JP2020111597A - 血漿タンパク質にコンジュゲートしたヘパリンを含む治療用ａｐａｃ分子 - Google Patents

Abstract

【課題】抗血小板活性と抗凝固活性の両方を有する二重性分子の製造方法の提供。【解決手段】抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子の製造のための方法であって、ｉ）未分画ヘパリン（Ｈｅｐ）鎖を改変してスルフヒドリル（−ＳＨ）基を有する反応体生成物を生成するステップと、ｉｉ）ヒト血漿タンパク質を改変してピリジルジチオール（−ＰＤＰ）基を有する反応体生成物を生成するステップとｉｉｉ）ヘテロ二機能性架橋剤を使用して、ｉ）の反応体生成物をｉｉ）の反応体生成物と連結させるステップとを含む方法。【選択図】なし

Description

本発明は、抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方の活性を有する抗血栓性分子；医薬としてのその使用；抗凝固剤および血小板阻害剤としてのその選択的構造および使用、または主に、抗凝固剤もしくは血小板阻害剤のいずれかとしてのその選択的構造および使用、ならびにその製造方法に関する。本発明は、医療産業および動物医療産業の両方で使用される。

循環血液が液体からゲル様マトリックスへと変わる凝固の生理的プロセスは、複雑であり、順次進行する多様な生化学反応を伴う。

凝血の生理的プロセスは、血小板の、血管損傷による特異的活性化、付着、および凝集により一次血栓またはシールを生じること、続いて、フィブリンの沈着および成熟により安定した血餅を生じることを伴う。前者の血小板活性は血小板阻害剤により阻害され、後者のフィブリンの沈着は抗凝固剤により阻害されうる。

凝血プロセスは、血管への傷害により血管の内皮および／または深層が損傷してほぼ直ちに開始する。血液が内皮の内側の空間へ曝されることにより２つのプロセスが始まる：血小板の変化、および他の凝固因子の中でもトロンビン生成およびフィブリン形成に際立って寄与する血漿凝固因子ＶＩＩへの内皮下組織因子の曝露。

内皮が損傷を受けると、下に存在するコラーゲンが循環血小板に曝され、循環血小板は、コラーゲン特異的糖タンパク質表面受容体を介してコラーゲンに直接結合する。間接的に、ヴォンヴィレブランド因子は、血小板をコラーゲンと密接に繋ぎ、また血小板をコラーゲンと架橋させる。血小板が細胞外マトリックスに局在化することにより、血小板インテグリンの活性化をもたらし、傷害部位への血小板のさらなる付着を引き起こすシグナル伝達カスケードを誘発する血小板糖タンパク質ＶＩとコラーゲンの相互作用が促進される。この結果、傷害部位に即座に血小板によって血栓が形成される。これは、一次止血と称される。

二次止血も同時に起こり、いわゆる「凝固カスケード」を伴う。因子ＶＩＩの他に、さらなる凝固因子または凝血因子が複雑なカスケードで反応し、フィブリノーゲンの酵素切断をもたらし、フィブリン鎖を形成して血小板血栓を補強する。凝固カスケードは、プロテアーゼが切断し、続いて、次のプロテアーゼとして作用する酵素前駆体を順に活性化する一連のステップからなる。これらの反応の結果として、可溶性タンパク質であるフィブリノーゲンが、活性化された血小板表面において不溶性のフィブリンの糸に変換される。血小板を結びつけるのと一緒に、フィブリンの糸は安定な血餅を形成する。重要なヴォンヴィレブランド因子およびフィブリノーゲンは、血小板と、さらに血漿によってもたらされる。

凝固カスケードは、古典的に（いくぶん人為的に）３つの経路に分けられ；第１に組織因子、第２に接触活性化経路、これらは両方、フィブリン形成に導く因子Ｘおよびトロンビンの第３の「最終共通経路」を活性化する。組織因子経路の主要な役割は、そのフィードバック活性化の役割という点で凝固カスケードの最も重要な構成要素であるトロンビンが瞬時に形成されるプロセスである、「トロンビンバースト」を生じさせることである。興味深いことに、トロンビンは、凝固カスケードによって産生される一方で、最も有効な血小板活性剤であるため、血小板活性化と凝固の間を結ぶものであり、したがって、この分子を標的とすることができる治療薬は、非常に有効ま抗血栓薬である可能性が高い。

凝固カスケードは、血管傷害後の著しい失血または出血を予防することを目的とする通常の生理的プロセスである。最終的に、血餅は、線維素溶解と称されるプロセスによって再構成され、再吸収される。このプロセスを担う主要な酵素（プラスミン）は、種々の活性剤および阻害剤によって調節される。さらに、凝固システムは、免疫系および補体系と重複し、その結果、血餅に侵入する微生物を物理的に捕捉し、血管透過性を増大させ、貪食細胞に対する走化性物質をもたらす。さらに、凝固システムの生成物のいくつかは、そのまま抗菌剤となる。

しかしながら、血餅（血栓としても知られる）が必要ない場合にも形成される場合がある。例えば、急性の医学的疾患、長引く運動抑制、手術、またはがんなどのいくつかの高リスク条件により、血餅の発生リスクが増大しうる。さらに、凝固プロセスに関する生理学的問題により、個体は出血、血栓症、および場合によってはその両方を引き起こす場合があり、アテローム動脈硬化性心血管疾患および／または不整脈を伴う重大な予後をもたらしうる。

抗血小板剤および抗凝固剤は、凝血障害を処置するために使用される。抗血小板剤は、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、チカグレロールおよびプラスグレルを含み、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤の非経口投与は冠動脈インターベンション（血管形成術およびステント留置）の間に使用される。抗凝固剤については、ワルファリン（および関連するクマリン）およびヘパリンが最も一般的に使用されるが、直接経口抗凝固剤はまた、トロンビン阻害剤であるダビガトランならびにリバーロキサバン、アピキサバンおよびエドキサバンなどの活性化因子Ｘの阻害剤を含む。

アンチトロンビン（ＡＴ）は、セリンプロテアーゼ阻害剤であり、凝固プロテアーゼの主要な血漿阻害剤の１つである。ＡＴは、例えばトロンビン（因子ＩＩａ）および活性化因子Ｘ（因子Ｘａ）を阻害することにより凝固カスケードをブロック／調節する。ＡＴとこれらの因子との相互作用は、ヘパリン（未分画ヘパリン；ＵＦＨ）および低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ；画分ヘパリン）の存在によって増大され、特異的なペンタサッカライド配列を介してＡＴに結合することにより凝固プロセスを阻害する。この結合によって、凝血に関する因子ＩＩａ、Ｘａ、および他のプロテアーゼの阻害を加速するＡＴの立体構造の変化がもたらされる。一旦解離すると、ヘパリンおよびＬＭＷＨは遊離して、他のＡＴ分子に結合し、続いてさらにトロンビンおよび因子Ｘａを阻害する。

ＡＴに加えて、他の天然に存在する抗凝固剤が存在し、そのうち、プロテインＣおよびＳ、組織因子経路阻害剤およびヘパリン補因子ＩＩは重要な役割を果たす。これらの分子の活性もヘパリンによって増強される。

主に、標準的ヘパリン調製物が血栓症の全身的処置に使用される。これらは、凝固活性が優勢である静脈血栓などの乏血小板血栓において最も有効である。臨床的に使用される標準的ヘパリンは、血栓症のさらなる成長をブロックすることによる血栓症の全身的処置に有効であるが、アテローム性プラークの内因性の破壊あるいは外部からの血管形成術または血管もしくは微小管手術に伴う動脈における血小板により推進される血栓性合併症を単独で予防する程には効果的ではない。

ステント留置を伴うまたは伴わない血管形成術［ＰＴ（Ｃ）Ａ＝経皮的血管（冠動脈）形成術］および血管または微小管手術などの動脈インターベンションは、（方向性）動脈切除術および末梢または肺の血栓内膜摘出術とともに、循環器疾患に対する処置の成長モダリティを表す。したがって、内因性血管もしくは微小管傷害および／または動静脈フィステラもしくは動静脈グラフトの挿入および維持などの外部からのインターベンションと関連して生じる、血小板により推進される動脈血栓症は、頻繁に遭遇する問題であり、これらの状況では、血栓症の従来の全身的抗凝固処置は、限られた有効性しかない場合が多い。

動脈インターベンションと関連する現代の全身的抗血栓症処置には、ＵＦＨ（平均１５ｋＤａの）またはＬＭＷＨ（平均７．５ｋＤａの）などの抗凝固剤と、アセチルサリチル酸（シクロオキシゲナーゼ阻害剤）、クロピドグレルまたは他のＡＤＰ拮抗薬などの抗血小板薬との組合せが含まれる。他の開発は、有効な血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ、ヴォンヴィレブランド因子ならびにアブシキシマブ、チロフィバンおよびエプチフィバタイドなどのフィブリノーゲン受容体拮抗薬によっても代表される。これらの比較的新しい静脈内投与される組合せ処置は、静脈内処置された血栓を生じやすい血管の急性血栓閉塞の３０〜３５％の予防に成功した。血液製剤の注入を必要とする最も初期入院患者の出血リスク（大出血）はおよそ６〜７％であり、有効な血小板ＡＤＰ受容体ブロック薬を用いると、大出血は、最初の１カ月間の外来で１２〜１５％まで増加する。死亡率に関連するリスクは、最初の１カ月の経過観察で、突発性出血の場合、１５〜３０倍である。

残念ながら、未分画ヘパリンを用いる全身的治療は、予測できないバイオアベイラビリティー、短い半減期、易感染抗トロンビン／ＡＴ機能をもたらすタンパク質への非特異的結合、血小板因子４（ＰＦ４）を用いて血小板減少症および血栓症をもたらす免疫原性効果などの不利益を有する。これらの望ましくない影響は、残念ながら、フィブリン結合トロンビン、および血小板結合因子Ｘａへの限定された効果、ならびに血小板分泌ＰＦ４によるヘパリン活性の部分的中和による動脈血栓症に対する限定された有効性も有する低分子量分画ヘパリンの使用によって軽減される。したがって、血管または微小管傷害およびインターベンションに伴う血栓症を予防および／または処置するための有効で、信頼性が高く、安全な治療法の開発には大きな需要がある。

本発明者らは、タンパク質コアに結合した際に、哺乳動物のマスト細胞から得ることができる長鎖（７５±２５ＫＤａ）の未変性ヘパリンプロテオグリカン（ＨＥＰ−ＰＧ）を含む合成分子が、血小板がコラーゲンに付着することによって誘発される血小板活性化の強力な阻害によって血小板とコラーゲンの相互作用を阻害するその能力に基づく、強力な抗血栓性を発現することを以前に見出した（ＷＯ９９２６９８３）。したがって、この分子は、抗血小板処置として有効であり、局所適用に最も適しており、全身的抗血小板薬と組み合わせて理想的に使用される。この分子は、少なくとも局所投与される場合に、正常な止血反応を確実にする全身的血小板機能を保つ点で有利である。

他の研究者らは、未分画ヘパリン鎖（約２０〜１００鎖）のポリリシンなどの直鎖ポリアミドへの結合を含む合成抗血栓性分子を作製した（ＵＳ５，５２９，９８６）。この分子は、抗トロンビンに結合し、この活性を増強するため、上記ＷＯ９９２６９８３に記載されたものと比較して異なる作用機序を有する。したがって、この分子は抗凝固剤として有効である。

本発明者らのさらなる研究により、本発明者らは、ヘパリンの使用に基づく別の分類の合成抗血栓性分子を開発した。しかしながら、本発明者らは、本発明者らの新たな分類の分子が、抗血小板活性と抗凝固活性の両方を有する点で有利であることを、驚くべきことに見出した。本発明者らの知る限り、このような二重性分子が同定されたのは初めてである。さらに、本発明者らは、本発明者らの新たな分類の分子の、抗血小板剤または抗凝固剤として優位にまたはより大きい程度で作用する傾向は、各分子に結合するまたは含まれるヘパリンの量に関して操作され／設計されうることを発見した。最後に、本発明者らはまた、本発明者らの新たな分類の分子が、局所作用を有し、故に全身的影響への懸念なく標的化された方式で使用することができる点で有利であることを発見した。

発明についての記述
本発明の第１の態様によれば、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む、抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が１０〜２１ＫＤａの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６を含む群から選択される抗血栓性分子が提供される。

本明細書中で言及される前記血漿タンパク質に結合しているヘパリン鎖の数は、比色定量による硫酸化グリコサミノグリカンアッセイ、Ｂｌｙｓｃａｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（例えば、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ．、英国）を考慮して、被験試料を読み取り／決定できる検量線を作成するために特定濃度のヘパリン標準物質を使用して決定されるものである。したがって、発明の主要な記述において言及されるヘパリン鎖の数は、表Ｉの列１と相関する。使用される特定のアッセイは、本明細書に記載されている。

