KR20210009980A - 단백질 결합체의 신규 제조 방법 - Google Patents

단백질 결합체의 신규 제조 방법 Download PDF

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KR20210009980A
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Abstract

본 발명은 단백질 결합체의 신규 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 단백질 결합체에 관한 것이다.

Description

단백질 결합체의 신규 제조 방법{Novel method for preparing a protein conjugate}
본 발명은 단백질 결합체의 제조 방법에 관한 것이다.
생리활성 폴리펩타이드는 안정성이 낮아 쉽게 변성되고 혈액 내 단백질 가수분해효소에 의해 분해되어 신장이나 간을 통해 쉽게 제거되기 때문에, 약리성분으로 생리활성 폴리펩타이드를 포함하는 단백질 의약품의 혈중 농도 및 역가를 유지하기 위해서는 단백질 약물을 환자에게 자주 투여할 필요가 있다. 그러나, 대부분 주사제 형태로 환자에게 투여되는 단백질 의약품의 경우, 생리활성 폴리펩타이드의 혈중 농도를 유지하기 위해 자주 주사를 놓는 것은 환자에게 엄청난 고통을 야기하게 되며 높은 치료비용의 원인이 된다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 단백질 약물의 혈중 안정성을 증가시키고 혈중 약물 농도를 오랫동안 높게 지속시켜 약효를 극대화하려는 노력이 계속되어 왔다. 이러한 단백질 약물의 지속형 제제는 단백질 약물의 안정성을 높이는 동시에 약물 자체의 역가가 충분히 높게 유지되어야 하고 환자에게 면역반응을 유발하지 않아야 한다.
단백질을 안정화시키고 단백질 가수분해효소와의 접촉 및 신장 소실을 억제하기 위한 방법으로, 종래에는 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol: 이하 "PEG"라 약칭함)과 같이 용해도가 높은 고분자를 단백질 약물 표면에 화학적으로 부가시키는 방법이 사용되어 왔다. 그러나, PEG를 이용하는 방법은 PEG 분자량을 증가시켜 펩타이드 약물의 생체 내 지속시간을 연장할 수 있는 반면, 분자량이 증가할수록 펩타이드 약물의 역가가 현저히 낮아지고, 또한 펩타이드와의 반응성이 낮아져 수율이 감소하는 문제가 있다.
이에, 혈중반감기 증대를 위한 방법으로서, 면역글로불린 단편과 생리활성 폴리펩타이드의 결합체가 이용되어 왔고, 그 제조방법의 개선을 위해 다각도의 연구가 계속되어 왔다(한국공개특허 제10-2014-0109342호).
한편, GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제의 한 예인 옥신토모듈린은 전구체인 프리 글루카곤(pre-glucagon)으로부터 만들어지며 주요 특징으로서 Glucagon-Like Peptide-1 (GLP-1)과 글루카곤 (glucagon)수용체에 모두 결합하여 이중 기능 (dual function)을 할 수 있는 펩타이드이기 때문에, 비만, 당뇨병, 고지혈증, 지방간 치료 등 다양한 목적으로 연구가 되고 있다.
그러나, 옥신토모듈린은 생체 내에서 반감기가 짧고, 이의 활성이 상기 비만, 당뇨, 고지혈증, 지방간 치료 등에 사용될 수 있을 정도로 나타나지 않아 고용량을 투여해야 하는 문제점이 존재한다. 이에, 증대된 반감기를 갖는 옥신토모듈린을 제조하기 위한 연구 개발이 요구된다.
본 발명의 하나의 목적은 단백질 결합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 제조방법으로 제조된 단백질 결합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 신규한 단백질 결합체의 제조방법이다.
