KR20140033126A

KR20140033126A - 단일 유닛 크로마토그래피 항체 정제

Info

Publication number: KR20140033126A
Application number: KR1020137033190A
Authority: KR
Inventors: 헨데릭 이 빈스트라; 디데릭 알 크레머; 이슬라스 마리아 펄라스카; 마크 케이 도이븐
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2011-06-16
Filing date: 2012-06-08
Publication date: 2014-03-17
Also published as: CN103619868A; AR086938A1; US20140187749A1; CL2013003596A1; MX2013014615A; IL229763A0; EA201400024A1; WO2012171853A1; AU2012269240A1; AU2012269240B2; CA2838476A1; BR112013031906A2; EP2721052A1; JP2014529330A

Abstract

본 발명은 최소한, 유체 통과 모드의 인-라인 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 처리 및 혼합 모드 크로마토그래피(MiMo) 처리를 포함하는 중간 정제 및 연마 단계를 포함하는, 생물반응기에서 생성된 단백질 혼합물로부터 항체를 정제하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 직렬 연결된 음이온 교환 크로마토그래피 부분 및 혼합 모드 크로마토그래피 부분을 둘 다 포함하는 단일 작동 유닛에 관한 것으로, 상기 유닛은 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 상류 말단에 유입구 및 혼합 모드 크로마토그래피 부분의 하류 말단에 유출구를 포함하며, 또한 음이온 교환 크로마토그래피 부분과 혼합 모드 크로마토그래피 부분 사이에 유입구를 포함한다.

Description

단일 유닛 크로마토그래피 항체 정제{SINGLE UNIT CHROMATOGRAPHY ANTIBODY PURIFICATION}

본 발명은 항체의 단일 유닛 정제 방법 및 상기 방법에 사용될 수 있는 장비에 관한 것이다.

약학적 용도에 사용하기 위해, 세포 배양에 의해 생성된 단클론성 항체의 정제는 많은 단계를 포함하는 공정이다. 항체는 필수적으로 모든 잠재적으로 해로운 오염물, 예를 들면, 항체를 생성하는 세포로부터 발생되는 단백질 및 DNA, 인슐린, FEG 에터 및 소포제와 같은 배지 성분, 및 임의의 잠재적으로 존재하는 감염 물질, 예를 들어, 바이러스 및 프리온을 함유하지 않아야 한다.

항체 단백질을 생성하는 세포 배양물로부터 항체의 정제를 위한 전형적인 방법은 문헌 [BioPharm International June 1, 2005, "Downstream Processing of Monoclonal Antibodies: from High Dilution to High Purity"]에 기술되어 있다.

항체는 세포, 예를 들면, 하이브리도마 세포 또는 형질전환 숙주 세포(차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포, 마우스 골수종 유래 NS0 세포, 새끼 햄스터 신장(Baby Hamster Kidney) 세포 및 인간 망막-유래 PER.C6(등록상표) 세포와 같이)에 의해 생성되기 때문에, 입자상 세포 물질은 세포 배양액으로부터, 바람직하게는 정제 공정에서 초기에 제거되어야 할 것이다. 공정의 상기 부분을 여기서는 "정화(clarification)"로 나타내고 있다. 이어서 또는 정화 단계의 일부로서, 항체는 통상적으로 결합 및 용출 크로마토그래피 단계(IgG의 경우에 흔히 고정화 단백질 A 사용)를 이용하여 대략적으로 약 80% 이상까지 정제된다. 여기에서 "포획(capturing)"으로 나타낸 상기 단계는 항체의 첫번째 상당한 정제를 야기할 뿐 아니라, 부피의 상당한 감소, 따라서 생성물 농도의 상당한 감소를 야기할 수도 있다. 대안적인 포획 방법은, 예를 들면, 팽창층 흡착(Expanded Bed Adsorption, EBA), 2-상 액체 분리(예를 들면, 폴리에틸렌글리콜 사용), 또는 이액성(lyotropic) 염(예를 들면, 황산암모늄)을 사용한 분별 침전이다.

정화 및 포획에 이어서, 항체는 더 정제된다. 일반적으로, 잔류 불순물을 충분히 제거하기 위해 포획후에 적어도 두 크로마토그래피 단계가 필요하다. 포획후의 크로마토그래피 단계는 흔히 중간 정제 단계로 불리며, 최종 크로마토그래피 단계는 일반적으로 연마 단계로 불린다. 상기 단계들은 각각 일반적으로 배치 모드로 단일 유닛 공정으로서 수행되며, 상기 단계들 중 적어도 하나는 일반적으로 결합 및 용출 모드로 수행된다. 또한, 각각의 크로마토그래피 단계는, 예를 들면, pH, 전도도 등에 대해 특정 부하(loading) 조건을 필요로 한다. 그러므로, 부하물을 필요한 조건으로 조절하기 위해 각각의 크로마토그래피 단계 전에 추가의 조작이 수행되어야 한다. 상기 언급한 것들 모두가 공정을 복잡하고 시간 소모적으로 만든다. 일반적으로 상기 단계들 동안 실질적으로 제거된 불순물은 공정 유도성 오염물, 예를 들면, 숙주 세포 단백질, 숙주 세포 핵산, 배양 배지 성분(존재하는 경우), 단백질 A(존재하는 경우), 내독소(존재하는 경우) 및 미생물(존재하는 경우)이다. 상기 항체 정제를 위한 여러 방법들이 최근의 특허 공보들에 기술되었다.

WO 2010/062244 호는 단클론성 항체와 같은 단백질의 분리 및 정제를 위한 수성 2상 추출 보강 침전 방법에 관한 것이다. 항체의 후속 추가 정제를 위해, 2가지 대안이 기술되어 있다: (1) 결합 및 용출 모드의 양이온 교환 크로마토그래피 후, 유체 통과(flow through) 모드의 음이온 교환, 또는 (2) 유체 통과 모드의 제 1 다중모드(multimodal)(또는 혼합-모드(mixed-mode)) 크로마토그래피 후, 유체-통과 모드의 음이온 교환. 대안 (2)의 2개의 크로마토그래피 유닛은 하나의 단일 유닛 공정으로 작동되지 않으며 어느 것도 연마 목적에 사용되지 않는다.

