は、アルブミンのLys351を遮断する。一部の実施態様において、薬剤は、アルブミンのLys525を遮断する。一部の実施態様において、薬剤は、アルブミンのLys541を遮断する。
特定の実施態様において、アルブミン上の非Cys34反応部位は、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)との接触によって遮断される。一部の実施態様において、アルブミン上の非Cys34反応部位は、アセチルサリチル酸との接触によって遮断される。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、アルブミンのLys71をアセチル化するために十分な条件下でアセチルサリチル酸と接触される。例えば、Gambhirらの論文、J. Bio. Chem. 250(17):6711-19 (1975)を参照されたい。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、アルブミンのLysl99をアセチル化するために十分な条件下でアセチルサリチル酸と接触させる。例えば、Walkerの論文、FEBS Lett. 66(2): 173-5 (1976)を参照されたい。
一部の実施態様において、アルブミン上の非Cys34反応部位は、ナプロキセンアシル補酵素A(ナプロキセン-CoA)との接触によって遮断される。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、アルブミンLys199、Lys351若しくはLys541又はこれらの組み合わせをアシル化するために十分な条件下で、ナプロキセン-CoAと接触される。例えば、Olsenらの論文、Anal. Biochem. 312(2): 148-56 (2003)を参照されたい。
より好ましい実施態様において、アルブミン上の非Cys34反応部位は、アルブミンの表面上の特定の部位に対して高親和性を有するが、アルブミンの表面上に共有結合性付加物を形態しない分子との接触によって遮断される。一部の実施態様において、非Cys34反応部位は、非Cys34反応性を限定するのを助ける緩衝液中で、例えば中性pHよりも低いpH、すなわち3<pH<7の緩衝液を使用することにより、血清アルブミン又は組換えアルブミンのいずれかを製剤化することにより、反応性を少なくさせ、すなわち求核性を少なくさせる。
(5.8 治療的化合物に対するアルブミンの抱合)
本発明の別の態様において、抱合体を形成する方法には、アルブミンを治療的基及び反応基を含む化合物と、反応基がアルブミンのCys34チオールに共有結合で結合して抱合体を形成することができる反応条件下で接触することを含む。一部の実施態様において、抱合反応は、アルブミンを含む任意の液体培地において進行させてもよい。
本発明の別の態様において、抱合体を形成する方法には、アルブミンを治療的基及び反応基を含む化合物と、反応基がアルブミンのCys34チオールに共有結合で結合して抱合体を形成することができる反応条件下で接触することを含む。一部の実施態様において、抱合反応は、アルブミンを含む任意の液体培地において進行させてもよい。
一部の実施態様において、アルブミンは、組換えアルブミンを発現するトランスジェニック非ヒト動物の血液、乳又は尿中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、組換えアルブミンを産生するように、形質転換された任意の宿主細胞、例えば動物細胞、植物細胞、細菌細胞又は酵母細胞の粗製可溶化液又は透明にした可溶化液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、組換えアルブミンがその中に分泌される、組換えアルブミンを産生する宿主生物の培養液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、精製されたアルブミン溶液、例えば上記の任意のクロマトグラフィー法又はこれらの組み合わせによる精製によって生じる溶液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、血清アルブミン溶液中の化合物によって接触される。
一部の実施態様において、アルブミンは、アルブミンがメルカプトアルブミンについて濃縮される、精製されたアルブミン溶液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、アルブミンが脱糖化されている、精製したアルブミン溶液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、アルブミンの非Cys34反応部位が共有結合又は非共有結合で遮断された、精製されたアルブミン溶液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、アルブミンがメルカプトアルブミンについて濃縮されて、かつ脱糖分されている、精製したアルブミン溶液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、アルブミンがメルカプトアルブミンについて濃縮されており、かつ非Cys34反応部位が共有結合又は非共有結合で遮断されている、精製されたアルブミン溶液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、アルブミンが脱糖化されており、かつ非Cys34反応部位が共有結合又は非共有結合で遮断されている、精製されたアルブミン溶液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。一部の実施態様において、アルブミンは、アルブミンがメルカプトアルブミンについて濃縮されており、かつ非Cys34反応部位が共有結合又は非共有結合で遮断されている、精製されたアルブミン溶液中の化合物によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で接触される。
一般に、化合物の反応基に対する組換えアルブミンのCys34チオールの共有結合を好む反応条件には、適切なpHを含むであろう。任意の特定の理論によって拘束されることを意図しないが、ヒト血清アルブミンは、3.0を下回るpHにてアンフォールドして、細長いランダムコイルに変性されると考えられる。従って、特定の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも3.0のpHにて、化合物と接触される。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、低から中性のpHにて化合物と接触される。詳細な実施態様において、pHは、約4.0〜7.0の間である。一部の実施態様において、pHは、4.0〜5.0の間である。一部の実施態様において、pHは、約5.0〜6.0の間である。一部の実施態様において、pHは、約6.0〜7.0の間である。一部の実施態様において、pHは、約3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5又は7.0である。
また、抱合体の形成を引き起こす好ましい反応条件には、適切な温度を含むであろう。抱合のための適切な温度は、組換えアルブミン製剤の相対的純度に応じて変化するであろう。詳細な実施態様において、組換えアルブミンが、培養液中の化合物によって、宿主生物の有無において、又は宿主生物の粗製若しくは透明にした可溶化液中で、接触させる場合、反応は、約34〜40℃、約35〜39℃又は約36〜38℃にて行われる。詳細な実施態様において、組換えアルブミンは、約37℃にて化合物によって接触される。その他の実施態様において、抱合反応が精製した組換えアルブミン溶液、例えば上記の任意のクロマトグラフィー法又はこれらの組み合わせによる精製によって生じる組換えアルブミン溶液中で進行する場合、反応は、約17〜25℃、約18〜24℃又は約19〜23℃にて行ってもよい。一部の実施態様において、反応は、約20〜25℃にて行われる。詳細な実施態様において、抱合反応が精製されたアルブミン溶液中で進行する場合、反応は、約20〜25℃以下で行われる。別の実施態様において、反応は、低温条件、例えば+1℃から+8℃にて行ってもよい。反応は、高温ほど遅くなるであろうし、それでも、Cys34により特異的なアルブミン抱合体生成物を生じるであろう。
また、抱合体の形成を引き起こす好ましい反応条件には、適切な反応時間を含むであろう。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55又は60分間化合物と接触される。特定の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも30分間化合物と接触される。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、約1〜60分、約5〜55分、約10〜50分、約20〜40分又は約25〜35分間化合物と接触される。
その他の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24時間化合物と接触される。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15又は20日間化合物と接触される。
その他の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24時間化合物と接触される。一部の実施態様において、組換えアルブミンは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15又は20日間化合物と接触される。
また、抱合体の形成を引き起こす好ましい反応条件には、溶液中の反応物の適切な化学量論を含むであろう。溶液中のアルブミンの力価は、当該技術分野において公知の任意の方法、例えばSDS-PAGE;アルブミン特異的酵素結合免疫測定法(ELISA);吸光度に基づいたアッセイ法(280nm、205nm);ローリー(Lowry)アッセイ法、ブラッドフォード(Bradford)アッセイ法、ビシンコニンアッセイ法などの比色アッセイ法;ケルダール法などに従って決定してもよい。一般に、化合物対アルブミンの最終モル比は、化合物がアルブミンと接触する溶液の相対的純度、並びに接触がなされるアルブミンの純度に応じて、変化するであろう。例えば、化合物が無処理又は溶解した宿主細胞を含む溶液に添加される場合、宿主タンパク質及び抗原は、化合物の反応基に対する結合に対して、組換えアルブミンと競合し、従ってアルブミンと比較してより大モル量の化合物が必要となるであろう。その他の実施態様において、化合物が精製されたアルブミンの標品、例えばキャップされず、脱糖化され、かつ/又は非Cys34反応部位にて遮断されたアルブミンに添加される場合、アルブミンと比較してより小モル量の化合物が必要とされるであろう。従って、一部の実施態様において、抱合反応には、アルブミンと比較してより高いモル濃度の化合物を含む溶液を含んでいてもよい。一部の実施態様において、抱合反応は、アルブミンに対する等モル濃度の化合物を含む溶液を含む。詳細な実施態様において、抱合反応は、アルブミンに対してより低モル濃度の化合物を含む溶液を含む。
一部の実施態様において、アルブミンは、約0.1:1〜約10,000:1の化合物対組換えアルブミンの最終モル比を含む溶液中で化合物と接触される。 一部の実施態様において、最終モル比は、約7500:1, 5000:1、約2500:1、約1000:1、約750:1、約500:1、約250:1、約100:1、約75:1、約50:1、約25:1、約10:1、約7.5:1、約5:1、約2.5:1又は約1:1である。
一部の実施態様において、最終モル比は、約0.1:1〜1:1の間である。一部の実施態様において、最終モル比は、約0.1:1、0.2:1、0.3:1、 0.4:1、0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1である。特定の実施態様において、化合物対組換えアルブミンの最終モル比は、約0.7:1である。
詳細な実施態様において、化合物が粉末形態に製剤化される場合、化合物は、抱合反応に添加する前に、滅菌水を使用して可溶化してもよい。その他の実施態様において、化合物は、好ましくは9.0よりも高くないpHにてセットされた水性緩衝液に可溶化してもよい。好ましい実施態様において、可溶化された化合物は、アルブミン溶液に対する化合物の滴下添加によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で、アルブミンと接触される。
詳細な実施態様において、化合物が粉末形態に製剤化される場合、化合物は、抱合反応に添加する前に、滅菌水を使用して可溶化してもよい。その他の実施態様において、化合物は、好ましくは9.0よりも高くないpHにてセットされた水性緩衝液に可溶化してもよい。好ましい実施態様において、可溶化された化合物は、アルブミン溶液に対する化合物の滴下添加によって、抱合体を形成するのに十分な条件下で、アルブミンと接触される。
(5.9抱合体の精製)
本明細書に記述した方法に従って形成された抱合体を含む溶液は、下記の記述した工程に従って、宿主タンパク質、抗原、内毒素、粒子状物質、還元剤、加工酵素、塩、結合していない化合物、キャップされ、若しくはキャップのない、又は単量体若しくは二量体結合していないアルブミン、及び/又は抱合体の凝集体形態から抱合体の単量体の形態を分離するために精製してもよい。
本明細書に記述した方法に従って形成された抱合体を含む溶液は、下記の記述した工程に従って、宿主タンパク質、抗原、内毒素、粒子状物質、還元剤、加工酵素、塩、結合していない化合物、キャップされ、若しくはキャップのない、又は単量体若しくは二量体結合していないアルブミン、及び/又は抱合体の凝集体形態から抱合体の単量体の形態を分離するために精製してもよい。