하나의 구체예에서, 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 하기 화학식 1의 링커를 연결하여 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 단백질 결합체의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
CHO-L1-(OCH2CH2)nO-L2-R
상기 화학식 1에서,
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 10 내지 2400이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
앞선 구체예에 따른 제조방법으로서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역은 환원제의 존재 하에 pH 4.0 내지 8.0에서 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 1의 링커를 연결하여 제조된 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 결합체는 pH 5.5 내지 8.0에서 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제를 연결하여 제조된 것인 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 결합체를 제조하는 단계는 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역 및 이중작용제를 1:1 내지 1:3의 몰비로 반응시키는 것인 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 1의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 및 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것인 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커는 이중작용제의 시스테인과 연결되는 것인, 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 화학식 1의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 pH 6.0 내지 8.5의 완충 용액 속에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및 상기 단계에서 정제된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것인 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 제조하는 단계 후 한외/투석여과를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는 것인 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 결합체를 1차례의 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 단계를 추가로 포함하는 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 화학식 1에서의 L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고; L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이며; a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고; n은 200 내지 250이며; R은 말레이미드인 것인 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 링커는 하기 화학식 2의 구조를 갖는 것인 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 2]
Figure pat00001
상기 화학식 2에서, n은 200 내지 250임.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 링커는 1 내지 100 kDa의 크기를 갖는 것인 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc영역은 하기 화학식 3의 구조를 갖는 것인 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 3]
Figure pat00002
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 제조방법에 관한 것이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 이중작용제는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 제조방법에 관한 것이다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 상기 방법으로 제조된 단백질 결합체이다.
본 발명에 따른 단백질 결합체의 제조방법은 기존 정제 공정의 일부 생략에도 불구하고, 높은 수율로 단백질 결합체를 제조할 수 있으므로, 단백질 결합체 생산성을 높일 수 있다.
도 1은 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 구조를 MALDI-TOF 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 방법으로 제조된 면역글로불린 Fc 영역-PEG 를 포함하는 링커-옥시토모듈린 유도체의 결합체의 구조를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다.
한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 전반을 통하여, 천연적으로 존재하는 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용될 뿐만 아니라 Aib(α-아미노이소부티르산), Sar(N-메틸글리신), 알파-메틸글루탐산(α-methyl-glutamic acid) 등과 같은 다른 아미노산에 대해 일반적으로 허용되는 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재되었다.
알라닌 Ala, A 아르기닌 Arg, R
아스파라긴 Asn, N 아스파르트산 Asp, D
시스테인 Cys, C 글루탐산 Glu, E
글루타민 Gln, Q 글리신 Gly, G
히스티딘 His, H 이소류신 Ile, I
류신 Leu, L 리신 Lys, K
메티오닌 Met, M 페닐알라닌 Phe, F
프롤린 Pro, P 세린 Ser, S
트레오닌 Thr, T 트립토판 Trp, W
티로신 Tyr, Y 발린 Val, V
본 발명의 하나의 양태는 단백질 결합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법은 링커를 통해 이중작용제 및 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 단백질 결합체를 제조하는 방법으로서, i) 폴리에틸렌글리콜(PEG)를 포함하는 링커 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결한 후, ii) 상기 면역글로불린 Fc 영역과 연결된 링커를 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하는 순으로 이루어지는 것을 특징으로 한다. 즉, PEG를 포함하는 링커 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 1단계 이후, 면역글로불린 Fc 영역에 연결된 링커에 이중작용제를 연결하는 2단계로 수행되는, 특정 순서의 단백질 결합체를 제조하는 것을 특징으로 한다. 상기 제조방법은 본 출원에서, “역순제법”으로 통용될 수 있다.
본 발명에서는, PEG를 포함하는 링커 및 면역글로불린 Fc 영역을 먼저 연결하는 제조방법의 경우, 한외/투석여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 단계를 생략할 수 있으며, 상기 정제 단계의 생략에도 불구하고, 높은 수율로 단백질 결합체를 제조할 수 있음을 확인하였다.
