CN105153311B - 重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人胰高血糖素样肽‑1突变体融合蛋白及其制备方法，编码该融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1；制备方法包括将发酵所含有重组人胰高血糖素样肽‑1突变体融合蛋白的发酵上清依次经过染料亲和层析、阳离子交换层析和分子筛层析得到高质量的重组人胰高血糖素样肽突变体融合蛋白。本发明的有益效果是：提供一种适宜于规模扩大化生产的、快速、高效、简便的重组人胰高血糖素样肽‑1突变体融合蛋白的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

Description

重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别地涉及一种重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白及其制备方法。

背景技术

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种多病因的代谢性疾病，其特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌和/或作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。临床研究发现，Ⅰ型糖尿病，以往称为胰岛素依赖型糖尿病，约占糖尿病病人总数的15%左右，常发生于儿童和青少年，但也可发生于其它年龄，甚至80-90岁时也有患病的可能。Ⅱ型糖尿病，又称为非胰岛素依赖型糖尿病，约占糖尿病病人总数的80%以上。据统计目前全球有Ⅱ型糖尿病患者1.6亿，我国达4000多万人，其发病率正呈迅速上升之势，在发展中国家(包括中国)尤为显著，预测到2025年，全球将增至3.8亿人。依据目前的医疗手段，糖尿病无根治办法。因此，糖尿病已经成为当前威胁人类健康的重要疾病，其对人体的危害仅次于癌症。

世界上治疗Ⅱ型糖尿病以磺酰脲类药物为主，辅以双胍类、α-糖苷酶抑制剂等药物。但是磺酰脲类药物的副作用大，长期使用会因为胰岛素过度分泌而导致胰岛β细胞衰竭。胰岛β一细胞功能衰竭，体内胰岛素绝对或相对缺乏，是导致糖尿病的根本原因。因此寻找新一代治疗Ⅱ型糖尿病药物的开发热点之一。人胰高血糖素样肽-1(human glucoganlike peptide-l，hGLP-1)是由肠道L细胞合成和分泌的由30个氨基酸组成的多肽。国内外研究显示hGLP-1是迄今已知的诱导胰岛素分泌能力最强的物质，可以促进胰岛素基因转录和胰岛素分泌，提高受体对胰岛素的敏感性，消除胰岛索抵抗所引发的各种并发症，且它降低血糖的作用依赖于患者血糖的浓度，用药后不会造成低血糖。此外，hGLP-1还可抑制胃的排空、控制食欲、减轻体重、消除患者饥饿感和糖尿病典型的“三多”症状，在降血脂和预防冠心病方面也有一定的作用。除了调节血糖，hGLP-1最显著的功能是促进胰岛β-细胞功能再生，防止胰岛β-细胞凋亡。然而，hGLP-1的活性形式是hGLP-1(7-36)，hGLP-1(7-36)在体内很快被一种蛋白酶—二肽酰基肽酶Ⅳ(dipeptidyl-peptidaseⅣ，DPPⅣ)从N末端降解2个氨基酸残基而变成一种无活性的hGLP-l(7-36)。因此hGLP-1(7-36)在体内的半衰期不足5 min，其新陈代谢的时间为12～13 min。hGLP-1(7-36)较短的体内半衰期决定了只有频繁、反复地给药才能取得令人满意的疗效，这就极大地限制了它的临床应用及疗效，还给病人造成了不必要的麻烦和痛苦。

为了克服上述缺点，开发长效的hGLP-1(7-36)突变体是目前的研究热点。该裂解主要受体内丝氨酸蛋白酶-DPPⅣ的催化，因为hGLP-1(7-36)序列第8位丙氨酸（Ala）可被DPPⅣ特异性所识别，为了保护hGLP-1不被DPPⅣ所降解，延长其在体内的生物半衰期，可以用甘氨酸（Gly）代替第8位丙氨酸（Ala）对hGLP-1的N-末端进行修饰。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）融合技术是构建长效蛋白类药物的有效技术手段，已在多种药物研究中得到应用。所谓的白蛋白融合技术利用白蛋白分子质量大的性状将药物蛋白易致机体产生过敏反应的部分折叠包入其内，暴露药物蛋白活性区域，使其位于融合蛋白的表面。这种处理手段的优点不但可显著降低产品的过敏反应，还可防止机体酶系统对药物蛋白的降解，提高产品的稳定性和延长其疗效。人血白蛋白融合技术与化学修饰相比，不需要额外的化学修饰，生产工艺简单，产物均一，质量控制相对容易，延长药物半衰期的效果可能比化学修饰更有效。