従って、一部の実施態様において、宿主生物を含む培養液中で形成された抱合体を含む溶液は、組換えアルブミンが宿主生物によって分泌された場合に、下記の工程に従って精製してもよい。一部の実施態様において、組換えアルブミンが宿主生物によって分泌され、かつ宿主生物が抱合の前に培養液から分離された、培養液上清中に形成された抱合体を含む溶液は、下記の工程に従って精製してもよい。一部の実施態様において、組換えアルブミンが細胞内に産生され、かつ宿主生物が抱合の前に溶解されて、培養液から分離された、透明にした可溶化液中に形成された抱合体を含む溶液は、下記の工程に従って精製してもよい。
一部の実施態様において、宿主細胞から産生される組換えアルブミンの精製された溶液中に形成された抱合体を含む溶液は、下記の工程に従って精製してもよい。一部の実施態様においてアルブミンがメルカプトアルブミンについて濃縮された、宿主細胞から産生される組換えアルブミンの精製された溶液中に形成された抱合体は、下記の工程に従って精製してもよい。一部の実施態様において、アルブミンが脱糖化されている、宿主細胞から産生される組換えアルブミンの精製された溶液中に形成された抱合体は、下記の工程に従って精製してもよい。一部の実施態様において、アルブミンが非Cys34反応部位にて遮断されている、宿主細胞から産生される組換えアルブミンの精製された溶液中に形成された抱合体は、下記の工程に従って精製してもよい。
一部の実施態様において、アルブミンがメルカプトアルブミンについて濃縮され、かつ脱糖化されている、宿主細胞から産生される組換えアルブミンの精製された溶液中に形成された抱合体は、下記の工程に従って精製してもよい。一部の実施態様において、アルブミンが脱糖化され、かつ非Cys34反応部位にて遮断されている、宿主細胞から産生される組換えアルブミンの精製された溶液中に形成された抱合体は、下記の工程に従って精製してもよい。一部の実施態様において、アルブミンがメルカプトアルブミンについて濃縮され、かつ非Cys34反応部位にて遮断されている、宿主細胞から産生される組換えアルブミンの精製された溶液中に形成された抱合体は、下記の工程に従って精製してもよい。一部の実施態様において、アルブミンがメルカプトアルブミンについて濃縮され、脱糖化され、かつ非Cys34反応部位にて遮断されている、宿主細胞から産生される組換えアルブミンの精製された溶液中に形成された抱合体は、下記の工程に従って精製してもよい。
好ましい実施態様において、抱合生成物は、疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製してもよい。一部の実施態様において、当業者の判断に従って、アルブミンに結合することができる任意の疎水性樹脂を使用してもよい。一部の実施態様において、疎水性樹脂は、オクチルセファロース、ブチルセファロース若しくはフェニルセファロース又はこれらの組み合わせであることができる。好ましい実施態様において、精製は、2工程精製、任意に続いて限外濾過を含む。
一部の実施態様において、抱合体のHIC精製には、溶液から結合していない化合物を除去するためのフェニルセファロースでの第1のフロースルー工程を含む。詳細な実施態様において、このフロースルー工程は、非Cys34アルブミン抱合体の形成を制限するために、抱合反応の直後に行われる。フェニルセファロース樹脂は、中性pH(例えばリン酸緩衝液pH 7.0)にてセットした、低塩、例えば5mM硫酸アンモニウム又は5mM硫酸マグネシウム又は5mM硫酸アンモニウム又は5mMオクタン酸ナトリウム中で平衡化してもよい。一部の実施態様において、平衡緩衝液の伝導率は、5.8mS/cmにセットされる。これらの条件下で、非抱合化合物は、樹脂に結合するが、大部分の化合物-アルブミン抱合体は、流れて通過し、5〜6カラム体積以内に溶出されるであろう。
フェニルセファロースカラムからの溶出後、フロースルーを任意に穏和な分解工程に供して、更に非Cys34アルブミン抱合産物の量を減少さてもよい。分解は、更に精製を進行する前に、室温及び中性のpHにて、7日までの間、フロースルーをインキュベートすることによって達成してもよい。一部の実施態様において、フェニルセファロースフロースルーを第2の疎水性相互作用クロマトグラフィー工程を進行する前に、室温にて1、2、3、4、5、6又は7日間インキュベートしてもよい。一部の実施態様において、フェニルセファロースフロースルーは、室温にて1日間インキュベートされる。一部の実施態様において、フェニルセファロースフロースルーは、室温にて2日間インキュベートされる。一部の実施態様において、フェニルセファロースフロースルーは、室温にて3日間インキュベートされる。一部の実施態様において、フェニルセファロースフロースルーは、室温にて4日間インキュベートされる。一部の実施態様において、フェニルセファロースフロースルーは、室温にて5日間インキュベートされる。一部の実施態様において、フェニルセファロースフロースルーは、室温にて6日間インキュベートされる。一部の実施態様において、フェニルセファロースフロースルーは、中性のpHにて7日間室温インキュベートされる。
詳細な実施態様において、穏和な分解工程に続いて、フェニルセファロースフロースルーは、第一と同一の条件下、例えば5mM硫酸アンモニウム又は5mM硫酸マグネシウム又は5mM硫酸アンモニウ又は5mMオクタン酸ナトリウム、pH 7.0;5.8mS/cmの伝導率で、第2のフェニルセファロースフロースルー工程に供して、分解工程により生じる非抱合化合物分子を除去してもよい。
フェニルセファロースクロマトグラフィー後、次いでフロースルーを、ブチルセファロース樹脂との接触を含む第2の疎水性相互作用クロマトグラフィーに適用する。ブチルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するアルブミン抱合体の精製のための方法は、米国特許出願第11/112,277号に記述されており、その内容は、その全体が引用により組み込まれている。この精製工程により、単量体の化合物-アルブミン抱合体を遊離の結合していないアルブミン、二量体アルブミン、さらなる結合していない化合物及び抱合体の凝集体形態から分離する。一部の実施態様において、ブチルセファロース樹脂は、中性pH(例えば、リン酸緩衝液pH 7.0)にセットした、750mM硫酸アンモニウム、5mMオクタン酸ナトリウム中で平衡化してもよい。充填及び樹脂に対する結合後、単量体化合物-アルブミン抱合体の分離は、直線的若しくは段階的にいずれかで塩濃度を減少させる勾配又はこれらの組み合わせを適用することによって達成してもよい。例えば、単量体化合物-アルブミン抱合体は、0-750mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出させてもよい。一部の実施態様において、非抱合アルブミンは、118mS/cmの伝導率において、約750mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出させてもよい。
一部の実施態様において、二量体非抱合アルブミンは、89mS/cmの伝導率にて、約550mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出させてもよい。
一部の実施態様において、二量体非抱合アルブミンは、89mS/cmの伝導率にて、約550mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出させてもよい。
一部の実施態様において、単量体の抱合されたアルブミンは、約50〜150mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出させてもよい。一部の実施態様において、単量体の抱合されたアルブミンは、約75〜125mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出させてもよい。一部の実施態様において、単量体の抱合されたアルブミンは、21mS/cmの伝導率にて、約100mM(NH4)2SO4を含む溶液との接触によって溶出させてもよい。
一部の実施態様において、抱合体は、HIC精製後に限外濾過により、例えばAmicon(登録商標)超遠心(30kDa)濾過装置(Millipore Corporation, Bedford, Mass.)を使用することにより、脱塩し、かつ濃縮してもよい。一部の実施態様において、抱合体は、所望の製剤組成物に再処方してもよい。その他の実施態様において、抱合体は、液体窒素に抱合体溶液を浸漬すること、及び抱合体を凍結乾燥させること、及び-20℃にて抱合体を貯蔵することによって長期保存のために製造される。
(6.実施例)
本発明は、いかなる形であれ限定することは意図されない以下の実施例によって例証される。以下の実施例のクロマトグラフィー法は、AKTA清浄器(Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden)を使用して行った。
本発明は、いかなる形であれ限定することは意図されない以下の実施例によって例証される。以下の実施例のクロマトグラフィー法は、AKTA清浄器(Amersham Biosciences、Uppsala、Sweden)を使用して行った。
(6.1 実施例1.:ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えアルブミンの精製)
本実施例は、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えアルブミンの種々のクロマトグラフィー法による精製を証明する。組換えアルブミンは、製造業者のプロトコルに従って、ピチア発現キット(Invitrogen、Carlsbad, CA)を使用して発現させた。
本実施例は、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えアルブミンの種々のクロマトグラフィー法による精製を証明する。組換えアルブミンは、製造業者のプロトコルに従って、ピチア発現キット(Invitrogen、Carlsbad, CA)を使用して発現させた。
(6.1.1 DEAEセファロース:弱い陰イオン交換クロマトグラフィー)
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えヒトアルブミンの精製を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)中で平衡化したDEAEセファロースのカラムで行った。塩を増加する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、2ml/分の流速):5カラム体積にわたって66mMリン酸ナトリウム;2カラム体積にわたって66mMリン酸ナトリウム;0カラム体積にわたって200mMリン酸ナトリウム;1カラム体積にわたって200mMリン酸ナトリウム;20mM Tris-HCl緩衝液及び2M NaCl、pH 8.0における再生。図1では、精製されたアルブミン画分を、画分としてリン酸ナトリウムを増加する勾配の間に溶出する。
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えヒトアルブミンの精製を10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)中で平衡化したDEAEセファロースのカラムで行った。塩を増加する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、2ml/分の流速):5カラム体積にわたって66mMリン酸ナトリウム;2カラム体積にわたって66mMリン酸ナトリウム;0カラム体積にわたって200mMリン酸ナトリウム;1カラム体積にわたって200mMリン酸ナトリウム;20mM Tris-HCl緩衝液及び2M NaCl、pH 8.0における再生。図1では、精製されたアルブミン画分を、画分としてリン酸ナトリウムを増加する勾配の間に溶出する。
(6.1.2 Qセファロース:強力な陰イオン交換クロマトグラフィー)
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えヒトアルブミンの精製を20mM Tris HCl緩衝液、pH 8.0中で平衡化したQセファロースのカラムで行った。塩を増加する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、2.5ml/分の流速): 8カラム体積にわたって1M NaCl;0体積にわたって2M NaCl;2カラム体積にわたって2M NaCl。図2では、精製したアルブミン画分は、0〜1M NaClに増加するNaCl勾配の間に溶出する。
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えヒトアルブミンの精製を20mM Tris HCl緩衝液、pH 8.0中で平衡化したQセファロースのカラムで行った。塩を増加する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、2.5ml/分の流速): 8カラム体積にわたって1M NaCl;0体積にわたって2M NaCl;2カラム体積にわたって2M NaCl。図2では、精製したアルブミン画分は、0〜1M NaClに増加するNaCl勾配の間に溶出する。
(6.1.3 Hitrap Blue:アフィニティークロマトグラフィー)
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えヒトアルブミンの精製を20mM Tris HCl緩衝液、pH 8.0中で平衡化したHiTrap(登録商標)Blue HP(GE Healthcare、Piscataway、NJ)カラムで行った。塩を増加する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、2.5ml/分の流速): 2カラム体積にわたって1M NaCl;0カラム体積にわたって2M NaCl;1カラム体積にわたって2M NaCl。図3では、精製したアルブミン画分は、0〜2M NaClに増加するNaCl勾配の間に溶出する。
