KR102469621B1 - 혈장 단백질에 접합된 헤파린을 포함하는 치료용 apac 분자 - Google Patents

혈장 단백질에 접합된 헤파린을 포함하는 치료용 apac 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항 혈소판 및 항응고제 (APAC) 활성을 갖는 항 혈전증 분자; 이의 의약제제로서의 사용; 항응고제 및 혈소판 억제제로서의 이의 선택적 구성 및 용도, 또는 주로 항응고제 또는 혈소판 억제제로서의 이의 선택적 구성 및 용도, 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

Description

혈장 단백질에 접합된 헤파린을 포함하는 치료용 APAC 분자{Therapeutic APAC Molecule comprising Heparin Conjugated to a Plasma Protein}
본 발명은 항혈소판 및 항응고제 (APAC) 활성을 갖는 항혈전증 분자; 이의 의약품으로서의 사용; 항응고제 및 혈소판 억제제로서의 이의 선택적 구성 및 용도, 또는 주로 항응고제 또는 혈소판 억제제로서의 이의 선택적 구성 및 용도; 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 의료 및 수의학 산업 모두에서 사용된다.
순환하는 혈액이 액체에서 겔과 같은 매트릭스로 변하는 혈액 응고(coagulation)의 생리학적 과정은 복잡하며, 순차적으로 진행되는 여러 생화학 반응을 수반한다.
응고의 생리학적 과정은 혈관 손상-특이적 활성화, 부착 및 혈소판의 응집을 수반하여 일차적인 플러그 또는 봉합을 만들고, 이어서 피브린의 침전 및 성숙에 의해 안정한 혈전을 생성한다. 전자의 혈소판 활성은 혈소판 억제제에 의해 억제될 수 있으며, 후자의 피브린 침전은 항응고제에 의해 억제될 수 있다.
응고 과정은 혈관 내피층 및/또는 심층을 손상시키는 혈관 손상 거의 직후에 시작된다. 혈액이 내피 아래의 공간에 노출되면 두 개의 과정이 시작된다: 혈소판 변화 및 내피하 조직 인자가 혈장 응고 인자 Ⅶ에 노출되는 것이 그것인데, 이는 다른 응고 인자들 중에서도 트롬빈 생성 및 피브린 형성에 크게 기여한다.
내피가 손상되면 하부 콜라겐이 순환하는 혈소판에 노출되고, 혈소판은 콜라겐-특이적인 당 단백질 표면 수용체를 통해 콜라겐에 직접 결합한다. 간접적으로, 폰빌레브란트인자(von Willebrand factor)는 혈소판을 콜라겐과 밀착시키고 혈소판을 콜라겐과 연결시킨다. 혈소판의 세포 외 기질 국소화는 전달증폭작용(signaling cascade)을 유발하는 혈소판 당 단백질 Ⅵ과 콜라겐의 상호 작용을 촉진하고 이로 인해 혈소판 인테그린(integrin)의 활성화가 초래되어 손상 부위에 혈소판이 부착되게 한다. 그 결과 손상 부위에 즉시 혈소판으로 형성된 플러그가 생기고, 이를 1차 지혈이라고 한다.
동시에 2차 지혈도 일어나며 소위 '혈액응고 연쇄반응(coagulation cascade)'을 수반한다. 제 Ⅶ 인자(Factor Ⅶ) 이외에 추가적인 혈액응고 인자(coagulation factors) 또는 응고 인자(clotting factors)는 복잡한 연쇄반응에서 반응하여 피브리노겐의 효소적 분해를 초래하고 이는 혈소판 플러그를 강화시키는 피브린 가닥을 형성한다. 혈액응고 연쇄반응은 일련의 단계로 구성되어 있는데, 이 단계에서는 프로테아제(protease)가 지모겐(zymogen)을 절단하고 곧이어 활성화시켜 지모겐이 다음 단계에서의 프로테아제로 작용한다. 이러한 반응의 결론은 활성화된 혈소판 표면상에서 용성 단백질인 피브리노겐을 불용성인 피브린 가닥으로 전환시키는 것이다. 혈소판 수축와 함께, 피브린 가닥은 안정한 혈전을 형성한다. 필수적인 폰빌레브란트인자와 피브리노겐은 혈장뿐 아니라 혈소판에 의해서도 제공된다.
혈액응고 연쇄반응은 관행에 따라 (그리고 다소 인위적으로) 3가지 경로로 나뉜다; 첫째는 조직 인자이고 둘째는 접촉 활성화 경로인데, 두 경로 모두 인자 X (factor X)의 세 번째 "최종 공통 경로(final common pathway)"와 피브린 형성을 유도하는 트롬빈을 활성화시킨다. 조직 인자 경로의 주요 역할은 "트롬빈 버스트(thrombin burst)"를 생성하는 것인데, 이는 피드백 활성화(feedback activation) 역할 면에서 혈액응고 연쇄반응에서 가장 중요한 구성요소인 트롬빈을 매우 빠르게 형성하는 과정이다. 흥미롭게도, 트롬빈은 혈액응고 연쇄반응에 의해 생성되는 동안 가장 강력한 혈소판 활성화제이므로 혈소판 활성화와 응고 사이의 연결고리이며, 따라서 이 분자를 표적으로 할 수 있는 치료제는 매우 효과적인 항혈전제라고 할 수 있다.
혈액응고 연쇄반응은 혈관 손상 후 심각한 실혈이나 출혈을 예방하기 위한 정상적인 생리적 과정이다. 결국, 섬유소용해(fibrinolysis)라는 과정에 의해 혈전(blood clots)이 재구성되고 재흡수된다. 이 과정에 관여하는 주효소(플라스민, plasmin)는 다양한 활성화제와 억제제에 의해 조절된다. 나아가, 응고계(coagulation system)는 면역계 및 보체계와 중첩되어 혈전에 침입하는 미생물들을 물리적으로 포획하고, 혈관 투과성을 증가시키고 식세포에 주화성인자(chemotactic agent)를 제공한다. 또한, 응고계의 일부 생성물은 직접적인 항균제이다.
그러나, 필요한 경우가 아닌데도 혈전(혈병이라고도 함)이 형성될 때가 있다. 예를 들어, 급성 의학 질환, 장기적으로 움직일 수 없는 상태, 수술 또는 암과 같은 고 위험 상태는 혈전을 생성할 위험을 증가시킬 수 있다. 또한, 응고 과정과 관련한 생리적 문제는 출혈, 혈전증 및 때때로 둘 다에 취약하게 만들 수 있으며, 이는 죽상경화성 심장혈관병(atherosclerotic cardiovascular disease) 및/또는 심장 부정맥과 관련하여 유의한 결과를 나타낼 수 있다.
항혈소판제 및 항응고제는 응고장애 치료에 사용된다. 항혈소판제는 아스피린(aspirin), 디피리다몰(dipyridamole), 티클로피딘(ticlopidine), 클로피도그렐(clopidogrel), 티카그렐로(ticagrelor) 및 프라수그렐(prasugrel)을 포함한다; 비경구 당단백질 Ilb/Illa 억제제는 관상동맥중재술(혈관 성형술 및 스텐트 삽입) 중에 사용된다. 항응고제 중에서, 와파린(및 관련된 쿠마린)과 헤파린이 가장 일반적으로 사용되지만 직접적인 경구 항응고제에는 트롬빈억제제인 다비가트란(dabigatran)과 리바록사반(rivaroxaban), 아피사반(apixaban) 및 에독사반(edoxaban)과 같은 활성화된 인자 X의 억제제가 포함된다.
안티트롬빈(Antithrombin, AT)은 세린 프로테아제 억제제이며 응고 프로테아제의 주요 혈장 억제제 중 하나이다. AT는, 예컨대 트롬빈(IIa 인자) 및 활성화된 인자 X(인자 Xa)를 억제함으로써 혈액응고 연쇄반응을 차단/조절한다. AT와 이들 인자들의 상호 작용은, 특정한 오당류 시퀀스(penta-saccharide sequence)를 통해 AT에 결합함으로써 혈액응고 과정을 억제하는 헤파린 (비분획 헤파린; UFH) 및 저분자량 헤파린 (LMWH; 분획화 된 헤파린)의 존재에 의해 증가된다. 이 결합은 AT의 구조적 변화를 유도하여 IIa, Xa 인자 및 혈액 응고와 관련된 다른 프로테아제의 억제를 촉진시킨다. 일단 해리되면, 헤파린 및 LMWH는 다른 AT 분자에 자유롭게 결합하고 이어서 더 많은 트롬빈 및 인자 Xa를 억제한다.
AT 이외에도 다른 자연적으로 발생하는 항응고제들이 있는데, 단백질 C와 S, 조직 인자 경로 억제제 및 헤파린 보조 인자 Ⅱ가 중요한 역할을 한다. 이 분자들의 활성 역시 헤파린에 의해서 강화된다.
주로, 일반적인 헤파린 제제들은 혈전증의 전신 치료(systemic treatment)에 사용된다. 이들은 혈액응고 활성이 우세하게 나타나는 정맥 혈전과 같이, 혈소판이 부족한 혈전에서 가장 효과적이다. 임상적으로 사용되는 일반 헤파린은, 혈전증의 추가 성장을 차단하여 혈전증의 전신적 치료에도 효과적이지만, 일반 헤파린 단독으로는 죽상반의 내인성 파열, 외인성 혈관성형술 또는 혈관 또는 미세혈관 수술과 관련된 혈소판성 혈전증 합병증을 방지하기에 충분하지 않다.
(방향성) 동맥절제술 및 말초 또는 폐동맥 혈전내막제거술뿐만 아니라, 삽입 또는 미삽입의 혈관성형술 [PT(C)A=경피경관혈관(관상동맥)성형술(percutaneous transluminal (coronary) angioplasty)] 및 혈관 또는 미세혈관 수술과 같은 동맥중재술은 심혈관질환 치료법의 증가 양상을 그대로 보여준다. 따라서, 내인성 혈관 또는 미세 혈관 손상 및/또는 동정맥루의 삽입 및 유지와 같은 외인성 중재술과 관련하여 발생하는 혈소판성 동맥혈전증은 빈번히 부딪히는 문제이며, 이러한 상황에서 전통적인 혈전증의 전신적 항응고 치료는 보통 효능이 제한적이다.
동맥 중재술와 관련된 현재의 전신적 항응고 치료는 UFH(평균 15kDa) 또는 LMWH(평균 7.5kDa)와 같은 항응고제와 아세틸 살리실산(cyclooxygenase inhibitor), 클로피도그렐, 또는 다른 ADP 길항제와 같은 항혈소판제의 조합을 포함한다. 다른 개발품은 강력한 혈소판 당단백질 Ilb/Illa, 폰빌레브란트인자 및 압식시맙(abciximab), 티로피반(tirofiban) 및 엡티피바타이드(eptifibatide)와 같은 피브리노겐(fibrinogen) 수용체 길항제로도 나타난다. 이러한 비교적 새로운 정맥 내 투여 병용 치료법은 중재적으로 치료된 혈전성 혈관에 있어서 급성 혈전성 폐쇄의 30-35%를 예방하는데 성공했다. 혈액 제제의 주입을 필요로 하는 초기 입원환자의 출혈 위험(대출혈)은 약 6-7%이며, 강력한 혈소판 ADP 수용체 차단제를 사용하면 첫 달 동안 외래 환자에서 대출혈이 12-15%까지 증가한다. 추적 관찰한 첫 1개월 동안 자발적 출혈의 경우 사망 위험성은 15-30배가 된다.
유감스럽게도, 비분획 헤파린을 이용한 전신 치료는 예측 불가능한 생체 이용률, 짧은 반감기, 항트롬빈/AT 기능 손상을 유도하는 단백질에 대한 비특이적 결합 및 혈소판 인자 4(PF4)와 함께 혈소판 감소증 및 혈전증을 일으키는 면역원성 효과와 같은 단점을 가진다. 이러한 불필요한 효과는 저분자량 분획 헤파린의 사용으로 완화되었으나, 유감스럽게도 이 또한 피브린에 결합된 트롬빈 및 혈소판에 결합된 인자 Xa에 대한 제한된 효과, 그리고 혈소판-분비 PF4에 의한 헤파린 활성의 부분적 중화에 기인하여 동맥혈전증에 대한 효능이 제한되어 있다. 따라서, 혈관 또는 미세혈관 손상 및 중재와 관련된 혈전증을 예방 및/또는 치료하기 위한 효과적이고 신뢰할 수 있고 안전한 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
본 발명자들은 포유동물 비만 세포로부터 얻을 수 있는 큰 사슬의(75±25 KDa) 천연 헤파린 프로테오글리칸(HEP-PG)을 포함하는 합성 분자가 단백질 중심에 결합될 때 강력한 항혈전 특성을 발현하고, 이는 혈소판이 콜라겐에 접착됨에 따라 야기되는 혈소판 활성화의 강력한 억제를 통해 혈소판-콜라겐 상호작용을 저해하는 능력에 기초한 것임을 이미 발견한 바 있다 (WO9926983). 따라서, 이 분자는 항 혈소판 치료제로서 효과적이며 국소 적용에 가장 적합하고 전신 항혈소판 약물과 조합되어 사용되기에 적합하다. 유리하게는, 이 분자는 적어도 국소 투여될 때 정상적인 지혈 반응을 보장하는 전신 혈소판 기능을 보존한다.
다른 연구자들은(미국특허 5,529,986) 폴리리신(polylysine)과 같은 직쇄 폴리아마이드에 비분획 헤파린 사슬(약 20-100 사슬)의 부착을 포함하는 합성 항혈전증 분자를 만들었다. 이 분자는 안티트롬빈에 결합하여 그의 활성을 증가시킨다는 점에서 상기 WO9926983에 기재된 것과는 상이한 작용 메커니즘을 갖는다. 따라서, 이 분자는 항응고제로서 효과적이다.
현재 진행중인 연구를 통해 헤파린을 사용하여 합성 항혈전증 분자의 추가적인 종류를 개발한 바 있다. 그러나, 놀랍게도 우리의 새로운 종류의 분자는 항혈소판 활성 및 항응고제 활성을 모두 유리하게 갖는다는 것을 발견했다. 우리가 아는 한, 이러한 이중 분자가 확인된 것은 이번이 처음이다. 더욱이, 본 발명자들은 새로운 종류의 분자의 대개 또는 대부분 항혈소판 또는 항응고제 형태로 작용하는 경향이, 각 분자에 부착된 또는 분자 내에 포함된 헤파린의 양에 따라서 조작/설계될 수 있다는 것을 발견했다. 마지막으로, 본 발명자들은 새로운 종류의 분자는 유리하게도 국부 작용을 가지고 있으므로 전신 효과에 대한 염려 없이 타겟 방식으로 사용될 수 있음을 또한 발견했다.
도 1은 혼합혈장에서, 헤파린(Hep)이 1.0 및 1.75㎍/㎖의 2가지 농도[C]로 존재하는 경우, 1세대 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains), 2세대 APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains) 및 3세대 APAC-CL6 내지 16(batch 3.1; 3.2; 3.3; 3.4; 3.5 및 3.6, 8; 8; 10; 13; 16이고 각각 6 Hep chains)의 트롬빈 시간(TT)에 대한 효과를 나타낸 도이다. TT 기준치는 28초이다.