重组人胰高血糖素样肽-1突变体就是将GLP-1（7-36）第8位的丙氨酸突变为甘氨酸，并将GLP-1（7-36）突变体串联直接与人血白蛋白的N段连接，并在酵母系统中表达。

发明内容

本发明是为了克服重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白表达量不高，不适合工业化生产的缺陷提出的。

本发明提供一种重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白，编码该融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

为了更好地实现发明目的，本发明还提供一种重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

步骤（1）重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白表达基因表达质粒的构建；

步骤（2）表达质粒转化至毕赤酵母中并诱导表达筛选得到重组子；

步骤（3）重组子发酵，得到发酵液上清；

步骤（4）将步骤（3）得到的发酵液上清纯化制得融合蛋白。

所述步骤（1）重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白表达基因表达质粒的构建包括以下步骤：将具有序列表SEQ ID No.1所示序列的DNA片段合成后连接到pMD-18T载体上，形成pMD-18T-(GLP-1A2G)₂-HSA质粒,将质粒转化至DH5α中进行克隆,提取单克隆质粒，用两种限制性内切酶SacⅡ和XhoⅠ双酶切，酶切产物以重量比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用Agarose Gel DNA Purification Kit回收目的基因，与经过两种限制性内切酶双酶切的酵母表达载体连接，构建出重组质粒。

所述限制性内切酶为SacⅡ和XhoⅠ，所述酵母表达载体为pPICZα，所述重组质粒为pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA。

所述步骤（2）中表达质粒转化至毕赤酵母中并诱导表达筛选重组子包括以下步骤：将重组质粒线性化处理后电击转化所述毕赤酵母，转化结束后立即加入山梨醇，混匀后涂布于YPDZ平板，培养至菌落出现，筛选阳性克隆得到重组子一；将得到的重组子一接种于装有50ml BMGY培养基的500ml三角瓶中，30℃300r/min培养至A₆₀₀值为2.0-6.0，离心收集菌体，然后用BMMY培养基重悬细胞至A₆₀₀值为1.0，30℃，300r/min下进行发酵培养，每隔24h补加一次甲醇（补加甲醇至浓度为0.5wt%），诱导表达96h后，离心取菌液上清， SDS-PAGE分析，筛选得到表达量最高的重组子二。

毕赤酵母优选为毕赤酵母X33，当毕赤酵母为毕赤酵母X33时，筛选得到的重组子一为X33/pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA，筛选得到的重组子二为表达量最高的重组子二X33/pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA。

所述BMGY培养基组分为1wt%酵母提取物，2wt%蛋白胨，1.34wt%YNB，4×10^-5wt%生物素，1wt%甘油，其余为水；

所述BMMY培养基组分为1wt%酵母提取物，2wt%蛋白胨，1.34wt%YNB，4×10^-5wt%生物素，0.5wt%甲醇，其余为水；

所述步骤（3）重组子发酵，得到发酵液上清包括以下步骤：将筛选得到的表达量最高的重组子二X33/pPICZα-(GLP-1A2G)2-HSA接种于YPD液体培养基，30℃、250～300rpm条件下培养16～24小时，直到OD600=2～6作为种子液；然后将种子液以5～10％的接种量接种基础盐培养基；培养直到甘油被完全耗尽后，开始补加50%的甘油补料，所述每升甘油补料中需添加12mlPTM1微量盐，设定补加甘油速率为18.15ml/小时/升初始发酵液体积；至菌体湿重180～220g/L时，停止补加甘油补料，甘油耗尽维持饥饿状态0.5～1h后，开始补加100％甲醇补料，所述每升甲醇补料中含12mlPTM1微量盐，进入诱导阶段,诱导前用氨水将培养基pH调到5.5，温度设定为22℃，开始补加甲醇补料；维持溶氧20%以上，诱导94-98小时下罐，离心收集发酵液上清。发酵液上清作SDS-PAGE电泳检测表达水平（见图3），表达水平在2-3g/l左右。