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えヒトアルブミンの精製を20mM Tris HCl緩衝液、pH 8.0中で平衡化したHiTrap(登録商標)Blue HP(GE Healthcare、Piscataway、NJ)カラムで行った。塩を増加する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、2.5ml/分の流速): 2カラム体積にわたって1M NaCl;0カラム体積にわたって2M NaCl;1カラム体積にわたって2M NaCl。図3では、精製したアルブミン画分は、0〜2M NaClに増加するNaCl勾配の間に溶出する。
(6.1.4 フェニルセファロース:疎水性相互作用クロマトグラフィー)
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えヒトアルブミンの精製を20mMリン酸ナトリウム、5mMカプリル酸ナトリウム及び750mM(NH4)2SO4、pH 7.0中で平衡化したフェニルセファロースを含むカラムで行った。塩濃度を減少する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、5ml/分の流速): 20mMリン酸ナトリウム、2カラム体積にわたって5mMカプリル酸ナトリウム;1カラム体積にわたって水で行う洗浄液;1カラム体積にわたって20% エタノール;及び1カラム体積にわたって水。図4では、精製されたアルブミン画分は、750〜0M(NH4)2SO4に減少する勾配の間に溶出する。
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えヒトアルブミンの精製を20mMリン酸ナトリウム、5mMカプリル酸ナトリウム及び750mM(NH4)2SO4、pH 7.0中で平衡化したフェニルセファロースを含むカラムで行った。塩濃度を減少する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、5ml/分の流速): 20mMリン酸ナトリウム、2カラム体積にわたって5mMカプリル酸ナトリウム;1カラム体積にわたって水で行う洗浄液;1カラム体積にわたって20% エタノール;及び1カラム体積にわたって水。図4では、精製されたアルブミン画分は、750〜0M(NH4)2SO4に減少する勾配の間に溶出する。
(6.2 実施例2:メルカプトアルブミンの濃縮に後の組換えアルブミンの精製)
本実施例は、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現され、かつメルカプトアルブミンについて濃縮した組換えアルブミンのフェニルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製を証明する。組換えアルブミン(0.2%の最終)を74mM トリグリコール酸の250mM Tris-酢酸緩衝液溶液で、4℃にて20時間処理した。精製は、20mMリン酸ナトリウム、5mMカプリル酸ナトリウム及び750mM(NH4)2SO4、pH 7.0中で平衡化したフェニルセファロースを含むカラムで行った。塩濃度を減少する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、5ml/分の流速): 20mMリン酸ナトリウム、2カラム体積にわたって5mMカプリル酸ナトリウム;1カラム体積にわたって水で行う洗浄液;1カラム体積にわたって20% エタノール;及び1カラム体積にわたって水。図5では、精製されたアルブミン画分は、750〜0M(NH4)2SO4に減少する勾配の間に溶出する。F2は、Amicon 10kDaミリポアフィルターで収集、濃縮して、注射用蒸留水(WFI)で4回洗浄した。
本実施例は、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現され、かつメルカプトアルブミンについて濃縮した組換えアルブミンのフェニルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製を証明する。組換えアルブミン(0.2%の最終)を74mM トリグリコール酸の250mM Tris-酢酸緩衝液溶液で、4℃にて20時間処理した。精製は、20mMリン酸ナトリウム、5mMカプリル酸ナトリウム及び750mM(NH4)2SO4、pH 7.0中で平衡化したフェニルセファロースを含むカラムで行った。塩濃度を減少する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、5ml/分の流速): 20mMリン酸ナトリウム、2カラム体積にわたって5mMカプリル酸ナトリウム;1カラム体積にわたって水で行う洗浄液;1カラム体積にわたって20% エタノール;及び1カラム体積にわたって水。図5では、精製されたアルブミン画分は、750〜0M(NH4)2SO4に減少する勾配の間に溶出する。F2は、Amicon 10kDaミリポアフィルターで収集、濃縮して、注射用蒸留水(WFI)で4回洗浄した。
(6.3 実施例3:脱糖化後の組換えアルブミンの精製)
本実施例は、リガンドとしてアミノフェニルボロン酸及びコンカナバリンAを使用するアフィニティークロマトグラフィーによるヒト血清アルブミンの脱糖化を証明する。クロマトグラフィーは、AKTA清浄器(Amersham biosciences、Uppsala、Sweden)で行った。
本実施例は、リガンドとしてアミノフェニルボロン酸及びコンカナバリンAを使用するアフィニティークロマトグラフィーによるヒト血清アルブミンの脱糖化を証明する。クロマトグラフィーは、AKTA清浄器(Amersham biosciences、Uppsala、Sweden)で行った。
(6.3.1 アガロースでアミノフェニルボロン酸クロマトグラフィー)
アガロース(Sigma, St. Louis, MO)を伴うアミノフェニルボロン酸樹脂は、4カラム体積の0.25M酢酸アンモニウム、pH 8.5、0.05 MgCl2(0.5ml/分の流速)で洗浄して、平衡化した。25% ヒト血清アルブミン溶液(Cortex Biochem, San Leandro, CA)を平衡化緩衝液に1:2に希釈して、カラムに充填した。フロースルーを収集し(F3)、カラムを4カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は、3カラム体積の0.2M ソルビトールを含む0.1M Tris、pH 8.5で行い、F2に収集した。F3及びF2は、10kDa、Amicon Milliporeフィルターで濃縮して、注射用蒸留水(WFI、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)で4回洗浄した。カラムは、5カラム体積の0.1M ホウ酸緩衝液、pH 9.8、1M NaCl;5カラム体積の0.1M ホウ酸緩衝液、pH 9.8、5カラム体積の水及び5カラム体積の2M NaClで再生した。代表的なクロマトグラムを図6に示してある。
アガロース(Sigma, St. Louis, MO)を伴うアミノフェニルボロン酸樹脂は、4カラム体積の0.25M酢酸アンモニウム、pH 8.5、0.05 MgCl2(0.5ml/分の流速)で洗浄して、平衡化した。25% ヒト血清アルブミン溶液(Cortex Biochem, San Leandro, CA)を平衡化緩衝液に1:2に希釈して、カラムに充填した。フロースルーを収集し(F3)、カラムを4カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は、3カラム体積の0.2M ソルビトールを含む0.1M Tris、pH 8.5で行い、F2に収集した。F3及びF2は、10kDa、Amicon Milliporeフィルターで濃縮して、注射用蒸留水(WFI、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)で4回洗浄した。カラムは、5カラム体積の0.1M ホウ酸緩衝液、pH 9.8、1M NaCl;5カラム体積の0.1M ホウ酸緩衝液、pH 9.8、5カラム体積の水及び5カラム体積の2M NaClで再生した。代表的なクロマトグラムを図6に示してある。
(6.3.2 コンカナバリンA(ConA)クロマトグラフィー)
ConA樹脂(Amersham、Piscataway、NJ)を、4カラム体積の0.1Mの酢酸緩衝液、pH 6.0、1M NaCl 1mM MgCK、1mM MgCl2、1mM CaCl2(2ml/分の流速)で洗浄し、平衡化した。20% 組換えヒト血清アルブミン溶液(North China Pharmaceutical Co., Shijiazhuang, China )を平衡化緩衝液に1:2に希釈して、カラムに充填した。フロースルーを収集して(F3)、カラムを4カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は、3カラム体積の平衡緩衝液プラス0.1Mのグルコース及び0.1Mのマンノースで行い、F2に収集した。F3及びF2は、10kDa、Amicon Milliporeフィルターで濃縮して、注射用蒸留水(WFI、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)で4回洗浄した。カラムは、5カラム体積の0.1M ホウ酸緩衝液、pH 9.8、1M NaCl;5カラム体積の水;5カラム体積の0.1Mのホウ酸緩衝液、pH 8.5;及び5カラム体積の0.1M ホウ酸緩衝液、pH 4.5で再生した。代表的なクロマトグラムを図7に示してある。
ConA樹脂(Amersham、Piscataway、NJ)を、4カラム体積の0.1Mの酢酸緩衝液、pH 6.0、1M NaCl 1mM MgCK、1mM MgCl2、1mM CaCl2(2ml/分の流速)で洗浄し、平衡化した。20% 組換えヒト血清アルブミン溶液(North China Pharmaceutical Co., Shijiazhuang, China )を平衡化緩衝液に1:2に希釈して、カラムに充填した。フロースルーを収集して(F3)、カラムを4カラム体積の平衡化緩衝液で洗浄した。溶出は、3カラム体積の平衡緩衝液プラス0.1Mのグルコース及び0.1Mのマンノースで行い、F2に収集した。F3及びF2は、10kDa、Amicon Milliporeフィルターで濃縮して、注射用蒸留水(WFI、Abbott Laboratories、Abbott Park、IL)で4回洗浄した。カラムは、5カラム体積の0.1M ホウ酸緩衝液、pH 9.8、1M NaCl;5カラム体積の水;5カラム体積の0.1Mのホウ酸緩衝液、pH 8.5;及び5カラム体積の0.1M ホウ酸緩衝液、pH 4.5で再生した。代表的なクロマトグラムを図7に示してある。
(6.4 実施例4:単量体化合物-アルブミン抱合体の精製)
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えアルブミンを精製して、上記実施例2に記載したようにチオグリコール酸で処理して、CJC-1134(反応基MPAを含むエキセンディン-4)との抱合の前に、フェニルセファロースHICによって精製した。抱合反応は、0.7:1の最終モル比にて、175μlのメルカプトアルブミンが濃縮されたアルブミンと組み合わせた、35μlの10mM CJC-1134を含んだ。反応は、37℃にて30分間進行させ、次いで液体クロマトグラフィー/質量スペクトル分析及びブチルセファロースHICによる精製のために4℃にて貯蔵した。
ピチア・パストリス(Pichia pastoris)に発現された組換えアルブミンを精製して、上記実施例2に記載したようにチオグリコール酸で処理して、CJC-1134(反応基MPAを含むエキセンディン-4)との抱合の前に、フェニルセファロースHICによって精製した。抱合反応は、0.7:1の最終モル比にて、175μlのメルカプトアルブミンが濃縮されたアルブミンと組み合わせた、35μlの10mM CJC-1134を含んだ。反応は、37℃にて30分間進行させ、次いで液体クロマトグラフィー/質量スペクトル分析及びブチルセファロースHICによる精製のために4℃にて貯蔵した。
図8は、最初にフェニルセファロースフロースルーカラムに充填する前のCJC-1134と組換えアルブミンとの間の抱合後に見いだされる結合していないCJC-1134のHPLCクロマトグラムを示す。結合していないCJC-1134の保持時間は、8.2分であり、CJC-1134-アルブミン抱合体のものは、12分後である。
第1のHICについては、フェニルセファロースを5mMオクタン酸ナトリウム及び5mM硫酸アンモニウムで構成された20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)中でプレ平衡化した。樹脂に対する抱合反応の直接の充填により、結合していないCJC-1134からのフロースルーにおいて観察されるタンパク質(アルブミン及び抱合されたアルブミン)の物理的分離が可能になった。従って、この樹脂の能力は、主に反応性部分を含む結合していない化合物に対して確保されている。代表的なクロマトグラムを図9に示してある。
図10は、最初にフェニルセファロースフロースルーカラムに充填した後のCJC-1134と組換えアルブミンとの間の抱合後に見いだされる結合していないCJC-1134のHPLCクロマトグラムを示す。結合していないCJC-1134の保持時間は8.2分であり、CJC-1134-アルブミン抱合体のものは、12分後である。従って、結合していないCJC-1134は、抱合反応生成物のプールから効率的に除去された。
第2のHICについては、ブチルセファロース樹脂を20mMリン酸ナトリウム緩衝液、5mMカプリル酸ナトリウム、750mM(NH4)2SO4、pH 7.0中で平衡化した。塩濃度を減少する勾配を以下の通りに適用した(50mlのカラム体積、2.5ml/分の流速):4カラム体積にわたって、20mMリン酸ナトリウム、5mMカプリル酸ナトリウム、pH 7.0;1カラム体積の間、水で洗浄させた;1カラム体積にわたって20% エタノール;及び1カラム体積にわたって水。F2を10kDa Amiconミリポアフィルターで収集、濃縮して、WFIで4回洗浄した。図11は、勾配に沿って異なる位置に溶出する3つの異なる集団を示す:約750mM(NH4)2SO4は、非抱合アルブミンに対応し、550mM(NH4)2SO4は、二量体非抱合アルブミンに対応し、及び約100m(NH4)2SO4は、単量体の抱合されたアルブミンに対応する。