도 2는 혼합혈장에서, 헤파린(Hep)이 0.75; 1.0 및 1.75㎍/㎖의 3 내지 5가지 농도[C]로 존재하는 경우, 4세대 APAC1(batch 4.1, 4 Hep chains)과 APAC2(batch 4.2, 8 Hep chains)의 트롬빈 시간(TT)을 나타낸 도이다. TT 기준치는 31초이다.
도 3은 혼합혈장에서, 헤파린(Hep)이 1; 2; 3; 6; 및 8㎍/㎖의 5가지 농도[C]로 존재하는 경우, 1세대 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains), 2세대 APAC2 (batch 2.1, 11 Hep chains) 및 3세대 APAC-CL8 내지 16(batches 3.1; 3.2; 3.3; 3.4 및 3.5이고 각각 8, 8, 10, 13 및 16 Hep chains)의 활성화된 부분트롬보플라스틴 시간(activated partial thromboplastin time, APTT)를 나타낸 도이다. APTT 기준치는 30초이다.
도 4는 APTT의 연장(1 내지 10배)에 있어서 5가지 서로 다른 헤파린 농도에서의 APAC의 헤파린 접합 레벨을 비교한 도이다. 혼합혈장에서, 헤파린(Hep) 농도[C] 1; 2; 3; 6; 및 8㎍/㎖의 경우, APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains), APAC-CL8 (batches 3.1 and 3.2, 8 Hep chains), APAC-CL10 (batch 3.3, 10 Hep chains), APAC2 (batch 2.1, 11 Hep chains), APAC-CL13 (batch 3.4, 13 Hep chains), APAC-CL16 (batch 3.5, 16 Hep chains)의 APTT 결과를 나타내었다. APTT 기준치는 30초이다.
도 5는 혼합혈장에서, 헤파린(Hep)이 1; 2; 3; 6 및 8㎍/㎖의 5가지 농도[C]로 존재하는 경우, 4세대 APAC1(batch 4.1, 4 Hep chains)과 APAC2(batch 4.2, 8 Hep chains)의 APTT를 나타내었다. APTT 기준치는 30초이다.
도 6은 5pM 조직 인자(TF) 및 4μM 인지질(PPL)이 보충된 혼합혈장(pooled plasma, PP)의 UFH 및 인산완충생리식염수(PBS)와 비교하여, 1세대 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains), 2세대 APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains)의 A) 0.25㎍/㎖ 및 B) 0.5㎍/㎖ 존재 하 지연된 트롬빈 생성을 보정된 자동화 트롬보그램을 통해 나타낸 도이다.
도 7은 5pM 조직 인자(TF) 및 4μM 인지질(PPL)이 보충된 혼합혈장(pooled plasma, PP)의 UFH 및 인산완충생리식염수(PBS)와 비교하여, 1세대 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains), 2세대 APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains)의 A) 1.0㎍/㎖ 및 B) 1.5㎍/㎖ 존재 하 지연된 트롬빈 생성을 보정된 자동화 트롬보그램을 통해 나타낸 도이다.
도 8은 5M 조직 인자(TF) 및 4μM 인지질(PPL)이 보충된 혼합혈장(pooled plasma, PP)에서, 3세대 APAC-CL6 내지 16(8, 8, 10, 13, 16 및 6 Hep chains)의 A) 0.25㎍/㎖ 및 B) 0.5㎍/㎖와, PBS 존재 하 트롬빈 생성을 보정된 자동화 트롬보그램을 통해 나타낸 도이다. APAC-CL8 (batch 3.1, 3.2, 8 Hep chains), APAC-CL10 (batch 3.3, 10 Hep chains), APAC-CL13 (batch 3.4, 13 Hep chains), APAC-CL16 (batch 3.5, 16 Hep chains) 및 APAC-CL6 (batch 3.6, 6 Hep chains).
도 9는 5M 조직 인자(TF) 및 4μM 인지질(PPL)이 보충된 혼합혈장(pooled plasma, PP)에서, APAC-CL6 내지 16(8, 8, 10, 13, 16 및 6 Hep chains)의 A) 1.0㎍/㎖ 및 B) 1.5㎍/㎖와, PBS 존재 하 트롬빈 생성을 보정된 자동화 트롬보그램을 통해 나타낸 도이다. APAC-CL8 (batch 3.1, 3.2, 8 Hep chains), APAC-CL10 (batch 3.3, 10 Hep chains), APAC-CL13 (batch 3.4, 13 Hep chains), APAC-CL16 (batch 3.5, 16 Hep chains) 및 APAC-CL6 (batch 3.6, 6 Hep chains).
도 10은 1pM 조직 인자(TF) 및 PPL 제공 혈소판이 보충된 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma, PRP)에서, UFH 0.25; 0.5; 1.0; 및 1.5㎍/㎖ 존재 하 트롬빈 생성을 보정된 자동화 트롬보그램을 통해 나타낸 도이다.
도 11은 1pM 조직 인자(TF) 및 PPL 제공 혈소판이 보충된 PRP(기증자가 고 반응자)에서, APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains), APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains) A) 0.25㎍/㎖ 및 B) 0.5㎍/㎖ 및 UFH 존재 하 트롬빈 생성을 보정된 자동화 트롬보그램을 통해 나타낸 도이다.
도 12는 1pM 조직 인자(TF) 및 PPL 제공 혈소판이 보충된 PRP(기증자가 중 반응자)에서, APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains), APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains) A) 0.25㎍/㎖, B) 0.5㎍/㎖ 및 C) 1.0㎍/㎖ 존재 하 트롬빈 생성을 보정된 자동화 트롬보그램을 통해 나타낸 도이다.
도 13은 PRP에서, 3세대 APAC들, APAC-CL6 내지 16(8, 8, 10, 13, 16 및 6 Hep chains) 존재 하 콜라겐-유발 응집을 나타낸 도이다. Hep농도[C] A) 1, B) 10 및 C) 30㎍/㎖일 때 APAC에 대한 저반응자의 예를 제시하였다. 채널 1: APAC-CL8 (batch 3.1, 8 Hep chains), 채널 2: APAC-CL8 (batch 3.2, 8 Hep chains), 채널 3: APAC-CL10 (batch 3.3, 10 Hep chains), 채널 4: APAC-CL13 (batch 3.4, 13 Hep chains), 채널 5: APAC-CL16 (batch 3.5, 16 Hep chains), 채널 6: APAC-CL6 (batch 3.6, 6 Hep chains) 및 채널 7: APAC-CL10과 16의 혼합(10 Hep chains 및 16 Hep chains). 콜라겐 농도[C]는 0.5㎍/㎖ 였다.
도 14는 APAC들에 대한 대표적인 고(빈 원) 및 중(빈 사각형) 반응자를 이용하여, PRP에서 헤파린 농도 3; 10; 30; 60 및 90㎍/㎖인 APAC1 (batch 1.1, 4 hep chains) 존재 하 콜라겐-유발 최대 혈소판 응집의 억제를 나타낸 도이다. 또한, UFH(검은 삼각형)가 있을 때, 기증자에서의 평균 혈소판 응집 억제도 나타내었다. Vehicle(PBS)에 대한 최대 혈소판 응집 억제를 백분율(%)로 표시하였다.
도 15는 개코원숭이 급성 혈전증 모델의 modified Folt's model에서, UFH와 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains) (모두 4㎍/㎖; 총 2㎎)의 손상 부위에 대한 국소 적용 이후의 혈액 순환 감소(cyclic flow reduction, CFR) 차트를 나타낸 도이다. 기준치의 혈류가 회복된 직후, 동맥을 100㎖/min의 유속으로 협착시켰다(30%). UFH(검은색 삼각형) 처리한 손상 부위에서 반복적인 폐색(25분 동안 5번의 CFR)이 관찰되었다. 다시 협착(20-50분 경) 시행 및 협착 증가(180분 경) 전에 상기 처리된 손상 부위는 인산완충생리식염수(PBS)로 세척되었다.
대조적으로, APAC 처리(빈 원)한 경우 손상 부위는 전체 실험 기간 동안 개방되어있었다: 처음에는 동맥 혈류 100㎖/분(빈 원)으로 120분 동안, 두 번째는 조여진 협착(60%)에서 동맥혈류 50㎖/분(검은 십자가)으로 14분 동안, 마지막으로 심한 협착(90%)에서 혈류 30㎖/분(검은 별)으로 10분 및 15분 동안 순차적으로 유지되었다.
도 16은 개코원숭이 모델(n=4)의 흐르는 혈액에서의 콜라겐-유발 혈전 형성에 대한 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains) 및 UFH (둘 다 4㎎/㎖)의 비교를 나타낸 도이다. 이하 부위에 대하여 감소된 혈소판 침전이 관찰되었다: A) 적용 부위의 콜라겐 표면에서, UFH(p=0.01)와 비교하여, APAC1 존재 하 혈소판 침전이 34±13%(평균 및 SD, n=4)로 감소 B) 콜라겐 단편에서 말단으로 10cm 떨어진 혈전에서, UFH(p=0.19)와 비교하여, APAC1 존재 하 혈소판 침전이 63±11%(평균 및 SD, n=4)로 감소. 피브린 형성 또한 아무 처리도 되지 않은 대조군과 비교하여 APAC1에 의해 45±14%(평균 및 SD, n=4)(p=0.01)로 감소하였고, 이는 혈소판 및 응고 억제의 이중작용과 양립한다.
도 17은 랫트 혈장에서 APAC와 UFH의 즉각적인 항응고제 작용을 나타낸 도이다. 허혈 재관류 손상 또는 급성 신장 손상을 알아보기 위해 16, 32 또는 80㎍로 사용된 APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains)는 APTT 분석을 사용하여 측정했을 때 효과적인 항응고제였다. 이와의 비교로서, 비분획 헤파린(UFH, 검은 점선)을 16, 32 또는 80㎍의 동일 농도 범위로 사용하였다. 상기 2가지 치료법은 16㎍에서 비교적 동등하게 수행되었지만, 32㎍에서는 UFH가 APAC2보다 APTT를 미세하게 더욱 연장시켰음을 볼 수 있고, 반면, 80㎍에서는 UFH가 APAC2(검은 선)보다 APTT를 훨씬 더 연장시켰다.
16㎍(0.06㎎/㎏), 32㎍(0.13㎎/㎏) 및 80㎍(0.32㎎/㎏) 용량의 APAC2 또는 UFH 정맥주사 투여 10분 후의 APTT 평균±SD (n=5-8/그룹. ***P<0.001). 16㎍ 용량에서, APTT는 APAC의 경우 18.0±6.6 (n=7)이었고 UFH의 경우 27±6.2 (n=4)였다. 32㎍ 용량에서, APTT는 APAC의 경우 17.4±4.0 (n=10)이었고 UFH의 경우 25.2±2.0 (n=5)이었다. 80㎍ 용량에서, APTT는 42.2±18 (n=8)이었고, UFH의 경우 72-180> (n=5)이었다. 빨간색 점선은 APTT 참고 기준치이다. 헤파린 투여량은 Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan assay에서 UFH를 표준 물질로 사용하여 결정하였다.
도 18은 양측 신장 허혈 재관류 손상 30분 후 신장 기능 및 요세사이질 손상(tubulointerinterstitial injury)을 나타낸 도이다. 확립된 마커를 사용하여 분석했을 때, APAC2 (batch 2.1, 11 Hep chains) 16 또는 32㎍의 신장 기능에 대한 효과는 saline vehicle 대조군(i.v.)과만 비교되었다. 30분의 원상회복이 가능한 허혈 재관류 손상 후, 신장 기능 마커인 크레아티닌, 요소(urea) 및 호중구 젤라티나제 관련 리포칼린(NGAL)가 3일간 분석되었고, 농도 32㎍의 APAC2가 매 시간 간격마다 각 마커의 레벨을 현저히 감소시켰다; 이는 32㎍에서 APAC2의 보호 역할을 암시한다.
신장 허혈 후 신장 기능 및 요세사이질 손상을 분석하기 위해, 재관류 후 3일 동안 매일 쥐 혈청을 채취하였다. APAC 16㎍(0.06㎎/㎏) 및 32㎍(0.13㎎/㎏)를 정맥주사로 전처리한 랫트에서, 요세사이질 손상의 바이오마커인 (A) 크레아티닌, (B) 요소 질소 및 (C) NGAL의 혈청 레벨. 랫트 대조군은 saline vehicle을 정맥주사하였다 (n=8/그룹. **P<0.01). 헤파린 투여량은 Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan assay에서 UFH를 표준 물질로 사용하여 결정하였다.
도 19는 30분의 양측 신장 허혈 재관류 손상 후 선천성 면역 활성화 및 조직병리를 나타낸 도이다. 30분의 원상회복이 가능한 손상 후 허혈 재관류 손상의 가시적인 효과는 saline vehicle(i.v.) 대조군과 비교하여 16 또는 32㎍ 모두에서 APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains)를 사용함으로써 개선되었다. 신장은 A) 선천성 면역 리간드 히알루론산(HA), B) tubulointerstitial injury의 바이오마커인 Kim-1을 통한 관 손상 및 C) 헤마톡실린과 에오신(Hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색을 통한 관 손상(편평화, 팽창, cast 및 괴사)에 대하여 조사되었다.
재관류 3일 후 선천성 면역 활성화 및 신장 손상 평가를 위해, APAC 16㎍(0.06㎎/㎏) 및 32㎍(0.13㎎/㎏)를 정맥주사로 전처리한 랫트에서. 파라핀 내장 신장 단면을 (A) 선천성 면역 리간드 히알루론산(HA), (B) 요세사이질 손상의 바이오마커인 Kim-1 및 (C) 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다. (A) 히알루론산에 양성인 영역을 컴퓨터 보조 영상으로 측정하였다. (C) C = 상피 casts; D = 관상 팽창; 화살촉 = 상피 편평화; 화살표 = 상피 괴사. 대조군 랫트에 saline vehicle을 정맥주사 하였다. IgG 대조군을 삽도에 나타내었다. (n=8/그룹. *P<0.05). 헤파린 투여량은 Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan assay에서 UFH를 표준 물질로 사용하여 결정하였다.
도 20은 1시간의 양측 신장 허혈 재관류 중증 손상 후 신장 기능 및 전반적인 생존률을 나타낸 도이다. 신장을 1시간 동안 두 개의 신동맥을 클램프로 고정 시켜서 중증 IRI화 하였다. 허혈성 신장 후의 생존 및 기능을 분석하기 위해, 재관류 3일 후 매일 쥐 혈청을 채취하였다. APAC(batch 2.1, 11 Hep chains) 32㎍ 처리로 조직이 생존하였고, APAC 32㎍(0.13㎎/㎏)를 정맥주사로 전처리한 랫트에서 (A) 3일의 감시 기간 동안의 랫트 생존률%, 나아가 (B) 크레아티닌 및 (C) 요소 질소의 혈청 레벨 역시 긍정적인 결과를 나타내었다; 쥐의 혈청 크레아티닌 및 요소가 감소했으며 이는 신장 기능의 유지를 시사한다. 대조군 랫트는 saline vehicle(i.v.) 처리되었다. n=8/그룹. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 헤파린 투여량은 GAG 분석에서 UFH를 표준 물질로 사용하여 결정하였다.
도 21은 안티트롬빈 결핍 혈장에서, Hep 농도[C] 1.0 및 2㎍/㎖인 5세대 APAC1(batch 5.1, 4 Hep chains) 및 Hep 농도[C] 2㎍/㎖인 APAC2(batch 5.2, 8 Hep chains) 존재 하 트롬빈 시간(TT)를 나타낸 도이다. 헤파린 투여량은 GAG 분석에서 UFH를 표준 물질로 사용하여 결정하였다.