WO 2005/044856 호는 선택적으로 음이온 교환 크로마토그래피와 함께 하이드록시아파타이트 수지를 사용하여 항체 제제로부터 고분자량 응집체의 제거에 관한 것이다. 두 크로마토그래피 처리 모두 특히 유체-통과 방법으로 기술되었지만, 상기 처리들은 별개의 공정으로 수행된 것으로 기술되었다.

WO 2011/017514 호는 후속 인-라인(in-line) 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 의한 항체 및 기타 Fc-함유 단백질의 정제에 관한 것이다. 두 크로마토그래피 처리는 모두 일반적으로 결합-및-용출 분리로서 수행되었지만, 두번째 단계는 유체-통과 공정으로 작동될 수도 있다.

WO 2005/082483 호는 두 후속 혼합 모드 크로마토그래피 단계에 의한 항체의 정제에 관한 것으로, 여기서 제 1 단계의 크로마토그래피 물질은 그 결합에 의해 항체가 결합될 수 있는 양이온-교환기 및 방향족 기를 둘 다 갖는 혼합-모드 양이온 교환 수지이고, 제 2 단계의 크로마토그래피 물질은 혼합 모드 음이온 교환 수지이다. 제 2 크로마토그래피 단계는 유체-통과 모드로 수행될 수 있다. 두 크로마토그래피 단계는 별개의 공정으로 기술되어 있다.

상기 기술된 방법들의 단점은 긴 작동 시간, 높은 가변 비용 및 높은 고정 비용(노동 비용으로 인한)이다.

본 발명의 한 태양에 따르면, 세포 배양-생성된 항체로부터 잔류 불순물의 매우 효과적인 제거가 둘다 유체-통과 모드의, 직렬 인-라인 음이온 크로마토그래피(AEX) 및 혼합-모드(MiMo) 크로마토그래피를 이용하여 달성될 수 있다. MiMo 크크로마토그래피 단계 전에, AEX 단계로부터의 유체-통과물의 인-라인 컨디셔닝(conditioning)(예를 들면, 적당한 완충액의 혼합에 의해)은 유체 통과물을 MiMo 크로마토그래피를 위한 pH 및 전도도에 대해 정확한 조건으로 조절하기 위해 사용된다.

상기 신규 방법의 이점은 작동 시간 및 노동의 상당한 감소 및 따라서 더 낮은 작동 비용이다. 또한, 모든 유닛이 불순물에 대해서만 충분한 결합 용량을 필요로 하고 생성물에 대해서는 그렇지 않은 유체-통과 모드로 작동하기 때문에, 더 작은(따라서 비용이 덜 드는) 크로마토그래피 유닛이 필요하다.

그러므로, 본 발명은, 적어도 중간 정제 및 연마 단계를 포함하는, 생물반응기에서 생성된 세포 배양액으로부터 항체를 정제하기 위한 방법으로서, 상기 신규한 정제 단계가 복합 직렬 인-라인 AEX 및 MiMo 크로마토그래피를 포함하는 방법으로 정의될 수 있다. 상기 방법은 유체-통과 분획으로서 분리 혼합물을 제공하는 AEX 크로마토그래피 단계에 이어, 유체-통과 분획으로서 정제된 항체 제제를 제공하는 MiMo 크로마토그래피 단계를 직렬 인라인으로 적용함으로써 수행될 수 있으며, 이때 정제된 항체 제제는 하나 이상의 추가의 정제 단계에 적용된다.

도 1은 음이온 교환 크로마토그래피 부분 및 양이온 교환 크로마토그래피 부분 둘 다를 포함하는 단일 작동 유닛이다. 완충액 A는 AEX 단계의 최적 작동에 적합한 컨디셔닝 및 세척 완충액이다. 완충액 B는 산성 용액을 함유하며 MiMo 단계의 작동에 최적 조건을 달성하기 위해 필요한 비로 부하물/완충액 A에 혼합된다. 혼합 비는 고정 부피 혼합 유동을 이용하여 달성될 수 있거나, 또는 예를 들면, pH 산출가를 기준으로 피드백 루프에 의해 자동적으로 제어될 수 있다. MC는 임의 유형의 정적 혼합기를 포함할 수 있는 선택적 혼합 챔버이다.
L = 부하물
PA = 펌프 A
PB = 펌프 B
AEX = 음이온 교환 유닛
MiMo = 양이온 교환 유닛
pH = pH 센서
σ = 전도도 센서
PF = 선택적 예비-필터

따라서, 본 발명의 맥락에서, "분리 혼합물"은 본 발명에 따른 제 1 크로마토그래피 단계로부터 생성되는 용액이고, "정제된 항체 제제"는 본 발명에 따른 제 2 크로마토그래피 단계로부터 생성되는 용액이다. 이것은 본 출원 전체에 걸쳐 상기 용어에 준수되는 것이다.

제 1 크로마토그래피 단계에 앞서, 생물반응기에서 생성된 세포 배양액은 일반적으로 정화될 것이다(즉, 전세포 및 세포 파편과 같은 모든 세포 물질들이 제거됨).

또한, 제 1 크로마토그래피 단계에 앞서, 상기 제 1 단계를 위한 pH 및 전도도의 측면에서 최적 조건을 보장하기 위해 컨디셔닝 용액을 세포 배양액 또는 항체 함유 용액에 첨가할 수 있다.

특정 태양에서, 본 발명에 따른 방법은 AEX 및 MiMo의 복합 크로마토그래피를 단일 유닛 공정으로 수행하는 것을 포함한다.