링커와 이중작용제를 먼저 연결하고, 이후에 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 기존 제법에서는, 이중작용제가 연결된 링커(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)와 면역글로불린 Fc 영역을 연결할 때, 이중작용제와 연결된 링커의 정제에 이용되는 평형완충액 및 용출완충액의 낮은 pH 조건(pH 3.0 내외)으로 인해 발생 가능한 응집(aggregation) 위험성 감소 및 반응을 위한 적절한 버퍼를 이용한 pH 조건을 맞춰 주어야 했기 때문에, 링커와 이중작용제를 연결한 후, 면역글로불린 Fc 영역과 연결하는 공정 전에 한외/투석 여과가 별도의 공정으로 요구되었다.
반면, 링커와 면역글로불린 Fc 영역을 먼저 연결하는 본 발명의 제조방법에서는, 면역글로불린 Fc 영역과 링커가 연결된 형태를 정제 시 사용되는 버퍼의 pH가 상대적으로 높아 한외/투석여과 공정을 생략하고 이중작용제와 연결시키는 공정을 수행할 수 있는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 제조방법은 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 제조하는 단계 후 한외/투석여과를 수행하지 않는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 단백질 결합체의 제조 방법에서는 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 정제액의 pH가 후속 반응액의 pH와 큰 차이가 없게 되므로, 한외/투석여과를 수행하지 않고, 이중작용제의 연결을 수행할 수 있다. 한외/투석여과 공정의 생략으로, 농축 단계에서 발생할 수 있는 응집체 불순물 생성 위험을 감소 시키고, 제조 공정을 간소화하여 기술의 상업화 시 비용의 감소 효과 또한 기대할 수 있다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 결합체를 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 소수성 상호작용 크로마토그래피는 1회만 수행되는 것일 수 있고, 또는 단백질 결합체의 이중작용제의 성질 및 링커의 종류, 크기에 따라 1회 이상 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 제조방법은 고가의 약물인 이중작용제의 사용량을 감소시킬 뿐만 아니라, 반응하지 않은 면역글로불린 Fc 영역의 양도 감소시킴에 따라 소수성 상호작용 크로마토그래피의 정제 공정을 전부 또는 일부 생략할 수 있게 하므로, 기존의 방법에 비하여 단백질 결합체 제조에 필요한 원료 및 비용을 절감할 수 있는 효과를 갖는다.
한편, 본 발명에 따른 제조방법은 기존의 단백질 결합체 제조 과정 중에 수행되는 한외/투석여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 공정이 생략되고, 최종 정제 공정만 수행(예를 들어, 1차례의 소수성 상호작용 크로마토그래피)됨에도 불구하고, 기존 공정과 대비하여 최종 결합체의 순도가 유지되는 장점을 갖는다. 즉, 본 발명에 따른 제조방법은 일부 정제 공정의 생략에도 불구하고, 최종 순도를 유지할 수 있고, 이로 인해 단백질 결합체 제조의 생산성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서 단백질 결합체의 순도는 당업계의 공지된 방법으로 측정될 수 있으며, 그 방법의 예시로는 SE-HPLC, RP-HPLC, 또는 IE-HPLC 측정이 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조방법에 의할 경우, 단백질 결합체의 최종 순도는 90% 이상, 구체적으로 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 제조방법은 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 먼저 제조한 후, 이중작용제와 연결하는 순서를 거쳐 제조함에 따라, 이중작용제는 물론 면역글로불린 Fc 영역 기준으로도 기존의 방법에 대비하여 높은 수율로 단백질 결합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 기존의 방법으로 단백질 결합체를 제조하는 경우에 비해, 본 발명의 제조 방법으로 단백질 결합체를 제조할 때의 수율이 2배 이상 향상된 것을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 제조방법은 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 하기 화학식 1의 링커를 연결하여 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는, 단백질 결합체의 제조방법에 관한 것이다:
[화학식 1]
CHO-L1-(OCH2CH2)nO-L2-R
상기 화학식 1에서,
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 10 내지 2400이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로,
상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 1의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 및 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있으며, 또는
상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 화학식 1의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 pH .0 내지 8.5, pH 6.0 내지 8.0, pH 6.0 내지 7.5, pH 6.0 내지 7.0, pH 6.1 내지 6.9, pH 6.2 내지 6.8, 또는 pH 6.3 내지 6.7의 완충 용액 속에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및 상기 단계에서 정제된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 제조방법에서,