また、抱合の成功は、組換えアルブミンとGLP-1及び反応基MPAを含む化合物との間で観察された。図12は、フェニルセファロースフロースルーカラムに対する充填前の、DAC-GLP-(CJC-1131)とrHAとの間の抱合後に見いだされる結合していないDAC-GLP-1(CJC-1131)のHPLCクロマトグラムを示す。結合していないCJC-1131の保持時間は、27.5分であり、アルブミン抱合体のものは、50分後である。
第1のHICについては、フェニルセファロースを5mMオクタン酸ナトリウム及び5mM硫酸アンモニウムで構成される20mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)中でプレ平衡化した。樹脂に対する抱合反応の直接の充填により、図13に示すように、結合していないDAC-GLP-1(CJC-1131)からのフロースルーにおいて観察されるタンパク質(アルブミン及び抱合されたアルブミン)の物理的分離が可能になった。図14は、フェニルセファロースフロースルーカラムに対する抱合体の反応の充填後の、DAC-GLP-1(CJC-1131)及び組換えヒトアルブミンとの間の抱合後に見いだされる結合していないDAC-GLP-1のHPLCクロマトグラムを示す。結合していないCJC-1131の保持時間は、27.5分であり、アルブミン抱合体のものは、46分後である。従って、結合していないCJC-1131は、効率的に全てのタンパク質種から除去された。20.5分の保持時間を有するピークは、オクタン酸塩に対応する。
また、GLP-1-アルブミン抱合体を、SDS-PAGE及びウェスタンブロット解析のために調製した。簡潔には、上記の抱合反応後、約20μgの材料をLaemmli 3×緩衝液に希釈し、3分間煮沸して、8%のポリアクリルアミド-ビスアクリルアミドゲルに充填した。タンパク質を非還元条件下で移動した。ニトロセルロース膜への転写後(定電流;1OOmA/ゲル、1時間(2mA/cm2))、膜染色をPonceauレッドで行い、TBSで完全に脱染させ;膜を0.05% Tween20、5% 乳のTween20溶液で4℃にて一晩飽和させ、続いてTween20中で10分、0.05%のTween20で3回洗浄し、続いて赤いクマシーブルーで染色して、30% MeOH、10% 酢酸で完全に脱染した。アルブミンの免疫検出は、HRP標識されたヤギ抗体抗ヒトアルブミン(GAHu/Alb/PO, Nordic immunology, batch#5457)と共に、室温にて1時間のインキュベーションによって行った。GLP-1の免疫検出は、ウサギ抗GLP-1抗体との1時間のインキュベーションによって、続いてHRP標識されたヤギ抗ウサギ抗体との1時間のインキュベーションによって行った。次いで、膜をTBS-0.05% Tween20洗浄液で10分間3回洗浄した。シグナルの検出は、ECL(Amersham Pharmacia Biotech、RPN 2209)で行った。
また、GLP-1-アルブミン抱合体を、SDS-PAGE及びウェスタンブロット解析のために調製した。簡潔には、上記の抱合反応後、約20μgの材料をLaemmli 3×緩衝液に希釈し、3分間煮沸して、8%のポリアクリルアミド-ビスアクリルアミドゲルに充填した。タンパク質を非還元条件下で移動した。ニトロセルロース膜への転写後(定電流;1OOmA/ゲル、1時間(2mA/cm2))、膜染色をPonceauレッドで行い、TBSで完全に脱染させ;膜を0.05% Tween20、5% 乳のTween20溶液で4℃にて一晩飽和させ、続いてTween20中で10分、0.05%のTween20で3回洗浄し、続いて赤いクマシーブルーで染色して、30% MeOH、10% 酢酸で完全に脱染した。アルブミンの免疫検出は、HRP標識されたヤギ抗体抗ヒトアルブミン(GAHu/Alb/PO, Nordic immunology, batch#5457)と共に、室温にて1時間のインキュベーションによって行った。GLP-1の免疫検出は、ウサギ抗GLP-1抗体との1時間のインキュベーションによって、続いてHRP標識されたヤギ抗ウサギ抗体との1時間のインキュベーションによって行った。次いで、膜をTBS-0.05% Tween20洗浄液で10分間3回洗浄した。シグナルの検出は、ECL(Amersham Pharmacia Biotech、RPN 2209)で行った。
図15及び図16は、それぞれ非抱合組換えアルブミン(レーン3)及びGLP-1アルブミン抱合反応(レーン4)の反応生成物のクマシー染色及び抗アルブミンウエスタンブロットを示す。単量体及び重合体GLP-1-アルブミン抱合体種を反映して、非抱合アルブミンと比較して、より高分子量種が抱合後に観察される。
図17及び図18は、それぞれGLP-1及び組換えヒトアルブミンとの間の抱合反応後の精製の種々の段階からの画分の、上記の通りの、クマシー染色及び抗アルブミンウエスタンブロットを示す。試料は、以下の通りに充填した:
(l)rHA
(2)プレ精製
(3)フェニルF8
(4)ブチルF3 75OmM(NH4)2SO4
(5)ブチルF5 55OmM(NH4)2SO4
(6)PC 200-200OmAU前のブチルF6A 100mM(NH4)2SO4
(7)ブチルF6A 100mM(NH4)2SO4 PC WFI
(8)ブチルF6A 100mM(NH4)2SO4 PCアセテート
(9)標準。
(l)rHA
(2)プレ精製
(3)フェニルF8
(4)ブチルF3 75OmM(NH4)2SO4
(5)ブチルF5 55OmM(NH4)2SO4
(6)PC 200-200OmAU前のブチルF6A 100mM(NH4)2SO4
(7)ブチルF6A 100mM(NH4)2SO4 PC WFI
(8)ブチルF6A 100mM(NH4)2SO4 PCアセテート
(9)標準。
(6.5実施例4:培養液中のアルブミンに対する抱合)
組換えヒトアルブミンは、製造業者プロトコルに従ってピチア発現キット(Invitrogen、Carlsbad, CA)を使用して発現した。28-30℃における培養液上清への3日のアルブミン発現及び分泌後、100mlのブロスを遠心分離して物理的に宿主細胞を粗製上清から分離した。次いで、粗製上清は、Amicon(登録商標)遠心チューブ(MWカットオフ=10kDa)を使用して20〜100 mg/mlの最終タンパク質濃度に濃縮し(標準化されたBCA方法を使用して見積もられるとおり)、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレー質量分析(LC-EMS)分析を行った。3日にて、抱合反応は、宿主細胞で構成される培養液に直接添加することによってアルブミンに対して1000x-倍のDAC-GLP-1(CJC-1131)の最終モル比で行った。
組換えヒトアルブミンは、製造業者プロトコルに従ってピチア発現キット(Invitrogen、Carlsbad, CA)を使用して発現した。28-30℃における培養液上清への3日のアルブミン発現及び分泌後、100mlのブロスを遠心分離して物理的に宿主細胞を粗製上清から分離した。次いで、粗製上清は、Amicon(登録商標)遠心チューブ(MWカットオフ=10kDa)を使用して20〜100 mg/mlの最終タンパク質濃度に濃縮し(標準化されたBCA方法を使用して見積もられるとおり)、液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレー質量分析(LC-EMS)分析を行った。3日にて、抱合反応は、宿主細胞で構成される培養液に直接添加することによってアルブミンに対して1000x-倍のDAC-GLP-1(CJC-1131)の最終モル比で行った。
抱合反応前後のLC-EMSデータは、メルカプトアルブミンのMW範囲に対応する種が検出可能でないことを示した。1000x-倍のCJC-1131(DAC-GLP-1;Mw = 3,721 Da)を培養液(宿主細胞で構成される)に直接添加して、25℃にて60分間反応させた。反応後、宿主細胞を、遠心分離を使用して粗製上清から物理的に分離した。次いで、上清をAmicon(登録商標)遠心チューブ(Mwカットオフ=10kDa)を使用して20〜100 mg/mlの最終タンパク質濃度に更に濃縮し、LC-EMS解析を行った。70,160〜70,170の総質量をもつタンパク質種がGLP-1-アルブミン抱合体の生成に対応するであろう。しかし、このサイズの検出可能な質量は、抱合反応後に観察されなかった。
組換えアルブミンの発現及び分泌が、L-システインなどの還元剤が除去され、又は消耗された条件下である場合、培養液における抱合が成功するであろう。更に、アルブミンのCys34残基が酸化に感受性であり得るため、組換えアルブミンの分泌を、より通気のストリンジェントな条件下で試みてもよい。例として、及び限定ではなく、このような発酵条件は、培養液における抱合体形成のために有利であろう。
本明細書において引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願が引用により組み込まれていることが具体的かつ個々に示されているかのように、本明細書に引用により組み込まれている。前述の本発明は、理解を明瞭にするために、図と例とをあげていくらか詳細に記述してあるが、当業者には、本発明の教示を考慮して、添付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、特定の変更及び修正をそれに対して行ってもよいことが直ちに明らかであろう。
Claims (58)
- 抱合体の製造のための方法であって、前記抱合体は、化合物に共有結合で連結されたアルブミンを含み、該方法は、第1の疎水性相互作用クロマトグラフィー、続いて第2の疎水性相互作用クロマトグラフィーによって抱合体を精製することを含む、前記方法。
- 第1の疎水性相互作用クロマトグラフィーが、フェニルセファロースクロマトグラフィーである、請求項1記載の方法。
- 第2の疎水性相互作用クロマトグラフィーが、ブチルセファロースクロマトグラフィーである、請求項1又は2記載の方法。
- 前記ブチルセファロースクロマトグラフィーが:
a. ブチルセファロース樹脂を750mM硫酸アンモニウム中で平衡化すること;
b. ブチルセファロース樹脂を抱合体を含む溶液と接触させること;及び、
c. 750〜0mM硫酸アンモニウムに、減少する塩濃度勾配を適用して、単量体の抱合されたアルブミン種を非単量体アルブミン種から分離すること、
を含む、請求項3記載の方法。 - 第1の疎水性相互作用クロマトグラフィーが第2の疎水性相互作用クロマトグラフィーとは異なる、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。
- 限外濾過によって抱合体を更に精製する工程を更に含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーから選択される方法によって抱合体を更に精製する工程を更に含む、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 反応基がアルブミンのシステイン34チオールに共有結合で結合して抱合体を形成することができる反応条件下で、抱合体が、溶液に含まれるアルブミンを化合物と接触させることによって溶液中で形成され、前記化合物が反応基を含む、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
- 前記溶液がその中に組換えアルブミンを分泌する宿主生物の培養液を含む、請求項8記載の方法。
- 前記培養液がアルブミンを化合物と接触させる前に宿主生物から分離される、請求項9記載の方法。
- 前記溶液が組換えアルブミンを産生する宿主生物の可溶化液である、請求項8記載の方法。
- 前記溶液が疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製された組換えアルブミンを含む、請求項8記載の方法。
- 前記アルブミンがメルカプトアルブミンの濃縮されたアルブミンである、請求項8記載の方法。
- メルカプトアルブミンがアルブミンをチオグリコール酸と接触させることによって濃縮される、請求項13記載の方法。
- メルカプトアルブミンがアルブミンをジチオスレイトールと接触させることによって濃縮される、請求項13記載の方法。
- 前記アルブミンが脱糖化されたアルブミンである、請求項8記載の方法。
- 前記アルブミンがメルカプトアルブミンについて濃縮された脱糖化されたアルブミンである、請求項8記載の方法。
- 前記アルブミンがアミノフェニルホウ酸アガロースアフィニティークロマトグラフィーによって脱糖化される、請求項16又は17記載の方法。
- 前記アルブミンがコンカナバリンAセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって脱糖化される、請求項16又は17記載の方法。
- 前記反応条件が20℃〜25℃の反応温度を含む、請求項8〜19のいずれか1項記載の方法。
- 前記反応条件が少なくとも30分の反応時間を含む、請求項8〜20のいずれか1項記載の方法。
- 前記反応条件が0.1:1〜1:1の化合物対組換えアルブミンの最終モル比を含む、請求項8〜21のいずれか1項記載の方法。
- 前記反応条件が0.5:1〜0.9:1の化合物対アルブミンの最終モル比を含む、請求項22記載の方法。
- 前記反応条件が0.7:1の化合物対アルブミンの最終モル比を含む、請求項22記載の方法。
- 前記化合物がアミノ酸、ペプチド、タンパク質、有機分子、RNA又はDNAを含む、請求項1〜24のいずれか1項記載の方法。
- 前記化合物が30kDa未満である、請求項1〜25のいずれか1項記載の方法。
- 前記化合物がインスリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、脳ナトリウム利尿ペプチド(BNP)、ペプチドYY(PYY)、成長ホルモン放出因子(GRF)、グルカゴン様ペプチド-1(GLP-1)、エキセンディン-3又はエキセンディン-4である、請求項1〜26のいずれか1項記載の方法。
- 前記化合物がGLP-1である、請求項27記載の方法。
- 前記化合物がエキセンディン-3である、請求項27記載の方法。
