JP2016515529A - 無塩条件下で疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用するタンパク質精製 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2013年3月15日に出願された米国仮出願第61/791,238号の利益を米国特許法第119条(e)に基づいて主張し、その全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)は、疎水性に基づいて分子を分離する。HICは、生物学的活性を維持しつつタンパク質を精製するための有用な分離技法である。
本明細書において提供される方法は、抗体を精製するのに特に有用である。抗体(複数形と交換可能に使用される)は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも1つの抗原識別部によって、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質またはポリペプチドなどの標的と特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、そのままの(例えば全長)ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合性フラグメント(Fab、Fab’、F(ab’)2及びFvなど)、単一鎖(scFv)、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二特異性抗体、線状抗体、単一鎖抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、ならびに抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体及び共有結合修飾抗体を含む、必要とされる特異性の抗原識別部を含む免疫グロブリン分子の他の修飾配置を包含する。抗体は、IgD、IgE、IgG、IgAまたはIgM(またはそのサブクラス)などの任意のクラスの抗体を含み、抗体が何らかの特定のクラスのものである必要はない。免疫グロブリンは、重鎖の不変領域の抗体アミノ酸配列に応じて異なるクラスに帰属させてもよい。5つの主要なクラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、これらの幾つかは、サブクラス(イソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2にさらに分けられてもよい。幾つかの実施形態において、本開示の抗体はIgG1抗体である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する、重鎖不変領域は、それぞれアルファ、デルタ及びイプシロン、ガンマ及びミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユット構造及び三次元配置はよく知られている。
この検討は、既存の高濃度塩HICFTステップ(対照)とプロセス性能において匹敵する、代替の無塩条件下での疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)素通り(FT)ステップの特定を対象とする。
材料
この検討において使用したmAbはすべて、CHO細胞株中で製造した。mAbA−mAbDは、それぞれ〜7.2、8.7、7.4及び6.5の等電点を有するIgG1であった。モデルタンパク質リゾチームは、シグマ(セントルイス、ミズーリ)から購入した。フェニルセファロースHS、カプトフェニルHS、ブチルセファロース4FF及びオクチルセファロース4FFなどのアガロース系樹脂は、GEヘルスケア(ピスカタウェイ、ニュージャージー)から得た。フェニルトヨパール650M、ブチルトヨパール650M及びヘキシルトヨパール650Cなどのメタクリラート系HIC樹脂は、東ソーバイオサイエンス(モンゴメリビル、ペンシルベニア)から得た。SEC分析に使用したTSKゲルG3000 SWXLカラム(7.8mm x 300mm)は、東ソーバイオサイエンス(モンゴメリビル、ペンシルベニア)から購入した。化学物質及び塩はすべてJTベーカー(フィリップスバーグ、ニュージャージー)から購入した。
クロマトグラフィーの実験はすべて、GEヘルスケア(ウプサラ、スウェーデン)からのAKTAエキスプローラークロマトグラフィーシステムで実行した。HPLC分析は、ウォーターズ(ミルフォード、マサチューセッツ)HPLC e2695分離モジュールで実行した。タンパク質試料の吸光度は、パーキンエルマー(ウォルサム、マサチューセッツ)からのラムダ25 UV/可視分光光度計を使用して測定した。
様々なHIC樹脂についてのリゾチームの直線状保持データは、D0.66cm x L10cmのカラムを使用して、パルス注入(〜5mg/mlの濃度のタンパク質0.1mL)を使用する直線状勾配実験から得られた。塩(硫酸アンモニウム)の下降する勾配を、pH7.0でリン酸緩衝系中の15カラム容量にわたって1.5Mから0Mで実施した。
HIC分取実験を素通りモードで実施した。D1cm x L20cmのカラムを各実験に使用した。カラムは、移動相(例えば平衡)緩衝剤の3カラム容量でまず平衡させた。その緩衝剤の移動相塩濃度及びpHは、結果の項で説明したようにタンパク質及び樹脂の組み合わせに特異的であった次いで、上に述べたようにカラムに特定の量のタンパク質を装填した。UVが上昇し始めるにつれて、素通りピークの収集が開始され、生成物は移動相(例えば平衡)緩衝剤を用いて追跡した。カラムを3−5カラム容量の水で浄化/洗浄し、0.5NのNaOHで用いて衛生的にした。6分の滞留時間をプロセスの全体にわたって使用した。
試料のHMW水準は、分析的なサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によってTSKゲルG3000 SWXLカラムを使用して測定した。100mM NaPO4、200mM NaCl、pH6.8及び1mL/分の流速の移動相を使用した。溶出ピークはUV吸光度によって280nmで検出した。
本明細書において開示される特色はすべて、任意に組み合わせられてもよい。本明細書において開示される各特色は、同一、等価または同様の目的に役立つ代替の特色と置き換えられてもよい。したがって、特に断らない限り、開示される各特色は、総括的な一連の等価または同様の特色の単なる例である。
本発明の幾つかの実施形態が本明細書に記載され例証されたが、当業者は、本明細書において記載された機能を果たし、及び/または、結果及び/または1つもしくは複数の利点を得るために、様々な他の手段及び/または構造の構想を容易に描くであろう。そのような変形及び/または修正はそれぞれ、本明細書において記載された発明の実施形態の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書において記載されたパラメーター、寸法、材料及び配置はすべて、例示であることが意図され、実際のパラメーター、寸法、材料及び/または配置は、本発明の教示が使用される具体的な用途(複数可)に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、単なるルーチン実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態との多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示され、添付された特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、具体的に記載され請求される以外に、本発明の実施形態が実施されてもよいことは理解されるはずである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載される個々の特色、システム、物品、材料、キット及び/または方法を対象とする。さらに、そのような特色、システム、物品、材料、キット及び/または方法の2以上の任意の組み合わせは、そのような特色、システム、物品、材料、キット及び/または方法が互に矛盾しない限り、本発明の範囲内に包含される。
Claims (9)
- 抗体の精製方法であって、
疎水性配位子を含有するマトリクスを使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーに素通り式で溶液中の抗体をかけることを含み、ここで、前記溶液は塩を含まず、約5.0から約7.0のpHを有する前記方法。 - 抗体の精製方法であって、
塩を含まず、約5.0から約7.0のpHを有する溶液中の抗体を準備することと、
疎水性配位子を含有するマトリクスに前記溶液を装填することと、
前記抗体を含む素通り画分を収集することとを含む前記方法。 - 前記溶液のpHが、約5.0から約6.5、約5.0から約6.0、約5.5から約7.0、または約6.0から約7.0である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記マトリクスが、ヒドロキシル化メタクリル酸ポリマー、アガロースまたはセファロースを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疎水性配位子が、フェニル基、ブチル基、ヘキシル基またはオクチル基である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗体が、ヒト抗体、マウス抗体またはキメラ抗体である、請求項6に記載の方法。
- 抗体の精製方法であって、
ヘキシル基を含有するヒドロキシル化メタクリル酸ポリマーマトリクスを使用して、疎水性相互作用クロマトグラフィーに素通り式で溶液中の抗体をかけることを含み、ここで、前記溶液は塩を含まず、約5.0から約7.0のpHを有する前記方法。 - 抗体の精製方法であって、
塩を含まず、約5.0から約7.0のpHを有する溶液中の抗体を準備することと、
ヘキシル基を含有するヒドロキシル化メタクリル酸ポリマーマトリクスに前記溶液を装填することと、
前記抗体を含む素通り画分を収集することとを含む前記方法。
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