(i) 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역은 환원제의 존재 하에 pH 4.0 내지 8.0, pH 4.5 내지 7.5, pH 5.5 내지 7.5, pH 5.6 내지 7.4, pH 5.7 내지 7.3 또는 pH 5.8 내지 7.2에서 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 1의 링커를 연결하여 제조된 것; 및/또는
(ii) 상기 결합체는 pH 5.5 내지 8.0, pH 6.0 내지 7.5, 또는 pH 6.5 내지 7.5에서 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 이중작용제를 연결하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 제조방법의 상기 결합체를 제조하는 단계는, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역에 비해 동량 이상의 이중작용제를 반응시키는 것일 수 있고, 구체적으로, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역: 이중작용제를 1:1 내지 1:10, 1:1 내지 1:7, 1:1 내지 1:5, 또는 1:1 내지 1:3의 몰비로 반응시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 “단백질 결합체”는 GLP-1(glucagon-like peptide-1) 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제가 면역글로불린 Fc 영역과 링커를 통해 연결된 구조를 갖는, 반감기가 증대된 단백질의 결합체를 의미한다.
본 발명의 용어, “이중작용제”는 GLP-1 및 글루카곤 두 receptor에 활성을 나타내는 물질을 의미하고, 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 의미한다.
본 발명의 단백질 결합체 제조방법은 옥신토모듈린 유도체와 면역글로불린 Fc 영역이 링커를 통해 연결된 결합체를 제조하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “면역글로불린 Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 또는 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 N-말단에 특정 힌지 서열을 포함한다.
본 발명의 용어, “힌지 서열”은 중쇄에 위치하여 이황화결합(inter disulfide bond)를 통하여 면역글로불린 Fc 영역의 이량체를 형성하는 부위를 의미한다.
본 발명에서, 상기 힌지 서열은 하기의 아미노산 서열을 갖는 힌지 서열 중 일부가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 4).
본 발명의 목적상, 상기 힌지 서열은 상기 서열번호 4의 힌지 서열 중 8번째 또는 11번째 시스테인 잔기가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 힌지 서열은 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는, 3 내지 12개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 힌지 서열은 다음과 같은 서열을 가질 수 있다: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Pro-Ser-Cys-Pro, Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys, Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro, Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro, Glu-Pro-Ser-Cys. 더욱 구체적으로는 상기 힌지 서열은 서열번호 5(Ser-Cys-Pro) 또는 서열번호 6(Pro-Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열의 존재로 면역글로불린 Fc 사슬 두 분자가 이량체를 형성한 형태일 수 있고, 또한, 본 발명의 단백질 결합체는 링커의 일 말단이 이량체의 면역글로불린 Fc 영역의 한 사슬에 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, “N-말단”은 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 아미노 말단의 최말단, 또는 최말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 아미노산까지 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열을 N-말단에 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체는 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 면역글로불린 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 면역글로불린 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피 (size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 면역글로불린 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며, 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
또한, 본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역(바람직하게는 Fc 영역)내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 불변영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “링커”는 단백질 결합체에서 단백질(예를 들어, 이중작용제) 및 면역글로불린 Fc 영역을 연결하는 일 모이어티로서, 상기 링커는 펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 링커일 수 있다.