도 22은 안티트롬빈 결핍 혈장에서, Hep 농도[C] 4 및 5㎍/㎖인 5세대 APAC1(batch 5.1, 4 Hep chains) 및 Hep 농도[C] 4㎍/㎖인 APAC2(batch 5.2, 8 Hep chains) 존재 하 활성화된 부분 트롬보플라스틴시간(APTT)를 나타낸 도이다. 헤파린 투여량은 GAG 분석에서 UFH를 표준 물질로 사용하여 결정하였다.
본 발명의 제 1 측면에 따르면, 각각 10 내지 21kDa의 분자량을 가지는 복수의 헤파린 사슬이 복수의 링커분자들을 통해 부착된 인간혈장단백질을 포함하고, 여기에서 상기 혈장단백질에 부착된 상기 헤파린 사슬의 개수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16을 포함하는 군으로부터 선택되는, 항혈소판 및 항응고제 (APAC) 활성을 모두 갖는 항혈전증 분자가 제공된다.
본문에서 참조되는 상기 혈장 단백질에 부착된 헤파린 사슬의 개수는 비색계 황산화 글리코사미노글리칸 분석법(colorimetric Sulphated glycosaminoglycan assay), 판독/결정될 수 있는 시료에 대한 검정곡선(calibration curve)을 제공하기 위해 지정된 농도에서 표준형 헤파린을 사용한 Blyscan Assay Kit (예를 들어, Biocolor Ltd., UK) 를 고려하여 결정된다. 따라서, 본 발명의 명세서에 언급된 헤파린 사슬의 수는 표 1의 제1열과 상관관계가 있다. 여기에 사용된 특정 분석법이 기재되어있다.
항혈소판(AP) 및 항응고제 (AC) 활성은 상기 분자가 항혈소판 활성이 필요한 경우 및/또는 항응고제 활성이 필요한 경우에 대응할 수 있도록 하므로 특이적이고 매우 유용하다. 항혈소판 활성이 필요한 경우는 곡선 혈관 또는 협착 혈관과 같은 협착 부위이고, 항응고제 활성이 필요한 경우는 말단부뿐만 아니라 근위부에서 와류 및 혈전 성장이 트롬빈에 의해 중재되는 경우이다.
유리한 이중 기능성 이외에, 본 발명자들은 본 발명의 분자들이 콜라겐 및 폰빌레브란트 인자를 포함하는 세포 외 기질에 대한 강한 결합능력을 가지며, 따라서 이들은 표적화된 국소 항혈전 작용을 한다는 것 또한 발견하였다. 이는 상기 분자들이 잠재적으로 출혈을 일으킬 수 있는 해로운 전신적 항혈전 효과가 있을 수 있다는 염려 없이 특정 상태를 치료하기 위해 특정 부위에서 사용될 수 있다는 것을 의미하는 매우 바람직한 특징이다. 이러한 유리한 표적화는 투여 방식에 상관없이 즉 국부적 또는 전신적으로 존재한다.
본문에서 참조되는 표적화된 항혈전 작용은 상당한 기간, 예를 들어 24시간보다 긴, 더욱 바람직하게는 48시간 또는 50시간보다 긴, 심지어 최대 120시간 동안 적용 부위에서 유지되는 것을 나타낸다. 특히, 적용 부위에서의 이러한 유지는 혈관 외측 및 내측에서 투여될 때 모두 발생한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 혈장 단백질은 알부민, 글로불린 또는 피브리노겐이며, 바람직하게는 혈청 알부민 또는 α2-고분자글로불린이고, 더욱 바람직하게는 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 인간 α2-고분자글로불린이다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 혈청 알부민은 간에 의해 생성되고 혈장에 용해되며 포유류에서 가장 풍부한 혈액 단백질이다. 혈청 알부민은 분자량이 약 66,000 Da인 구형의 수용성 단백질이다. 또한, α2-고분자글로불린(α2M과 A2M)은 큰 혈장 단백질이고, 실제로 혈장에서 가장 큰 주요 비 면역 글로블린 단백질이며 주로 간에서 생성된다는 것이 알려져 있다. α2-고분자글로불린은 항프로테아제 역할을 하며 다양한 단백질 분해 효소를 불활성화시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 혈장 단백질은 재조합체이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서 상기 헤파린은 비분획 헤파린이다. 더욱 바람직하게는, 상기 헤파린은 포유류 유래이고, 바람직하게는 사람이나 돼지유래이다. 혈장 단백질이 인간이고 헤파린이 돼지 또는 소인 경우, 상기 APAC 분자는 키메라 분자를 나타낸다.
바람직하게는, 상기 헤파린은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21KDa, 바람직하게는 15 또는 16 또는 17KDa를 포함하는 군으로부터 선택된 분자량을 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 헤파린은 재조합체이다.
본 발명의 더욱 바람직한 구현예에서, 상기 링커분자는 적어도 상기 혈장 단백질에 상기 헤파린의 연결이 완료된 경우, 한 분자의 헤파린과 결합하는 단일 연결 분자이며, 따라서 단일 링커 분자의 상기 혈장 단백질에 대한 접합의 결과로, 한 분자의 헤파린이 상기 혈장 단백질에 접합하게 된다. 따라서, 상기 헤파린에 대한 상기 링커의 화학량론은 1:1이다. 바람직하게는, 상기 링커는 아민 링커이고 따라서 상기 헤파린 및 혈장 단백질상의 아미노기와 결합하며, 바람직하게는, 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 링커는 헤파린 사슬 상의 세린(바람직하게는, 세린은 상기 헤파린 사슬의 말단 또는 말단 근처에 위치한다) 및 바람직하게는, 이에 제한되는 것은 아니나, 혈장단백질 상의 리신에 접합한다. 더욱 바람직하게는 상기 링커는 이황화물다리를 이용하여 상기 헤파린과 혈장 단백질을 접합한다. 더욱 바람직하게는, 상기 링커는 SPDP 링커와 같은 이질적양기능성 크로스링커(hetero-bi-functional cross-linker) 또는 DTSP 링커와 같은 동질적양기능성 크로스링커(homo-bi-functional cross-linker)이다.
SPDP (예를 들어, Sigma-Aldrich 또는 Thermo Scientific Pierce로부터 상업적으로 구입 가능)는 N-하이드록시석신이미드 (NHS) -에스터 및 피리딜다이싸이올 반응기를 통해 아민과 설프히드릴 접합에 사용되는 짧은 사슬 크로스링커이며, 시스테인 설프히드릴과 함께 절단될 수 있는 (환원 가능한) 이황화 결합을 형성한다. 이는 짧은 사슬 및 긴 사슬 모두에서 가능하다. 긴 사슬의 경우 설폰화된 형태에서 가능하며, 수용성이다. 본 발명자들은 3-(2-피리딜다이싸이오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터를 사용하는 것을 선호하였다. 모든 SPDP는 라이신 잔기와 반응하여 안정한 아마이드 결합을 형성하는 아민 반응성 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 에스터를 포함하지만, 상기 링커의 다른 쪽 끝에는 설프히드릴기와 반응하여 가역성 이황화 결합을 형성하는 피리딜 이황화기가 있다.
DTSP(3,3'-다이싸이오프로피온산 다이(N-하이드록시석신이미드 (NHS)-에스터))(3,3'-dithiopropionicacid di(N-hydroxysuccinimide(NHS)-ester))(예를 들어, Sigma-Aldrich 또는 Thermo Scientific Pierce로부터 상업적으로 구입 가능) 는 N-하이드록시석신이미드(NHS) 에스터기를 통해 아민과 아민 접합에 사용되는 짧은 사슬 크로스링커이다. 이는 짧은 사슬 및 긴 사슬 모두에서 가능하다. 긴 사슬의 경우 설폰화된 형태(N-하이드록시설포석신이미드(설포-NHS) 에스터)에서 가능하며, 수용성이다. DTSP는 두 개의 아민 반응성 N-하이드록시석신이미드 (NHS) 에스터를 포함하고 스페이서 암(spacer arm)에 이황화물다리를 포함한다. N-하이드록시석신이미드 에스터는 잔기를 포함하는 1차 아민과 반응하여 상기 링커 분자 내에 절단 가능한 이황화 결합을 가진 안정한 아마이드 결합을 형성한다.
따라서, 본 발명의 바람직한 합성 분자의 일반식은 다음과 같이 표시될 수 있다:
(Hep-링커)n-PIPr
상기 n은 4 내지 16;
PIPr은 혈장단백질, 예컨대 인간혈청알부민 또는 인간 α2-고분자글로불린; 및 각각의 헤파린(Hep) 사슬은 약 10 내지 21 KDa.
특히, 바람직하게 3-(2-피리딜다이싸이오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터(SPDP) 또는 3,3'-다이싸이오프로피온산 다이(N-하이드록시석신이미드 에스터)(DTSP) 링커를 이용하는 경우, 본 발명의 바람직한 합성 분자의 일반식은 다음과 같이 표시될 수 있다:
(Hep-NH-CO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CO-NH)n-PlPr
상기 n은 4 내지 16;
PIPr은 혈장단백질, 예컨대 인간혈청알부민 또는 인간 α2-고분자글로불린; 및 각각의 헤파린(Hep) 사슬은 약 10 내지 21 KDa.
알부민, 특히 HSA와 같은 각 혈장 단백질에 최대 36개의 헤파린 사슬을 부착할 수 있지만, 본 발명자들은 4 내지 16개의 헤파린 사슬을 각 혈장 단백질에 부착하는 것이 항혈소판 활성 및 항응고제 활성 모두의 바람직한 이중 기능성을 제공한다는 것을 발견하였다. 더욱이, 본원 데이터가 보여주는 바와 같이, 본 발명자들은 8개 이상의 헤파린 사슬, 바람직하게는 8 내지 16개의 헤파린 사슬의 각 혈장 단백질에의 부착이 대개 또는 대부분 바람직한 항혈소판 활성을 제공하는 반면, 6개 미만의 헤파린 사슬, 바람직하게는 4 내지 6개의 헤파린 사슬의 각 혈장 단백질에의 부착은 대개 또는 대부분 바람직한 항응고제 활성을 제공한다는 것 또한 발견하였다.
따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 APAC 분자는 상기 분자가 대개 또는 대부분 항응고제로 사용되는 경우에 상기 혈장 단백질에 부착된 6개 이하, 예를 들어 4 내지 6개의 헤파린 사슬을 가진다.
따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 APAC 분자는 상기 분자가 대개 또는 대부분 항혈소판/혈소판 억제제로 사용되는 경우에 상기 혈장 단백질에 부착된 8개 이상, 예를 들어 8 내지 16개의 헤파린 사슬을 가진다.
따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 APAC 분자는 상기 분자가 대개 또는 대부분 항혈소판/혈소판 억제제로 사용되는 경우에 상기 혈장 단백질에 부착된 8개의 헤파린 사슬을 가진다.
따라서, 본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 APAC 분자는 상기 분자가 대개 또는 대부분 항혈소판/혈소판 억제제로 사용되는 경우에 상기 혈장 단백질에 부착된 11개의 헤파린 사슬을 가진다.
따라서, 일정한 개수의 헤파린 사슬을 각각의 혈장 단백질 중심에 우선적으로 연결시키는 것이 합성 분자의 우세한 기능에 영향을 미칠 수 있다. 이 놀라운 특징은 우리의 분자(들)를 사용할 때 얻어지는 결과가 항혈전성이더라도, 항혈소판 활성에 중점을 둘 필요가 있는 경우 및 항응고제 활성에 추가적으로 중점을 둘 필요가 있기 때문에 기술적 용도가 있다. 예를 들어, 전단 속도가 상대적으로 낮은 정맥과 같은 혈관, 즉 더 큰 혈관 내강 및 낮은 혈류 속도를 갖는 혈관을 치료하는 경우, 항 응고에 우세하거나 중점을 둔 항혈전제가 매우 바람직하다. 반면, 동맥 또는 동정맥루와 같은 혈관, 예를 들어, 전단 속도가 비교적 높은, 즉 높은 혈류 속도와 좁은 혈관 내강을 가져 혈류량이 높은 혈관을 치료하는 경우, 항혈소판 작용이 우세하거나 강조되는 항혈전제가 매우 바람직하다. 유사하게, 풍선 혈관 형성술을 수행하는데 사용되는 카테터, 스텐트 또는 장치와 같은 임플란트가 사용되는 경우, 이들은 본 발명의 APAC 분자로 코팅될 수 있고, 사용된 APAC 분자의 유형은, 바람직하게는, 임플란트가 삽입될 혈관의 성질을 고려하여 결정될 것이다.
본 발명의 제 2 측면에 따르면, 복수개의 링커 분자들을 통해 각각 10 내지 21kDa의 분자량을 가진 복수개의 헤파린 사슬이 혈장 단백질에 부착되고, 상기 혈장 단백질에 부착된 상기 헤파린 사슬의 개수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈장 단백질을 포함하는 항혈소판 및 항응고제 활성을 모두 갖는 의약제제로 사용을 위한 항혈전증 분자가 제공된다.
본 발명의 제 3 측면에 따르면, 복수개의 링커 분자들을 통해 각각 10 내지 21kDa의 분자량을 가진 복수개의 헤파린 사슬이 혈장 단백질에 부착되고, 상기 혈장 단백질에 부착된 상기 헤파린 사슬의 개수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈장 단백질을 포함하는 항혈소판 및 항응고제 활성을 모두 갖는 항혈전제로 사용을 위한 분자가 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 항혈전제는 국소적으로 작용한다. 이것에 의해, 본 발명자들은 상기 항혈전제가 세포 외 기질에 결합하여, 이에 따라 적용 부위 또는 의도된 부위에서 연장된 국소작용을 가지면서 유지되는 것을 의도했다. 실제로, 이 국소 작용 활성은 본 발명의 상기 분자들이 그들을 필요로 하는 부위, 예를 들어 혈전증이 일어날 가능성이 있는 부위, 다시 말해서, 콜라겐 및 폰빌레브란트 인자가 동시에 존재하는/필수 구성요소인 세포외 기질을 효과적으로 표적화할 수 있는 것을 의미하므로 유용하다.
본 발명의 제 4 측면에 따르면, 복수개의 링커 분자들을 통해 각각 10 내지 21kDa의 분자량을 가진 복수개의 헤파린 사슬이 혈장 단백질에 부착되고, 상기 혈장 단백질에 부착된 상기 헤파린 사슬의 개수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈장 단백질을 포함하는 항혈소판 및 항응고제 활성을 모두 갖는 혈전증 또는 혈전증으로 의심되는 증상의 치료를 위한 의약제제의 제조방법에 사용되는 항혈전증 분자가 제공된다.
본문에서 참조되는 혈전증으로 의심되는 증상이란, 예를 들어 외과적 혈전절제술과 같은 외과 수술의 수행과 같이(이에 제한되지 않는다), 혈전증을 일으킬 수 있는 상황 또는 상태의 모든 경우를 나타낸다. 외과적 혈전절제술의 경우, 본 발명의 상기 분자들은 수술 부위에 투여되거나, 또는 외과 수술을 받은 혈관에 주입되거나, 또는 혈액 공급이 상기 수술 부위에 의해/그 수술 부위로 흐르는 인접한 하류 혈관으로 주입될 수 있다.