抗血小板（ＡＰ）活性および抗凝固（ＡＣ）活性は、狭窄症の部位でＡＰが必要とされ、ならびに乱れがあり、血小板の成長がトロンビンによって媒介される場合に、遠位および近位でＡＣ作用が必要とされる湾曲血管または狭窄血管においてなど、抗血小板活性が必要とされおよび／または抗凝固活性が必要とされる事例に、分子が対処できるため、独特であり、極めて有利である。

好ましい二重機能性に加えて、本発明者らはまた、本発明の分子が、コラーゲンおよびヴォンヴィレブランド因子を含む細胞外マトリックスへの強力な結合能を有し、したがって、これらの分子は標的化された局所抗血栓作用を有することを発見した。出血または大量出血を引き起こす可能性のある有害な全身的抗血栓効果を有するかもしれないという懸念なく、分子を特定の部位で使用して、特定の状態を処置できることを意味するため、このことは非常に望ましい特徴である。この有利な標的化は、投与方式、すなわち局所的または全身的にかかわらず存在する。

本明細書において言及される標的化抗血栓作用は、適用部位において、かなりの期間、例えば２４時間超、さらに理想的には４８時間または５０時間超、さらには１２０時間まで、本発明の分子を保持することを指す。とりわけ、この適用部位における保持は、血管の外側および内側に投与される場合の両方で起こる。

本発明の好ましい実施形態において、前記血漿タンパク質は、アルブミン、グロブリンまたはフィブリノーゲンであり、理想的には血清アルブミンまたはアルファ２−マクログロブリンであり、より理想的にはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはヒトアルファ２−マクログロブリンである。一般的に知られているように、血清アルブミンは肝臓によって産生され、血漿に溶解され、哺乳動物において最も豊富に存在する血液タンパク質である。血清アルブミンは、分子量がおよそ６６，０００ダルトンの球状の水溶性タンパク質である。さらに知られているように、アルファ２−マクログロブリン（α２ＭおよびＡ２Ｍ）は、大きな血漿タンパク質であり、実際に血漿中で最も大きな、主要非免疫グロブリンタンパク質であり、主に肝臓によって産生される。アルファ２−マクログロブリンは、アンチプロテアーゼとして作用し、多種のプロテイナーゼを不活性化することができる。

本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記血漿タンパク質は組換え体である。

本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記ヘパリンは未分画ヘパリンである。より理想的には、やはり前記ヘパリンは哺乳動物由来、理想的にはヒトまたはブタ由来のものである。血漿タンパク質がヒト由来であり、ヘパリンがブタまたはウシヘパリンである場合において、前記ＡＰＡＣ分子はキメラ分子に相当する。

好ましくは、ヘパリンは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２１ｋＤａ、理想的には１５または１６または１７ｋＤａを含む群から選択される分子量を有する。

本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記ヘパリンは組換え体である。

本発明のまたより好ましい実施形態において、前記リンカー分子は、少なくとも前記ヘパリンの前記血漿タンパク質への連結が完了した場合に、ヘパリンの１分子に結合する単一リンカー分子であり、したがって、１つのリンカー分子の前記血漿タンパク質への結合により、ヘパリン１分子の前記血漿タンパク質への結合が生じる。したがって、前記リンカーの前記ヘパリンに対する化学量論は、１：１である。好ましくは、前記リンカーはアミンリンカーであり、故に前記ヘパリンおよび血漿タンパク質のアミノ基と連結し、理想的にであって排他的にではないが、前記リンカーはヘパリン鎖のセリンとコンジュゲートし、理想的には同鎖の末端または末端付近に位置し、かつ理想的にであって排他的にではないが、前記リンカーは血漿タンパク質のリシンとコンジュゲートする。より理想的にはまた、前記リンカーは、ジスルフィド架橋の使用により、前記ヘパリンと血漿タンパク質をコンジュゲートする。またより好ましくは、前記リンカーは、ＳＰＤＰリンカーなどのヘテロ二機能性架橋剤またはＤＴＳＰリンカーなどのホモ二機能性架橋剤である。

ＳＰＤＰ（例えばＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅから市販されている）は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルおよびピリジルジチオール反応基を介したアミン対スルフヒドリルのコンジュゲーションのために使用される短鎖架橋剤であり、システインのスルフヒドリルと切断可能な（還元可能な）ジスルフィド結合を形成する。これは、短鎖型および長鎖型で利用できる。長鎖型はスルホン化形態で利用でき、水溶性である。本発明者らは３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用することを好む。すべてのＳＰＤＰは、リシン残基と反応して安定なアミド結合を形成するアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含有するが、リンカーの他方の末端において、スルフヒドリルと反応して可逆的なジスルフィド結合を形成するピリジルジスルフィド基が存在する。

ＤＴＳＰ（３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル）、例えばＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅから市販されている）は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を介したアミン対アミンのコンジュゲーションのために使用される短鎖架橋剤である。これは、短鎖型および長鎖型で利用できる。長鎖型は、スルホン化形態（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）エステル）で利用でき、水溶性である。ＤＴＳＰは、スペーサーアームにおいて、２つのアミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基およびジスルフィド架橋を含有する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、第一級アミン含有残基と反応して、リンカー分子に切断可能なジスルフィド結合を有する安定なアミド結合を形成する。

したがって、本発明者らの好ましい合成分子に対する一般式は以下のように記述されうる：
（Ｈｅｐ−リンカー）ｎ−ＰｌＰｒ
［式中、
ｎ＝４〜１６であり、
ＰｌＰｒは、ヒト血清アルブミンまたはヒトアルファ２−マクログロブリンなどの血漿タンパク質であり、
ヘパリン鎖は１０〜２１ＫＤａである］。

より詳細には、本発明者らが、本発明者らの好ましいリンカーである３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）または（３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＴＳＰ）を使用する場合、本発明者らの好ましい合成分子は以下のように記述されうる：
（Ｈｅｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ）ｎ−ＰｌＰｒ
ここで、ｎ＝４〜１６；
ＰｌＰｒは、ヒト血清アルブミンまたはヒトアルファ２−マクログロブリンなどの血漿タンパク質であり、ヘパリン鎖は１０〜２１ＫＤａである。

アルブミン、特にＨＳＡなどの各血漿タンパク質に３６鎖までのヘパリンを結合することが可能であるが、本発明者らは、４〜１６個の間のヘパリン鎖が各血漿タンパク質に結合することによって、抗血小板活性および抗凝固活性の両方の望ましい二重機能性がもたらされることを発見した。さらに、本明細書でデータが示すように、本発明者らはまた、６個未満のヘパリン鎖、理想的には４〜６個の間のヘパリン鎖が各血漿タンパク質に結合することによって、優位にまたはより大きい程度で、望ましい抗凝固活性がもたらされる一方で、８個超のヘパリン鎖、理想的には８〜１６個の間のヘパリン鎖が各血漿タンパク質に結合することによって、優位にまたはより大きい程度で、望ましい抗血小板活性がもたらされることを発見した。

したがって、本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記ＡＰＡＣ分子が、優位にまたはより大きい程度で、抗凝固剤として使用される場合、前記分子は、前記血漿タンパク質に結合した６個以下、例えば４〜６個の間のヘパリン鎖を有する。

したがって、本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記ＡＰＡＣ分子が、優位にまたはより大きい程度で、抗血小板剤／血小板阻害剤として使用される場合、前記分子は、前記血漿タンパク質に結合した８個以下、例えば８〜１６個の間のヘパリン鎖を有する。

したがって、本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記ＡＰＡＣ分子が、優位にまたはより大きい程度で、抗血小板剤／血小板阻害剤として使用される場合、前記分子は、前記血漿タンパク質に結合した８個のヘパリン鎖を有する。

したがって、本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記ＡＰＡＣ分子が、優位にまたはより大きい程度で、抗血小板剤／血小板阻害剤として使用される場合、前記分子は、前記血漿タンパク質に結合した１１個のヘパリン鎖を有する。

したがって、ある特定数のヘパリン鎖が各血漿タンパク質のコアに優先的に連結することによって、合成分子の優位な機能に影響を与えることができる。本発明者らの分子を使用する場合に達成されるべき結果が抗血栓性である一方、抗血小板活性に重きを置く必要がある場合もあり、抗凝固活性にさらに重きを置く必要がある場合もあるため、このような顕著な特徴は技術アプリケーションを有する。例えば、ずり速度の比較的低い、すなわち管腔が大きく血流速度が低い静脈などの管を処置する場合、抗凝固性に優位または重きを置く抗血栓薬が非常に望ましい。一方、例えば、ずり速度が比較的高い、すなわち血流速度が高いまたは管の管腔が小さい、かつそれ故に血流速度が高い動脈または動静脈瘻などの管を処置する場合、抗血小板活性に優位または重きを置く抗血栓薬が非常に望ましい。同様に、カテーテル、ステントまたはバルーン血管形成術を行うために使用される装置などのインプラントが使用される場合、これらを本発明のＡＰＡＣ分子で被覆することができ、使用されるＡＰＡＣ分子のタイプは、理想的には、インプラントが挿入される管の性質に関して決定される。

本発明の第２の態様によれば、医薬として使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が１０〜２１ＫＤａの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６を含む群から選択される抗血栓性分子が提供される。

本発明の第３の態様によれば、抗血栓薬として使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が１０〜２１ＫＤａの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６を含む群から選択される抗血栓性分子が提供される。

本発明のこの態様の好ましい実施形態において、前記抗血栓薬は局所的に作用する。このことにより、本発明者らは、抗血栓薬が細胞外マトリックスに結合し、したがって、抗血栓薬は、適用部位、または意図された作用部位で、持続性の局所活性を保持することを意味する。実際に、この局所作用活性は、本発明の分子が、最も必要とされる、すなわち抗血栓症が起こりやすい部位、言い換えれば、コラーゲンとヴォンヴィレブランド因子の両方が存在する／不可欠な構成要素である細胞外マトリックスに効率的に標的化されることを意味するため、有利である。

本発明の第４の態様によれば、血栓症または血栓症が疑われるものを処置するための医薬の製造において使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が１０〜２１ＫＤａの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６を含む群から選択される抗血栓性分子の使用が提供される。

本明細書において言及される血栓症が疑われるものとは、外科的インターベンション、例えば外科的血栓除去術の実施など（限定されない）、血栓症を起こす可能性のある任意の例、状況または条件を指し、この例において、本発明の分子は、手術部位に投与されるか、手術された管に注入されるか、血液供給が前記手術部位の付近／前記手術部位に流れる隣接する下流の管に注入される。

本発明のこの態様の好ましい実施形態において、前記医薬は抗血栓薬であり、理想的には局所作用する。局所作用によって、本発明者らは、抗血栓薬が細胞外マトリックスに結合し、したがって、適用部位で、持続性の局所活性と共に保持されることを意味する。実際に、この局所作用活性は、本発明の分子が、最も必要とされる、すなわち抗血栓症が起こりやすい部位、言い換えれば、コラーゲンとヴォンヴィレブランド因子の両方が存在する／不可欠な構成要素である細胞外マトリックスに効率的に標的化されることを意味するため、有利である。

本発明の前述の態様において、前記ＡＰＡＣ分子が、抗凝固剤として優位にまたはより大きい程度で使用される場合、好ましくは、前記分子は、前記リンカーを介して、前記血漿タンパク質に結合する６以下、例えば４〜６のヘパリン鎖を有する。

同様に、本発明の前述の態様において、前記ＡＰＡＣ分子が、抗血小板剤／血小板阻害剤として優位にまたはより大きい程度で使用される場合、好ましくは、前記分子は、前記リンカーを介して、前記血漿タンパク質に結合する８以上、例えば８〜１６のヘパリン鎖を有する。

本発明のまたさらに好ましい実施形態において、前記ＡＰＡＣ分子は、血栓性合併症、例えば、アテローム性プラークの内因性の破裂；または再閉塞を予防するための血栓溶解療法；または外部からの血管形成術；または血管もしくは微小血管の手術、血管形成術、特にステント留置を伴うもしくは伴わない経皮的経腔的（冠動脈）血管形成術などの動脈インターベンション；（方向性）動脈切除術；末梢もしくは肺の血管内膜摘除術；血小板由来の動脈血栓症；血管もしくは微小血管傷害；血栓性血小板減少性紫斑病または外部からのインターベンション、例えば、または動静脈瘻もしくは動静脈グラフトの挿入および維持ならびにアンチトロンビン（ＡＴ）欠乏症に関連するものの処置又は予防において使用されうる。

本発明の第５の態様によれば、虚血再灌流傷害または急性腎傷害または心筋梗塞または卒中または末梢動脈閉塞性疾患または腸間膜虚血の処置に使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が１０〜２１ＫＤａの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６を含む群から選択される抗血栓性分子の使用が提供される。