구체적으로, 상기 링커는 하기 화학식 1로 표현되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 1]
CHO-L1-(OCH2CH2)nO-L2-R
상기 화학식 1에서,
L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
n은 1 내지 3000, 10 내지 2000, 50 내지 1000, 100 내지 700, 150 내지 300, 또는 200 내지 250이고;
R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트,
상기 링커는 폴리에틸렌글리콜을 포함하고, 폴리에틸렌글리콜의 양 말단에 특정 화학 구조를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 화학식 1에서의 L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고; L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이며; a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고; n은 200 내지 250이며; R은 말레이미드일 수 있고, 상기 링커는 1 내지 200 kDa, 1 내지 150kDa, 1 내지 100kDa, 1 내지 50kDa, 또는 1 내지 10kDa의 크기를 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 링커는 하기 화학식 2의 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
[화학식 2]
Figure pat00003
상기 화학식 2 에서, n은 1 내지 3000, 10 내지 2000, 50 내지 1000, 100 내지 700, 150 내지 300, 또는 200 내지 250일 수 있다.
상기 링커의 일 말단은 면역글로불린 Fc 영역, 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단, 보다 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 위치하는 힌지 서열, 구체적으로 힌지 서열의 프롤린 잔기와 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, “단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역”은 하나의 폴리에틸렌글리콜을 포함하는 하나의 링커가 면역글로불린 Fc 영역과 연결된, 본 발명에 따른 단백질 결합체의 제조 과정 중간에 발생하는 중간체 물질을 의미한다. 링커와 면역글로불린 Fc 영역의 연결은 링커의 일 말단과 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단이 공유 또는 비공유 결합에 의한 것일 수 있으나, 결합 위치나 방식은 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단 프롤린과 링커의 -CHO 기의 연결에 의해 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역은 하기 화학식 3의 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[화학식 3]
Figure pat00004
상기 화학식 3에서,
n은 1 내지 3000, 10 내지 2000, 50 내지 1000, 100 내지 700, 150 내지 300, 또는 200 내지 250일 수 있고;
면역글로불린 Fc 영역은 단량체 형태인 면역글로불린 Fc 사슬일 수 있다.
본 발명의 제조방법은 상기 화학식 3의 구조를 갖는 단일 페길화된 면역글로부린 Fc 영역의 일 말단에 이중작용제를 연결하는 단계를 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 링커의 면역글로불린 Fc 영역과 연결되지 않은 다른 일 말단은 이중작용제와 연결되는 것일 수 있고, 구체적으로는 이중작용제의 -SH기 또는 -SH기를 포함하는 아미노산, 또는 시스테인과 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 실시예에서는 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 먼저 제조한 후 이중작용제와 연결하는 본 발명의 제조방법으로 단백질 결합체를 제조할 경우, 한외/투석여과 및 소수성 상호작용 크로마토그래피 공정이 생략되고, 최종 정제 공정만 수행(예를 들어, 1차례의 소수성 상호작용 크로마토그래피)됨에도 불구하고, 기존 공정과 대비하여 최종 결합체의 순도가 유지되면서도 수율이 향상되는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 방법으로 제조된, 단백질 결합체를 제공한다.
본 발명의 제조방법으로 제조된 단백질 결합체는 링커 또는 면역글로불린 Fc 영역이 연결되지 않은, 이중작용제에 비해 증가된 반감기를 나타내므로, 약제의 제조에 유리한 효과를 갖는다.
이중작용제를 포함하는 단백질 결합체는 비만, 대사성질환, 고지혈증 등의 예방, 치료, 또는 개선에 이용될 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
비교예: 페길화된 옥시토모듈린 유도체와 면역글로불린 Fc 영역의 연결에 의한 결합체 제조
페길화된 옥시토모듈린 유도체를 면역글로불린 Fc 영역과 연결하여 지속형 결합체를 제조하였다.