본 발명의 이런 측면에 있어서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 의약제제는 항혈전제이고, 바람직하게는 국소적으로 작용한다. 국소 작용이라고 함은, 상기 항혈전제가 세포 외기질에 결합하여, 이에 따라 적용 부위에서 연장된 국소활성을 가지면서 유지되는 것을 의미한다. 실제로, 이 국소 작용 활성은 본 발명의 상기 분자들이 그들을 필요로 하는 부위, 예를 들어 혈전증이 일어날 가능성이 있는 부위, 다시 말해서, 콜라겐 및 폰빌레브란트 인자가 동시에 존재하는/필수 구성요소인 세포 외 기질을 효과적으로 표적화하는 것을 의미하므로 유용하다.
본 발명의 전술한 측면에서, 바람직하게는, 상기 APAC 분자는 상기 링커를 통해 상기 혈장 단백질과 부착된 6개 이하, 예를 들어 4 내지 6개의 헤파린 사슬을 가지고, 상기 분자는 대개 또는 대부분 항응고제로 사용된다.
유사하게, 본 발명의 전술한 측면에서, 바람직하게는, 상기 APAC 분자는 상기 링커를 통해 상기 혈장 단백질과 부착된 8개 이상, 예를 들어 8 내지 16개의 헤파린 사슬을 가지고, 상기 분자는 대개 또는 대부분 항혈소판/혈소판 억제제로 사용된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 APAC 분자는 하기의 내용을 포함하는 혈전증 합병증의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다: 죽상반의 내인성 파열; 또는 재폐색 방지용 혈전용해 치료법; 또는 외인성 혈관성형술; 또는 혈관수술 또는 미세혈관 수술; 혈관성형술과 같은 동맥중재술로서 특히, 스텐트 삽입 또는 미삽입의 경피경관(관상동맥)혈관성형술; (방향성) 동맥절제술; 말초 또는 폐동맥 혈전내막제거술; 혈소판성 동맥혈전증; 혈관 또는 미세혈관 손상; 혈전성 혈소판 감소성 자반증 또는 동정맥루의 삽입 또는 유지와 같은 외인성 중재술 및 안티트롬빈(AT) 결핍증.
본 발명의 제 5 측면에 따르면, 복수개의 링커 분자들을 통해 각각 10 내지 21kDa의 분자량을 가진 복수개의 헤파린 사슬이 혈장 단백질에 부착되고, 상기 혈장 단백질에 부착된 상기 헤파린 사슬의 개수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈장 단백질을 포함하는 항혈소판 및 항응고제 활성을 모두 갖는, 허혈-재관류 손상 또는 급성신부전 또는 심근경색증 또는 뇌졸중 또는 말초동맥 폐색성 질환 또는 장간막 허혈 치료에 사용을 위한 항혈전증 분자가 제공된다.
대안으로, 본 발명의 제 6 측면에 따르면, 복수개의 링커 분자들을 통해 각각 10 내지 21kDa의 분자량을 가진 복수개의 헤파린 사슬이 혈장 단백질에 부착되고, 상기 혈장 단백질에 부착된 상기 헤파린 사슬의 개수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈장 단백질을 포함하는 항혈소판 및 항응고제 활성을 모두 갖는, 허혈-재관류 손상 또는 급성신부전 또는 심근경색증 또는 뇌졸중 또는 말초동맥 폐색성 질환 또는 장간막 허혈 치료를 위한 의약제제의 제조방법에 사용하기 위한 항혈전증 분자가 제공된다.
본 발명의 제 7 측면에 따르면, 항혈소판 및 항응고제(APAC) 활성을 모두 갖는 항혈전증 분자의 제조 방법이 제공되며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
1) 비분획성 헤파린(Hep) 사슬을 설프히드릴(-SH)기를 갖는 반응산물을 생산하도록 변형시키는 단계;
2) 인간혈장단백질을 피리딜 다이싸이올(-PDP)기를 갖는 반응산물을 생산하도록 변형시키는 단계; 및
3) 이질적양기능성 크로스링커를 이용하여 1)의 반응산물과 2)의 반응산물을 연결시키는 단계.
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 링커는 3-(2-피리딜다이싸이오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터 SPDP 링커 (Sigma-Aldrich 또는 Thermo Scientific Pierce로부터 상업적으로(선택적으로 GMP 품질로) 구입 가능) 이다.
본 발명의 제 8 측면에 따르면, 항혈소판 및 항응고제(APAC) 활성을 모두 갖는 항혈전증 분자의 제조 방법이 제공되며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
1) 비분획성 헤파린(Hep) 사슬을 N-하이드록시석신이미드에스터(-NHS)기를 갖는 반응산물을 생산하도록 변형하는 단계;
2) 동질적양기능성 크로스링커를 이용하여 1)의 반응산물과 인간혈장단백질, 예컨대 일차 아민을 함유하는 혈청알부민을 연결하는 단계를 포함하는,
본 발명의 바람직한 방법에서, 상기 링커는 3,3'-다이싸이오프로피온산 다이(N-하이드록시석신이미드 에스터) DTSP 링커 (Sigma-Aldrich 또는 Thermo Scientific Pierce로부터 상업적으로(선택적으로 GMP 품질로) 구입 가능) 이다.
본 발명의 제 9 측면에 따르면, 본 발명은 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 질병 또는 상태의 치료에 사용되는 방법을 제공한다:
죽상반의 내인성 파열; 또는 재폐색 방지용 혈전용해 치료법; 혈소판성 동맥혈전증; 혈관수술 또는 미세혈관 수술; 혈전성 혈소판 감소성 자반증; 허혈 재관류 손상; 급성 신부전; 심근경색증; 뇌졸중; 말초동맥 폐색성 질환, 장간막 허혈 및 안티트롬빈(AT) 결핍증과 같은 혈전증 합병증;
여기에서, 복수개의 링커 분자들을 통해 각각 10 내지 21kDa의 분자량을 가진 복수개의 헤파린 사슬이 혈장 단백질에 부착되고, 상기 혈장 단백질에 부착된 상기 헤파린 사슬의 개수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈장 단백질을 포함하는 항혈소판 및 항응고제 활성을 모두 갖는 항혈전증 분자의 유효량이 치료 대상 개체에게 투여된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 항혈전증 분자는 재폐색 방지용 혈전용해치료법 이후에 투여된다.
더욱 바람직하게는, 상기 헤파린 사슬의 개수는 8, 9, 10, 11 및 12를 포함하는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제 10 측면에 따르면, 본 발명은 하기를 포함하는 군으로부터 선택된 것의 치료 방법을 제공한다:
외인성 혈관성형술; 혈관수술 또는 미세혈관 수술; 동맥중재술; 혈관성형술, 특히, 스텐트 삽입 또는 미삽입의 경피경관(관상동맥)혈관성형술; (방향성) 동맥절제술; 말초 또는 폐동맥 혈전내막제거술; 및 동정맥루의 삽입 또는 유지와 같은 외인성 중재술;
여기에서, 복수개의 링커 분자들을 통해 각각 10 내지 21kDa의 분자량을 가진 복수개의 헤파린 사슬이 혈장 단백질에 부착되고, 상기 혈장 단백질에 부착된 상기 헤파린 사슬의 개수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16을 포함하는 군으로부터 선택되는 혈장 단백질을 포함하는 항혈소판 및 항응고제 활성을 모두 갖는 항혈전증 분자의 유효량이, 상기 치료 전, 도중 또는 이후에 치료 대상 개체에게 투여된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 항혈전증 분자는 상기 1 또는 그 이상의 치료가/치료들이 수행되기 전에 투여된다.
더욱 바람직하게는, 상기 헤파린 사슬의 개수는 8, 9, 10, 11 및 12를 포함하는 군으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게는, 상기 항혈소판 및 항응고제 (APAC) 활성을 모두 갖는 항혈전증 분자는 Butyl Sepharose 배지(GE Healthcare, 미국)를 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)와 같은 크로마토그래피 및/또는 한외/정용여과에 의해 정제되었다. 그러나, 상기 APAC 분자는 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 다른 방법에 의해, 또는 당업자에게 공지된 방법이면 다른 수단에 의해서도 정제 될 수 있다.
다음의 청구범위 및 전술한 발명의 설명에서, 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, "포함하다", 또는 "포함하는" 또는 "포함"과 같은 변형된 용어는 기재된 특징의 존재를 구체화하는 등과 같이 폭넓은 의미로서 사용된 것이지, 본 발명의 다양한 실시예에서 추가적인 특징들의 추가를 배제하려는 것이 아니다.
본 명세서에 인용된 임의의 특허 또는 특허 출원을 포함하는 모든 인용문헌은 여기에 참조로 포함되었다. 어떤 인용문헌도 선행 기술을 구성한다고 인정되지 않는다. 또한, 어느 선행기술도 본 발명이 속하는 분야에서 통상적인 지식이라고 인정되지 않는다.
본 발명의 각 측면의 바람직한 특징은 임의의 다른 측면과 관련하여 설명된 바와 동일할 수 있다.
본 발명의 다른 특징들은 하기 실시예들로부터 명백해진다. 일반적으로, 본 발명은 본 명세서(첨부된 청구범위 및 도면을 포함함)에 개시된 특징 중 임의의 신규한 것 또는 임의의 신규한 조합으로 확장된다. 따라서, 본 발명의 특정 측면, 실시예 또는 구현예와 함께 기재된 특징, 정수, 특성, 화합물 또는 화학적 잔기는, 양립할 수 없는 경우가 아니라면, 여기에 기재된 임의의 다른 측면, 실시예 또는 구현예에도 적용 가능한 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 언급되지 않는 한, 여기에 개시된 임의의 특징은 동일하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특징으로 대체될 수 있다.
본 발명을 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 대하여 설명하면 다음과 같다.
실험방법
접합
비분획 헤파린(Hep) 사슬은 두 개의 다른 크로스링커 및 반응 경로에 의해 생성된 이황화 결합을 통해 인간 혈청 알부민 (HSA)에 접합되었다:
i) 이질적양기능성(hetero-bi-functional) 크로스링커 3-(2-피리딜다이싸이오)프로온산 N-하이드록시석신이미드 에스터 (3-(2-Pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester, SPDP). 접합을 위해 Hep 링커 영역의 Ser 상의 자유 아민 및 HSA상의 Lys를 사용하였다. Hep과 HSA는 설프히드릴(-SH) 및 피리딜다이싸이올(-PDP) 유도체로 분리된 반응에서 각각 변형되었다. 최종 접합 반응에서, HSA의 피리딜다이싸이올기는 Hep의 설프히드릴기와 반응하여 이황화 결합 복합체의 형성 및 피리딘 2-싸이온의 방출을 야기하였다.
ii) 동질적양기능성(homo-bi-functional) 크로스링커 3,3'-다이싸이오프로피온산 다이(N-하이드록시석신이미드(NHS)-에스터)(3,3'-Dithiodipropionicacid di(N-hydroxysuccinimide(NHS)-ester), DTSP). 접합을 위해, Hep 링커 영역에서 Ser 상의 자유 아민 및 HSA상의 Lys를 사용하였다. 첫 번째 NHS기의 방출로, 먼저 Hep을 N-하이드록시석신이미드(NHS)-에스터 유도체로 변형시켰다. 최종 접합 반응에서 HSA의 Lys는 유도된 Hep의 N-하이드록시석신이미드(NHS)-에스터기와 반응하여 링커 영역에서 절단 가능한 이황화 결합을 갖는 복합체를 형성하고 N-하이드록시-석신이미드기의 두 번째 방출을 야기하였다.
Hep-HSA 복합체는 Butyl Sepharose 배지(GE Healthcare, 미국) 또는 한외/정용 여과를 사용한 소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)로 정제하였다. 최종적으로, Hep-HSA 복합체를 pH 7.4의 인산완충생리식염수(PBS)로 용출시켰다. 복합체들은 APAC-로 명명되었으며, 접미어 확장은 Hep 사슬의 HSA로의 접합 레벨을 나타낸다.
본 발명을 예시하는 APAC 복합체의 일반식은
(Hep-NH-CO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CO-NH)n-HSA 이며,
여기에서 HSA에 결합 된 비분획 헤파린 사슬의 평균 개수를 n으로 정의한다.
Hep의 HSA에의 평균 접합 레벨(CL)은 Hep과 HSA의 농도 및 이들의 평균 분자량을 사용하여 하기 방정식에 따라 결정하였다:
Hep의 몰 수 = Hep 농도[C] / 평균 Hep 분자량(MW)
HSA의 몰 수 = HSA 농도[C] / HSA 분자량(MW)
CL = Hep 몰 / HSA 몰
Hep 분자량(MW) = 15800
HSA 분자량(MW) = 66472
Hep 중합체의 평균 분자량은 헤파린 제조업체로부터 얻은 정보를 기반으로 하였다. HSA의 분자량은 UniProtKB/Swiss-Prot의 ALBU_HUMAN, P02768으로 시그널 및 프로펩타이드가 없는 isoform 1을 기반으로 하였다.
APAC 복합체. 표 I 참조.
APAC1은 HSA 1몰 당 Hep 4 내지 6 몰의 평균 CL을 갖는다.
APAC2는 HSA 1몰 당 Hep 8-16 몰의 평균 CL을 갖는다.
2010년에, APACs의 1세대, 즉 APAC1이 HSA 1몰 당 평균 Hep 6몰의 비교적 큰 (1g) 규모로 제조되었다 (CL 6:1; batch 1.1). APAC1은 체외(in vitro)에서 항응고제 및 항혈소판 효능을 모두 나타내었다. 이는 급성혈전증의 2가지 서로 다른 개코원숭이 모델에서, 비분획 헤파린(UFH), 즉 HSA에 연결되지 않은 헤파린인 대조군에 비해 혈관 개방성을 유지하고 혈전증 및 피브린 침착을 감소시켰다. 또한, 방사능(Cu-64) 표지된 APAC1은 대조군, 즉 UFH와 비교하여 fresh 랫 문합 상 국소 투여 부위에서의 국소화가 연장되었다(캐나다, IPS Therapeutics에서의 연구).
2011년에는, APAC2(batch 2.1)로 명명된 2세대 APACs가 APAC1과 비교했을 때 Hep의 HSA에 대한 평균 CL이 거의 두 배(11:1)가 되도록 제조되었다. APAC1과 비교했을 때, APAC2는 동일한 헤파린 농도에서 혈소판이 많은 혈장(platelet-rich plasma, PRP)에서 콜라겐-유발 혈소판 응집을 억제하는데 더 효과적이었다. 랫트 문합 모델에서, Cu-64로 표지된 APAC2를 혈관 내에 투여하고, UFH 대조군의 2배의 시간 동안 검출 할 수 있었다(IPST, 캐나다).
2012년에는, 3세대 APAC(이번에는 여러 개의 batch 3.1~3.6)이 제조되었다. 접합 반응(conjugation reaction, CR) 자체의 재현성을 연구하기 위해 6가지의 다른 APAC 복합체(CL 6:1 ~ 16:1)가 소규모(~50mg의 batch 크기)로 제조되었다. 이러한 APAC 복합체는 제조 순서에 따라 명명(CR1-6)되었으므로 이들 이름은 제품의 특정 CL을 반영하지 않는다. 제조 프로토콜이 소규모로 조정되었기 때문에 이에 따른 변경은 제품의 최종 특성을 약간 수정했을 수 있다. 흥미롭게도, 또한 균등하게, 높은 CL을 갖는 화합물은 PRP에서 콜라겐-유발 혈소판 응집을 저해하는데 있어 CL이 낮은 것보다 더 효과적이었다. 한편, 항응고제 효능은 CL이 낮을수록 더 두드러진 것처럼 보였다.