- 前記化合物がエキセンディン-4である、請求項27記載の方法。
- 前記化合物が反応基を含む、請求項1〜30のいずれか1項記載の方法。
- 前記反応基がマイケルアクセプター、スクシンイミジル含有基、マレイミド含有基又は求電子性チオールアクセプターである、請求項31記載の方法。
- 前記反応基がマレイミド含有基である、請求項31記載の方法。
- 前記反応基がマレイミド-プロピオン酸(MPA)である、請求項31記載の方法。
- 前記反応基がシステイン残基である、請求項31記載の方法。
- 前記アルブミンが組換え血清アルブミンである、請求項8〜35のいずれか1項記載の方法。
- 前記アルブミンが組換えヒト血清アルブミンである、請求項8〜35のいずれか1項記載の方法。
- 前記アルブミンがペプチドに融合されている、請求項8記載の方法。
- 前記ペプチドがグルカゴン様ペプチド1、エキセンディン3又はエキセンディン-4である、請求項38記載の方法。
- 前記アルブミンが宿主生物によって産生される、請求項8記載の方法。
- 前記宿主が組換えアルブミンを発現するように形質転換された酵母株である、請求項42記載の方法。
- 前記酵母がサッカロマイセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)、クルイベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、アークスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)及びハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)を含む群から選択される、請求項43記載の方法。
- 前記宿主が組換えアルブミンを発現するように形質転換された細菌である、請求項42記載の方法。
- 前記細菌が大腸菌(Escherichia coli)である、請求項45記載の方法。
- 前記宿主が組換えアルブミンを発現するトランスジェニック植物である、請求項42のいずれか1項記載の方法。
- 前記宿主が組換えアルブミンを発現するトランスジェニック動物である、請求項42記載の方法。
- 前記組換えアルブミンがアルブミン又はその変異体若しくは誘導体をコードするベクターで形質転換された哺乳動物細胞によって産生される、請求項8記載の方法。
- 抱合体の製造のための方法であって、該抱合体は、組換えアルブミンとアミノ酸、ペプチド、タンパク質、有機分子、RNA及びDNAからなる群から選択される30kDa未満を有する化合物とを含み、該化合物は、それに対して反応基を結合することによって修飾されており、かつ該抱合体は、修飾された化合物と組換えアルブミンとの反応によって形成され:
a. 組換えアルブミンが培養液に分泌されるように、培養液中で宿主生物を培養することによって組換えアルブミンを産生する工程;
b. 工程(a)と同時に、修飾された化合物を培養液に添加して、修飾された化合物を培養液に分泌される組換えアルブミンと反応させる工程;及び、
c. 工程(b)の反応から生じる抱合体を精製する工程、
を含む、前記方法。 - 抱合体の製造のための方法であって、該抱合体は、組換えアルブミンとアミノ酸、ペプチド、タンパク質、有機分子、RNA及びDNAからなる群から選択される30kDa未満を有する化合物とを含み、該化合物は、それに対して反応基を結合することによって修飾されており、かつ該抱合体は、修飾された化合物と組換えアルブミンとの反応によって形成され:
a. 組換えアルブミンが培養液に分泌されるように、培養液中で宿主生物を培養することによって組換えアルブミンを産生する工程;
b. 組換えアルブミンを含む培養液を収集する工程;
c. 修飾された化合物を工程(b)にて得られる収集された培養液に添加して、修飾された化合物を組換えアルブミンと反応させる工程;及び、
d. 工程(b)の反応から生じる抱合体を精製する工程、
を含む、前記方法。 - 抱合体の製造のための方法であって、該抱合体は、組換えアルブミンとアミノ酸、ペプチド、タンパク質、有機分子、RNA及びDNAからなる群から選択される30kDa未満を有する化合物とを含み、該化合物は、それに対して反応基を結合することによって修飾されており、かつ該抱合体は、修飾された化合物と組換えアルブミンとの反応によって形成され:
a. 組換えアルブミンが培養液に分泌されるように、培養液中で宿主生物を培養することによって組換えアルブミンを産生する工程;
b. 分泌された組換えアルブミンを精製する工程;
c.修飾された化合物を工程(b)にて精製した組換えアルブミンに添加して、修飾された化合物を組換えアルブミンと反応させる工程;及び、
d. 工程(c)の反応から生じる抱合体を精製する工程、
を含む、前記方法。 - 前記工程(b)の精製された組換えアルブミンが、キャップされたアルブミン及びメルカプトアルブミンを含み、かつ前記方法が工程(c)の修飾された化合物との反応より前にメルカプトアルブミンの濃縮の工程を更に含む、請求項52記載の方法。
- 宿主生物が酵母である、請求項50、51又は52記載の方法。
- 抱合体の製造のための方法であって、該抱合体は、組換えアルブミンとアミノ酸、ペプチド、タンパク質、有機分子、RNA及びDNAからなる群から選択される30kDa未満を有する化合物とを含み、該化合物は、それに対して反応基を結合することによって修飾されており、かつ該抱合体は、修飾された化合物と組換えアルブミンとの反応によって形成され:
a. 組換えアルブミンが細胞内に貯蔵されるように、培養液中で宿主生物を培養することによって組換えアルブミンを産生する工程;
b. 宿主生物の細胞から物理的に組換えアルブミンを分離する工程;
c. 修飾された化合物を工程(b)で得られた組換えアルブミンに添加して、修飾された化合物を組換えアルブミンと反応させる工程:及び、
d. 工程(b)の反応から生じる抱合体を精製する工程、
を含む、前記方法。 - 工程(b)で得られた組換えアルブミンの精製のさらなる工程(b-1)を、それを工程(c)の修飾された化合物と反応させる前に有する、請求項50に記載の方法。
- 精製工程(b-1)によって得られた組換えアルブミンが、キャップされたアルブミン及びメルカプトアルブミンを含み、かつ前記方法が、メルカプトアルブミンの濃縮の工程(b-2)を更に含み、かつ前記方法が工程(c)の修飾された化合物との反応より前に、メルカプトアルブミンの濃縮の工程(b-2)を更に含む、請求項56に記載の方法。
- 宿主生物が細菌である、請求項55、56又は57に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US75368005P | 2005-12-22 | 2005-12-22 | |
PCT/CA2006/002124 WO2007071068A1 (en) | 2005-12-22 | 2006-12-22 | Process for the production of preformed conjugates of albumin and a therapeutic agent |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009520469A true JP2009520469A (ja) | 2009-05-28 |
Family
ID=38188243
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008546063A Pending JP2009520469A (ja) | 2005-12-22 | 2006-12-22 | アルブミンと治療薬との前もって形成された抱合体の産生のための方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20070269863A1 (ja) |
EP (1) | EP1976876A4 (ja) |
JP (1) | JP2009520469A (ja) |
CN (1) | CN101384623B (ja) |
AU (1) | AU2006329215A1 (ja) |
CA (1) | CA2634495A1 (ja) |
MX (1) | MX2008008076A (ja) |
WO (1) | WO2007071068A1 (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016515529A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-30 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドBiogen MA Inc. | 無塩条件下で疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するタンパク質精製 |
JP2017058278A (ja) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | 国立大学法人 東京大学 | 酸化型及び還元型アルブミンの分析方法、酸化型及び還元型アルブミンの分析装置、及び酸化型及び還元型アルブミンの分析キット |
JP2017526664A (ja) * | 2014-08-26 | 2017-09-14 | アプラゴン オイAplagon Oy | 血漿タンパク質にコンジュゲートしたヘパリンを含む治療用apac分子 |
US10433578B2 (en) | 2013-03-28 | 2019-10-08 | Philip Morris Products S.A. | Smoking article including a flavour delivery member |
JP2021105025A (ja) * | 2015-03-12 | 2021-07-26 | メディミューン,エルエルシー | アルブミン融合タンパク質を精製する方法 |
Families Citing this family (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6514500B1 (en) * | 1999-10-15 | 2003-02-04 | Conjuchem, Inc. | Long lasting synthetic glucagon like peptide {GLP-!} |
US7601691B2 (en) | 1999-05-17 | 2009-10-13 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Anti-obesity agents |
SI1180121T1 (en) * | 1999-05-17 | 2004-04-30 | Conjuchem, Inc. | Long lasting insulinotropic peptides |
US20090175821A1 (en) * | 1999-05-17 | 2009-07-09 | Bridon Dominique P | Modified therapeutic peptides with extended half-lives in vivo |
AU2002233089B2 (en) * | 2001-02-16 | 2005-12-22 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Long lasting glucagon-like peptide 2 (GLP-2) for the treatment of gastrointestinal diseases and disorders |
ES2242860T3 (es) | 2001-05-31 | 2005-11-16 | Conjuchem, Inc. | Inhibidores peptidicos de fusion de larga vida contra infecciones por vih. |
WO2008047241A2 (en) | 2006-10-16 | 2008-04-24 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Modified corticotropin releasing factor peptides and uses thereof |
US9242011B2 (en) | 2008-04-01 | 2016-01-26 | Novo Nordisk A/S | Insulin albumin conjugates |
US9493545B2 (en) | 2009-02-11 | 2016-11-15 | Albumedix A/S | Albumin variants and conjugates |
EP3421491A3 (en) | 2009-10-30 | 2019-03-27 | Albumedix Ltd | Albumin variants |
WO2011106086A1 (en) * | 2010-02-25 | 2011-09-01 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Pegylated albumin polymers and uses thereof |
JP5969458B2 (ja) | 2010-04-09 | 2016-08-17 | アルブミディクス アクティーゼルスカブ | アルブミン誘導体及び変異体 |
EP2780364A2 (en) | 2011-11-18 | 2014-09-24 | Eleven Biotherapeutics, Inc. | Proteins with improved half-life and other properties |
BR112014018679A2 (pt) | 2012-03-16 | 2017-07-04 | Novozymes Biopharma Dk As | variantes de albumina |
BR112015010318A2 (pt) | 2012-11-08 | 2017-08-22 | Albumedix As | Variantes de albumina |