본 발명의 맥락에서, "항체" 및 복수형 "항체들"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 임의의 단백질을 의미한다. 그의 천연 형태에서 항체(또는 면역글로불린)은 항원성 자극제, 예를 들면, 세균, 바이러스, 기생충 또는 이식 장기에 반응하여 혈액 또는 림프 내로 분비되고 항원에 특이적으로 결합함으로써 항원을 중화시키는 B 세포의 표면상의 Y-형 단백질이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 항체는 또한 천연 또는 인공 항체의 항원 결합 부분을 포함한다. 용어 항체는 또한 천연 항체와 유사한 상호작용 메카니즘을 근거로 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 비-천연(따라서 인공) 단백질을 포함하며, 따라서 또한, 예를 들면, 한 종(예, 마우스)으로부터 유래된 항원-결합 부분 및 또 다른 종(예, 인간)으로부터 유래된 비-항원-결합 부분으로 이루어진 키메라 항체를 포함한다.

"혼합-모드 크로마토그래피(MiMo)"는 단백질의 흡착 및/또는 탈착에 하나보다 많은 상호작용이 일어나는 물질을 사용하는 크로마토그래피 유형을 의미한다. 상기 상호작용은 다음의 유형일 수 있다: 음이온성, 양이온성, 소수성, 친화성, π-π, 호황성(thiophilic), 크기 배제. 혼합 모드 물질의 공지되어 있는 예는 하이드록시아파타이트(금속 친화성, 음이온성 및 양이온성 상호작용), 캅토(Capto, 등록상표) 점착물(음이온성 및 소수성 상호작용) 및 MEP 하이퍼셀(HyperCel, 등록상표)(양이온성 및 소수성 상호작용).

"직렬 인-라인 AEX 및 MiMo"는 AEX 장치의 유출물이 중간 저장 없이 MiMo 장치 내로 공급되는 방식으로 AEX 및 MiMo가 직렬로 연결되는 것을 의미한다.

"유체-통과 분획"은 본원에서 용출 유체와 실질적으로 동일한 속도로 크로마토그래피 컬럼에서 유출되는 부하된 항체-함유 분획의 적어도 일부를 의미한다. 상기 분획은 실질적으로 용출시 컬럼 상에 보유되지 않는다. 따라서, 항체가 아니라 불순물이 각각의 크로마토그래피 물질에 결합되도록 하는 조건이 선택된다.

대규모 생산 목적으로 본 발명에 따른 방법(유체-통과 모드 사용)은 목적 항체의 결합 및 용출을 사용하는 선행의 개시된 방법보다 훨씬 더 빠른 분리를 제공하는 것으로 밝혀졌다.

본 발명에 따르면, 항체를 함유하는 분리 혼합물은 인-라인으로 컨디셔닝된다. 이 때문에, 분리 혼합물의 조성 및/또는 성질, 예를 들어, pH 및/또는 전도도 및/또는 본 발명에 따른 제 2 크로마토그래피 단계에서의 최적 성능을 위한 특정 이온 성분의 존재 및 양을 변화시키기 위해, 분리 혼합물은 적절량의 적합한 컨디셔닝 용액으로 보충된다.

상기 인용된 선행 기술 문헌 어디에서도, 두 크로마토그래피 단계 사이에 인-라인 컨디셔닝은 적용되거나 제시되지 않았으며, 놀랍게도 본 발명에 따른 제 2 크로마토그래피 단계로 유입되기 전에 유체(분리 혼합물)의 인-라인 컨디셔닝에 의해 매우 우수한 분리 결과가 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 적어도 중간 정제 및 연마 단계를 포함하는, 생물반응기에서 생성된 단백질 혼합물로부터 항체의 정제 방법에 관한 것으로, 여기서, 상기 중간 정제 및 연마 단계는 유체-통과 분획으로서 분리 혼합물을 제공하는 직렬의 인-라인 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 이어, 유체 통과 분획으로서 정제된 항체 제제를 제공하는 혼합-모드 크로마토그래피(MiMo)를 포함하고, 상기 정제된 항체 제제는 하나 이상의 추가의 정제 단계에 적용되며, 상기 혼합 모드 크로마토그래피 전에 분리 혼합물은 pH 및/또는 전도도 및/또는 혼합-모드 크로마토그래피 단계에서 항체로부터 불순물 제거를 위한 특정 이온 성분의 농도 또는 유형을 조정하기 위해 적절량의 적합한 조절 용액으로 보충된다.

용어 "컨디셔닝 용액(conditioning solution)" 및 "조절 용액(adjusting solution)"은 상호교환적으로 사용되며, 본원에서 본 발명에 따른 제 2 (MiMo) 크로마토그래피 단계에 분리 혼합물을 공급하기 전에 분리 혼합물에 첨가되는 용액을 의미한다.

"적절량의 적합한 조절 용액"은 본원에서, 분리 혼합물과 혼합될 때 MiMo 물질에 관련된 불순물의 대부분의 흡착을 야기하지만 생성물의 실질적인 결합은 촉진하지 않을 하나 이상의 염 또는 임의의 다른 첨가제를 선택적으로 함유하는 임의의 산성, 중성 또는 알칼리성 용액을 의미한다. 각각의 정제 공정에서, 최적 pH, 염 시스템의 바람직한 유형, 및 조절 용액중 최적량이 설정되어야 한다.

바람직하게, 언급한 용액의 pH는 항체를 함유하는 분리 혼합물의 pH와 동일할 것이며, 최적 전도도 값은 적절량의 하나 이상의 염의 첨가 또는 분리 혼합물에 존재하는 염(들)의 희석의 결과일 것이다. 염의 음이온은 바람직하게는 포스페이트, 설페이트, 아세테이트, 클로라이드, 브로마이드, 니트레이트, 클로레이트, 요오다이드 및 티오시아네이트 이온으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 염의 양이온은 바람직하게는 암모늄, 루비듐, 칼륨, 나트륨, 리튬, 마그네슘, 칼슘 및 바륨 이온으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 바람직한 염은 황산암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 인산암모늄, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화칼륨 및 염화나트륨이다. 사용될 수 있는 다른 첨가제는 에탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 MiMo 크로마토그래피 단계를 최적화시키도록 작용하는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 화합물이다.