2013년에는, APAC1(CL 4:1; batch 4.1)과 APAC2(CL 8:1; batch 4.2)의 4세대 APAC가 제조되었다.
2014년에는, 5세대 APAC은 APAC1(CL 4:1; batch 5.1) 및 APAC2(CL 8:1; batch 5.2)로 만들어졌다. 2014 년의 배치 분석이 현재 진행 중에 있다.
정량화
공액 분자의 성질, 즉 HSA 단백질 및 고도로 황화된 헤파린 잔기 모두를 가지는 성질 때문에, APAC 생성물의 CL을 결정하는 것은 쉽지 않았다. HSA의 농도는 제조자(Pierce Biotechnology, 미국)의 지침에 따라 bicinchoninic acid(BCA) 단백질 분석으로 결정되었다. BCA 분석은 단백질을 과도하게 측정하는 것으로 보였으므로 2013년에는 280nm에서의 직접 UV 측정을 통해 BCA 분석을 검증하였다. Hep(Heparin Leo, Leo Pharma, 덴마크)은 제조사(Biocolor Ltd., 영국)의 지침에 따른 Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan assay인 Blyscan 분석법에 따라 측정되었다.
2010년과 2012년에, Hep은 글리코사미노글리칸(GAG) 표준 (소 기관 콘드로이틴 4-황산염)에 대해 분석되었다. 이 GAG 표준을 사용하면 Hep 농도는 일반적으로 과도하게 측정되었다. 따라서 2013년 헤파린 출발 물질이 Blyscan 분석을 위한 새로운 표준으로 포함되었다. 정확성 및 비교 분석을 위해, GAG와 헤파린을 후속 분석에 사용하였다. CL의 결정은 헤파린 분석에 사용된 특정 표준(표 1) 및 HSA 분석의 영향을 받았다. 그럼에도 불구하고, 다른 APACs와 대조군 UFH가 비교된 모든 연구에서, Hep 농도는 GAG 또는 더욱 최근의 Hep 표준(황산화글리코사미노글리칸 분석, Blyscan assay kit, Biocolor Ltd., 영국) 과 같은 동일한 분석법으로 결정된다.
간단히 말하면, 정량될 시험 시료를 마이크로-원심분리 관에 첨가하고 물을 사용하여 100㎕로 부피를 조정하였다. 각 분석에서, Blyscan 분석 키트의 황산화 GAG 표준 또는 알려진 헤파린 표준도 시약바탕시료(0㎍, 물 또는 PBS)에 더하여 특정 농도 범위에서 측정되었다. 분석을 시작하기 위해 Blyscan 염료 시약 1.0㎖(무기 완충 용액에 1,9-디메틸-메틸렌 블루)를 첨가하고 적어도 30분 동안 혼합하였다. 황산화된 헤파린이 들어있는 관은 자주색/분홍색으로 바뀌었다. 생성된 GAG-염료 복합체는 원심 분리(> 10,000 x g, 10분)에 의해 결합되지 않은 염료로부터 분리되었다. 상등액을 버리고 1.0ml의 Blyscan Dissociation Reagent를 첨가하고 교반하였다. 이어서, 생성된 용액을 656nm에서 분광 광도계로 분석하였다. 시약바탕시료와 함께 표준 물질을 사용하여 헤파린 농도를 결정하는데 사용된 검량선을 제작하였다. 흡광도 값은 0.05 내지 1.5 사이였고, 그렇지 않은 경우 시료들은 각각 재구성되거나 희석되었다.
분자량
APAC의 분자량 (MW)은 아직 확정되지 않았으며, 용액의 몰 농도는 근사치로 낼 수 있다. 일반적인 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC), 고압 SEC 및 삼중 검출기(triple detector array, TDA; 굴절계, 점도계 및 좌/우각 광 산란 검출기) 결합 기술을 이용한 연구는 APAC1(batch 1.1) 및 APAC2(batch 2.1) 사이에서 분자량이 대략 두 배가 된 것을 보여준다.
In vitro 에서의 APAC 기능 평가
실험 재료 및 실험 방법
혈액 채취
샘플 채취 이전에 적어도 6 내지 7일 동안 어떤 약물도 복용하지 않은 건강한 기증자의 혈액을 사용하였다. 하룻밤을 공복으로 지낸 후에 정맥으로부터 표준 진공 혈액 채취 튜브 (0.109M 소듐 시트레이트 Vacuette 455322, Greiner Bio-one)로 정맥천자(venipuncture)를 통해 샘플들을 채취하였다. 샘플은 혈액 채취 후 4시간 동안 유효한 것으로 간주하였다.
혈소판 풍부 혈장 및 혈소판 결핍 혈장
혈액을 22℃에서 12분간 180 x g으로 원심 분리하여 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma, PRP)을 분리하였다. 혈소판 결핍 혈장(platelet-poor plasma, PPP) 채취를 위해 잔여 혈액을 22℃에서 10분간 1500 x 로 다시 원심 분리하였다. PRP의 혈소판(PLT) 수는 Sysmex KX-21(Sysmex Corporation, 일본) 셀 카운터로 측정하였고, 보정된 자동화 트롬보그램(Calibrated Automated Thrombogram, CAT) 분석을 위해 PPP로 150*106 10% PLT/mL가 되도록 조정하였고, 작용제-유발 PRP 응집을 위해서는 300*106 ± 10%으로 조정하였다. 내부 혈장 풀(in house plasma pool)의 경우, 11명의 기증자로부터 채취된 혈액을 2000 x g에서 10분간 원심 분리하였다. PPP를 10.000 x g에서 10분간 다시 원심 분리하여 남아있는 혈소판을 모두 제거하였다. 혈장을 혼합하고, 분액으로 보관하여 사용할 때까지 동결시켰다. CAT 혈장은 2회 원심 분리 하였다.
혈장
APAC 복합체와 UFH 대조군의 항응고 효능을 동일한 헤파린 농도(Blyscan GAG st.)에서 시험하였다. 실험실 대조군 혈장, 즉 표준 인간 혈장(SHP, Siemens, 독일), 유기용제/계면활성제(S/D) 처리된 혈장(Octaplas, Octapharma, 스위스) 및 내부 혈장 풀(PP, 11명의 건강한 기증자)의 세 가지 다른 혈장들이 사용되었다. 요약하여, 내부 혈장 풀에서의 결과를 예시로 보여주었다. APAC의 AT-비의존적 항응고제 효능을 연구하기 위하여 안티트롬빈(AT) 결핍 혈장(American Diagnostica, 미국)을 사용하였고, APTT 분석에서는 UFH를 사용하였다.
응고
헤파린은 안티트롬빈 복합체와 트롬빈을 결합시키고 안티트롬빈의 능력을 강화시켜 트롬빈, 응고 인자 Xa 및 응고의 내인성/외인성 경로의 상류에 있는 기타 여러 응고 인자를 비활성화시킨다. 대조적으로, 저분자량 헤파린(LMWH)은 안티트롬빈에만 결합하여 거의 독점적으로 인자 Xa만을 억제한다. 트롬빈 표적화는 더 긴 사슬 길이를 요구한다; 헤파린 내에 적어도 18 단위 서열의 오당류가 필요하다. 헤파린-함유 혈장 샘플의 항응고제 효능은 혈소판 및 다른 혈액 세포가 없는 PPP에서의 피브린 혈전 형성 시간에 의해 정기적으로 시험하였다. 헤파린은 매우 황산화되어 있으며 강한 음전하를 가지고 있다. 따라서, 순환하는 혈장 단백질 또는 혈관 내피세포에 대한 비특이적 결합은 여기에서 다루지 않은 다른 상호 작용을 유도할 수 있다.
트롬빈 시간
트롬빈 시간(TT)(Thrombin BC reagent, Siemens, 독일) 분석에서, 희석된(40㎕ 혈장 및 100㎕ 트롬빈 BC) 시트레이트 처리된 혈장은 표준화된 고농도의 트롬빈(0.8 IU/㎖)이 보충되고, 피브리노겐에서 피브린 혈전으로의 변환 시간은 코어귤로미터(coagulometer)(KC-4, Sigma-Amelung, 미국)으로 측정하였다.
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT, 시약 Dade Actin FSL, Siemens, 미국) 분석에서 혈전 형성은 내재적 경로(I, Ⅱ, Ⅴ, Ⅷ, Ⅸ, Ⅹ, ⅩⅠ, ⅩⅡ)의 응고 인자에 의해 유발되며, 접촉 활성화를 나타내고 혈장의 재석회화에 의해 야기된다. 실험에서, 50㎕의 혈장을 50㎕의 Actin FSL(100μM ellagic acid 내 대두 및 토끼 뇌 인지질)로 희석하고 25mM CaCl2 50㎕로 다시 석회화시켰다. 충분한 양의 헤파린이 존재할 때, TT와 APTT는 용량 의존적으로 연장되기 시작한다. 임상적으로 정맥 내 투여 된 헤파린 항응고제의 양은 주로 APTT로 모니터링된다. 항응고의 치료적 수준에 도달하기 위해, 대조군 샘플에 비해 1.5배 내지 3배의 연장을 목표로 하였다. APTT 분석은 사용된 시약 및 코어귤로미터에 따라 다르지만, 일반적으로 기준 범위는 20-40초였다.
보정된 자동화 트롬보그램
트롬빈 생성은 출혈이나 혈전증의 위험과 관련된 상태를 추정하기 위해 실험적으로 사용된다 (Hemker et al. Pathophysiol Haemost Thromb 2002; 32 : 249-53). 트롬빈은 전체 응고 과정에서 형성되지만, 피브린이 체외에서 응고되기 위해서는 총 트롬빈의 2 내지 5%만이 필요하다. 따라서 전통적인 응고 시간(즉, TT 및 APTT)은 응고 중 트롬빈 활성의 대부분을 고려대상으로 하지 않으며, 이는 Hemker의 방법인 Calibrated Automated Thrombogram(CAT)에 의해 확인될 수 있다. CAT은 조직인자-유발된 트롬빈 생성을 평가하며, 이는 형광성 트롬빈 기질의 분열 및 공지된 트롬빈 활성을 갖는 대조군과의 샘플의 병렬 비교를 검출함으로써 모니터링된다. 트롬빈 생성 과정에서, 항응고 인자와 응혈 촉진 인자 모두 트롬보그램의 측정 가능한 특성에 영향을 미친다. 지연 시간은 PT(조직인자(TF)에 의해 유발된다) / APTT(엘라그산에 의해 유발된다)를 반영하는 피브린 혈전 형성 시간을 나타낸다. 곡선의 피크는 총 트롬빈 생성의 최대 속도와 그에 도달하는 시간을 나타낸다 (ttpeak). 곡선 아래 영역, 즉 내인성 트롬빈 전위분석(endogenous thrombin potential, ETP)은 형성되는 총 트롬빈을 측정한다. CAT에서는 시트레이트 처리된 PPP 또는 PRP 중 하나를 통해 트롬빈 생성이 평가될 수 있다. 트롬빈은 PPP의 경우 샘플을 TF(5pM) 및 인지질(phospholipids, PPL)(4μM)(PPP 시약, Stago, 프랑스)로, 또는 PRP의 경우 TF(1pM, PRP 시약, Stago, 프랑스)을 각각 유발 또는 보충함에 따라 재석회화된 혈장에서 활성화된다. CAT은 응고 인자의 결핍이나 과활성을 검출할 수 있고, 출혈 질환의 경우에 있어서 헤파린이나 직접 트롬빈 저해제와 같은 항응고제의 사용 또는 대체 요법을 감지할 수 있다.
PRP에서의 혈소판 응집
혈소판 응집은 37℃에서 1000 r.p.m 속도의 stir bar를 갖는 Aggram aggregometer(Helena Laboratories Inc., 미국)를 사용하여 Born 탁도측정법으로 연구되었다(J Physiol 1962, 162 : 67-68). 콜라겐 (타입 I 피브릴, Kollagenreagens-Horm, Nycomed Pharma, 오스트리아 또는 Chronolog collagen, Chronolog Ltd., 미국)을 0.5㎍/㎖의 최종 농도로 주작용제로 사용하였다. 혈소판 응집을 유도하기 전에 시험 물질을 22℃에서 PRP와 함께 2분간, 37℃에서 1분간 배양하였다. 적용 가능한 경우 5분에서 최대 응집도(광투과율의 변화 %), 곡선 및 커브 아래의 면적을 측정하였다.
모든 분석에서, 시험 물질과 동등한 부피에서 vehicle (PBS, pH 7.4)로 기준치를 측정하였다. 본 발명자들은 또한 다른 작용제들을 연구하였다; 아데노신 다이포스페이트(ADP), 리스토세틴 및 콜라겐 관련 펩타이드(collagen-related peptide, CRP). APAC들은 ADP에 의해 유발된 혈소판 응집을 억제하지 않지만, 고농도에서는 리스토세틴에 의해 유발된 응집을 억제하였다 (데이터는 나타내지 않음). 콜라겐에 대한 APAC의 항혈소판 활성은 혈소판 응집 시험에서 가장 두드러진 특징이다.
개코원숭이 급성 혈전증 모델
마취된 개코원숭이에서의 두 개의 잘 확립된 급성 혈전증 모델에서 vehicle과 비교하여 APAC1(batch 1.1.) 및 UFH의 항혈전 효과를 연구하였다. 수정된 Folts' model 에서는 대퇴 동맥과 정맥 사이에 체외 동정맥 단락(AV-shunt)이 만들어졌다. 혈류는 동맥에 놓인 외부 압축 장치에 의해 제어하였고 혈류는 탐침으로 모니터링 하였다. 동맥은 Martin needle holder(Hegar-Baumgartner TC Gold 14 cm)로 10초 동안 두 번 교차 고정함으로써 외부에서 손상되었다. 상해부위에 근접한 모든 곁가지를 결찰 하였다. 상기 단락은 APAC1 또는 UFH 또는 인산완충생리식염수(PBS) 중 하나의 볼러스(bolus)(4㎎/㎖)를 주사하기 위해 혈관 근처에 1cm 근접하게 바늘(26G)로 구멍을 뚫었다. 혈류에 노출되기 전에 상해 부위를 연구 물질로 3분간 처리하였다. 기준 혈류를 회복한 직후에 외부 압축 장치를 손상 부위에 위치시키고 혈류량을 30 내지 100 mL/min(90%에서 30%로의 협착)으로 감소시켰다. 협착된 동맥 상에 혈소판의 침착은 감소된 혈류에 의해 검출되어 순환 유동 감소(cyclic flow reductions, CFR)로 기록되었다. 5㎖/분에서 동맥은 폐색된 것으로 간주되고, 압축기를 방출하고 인산완충식염수(PBS)로 씻어냄으로써 혈전을 제거하였다. 기준 혈류량이 회복된 후에 협착을 재발시키고 실험을 반복하였다.
두번째 개코원숭이 모델에서, 혈전증을 콜라겐이 코팅된 PTFE 이식편(2cm, 4mm 내강)을 외부 동맥-정맥 단락에 놓음으로써 유발하였다. 응고물을 형성하는 콜라겐 표면을 APAC 또는 UFH (모두 4㎎/㎖)로 10분 동안 처리하였다. 혈류가 시작되고 (100㎖/분; 265-1), 111-인듐-표지된 혈소판 및 피브린(125-아이오딘-피브리노겐의 침착)의 침착이 60분 동안 정량화하였다.