所述YPD液体培养基组分为：酵母粉1wt%、蛋白胨2wt％、葡萄糖2wt％,其余为水。

所述基础盐培养基配置方法：85%磷酸液26.7ml，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾 4.13g，甘油 40g，PTM1微量元素4.4ml,混合后，用去离子水加至1L。

所述补加甲醇补料的方法为：开始设定甲醇补加速度为3.6ml/小时/L初始发酵液体积；补料4-5小时后补加速度再加倍到7.3ml/小时/L初始发酵液体积；以7.3ml/小时/L初始发酵液体积速度补料2小时后，提高补加速度至10.9ml/小时/L初始发酵液体积，并且这个补料速度保持到发酵的其余整个过程；

所述种子液接种前用氨水将发酵培养基pH调到5.0，温度设定为30℃，溶氧始终大于20％饱和度；

所述PTM1微量盐，配制方法：五水硫酸铜-5H2O 6.0g，碘化钠0.08g，一水硫酸锰3.0g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，氯化钴0.5g，氯化锌20.0g，七水硫酸亚铁65.0g，生物素0.2g，硫酸（浓）5.0ml，混合后，补水到1升， 0.22μm过滤除菌，室温保存得到PTM1微量盐；

所述步骤（4）将步骤（3）得到的发酵液上清纯化制得融合蛋白是依次通过染料亲和层析、阳离子交换层析和分子筛层析进行纯化，该方法至少包括以下步骤：

（a）将步骤（3）得到的发酵液上清离心过滤得到滤液；除去发酵液上清中的菌体成分；

将滤液上样到用平衡缓冲液A充分平衡的染料亲和层析柱；

用3-5个柱体积的平衡缓冲液A冲洗，然后用洗脱缓冲液B进行洗脱，收集洗脱蛋白液A组分；

该过程主要用于捕获发酵上清液中的重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白，同时除去少量杂质蛋白和色素。

（b）将洗脱蛋白液A上样到用平衡缓冲液C充分平衡好的阳离子层析柱，用洗脱缓冲液D冲洗，收集洗脱蛋白液B；该过程主要用于除去色素与杂质蛋白；

（c）用分子筛流动相E液对分子筛层析柱进行平衡3-5个柱体积，洗脱蛋白液B上样柱体积的3%，用分子筛流动相E液对上样的分子筛层析柱进行洗脱，收集目的蛋白液。该过程，不但可以去除前两步无法去除的二聚体和杂质，而且可以直接更换样品的缓冲系统，可以直接用于制剂的配制，不需要采用其他更换缓冲体系的处理。

所述步骤（a）中染料亲和层析柱为Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱；平衡缓冲液A为 pH 8.0的20m mol/l Tris-HCl缓冲液；洗脱缓冲液B含有20m mol/l Tris-HCl和2mol/l NaCl的溶液，所述洗脱缓冲液B的pH为8.0。

所述步骤（b）中阳离子层析柱为SP Sepharose High Porformance阳离子层析柱；所述平衡缓冲液C为pH 4.0的20m mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液；所述洗脱缓冲液D含有20mmol/l醋酸-醋酸钠缓冲液和0.2 mol/l NaCl溶液，所述洗脱缓冲液D的 pH 4.0。

所述步骤（c）中分子筛层析柱为Superdex200 pg分子筛层析柱，所述流动相E液中含有10m mol/l磷酸盐、100m mol/l海藻糖和占流动相总体积分数0.01%的吐温80，所述流动相E液的pH7.0。