あるいは、本発明の第６の態様によれば、虚血再灌流傷害または急性腎傷害または心筋梗塞または卒中または末梢動脈閉塞性疾患または腸間膜虚血を処置するための医薬の製造において使用するための、複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子であって、各ヘパリン鎖が１０〜２１ＫＤａの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６を含む群から選択される抗血栓性分子の使用が提供される。

本発明の第７の態様によれば、抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子の製造のための方法であって、
ｉ）未分画ヘパリン（Ｈｅｐ）鎖を改変してスルフヒドリル（−ＳＨ）基を有する反応体生成物を生成するステップと、
ｉｉ）血清アルブミンなどの血漿タンパク質を改変してピリジルジチオール（−ＰＤＰ）基を有する反応体生成物を生成するステップと
ｉｉｉ）ヘテロ二機能性架橋剤を使用して、ｉ）の反応体生成物をｉｉ）の反応体生成物と連結させるステップと
を含む方法が提供される。

本発明の好ましい方法において、前記リンカーは、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＳＰＤＰリンカー（例えばＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅから市販されている（場合によってはＧＭＰ品質））である。

本発明の第８の態様によれば、抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子の製造のための方法であって、
ｉ）未分画ヘパリン（Ｈｅｐ）鎖を改変してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（−ＮＨＳ）基を有する反応体生成物を生成するステップと、
ｉｉ）ホモ二機能性架橋剤を使用して、ｉ）の反応体生成物を、第一級アミンを含有する血清アルブミンなどの血漿タンパク質と連結させるステップと
を含む方法が提供される。

本発明の好ましい方法において、前記リンカーは、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＤＴＳＰリンカー（例えばＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅから市販されている（場合によってはＧＭＰ品質））である。

本発明の第９の態様によれば、血栓性合併症、例えば、アテローム性プラークの内因性の破裂に関連するもの；再閉塞を予防するための血栓溶解療法；血小板由来の動脈血栓症；血管または微小血管傷害；血栓性血小板減少性紫斑病；虚血性再灌流傷害；急性腎傷害；心筋梗塞；卒中；末梢動脈閉塞性疾患、腸間膜虚血およびアンチトロンビン（ＡＴ）欠乏症を含む群から選択される疾患または状態の処置のための方法であって、
複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子であり、各ヘパリン鎖が１０〜２１ＫＤａの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６を含む群から選択される抗血栓性分子の有効量を、処置される個体に投与するる、方法が提供される。

本発明のこの態様の好ましい実施形態において、前記抗血栓性分子は、再閉塞を予防するための血栓溶解療法後に投与される。

より好ましくはさらに、前記ヘパリン鎖数が、８、９、１０、１１および１２を含む群から選択される。

本発明の第１０の態様によれば、外部からの血管形成術、血管または微小血管の手術、動脈インターベンション、血管形成術、特にステント留置を伴うまたは伴わない経皮的経腔的（冠動脈）血管形成術、（方向性）動脈切除術、末梢または肺の血管内膜摘除術、および外部からのインターベンション、例えば、動静脈瘻または動静脈グラフトの挿入および維持などを含む群から選択される処置方法であって、
複数のリンカー分子を介して複数のヘパリン鎖が結合している血漿タンパク質を含む抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子であり、各ヘパリン鎖が１０〜２１ＫＤａの間の分子量を有し、さらに前記血漿タンパク質に結合している前記ヘパリン鎖の数が４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、および１６を含む群から選択される抗血栓性分子の有効量を、前記処置の前、間または後に、処置される個体に投与する方法が提供される。

本発明のこの態様の好ましい実施形態において、前記抗血栓性分子は、任意の１または複数の上記処置が実施される前に投与される。

より好ましくはさらに、前記ヘパリン鎖の数が、８、９、１０、１１および１２を含む群から選択される。

より好ましくはさらに、抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子は、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ媒体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）および／または限外濾過／血液透析濾過などのクロマトグラフィーによって精製された。しかしながら、ＡＰＡＣ分子は、陰イオン交換クロマトグラフィーなどの他の手段、または当業者に公知の他の方法によって精製されてもよい。

以下の特許請求の範囲および本発明の前述の明細書において、文脈が技術用語または必要な意味を表現するために他に要求する場合を除き、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、包括的な意味で使用され、すなわち、本発明の種々の実施形態において、述べられた特徴の存在を特定するが、さらなる特徴の存在または付加を排除するものではない。

この明細書において引用されている、任意の特許または特許出願を含むすべての参照文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。いかなる参照文献も先行技術を構成することは認められない。さらに、先行技術のいずれも、当技術分野における共通の一般知識の一部を構成することは認められない。

本発明の各態様の好ましい特徴は、他の態様のいずれかと関連して記載されていてもよい。

本発明の他の特徴は、以下の実施例から明らかになる。一般的に言えば、本発明は、この明細書（添付の特許請求の範囲および図面を含む）において開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組合せに拡張される。したがって、本発明の特定の態様、実施形態または実施例と併せて記載されている特徴、整数、特性、化合物または化学的部分は、矛盾しなければ、本明細書に記載された任意の他の態様、実施形態または実施例に適用できるものと理解される。