옥시토모듈린 유도체(서열번호 1)의 시스테인(-SH기)에 페길화(PEGylation)시키기 위하여, 옥시토모듈린 유도체:PEG를 포함하는 링커(화학식 2, 10 kDa, NOF corporation)의 몰비를 1:1~1:1.3으로, 옥시토모듈린 유도체의 농도를 약 3 g/L로 하여 약 1시간 반응시켰다. 구체적으로 반응은 이소프로판올을 포함한 Tris(6±4℃) 버퍼에서 이루어졌다. 단일 페길화된 옥시토모듈린 유도체를 얻기 위해 상기 반응액을 구연산나트륨과 에탄올이 포함된 평형완충액으로 총 20배 부피가 되게 희석하고 정제하였다. 이 때, SP High Performance(GE Healthcare, 양이온 교환 크로마토그래피)컬럼을 이용하여 구연산나트륨과 에탄올이 포함된 용액과 염화칼륨 농도구배로 단일 페길화된 옥시토모듈린 유도체를 정제하였다. 페길화된 옥시토모듈린 유도체 정제액을 물로 희석한 후, 분리막 한외/투석여과(UF/DF)방법을 통하여 0.1 M 인산칼륨용액으로 완충액교환 및 농축하여 최종 회수농도가 약 3 g/L이상이 되게 하였다.
상기에서 제조된 단일 페길화된 옥시토모듈린 유도체를 면역글로불린 Fc 영역 연결하여 지속형 결합체를 다음과 같이 제조하였다.
이 때, 단일 페길화된 옥시토모듈린 유도체의 알데하이드기와 면역글로불린 Fc 영역의 아미노말단이 결합하도록 단일 페길화된 옥시토모듈린 유도체와 면역글로불린 Fc 영역의 몰비를 1:2.5~1:5로, 총 단백질 농도(옥시토모듈린 유도체 및 면역글로불린 Fc 영역)를 약 35 g/L로 하여 6±4℃에서 약 12~16시간 반응시켰다.
결합반응 이후 미 반응된 면역글로불린 Fc 영역을 분리, 제거하기 위해 Butyl 4 Fast Flow (GE Healthcare, 소수성 상호작용 크로마토그래피) 컬럼을 이용하여 정제하였다. 이 때, 반응액에 트리스와 염화나트륨을 투입하였고, 비스트리스가 포함된 용액과 염화나트륨 농도구배로 정제하였다.
이후, 추가로 Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 공정 부산물을 제거하여, 면역글로불린 Fc영역-PEG를 포함하는 링커-옥시토모듈린 유도체의 결합체를 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다. 본 발명자들은 상기 비교예에 따른 결합체 제조 과정에서, 막 투과 공정 및 정제 공정(소수성 상호작용 크로마토그래피, Butyl 4 Fast Flow)을 생략하여 효율적인 결합체 생산이 가능하면서도 제조되는 결합체의 높은 순도를 유지할 수 있는 공정을 다음과 같이 개발하였다.
실시예 1 : 단일 페길화된(mono-PEGylated) 면역글로불린 Fc 영역의 제조
실시예 1-1. 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 제조
N-말단에 Pro-Ser-Cys-Pro 서열의 힌지 영역을 갖는 면역글로불린 Fc 영역(49.8kDa, 서열번호 7)의 N 말단에 페길화(PEGylation)시키기 위하여, 면역글로불린 Fc 영역:PEG를 포함하는 링커(화학식 2의 구조, 10 kDa)의 몰비를 1:1로, 면역글로불린 Fc 영역의 농도를 50 g/L로 하여 6±4℃에서 약 4시간 반응시켰다.
[화학식 2]
Figure pat00005
구체적으로, 반응은 5 mM Bis Tris (pH 6.5)와 인산칼륨이 포함된 조성 에서 이루어 졌으며, 10 mM NaCNBH3 (sodium cyanoborohydride) 환원제를 첨가하여 반응시켰다. 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 얻기 위해 상기 반응액을 BisTris 버퍼로 희석하고 정제하였다.
이 때, 양이온 교환 크로마토그래피로 단일 페길화된 옥시토모듈린을 정제했던 비교예의 제조 방법과 달리, CaptoQ ImpRes (GE Healthcare, 음이온 교환 크로마토그래피) 컬럼을 이용하여 BisTris 가 포함된 버퍼와 염화나트륨 농도구배로 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 정제하였다.