산성 조절 용액용 산성 성분은 시트르산(또는 그의 일 또는 이 염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 인산(또는 그의 일 또는 이 염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 아세트산, 염산, 황산과 같은 화합물로부터 선택될 수 있다.

알칼리성 조절 용액용 알칼리성 성분은 수산화 나트륨 또는 칼륨(또는 그의 일 또는 이 염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄과 같은 화합물로부터 선택될 수 있으나, 당해 분야에 공지된 임의의 다른 알칼리성 성분도 상기 목적으로 사용될 수 있다.

바람직하게, 필요한 조절 용액은 생성물의 최소 희석물을 가지도록 소량으로 보충될 것이다.

바람직하게, 상기 경우에서 적절량의 적절한 조절 용액으로 분리 혼합물을 보충하는 것은, 예를 들면, MiMo 크로마토그래피 단계 이전에 공정 스트림 내에(예를 들면, 혼합 챔버 내에) 언급한 조절 용액의 인-라인 혼합에 의한 단일 유닛 공정의 일부이다.

본 발명에 따른 AEX 크로마토그래피는 수지를 함유하는 전통적인 충전층 컬럼, 모노리스(monolith) 물질을 함유하는 컬럼, 적합한 크로마토그래피 매질을 함유하는 방사상 컬럼, 흡착 막 유닛, 또는 적절한 매질 및 음이온 교환기로 작용하는 리간드를 사용하는, 당해 분야에 공지된 임의의 다른 음이온 교환 크로마토그래피 장치로 나타낼 수 있는 AEX 유닛에서 수행될 수 있다. AEX 컬럼에서 크로마토그래피 물질은 강 또는 약 양이온 리간드가 결합되는 입자상 지지체 물질로서 존재할 수 있다. 막-유형 음이온 교환기는 강 또는 약 양이온 리간드가 결합되는 하나 이상의 시트 형태의 지지체 물질로 이루어진다. 지지체 물질은 유기 물질 또는 무기 물질 또는 유기 및 무기 물질의 혼합물로 이루어질 수 있다. 적합한 유기 물질은 아가로스 기본 매질 및 메타크릴레이트이다. 적합한 무기 물질은 실리카, 세라믹 및 금속이다. 막-형태 음이온 교환기는 AEX 리간드를 함유하는 친수성 폴리에터설폰으로 이루어질 수 있다. 적합한 강 AEX 리간드는, 예를 들면, 4급 아민기를 기본으로 한다. 적합한 약 AEX 리간드는, 예를 들면, 1급, 2급 또는 3급 아민기 또는 당해 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 리간드를 기본으로 한다.

본 발명에 따른 MiMo 크로마토그래피는 수지를 함유하는 전통적인 컬럼, 모노리스 물질을 기본으로 하는 컬럼, 적합한 크로마토그래피 매질을 함유하는 방사상 컬럼, 흡착 막 유닛, 또는 혼합 모드 물질로 작용하는 적절한 리간드를 갖는, 당해 분야에 공지된 임의의 다른 혼합 모드 크로마토그래피 장치로 나타낼 수 있는 MiMo 유닛에서 수행될 수 있다. MiMo 컬럼에서 크로마토그래피 물질은 MiMo 리간드가 결합되는 입자상 지지체 물질로서 존재할 수 있다. 막-유사 크로마토그래피 장치는 MiMo 리간드가 결합되는 하나 이상의 시트 형태의 지지체 물질로 이루어진다. 지지체 물질은 유기 물질 또는 무기 물질 또는 유기 및 무기 물질의 혼합물로 이루어질 수 있다. 적합한 유기 지지체 물질은, 예를 들면, 친수성 탄수화물(예를 들면, 가교결합 아가로스, 셀룰로스 또는 덱스트란) 또는 합성 공중합체 물질(예를 들면, 폴리(알킬아스파트아미드), 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트와 에틸렌 다이메타크릴레이트의 공중합체, 또는 아실화 폴리아민)로 이루어진다. 적합한 무기 지지체 물질은, 예를 들면, 실리카, 세라믹 및 금속이다. 막-형태 MiMo는 MiMo 리간드를 함유하는 친수성 폴리에터설폰으로 이루어질 수 있다. MiMo 리간드의 적합한 예는 하이드록시아파타이트, 플루오르아파타이트, 4-머캅토 에틸 피리딘, 헥실아미노, 페닐프로필아미노, 2-머캅토-5-벤즈아미다졸 설폰산, N-벤질-N-메틸 에탄올아민, 또는 다중모드 기능을 갖는, 당해 분야에 공지된 임의의 다른 리간드이다.

본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 항체는 6.0 이상, 바람직하게는 7.0 이상, 보다 바람직하게는 7.5 이상의 등전 pH를 갖는 항체이다. 이들 항체는 G, A 또는 M 부류의 면역글로불린일 수 있다. 항체는 인간, 또는 비-인간(예, 설치류) 또는 키메라(예, "인간화") 항체일 수 있거나, 또는 전술한 면역글로불린의 서브유닛(subunit)일 수 있거나, 또는 면역글로불린 부분 및 또 다른 (비-면역글로불린) 단백질로부터 유도되거나 이와 동일한 부분으로 이루어진 하이브리드 단백질일 수 있다.

놀랍게도, 복합 AEX 및 MiMo 크로마토그래피로부터 수득된 항체 물질은 일반적으로 98% 이상, 바람직하게는 99% 이상, 보다 바람직하게는 99.9% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 99.99% 이상의 매우 높은 순도(단백질 함량에 관해)를 가질 것이다.

본 발명에 따른 AEX 크로마토그래피 단계는 중성 또는 약간 알칼리성 pH에서 수행된다. 상기 단계는 음으로 하전된 불순물, 예를 들어, DNA, 숙주 세포 단백질, 단백질 A(존재하는 경우), 바이러스(존재하는 경우), 인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자와 같은 단백질성 배지 성분(존재하는 경우)을 제거할 것이다.