本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供一种优化的人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的核苷酸序列,其具有SEQ ID NO.1所示的序列。该序列与酵母表达载体pPICZαA连接后引入毕赤酵母X33表达，提高其在酵母中的表达量，工程菌发酵表达量2g-3g/L。本发明还提供SEQ ID No.1所示序列表达的人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的制备方法， 本发明将含有重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的发酵液依次经过Blue Sepharose 6 Fast Flow 染料亲和层析、SP Sepharose High Porformance离子交换层析和Superdex200 pg分子筛层析进行组合生产得到高质量的重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白原液。纯化出原液收率在50-60%之间，相当于每升发酵液获得重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白纯品为1.3g左右。本发明提供一种适宜于规模扩大化生产的、快速、高效、简便的重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的纯化方法，具有工艺简单、成本低，目的产物纯度高以及中间过程便于控制和易于规模化放大生产等特点。

本发明首先采用染料亲和层析捕获重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白，同时除去少量杂质，然后利用阳离子交换层析和分子筛层析去除少量色素、内毒素和杂质蛋白，三种层析方法依次作用，组合合理，不需要其他处理过程，操作简单，工艺稳定，易于产业化。

附图说明

图1表示X33转化子的PCR分析电泳图，图中各泳道样品分别是1-5为阳性转化子，6为阳性对照，7为阴性对照，8为DNA Marker。

图2表示转化子融合蛋白的表达情况的非还原SDS-PAGE检测结果，图中样品分别为1-5为阳性转化子，6为阴性对照，7为蛋白Marker。

图3表示融合蛋白纯化产物的非还原SDS-PAGE检测结果，图中各泳道样品1为发酵样品，2为Blue Sepharose FF染料亲和层析纯化样品，3为SP Sepharose HighPorformance离子交换层析纯化样品，4为Superdex200 pg分子筛层析样品。

图4表示融合蛋白纯化产物的Western blot检测结果，图中样品1为阴性对照，2为阳性对照，3-4为融合蛋白纯化产物。

图5表示融合蛋白对胰岛原代细胞的刺激作用。

具体实施方式

针对现有技术的不足，本发明提供一种重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白及其制备方法。

以下采用实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1：

参见图1-5。

1、重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白表达基因表达质粒的构建

将具有序列表SEQ ID No.1所示序列的DNA片段合成后连接到pMD-18T载体上，形成pMD-18T-(GLP-1A2G)₂-HSA质粒,将质粒转化至DH5α中进行克隆,提取单克隆质粒，用两种限制性内切酶SacⅡ和XhoⅠ双酶切(限制性内切酶为MBI公司的产品)，酶切产物以重量比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用Agarose Gel DNA Purification Kit回收目的基因，与经过两种限制性内切酶SacⅡ和XhoⅠ双酶切的酵母表达载体pPICZα连接，构建出重组质粒pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA。

其中，(GLP-1A2G)₂-HSA为重组人胰高血糖样肽第8位的丙氨酸突变为甘氨酸，并将GLP-1突变体串联直接与人血白蛋白的N段连接,HSA为人血白蛋白。

2、表达质粒转化至毕赤酵母中并诱导表达筛选重组子

（1）将10-20μg的重组质粒pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA线性化处理后电击转化毕赤酵母X33，转化结束后立即加入1ml 1mol/L山梨醇，混匀后取200μl涂布于YPDZ平板（平板含有100μg/ml Zeocin， 2wt%胰蛋白胨，2wt%葡萄糖，2wt%琼脂，余量为水），30℃培养至菌落出现，筛选阳性克隆，得到重组子一X33/pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA。

重组毕赤酵母的PCR鉴定

提取重组子一X33/pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA基因组DNA。引物：α-factor primer/3’ AOX primer。PCR扩增鉴定酵母基因组DNA，凝胶电泳检测PCR产物(见图1)。