손상 부위에서의 유지
랫트에서 부분적으로 결찰된 (1cm 간격의 2개의 느슨한 봉합) 대퇴 동맥 연결에 대한 50시간 동안의 PET 이미징을 통해 국소투여된 64-Cu-표지된 APAC 또는 UFH (3㎎/㎏)의 적용부위에서의 효능, 분포 및 유지를 평가하였다.
허혈 재관류 손상 및 급성 신장 손상 모델
동물. 특정된, 병원균이 없는, 235 내지 250g의 무작위 교배시킨 Sprague Dawley(SD) 쥐 수컷(Harlan Laborato-ries, Horst, Nederland)을 사용했다. 랫트는 규칙적으로 쥐 사료와 수돗물을 자유롭게 섭취하고, 12시간의 명암 사이클을 유지했다. 동물들은 국립 보건원 및 동물 관리국(National Research Council, Washington DC, National Academy Press, 1996)에 의해 출판된 실험실 동물 재원 관리 및 사용 안내서에 따라 사람의 보살핌을 받았다.
혈액 세포 수와 응고 프로필. SD 랫트(n=8/군)에 APAC2(batch 2.1; 16㎍, 32㎍ 또는 80㎍) 또는 PBS(pH 7.4에서 10mM 인산 나트륨, 137mM 염화 나트륨, 2.7mM 염화칼륨)로 적절한 농도까지 희석된 UFH 32㎍ (주입용액 5000IU/㎖; 200 IU/㎎; Leo Pharma, 덴마크)를 정맥주사로 투여하였다. 랫트 대조군은 정맥주사로 saline vehicle을 처치하였다. 10분 째에, 쥐를 희생시켜 혈액 세포 수와 응고 프로필 분석을 하였다. 첫 번째 혈액 샘플은 3.8% 소듐 시트레이트 항응고제로 미리 채워진 2㎖의 주사기로 추출되어 3㎖의 폴리프로필렌 샘플 튜브에 두었다. 그 직후, 두번째 샘플을 쥐 혈청 채취를 위한 다른 2㎖ 빈 주사기로 추출하였다. 샘플들은 혈액세포 개수, PPP, 혈장 및 혈청에 대해 개별적으로 처리되었다. 혈액세포 개수는 셀 카운터 Sysmex KX-21을 사용하여 시트레이트 처리된 혈액 샘플에서 측정하였다. PPP 혈액은 1200 x g에서 15분간 원심 분리하여 (22℃) 백혈구와 적혈구를 분리하였다. 새로운 튜브에 PPP를 피펫팅 하는 동안 버피코트를 건드리지 않도록 주의를 기울였다. PPP는 새 튜브에 채취된 후, 16100 x g에서 5분간 두 번째로 원심 분리하였다. PPP는 즉시 사용하지 않는 경우 -40℃에서 보관하였다.
신동맥 클램핑 모델. SD 랫트들에게 연구 모델에 따라 온허혈 발병 전후 10분에 APAC2(batch 2.1; 16㎍, 32㎍ 또는 80㎍) 또는 PBS(pH 7.4에서 10mM 인산 나트륨, 137mM 염화 나트륨, 2.7mM 염화칼륨)로 적절한 농도까지 희석된 UFH 32㎍ (주입용액 5000 IU/㎖; 200 IU/㎎) 중 하나를 정맥주사 하였다(n=8/그룹). 랫트 대조군은 정맥주사로 saline vehicle을 처치하였다. 쥐를 흡입성 아이소플루레인(isoflurane)으로 마취시키고 정중선 절개를 수행하였다. 연구 모델에 따라 두 신동맥 모두를 30분 또는 60분 동안 클램프로 고정시켰다. 클램프를 제거한 후 신장을 검사하여 혈류 회복여부를 검사하고 복부를 닫았다. 랫트에게 체액 균형의 수술 후 유지 및 통증 완화를 위해 각각 1mL의 PBS와 0.1㎖의 buprenorphinum(Temgesic 0.3㎎/㎖, Schering-Plough, Kenilworth, NJ)을 투여하였다.
신장 기능 및 급성 신장 손상 평가. 신장 기능 및 신장 손상의 평가를 위해, 신장 손상 후 1일, 2일 및 3일에 쥐꼬리 정맥 혈액 샘플을 마취 하에 채취하였다. 핀란드 헬싱키의 헬싱키 대학 병원(Helsinki University Hospital)의 HUSLAB 임상 화학 부서에서 크레아티닌 및 요소 질소 활성에 대한 추가 분석이 이루어질 때까지 혈청을 -20℃에서 동결시켰다. 급성 신장 손상을 위한 바이오마커로서, 본 발명자들은 랫트 호중성 젤라티나제 관련 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)을 사용하였다. NGAL 혈청 레벨은 양측 신장 동맥 클램핑 3일 후 마우스 단일클론항체 anti-NGAL(BioPorto Diagnostics A/S, Gentofte, 덴마크의 ABS 039-08)을 사용하여 ELISA로 평가하였다.
면역 조직 화학. 면역 조직 화학 검사를 위해, 4mm 두께의 파라핀-내장 또는 저온유지장치 단면을 유리 슬라이드 위에서 연속하여 자르고 페록시다제 ABC method(Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories)을 사용하여 염색하였다. 반응은 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC, Vector Laboratories)에 의해 밝혀졌다. 면역 염색을 위해 표본을 pH 7.40에서 1.5% 정상 염소 혈청/PBS와 함께 20분 배양하여 차단하고, 최적 희석한 1차 항체와 30분 동안 실온에서 배양(단일 클론 항체) 또는 +4℃에서 15시간 동안 배양하였다(다클론 항체). 일차 항체들은 0.1% 소 혈청 알부민/PBS 용액으로 희석되었다. PBS로 세척한 후, 내인성 페록시다제 활성을 0.1% 수소 페록시다제(30%)/PBS 용액으로 10분 배양하여 차단하였다. PBS에서 세척하는 과정 중에, 표본을 비오틴화된 항체와 함께 실온에서 30분 동안 PBS 완충액에서 추가로 배양하였다; 이는 실온에서 30분 동안 PBS 완충액에서 아비딘-비오틴화-홀스라디쉬 복합체(avidin-biotinylated horseradish complex)로 검출되었고, 상기 반응은 AEC (Vector Laboratories)에 의해 밝혀졌다. 슬라이드들은 Mayer's haemalum으로 대조 염색되었다. 양성 세포의 밀도를 결정하기 위해, 단면의 각 사분면에서 임의의 4개 구역을 40배 배율로 계수하였고, 점수는 1mm2에서의 합계로 나타내었다. 사용된 항체 및 희석액은 CD8+ T세포(5mg/mL, 22071D)(BD Pharmingen, San Diego, CA) 및 KIM-1(8mg/mL, AF3689)(R&D systems, Abingdon, 영국)이다.
히알루론산(Hyaluronan, HA)은 이전에 기술된 바와 같이 아비딘-비오틴-페록시다제(avidin-biotin-peroxidase) 검출법(Vector Laboratories; 1:200 희석)에 의해 소 관절 연골로부터 준비된 아그레칸(aggrecan)의 비오틴화 G1 도메인과 연결 단백질을 포함하는 특정 비오틴화 bHABC 히알루론산 결합 복합체(biotinylated bHABC hyaluronan binding complex)를 사용하여 0.05% 3,3-다이아미노벤지딘 (DAB) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)으로 파라핀 절편에서 염색되었다. 상기 염색의 특이도는 염색하기 전 프로테아제 억제제 존재 하에서 Streptomyces hyaluronidase로 일부 절편을 소화시키거나 bHABP 탐침을 히알루론산 올리고당으로 사전 배양함으로써 조절하였다. 각 샘플에서 배율 40 배의 사진 10장을 촬영하고 컴퓨터 보조 영상(Zeiss Axionvision 4.4, Carl Zeiss International)으로 히알루론산에 양성인 영역을 측정하였다. 이 10가지 측정의 평균 면적을 통계 분석에 사용하였다. 모든 분석은 두 명의 독립적인 관찰자가 맹검법으로 수행하였다.
신장 조직학. 조직학적 손상의 반 정량적 평가는 다음과 같이 수행하였다: 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 2mm 두께의 파라핀 내장 신장 샘플을 염색하였다. 관 손상(편평화, 팽창, 돌기 및 괴사) 심각도를 다음의 파라미터에 따라 0 내지 3으로 점수화하였다: 등급 0 = 손상 없음, 등급 1 = 경미한 손상, 등급 2 = 중등도 손상, 등급 3 = 심각한 손상, 전체 관 손상 점수(0-12).
통계. 모든 데이터는 평균 +/- SEM이고 SPSS, Windows 버전 15.0 (SPSS Inc, Chicago, IL)에 의해 분석되었다. 2 그룹 비교를 위해서, 비모수적 Mann-Whitney U 테스트와 모수적 Student t- 테스트가 적용되었다. 다중 그룹 비교를 위해서는, Dunn post-hoc 테스트를 통한 비모수적 Kruskal-Wallis 테스트와 Dunnett's Correction을 사용한 모수적 ANOVA가 적용되었다. 생존율을 위해 로그 순위(Mantel-Cox)를 이용한 Kaplan-Meier 분석을 적용하였다. P<0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
결과
트롬빈 시간
2010년부터 2012년까지의 APAC 복합체(CL 6:1 ~ 16:1) 존재 하 혼합혈장(pooled plasma)에서의 TT 측정의 예를 도 1에 나타내었고, APAC1 (batch 4.1) 및 APAC2 (batch 4.2)의 경우는 도 2에 나타내었다.
도1
1㎍/㎖에서 모든 APAC들은 TT를 적어도 1.5배 연장시켰으며, UFH는 TT를 기준치(30초)의 1.3배로 연장시켰다. APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains)은 측정된 최대 TT (300초)에 도달한 반면, APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains)는 TT를 기준치의 2.5배로 연장시켰다 (도 1). APAC-CL6은 (6 Hep chains) TT를 기준치의 5.5배, APAC-CL8 batch 3.2 (8 Hep chains)는 5.8배, batch 3.1 (8 Hep chains)은 4.3배, APAC-CL10 (10 Hep chains)은 2.4배, APAC-CL13(13 Hep chains)은 2.5 배 및 APAC-CL16(16 Hep chain)은 3.7배로 연장시켰다 (도 1). 1.5㎍/㎖에서 모든 APAC들과 UFH는 측정의 최대시간에 도달하였다.
도 2
APAC1(batch 4.1, 4 Hep chains)과 APAC2 (batch 4.2, 8 Hep chains)는 TT를 각각 2.1~2.4배로 연장시켰다 (도 2). 1.25㎍/㎖에서 APAC1(batch 4.1, 4 Hep chains)은 측정된 최대 시간 (300초)에 도달하였으나 APAC2(batch 4.2, 8 Hep chains)는 3.2배로 연장시켰다 (도 2).
활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간
도 3
혼합혈장에 존재하는 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains), APAC 2 (batch 2.1, 11 Hep chains) 및 CL 6:1에서 16:1까지의 APAC batch 3.1~3.5 (8, 8, 10, 13 Hep chains)의 APTT 측정예를 도 3에 나타내었다.
APTT 기준치(3초)에 비해, 1㎍/㎖의 APAC1(batch 1.1)은 APTT를 1.4배 연장시킨 반면, 다른 APAC 및 UFH는 APTT를 1.1에서 1.2배로 연장시켰다. 2㎍/㎖에서 APAC1(batch 1.1)은 APTT를 2.0배 연장시킨 반면, 다른 APAC 및 UFH는 1.4내지 1.6배로 적게 연장시켰다. 3㎍/㎖에서는 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains) 기준치와 비교하여 APTT는 2.6배, APAC-CL8 (batch 3.1 및 3.2, 8 Hep chains)은 2.1 배, APAC-CL10(batch 3.3, 10 Hep chains)은 2.0배, APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains)는 1.9배, APAC-CL13(batch 3.4, 13 Hep chains), APAC-CL16 (batch 3.5, 16 Hep chains) 및 UFH는 모두 1.8배 연장시켰다. 6㎍/㎖에서는 APAC1 (batch 1.1, 4 Hep chains) APTT를 6.7배로 연장시켰고, APAC-CL8(batch 3.1 및 3.2, 8 Hep chains)는 5.4에서 4.7배, APAC-CL10(batch 3.3, 10 Hep chains)은 4.5배, APAC2(batch2.1, 11 Hep chains)는 4배, APAC-CL13 (batch 3.4, 13 Hep chains)는 3.8배, APAC-CL16(batch 3.5, 16 Hep chains)는 3.6배 및 UFH는 3.1배로 연장시켰다. 8㎍/㎖에서는, APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains)은 ATPP를 9.8배, APAC-CL8(batch 3.1, 3.2, 8 Hep chains)는 9.3에서 8.7배, APAC-CL10(batch 3.3, 10 Hep chains)은 7.4배, APAC-CL13(batch 3.3, 10 Hep chains)는 6.0배, APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains)는 5.4배, APAC-CL16(batch 3.5, 16 Hep chains)는 5.8배 및 UFH는 가장 적은 4.2배로 연장시켰다. 사용된 최고 농도에서 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains)과 APAC-CL10(batch 3.3, 10 Hep chains) 간의 APTT 차이는 25% 였고 APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains) 간에는 45%였다. 모든 경우에, APTT는 전형적으로 1세대 및 2세대 APAC(batch 1.1, 2.1, 4 및 11 Hep chains)의 가장 낮은 CL 존재 하에 기준치와 비교하여 가장 연장되었다.
4세대 APAC (APAC1 대 APAC2)는 Hep이 더 높은 용량(6㎍/㎖ 초과)으로 사용되지 않는 한 APTT 연장이 꽤 비슷하다는 점에서 이전의 batch와 달랐다. 또 한편으로는, 항응고작용은 헤파린의 낮은 커플링 CL로부터 이익을 보았다. 1㎍/㎖에서, APAC1(batch 4.1, 4 Hep chains)과 APAC2 (batch 4.2, 8 Hep chains) 모두 기준치(29초)와 비교하여 APTT를 1.2배 연장시켰다. 2㎍/㎖에서는, APAC1(batch 4.1) 및 APAC2(batch 4.2)는 APTT를 유사하게 각각 1.4배 및 1.3배 연장시켰다. 3㎍/㎖에서도, APAC1(batch 4.1) 및 APAC2(batch 4.2)는 APTT를 각각 1.8배 및 1.7배 연장시켰다. 6㎍/㎖에서는, APAC1(batch 4.1) 및 APAC2(batch 4.2)는 각각 APTT를 3.9배 및 3.4배 연장시켰다. 8㎍/㎖에서는, APAC1(batch 4.1) 및 APAC2(batch 4.2)는 APTT를 각각 7.5배 및 6.0배 연장시켰다. 사용된 최고 농도에서, APAC1(batch 4.1)과 APAC-2(batch 4.2) 사이의 APTT의 차이는 21%였다.
도 4
상이한 헤파린 커플링 CL을 갖는 APAC의 APTT-평가된 항응고 작용을 도 4에 나타내었다
도 5
4세대 APAC1(batch 4.1, 4 Hep chains) 및 APAC2(batch 4.2, 8 Hep chains)의 존재 하 APTT를 도 5에 나타내었다.