さらに、他に記述がなければ、本明細書に開示された任意の特徴は、同じまたは同様の目的を果たす代わりの特徴によって置き換えることができる。

本発明は、例としてのみであるが、特に以下の図面を参照して、ここで記載される。

プール血漿中１．０および１．７５μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｈｅｐ）［Ｃ］で、２種の濃度の第一世代のＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）、第二世代のＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）および第三世代のＡＰＡＣ−ＣＬ６からＣＬ１６（それぞれ、バッチ３．１、３．２、３．３、３．４、３．５および３．６に、８、８、１０、１３、１６および６Ｈｅｐ鎖）の存在下でのトロンビン時間（ＴＴ）の効果のスクリーニングを示すグラフである。ＴＴベースラインは２８秒であった。 プール血漿中０．７５、１．０および１．７５μｇ／ｍＬのＨｅｐ［Ｃ］で、３から５種の濃度の第四世代のＡＰＡＣ１（バッチ４．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２、８Ｈｅｐ鎖）の存在下でのトロンビン時間（ＴＴ）を示すグラフである。ＴＴベースラインは３１秒であった。 プール血漿中Ｈｅｐ［Ｃ］１、２、３、６および８μｇ／ｍＬで、５種の濃度の第一世代のＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）、第二世代のＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）および第三世代のＡＰＡＣ−ＣＬ８から１６（それぞれ、バッチ３．１、３．２、３．３、３．４および３．５に、８、８、１０、１３および１６Ｈｅｐ鎖）の存在下での活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を示すグラフである。ＡＰＴＴベースラインは３０秒であった。 ＡＰＴＴの延長（１から１０倍）について、５種の異なるヘパリン濃度で、ＡＰＡＣにおけるヘパリンコンジュゲーションレベルの比較を示すグラフである。Ｈｅｐ［Ｃ］１、２、３、６、８μｇ／ｍＬでのＡＰＴＴについて、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．１および３．２、８Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（バッチ３．４、１３Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６Ｈｅｐ鎖）に関する結果が、プール血漿中で示されている。ＡＰＴＴベースラインは３０秒であった。 プール血漿中Ｈｅｐ［Ｃ］１、２、３、６および８μｇ／ｍＬで、５種の濃度の第四世代のＡＰＡＣ１（バッチ４．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２、８ｈｅｐ鎖）の存在下でのＡＰＴＴを示すグラフである。ＡＰＴＴベースラインは３０秒であった。 ５ｐＭの組織因子（ＴＦ）および４μＭのリン脂質（ＰＰＬ）を補充したプール血漿（ＰＰ）中、ＵＦＨおよびリン酸緩衝液（ＰＢＳ）と比較して、Ａ）０．２５μｇ／ｍＬおよびＢ）０．５μｇ／ｍＬの第一世代のＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）、第二世代のＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）の存在下での遅延したトロンビン生成を、自動校正トロンボグラムによって示す図である。 ５ｐＭのＴＦおよび４μＭのＰＰＬを補充したプール血漿（ＰＰ）中、ＵＦＨおよびＰＢＳと比較して、Ａ）１．０μｇ／ｍＬおよびＢ）１．５μｇ／ｍＬの第一世代のＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）、第二世代のＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）の存在下での遅延したトロンビン生成を、自動校正トロンボグラムによって示す図である。 ５ＭのＴＦおよび４μＭのＰＰＬを補充したプール血漿（ＰＰ）中、Ａ）０．２５μｇ／ｍＬおよびＢ）０．５μｇ／ｍＬの第三世代のＡＰＡＣ−ＣＬ６からＣＬ１６（８、８、１０、１３、１６および６Ｈｅｐ鎖）およびＰＢＳの存在下でのトロンビン生成を、自動校正トロンボグラムによって示す図である。ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．１および３．２、８Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（バッチ３．４、１３Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ−ＣＬ６（バッチ３．６、６Ｈｅｐ鎖）。 ５ＭのＴＦおよび４μＭのＰＰＬを補充したプール血漿（ＰＰ）中、Ａ）１．０μｇ／ｍＬおよびＢ）１．５μｇ／ｍＬのＡＰＡＣ−ＣＬ６からＣＬ１６（８、８、１０、１３、１６および６Ｈｅｐ鎖）およびＰＢＳの存在下でのトロンビン生成を、自動校正トロンボグラムによって示す図である。ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．１および３．２、８Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（バッチ３．４、１３Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ−ＣＬ６（バッチ３．６、６Ｈｅｐ鎖）。 １ｐＭのＴＦ ＰＰＬを供給する血小板を補充した多血小板血漿（ＰＲＰ）中、０．２５、０．５、１．０および１．５μｇ／ｍＬのＵＦＨの存在下でのトロンビン生成を、自動校正トロンボグラムによって示す図である。 １ｐＭのＴＦ、ＰＰＬを供給する血小板を補充したＰＲＰ中（ドナーは高レスポンダーである）、Ａ）０．２５μｇ／ｍＬおよびＢ）０．５μｇ／ｍＬのＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）ならびにＵＦＨの存在下でのトロンビン生成を、自動校正トロンボグラムによって示す図である。 １ｐＭのＴＦ、ＰＰＬを供給する血小板を補充したＰＲＰ中（ドナーは中程度レスポンダーである）、Ａ）０．２５μｇ／ｍＬ、Ｂ）０．５μｇ／ｍＬおよびＣ）１．０μｇ／ｍＬのＡＰＡＣ１（バッチ４．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２、８Ｈｅｐ鎖）の存在下でのトロンビン生成を、自動校正トロンボグラムによって示す図である。 第三世代のＡＰＡＣ、ＡＰＡＣ−ＣＬ６からＣＬ−１６（８、８、１０、１３、１６および６Ｈｅｐ鎖）の存在下でのＰＲＰ中のコラーゲン誘発凝集を示す図である。１μｇ／ｍＬのＨｅｐ［Ｃ］で、ＡＰＡＣに対する低レスポンダーの例が示されている。チャネル１：ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．１、８Ｈｅｐ鎖）、チャネル２：ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．２、８Ｈｅｐ鎖）、チャネル３：ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）、チャネル４：ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（バッチ３．４、１３Ｈｅｐ鎖）、チャネル５：ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６Ｈｅｐ鎖）、チャネル６：ＡＰＡＣ−ＣＬ６（バッチ３．６、６Ｈｅｐ鎖）およびチャネル７：ＡＰＡＣ−ＣＬ１０および１６の混合物（１０Ｈｅｐ鎖および１６Ｈｅｐ鎖）。コラーゲンの［Ｃ］は０．５μｇ／ｍＬであった。 第三世代のＡＰＡＣ、ＡＰＡＣ−ＣＬ６からＣＬ−１６（８、８、１０、１３、１６および６Ｈｅｐ鎖）の存在下でのＰＲＰ中のコラーゲン誘発凝集を示す図である。１０μｇ／ｍＬのＨｅｐ［Ｃ］で、ＡＰＡＣに対する低レスポンダーの例が示されている。チャネル１：ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．１、８Ｈｅｐ鎖）、チャネル２：ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．２、８Ｈｅｐ鎖）、チャネル３：ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）、チャネル４：ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（バッチ３．４、１３Ｈｅｐ鎖）、チャネル５：ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６Ｈｅｐ鎖）、チャネル６：ＡＰＡＣ−ＣＬ６（バッチ３．６、６Ｈｅｐ鎖）およびチャネル７：ＡＰＡＣ−ＣＬ１０および１６の混合物（１０Ｈｅｐ鎖および１６Ｈｅｐ鎖）。コラーゲンの［Ｃ］は０．５μｇ／ｍＬであった。 第三世代のＡＰＡＣ、ＡＰＡＣ−ＣＬ６からＣＬ−１６（８、８、１０、１３、１６および６Ｈｅｐ鎖）の存在下でのＰＲＰ中のコラーゲン誘発凝集を示す図である。３０μｇ／ｍＬのＨｅｐ［Ｃ］で、ＡＰＡＣに対する低レスポンダーの例が示されている。チャネル１：ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．１、８Ｈｅｐ鎖）、チャネル２：ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．２、８Ｈｅｐ鎖）、チャネル３：ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）、チャネル４：ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（バッチ３．４、１３Ｈｅｐ鎖）、チャネル５：ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６Ｈｅｐ鎖）、チャネル６：ＡＰＡＣ−ＣＬ６（バッチ３．６、６Ｈｅｐ鎖）およびチャネル７：ＡＰＡＣ−ＣＬ１０および１６の混合物（１０Ｈｅｐ鎖および１６Ｈｅｐ鎖）。コラーゲンの［Ｃ］は０．５μｇ／ｍＬであった。 ３、１０、３０、６０および９０μｇ／ｍＬで、ＡＰＡＣに対する代表的な高レスポンダー（白丸）および中程度（白四角）レスポンダーに関して、ＰＲＰ中ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）の存在下での、コラーゲン誘発最大血小板凝集の阻害を示すグラフである。ＵＦＨ（黒三角）の存在下でのドナーの血小板凝集の平均阻害も示されている。媒体（ＰＢＳ）に対する最大血小板凝集の阻害はパーセンテージ（％）として示されている。 ヒヒの急性血栓症の改変Ｆｏｌｔ’ｓモデルにおいて、新しい傷害部位におけるＵＦＨおよびＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）（いずれも４ｍｇ／ｍＬ、合計２ｍｇ）の局所適用後の周期的血流減少（ＣＦＲ）のチャートを示す図である。ベースラインの血流に戻った後直ちに、動脈を狭窄させて（３０％）１００ｍＬ／分の流量とした。ＵＦＨ（黒三角）で処置した傷害部位で、閉塞が繰り返される（２５分以内に５ＣＦＲ）ことが観察された。狭窄を再び実施する（２０〜５０分で）および狭窄を増大する（１８０分で）前に、処置された傷害部位をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗い流した。これに対して、ＡＰＡＣ処置（白丸）に関しては、新しい傷害部位は、実験全体の間開いたままであった：最初に、動脈血流１００ｍＬ／分で１２０分間（白丸）、次に動脈血流５０ｍＬ／分に締め付けた狭窄（６０％）で１４分間（黒×）、最後に血流３０ｍＬ／分のきつい狭窄（９０％）で１０および１５分間の連続期間（黒星）。 ヒヒモデル（ｎ＝４）において血が流れている際のコラーゲン誘発血栓形成におけるＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＵＦＨ（いずれも４ｍｇ／ｍＬ）の比較を示すグラフである。以下について血小板沈着の減少が観察された：Ａ）適用部位でのコラーゲン表面、ここで、ＡＰＡＣ１の存在下で、ＵＦＨ（ｐ＝０．０１）と比較して３４±１３％（平均および標準偏差、ｎ＝４）血小板沈着が減少する、Ｂ）コラーゲンセグメントの遠位１０ｃｍに広がった血栓、ここで、ＡＰＡＣ１の存在下で、ＵＦＨ（ｐ＝０．１９）と比較して６３±１１％（平均および標準偏差、ｎ＝４）血小板沈着が減少した。フィブリン形成も、未処置の対照と比較して、ＡＰＡＣ１で４５％±１４％（平均および標準偏差、ｎ＝４）減少し（ｐ＝０．０１）、これは、血小板および凝固阻害の二重作用に対応している。 ラットの血漿におけるＡＰＡＣおよびＵＦＨの速効性抗凝固作用を示すグラフである。虚血性再灌流傷害または急性腎傷害を調査するために１６、３２または８０μｇで使用したＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）は、ＡＰＴＴアッセイを使用して測定した場合、有効な抗凝固剤であった。コンパレータとして、未分画ヘパリン（ＵＦＨ、黒色の破線）が同じ濃度範囲１６、３２または８０μｇで使用された。２つの治療法は、１６μｇで比較的等しく作用したが、３２μｇではＵＦＨはＡＰＡＣ２よりわずかにＡＰＴＴを延長させ、一方８０μｇではＵＦＨはＡＰＡＣ２よりも有意に大きくＡＰＴＴを延長させた（黒色の実線）ことがわかる。 １６μｇ（０．０６ｍｇ／ｋｇ）、３２μｇ（０．１３ｍｇ／ｋｇ）および８０μｇ（０．３２ｍｇ／ｋｇ）の用量でのＡＰＡＣ２またはＵＦＨの静脈内投与後１０分の平均±標準偏差としてのＡＰＴＴ。ｎ＝５〜８／群。^＊＊＊Ｐ＜０．００１。１６μｇの用量で、ＡＰＴＴは、ＡＰＡＣについて１８．０±６．６（ｎ＝７）であり、ＵＦＨについて２７±６．２（ｎ＝４）であった。３２μｇの用量で、ＡＰＴＴは、ＡＰＡＣについて１７．４±４．０（ｎ＝１０）であり、ＵＦＨについて２５．２±２．０（ｎ＝５）であった。８０μｇの用量で、ＡＰＴＴは、ＡＰＡＣについて４２．２±１８（ｎ＝８）であり、ＵＦＨについて７２−１８０＞（ｎ＝５）であった。赤色の破線はＡＰＴＴに対する基準のベースラインである。ヘパリン用量は、Ｂｌｙｓｃａｎ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎアッセイにおける標準物質としてＵＦＨを使用して決定された。 ３０分の両腎虚血性再灌流傷害後の腎機能および尿細管間質性傷害を示すグラフである。確立されたマーカーを使用してアッセイされた場合、腎機能に関する１６または３２μｇのＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）の効果を生理食塩水媒体（静脈内）のみの対照と比較した。腎機能マーカーであるクレアチニン、尿素および好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）が、３０分の可逆性虚血性再灌流傷害に続いて３日間にわたりアッセイされ、３２μｇのＡＰＡＣ２の濃度によって、各時間間隔で各マーカーのレベルが有意に低下し、このことは３２μｇのＡＰＡＣ２の保護的役割を意味する。 腎虚血後の腎機能および尿細管間質性傷害を分析するために、再灌流後、ラット血清が３日間毎日採取された。ＡＰＡＣ１６μｇ（０．０６ｍｇ／ｋｇ）および３２μｇ（０．１３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に前処置したラットにおける、尿細管間質性傷害のバイオマーカーである（Ａ）クレアチニン、（Ｂ）尿素窒素および（Ｃ）ＮＧＡＬの血清レベル。対照ラットは生理食塩水媒体を静脈内に受けた。ｎ＝８／群。^＊＊Ｐ＜０．０１。ヘパリン用量は、Ｂｌｙｓｃａｎ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎアッセイにおける標準物質としてＵＦＨを使用して決定された。 ３０分の両腎虚血性再灌流傷害後の自然免疫活性化および組織病理学を示すグラフである。３０分の可逆性傷害後の虚血性再灌流傷害の目に見える効果は、生理食塩水媒体（静脈内）対照と比較して、１６または３２μｇのいずれかでＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）を使用することによって改善された。腎臓は、Ａ）自然免疫リガンドであるヒアルロナン（ＨＡ）、Ｂ）尿細管間質性傷害による尿細管損傷のマーカーであるＫｉｍ−１およびＣ）ヘマトキシリンエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を用いる尿細管傷害（扁平化、拡張、円柱および壊死）について調査された。 再灌流の３日後の自然免疫活性化および腎傷害の評価のために、ＡＰＡＣ１６μｇ（０．０６ｍｇ／ｋｇ）および３２μｇ（０．１３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に前処置したラットにおおて、腎臓のパラフィン包埋断面を（Ａ）自然免疫リガンドであるヒアルロナン、（Ｂ）尿細管間質性傷害のマーカーであるＫｉｍ−１および（Ｃ）組織病理学のためのＨ＆Ｅについて染色した。（Ａ）ヒアルロナンに対して陽性の面積は、コンピュータ映像化を用いて測定された。（Ｃ）Ｃ＝上皮円柱、Ｄ＝尿細管拡張、矢頭＝上皮扁平化、矢印＝上皮壊死。対照ラットは生理食塩水媒体を静脈内に受けた。挿入図におけるＩｇＧ対照。ｎ＝８／群。^＊Ｐ＜０．０５。ヘパリン用量は、Ｂｌｙｓｃａｎ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎアッセイにおける標準物質としてＵＦＨを使用して決定された。 厳格に１時間の両腎虚血性再灌流傷害後の腎機能および全生存を示す図である。両腎動脈を１時間クランピングして、腎臓を重度のＩＲＩにさせた。虚血後の腎臓の生存と機能を分析するために、再灌流後、ラット血清が３日間毎日採取された。ＡＰＡＣ（バッチ２．１、１１ヘパリン鎖）３２μｇで処置することにより組織が生存可能となり、３日間の監視期間にわたって（Ａ）ラットの生存％、さらにＡＰＡＣ３２μｇ（０．１３ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に前処置したラットにおいて（Ｂ）クレアチニンおよび（Ｃ）尿素窒素の血清レベルも陽性の結果を示した。ラット血清クレアチニンおよび尿素は減少し、このことは腎機能の保持を示唆した。対照ラットは生理食塩水媒体を静脈内に受けた。ｎ＝８／群。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。ヘパリン用量は、ＧＡＧアッセイにおける標準物質としてＵＦＨを使用して決定された。 アンチトロンビン欠乏血漿中１．０および２μｇ／ｍＬのＨｅｐ［Ｃ］で、第五世代のＡＰＡＣ１（バッチ５．１、４Ｈｅｐ鎖）、および２μｇ／ｍＬのＨｅｐ［Ｃ］で、ＡＰＡＣ２（バッチ５．２、８Ｈｅｐ鎖）の存在下でのトロンビン時間（ＴＴ）を示す図である。ヘパリン用量は、ＧＡＧアッセイにおける標準物質としてＵＦＨを使用して決定された。 アンチトロンビン欠乏血漿中Ｈｅｐ［Ｃ］４および５μｇ／ｍＬで、第五世代のＡＰＡＣ１（バッチ５．１、４Ｈｅｐ鎖）、およびＨｅｐ［Ｃ］４μｇ／ｍＬで、ＡＰＡＣ２（バッチ５．２、８Ｈｅｐ鎖）およびＵＦＨの存在下での活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を示す図である。ヘパリン用量は、ＧＡＧアッセイにおける標準物質としてＵＦＨを使用して決定された。

方法
コンジュゲーション
未分画ヘパリン（Ｈｅｐ）鎖を、２種の代替的架橋剤によって作製されたジスルフィド架橋を介して、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）にコンジュゲートし、反応経路は以下を使用する：
ｉ）ヘテロ二機能性架橋剤である３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）。コンジュゲーションのために、Ｈｅｐリンカー領域におけるＳｅｒおよびＨＳＡにおけるＬｙｓの遊離アミンを利用した。ＨｅｐとＨＳＡは、それぞれ、別の反応で、スルフヒドリル（−ＳＨ）およびピリジルジチオール（−ＰＤＰ）誘導体に改変した。最終のコンジュゲーション反応において、ＨＳＡのピリジルジチオール基は、Ｈｅｐのスルフヒドリル基と反応して、ジスルフィド結合複合体の形成とピリジン２−チオンの放出をもたらした。
ｉｉ）ホモ二機能性架橋剤である３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル（ＤＴＳＰ）。コンジュゲーションのために、Ｈｅｐリンカー領域におけるＳｅｒおよびＨＳＡにおけるＬｙｓの遊離アミンを利用した。Ｈｅｐを、最初に、第１のＮＨＳ基の放出を伴って、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル誘導体に改変した。最終のコンジュゲーション反応において、ＨＳＡのＬｙｓは、誘導体化ＨｅｐのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基と反応して、リンカー領域における切断可能なジスルフィド結合を有する複合体の形成と第２のＮ−ヒドロキシスクシンイミド基の放出をもたらした。

Ｈｅｐ−ＨＳＡ複合体を、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ媒体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）または限外濾過／血液透析濾過によって精製した。最後に、Ｈｅｐ−ＨＳＡ複合体を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶出した。複合体を、ＨＳＡに対するＨｅｐ鎖のコンジュゲーションレベルを示すサフィックスエクステンション付きのＡＰＡＣと称した。

本発明を例示するＡＰＡＣ複合体の一般式は、
（Ｈｅｐ−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＯ−ＮＨ）_ｎ−ＨＳＡ
（式中、ＨＳＡに結合する未分画ヘパリン鎖の平均数をｎと定義する）
である。