WO2014122079A2 (en) * | 2013-02-05 | 2014-08-14 | Chr. Hansen A/S | Improved purification of proteins via a deglycosylation step |
CN104147596A (zh) * | 2013-05-14 | 2014-11-19 | 李荣秀 | 生物药非共价结合聚合物延长治疗浓度的方法及用途 |
CN103724425B (zh) * | 2013-12-27 | 2016-02-03 | 长春圣金诺生物制药有限公司 | 一种重组人生长激素粗提中的提取方法 |
CN104945499B (zh) * | 2014-03-31 | 2019-12-10 | 博瑞生物医药(苏州)股份有限公司 | 结构修饰的glp-1类似物及其制备方法 |
CN105153311B (zh) * | 2015-07-17 | 2018-09-04 | 山东泉港药业有限公司 | 重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白及其制备方法 |
CN108137674B (zh) | 2015-08-20 | 2022-12-06 | 阿尔布梅迪克斯医疗有限公司 | 白蛋白变体和缀合物 |
CN105399834A (zh) * | 2015-10-29 | 2016-03-16 | 岳阳新华达制药有限公司 | 一种人胰高血糖素样肽-1类似物的复合物及其制备方法 |
CN106890135B (zh) * | 2017-03-07 | 2020-04-07 | 中国科学院化学研究所 | 一种pH响应性肽基水凝胶及其制备方法与应用 |
CN108840922A (zh) * | 2018-06-04 | 2018-11-20 | 河北常山生化药业股份有限公司 | 分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法 |
CN115397846A (zh) * | 2020-03-06 | 2022-11-25 | 昆山新蕴达生物科技有限公司 | 疏水性修饰的白蛋白及其制备方法和用途 |
WO2021222759A1 (en) * | 2020-04-30 | 2021-11-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Albumin drug conjugates and use thereof for the treatment of cancer |
CN111925450B (zh) * | 2020-09-21 | 2020-12-15 | 迈威(上海)生物科技股份有限公司 | 一种去除毕赤酵母表达重组蛋白聚集体和/或降解片段的方法 |
CN113045638B (zh) * | 2021-04-01 | 2022-04-15 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种酿酒酵母表达长效重组人丝聚蛋白及其应用 |
CN115715809A (zh) * | 2022-11-24 | 2023-02-28 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 重组人血清白蛋白-药物偶联物 |
CN115845079B (zh) * | 2022-11-24 | 2023-07-18 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备方法 |
CN115894719B (zh) * | 2022-11-24 | 2023-10-20 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 一种人血清白蛋白胰岛素偶联物及其制备方法 |
Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03103188A (ja) * | 1989-09-18 | 1991-04-30 | Green Cross Corp:The | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
EP0612761A1 (en) * | 1993-02-25 | 1994-08-31 | The Green Cross Corporation | Human serum albumin and process for producing the same |
US6358918B1 (en) * | 1997-01-17 | 2002-03-19 | Baxter Aktiengesellschaft | Preparation comprising thiol-group-containing proteins |
US20030138872A1 (en) * | 1999-11-02 | 2003-07-24 | Glenn Kawasaki | Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine |
WO2003103572A2 (en) * | 2002-06-04 | 2003-12-18 | Eli Lilly And Company | Modified glucagon-like peptide-1 analogs |
WO2004071536A1 (en) * | 2003-02-17 | 2004-08-26 | Upperton Limited | Conjugates for medical imaging comprising carrier, targeting moiety and a contrast agent |
JP2005514060A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-05-19 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | アルブミン融合タンパク質 |
WO2005058958A2 (en) * | 2003-12-18 | 2005-06-30 | Novo Nordisk A/S | Novel glp-1 analogues linked to albumin-like agents |
JP2005524633A (ja) * | 2002-02-08 | 2005-08-18 | ユニバーシティ オブ サウス フロリダ | 増殖した細胞系およびその使用方法 |
WO2005103087A1 (en) * | 2004-04-23 | 2005-11-03 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Method for the purification of albumin conjugates |
Family Cites Families (78)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4206199A (en) * | 1977-07-22 | 1980-06-03 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Novel glucagon fragment and its derivatives |
US4251631A (en) * | 1978-02-23 | 1981-02-17 | Research Products Rehovot Ltd. | Cross-linked enzyme membrane |
US4462941A (en) * | 1982-06-10 | 1984-07-31 | The Regents Of The University Of California | Dynorphin amide analogs |
US4736866A (en) * | 1984-06-22 | 1988-04-12 | President And Fellows Of Harvard College | Transgenic non-human mammals |
US4745100A (en) * | 1985-05-14 | 1988-05-17 | Eye Research Institute Of Retina Foundation | Stimulation of tear secretion |
US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
US5120712A (en) * | 1986-05-05 | 1992-06-09 | The General Hospital Corporation | Insulinotropic hormone |
US5118666A (en) * | 1986-05-05 | 1992-06-02 | The General Hospital Corporation | Insulinotropic hormone |
US5614492A (en) * | 1986-05-05 | 1997-03-25 | The General Hospital Corporation | Insulinotropic hormone GLP-1 (7-36) and uses thereof |
US4902505A (en) * | 1986-07-30 | 1990-02-20 | Alkermes | Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier |
US4859604A (en) * | 1987-08-27 | 1989-08-22 | Ampor, Inc. | Composition for stabilization of diagnostic reagents |
US5968914A (en) * | 1987-10-28 | 1999-10-19 | Pro-Neuron, Inc. | Treatment of chemotherapeutic agent and antiviral agent toxicity with acylated pyrimidine nucleosides |
US5919665A (en) * | 1989-10-31 | 1999-07-06 | Ophidian Pharmaceuticals, Inc. | Vaccine for clostridium botulinum neurotoxin |
US5545618A (en) * | 1990-01-24 | 1996-08-13 | Buckley; Douglas I. | GLP-1 analogs useful for diabetes treatment |
US5612034A (en) * | 1990-10-03 | 1997-03-18 | Redcell, Inc. | Super-globuling for in vivo extended lifetimes |
US5725804A (en) * | 1991-01-15 | 1998-03-10 | Hemosphere, Inc. | Non-crosslinked protein particles for therapeutic and diagnostic use |
AU666853B2 (en) * | 1991-04-05 | 1996-02-29 | Genentech Inc. | Platelet aggregation inhibitors having high specificity for GP IIbIIIa |
US5103233A (en) * | 1991-04-16 | 1992-04-07 | General Electric Co. | Radar system with elevation-responsive PRF control, beam multiplex control, and pulse integration control responsive to azimuth angle |
EP0597010A4 (en) * | 1991-07-31 | 1996-12-27 | Rhone Poulenc Rorer Int | Transgenic protein production. |
FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
ES2193143T3 (es) * | 1992-03-05 | 2003-11-01 | Univ Texas | Uso de inmunoconjugados para la diagnosis y/o terapia de tumores vascularizaos. |
US5424286A (en) * | 1993-05-24 | 1995-06-13 | Eng; John | Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same |
US5614487A (en) * | 1993-05-28 | 1997-03-25 | Genentech, Inc. | Sustained release pharmaceutical composition |
CA2127679A1 (en) * | 1993-07-27 | 1995-01-28 | Ewald Vorberg | Set of reagents for determining the fructosamine content |
US20020018751A1 (en) * | 1993-10-15 | 2002-02-14 | BRIDON Dominique P. | Cellular and serum protein anchors for diagnostic imaging |
US5705483A (en) * | 1993-12-09 | 1998-01-06 | Eli Lilly And Company | Glucagon-like insulinotropic peptides, compositions and methods |