（2）重组子的诱导表达筛选重组子

将得到的重组子一X33/pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA接种于装有50ml BMGY培养基（BMGY培养基组分为1wt%酵母提取物，2wt%蛋白胨，1.34wt%YNB，4×10^-5wt%生物素，1wt%甘油，其余为水）的500ml三角瓶中，30℃300r/min培养至A₆₀₀值为2.0-6.0，离心收集菌体，BMMY培养基（BMMY培养基组分为1wt%酵母提取物，2wt%蛋白胨，1.34wt%YNB，4×10^-5wt%生物素，0.5wt%甲醇，其余为水）重悬细胞至A₆₀₀值为1.0，30℃，300r/min下进行发酵培养，每隔24h补加一次甲醇（使甲醇含量为0.5wt%），诱导表达96h后,离心取菌液上清， SDS-PAGE分析，筛选表达量最高的重组子二X33/pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA (见图2)。

3、表达量最高的重组子二X33/pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA发酵

将筛选得到的表达量最高的重组子二X33/pPICZα-(GLP-1A2G)2-HSA接种于YPD液体培养基（YPD液体培养基组分为：酵母粉1wt%、蛋白胨2wt％、葡萄糖2wt％,其余为水），30℃、280rpm条件下培养18小时，直到OD600=4.5作为种子液，以5～10％的接种量接种基础盐培养基（基础盐培养基配置方法：将85%磷酸26.7ml，硫酸钙0.93g，硫酸钾18.2g，七水硫酸镁14.9g，氢氧化钾 4.13g，甘油 40g和PTM1微量元素4.4ml,混合后，用去离子水加至1L）。接种前用氨水将发酵培养基pH调到5.0，温度设定为30℃，溶氧始终大于20％饱和度。培养直到甘油被完全耗尽后，开始补加50%的甘油补料（每升甘油补料中需添加12mlPTM1微量盐），设定补加速率为18.15ml/小时/升初始发酵液体积。至菌体湿重200g/L时，停止补甘油补料，甘油耗尽维持饥饿状态0.8h，开始补加100％甲醇补料(每升甲醇补料中含12mlPTM1微量盐)进入诱导阶段,诱导前用氨水将培养基pH调到5.5，温度设定为22℃，开始设定补加甲醇补料的速度为3.6ml/小时/L初始发酵液体积。补加4-5小时后补加速度再加倍到7.3ml/小时/L初始发酵液体积，以7.3ml/小时/L初始发酵液体积速度补加2小时后，提高补加速度至10.9ml/小时/L初始发酵液体积。并且这个补料速度保持到发酵的其余整个过程。维持溶氧20%以上，诱导96小时下罐，离心收集发酵液上清。发酵液上清作SDS-PAGE电泳检测表达水平（见图3），表达水平在2.8g/l。

其中PTM1微量盐，配制方法：五水硫酸铜-5H2O 6.0g，碘化钠0.08g，一水硫酸锰3.0g，二水钼酸钠0.2g，硼酸0.02g，氯化钴0.5g，氯化锌20.0g，七水硫酸亚铁65.0g，生物素0.2g，硫酸（浓）5.0ml，混合后，补水到1升， 0.22μm过滤除菌，室温保存得到PTM1微量盐。

4、发酵液上清的纯化

（a）将得到的发酵液上清在8000rpm离心5min，收集上清，然后将上清液用1 mol/l氢氧化钠调pH至6.0，0.45μm滤膜过滤得到滤液；

将滤液上样到用平衡缓冲液A充分平衡的染料亲和层析柱；

用3-5个柱体积的平衡缓冲液A冲洗，然后用洗脱缓冲液B进行洗脱，收集洗脱蛋白液A组分（见图3）；

染料亲和层析柱为Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱；平衡缓冲液A为 pH 8.0的20m mol/l Tris-HCl缓冲液；洗脱缓冲液B含有20m mol/l Tris-HCl和2 mol/l NaCl的溶液 ，洗脱缓冲液B的pH为8.0。