ＨＳＡに対するＨｅｐの平均コンジュゲーションレベル（ＣＬ）は、以下の等式に関するＨｅｐおよびＨＳＡの濃度ならびにこれらの平均分子量を使用して決定する：
Ｈｅｐのモル＝Ｈｅｐ［Ｃ］／平均Ｈｅｐ分子量
ＨＳＡのモル＝ＨＳＡ［Ｃ］／ＨＳＡ分子量
ＣＬ＝Ｈｅｐのモル／ＨＳＡのモル
Ｈｅｐ分子量＝１５８００
ＨＳＡ分子量＝６６４７２

Ｈｅｐポリマーに対する平均分子量は、ヘパリン製造者から得られた情報に基づく。ＨＳＡ分子量は、ＡＬＢＵ＿ＨＵＭＡＮ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔからのＰ０２７６８、シグナルおよびプロペプチドを有さないアイソフォーム１に基づく。
ＡＰＡＣ複合体。表Ｉを参照のこと。
ＡＰＡＣ１は１モルのＨＳＡ当たり４〜６モルのＨｅｐの平均ＣＬを有する。
ＡＰＡＣ２は１モルのＨＳＡ当たり８〜１６モルのＨｅｐの平均ＣＬを有する。

２０１０年に、第一世代のＡＰＡＣ、すなわちＡＰＡＣ１が、１モルのＨＳＡ当たり６モルのＨｅｐの平均ＣＬを有する比較的大きな（１ｇ）スケールで製造された（ＣＬ６：１、バッチ１．１）。ＡＰＡＣ１は、インビトロで抗凝固有効性および抗血小板有効性の両方を示した。急性血栓症の２種の異なるヒヒモデルにおいて、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、すなわちＨＳＡに結合していないヘパリンである対照に対して、これは、血管開存性ならびに血栓およびフィブリンの蓄積の両方の減少を維持した。また、放射活性で（Ｃｕ−６４）標識されたＡＰＡＣ１は、対照、すなわちＵＦＨと比較して、新たなラットの吻合における局所投与部位での局在性を延長した（ＩＰＳ治療法における研究、カナダ）。

２０１１年に、ＡＰＡＣ２（バッチ２．１）と称される第二世代のＡＰＡＣが製造され、ＡＰＡＣ１と比較した場合、ＨＳＡに対するＨｅｐの平均ＣＬ（１１：１）がほぼ２倍であった。ＡＰＡＣ１と比較した場合、ＡＰＡＣ２は、同じヘパリン濃度で多血小板血漿（ＰＲＰ）におけるコラーゲン誘発血小板凝集の阻害においてより効率的であった。ラットの吻合モデルにおいて、Ｃｕ−６４標識したＡＰＡＣ２は、血管の内側に投与され、ＵＦＨ対照の２倍の時間検出可能であった（ＩＰＳＴ、カナダ）。

２０１２年に、第三世代のＡＰＡＣ（今回は複数のバッチ３．１から３．６）が製造された。６種の異なるＡＰＡＣ複合体（ＣＬ６：１から１６：１を有する）が、コンジュゲーション反応（ＣＲ）自体の再現性を研究するために、小規模で製造された（バッチサイズ約５０ｍｇ）。これらのＡＰＡＣ複合体は、製造順に従って称され（ＣＲ１から６）、したがって、これらの名称は生成物の特定のＣＬを反映していない。製造プロトコルが小規模用に調整されたので、それと一致した変化によって生成物の最終特性がわずかに改変される場合もあった。興味深くかつ一様に、ＣＬの高い化合物は、ＰＲＰにおけるコラーゲン誘発血小板凝集の阻害において、低いＣＬよりも効率的であった。一方、抗凝固有効性は、低いＣＬでより明白であると思われた。

２０１３年には、第四世代のＡＰＡＣ、ＡＰＡＣ１（ＣＬ４：１、バッチ４．１）およびＡＰＡＣ２（ＣＬ８：１、バッチ４．２）の両方が製造された。

２０１４年には、第五世代のＡＰＡＣ、ＡＰＡＣ１（ＣＬ４：１、バッチ５．１）およびＡＰＡＣ２（ＣＬ８：１、バッチ５．２）が作製された。２０１４年のバッチの分析が進行中である。

定量
コンジュゲート分子、すなわちＨＳＡタンパク質と高度に硫酸化されたヘパリン部分の両方を有する性質のため、ＡＰＡＣ生成物のＣＬを決定することが要求されてきた。ＨＳＡ濃度は、製造者の使用説明書（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国）に従って、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイで決定した。２０１３年には、ＢＣＡアッセイはタンパク質を過大評価すると思われたため、２８０ｎｍでの直接ＵＶ測定も行い、ＢＣＡアッセイを検証した。Ｈｅｐ（Ｈｅｐａｒｉｎ Ｌｅｏ、Ｌｅｏ Ｐｈａｍａ、デンマーク）は、製造者の使用説明書（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ．、英国）に従って、Ｂｌｙｓｃａｎ Ｓｕｌｆａｔｅｄ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎアッセイ、すなわちＢｌｙｓｃａｎアッセイで決定した。

２０１０年および２０１２年には、Ｈｅｐはグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）標準物質（ウシ気管のコンドロイチン４−硫酸）に対してアッセイされた。このＧＡＧ標準物質を用いて、Ｈｅｐ濃度は、典型的には過大評価された。したがって、２０１３年には、ヘパリン出発物質が、Ｂｌｙｓｃａｎアッセイに対する新しい標準物質として含まれた。完全性と比較の理由のため、ＧＡＧおよびヘパリンの両方を次の分析に使用した。ＣＬの決定は、ヘパリンアッセイにおいて使用した特定の標準物質に影響を受け（表Ｉ）、またＨＳＡの分析によっても影響を受けた。それにもかかわらず、様々なＡＰＡＣと対照ＵＦＨが比較された全ての研究において、Ｈｅｐ濃度は、同じアッセイ、すなわちＧＡＧまたは最近ではＨｅｐ標準物質のいずれか（硫酸化グリコサミノグリカンアッセイ、Ｂｌｙｓｃａｎアッセイキット、Ｂｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ．、英国）を用いて決定した。

簡潔には、定量化される被験試料を微量遠心管に添加し、水を使用して体積を１００μｌに調整した。各アッセイについて、Ｂｌｙｓｃａｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔの硫酸化ＧＡＧ標準物質または公知のヘパリン標準物質も、試薬ブランク（０μｇ；水またはＰＢＳ）に加えて、特定濃度範囲で行った。アッセイを開始するために、１．０ｍｌのＢｌｙｓｃａｎ Ｄｙｅ試薬を添加し（無機緩衝液中の１，９−ジメチル−メチレンブルー）、少なくとも３０分間混合した。硫酸化ヘパリンを含有する管は、紫／ピンク色に変化した。得られたＧＡＧ色素複合体を、遠心分離（＞１０，０００×ｇで１０分間）によって未結合の色素から分離した。上清を捨て、１．０ｍｌのＢｌｙｓｃａｎ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを添加してボルテックスした。次いで、得られた溶液を、６５６ｎｍの分光光度法による読取値でアッセイした。試薬ブランクと一緒に標準物質を使用して検量線を作成し、これを利用してヘパリン濃度を決定した。吸光度値は、０．０５から１．５単位の間であり、そうでなければ、試料をそれぞれ再構成または希釈した。

分子量
ＡＰＡＣの分子量（分子量）はまだ最終のものではなく、溶液のモル濃度が概算されただけにすぎない。通常のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および組合せの高圧ＳＥＣに関する研究ならびにトリプル検出器アレイ（ＴＤＡ；屈折計、粘度計および左右角度光散乱検出器を有する）技術により、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１）とＡＰＡＣ２（バッチ２．１）の間の分子量において、おおよそ２倍の増加が示された。

インビトロにおけるＡＰＡＣ機能の評価
材料および方法
採血
試料採取前少なくとも６〜７日間にいかなる医薬も得ていない健常ドナーからの血液を使用した。試料は、一晩の絶食後に、静脈穿刺を介して前肘静脈から標準の真空採血管（０．１０９Ｍのクエン酸ナトリウムＶａｃｕｅｔｔｅ４５５３２２、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−ｏｎｅ）に採取した。試料は採血後４時間有効であるとみなした。

多血小板血漿および乏血小板血漿
血液を、摂氏２２度にて、１８０×ｇで１２分間遠心分離し、多血小板血漿（ＰＲＰ）を分離した。乏血小板血漿（ＰＰＰ）採取のために、残りの血液を、摂氏２２度にて、１５００×ｇで１０分間再度遠心分離した。ＰＲＰの血小板（ＰＬＴ）数を細胞カウンタＳｙｓｍｅｘ ＫＸ−２１（Ｓｙｓｍｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、日本）で測定し、自動校正トロンボグラム（ＣＡＴ）分析用にＰＰＰで１５０×１０^６ １０％ＰＬＴ／ｍＬに、アゴニスト誘発ＰＲＰ凝集用に３００×１０^６±１０％ＰＬＴ／ｍＬに調整した。院内血漿プールとして、１１人のドナーから採血し、２０００×ｇで１０分間遠心分離した。ＰＰＰを１０．０００×ｇで１０分間再度遠心分離し、全ての残っている血小板を除去した。血漿を合わせて、アリコートで保存し、使用まで凍結させた。ＣＡＴ血漿は２回遠心分離した。

血漿
ＡＰＡＣ複合体およびＵＦＨ対照の抗凝固有効性を、同等のヘパリン濃度（Ｂｌｙｓｃａｎ ＧＡＧ ｓｔ．）で試験した。３種の異なる血漿が使用された：実験室対照血漿、すなわち標準ヒト血漿（ＳＨＰ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、ドイツ）、溶媒／界面活性剤（Ｓ／Ｄ）処理血漿（Ｏｃｔａｐｌａｓ、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ、スイス）、および院内プール血漿（ＰＰ、１１人の健常ドナー）。この概要において、院内プール血漿での結果を実施例として示している。

アンチトロンビン（ＡＴ）欠乏血漿（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ、米国）を使用して、ＡＰＡＣおよび、ＡＰＴＴアッセイでＵＦＨの、ＡＴに依存しない抗凝固有効性を研究した。

凝固
ヘパリンは、アンチトロンビンとトロンビンの複合体（ＩＩａ）に結合し、アンチトロンビンの能力を増強させて、トロンビンおよび凝固因子Ｘａならびに凝固の内因性および外因性経路の上流のいくつかの他の凝固因子を不活性化させる。対照的に、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）はアンチトロンビンにのみ結合し、ほぼ排他的に因子Ｘａを阻害する。トロンビンの標的化は長い鎖長を要し、ヘパリンにおいて少なくとも１８単位の五糖の配列を必要とする。ヘパリン含有血漿試料の抗凝固有効性は、血小板と他の血液細胞を欠くＰＰＰにおけるフィブリン血餅形成までに通常試験される。ヘパリンは高度に硫酸化され、強い負電荷を有する。したがって、循環血漿タンパク質または血管内皮への非特異的結合は、ここでは調査されない他の相互作用を誘発するかもしれない。

トロンビン時間
トロンビン時間（ＴＴ）（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ＢＣ試薬、Ｓｉｅｍｅｎｓ、ドイツ）アッセイでは、希釈した（４０μＬの血漿および１００μＬのトロンビンＢＣ）クエン酸血漿を、標準化された高用量のトロンビン（０．８ＩＵ／ｍｌ）で補充し、フィブリノーゲンのフィブリン血餅への変換時間を凝固計（ＫＣ−４、Ｓｉｇｍａ−Ａｍｅｌｕｎｇ、米国）で測定する。

活性化部分トロンボプラスチン時間
活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ、試薬Ｄａｄｅ Ａｃｔｉｎ ＦＳＬ、Ｓｉｅｍｅｎｓ、米国）アッセイでは、血餅形成は、接触活性化を表す内因性経路（Ｉ、ＩＩ、Ｖ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ）の凝固因子によって、および血漿の再石灰化によって誘発される。実験では、５０μＬの血漿を５０μＬのＡｃｔｉｎ ＦＳＬ（１００μＭのエラグ酸中のダイズおよびウサギの脳のリン脂質）で希釈し、５０μＬの２５ｍＭ ＣａＣｌ_２で再石灰化した。充分量のヘパリンの存在下で、ＴＴおよびＡＰＴＴは用量に依存して延長され始める。臨床的には、静脈内投与されたヘパリン抗凝固の程度が主にＡＰＴＴでモニターされる。治療レベルの抗凝固に到達するためには、対照試料に対して１．５から３倍の延長が目標とされる。ＡＰＴＴアッセイは、使用される試薬と凝固計に依存するが、ベースラインの範囲は、典型的には２０〜４０秒である。