DK145493D0 (da) * | 1993-12-23 | 1993-12-23 | Dako As | Antistof |
US5429746A (en) * | 1994-02-22 | 1995-07-04 | Smith Kline Beecham Corporation | Antibody purification |
CA2187322A1 (en) * | 1994-04-07 | 1995-10-19 | Israel Rubinstein | Vasoactive intestinal polypeptide |
US5939390A (en) * | 1995-03-09 | 1999-08-17 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition |
US5869602A (en) * | 1995-03-17 | 1999-02-09 | Novo Nordisk A/S | Peptide derivatives |
US5654276A (en) * | 1995-06-07 | 1997-08-05 | Affymax Technologies N.V. | Peptides and compounds that bind to the IL-5 receptor |
GB9526733D0 (en) * | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
US6277583B1 (en) * | 1996-02-07 | 2001-08-21 | Conjuchem, Inc. | Affinity labeling libraries and applications thereof |
CN1183158C (zh) * | 1996-06-05 | 2005-01-05 | 罗赫诊断器材股份有限公司 | Exendin类似物,其制备方法及含有它们的药物制剂 |
US5840733A (en) * | 1996-07-01 | 1998-11-24 | Redcell, Canada, Inc. | Methods and compositions for producing novel conjugates of thrombin inhibitors and endogenous carriers resulting in anti-thrombins with extended lifetimes |
US5763401A (en) * | 1996-07-12 | 1998-06-09 | Bayer Corporation | Stabilized albumin-free recombinant factor VIII preparation having a low sugar content |
DE69739172D1 (de) * | 1996-08-08 | 2009-01-29 | Amylin Pharmaceuticals Inc | Regulation gastrointestinaler beweglichkeit |
US6268343B1 (en) * | 1996-08-30 | 2001-07-31 | Novo Nordisk A/S | Derivatives of GLP-1 analogs |
US6277819B1 (en) * | 1996-08-30 | 2001-08-21 | Eli Lilly And Company | Use of GLP-1 or analogs in treatment of myocardial infarction |
AU4351897A (en) * | 1996-09-16 | 1998-04-02 | Conjuchem, Inc. | Affinity labeling libraries with tagged leaving groups |
UA65549C2 (uk) * | 1996-11-05 | 2004-04-15 | Елі Ліллі Енд Компані | Спосіб регулювання ожиріння шляхом периферійного введення аналогів та похідних glp-1 (варіанти) та фармацевтична композиція |
DE122007000044I2 (de) * | 1997-01-07 | 2011-05-05 | Amylin Pharmaceuticals Inc | Verwendung von exedinen und deren antagonisten zur verminderung der lebensmittelaufnahme |
US6723530B1 (en) * | 1997-02-05 | 2004-04-20 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Polynucleotides encoding proexendin, and methods and uses thereof |
DE69839946D1 (de) * | 1997-11-07 | 2008-10-09 | Conjuchem Biotechnologies Inc | Methoden zum Screening von Affinitätsmarker-Bibliotheken |
US6437092B1 (en) * | 1998-11-06 | 2002-08-20 | Conjuchem, Inc. | Conjugates of opioids and endogenous carriers |
US6703359B1 (en) * | 1998-02-13 | 2004-03-09 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Inotropic and diuretic effects of exendin and GLP-1 |
WO1999046283A1 (en) * | 1998-03-09 | 1999-09-16 | Zealand Pharmaceuticals A/S | Pharmacologically active peptide conjugates having a reduced tendency towards enzymatic hydrolysis |
US6107489A (en) * | 1998-03-17 | 2000-08-22 | Conjuchem, Inc. | Extended lifetimes in vivo renin inhibitors |
US6998387B1 (en) * | 1998-03-19 | 2006-02-14 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Human appetite control by glucagon-like peptide receptor binding compounds |
US6432679B1 (en) * | 1998-06-12 | 2002-08-13 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Enhancement of B cell activation and immunoglobulin secretion by co-stimulation of receptors for antigen and EBV Gp350/220 |
EP1088084B1 (en) * | 1998-06-15 | 2006-09-13 | GTC Biotherapeutics, Inc. | Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein |
AU770712B2 (en) * | 1999-01-14 | 2004-02-26 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Methods for glucagon suppression |
US7399489B2 (en) * | 1999-01-14 | 2008-07-15 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Exendin analog formulations |
EP1609478A1 (en) * | 1999-01-14 | 2005-12-28 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Exendin agonist peptide formulations |
SI1180121T1 (en) * | 1999-05-17 | 2004-04-30 | Conjuchem, Inc. | Long lasting insulinotropic peptides |
US6887470B1 (en) * | 1999-09-10 | 2005-05-03 | Conjuchem, Inc. | Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components |
US6514500B1 (en) * | 1999-10-15 | 2003-02-04 | Conjuchem, Inc. | Long lasting synthetic glucagon like peptide {GLP-!} |
DK1264840T3 (da) * | 1999-05-17 | 2009-11-16 | Conjuchem Biotechnologies Inc | Langtidsvirkende fusionspeptidinhibitorer af viral infektion |
US6849714B1 (en) * | 1999-05-17 | 2005-02-01 | Conjuchem, Inc. | Protection of endogenous therapeutic peptides from peptidase activity through conjugation to blood components |
US6506724B1 (en) * | 1999-06-01 | 2003-01-14 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Use of exendins and agonists thereof for the treatment of gestational diabetes mellitus |
US6528486B1 (en) * | 1999-07-12 | 2003-03-04 | Zealand Pharma A/S | Peptide agonists of GLP-1 activity |
DE19932782A1 (de) * | 1999-07-14 | 2001-01-18 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Fraktionierung von Plasma oder Serum, so erhaltene Präparate und deren Verwendung |
DE19942230C2 (de) * | 1999-09-03 | 2003-09-25 | Wolf-Georg Forssmann | Verwendung natriuretischer Peptide als antibiotisch wirksame Subsanzen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen |
US6706892B1 (en) * | 1999-09-07 | 2004-03-16 | Conjuchem, Inc. | Pulmonary delivery for bioconjugation |
EP2267026A1 (en) * | 2000-04-12 | 2010-12-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
AU6323001A (en) * | 2000-05-19 | 2001-12-03 | Bionebraska Inc | Treatment of acute coronary syndrome with glp-1 |
DE60142351D1 (de) * | 2000-10-20 | 2010-07-22 | Amylin Pharmaceuticals Inc | Behandlung von hypoaktivem myokard und diabetischer herzmyopathie mit einem glp-1 peptid |
CN1501809B (zh) * | 2000-12-13 | 2012-10-10 | 伊莱利利公司 | 应用胰高血糖素样促胰岛肽的长期治疗方案 |
BR0206919A (pt) * | 2001-02-02 | 2004-07-06 | Conjuchem Inc | Derivados de fator de liberação de hormÈnio de crescimento de longa duração |
ES2242860T3 (es) * | 2001-05-31 | 2005-11-16 | Conjuchem, Inc. | Inhibidores peptidicos de fusion de larga vida contra infecciones por vih. |
AU2002364587A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-30 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
US6861236B2 (en) * | 2002-05-24 | 2005-03-01 | Applied Nanosystems B.V. | Export and modification of (poly)peptides in the lantibiotic way |