（b）将洗脱蛋白液A上样到用平衡缓冲液C充分平衡好的阳离子层析柱，用洗脱缓冲液D冲洗，收集洗脱蛋白液B（见图3）；

其中，阳离子层析柱为SP Sepharose High Porformance阳离子层析柱；平衡缓冲液C为pH 4.0的20m mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液；洗脱缓冲液D含有20m mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液和0.2 mol/l NaCl溶液，洗脱缓冲液D的 pH 4.0。

（c）用分子筛流动相E液对分子筛层析柱进行平衡3-5个柱体积，洗脱蛋白液B上样柱体积的3%，用分子筛流动相E液对上样的分子筛层析柱进行洗脱，收集目的蛋白液（见图3）。

其中分子筛层析柱为Superdex200 pg分子筛层析柱，流动相E液中含有10m mol/l磷酸盐、100m mol/l海藻糖和占流动相总体积分数0.01%的吐温80，流动相E液的pH7.0。将收集的目的蛋白液超滤浓缩至50-60mg/ml之间，膜孔径为30kDa。

表1 重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白纯化过程回收率和纯化效果

纯化步骤	体积（mL）	蛋白浓度（g/L）	蛋白纯度	回收率
					上清	5000	2.34	-	-
Blue Sepharose 6 Fast Flow	750	12.7	90.3%	81.4%
					SP Sepharose High Porformance	685	11.2	96.5%	80.5%
Superdex200 pg	2200	3.15	100%	90.3%
					超滤	129	51.1	100%	95.1 %
总计	129	51.1	100%	56.3%

5、融合蛋白纯化产物的Western blot鉴定

融合蛋白纯化产物经SDS-PAGE后，电转移蛋白至硝酸纤维素膜上，将膜转入TTBS配制的5%BSA中，4℃封闭过夜，用TTBS清洗后加入小鼠抗人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的多克隆抗体（1：2000体积比）室温孵育1h，用TBS清洗后用HRP-DAB Kit显色（见图4）。

6、融合蛋白rh(GLP-1A2G)₂-HSA体外对胰岛原代细胞的刺激作用

胰岛原代细胞培养至所需细胞量时，倾去培养液，加入 5 mL 0.25%胰酶溶液消化，37℃保温至细胞开始从瓶壁脱落前，倾去胰酶溶液，加入适量以上培养基，用玻璃吸管吹打至细胞全部从瓶壁脱落；血球计数板计数细胞，用培养基稀释细胞浓度至 0.8-1.2×10⁵ cell/mL；铺于 96 孔细胞培养板，每孔加 100 μL 细胞悬液，将融合蛋白以培养基稀释至系列浓度，加入以上 96 孔细胞培养板，每浓度点设 4 个复孔，同时设置空白点、阳性对照点及阴性参照点，每实验孔均以培养基补至 300 μL，于 37℃，5% CO₂培养箱中常规培养。实验结束前，小心吸去上清，每孔加入 180 μL 新鲜培养基，再加入 20 μL MTT 溶液(5mg/mL，即 0.5% MTT)，继续培养 4 h；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入 150 μLDMSO，置摇床上低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪 570 nm 处测量各孔的吸光值(OD₅₇₀ nm)。

用单体重组人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）作为阳性对照，用生理盐水作为阴性对照，对胰岛原代细胞的刺激作用应与单体的重组人胰高血糖素样肽-1一致。具体结果请见图5,重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白(rh(GLP-1A2G)₂-HSA)与单体重组人胰高血糖素样肽-1 （GLP-1）对胰岛原代细胞的增殖作用的影响趋势基本相同，这说明采用重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白(rh(GLP-1A2G)₂-HSA)的体外生物活性与单体重组人胰高血糖素样肽-1（GLP-1）相差不大（见图5）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东泉港药业有限公司

<120> 重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白及其制备方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1935