校正自動トロンボグラム
出血または血栓症のリスクに関連する状態を評価するために、トロンビン生成が実験的に使用される（Ｈｅｍｋｅｒら Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ ２００２；３２：２４９〜５３）。トロンビンは、凝固プロセス全体にわたって形成されるが、全トロンビンの２から５％のみが、フィブリンがインビトロで凝血するために必要である。したがって、従来の凝固時間（すなわち、ＴＴおよびＡＰＴＴ）によって、Ｈｅｍｋｅｒの方法である校正自動トロンボグラム（ＣＡＴ）によって捕捉されうる、凝固の間のトロンビン活性の大半が見過ごされる。ＣＡＴは、組織因子に誘発されるトロンビン生成を評価し、これは、蛍光発生的トロンビン基質の分裂を検出し、試料を公知のトロンビン活性を有する対照と並列比較することによってモニターされる。トロンビン生成の過程で、抗凝固因子およびプロコアグラント因子の両方が、トロンボグラムの測定特性に影響を与える。ラグタイムは、ＰＴ（組織因子（ＴＦ）で誘発される）／ＡＰＴＴ（エラグ酸で誘発される）を反映するフィブリン血餅形成の時間を反映する。曲線のピークは、正味のトロンビン生成の最大速度とそれに到達する時間（ｔｔピーク）を示す。曲線下面積、すなわち内因性トロンビン産生能（ＥＴＰ）は、形成される全トロンビンを測定する。ＣＡＴでは、トロンビン生成は、クエン酸ＰＰＰまたはＰＲＰのいずれかにおいて評価されうる。トロンビンは、再石灰化血漿において、試料を、ＰＰＰおよびＰＲＰに対して、それぞれＴＦ（５ｐＭ）およびリン脂質（ＰＰＬ）（４μＭ）（ＰＰＰ試薬、Ｓｔａｇｏ、フランス）で、またはＴＦ（１ｐＭ、ＰＲＰ試薬、Ｓｔａｇｏ、フランス）で誘発および補充することによって活性化される。ＣＡＴによって、凝血因子の欠乏または過活性、および抗凝固剤（ヘパリンまたは直接トロンビン阻害剤のような）または出血障害の場合の補充療法の使用を検出することができる。

ＰＲＰにおける血小板凝集
血小板凝集は、３７℃で１０００ｒ．ｐ．ｍの撹拌子速度にてＡｇｇｒａｍ血小板凝集計（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、米国）を使用して、Ｂｏｒｎ（Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９６２；１６２：６７〜６８）の比濁法を用いて研究した。コラーゲン（Ｉ型フィブリル、Ｋｏｌｌａｇｅｎｒｅａｇｅｎｓ−Ｈｏｒｍ、Ｎｙｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ、ＡｕｓｔｒｉａまたはＣｈｒｏｎｏｌｏｇコラーゲン、Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ Ｌｔｄ．、米国）を、最終濃度０．５μｇ／ｍＬの主要アゴニストとして使用した。血小板凝集を誘発する前に、試験物質を、ＰＲＰを用いて、摂氏２２°で２分間、摂氏３７°で１分間インキュベートした。該当する場合、５分での最大凝集（光透過の％変化）、傾きおよび曲線下面積を測定した。

全てのアッセイにおいて、ベースラインは、試験物質と等しい体積の媒体（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を用いて測定した。本発明者らは、他のアゴニスト；アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、リストセチンおよびコラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）についても研究した。ＡＰＡＣは、ＡＤＰ誘発血小板凝集を阻害しないが、高濃度のリストセチン誘発凝集は阻害される（データは図示せず）。コラーゲンに対するＡＰＡＣの抗血小板活性は、血小板凝集試験において最も顕著な特徴である。

ヒヒにおける急性血栓症のモデル
媒体と比較したＡＰＡＣ１（バッチ１．１）およびＵＦＨの抗血栓症に対する有効性を、麻酔ヒヒの急性血栓症の２種の充分に確立されたモデルで研究した。改変Ｆｏｌｔ’ｓモデルにおいて、大腿動脈と静脈の間に体外ＡＶシャントを作成した。血流を、動脈に配置された外部圧迫器によって制御し、流量をプローブでモニターした。動脈を、Ｍａｒｔｉｎ把針器（Ｈｅｇａｒ−Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ ＴＣ Ｇｏｌｄ １４ｃｍ）を備えた交差クランプによって１０秒間、２回、外側から傷つけた。傷に近接した全ての側枝を結紮した。ＡＰＡＣ１またはＵＦＨまたはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）のいずれかのボーラス（４ｍｇ／ｍＬ）を注射するために、血管アクセスの近位１ｃｍに針（２６Ｇ）を用いてシャントを穿刺した。血流に曝す前に、傷を試験物質で３分間処置した。ベースラインの血流を回復した直後に、外部圧迫器を傷に配置し、流量を３０〜１００ｍＬ／分に減少させた（９０から３０％の狭窄）。減少した血流によって、狭窄動脈において血小板の蓄積が検出され、周期的血流減少（ＣＦＲ）として記録された。５ｍＬ／分で、動脈は閉塞したと考えられ、圧迫器を開放し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗い流すことによって血栓を除去した。ベースラインの血流が回復した後に、狭窄を最適用し、実験を繰り返した。

第２のヒヒモデルでは、コラーゲン被覆ＰＴＦＥグラフト（２ｃｍ、４ｍｍ内腔）を外在化動静脈シャントに配置することによって血栓症を誘発した。血栓形成コラーゲン表面をＡＰＡＣまたはＵＦＨ（いずれも４ｍｇ／ｍＬ）で１０分間処置した。血流が開始し（１００ｍＬ／分；２６５−１）、１１１−インジウム標識血小板およびフィブリンの沈着（１２５−イオジン−フィブリノーゲンの蓄積）を６０分間定量化した。

傷害部位の保持
局所投与した６４−Ｃｕ標識ＡＰＡＣまたはＵＦＨ（３ｍｇ／Ｋｇ）のオンサイト有効性、分布、及び保持を、ラットにおいて部分的に結紮した（１ｃｍ離して２個の緩い縫合糸）大腿動脈の吻合を５０時間ＰＥＴ画像化することによって評価した。

虚血性再灌流傷害および急性腎傷害モデル。
動物。体重２３５〜２５０ｇの特定病原体除去、近交系雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット（Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｏｒｓｔ、オランダ）を使用した。ラットは、通常のラットフードと水道水を自由に摂取させ、１２時間の明／暗サイクルで維持した。アメリカ国立衛生研究所およびＯｆｆｉｃｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６）によって出版されたＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓに従って、動物をヒトが世話した。

血液細胞の計数および凝固プロファイル。ＳＤラットに、ＰＢＳ（ｐＨ７．４で１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウム）で適当な濃度に希釈したＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１６μｇ、３２μｇもしくは８０μｇ）またはＵＦＨ３２μｇ（注入溶液５０００ＩＵ／ｍＬ；２００ＩＵ／ｍｇ；Ｌｅｏ Ｐｈａｒｍａ、デンマーク）を静脈内投与した（ｎ＝８／群）。対照ラットは生理食塩水媒体を静脈内に受けた。１０分で、ラットは血液細胞計数および凝固プロファイル分析のために屠殺された。最初の血液試料を、３．８％のクエン酸ナトリウム抗凝固剤を予め充填した２ｍＬシリンジで抜き取り、３ｍＬのポリプロピレン試料管に入れた。第２の試料を、直後に、ラット血清の採取のために別の２ｍＬの空のシリンジに抜き取った。試料、すなわちＰＰＰおよび血漿ならびに血清を血液細胞の計数のために別々に処理した。血液細胞の計数を、クエン酸血液試料中で、細胞カウンタＳｙｓｍｅｘ ＫＸ−２１を用いて決定した。ＰＰＰに対して、血液を、１２００×ｇで１５分間遠心分離して（２２℃）、白血球と赤血球細胞を分離した。ＰＰＰを新しい管にピペットで移しながら、バフィーコートを破壊しないよう注意した。ＰＰＰを再度、１６１００×ｇで５分間遠心分離し、その後ＰＰＰを新しい管に採取した。すぐに使用しない場合、ＰＰＰは−４０℃で保存した。

腎動脈のクランピングモデル。ＳＤラットは、温虚血の発症１０分前または後に、試験モデルによって、ＰＢＳで適切な濃度に希釈したＡＰＡＣ２（バッチ２．１）１６μｇ、３２μｇもしくは８０μｇまたはＵＦＨ３２μｇ（注入溶液 ５０００ＩＵ／ｍＬ、２００ｍｇ／ＩＵ）のいずれかを静脈内に受けた（ｎ＝８／群）。対照ラットは生理食塩水媒体を静脈内に受けた。ラットを吸入イソフルランで麻酔して、正中腹部切開を行った。両腎動脈を、試験モデルによって、３０または６０分間クランピングした。クランプを除去した後、血流を回復させるために腎臓を検査して、腹部を閉じた。ラットには、体液平衡と疼痛緩和の術後維持のために、それぞれ１ｍＬのＰＢＳと０．１ｍＬのブプレノルフィン（Ｔｅｍｇｅｓｉｃ ０．３ｍｇ／ｍｌ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ニュージャージー）を投与した。

腎機能および急性腎傷害の評価。腎機能および腎傷害の評価のために、腎傷害の１、２、および３日後に、ラット尾静脈血液試料を麻酔下で採取した。フィンランド、ヘルシンキのヘルシンキ大学病院、ＨＵＳＬＡＢ臨床化学部でクレアチニンおよび尿素窒素活性をさらに分析するまで、血清を−２０℃で凍結させた。急性腎傷害に対するバイオマーカーとして、本発明者らは、ラットの好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）を使用した。ＮＧＡＬ血清レベルを、両腎動脈クランピングの３日後、マウスモノクローナル抗ＮＧＡＬ（ＢｉｏＰｏｒｔｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａ／ＳからのＡＢＳ ０３９−０８、Ｇｅｎｔｏｆｔｅ、デンマーク）を使用するＥＬＩＳＡによって評価した。

免疫組織化学。免疫組織化学のつぃて、４ｍｍ厚さのパラフィン包埋またはクリオスタット断片を、ガラススライド上で連続して切断し、ペルオキシダーゼＡＢＣ法を使用して染色した（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｅｌｉｔｅ ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。反応は、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって可視化された。免疫染色として、標本を、ｐＨ７．４０の１．５％の正常ヤギ血清／ＰＢＳで２０分インキュベーションし、続いて、室温で３０分間（モノクローナル抗体）または＋４℃で１５時間（ポリクローナル抗体）、最適希釈で一次抗体とインキュベーションして、ブロックした。一次抗体を０．１％ウシ血清アルブミン／ＰＢＳ溶液で希釈した。ＰＢＳで洗浄した後、内因性ペルオキシダーゼの活性を、０．１％のペルオキシダーゼ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）（３０％）／ＰＢＳ溶液との１０分のインキュベーションでブロックした。ＰＢＳでの介在洗い流しと共に、標本を、ＰＢＳ緩衝液中で、室温で３０分間、ビオチン化抗体とさらにインキュベートし、ＰＢＳ緩衝液中で、室温で３０分間、アビジン−ビオチン化ホースラディッシュ複合体で検出し、反応をＡＥＣ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で明らかにした。スライドを、Ｍａｙｅｒ’ｓのヘマラムで対比染色した。陽性細胞の密度を決定するために、４つのランダムフィールドの各四分円の断面を、４０×の倍率で計数し、１ｍｍ^２に対する合計としてスコアを得た。使用した抗体と希釈液は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニアからのＣＤ８＋Ｔ細胞（５ｍｇ／ｍＬ、２２０７１Ｄ）およびＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、アビングドン、英国からのＫＩＭ−１（８ｍｇ／ｍＬ、ＡＦ３６８９）であった。

ヒアルロナン（ＨＡ）を、記載されたように、０．０５％の３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、セントルイス、ミズーリ）を用いるアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ検出（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；１：２００希釈）によって、ウシ関節軟骨から調製したアグリカンのビオチン化Ｇ１ドメインとリンクタンパク質を含有する特定のビオチン化ｂＨＡＢＣヒアルロナン結合複合体を使用して、パラフィン断片から染色した。染色前に、プロテアーゼ阻害剤の存在下で、ストレプトマイセス属のヒアルロン酸分解酵素でいくつかの断片を消化すること、またはヒアルロン酸オリゴ糖でｂＨＡＢＰプローブをプレインキュベートすることによって、染色の特異性を制御した。各試料から、４０×倍率で１０枚の写真を撮影し、ヒアルロナンに陽性の面積を、コンピュータ映像化を用いて測定した（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｎｖｉｓｉｏｎ ４．４、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）。これら１０個の測定値の平均面積を統計分析に使用した。全ての分析を、２人の独立した観察者による盲検下で行った。