CA2500248C (en) * | 2002-09-24 | 2013-03-19 | Frontier Biotechnologies Co., Ltd. | Peptide derivative fusion inhibitors of hiv infection |
US6989369B2 (en) * | 2003-02-07 | 2006-01-24 | Dyax Corp. | Kunitz domain peptides |
WO2005007809A2 (en) * | 2003-05-30 | 2005-01-27 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Antibodies and fusion proteins that include engineered constant regions |
KR100844593B1 (ko) * | 2004-03-09 | 2008-07-07 | 내셔날 헬스 리서치 인스티튜트 | 피롤리딘 화합물 |
CN101374941A (zh) * | 2005-12-29 | 2009-02-25 | 人类起源公司 | 采集和保存胎盘干细胞的改良组合物及其使用方法 |
-
2006
- 2006-12-22 CN CN2006800531729A patent/CN101384623B/zh active Active
- 2006-12-22 WO PCT/CA2006/002124 patent/WO2007071068A1/en active Application Filing
- 2006-12-22 EP EP06840550A patent/EP1976876A4/en not_active Withdrawn
- 2006-12-22 JP JP2008546063A patent/JP2009520469A/ja active Pending
- 2006-12-22 MX MX2008008076A patent/MX2008008076A/es unknown
- 2006-12-22 US US11/645,297 patent/US20070269863A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-22 CA CA002634495A patent/CA2634495A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-22 AU AU2006329215A patent/AU2006329215A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-03-14 US US13/047,702 patent/US20110313132A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03103188A (ja) * | 1989-09-18 | 1991-04-30 | Green Cross Corp:The | ヒト血清アルブミンの製造方法 |
EP0612761A1 (en) * | 1993-02-25 | 1994-08-31 | The Green Cross Corporation | Human serum albumin and process for producing the same |
US6358918B1 (en) * | 1997-01-17 | 2002-03-19 | Baxter Aktiengesellschaft | Preparation comprising thiol-group-containing proteins |
US20030138872A1 (en) * | 1999-11-02 | 2003-07-24 | Glenn Kawasaki | Enzymatic cycling assays for homocysteine and cystathionine |
JP2005514060A (ja) * | 2001-12-21 | 2005-05-19 | ヒューマン ジノーム サイエンシーズ, インコーポレイテッド | アルブミン融合タンパク質 |
JP2005524633A (ja) * | 2002-02-08 | 2005-08-18 | ユニバーシティ オブ サウス フロリダ | 増殖した細胞系およびその使用方法 |
WO2003103572A2 (en) * | 2002-06-04 | 2003-12-18 | Eli Lilly And Company | Modified glucagon-like peptide-1 analogs |
WO2004071536A1 (en) * | 2003-02-17 | 2004-08-26 | Upperton Limited | Conjugates for medical imaging comprising carrier, targeting moiety and a contrast agent |
WO2005058958A2 (en) * | 2003-12-18 | 2005-06-30 | Novo Nordisk A/S | Novel glp-1 analogues linked to albumin-like agents |
WO2005103087A1 (en) * | 2004-04-23 | 2005-11-03 | Conjuchem Biotechnologies Inc. | Method for the purification of albumin conjugates |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6012015630; Bioorg. Med. Chem. Lett. Vol.14, 2004, P.4395-4398 * |
JPN6012015631; Nucl. Acids Res. Vol.9, No.22, 1981, P.6103-6114 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016515529A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-30 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドBiogen MA Inc. | 無塩条件下で疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するタンパク質精製 |
US11111269B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-09-07 | Biogen Ma Inc. | Hydrophobic interaction protein chromatography under no-salt conditions |
US10433578B2 (en) | 2013-03-28 | 2019-10-08 | Philip Morris Products S.A. | Smoking article including a flavour delivery member |
JP2017526664A (ja) * | 2014-08-26 | 2017-09-14 | アプラゴン オイAplagon Oy | 血漿タンパク質にコンジュゲートしたヘパリンを含む治療用apac分子 |
JP2020111597A (ja) * | 2014-08-26 | 2020-07-27 | アプラゴン オイAplagon Oy | 血漿タンパク質にコンジュゲートしたヘパリンを含む治療用apac分子 |
JP2021105025A (ja) * | 2015-03-12 | 2021-07-26 | メディミューン,エルエルシー | アルブミン融合タンパク質を精製する方法 |
JP7320550B2 (ja) | 2015-03-12 | 2023-08-03 | メディミューン,エルエルシー | アルブミン融合タンパク質を精製する方法 |
JP2017058278A (ja) * | 2015-09-17 | 2017-03-23 | 国立大学法人 東京大学 | 酸化型及び還元型アルブミンの分析方法、酸化型及び還元型アルブミンの分析装置、及び酸化型及び還元型アルブミンの分析キット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20070269863A1 (en) | 2007-11-22 |
CN101384623A (zh) | 2009-03-11 |
EP1976876A4 (en) | 2010-01-13 |
CN101384623B (zh) | 2013-07-24 |
US20110313132A1 (en) | 2011-12-22 |
WO2007071068A1 (en) | 2007-06-28 |
CA2634495A1 (en) | 2007-06-28 |
EP1976876A1 (en) | 2008-10-08 |
MX2008008076A (es) | 2008-11-28 |
AU2006329215A1 (en) | 2007-06-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2009520469A (ja) | アルブミンと治療薬との前もって形成された抱合体の産生のための方法 | |
AU715210B2 (en) | Recombinant fusion proteins to growth hormone and serum albumin | |
US9657079B2 (en) | Truncated GLP-1 derivatives and their therapeutical use | |
KR101400105B1 (ko) | N-말단 폴리시알화 | |
AU2007291502B2 (en) | Method for the production of conjugates of insulin-like growth factor-I and poly(ethylene glycol) | |
CN108367053A (zh) | 使用生长分化因子15(gdf-15)治疗或改善代谢性疾病的方法 | |
KR101106795B1 (ko) | 인슐린-유사 성장 인자-i의 제조 방법 | |
WO2011020320A1 (zh) | 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其制备方法与用途 | |
US20150025003A1 (en) | Glucagon-like peptide-1 derivatives and their pharmaceutical use | |
CA2187083A1 (fr) | Fragment peptidique de la proteine g du virus respiratoire syncytial, agent immunogene, composition pharmaceutique le contenant et procede de preparation | |
CA2776241A1 (en) | Albumin variants | |
US20070293429A1 (en) | Vasoactive Intestinal Polypeptide Compositions | |
WO2015014228A1 (zh) | Glp-1类似物融合蛋白,及其制备方法和用途 | |
Chen et al. | Bioactivity and pharmacokinetics of two human serum albumin–thymosin α1-fusion proteins, rHSA-Tα1 and rHSA-L-Tα1, expressed in recombinant Pichia pastoris | |
Di Cesare et al. | High-yield production of PASylated human growth hormone using secretory E. coli technology | |
CA2094512A1 (en) | Fusion polypeptides | |
TW201109033A (en) | Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof | |
JP6014194B2 (ja) | Igf−iポリ(エチレングリコール)コンジュゲート | |
Wang et al. | Expression, purification, and lipolytic activity of recombinant human serum albumin fusion proteins with one domain of human growth hormone in P ichia pastoris | |
JP7394207B2 (ja) | 新規な中間体製造による持続型薬物結合体の製造方法 | |
Houard et al. | Cloning, expression and purification of recombinant cotton rat interferon-gamma | |
KR20210009980A (ko) | 단백질 결합체의 신규 제조 방법 | |
CN104592382A (zh) | 一种peg-长链脂肪烷定点修饰的人生长激素及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091216 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120417 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20121009 |