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

catggtgaag gtacttttac ttccgacgtt tcctcatact tggagggtca agctgccaaa 60

gagttcattg cctggttggt taagggtaga catggtgagg gaacctttac ctctgatgtc 120

tcatcctact tggaaggtca ggccgctaaa gagtttatcg cttggcttgt caagggtaga 180

gatgctcaca agtctgaggt tgcccacaga ttcaaggact tgggtgaaga gaacttcaag 240

gccttggttt tgatcgcttt cgcccaatac ttgcagcagt gtccattcga ggatcacgtc 300

aagttggtta acgaggttac tgagttcgcc aagacttgtg ttgctgacga atctgctgag 360

aactgcgata agtccttgca cactttgttc ggtgacaagt tgtgtaccgt tgccaccttg 420

agagaaacct acggtgaaat ggctgactgt tgtgctaagc aagagcctga gagaaacgag 480

tgtttcttgc aacacaagga cgacaaccca aacttgccaa gattggttag accagaggtt 540

gacgttatgt gtactgcctt ccacgacaac gaggaaacct tcttgaagaa gtacctgtac 600

gagatcgcca gaagacaccc atacttttac gctccagagt tgctgttctt cgccaagaga 660

tacaaggctg ctttcaccga gtgttgtcaa gctgctgata aggctgcttg cttgttgcca 720

aagttggacg agttgagaga tgagggtaag gcttcttccg ctaagcagag attgaagtgt 780

gcctccttgc aaaagttcgg tgagagagct tttaaggctt gggctgttgc tagactgtcc 840

cagagatttc caaaggctga attcgctgag gtttccaagt tggttaccga cttgactaag 900

gttcacaccg aatgttgtca cggtgacttg ttggaatgtg ctgatgacag agctgacctg 960

gccaagtaca tttgtgaaaa ccaggactcc atctcctcca agttgaaaga gtgttgcgag 1020

aagccactgt tggagaagtc tcactgtatt gccgaagttg agaacgacga aatgccagct 1080

gatttgccat ctttggctgc tgacttcgtt gaatccaagg acgtctgtaa gaactacgct 1140

gaggctaagg acgttttcct gggtatgttc ttgtacgagt acgctagaag acatccagac 1200

tactccgtcg tcttgttgtt gagattggct aagacctacg agactacctt ggagaagtgt 1260

tgtgctgctg ctgatccaca cgaatgttac gctaaggttt tcgacgagtt caagccattg 1320

gttgaggaac cacagaacct gatcaagcag aactgtgagt tgttcgagca gctgggtgag 1380

tacaagttcc agaacgcttt gttggtcaga tacaccaaga aggtcccaca ggtttccact 1440

ccaactttgg ttgaggtttc cagaaacctg ggtaaggttg gttccaagtg ttgtaagcac 1500

ccagaggcta agagaatgcc atgtgctgaa gattacttgt ccgtcgtcct gaaccagttg 1560

tgtgtcttgc acgaaaagac tccagtttcc gacagagtta ccaagtgttg cactgagtcc 1620

ctggtcaaca gaagaccttg tttctctgct ttggaggtcg acgagactta cgtcccaaaa 1680

gaattcaacg ccgagacttt cactttccac gctgacatct gtaccctgtc cgaaaaagag 1740

agacagatca agaagcagac cgccttggtt gagttggtta agcacaagcc aaaggccacc 1800

aaagagcagt tgaaggctgt tatggatgac ttcgctgcct tcgttgagaa gtgttgcaag 1860

gctgacgaca aagagacttg tttcgctgaa gagggtaaga agttggttgc tgcttctcaa 1920

gctgctttgg gtctg 1935

Claims (10)

1.一种重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的编码基因，其特征在于，编码该融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

2.一种重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤（1）重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白表达基因表达质粒的构建；

步骤（2）表达质粒转化至毕赤酵母中并诱导表达筛选重组子；

步骤（3）重组子发酵，得到发酵液上清；

步骤（4）将步骤（3）得到的发酵液上清纯化制得融合蛋白；

其中，编码所述融合蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No.1。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）重组人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白表达基因表达质粒的构建包括以下步骤：