腎臓の組織学的検査。組織損傷の半定量的評価を以下のように行った：２ｍｍの厚さのパラフィン包埋腎臓試料をヘマトキシリンエオジンで染色した。尿細管傷害（扁平化、拡張、円柱および壊死）について以下のパラメータの重症度を以下のように０から３のスケールで等級付けし：等級０＝損傷なし、等級１＝軽度の損傷、等級２＝中程度の損傷、等級３＝重度の損傷、全体の尿細管傷害スコア（０〜１２）として表した。

統計。全てのデータは、平均＋／−ＳＥＭであり、Ｗｉｎｄｏｗｓ バージョン１５．０用ＳＰＳＳによって分析した（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ、シカゴ、イリノイ）。２群の比較のために、ノンパラメトリックＭａｎｎ−ＷｈｉｔｎｅｙのＵ検定およびパラメトリックＳｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定を適用した。多群の比較のために、Ｄｕｎｎの事後検定を用いたノンパラメトリックＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを用いたパラメトリックＡＮＯＶＡを適用した。生存のために、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）を用いたＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ分析を適用した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意とみなした。

結果
トロンビン時間
２０１０年から２０１２年までのＡＰＡＣ複合体（ＣＬ６：１から１６：１）の存在下でのプール血漿におけるＴＴ測定の例が図１に示されており、ＡＰＡＣ１（バッチ４．１）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２）については図２に示されている。

図１
１μｇ／ｍＬでは、全てのＡＰＡＣはＴＴを少なくとも１．５倍延長させ、一方ＵＦＨはＴＴをベースライン（３０秒）の１．３倍延長させた。ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）は測定された最大ＴＴ（３００秒）に到達し、一方ＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）はＴＴをベースラインの２．５倍延長させた（図１）。ＡＰＡＣ−ＣＬ６（６Ｈｅｐ鎖）はＴＴを５．５倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ８、バッチ３．２（８Ｈｅｐ鎖）は５．８倍、バッチ３．１（８Ｈｅｐ鎖）は４．３倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（１０Ｈｅｐ鎖）は２．４倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（１３Ｈｅｐ鎖）は２．５倍およびＡＰＡＣ−ＣＬ１６（１６Ｈｅｐ鎖）は３．７倍、ベースライン値を延長させた（図１）。１．５μｇ／ｍＬでは、全てのＡＰＡＣおよびＵＦＨが測定値の最大時間に到達した。

図２
ＡＰＡＣ１（バッチ４．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２、８Ｈｅｐ鎖）は、それぞれＴＴを２．１から２．４倍延長させた（図２）。１．２５μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ４．１、４Ｈｅｐ鎖）は測定された最大時間（３００秒）に到達し、一方ＡＰＡＣ２（バッチ４．２、８Ｈｅｐ鎖）はＴＴを３．２倍延長させた（図２）。

活性化部分トロンボプラスチン時間
図３
ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）およびＣＬ６：１から１６：１で、バッチ３．１から３．５（８、８、１０、１３、１６Ｈｅｐ鎖）のＡＰＡＣの存在下で、プール血漿におけるＡＰＴＴ測定の例が、図３に示されている。

ＡＰＴＴベースライン（３０秒）と比較して、１μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１）はＡＰＴＴを１．４倍延長させ、一方他のＡＰＡＣおよびＵＦＨはＡＰＴＴを１．１から１．２倍延長させた。２μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１）はＡＰＴＴを２．０倍延長させ、一方他のＡＰＡＣおよびＵＦＨはより少ない、１．４から１．６倍の延長を示した。３μｇ／ｍＬでは、ベースラインと比較して、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）はＡＰＴＴを２．６倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．１および３．２、８Ｈｅｐ鎖）は２．１倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）は２．０倍、ＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）は１．９倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（バッチ３．４、１３Ｈｅｐ鎖）、ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６Ｈｅｐ鎖）およびＵＦＨはいずれも１．８倍延長させた。６μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）はＡＰＴＴを６．７倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．１および３．２、８Ｈｅｐ鎖）は５．４から４．７倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）は４．５倍、ＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）は４倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（バッチ３．４、１３Ｈｅｐ鎖）は３．８倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６ｈｅｐ鎖）は３．６倍およびＵＦＨは３．１倍延長させた。８μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）はＡＰＴＴを９．８倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ８（バッチ３．１および３．２、８Ｈｅｐ鎖）は９．３から８．７倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）は７．４倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１３（バッチ３．４、１３Ｈｅｐ鎖）は６．０倍、ＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）は５．４倍、ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６Ｈｅｐ鎖）は５．８倍およびＵＦＨは４．２倍、少なくとも延長させた。使用した最も高い濃度では、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）とＡＰＡＣ−ＣＬ１０（バッチ３．３、１０Ｈｅｐ鎖）との間のＡＰＴＴの差は２５％、ＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）との間の差は４５％であった。全てにおいて、典型的には、ＡＰＴＴは、第一世代および第二世代のＡＰＡＣ（バッチ１．１および２．１、４および１１Ｈｅｐ鎖）の最も低いＣＬの存在下で、ベースラインと比較して最も延長された。

第四世代のＡＰＡＣ（ＡＰＡＣ１対ＡＰＡＣ２）は、高用量（６μｇ／ｍＬ超）のＨｅｐが使用されるまで、ＡＰＴＴ延長が非常に類似するという点で、以前のバッチと異なった。次いで再び、抗凝固は、ヘパリンのより低い結合ＣＬから利益を得た。１μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ４．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２、８Ｈｅｐ鎖）はいずれも、ベースライン値（２９秒）と比較してＡＰＴＴを１．２倍延長させた。２μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ４．１）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２）は、ＡＰＴＴを同様に、それぞれ１．４および１．３倍延長させた。３μｇ／ｍＬでは、再度、ＡＰＡＣ１（バッチ４．１）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２）は、ＡＰＴＴを同様に、それぞれ１．８および１．７倍延長させた。６μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ４．１）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２）は、ＡＰＴＴを、それぞれ３．９および３．４倍延長させた。８μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ４．１）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２）は、ＡＰＴＴを、それぞれ７．５および６．０倍延長させた。使用した最も高い濃度では、ＡＰＡＣ１（バッチ４．１）とＡＰＡＣ２（バッチ４．２）の間のＡＰＴＴの差は２１％であった。

図４
異なるヘパリン結合、ＣＬを有するＡＰＡＣのＡＰＴＴ評価した抗凝固作用を図４に示す。

図５
第四世代のＡＰＡＣ１（バッチ４．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２、８Ｈｅｐ鎖）の存在下でのＡＰＴＴを図５に示す。

ＰＰＰにおける自動校正トロンボグラム（ＣＡＴ）
図６〜９
組織因子（５ｐＭ）、外因性経路活性剤によって誘発されるＣＡＴは、ＡＰＴＴを延長させるために必要とされるより低い濃度のＡＰＡＣで抗凝固作用を示した。０．２５〜１．５μｇ／ｍＬの低いヘパリン濃度において、ＡＰＡＣはピークとＥＴＰを低減させ、試験した３つの異なる血漿全て（ＰＰ、ＳＨＰおよびＯｃｔａｐｌａｓ）に用量依存してｔｔピークを延長させた。プール血漿における第一世代のＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）、第二世代のＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）、ＵＦＨおよび第三世代のＡＰＡＣ−ＣＬ６から１６の影響を示すトロンボグラムを、実施例として、図７〜１２に示した。ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）に対するラグタイム（秒）、ＥＴＰ（ｎＭ）、ピーク（ｎＭ）およびｔｔピーク（秒）は表ＩＩにまとめ、ＡＰＡＣ−ＣＬ６からＡＰＡＣ−ＣＬ１６に対しては表ＩＩＩにまとめた。媒体対照と比較した値の相対変化（％）を示す。トロンビン生成が完全に阻害された場合、ラグタイム（秒）、ＥＴＰ（ｎＭ）、ピーク（ｎＭ）、ｔｔピーク（秒）を０として表した。

ＵＦＨと比較して、ラグタイムとｔｔピークは、試験した全ての濃度で全てのＡＰＡＣによって明らかに延長された。ＥＴＰは、ＥＴＰがＵＦＨと類似する１．０μｇ／ｍＬのＡＰＡＣ−ＣＬ６（バッチ３．６、６Ｈｅｐ鎖）を除いて、全ての濃度で、ＵＦＨと比較してＡＰＡＣによって減少した。ピークは、ピーク値がＵＦＨに類似する１．０μｇ／ｍＬのＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）を除いて、全ての濃度で、ＵＦＨと比較してＡＰＡＣによって減少した。トロンビン生成は、ベースラインピーク値１５％を示したＡＰＡＣ−ＣＬ６（バッチ３．６、６Ｈｅｐ鎖）を除いて、１．５μｇ／ｍＬのＡＰＡＣで完全に消失した。全体的に、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）は、比較的類似したトロンビン生成阻害を有した。第三世代では、ＣＬ１３：１および１６：１を有するＡＰＡＣは、ＣＬ＜１０を有するＡＰＡＣより有効な阻害剤である。

ＰＲＰにおける自動校正トロンボグラム
図１０〜１２
これらの図は、血小板依存性トロンビン生成、すなわちプロコアグラント活性を調査し（出血または血栓症のリスクを評価するため）、ＡＰＡＣがトロンビン生成を阻害することを示す。血小板の存在下で、低い（１ｐＭ）ＴＦトリガーを使用し、それによってトロンビン生成もＰＰＬを添加した血漿ＣＡＴにおけるより少なかった。低Ｈｅｐ濃度０．２５〜１．５μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣはピークおよびＥＴＰを低減させ、試験した各健常ドナーのＰＲＰに用量依存するｔｔピークを延長させた。

図１０ではＵＦＨ濃度、図１１では第一世代のＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）、第二世代のＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）、ならびに図１２では第四世代のＡＰＡＣ１（バッチ４．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ４．２、８Ｈｅｐ鎖）の影響を示すトロンボグラムを、研究の結果を反映する選択濃度を使用する実施例として示した。０．５μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣは、ＵＦＨの少なくとも２倍のトロンビン生成の有効阻害剤であった。ＣＬ８：１および１１：１を有するＡＰＡＣは、血漿−プロコアグラント活性のより強力な阻害剤であり、ＣＬ６：１を有するＡＰＡＣよりピークおよびｔｔピークを低減させた。１．０μｇ／ｍＬでは、ＵＦＨに対する有効性の差が、全てのＡＰＡＣによってより一層宣言された。

まとめると、ＵＦＨと比較してＡＰＡＣでは明らかに、トロンビン生成が遅延し、血小板活性が阻害された。コンジュゲートしたヘパリン鎖数が多いほど、阻害も強かった。

コラーゲン誘発血小板凝集
図１３〜１４。ＡＰＡＣに対して高感受性（ドナーの５０％）、中程度感受性（ドナーの３０％）および低感受性を有するドナーにおける代表的な凝集曲線（図１３）ならびに高レスポンダーおよび中程度レスポンダーにおけるＡＰＡＣ１のプール用量反応分析（図１４）。

図１３。ＡＰＡＣ ＡＰＡＣ−ＣＬ６からＣＬ１６（Ｈｅｐ［Ｃ］１、３、１０、３０および９０μｇ／ｍＬで）について、３人の独立したドナーからのクエン酸抗凝固ＰＲＰにおいて試験し、ドナーはそれぞれ異なる感受性を有する（３０μｇ／ｍＬのヘパリン濃度での阻害％として定義（全体でＥＤ５０））：コラーゲン（ｃｏｌｌ；０．５μｇ／ｍＬ）誘発血小板凝集において、ＡＰＡＣに対する高レスポンダー＞６０％、低レスポンダー＜４０％および中程度レスポンダー４０〜６０％。６分での最大凝集％および曲線の傾き（凝集の速度）についての結果を検出した。

ＡＰＡＣ−ＣＬ６からＡＰＡＣ−ＣＬ１６（８、８、１０、１３、１６、および６Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）は、速度と最大血小板凝集を低下させたが、ＵＦＨは低下させなかった。高い結合ＣＬ１１から１６：１を有するＡＰＡＣは、より低いＣＬ６から１０：１を有する分子より、より強力な阻害剤であった。ＡＰＡＣ−ＣＬ６からＡＰＡＣ−ＣＬ１６に対する、低レスポンダーに関する１、１０および３０μｇ／ｍＬでの結果を図１３に表した。最大凝集はそれほど影響を受けなかったが、凝集曲線（凝集の速度に関する）は、全てのＡＰＡＣバリアントについて用量依存的に下降した。ＡＰＡＣ−ＣＬ１６（バッチ３．５、１６Ｈｅｐ鎖）は、この低レスポンダー（ドナー２）において最高の阻害剤であり、最大凝集％を９２から３８％まで低下させた。