PPP에서 보정된 자동화 트롬보그램 (CAT)
도 6-9
외인성 경로 활성화제인 조직 인자(5pM)에 의해 유발된 CAT에서 APAC는 APTT를 연장시키는데 필요한 것보다 낮은 농도에서 항응고제 작용을 나타내었다. 0.25~1.5㎍/㎖의 낮은 헤파린 농도에서 APAC은 피크와 ETP를 감소시켰으며 테스트에 사용된 세 가지 다른 혈장(PP, SHP 및 Octaplas)에서 용량 의존적으로 tt 피크를 연장시켰다. 혼합혈장에서 1세대 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains), 2세대 APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains), UFH 및 3세대 APAC-CL6~16의 영향을 보여주는 트롬보그램을 도 7~12에 나타내었다. APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains) 및 APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains)에 대한 지연시간(초), ETP(nM), 피크(nM) 및 tt 피크(초)를 표 Ⅱ에 요약하였고, APAC-CL6 ~ APAC-CL16은 표 Ⅲ에 요약하였다. Vehicle 대조군과 비교한 상대적인 변화값(%)을 나타내었다. 트롬빈 생성이 완전히 억제되면 지연 시간(초), ETP(nM), 피크(nM), tt Peak(초)는 0으로 표시되었다.
UFH와 비교하여 지연시간과 tt 피크는 테스트에 사용된 모든 농도에서 모든 APAC에 의해 또렷하게 연장되었다. ETP는 ETP가 UFH와 비슷한 1.0㎍/㎖에서의 APAC-CL6(batch 3.6, 6 Hep chains)을 제외한 모든 농도에서 UFH와 비교하여 APAC에 의해 감소되었다. 상기 피크는 피크값이 UFH와 비슷한 1.0㎍/㎖에서의 APAC2 (batch 2.1, 11 Hep chains)를 제외한 모든 농도에서 UFH와 비교하여 APAC에 의해 감소되었다. 트롬빈 생성은 기준치 피크값의 15%를 나타낸 APAC-CL6(batch 3.6, 6 Hep chains)을 제외하고는 1.5㎍/㎖에서 APAC로 인해 완전히 제거되었다. 전반적으로, APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains) 및 APAC2(batch 2.1, 11 HEp chains)는 비교적 유사하게 트롬빈 생성을 저해시켰다. CL 13:1과 16:1인 3세대 APAC는 CL<10 인 APAC보다 더 강력한 억제제였다.
PRP에서 보정된 자동화 트롬보그램
도 10-12
이들 도는 혈소판 의존성 트롬빈 생성, 즉 응고촉진제 활성(출혈 또는 혈전증의 위험성 평가를 위한)에 대한 것이며, APAC가 트롬빈 생성을 억제한다는 것을 보여준다. 혈소판이 존재할때, 낮은(1pM) TF 유도제가 사용되었고, 또한 따라서 트롬빈 생성은 PPL이 첨가된 혈장 CAT보다 적었다. 0.25~1.5㎍/㎖의 낮은 Hep 농도에서, APACs는 피크와 ETP를 감소시켰고, 테스트에 참여한 각 건강한 기증자의 PRP에서 용량 의존적으로 tt 피크를 연장시켰다.
UFH 농도의 영향을 나타내는 트롬보그램을 도 10에, 1세대 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains) 및 2세대 APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains)을 도 11에, 4세대 APAC1(batch 4.1, 4 Hep chains) 및 APAC2 (batch 4.2, 8 Hep chains)을 도 12에 실험의 결과를 반영하는 선택된 농도의 실시예로서 나타내었다. 0.5㎍/㎖에서, APAC은 UFH와 비교하여 적어도 2배로 강력한 트롬빈 생성 억제제였다. CL 8:1과 11:1을 가진 APACs는 혈소판 응고촉진제 활성을 더욱 강력하게 억제하였으며, CL 6:1 APAC보다 피크와 tt 피크를 감소시켰다. 1.0㎍/㎖에서는 UFH에 대한 효능의 차이가 모든 APAC에서 더욱 두드러졌다.
요약하면, APAC에 의해 트롬빈 생성은 지연되었고, 혈소판 활성은 UFH와 비교하여 또렷하게 억제되었다. 접합된 헤파린 사슬의 수가 많을수록 억제가 강하게 나타났다.
콜라겐-유발 혈소판 응집
도 13-14. APACs에 대한 고(기증자의 50%), 중(기증자의 30%) 및 저 감수성(도 13)을 가진 기증자에서의 대표적인 응집곡선(도 13) 및 고 및 중 반응자에서의 APAC1의 전체용량-반응분석 (도 14).
도 13. APACs. APAC-CL6에서 -CL16(Hep 농도 [C] 1, 3, 10, 30 및 90㎍/㎖)을 각각 다른 감수성을 가진 3명의 독립적인 기증자의 시트레이트 처리된 PRP에서 시험하였다 (감수성은 헤파린 농도 30㎍/㎖(전체 ED50)에서 억제도%로 정의되었다: 콜라겐(coll, 0.5㎍/㎖)-유발 혈소판 응집체에서 APAC에 대한 반응자로 고>60 %, 저<40 % 및 중 40-60%). 6분째에 최대 침착% 및 곡선의 기울기(응집 속도)가 검출되었다.
APAC-CL6에서 APAC-CL16 (8, 8, 10, 13, 16 및 6 Hep chains)과 APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains)은 속도 및 최대 혈소판 응집을 감소시켰지만, UFH는 그렇지 못했다. 더 높은 커플링 CL 11 ~ 16:1을 갖는 APAC는 CL이 6 ~ 10:1보다 낮은 분자들보다 더 강력한 억제제였다. APAC-CL6 ~ APAC-CL16에 대한 1, 10 및 30㎍/㎖의 낮은 반응자에서의 결과를 도 13에 나타내었다. 최대 응집은 덜 영향을 받았음에도 불구하고, 응집 곡선(응집 속도와 관련한)은 모든 APAC 변이형에서 용량 의존적으로 감소하였다. APAC-CL16(batch 3.5, 16 Hep chains)은 낮은 반응자 (기증자 2)에서 가장 좋은 억제제였고 최대 응집%를 92%에서 38%로 감소시켰다.
도 14. APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains)은 고 반응자 PRP 10㎍/㎖에서 최대 혈소판 응집의 90%를 억제하는 반면, 중 반응자 PRP에서는 75%의 응집을 억제하기 위해 90㎍/㎖가 필요했다. 고 및 중 반응자에서 APAC1 3; 10; 30; 60 및 90㎍/㎖에서의 결과를 나타내었다.
개코원숭이의 급성 혈전증 모델
도 15-16
개코원숭이의 급성 혈전증 모델에서 APAC과 UFH는 4㎎/㎖로 손상 부위에 국소 투여되었다 (도 15). UFH 존재 하에서 동맥은 반복적으로 (5 CFRs/27분) 100mL/분의 유속으로 차단되었다 (30%으로 협착). 대조적으로, APAC1(batch 1.1, 4 Hep chains)은 120분의 추적 시간 후, 실험이 중단될 때까지 혈전 형성을 효과적으로 억제시켰다. 실험 종료 시점인 180분 후, 동맥은 처음으로 50㎖/분(60% 협착)으로 재협착되었고, APAC가 선택된 테스트 기간(각각 10, 15분) 동안 폐색을 계속 억제하는 동안 마침내 30㎖/분(90% 협착)으로 재협착되었다. UFH와 인산완충생리식염수(PBS)를 이용한 대조군 실험에서 반복적인 CFR이 나타났다(결과는 표시되지 않음). 체외 이식편 콜라겐에서의 개코원숭이 혈전증 모델에서(도 16), APAC1은 콜라겐에 대한 혈소판 침착을 UFH와 비교하여 34±13% (평균 및 SD, n=4, p=0.01)로 감소시켰다. 말초 혈전 증식 또한 63±11%로 감소하였다 (n=4, p=0.19). UFH를 사용한 결과는 치료받지 않은 대조군 값과 유사하였다 (n=21). 피브린 침착은 APAC1에 의해 감소(45±14 %)되었으나 UFH에 의해서는 감소되지 않았다(1.1±0.1%, n=4, p=0.01).
강력한 유지 잠재력과 느린 분해에 의해 50시간(~120시간) 이후에도 랫트 마취부위에서 비분해된 APAC가 PET로 검출된 반면, UFH는 24시간 후부터 이미 검출되지 않았다(n=2). 약 10%의 APAC는 혈관 적용부위에 직접 부착되었다. APAC와 UFH 모두 요로 경로를 통해 제거되었다.
허혈 재관류 손상 및 급성 신장 손상 모델
도 17-20
특히, 허혈 재관류 손상은 급성 신장 손상 모델에서 입증되었지만, 본 발명의 치료제는 임의의 다른 재관류 손상과 관련하여 사용되며, 따라서 심근경색 또는 뇌졸중 또는 말초동맥폐색성 질환 또는 장간막 허혈증으로 예시되는 다른 손상을 예방, 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
IRI로부터의 신장 기능 회복을 분석하였다. APAC2(batch 2.1, 11 Hep chains) 16 또는 32㎍의 투여량은 쥐의 혈액학적 분석에 근거하였다. APAC2의 임상적으로 관련된 투여량 범위와 UFH의 비교 임상 투여량은 이전의 동물 모델에 기초하였다. APAC2와 UFH의 항응고제 효능과 관련된 용량은, UFH가 최고 용량(80㎍)에서 APAC2보다 APTT를 3배로 연장시킨 10분 경의 정맥주사 투여 후에 APTT로 나타났다. 두 개의 신장 동맥을 30분간 클램프하기 10분 전에 SD 랫트는 생리 식염수(i.v.) 또는 APAC2 16 또는 32㎍(i.v.)로 처리하였다. 허혈 후 신장 기능을 평가하기 위해 재관류 후 3일 동안 쥐 혈청 및 혈장을 채취하였다. Vehicle 처리된 랫트와 비교했을 때, APAC2 32㎍ 처리된 랫트에서, 혈청 크레아티닌(** P<0.01, 도 18A) 및 요소 질소 (**P<0.01, 도 18B) 레벨이 감소되었다. 신장 손상의 바이오마커인 호중구 젤라티나제 관련 리포칼린(NGAL) 혈청 수준의 ELISA 분석은 APAC2 32㎍ 전처리가 요세사이질 손상(tubulointerstatial injury) (**P<0.01, 도 18C) 또한 감소시키는 것을 나타낸다.
APAC2 전처리는 30분 양측 신장 동맥 클램핑 모델에서 위험연관 선천성 면역 리간드 히알루론산 발현 및 염증세포의 침윤을 감소시켰다. 재관류 3일 후 우측 신장을 제거 하였다. 요세사이질 손상 마커인 Kim-1의 밀도는 APAC2 32㎍ 전처리된 쥐의 신장에서의 손상된 면역반응성 세관의 수가 Vehicle 처리한 것과 비교하여 유의하게 감소함(*P<0.05, 도 19B)을 나타낸다. IRI가 선천적 면역 리간드 히알루론산(HA)의 대뇌 피질 축적을 유도함에 따라, 본 발명자들은 IRI 후 HA 단백질 발현에 대한 APAC2 전처리 효과를 분석하였다. 30분 간의 온허혈 및 3일간의 재관류를 동반한 신장에서, APAC2 32㎍ 전처리는 Vehicle 처리 신장과 비교했을 때 HA 면역반응성 부위를 유의하게 감소시켰다(*P<0.05, 도 19A).
관형 팽창, 상피 괴사, 편평화 및 casts의 분석을 포함하는 관 손상의 반정량적 평가는 3일째에 Vehicle 처리된 신장에서의 중증 관 손상을 밝혔다 (도 19). APAC2 16 및 32㎍ 전처리는 오직 경미한 관상 동맥 확장 및 상피 평탄화가 분리된 관 모양의 단면에서 관찰되었기 때문에 전체 관 손상 점수를 감소시켰다 (*P<0.05, 도 19).
APAC 전처리는 1시간 양측 신장 동맥 클램핑 모델에서 급성 신장 손상을 예방하였다. 마지막으로, 본 발명자들은 심각한, 거의 회복 불가능한 IRI 모델에서 APAC(batch 2.1, 11 Hep chains) 전처리의 효과를 연구하였다. 양쪽 신장 동맥을 1시간 동안 클램프로 조였다. SD 랫트에게 온허혈 유도 10분 전에 식염수 Vehicle(i.v.) 또는 32㎍(i.v.) 중 하나를 투여하였다. 쥐의 생존률은 Vehicle 처리군에서 75%(6/8)이고 APAC2 32㎍ 군에서 100%(8/8)이었다 (*P <0.05, 도 20A).
다음으로, 본 발명자들은 혈청 크레아티닌과 요소 질소 측정을 통해 신장 기능을 분석하였다. APAC2 전처리는 Vehicle 처리된 신장과 비교했을 때 혈청 크레아티닌과 요소 질소 레벨을 감소시켰다 (빨간색 파선, **P<0.01 및 ***P<0.001, 도 20B & C).
안티트롬빈 결핍 혈장에서 트롬빈 시간과 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간
APAC1 (batch 5.1, 4 Hep chains) 및 APAC2(batch 5.2, 8 Hep chains) 존재 하에 AT-결핍 혈장에서의 TT 및 APTT 측정의 예를 도 21, 22에 각각 나타내었다. 헤파린 농도는 표준으로 헤파린 출발 물질을 기준으로 결정한다.
도 21
1㎍/㎖에서, APAC1(batch 5.1, 4 Hep chains)은 TT를 적어도 기준치의 2배 이상 연장시켰고 2μg/mL에서는 TT가 최대 측정 시간(250초)에 도달하였다. 2㎍/㎖에서, APAC2(batch 5.2, 8 Hep chains)는 TT를 기준치의 4.6배로 연장시켰다 (도 21).
도 22
4㎍/㎖에서 모든 APAC1(batch 5.1, 4 Hep chains)은 APTT를 기준치의 1.4배, 5㎍/㎖의 1.7 배로 연장시켰다. 4㎍/㎖에서 APAC2(batch 5.2, 8 Hep chains)는 APTT를 기준치의 1.9배로 연장시켰다(도 22). 4㎍/㎖에서 UFH는 APTT를 기준치의 1.5배로 연장시켰다.
Hep의 접합 레벨( CL ) 및 이의 항응고제 및 항혈소판 효과와의 관련성의 결론
모든 변이형은 항응고제 및 항혈소판 (콜라겐-유발 응집 및 혈소판 응고촉진 활성)의 이중 작용을 나타낸다.
CL 6 -16:1의 APAC는 다음과 같은 항응고제 특성을 공유한다 :
(Blyscan GAG 기준으로 추산된 헤파린 농도)
· 임상 투여량 (약 3㎍/㎖)에서 UFH와 유사하게 APTT의 연장
· 높은 임상 투여량 (약 6-8㎍/㎖)에서 UFH보다 더 효율적으로 APTT의 연장
· Hep CL 6:1의 APACs는, 특히 농도가 더 높을 때, CL≥8:1 인 APAC보다 더 강력한 항응고제이다.
· CAT에서 트롬빈 생성은 적어도 UFH만큼 효율적으로, APTT 연장에 필요한 것보다 낮은 농도(1.0㎍/㎖)에서 PPP와 PRP 모두에서 지연 및 감소되었다.