실시예 1-2. 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 구조 분석
상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 구조를 MALDI-TOF 및 Peptide mapping을 통해 분석하였다. MALDI-TOF 분석 결과 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역 예상 분자량과 일치하였고 (도 1), Peptide mapping 분석 결과 면역글로불린 Fc 영역의 N 말단에 PEG가 90%이상 페길화된 것을 확인하였다.
한편, 상기 실시예 1-1의 방법으로 제조된 단일 페길화된(Mono-PEGylated) 면역글로불린 Fc 영역 (화학식 3)을 SE-HPLC, RP-HPLC와 IE-HPLC 분석법을 사용하여 분석한 결과, SE-HPLC 측정으로는 90%이상, RP-HPLC 측정으로는 90%이상, 및 IE-HPLC 측정으로는 80%이상의 순도로 제조된 것을 확인하였다.
[화학식 3]
Figure pat00006
실시예 2 : 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 옥시토모듈린 유도체의 연결에 의한 결합체 제조
상기 실시예 1-1에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 옥시토모듈린 유도체와 연결하여 지속형 결합체를 다음과 같이 제조하였다.
양이온 교환 크로마토그래피로 페길화된 펩타이드를 정제한 후 분리막 한외/투석여과(UF/DF) 방법에 의해 페길화된 펩타이드를 완충액교환 및 농축했던 비교예의 제조 방법과 달리, 한외/투석여과 없이 peptide conjugation을 통해 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 옥시토모듈린 유도체와 반응시켰다. 이렇게 제조된 지속형 결합체는 높은 순도로 제조되어 비교예의 제조 방법과 달리, 2차례의 소수성 상호작용 크로마토그래피 중 1차례를 생략할 수 있었다.
구체적으로, 실시예 1-1의 음이온 교환크로마토그래피 후 한외/투석여과 없이 GLP-1과 글루카곤 이중작용제인 옥신토모듈린 유도체(서열번호 1)의 peptide conjugation 반응을 수행하여 지속형 결합체(면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-옥신토모듈린 유도체)를 제조하였다.
[서열번호 1]
Figure pat00007
이 때, 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 PEG 한 쪽 말단의 말레이미드 반응기와 옥신토모듈린 유도체의 시스테인이 결합하도록 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역과 옥신토모듈린 유도체의 몰비를 1:1로, 옥신토모듈린 유도체 단백질 농도를 0.2 g/L로 하여 6±4℃에서 약 2시간 반응시켰다. 이 때 반응액은 이소프로판올을 포함한 Tris-Cl( 6±4℃)버퍼에서 수행되었다. 반응 후의 결과물을 SE-HPLC, RP-HPLC 및 IE-HPLC 분석법으로 분석한 결과, 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-옥신토모듈린 유도체 결합체(화학식 4)의 순도는 SE-HPLC 측정으로는 90%이상, RP-HPLC 측정으로는 80% 이상, 및 IE-HPLC 측정으로는 80% 이상인 것으로 확인 되었다.
이후, 상기 반응물의 결과물로 Source 15ISO (GE Healthcare) 컬럼을 사용하여, 한 번의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 이를 통해, 반응 부산물을 제거하고 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-옥시토모듈린 유도체의 결합체를 수득하였다. 이 때, 구연산나트륨이 포함된 버퍼와 황산암모늄의 농도 구배를 이용하여 정제하였다. 투입 옥신토모듈린 유도체 대비 수율은 비교예의 수율에 비해 상대적으로 약 2배 이상 향상된 것으로 확인하였다.
용출된 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커 -옥신토모듈린 유도체 결합체(화학식 4)는 MALDI-TOF, SE-HPLC, RP-HPLC 및 IE-HPLC 분석법을 사용하여 분석하였으며, MALDI-TOF 분석 결과 면역글로불린 Fc 영역-PEG를 포함하는 링커-옥시토모듈린 유도체 결합체의 예상 분자량과 일치하였고, SE-HPLC측정으로는 90%이상, RP-HPLC측정으로는 90%이상, 및 IE-HPLC측정으로는 90%이상의 고순도로 제조되었음을 확인하였다.