MiMo 크로마토그래피 단계 동안, pH 및 전도도의 정확한 조건을 적용하여 생성물이 통과하는 동안 크로마토그래피 장치에 결합하는 성질을 이용하여, 주요 잔류 거대 분자 불순물(주로 생성물 응집체)이 제거될 것이다.

이어서, (고도로) 정제된 항체 제제는, 일반적으로, 모든 잔류하는 저분자량 불순물을 제거하기 위해 한외여과 및 정용여과에 의해 처리되고, 최종 제형화 완충액으로 완충액을 대체하고, 목적하는 최종 생성물 농도를 조정해야 할 것이다.

또한, 정제된 항체 제제는, 일반적으로 또한 바이러스 및/또는 프리온과 같은 잠재적으로 존재하는 감염 물질을 완전히 제거하도록 처리되어야 할 것이다.

본 발명은 또한 직렬로 연결된 음이온 교환 크로마토그래피 부분(AEX) 및 혼합 모드 크로마토그래피 부분(MiMo)을 둘 다 포함하는 단일 작동 유닛에 관한 것이다. 상기 단일 작동 유닛은 또한 제 1 이온 교환 크로마토그래피 부분의 상류 말단에 유입구 및 제 2 이온 교환 크로마토그래피 부분의 하류 말단에 유출구를 포함한다. 상기 단일 작동 유닛은 또한 제 1 이온 교환 크로마토그래피 부분과, 분리 혼합물에 컨디셔닝 용액을 공급하기 위한 유입구를 추가로 포함하는 제 2 이온 교환 크로마토그래피 부분 사이에 접속부를 포함한다.

본 발명에 따른 공정 동안 액체 흐름은, 상업적으로 시판하는 임의의 이중 펌프 크로마토그래피 시스템, 예를 들면, 악타 익스플로러(AKTA explorer)(GE), 바이오프로세스(BIOPROCESS)(GE), 임의의 이중 펌프 HPLC 시스템 또는 도 1의 도해에 따르는 임의의 맞춤형 장치에 의해 확립될 수 있다. 상기 크로마토그래피 장치들의 대부분은 단일 크로마토그래피 유닛(즉, 컬럼 또는 막)을 작동시키도록 설계된다. 단순한 변형에 의해, 펌프 A 다음에 및 혼합 챔버 전에 제 1 이온 교환 유닛을 배치하는 추가의 접속이 이루어질 수 있다.

도 1은 기본 형태를 나타낸 것이다. 2개의 크로마토그래피 장치와 도 1에 나타낸 바와 같은 위치의 선택적인 예비-필터의 직렬 인-라인 연결은 가끔 바람직하지 않은 압력 상승을 초래할 수 있다. 그러므로, 일부 조건하에서, 추가의 기술적 변형(예를 들면, AEX 유닛 다음에 추가 펌프 및 AEX 유닛 전에 압력 감소 장치)이 상기 도해에 포함되어야 할 수도 있다.

실시예

재료 및 방법:

모든 실험은 CHO 세포주에 의해 생성된 IgG를 사용하여 수행하였다. 배양은 화학적 규정 배지를 사용하여 XD(등록상표) 모드(문헌 [Genetic Engineering & Biotechnology news, Apr 1 2010, No. 7] 참조)로 수행하였다.

조 XD(등록상표) 수거물의 정화 및 포획은 단백질 A를 사용한 로부스트(Rhobust, 등록상표) EBA 기술(문헌 [Innovations in Pharmaceutical Technology, March 2011] 참조)을 이용하여 단일 단계로서 수행되었다. 생성물은 35 mM NaCl, 0.1 M 아세테이트; pH 3.0 용출 완충액으로 용출시켰다. 용출액은 5 g/L IgG를 함유하였으며 2 내지 8 ℃에서 저장하였다.

상기와 같이 수득된 물질을 사용하여, 6회의 실험을 각각 수행하였다: 1. 하이드록시아파타이트 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피에서 응집체의 우선적 결합을 위한 조건을 설정하기 위해(실험 1). 2. 인-라인 혼합하에 유체 통과 모드로 하이드록시아파타이트 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피를 실행하기 위해(실험 2). 3. AEX, 및 하이드록시아파타이트 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피를 하나의 단일 유닛 공정으로 병합시키기 위해(실시예 1). 4. 유체 통과 모드의, 음이온성-HIC 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피에서 최전 조건을 설정하기 위해(실험 3). 5. 인-라인 혼합하에 유체 통과 모드로 음이온성-HIC 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피를 실행하기 위해(실험 4). 6. AEX, 및 음이온성-HIC 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피를 하나의 단일 유닛 공정으로 병합하기 위해(실시예 2).

유체 통과 모드의 AEX 크로마토그래피에 최적 조건은 앞에서 결정되었으며, 실시예 1 및 실시예 2의 실험에 적용되었다.

단백질 (생성물) 농도는 280 nm에서의 흡광도(A²⁸⁰)를 측정함으로써 UV/Vis 분광학 및 1.63의 흡광 계수를 사용하여 측정하였다.

단량체성 IgG 및 응집체 농도는 표준 절차에 따른 크기 배제 크로마토그래피(HP-SEC)에 의해 측정하였다.

HCP는 CHO HCP ELISA 분석법, 3G(사이그누스 테크놀로지스(Cygnus Technologies))로 측정하였다.

실험 1

하이드록시아파타이트 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피에서 응집체의 우선적 결합을 위한 조건의 설정

본 실험을 위해, 예비-정제된 IgG를 탈염수로 5 mS/cm 이하의 전도도로 희석하고, 2 M 트리스 pH 9.0을 사용하여 pH 6.5로 조정하였다. 결합-용출 모드로 MiMo 크로마토그래피를 수행하였다. 4 cm 층 길이의 HA 울트로겔(Ultrogel, 등록상표) 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 흡착제(폴(Pall), 라이프 사이언시즈(Life Sciences))로 충전된 VL11(밀리포어(Millipore)) 컬럼을 악타 익스플로러 상에서 사용하였다. 컬럼을 3 mL/분의 유량에서 10 mM 인산나트륨, pH 7.0으로 평형화시키고 세척하였다. 생성물을 2 mL/분의 유량으로 부하시켰다. 초기 부하물은 2.6 g/L의 IgG 및 2.2%의 초기량의 응집체를 함유하였다. 부하 후에, 10 mM 인산나트륨, pH 7.0 (완충액 A) 및 10 mM 인산나트륨, 1 M NaCl, pH 7.0 (완충액 B)의 0에서 100% 까지의 선형 구배로 생성물을 용출시켰다.