図１４。高レスポンダーのＰＲＰでは、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）は、１０μｇ／ｍＬで、最大血小板凝集の９０％を阻害したが、中程度レスポンダーのＰＲＰでは、凝集の７５％を阻害するためには９０μｇ／ｍＬが必要だった。高レスポンダーおよび中程度レスポンダーに関してＡＰＡＣ１の３、１０、３０、６０および９０μｇ／ｍＬでの結果が表されている。

ヒヒにおける血栓症の急性モデル
図１５〜１６
ヒヒにおける急性血栓症モデルにおいて、ＡＰＡＣおよびＵＦＨを、４ｍｇ／ｍＬで、傷に局所投与した（図１５）。ＵＦＨの存在下で、１００ｍＬ／分の流量で、動脈は繰り返し（５ＣＦＲ／２７分）閉塞した（３０％に狭窄）。対照的に、ＡＰＡＣ１（バッチ１．１、４Ｈｅｐ鎖）は、１２０分の経過観察時間の後、実験が中断されるまで、血栓形成を有効に阻害した。実験の終わりに、１８０分の時点で、ＡＰＡＣが選択試験期間（それぞれ１０および１５分）閉塞を阻害し続ける一方で、動脈を、まず５０ｍＬ／分まで（６０％の狭窄）、最終３０ｍＬ／分まで（９０％の狭窄）再狭窄した。ＵＦＨおよびリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いる対照実験では、繰り返しＣＦＲが起こった（結果は図示せず）。体外コラーゲングラフトに関するヒヒ血栓症モデルでは（図１６）、ＡＰＡＣ１は、ＵＦＨと比較して、コラーゲンへの血小板沈着を３４±１３％（平均および標準偏差、ｎ＝４、ｐ＝０．０１）まで低減させた。遠位への血栓の広がりも、６３±１１％（ｎ＝４、ｐ＝０．１９）まで減少した。ＵＦＨに関する結果は、未処置対照（ｎ＝２１）の値と類似した。フィブリンの蓄積は、ＡＰＡＣ１によって低減したが（４５±１４％）、ＵＦＨによっては低減しなかった（１．１±０．１％、ｎ＝４、ｐ＝０．０１）。

強力な保持能力と緩慢な分解に対応して、ＰＥＴは、５０時間を超えて（〜１２０時間）、ラットの吻合部位で未分解ＡＰＡＣを検出したが、ＵＦＨは２４時間後にすでに検出できなかった（ｎ＝２）。約１０％のＡＰＡＣが、血管の適用部位に直接結合した。ＡＰＡＣとＵＦＨは両方、尿路経路を介して排除された。

虚血性再灌流傷害および急性腎傷害モデル
図１７〜２０
とりわけ、虚血性再灌流傷害は、急性腎傷害モデルにおいて実証されたが、本発明の治療法は、任意の他の再灌流傷害に関連して使用され、したがって、心筋梗塞または卒中または末梢動脈閉塞性疾患または腸間膜虚血によって例示されるような他の傷害を予防し、回復させまたは処置するために使用されうる。

ＩＲＩからの腎機能の回復を分析した。ＡＰＡＣ２（バッチ２．１、１１Ｈｅｐ鎖）の１６または３２μｇの用量は、ラットの血液学的分析に基づいた。ＡＰＡＣ２の臨床上妥当な用量範囲およびＵＦＨの比較臨床用量は、以前の動物モデルに基づいた。ＡＰＡＣ２およびＵＦＨの抗凝固有効性に関する用量は、ＡＰＴＴで１０分の静脈内注射後に示され（図１７）、ＵＦＨは、最も高い用量（８０μｇ）でＡＰＡＣ２よりＡＰＴＴを３倍延長させた。ＳＤラットは、両腎動脈が３０分間クランピングされる１０分前に、生理食塩水媒体（静脈内）またはＡＰＡＣ２ １６もしくは３２μｇ（静脈内）のいずれかで処置した。虚血後の腎機能を評価するために、再灌流後３日間、ラット血清および血漿を採取した。ＡＰＡＣ２ ３２μｇ処置ラットでは、媒体処置ラットと比較した場合、血清クレアチニン（^＊＊Ｐ＜０．０１、図１８Ａ）および尿素窒素（^＊＊Ｐ＜０．０１、図１８Ｂ）レベルが減少した。腎傷害のバイオマーカーである好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）血清レベルのＥＬＩＳＡ分析により、ＡＰＡＣ２ ３２μｇの前処置も尿細管間質性傷害を低減させることが明らかとなった（^＊＊Ｐ＜０．０１、図１８Ｃ）。

ＡＰＡＣ２前処置により、３０分の両腎動脈クランピングモデルにおいて、損傷関連自然免疫リガンドヒアルロナン発現および炎症性細胞浸潤が減少した。右の腎臓は、再灌流後３日で除去した。尿細管間質性傷害マーカーＫｉｍ−１の密度により、媒体処置のラット腎臓と比較してＡＰＡＣ２ ３２μｇ前処置のラット腎臓において、傷害免疫反応性尿細管の数が有意に減少したことが示された（^＊Ｐ＜０．０５、図１９Ｂ）。ＩＲＩは、自然免疫リガンドヒアルロナン（ＨＡ）の腎皮質への蓄積を誘発するので、本発明者らは、ＩＲＩ後のＨＡタンパク質発現に対するＡＰＡＣ２前処置の効果を分析した。３０分の温虚血および３日間の再灌流を受けた腎臓では、ＡＰＡＣ２ ３２μｇ前処置は、媒体処置腎臓と比較した場合、ＨＡ免疫反応性領域を有意に減少させた（^＊Ｐ＜０．０５、図１９Ａ）。

尿細管の拡張、上皮壊死、扁平化および円柱の分析を含む尿細管損傷の半定量評価によって、３日目に、媒体処置腎臓において重度の尿細管傷害が明らかになった（図１９）。ＡＰＡＣ２ １６および３２μｇ前処置は両方、全体の尿細管傷害スコアを低減させ、単離された尿細管の断面において、軽度の尿細管拡張および上皮の扁平化のみが観察された（^＊Ｐ＜０．０５、図１９）。

ＡＰＡＣ前処置によって、１時間両腎動脈クランピングモデルにおいて、急性腎傷害が予防される。

最後に、本発明者らは、重度のほぼ不可逆的なＩＲＩモデルにおいて、ＡＰＡＣ（バッチ２．１、１１ヘパリン鎖）前処置の効果を研究した。両腎動脈を１時間クランピングした。ＳＤラットは、温虚血の誘導の１０分前に生理食塩水媒体（静脈内）または３２μｇ（静脈内）のいずれかを受けた。ラットの生存は、媒体処置で７５％（８匹中６匹）およびＡＰＡＣ２ ３２μｇ群で１００％（８匹中８匹）であった（^＊Ｐ＜０．０５、図２０Ａ）

次に、本発明者らは、血清クレアチニンおよび尿素窒素測定を用いて腎機能を分析した。ＡＰＡＣ２前処置によって、媒体処置腎臓と比較した場合、血清クレアチニンおよび尿素窒素レベルが低減した（赤色破線、^＊＊Ｐ＜０．０１および^＊＊＊Ｐ＜０．００１、図２０Ｂ＆Ｃ）。

アンチトロンビン欠乏血漿におけるトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間
ＡＰＡＣ１（バッチ５．１、４Ｈｅｐ鎖）およびＡＰＡＣ２（バッチ５．２、８Ｈｅｐ鎖）の存在下で、ＡＴ欠乏血漿におけるＴＴおよびＡＰＴＴ測定の例が、図２１および２２にそれぞれ示されている。ヘパリン濃度は、標準物質としてヘパリン出発物質を用いて決定する。

図２１
１μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ１（バッチ５．１、４Ｈｅｐ鎖）は、ＴＴを少なくともベースラインの２倍延長させ、２μｇ／ｍＬでは、ＴＴは、測定した最大時間に到達した（２５０秒）。２μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ２（バッチ５．２、８Ｈｅｐ鎖）は、ＴＴをベースラインの４．６倍延長させた（図２１）。

図２２
４μｇ／ｍＬでは、全てのＡＰＡＣ１（バッチ５．１、４Ｈｅｐ鎖）は、ＡＰＴＴをベースラインの１．４倍、５μｇ／ｍＬでは、１．７倍延長させた。４μｇ／ｍＬでは、ＡＰＡＣ２（バッチ５．２、８Ｈｅｐ鎖）は、ＡＰＴＴをベースラインの１．９倍延長させた（図２２）。４μｇ／ｍＬでは、ＵＦＨは、ＡＰＴＴをベースラインの１．５倍延長させた。

Ｈｅｐのコンジュゲーションレベル（ＣＬ）と抗凝固効果および抗血小板効果との関連についての結論
全てのバリアントは、抗凝固および抗血小板（コラーゲン誘発凝集および血小板プロコアグラント活性）の二重作用を発現する。

ＣＬ６〜１６：１を有するＡＰＡＣは以下の抗凝固特性を共有する：
（Ｂｌｙｓｃａｎ ＧＡＧ標準物質で評価されたヘパリン濃度）
・ 臨床用量（約３μｇ／ｍＬ）でＵＦＨと類似したＡＰＴＴの延長
・ 高臨床用量（約６〜８μｇ／ｍＬ）でＵＦＨより有効なＡＰＴＴの延長
・ Ｈｅｐ ＣＬ６：１を有するＡＰＡＣは、特により高濃度で、ＣＬ≧８：１を有するＡＰＡＣより強力な抗凝固剤と思われる。
・ トロンビン生成は、ＣＡＴにおいて遅延し、ＰＰＰおよびＰＲＰの両方において、少なくともＵＦＨと同等の有効性のＡＰＴＴ延長（１．０μｇ／ｍＬ）に必要とされるより低い濃度で減少した。
・ ＣＬ≧８：１を有するＡＰＡＣは、ＰＲＰにおいて、より低いＣＬを有する種よりもトロンビン生成の阻害においてより強力であると思われる

ＡＰＡＣは、抗血小板特性を有する：
・ クエン酸ＰＲＰにおいて、速度およびコラーゲンによって誘発される最大血小板凝集を低減させるが、ＵＦＨは低減させない
・ ＣＬ（８〜１６：１）を有するＡＰＡＣは、一様に、ＣＬ４〜６：１を有する分子よりコラーゲン誘発血小板凝集のより強力な阻害剤である

以下を有するＡＰＡＣ、すなわち
ＣＬ≦６：１を有するＡＰＡＣは、ＣＬ≧８を有するＡＰＡＣよりＴＴを延長させる
ＣＬ≦６：１を有するＡＰＡＣは、ＣＬ≧８を有するＡＰＡＣよりＡＰＴＴを延長させる
ＣＬ≧８：１を有するＡＰＡＣは、ＣＡＴにおいて、特にＰＲＰにおいて、ＣＬ４〜６：１を有するＡＰＡＣよりトロンビン生成を阻害する
ＣＬ≧８：１を有するＡＰＡＣは、ＣＬ４〜６：１を有するＡＰＡＣよりコラーゲン誘発ＰＲＰ凝集を阻害する

全体として、血小板凝集および血小板プロコアグラント活性の両方の阻害は、ＨＳＡにコンジュゲートする多数のヘパリン鎖からの利益を受けている。

Claims (7)

1. 抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子の製造のための方法であって、
   ｉ）未分画ヘパリン（Ｈｅｐ）鎖を改変してスルフヒドリル（−ＳＨ）基を有する反応体生成物を生成するステップと、
   ｉｉ）ヒト血漿タンパク質を改変してピリジルジチオール（−ＰＤＰ）基を有する反応体生成物を生成するステップと
   ｉｉｉ）ヘテロ二機能性架橋剤を使用して、ｉ）の反応体生成物をｉｉ）の反応体生成物と連結させるステップと
   を含む方法。
2. リンカーが、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）リンカーである、請求項１に記載の方法。
3. 抗血小板および抗凝固（ＡＰＡＣ）活性の両方を有する抗血栓性分子の製造のための方法であって、
   ｉ）未分画ヘパリン（Ｈｅｐ）鎖を改変してＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（−ＮＨＳ）基を有する反応体生成物を生成するステップと、
   ｉｉ）ホモ二機能性架橋剤を使用して、ｉ）の反応体生成物を、第一級アミンを含有する血清アルブミンなどのヒト血漿タンパク質と連結させるステップと
   を含む方法。
4. リンカーが、３，３’−ジチオジプロピオン酸ジ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＴＳＰ）リンカーである、請求項３に記載の方法。
5. 前記抗血栓性分子が、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）または限外濾過／血液透析濾過によって精製される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記血漿タンパク質が、アルブミン、グロブリン、フィブリノーゲン、血清アルブミンおよびアルファ２−マクログロブリンを含むまたはこれらからなる群から選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記血漿タンパク質が、血清アルブミンまたはアルファ２−マクログロブリンである、請求項６に記載の方法。