· CL ≥ 8:1 인 APAC는 CL이 낮은 종보다 PRP의 트롬빈 생성을 억제하는데 더 효과적이다.
APAC는 항혈소판 특성을 가진다 :
· 시트레이트 처리된 PRP에서 콜라겐에 의해 유발되는 속도 및 최대 혈소판 응집을 감소시키는 반면, UFH는 그렇지 못하다.
· CL 8-16:1의 APAC는 공통적으로 CL 4-6:1인 분자들보다 콜라겐-유발 혈소판 응집의 더 강력한 억제제이다.
APAC
CL ≤ 6:1은 CL ≥ 8인 APAC보다 TT를 연장시킨다.
CL ≤ 6:1 은 CL ≥8인 APAC보다 APTT를 연장시킨다.
CL ≥ 8:1은 CL 4-6:1의 APAC보다, 특히 PRP에서, CAT에서의 트롬빈 생성을 억제한다.
CL ≥ 8:1은 콜라겐-유발 PRP 응집을 CL 4-6:1 APAC보다 억제한다.
전반적으로, 혈소판 응집 및 혈소판 응고촉진성 활성 모두의 억제는 HSA에 접합된 헤파린 사슬의 수가 많으면 유리하다.
APAC 및 HSA에 대한 Hep의 접합 레벨. HSA에 대한 접합 수준(CL)의 결정을 위한 Hep 농도[C], 즉, Hep 몰/몰 HSA를 분석하기 위해 2가지 상이한 방법이 사용되었다: 1. 헤파린 출발 물질 (Hep st.); 및 2. 글리코사미노글리칸 표준 (GAG st.). HSA 농도[C]는 BCA 분석으로 측정하였다.
CL CL 제조사
Hep st.
BCA		 GAG st.
BCA		 식별명 닉네임 Batch 년도 Solvias Gmbh, Switzerland
4 8 APAC1 APL001 1.1 2010 Report L09--1647-201-125
11 17 APAC2 APL00X
Fraction A		 2.1 2011 N11-02672-Report_20110623
8 12 APAC-CL8 CR1 3.1 2012 N11-13045A_REP_01
8 11 APAC-CL8 CR2 3.2 2012 N11-13045A_REP_01
10 14 APAC-CL10 CR3 3.3 2012 N11-13045A_REP_01
13 20 APAC-CL13 CR4 3.4 2012 N11-13045A_REP_01
16 26 APAC-CL16 CR5 3.5 2012 N11-13045A_REP_01
6 8 APAC-CL6 CR6 3.6 2012 N11-13045A_REP_01
4 7.5 APAC1 APL001 4.1 2013 N11-1210326_REP_01
8 15 APAC2 APL00X 4.2 2013 N11-1210326_REP_01
4 n.d. APAC1 APL001 5.1 2014 N14-10639_REP_01
8 n.d. APAC2 APL00X 5.2 2014 N14-10639_REP_01
5pM TF 및 4μM 인지질(PPL)로 유발된 혼합혈장(PP)에서, 1세대 APAC1(batch 1.1), 2세대 APAC2(batch 2.1), UFH 및 PBS의 CAT에서의 트롬빈 생성. Hep 농도는 분석에서 Blyscan (GAG st.)으로 추산되었다.
Hep 농도 vehicle 대조군과 비교할 때 % 차이
㎍/㎖ 지연시간 ETP 피크 tt 피크 지연시간 ETP 피크 tt 피크
PP 2.7 1144,5 160.8 6,7
UFH 0.25 2.3 1190 185.1 6.0 -12.4 4.9 7.6 -2.8
APAC1 (batch 1.1) 0.25 3.3 1001.5 92.7 8.8 25.2 -11.7 -46.1 43.3
APAC2 (batch 2.1) 0.25 4.2 1022 90.7 10.2 56.4 -9.9 -47.3 64.8
UFH 0.5 2.3 1000.5 122.4 6.3 -12.4 -11.8 -28.9 2.6
APAC1 (batch 1.1) 0.5 7.0 691 42.7 19.0 163.2 -39.1 -75.2 208.3
APAC2 (batch 2.1) 0.5 8.3 775.5 56.8 18.9 213.5 -31.6 -67.0 205.7
UFH 1.0 3.0 650 39.1 8.8 12.4 -42.7 -77.3 43.3
APAC1 (batch 1.1) 1.0 17.5 427 25.5 31.4 558.6 -62.3 -85.2 408.6
APAC2 (batch 2.1) 1.0 17.0 601 42.7 28.4 539.8 -47.0 -75.2 359.8
UFH 1.5 3.8 343 17.0 15.7 44.0 -69.8 -90.1 154.1
APAC1 (batch 1.1) 1.5 34.6 0 0.8 49.1 1198.9 - -99.5 695.5
APAC2 (batch 2.1) 1.5 0.0 0 0.0 0.0 - - - -
PBS 0 2.7 1134 172.1 6.2 0.0 0.0 0.0 0.0
5pM TF와 4μM PPL로 유발된 혼합혈장(PP)에서, APAC-CL6 내지 16 및 PBS의 CAT에서의 트롬빈 생성. Hep 농도는 분석에서 Blyscan (GAG st.)으로 추산되었다.
Hep 농도 vehicle 대조군과 비교할 때 % 차이
㎍/㎖ 지연시간 ETP 피크 tt 피크 지연시간 ETP 피크 tt 피크
PP 2.7 1123.0 152.7 6.8
APAC-CL8 (batch 3.1) 0.25 3.5 1059.0 102.1 9.2 16.7 2.1 -35.6 44.9
APAC-CL8 (batch 3.2) 0.25 3.5 973.5 94.7 9.0 16.7 -6.2 -40.3 42.2
APAC-CL10 (batch 3.3) 0.25 3.5 1049.5 103.1 9.2 16.7 1.2 -35.0 44.9
APAC-CL13 (batch 3.4) 0.25 3.8 1018.0 95.7 9.8 27.7 -1.9 -39.7 55.3
APAC-CL16 (batch 3.5) 0.25 4.2 995.5 88.3 10.2 39.0 -4.0 -44.3 60.7
APAC-CL6 (batch 3.6) 0.25 3.2 1064.5 117.8 7.8 5.7 2.6 -25.8 23.7
APAC-CL8 (batch 3.1) 0.5 5.5 819.0 55.9 15.8 83.3 -21.1 -64.8 150.1
APAC-CL8 (batch 3.2) 0.5 5.3 829.0 59.7 15.5 77.7 -20.1 -62.4 144.9
APAC-CL10 (batch 3.3) 0.5 5.5 871.5 61.4 15.8 83.3 -16.0 -61.3 150.1
APAC-CL13 (batch 3.4) 0.5 5.7 892.5 64.3 15.7 89.0 -14.0 -59.5 147.6
APAC-CL16 (batch 3.5) 0.5 6.8 826.5 60.9 16.8 127.7 -20.3 -61.6 165.9
APAC-CL6 (batch 3.6) 0.5 4.2 928.5 70.0 11.2 39.0 -10.5 -55.9 76.5
APAC-CL8 (batch 3.1) 1.0 16.2 527.0 33.2 29.0 439.0 -49.2 -79.1 358.1
APAC-CL8 (batch 3.2) 1.0 16.3 514.0 31.3 29.8 444.3 -50.5 -80.3 371.2
APAC-CL10 (batch 3.3) 1.0 20.8 473.5 29.2 34.0 594.3 -54.4 -81.6 437.1
APAC-CL13 (batch 3.4) 1.0 22.2 507.5 32.1 34.8 639.0 -51.1 -79.8 450.2
APAC-CL16 (batch 3.5) 1.0 25.3 0.0 40.0 38.3 744.3 -100.0 -74.8 505.5
APAC-CL6 (batch 3.6) 1.0 9.2 648.5 39.9 22.0 205.7 -37.5 -74.8 247.6
APAC-CL8 (batch 3.1) 1.5 19.5 0.0 0.4 31.5 550.0 - -99.7 397.6
APAC-CL8 (batch 3.2) 1.5 48.3 0.0 3.7 58.2 1511.0 - -97.7 819.0
APAC-CL10 (batch 3.3) 1.5 49.5 0.0 1.5 56.8 1550.0 - -99.0 797.8
APAC-CL13 (batch 3.4) 1.5 21.5 0.0 0.5 25.7 616.7 - -99.7 305.5
APAC-CL16 (batch 3.5) 1.5 0.0 0.0 0.0 0.0 - - - -
APAC-CL6 (batch 3.6) 1.5 26.3 0.0 25.3 42.0 777.7 - -84.1 563.5
PBS 0 3.0 1037.5 158.6 6.3 0 0 0 0

Claims (33)

  1. 각각 10 내지 21 KDa의 분자량을 가지는 복수의 헤파린 사슬이 복수의 이질적양기능성 크로스링커(hetero-bi-functional cross-linker) 분자 또는 동질적양기능성 크로스링커(homo-bi-functional cross-linker) 분자들을 통해 부착된 인간혈장단백질을 포함하고,
    여기에서, 상기 혈장단백질에 부착된 상기 헤파린 사슬의 개수는 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 및 16을 포함하는 군으로부터 선택되는, 항혈소판 및 항응고제(antiplatelet and anticoagulant, APAC) 활성을 모두 가진 항혈전증 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 분자는 표적 작용을 가지고, 이에 따라 적용 부위에서 24시간, 48시간, 50시간 또는 120시간을 초과하여 유지되는, 항혈전증 분자.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혈장단백질은 알부민, 글로불린, 피브리노겐, 혈청 알부민 및 α2-고분자글로불린을 포함하는 또는 이들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 항혈전증 분자.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 헤파린은 비분획 헤파린(unfractionated heparin)인, 항혈전증 분자.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 헤파린은 포유류 유래인, 항혈전증 분자.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 헤파린은 사람 또는 돼지 또는 소 유래인, 항혈전증 분자.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 링커분자는 한 분자의 헤파린과 결합하는 것인, 항혈전증 분자.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 링커분자는 아민 링커이며, 이에 따라 상기 헤파린 및 혈장단백질의 아미노기에 연결되는, 항혈전증 분자.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 링커는 이황화물다리를 이용하여 상기 헤파린과 혈장단백질을 접합하는, 항혈전증 분자.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 링커는 3-(2-피리딜다이싸이오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터 (3-(2-Pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester, SPDP) 링커 또는 3,3'-다이싸이오프로피온산 다이(N-하이드록시석신이미드 에스터)(3,3'-Dithiodipropionicacid di(N-hydroxysuccinimide ester), DTSP) 링커인 항혈전증 분자.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 분자의 일반식은 하기와 같은, 항혈전증 분자:
    (Hep-링커)n-PIPr
    상기 n은 4 내지 16;
    PIPr은 혈장단백질; 및
    각각의 헤파린(Hep) 사슬은 10 내지 21 KDa임.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 분자의 일반식은 하기와 같은, 항혈전증 분자:
    (Hep-NH-CO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-CO-NH)n-PlPr
    상기 n은 4 내지 16;
    PIPr은 혈장단백질; 및
    각각의 헤파린(Hep) 사슬은 10 내지 21 KDa임.
  13. 제1항에 있어서,
    APAC 분자는 상기 혈장단백질에 부착된 4, 5 또는 6개의 헤파린 사슬을 갖는 것인, 항혈전증 분자.
  14. 제1항에 있어서,
    APAC 분자는 상기 혈장단백질에 부착된 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 헤파린 사슬을 갖는 것인, 항혈전증 분자.
  15. 제1항에 있어서,
    APAC 분자는 상기 혈장단백질에 부착된 7개의 헤파린 사슬을 갖는 것인, 항혈전증 분자.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 각 헤파린 사슬은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21 KDa을 포함하는 군으로부터 선택되는 분자량을 갖는, 항혈전증 분자.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 헤파린은 재조합체인 항혈전증 분자.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 혈장단백질은 재조합체인 항혈전증 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항혈전증 분자를 포함하는 혈전증 치료용 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 조성물은 국소적으로 작용하는 것인, 약학적 조성물.
  21. 제19항에 있어서,
    APAC 분자는 링커를 통해 상기 혈장단백질과 부착된 4, 5 또는 6개의 헤파린 사슬을 가지는 것인, 약학적 조성물.
  22. 제19항에 있어서,
    APAC 분자는 링커를 통해 상기 혈장단백질과 부착된 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 헤파린 사슬을 가지는 것인, 약학적 조성물.
  23. 제19항에 있어서,
    APAC는 혈전증 합병증; 또는 재폐색 방지용 혈전용해 치료법; 또는 외인성 혈관성형술; 또는 혈관수술 또는 미세혈관 수술; 또는 동맥중재술; 또는 방향성 동맥절제술; 또는 말초 또는 폐동맥 혈전내막제거술; 또는 혈소판성 동맥혈전증; 또는 혈관 또는 미세혈관 손상; 또는 외인성 중재술; 또는 카테터의 사용, 또는 안티트롬빈(AT) 결핍증 또는 혈소판성 동맥혈전증; 또는 혈관 또는 미세혈관 손상을 치료 또는 예방하기 위해 사용되는 것인, 약학적 조성물.
  24. 제19항에 있어서,
    APAC 분자는 허혈-재관류 손상 또는 급성신부전 또는 심근경색증 또는 뇌졸중 또는 말초동맥 폐색성 질환 또는 장간막 허혈을 치료 또는 예방하기 위해 사용되는 것인, 약학적 조성물.
  25. 1) 비분획성 헤파린(Hep) 사슬을 설프히드릴(-SH)기를 갖는 반응산물을 생산하도록 변형시키는 단계;
    2) 인간혈장단백질을 피리딜 다이싸이올(-PDP)기를 갖는 반응산물을 생산하도록 변형시키는 단계; 및
    3) 이질적양기능성(heterobifunctional) 크로스링커를 이용하여 1)의 반응산물과 2)의 반응산물을 연결시키는 단계를 포함하는,
    항혈소판 및 항응고제(antiplatelet and anticoagulant, APAC) 활성을 모두 가진 항혈전증 분자를 제조하는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 링커는 3-(2-피리딜다이싸이오)프로피온산 N-하이드록시석신이미드 에스터 (3-(2-Pyridyldithio)propionic acid N-hydroxysuccinimide ester, SPDP) 링커인, 방법.
  27. 1) 비분획성 헤파린(Hep) 사슬을 N-하이드록시석신이미드에스터(-NHS)기를 갖는 반응산물을 생산하도록 변형하는 단계;
    2) 동질적양기능성(homo-bi-functional) 크로스링커를 이용하여 1)의 반응산물과 인간혈장단백질을 연결하는 단계를 포함하는,
    항혈소판 및 항응고제(antiplatelet and anticoagulant, APAC) 활성을 모두 가진 항혈전증 분자를 제조하는 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 링커는 3,3'-다이싸이오프로피온산 다이(N-하이드록시석신이미드 에스터)(3, 3'-Dithiodipropionicacid di(N-hydroxysuccinimide ester), DTSP) 링커인 방법.
  29. 제25항 또는 제27항에 있어서,
    상기 항혈전증 분자는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 또는 한외/정용여과에 의해 정제된 것인, 방법.
  30. 제25항 또는 제27항에 있어서,
    상기 혈장단백질은 알부민, 글로불린, 피브리노겐, 혈청 알부민 및 α2-고분자글로불린을 포함하는 또는 이들로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 혈장단백질은 혈청알부민 또는 α2-고분자글로불린인, 방법.
  32. 삭제
  33. 삭제
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