용출 단계동안 분획들을 수거하고, 응집체의 존재 및 단백질(생성물) 함량에 대해 전도도의 함수로서 분석하였다.

[표 1]

상이한 전도도에서 인산나트륨/염화나트륨 완충액을 사용한 하이드록시아파타이트 수지 중 응집체 용출

샘플에 대한 분석 결과(표 1에 나타낸)는 26.9 mS/cm의 전도도 값 이하에서, 용출액이 응집체를 함유하지 않거나 미미한 양의 응집체를 함유함을 명백히 나타내었다.

실험 2

인-라인 혼합하에 유체 통과 모드로 하이드록시아파타이트 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피에서의 응집체 제거

본 실험을 위해, 예비-정제된 IgG를 탈염수로 2.4 mS/cm의 전도도로 희석하고, 2 M 트리스 pH 9.0 완충액을 사용하여 pH 7.4로 조정하였다. 4 cm 층 길이의 HA 울트로겔(등록상표) 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 흡착제(폴, 라이프 사이언시즈)로 충전된 VL11(밀리포어) 컬럼을 악타 익스플로러 상에서 사용하였다. 컬럼을 탈염수 및 10 mM 인산나트륨, 0.8 M NaCl, pH 7.4 (완충액 B)로 평형화시켰다. 탈염수 및 완충액 B를 5 mL/분의 유량에서, 30% 완충액 B의 고정 부피비에서 인-라인 혼합하였다. 평형화 후에, 생성물을 부하시켰다. 부하시에 전도도를 25 mS/cm의 값으로 조정하기 위해 생성물 유체를 완충액 B와 인-라인 혼합시켰다. 생성물 유체 및 완충액 B를 1 mL/분의 유량에서, 30% 완충액 B의 고정 부피비에서 인-라인 혼합하였다. 초기 부하물은 0.78 g/L의 IgG 및 2.97%의 초기량의 응집체를 함유하였다.

유체 통과 분획들을 수거하고, 응집체의 존재 및 단백질(생성물) 함량에 대해 분석하였다.

[표 2]

인산나트륨/염화나트륨 완충액의 인-라인 혼합하에 유체 통과 모드로 하이드록시아파타이트 수지 중 응집체 제거율

이들 샘플의 분석 결과(표 2에 나타낸)는, 30%의 고정 부피비에서 10 mM 인산나트륨, 0.8 M NaCl, pH 7.4와 생성물 함유 부하물의 인-라인 혼합하에 유체 통과 모드로 하이드록시아파타이트 수지를 사용하여 1% 이하까지 응집체의 제거를 명백히 나타내었다.

실시예 1

하나의 단일 유닛 공정으로서 AEX 및 하이드록시아파타이트 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피에 의한 IgG 의 정제

AEX 유닛 및 MiMo 유닛을 악타 익스플로러를 사용하여 도 1의 도해에 도시된 바와 같이 직렬로 커플링시켰다. AEX의 경우, 사토바인드(Sartobind) Q 캡슐(1 mL)을 사용하였으며, MiMo의 경우 4 cm 층 길이의 HA 울트로겔(등록상표) 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 흡착제(폴, 라이프 사이언시즈)로 충전된 VL11(밀리포어) 컬럼을 사용하였다. 생성물 부하 전에 및 AEX 유닛과 연결하기에 앞서 컨디셔닝을 위해, MiMo 유닛을 탈염수(펌프 A로 펌핑됨) 및 10 mM 인산나트륨, 0.8 M NaCl, pH 7.4 (완충액 B)로 평형화시켰다. 탈염수 및 완충액 B를 5 mL/분의 유량에서, 30% 완충액 B의 고정 부피비에서 인 라인 혼합하였다. AEX 유닛을 플러싱하고 평형화시킨 후 100 mL의 0.05 M 트리스, pH 7.4 완충액을 사용하여 시스템에 연결시켰다. 각 유닛의 평형화를 별도로 수행하지 않는 실험이 수행될 수 있다.

본 실험을 위해, 예비-정제된 IgG를 탈염수로 2.4 mS/cm의 전도도로 희석하고, 2 M 트리스 pH 9.0 완충액을 사용하여 pH 7.4로 pH를 조정하고, 0.22 ㎛ 상에서 여과시켰다. 예비-정제된 IgG의 부하는 1 mL/분의 속도로 펌핑함으로써 개시하였다. 완충액 B는 30% 부피 비에서 동일한 유량으로 펌핑하였다. 0.6 g/L의 IgG를 함유하는 240 mL의 양을 부하시켰다. 부하 완료 후, 세척을 시작하기 위해 AEX 유닛을 제거하였다. 세척을 위해 AEX 유닛을 제거할 필요가 없는 실험이 수행될 수 있다. MiMo 유닛을 0에서 30%까지의 10 mM 인산나트륨, pH 7.4 (완충액 A) 및 완충액 B의 선형 구배로 세척하고, 0.5 M 인산나트륨, 1.5 NaCl, pH 6.8 완충액으로 스트리핑시켰다. 부하물, 유체 통과물 및 세척물을 응집체의 존재, HCP 함량 및 단백질(생성물) 함량에 대해 분석하였다. 부하물은 2179 ng/mg IgG의 HCP 농도를 나타내었다. 유체 통과물과 세척물 분획은 447 ng/mg IgG의 HCP 농도를 나타내었다. 부하물 중 응집체의 양은 2.93%였으며, 유체 통과물과 세척물 중에는 0.76%였다. 스트립은 54.97%의 응집체를 함유하였다. 유체 통과물과 세척물 중 전체 생성물 회수율은 88.2%였으며, 유체 통과물과 세척물과 스트립 중에서는 90%였다.