[화학식 4]
Figure pat00008
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANMI PHARM. CO., LTD. <120> Novel method for preparing a protein conjugate <130> KPA190188-KR <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 1 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 2 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> oxyntomodulin derivative <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> Xaa = aminoisobutyric acid <400> 3 His Xaa Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu 1 5 10 15 Lys Arg Ala Lys Glu Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Cys 20 25 30 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 5 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of hinge region <400> 5 Ser Cys Pro 1 <210> 6 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variant of hinge region <400> 6 Pro Ser Cys Pro 1 <210> 7 <211> 221 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 7 Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 1 5 10 15 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 20 25 30 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 35 40 45 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 50 55 60 Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 65 70 75 80 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 85 90 95 Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 100 105 110 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 115 120 125 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 130 135 140 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 145 150 155 160 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 165 170 175 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 180 185 190 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 195 200 205 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 220

Claims (16)

  1. 힌지 서열을 포함하는 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 하기 화학식 1의 링커를 연결하여 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는, 단백질 결합체의 제조방법:
    [화학식 1]
    CHO-L1-(OCH2CH2)nO-L2-R
    상기 화학식 1에서,
    L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고;
    L2는 -a1-CONH-, -a1-NHCO-, -a1-NHCO-a2-, -COO-, -b1-COO-, -COO-b2-, 또는 -b1-COO-b2-이며, a1, a2, b1 및 b2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고;
    n은 10 내지 2400이고;
    R은 2,5-디옥소피롤리디닐, 2,5-디옥소피롤릴, 알데히드, 말레이미드, C6-C20 아릴디설파이드, C5-C20 헤테로아릴디설파이드, 비닐술폰, 티올, 할로겐화 아세트아미드, 석시니미드, p-니트로페닐 카보네이트, 티오에스테르 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역은 환원제의 존재 하에 pH 4.0 내지 8.0에서 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 1의 링커를 연결하여 제조된 것인, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 결합체는 pH 5.5 내지 8.0에서 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제를 연결하여 제조된 것인, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 결합체를 제조하는 단계는 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역 및 이중작용제를 1:1 내지 1:3의 몰비로 반응시키는 것인, 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 상기 화학식 1의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 및 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것인 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커는 이중작용제의 시스테인과 연결되는 것인, 제조방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제조방법은 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 화학식 1의 링커를 연결하여 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 제조하는 단계; 상기 단계에서 제조된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역을 pH 6.0 내지 8.5의 완충 용액 속에서 음이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 단계; 및 상기 단계에서 정제된 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 링커와 GLP-1 및 글루카곤에 모두 활성을 나타내는 이중작용제와 연결하여 결합체를 제조하는 단계를 포함하는 것인 제조방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역의 제조하는 단계 후 한외/투석여과를 수행하지 않는 것을 특징으로 하는 것인, 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 결합체를 1차례의 소수성 상호작용 크로마토그래피로 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1에서의 L1은 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6의 알킬렌이고; L2는 -a1-NHCO- 또는 -a1-NHCO-a2- 이며; a1 및 a2는 각각 독립적으로 C1-C6 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌이고; n은 200 내지 250이며; R은 말레이미드인 것인, 제조방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 링커는 하기 화학식 2의 구조를 갖는 것인, 제조방법:
    [화학식 2]
    Figure pat00009

    상기 화학식 2에서, n은 200 내지 250임.
  12. 제1항에 있어서, 상기 링커는 1 내지 100 kDa의 크기를 갖는 것인, 제조방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 단일 페길화된 면역글로불린 Fc 영역은 하기 화학식 3의 구조를 갖는 것인, 제조방법.
    [화학식 3]
    Figure pat00010

  14. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 제조방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 이중작용제는 서열번호 1 내지 3 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 제조방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 단백질 결합체.
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