将序列表SEQ ID No.1所示序列的DNA片段合成后连接到pMD-18T载体上，形成pMD-18T-(GLP-1A2G)₂-HSA质粒,将质粒转化至DH5α中进行克隆,提取单克隆质粒，用两种限制性内切酶双酶切，酶切产物以重量比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳，用Agarose Gel DNAPurification Kit回收目的基因，与经过两种限制性内切酶双酶切的酵母表达载体连接，构建出重组质粒。

4.根据权利要求3所述的的制备方法，其特征在于，所述限制性内切酶为SacⅡ和XhoⅠ，所述酵母表达载体为pPICZα，所述重组质粒为pPICZα-(GLP-1A2G)₂-HSA。

5.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中表达质粒转化至毕赤酵母中并诱导表达筛选重组子包括以下步骤：将重组质粒线性化处理后电击转化所述毕赤酵母，转化结束后立即加入山梨醇，混匀后涂布于YPDZ平板，培养至菌落出现，筛选阳性克隆得到重组子一；将得到的重组子一接种于装有50mlBMGY培养基的三角瓶中，30℃、300r/min培养至A₆₀₀值为2.0-6.0，离心收集菌体，然后用BMMY培养基重悬细胞至A₆₀₀值为1.0，30℃，300r/min下进行发酵培养，每隔24h补加一次甲醇，诱导表达96h后，离心取菌液上清，SDS-PAGE分析，筛选得到重组子二。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）重组子发酵，得到发酵液上清包括以下步骤：将筛选得到的重组子二接种于YPD液体培养基，30℃、250～300rpm条件下培养16～24小时，直到OD600=2～6作为种子液，接种前用氨水将发酵培养基pH调到5.0，温度设定为30℃，溶氧始终大于20％饱和度；然后将种子液以5～10％的接种量接种基础盐培养基；培养直到甘油被完全耗尽后，开始补加50%的甘油补料，所述甘油补料每升中需添加12mlPTM1微量盐，设定补加甘油速率为18.15ml/小时/升初始发酵液体积；至菌体湿重180～220g/L时，停止补加甘油补料，甘油耗尽维持饥饿状态0.5～1h后，开始补加100％甲醇补料，所述甲醇补料每升中含12mlPTM1微量盐，进入诱导阶段,诱导前用氨水将培养基pH调到5.5，温度设定为22℃，开始补加甲醇补料；维持溶氧20%以上，诱导94-98小时下罐，离心收集发酵液上清。

7.根据权利要求2-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）将步骤（3）得到的发酵液上清纯化制得融合蛋白是依次通过染料亲和层析、阳离子交换层析和分子筛层析进行纯化，该方法至少包括以下步骤：

（a）将步骤（3）得到的发酵液上清离心过滤，得到滤液；

将滤液上样到用平衡缓冲液充分平衡的染料亲和层析柱；

用3-5个柱体积的平衡缓冲液冲洗，然后用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱蛋白液A组分；

（b）将洗脱蛋白液A上样到用平衡缓冲液充分平衡好的阳离子层析柱，用洗脱缓冲液冲洗，收集洗脱蛋白液B；

（c）用分子筛流动相液对分子筛层析柱进行平衡3-5个柱体积，洗脱蛋白液B上样柱体积的3%，用分子筛流动相液对上样的分子筛层析柱进行洗脱，收集目的蛋白液。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中染料亲和层析柱为Blue Sepharose 6 Fast Flow层析柱；平衡缓冲液为 pH 8.0的20m mol/l Tris-HCl缓冲液；洗脱缓冲液含有20m mol/l Tris-HCl和2 mol/l NaCl的溶液，所述洗脱缓冲液的pH为8.0。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（b）中阳离子层析柱为SPSepharose High Porformance阳离子层析柱；所述平衡缓冲液为pH 4.0的20m mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液；所述洗脱缓冲液含有20m mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液和0.2 mol/l NaCl溶液，所述洗脱缓冲液的 pH 4.0。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（c）中分子筛层析柱为Superdex200 pg分子筛层析柱，所述流动相液中含有10m mol/l磷酸盐、100m mol/l海藻糖和占流动相总体积分数0.01%的吐温80，所述流动相液的pH7.0。