본 실험은, 분리 혼합물이 적절량의 적절한 조절 용액으로 인-라인 보충될 때 하나의 단일 유닛 공정으로 작동하는 직렬 인-라인 음이온 교환 크로마토그래피에 이은 MiMo (하이드록시아파타이트) 크로마토그래피의 사용에 의해 99.2%의 항체 물질의 최종 순도가 달성됨을 보여준다. 부하물의 초기 순도는 97%였다.

실험 3

유체 통과 모드의 , 음이온성 - HIC 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피에서 최적 조건의 설정

본 실험 세트를 위해, 예비-정제된 IgG를 탈염수로 2.29 mS/cm의 전도도로 희석하고, 2 M 트리스 pH 9.0 완충액을 사용하여 pH 7.4로 pH를 조정하였다. 6.3 층 길이의 캅토(등록상표) 점착물(GE 헬쓰케어)로 충전된 VL11(밀리포어) 컬럼을 악타 익스플로러 상에서 사용하였다. 컬럼을 25 mM 인산나트륨, pH 7.4 (완충액 A) 및 100 mM 인산나트륨, pH 7.4 (완충액 B)로 평형화시키고 세척하였다. 완충액 A와 완충액 B를 별도의 실행으로, 5 mL/분의 유량에서, 0, 5, 15 및 25% 부피 비에서 인-라인으로 혼합하였다. 평형화후에, 생성물을 부하시켰다. 부하시, 생성물 유체를 완충액 B와 인-라인 혼합시켰다. 생성물 유체와 완충액 B를 별도의 실행으로서, 3 mL/분의 유량에서, 0, 5, 15 및 25%의 완충액 B의 부피비에서 인-라인 혼합하였다. 초기 부하물은 완충액 B와의 인-라인 혼합으로 인해 희석 전에 1.09 g/L의 IgG, 및 3.13%의 초기량의 응집체를 함유하였다. 컬럼을 100 mM 인산나트륨, pH 3.0 완충액으로 스트리핑시켰다.

완충액 B의 상이한 비에서 유체 통과 분획들을 수거하고, 응집체의 존재 및 단백질(생성물) 함량에 대해 분석하였다.

[표 3]

상이한 비에서 인산나트륨 완충액을 사용한 유체 통과 모드의 음이온성-HIC MiMo 수지 중 응집체 제거율

샘플들의 분석 결과(표 3에 나타낸)는 생성물 함유 부하물을 인산염 조절 완충액과 인-라인 혼합시킬 때 음이온성 - HIC MiMo 수지 중에서 1% 미만까지 응집체의 제거를 명백히 보여주었다.

실험 4

인-라인 혼합하에 유체 통과 모드의 , 음이온성 - HIC 수지를 사용한 MiMo 크로마토그래피에서 응집체 제거

본 실험을 위해, 예비-정제된 IgG를 탈염수로 2.4 mS/cm의 전도도로 희석하고, 2 M 트리스 pH 9.0 완충액을 사용하여 pH 7.4로 조정하였다. 6.3 층 길이의 캅토(등록상표) 점착물(GE 헬쓰케어)로 충전된 VL11(밀리포어) 컬럼을 악타 익스플로러 상에서 사용하였다. 컬럼을 25 mM 인산나트륨, pH 7.4 (완충액 A) 및 100 mM 인산나트륨, pH 7.4 (완충액 B)로 평형화시키고 세척하였다. 완충액 A와 완충액 B를 5 mL/분의 유량에서, 15% 완충액 B의 고정 부피 비에서 인-라인으로 혼합하였다. 평형화후에, 생성물을 부하시켰다. 부하시, 생성물 유체를 완충액 B와 인-라인 혼합시켰다. 생성물 유체와 완충액 B를 3 mL/분의 유량에서, 15%의 완충액 B의 고정 부피비에서 인-라인 혼합하였다. 초기 부하물은 0.93 g/L의 IgG 및 3.15%의 초기량의 응집체를 함유하였다. 컬럼을 100 mM 인산나트륨, pH 3.0 완충액으로 스트리핑시켰다.

[표 4]

인산나트륨 완충액의 인-라인 혼합 하에 유체 통과 모드의 음이온성-HIC MiMo 수지 중 응집체 제거율

상기 샘플들의 분석 결과(표 4에 나타낸)는 30%의 고정 부피비에서 100 mM 인산나트륨, pH 7의 인-라인 혼합하에 유체 통과 모드의 , 음이온성 - HIC MiMo 수지 중 실행 전체에 걸친 유체 통과물중에서 1% 이하까지 응집체의 제거를 명백히 보여주었다. 유체 통과물의 벌크물 중 응집체 퍼센트는 0.18%였다.

실시예 2

하나의 단일 유닛 공정으로서 AEX 및 음이온성 - HIC 수지를 사용한 MiMo 크로 마토그래피에 의한 IgG 의 정제

AEX 유닛 및 MiMo 유닛을 악타 익스플로러를 사용하여 도 1의 도해에 도시된 바와 같이 직렬로 커플링시켰다. AEX의 경우, 사토바인드 Q 캡슐(1 mL)을 사용하였으며, MiMo의 경우 6.3 층 길이의 캅토(등록상표) 점착물(GE 헬쓰케어)로 충전된 VL11(밀리포어) 컬럼을 사용하였다. 생성물 부하 전에 및 AEX 유닛과 연결하기에 앞서 컨디셔닝을 위해, MiMo 유닛을 25 mM 인산나트륨, pH 7.4 (완충액 A) 및 100 mM 인산나트륨, pH 7.4 (완충액 B)로 평형화시켰다. 완충액 A와 완충액 B를 5 mL/분의 유량에서, 15% 완충액 B의 고정 부피비에서 인 라인으로 혼합하였다. AEX 유닛을 플러싱하고 평형화시킨 후 100 mL의 0.05 M 트리스, pH 7.4 완충액을 사용하여 시스템에 연결시켰다. 각 유닛의 평형화를 별도로 수행하지 않는 실험이 수행될 수 있다.

본 실험을 위해, 예비-정제된 IgG를 탈염수로 2.29 mS/cm의 전도도로 희석하고, 2 M 트리스 pH 9.0 완충액을 사용하여 pH 7.4로 pH를 조정하고, 0.22 ㎛ 상에서 여과시켰다. 예비-정제된 IgG의 부하는 3 mL/분의 속도로 펌핑함으로써 개시하였다. 완충액 B는 15% 부피 비에서 동일한 유량으로 펌핑하였다. 0.91 g/L의 IgG를 함유하는 479 mL의 양을 부하시켰다. 부하 완료 후, 세척을 시작하기 위해 AEX 유닛을 제거하고 유체를 완충액 A로 다시 교체하고, 라인을 준비시켰다. 세척을 위해 AEX 유닛을 제거할 필요가 없는 실험을 수행할 수 있다. 세척 후에, 100 mM 인산나트륨, pH 3.0 완충액을 펌프 A를 통해 첨가함으로써 MiMo 유닛을 스트리핑시키고, 펌프 B를 중지시켰다. 부하물, 유체 통과물 및 세척물을 응집체의 존재, HCP 함량 및 단백질(생성물) 함량에 대해 분석하였다. 부하물은 1711 ng/mg IgG의 HCP 농도를 나타내었다. 유체 통과물과 세척물 분획은 206 ng/mg IgG의 HCP 농도를 나타내었다. 부하물 중 응집체의 양은 3.13%였으며, 유체 통과물과 세척물 중에는 0.18%였다. 스트립은 14.23%의 응집체를 함유하였다. 유체 통과물과 세척물 중 전체 생성물 회수율은 82.9%였으며, 유체 통과물과 세척물과 스트립 중에서는 99.9%였다.

본 실험은, 분리 혼합물이 적절량의 적절한 조절 용액으로 인-라인 보충될 때 하나의 단일 유닛 공정으로 작동하는 직렬 인-라인 음이온 교환 크로마토그래피에 이은 MiMo (음이온성-HIC) 크로마토그래피의 사용에 의해 99.72%의 항체 물질의 최종 순도가 달성됨을 보여준다. 부하물의 초기 순도는 96.8%였다.

사용된 약어

A²⁸⁰ 280 nm에서의 (빛) 흡광도

AEX 음이온 교환

BHK 세포 새끼 햄스터 신장 세포

CHO 세포 차이니즈 햄스터 난소 세포

EBA 팽창층 흡착

HCP 숙주 세포 단백질

HIC 소수성 상호작용 크로마토그래피

HPLC 고압 액체 크로마토그래피

IgG 면역글로불린 G

MiMo 혼합 모드

TFF 접선 유동 여과

Tris 트리스(하이드록시메틸)메틸아민

Claims

적어도 중간 정제 및 연마 단계를 포함하는, 생물반응기에서 생성된 단백질 혼합물로부터 항체를 정제하는 방법으로서, 중간 정제 및 연마 단계가 유체-통과 분획으로서 분리 혼합물을 제공하는 직렬 인-라인 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)에 이어, 유체 통과 분획으로서 정제된 항체 제제를 제공하는 혼합-모드 크로마토그래피(MiMo)를 포함하고, 상기 정제된 항체 제제가 하나 이상의 추가 정제 단계에 적용되며, pH 및/또는 전도도 및/또는 혼합-모드 크로마토그래피 단계에서 항체로부터 불순물을 제거하기 위한 특정 이온 성분들의 농도 또는 유형을 조절하기 위해 혼합 모드 크로마토그래피 전에 상기 분리 혼합물이 적절량의 적합한 조절 용액으로 보충되는 방법.
제 1 항에 있어서,
음이온 교환 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피가 직렬로 연결된 2개의 별개의 장치에서 일어나는, 방법.
제 1 항에 있어서,
직렬 인-라인 AEX 및 MiMo가 단일 유닛 공정으로 수행되는, 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
MiMo 전에 분리 혼합물이 적절량의 염 또는 염들의 혼합물로 보충되는, 방법.
제 4 항에 있어서,
MiMo 전에 분리 혼합물이 적절량의 황산암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 인산암모늄, 인산나트륨, 인산칼륨, 염화칼륨 및 염화나트륨으로 보충되는, 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
MiMo 크로마토그래피 전에 분리 혼합물이 적절량의 산성 용액으로 보충되는, 방법.
제 6 항에 있어서,
MiMo 크로마토그래피 전에 분리 혼합물이 시트르산(또는 그의 일염기성 또는 이염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 인산(또는 그의 일염기성 또는 이염기성 나트륨 또는 칼륨 염), 아세트산, 염산 또는 황산을 함유하는 용액 적절량으로 보충되는, 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
혼합 모드 크로마토그래피 전에 분리 혼합물이 적절량의 알칼리성 용액으로 보충되는, 방법.
제 8 항에 있어서,
MiMo 크로마토그래피 전에 분리 혼합물이 수산화 나트륨 또는 칼륨(또는 그의 일염기성 또는 이염기성 나트륨 또는 칼륨 염) 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄을 함유하는 용액 적절량으로 보충되는, 방법.
직렬로 연결된 음이온 교환 크로마토그래피 부분 및 혼합 모드 크로마토그래피 부분 둘 다를 포함하는, 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 사용될 수 있는 단일 작동 유닛으로서, 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 유출구가 혼합 모드 크로마토그래피 부분의 유입구에 연결되고, 상기 유닛이 음이온 교환 크로마토그래피 부분의 상류 말단에 유입구 및 혼합 모드 크로마토그래피 부분의 하류 말단에 유출구를 포함하고 또한 음이온 교환 크로마토그래피 부분과 혼합 모드 크로마토그래피 부분 사이에 유입구를 포함하는 단일 작동 유닛.