CN112795494B - 一种基因工程菌及其构建方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因工程菌及其构建方法和用途。通过基因工程技术改造植物内生真菌齿梗孢霉，获得高表达PKS17的基因工程菌，例如，MCA17。该基因工程菌的发酵产物为新化合物MCA17‑1，其唯一手性中心为S‑构型。体外细胞实验显示，化合物MCA17‑1在1μM下即可显著抑制星状细胞活化，其本身或其衍生物有望成为治疗纤维化的候选药物。由于化合物MCA17‑1可以通过该基因工程菌大规模发酵得到，成本低，环境污染少，因此，该基因工程菌和发酵产物在抗纤维化活性的药物制备中具有很好的应用开发前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物制药领域，具体涉及基因工程菌及其构建方法和用途。
背景技术
肝纤维化是肝脏损伤修复失衡的结果，主要表现在两个方面：细胞外基质(ECM)合成增加和细胞外基质降解减少。
通过大量的免疫组织化学染色对比研究发现，在纤维化的肝脏中，原本正常的构成肝脏基本结构的肝小叶已经被严重破坏，而取而代之的是大量的纤维间隔的形成；同时，对胶原的检测发现，肝窦内有大量的Ⅰ、Ⅳ型胶原沉积，导致了肝窦内皮细胞间空隙缩小，产生胶原的细胞主要包括：肝星状细胞(HSC)、上皮间充质细胞(EMT)和骨髓来源的肌纤维母细胞。
在正常肝组织中，胶原的分泌也是一直存在的，这对于肝细胞局限炎症反应是一个保护机制。正常的修复过程中，胶原的产生和降解处于动态平衡中，因此不会导致纤维化的发生。基质金属蛋白酶(MMP)可以降解细胞外间质中的胶原。不同的胶原可以被不同的基质金属蛋白酶降解。Ⅳ型胶原酶，主要降解基底膜中的Ⅳ型胶原；胶原酶(collagenase)主要降解Ⅰ、Ⅲ型胶原。在不同原因引起的纤维化过程中，MMP的活性有所不同。一般在纤维化早期，胶原的形成旺盛，胶原酶的活力也非常旺盛。但是随着纤维化的进展，胶原的分泌占据了主导地位，胶原酶的活性将显著下降。
作为肝脏发生慢性损伤后机体的修复反应，肝纤维化的特征是肝星状细胞活化后胶原蛋白在细胞外基质(ECM)过度累积。肝纤维化可进展到失代偿期的肝硬化，在肝硬化基础上也易发生肝癌，病死率很高。肝硬化是美国最常见的非肿瘤致死病因。
研究肝纤维化的发生机制是阻止肝纤维化发展及逆转肝纤维化的关键。肝星状细胞在肝纤维化发生过程中起着至关重要的作用，因此它一直以来被作为抗纤维化治疗研究的靶细胞。抑制肝星状细胞活化是目前肝纤维化的治疗热点，包括使肝星状细胞失活和使已活化的肝星状细胞被诱导凋亡两种途径。
活化的肝星状细胞分泌的胶原蛋白过量沉积是导致肝纤维化发生的主要原因。胶原蛋白中存在的羟基脯氨酸在其它蛋白质中不存在，但它不是直接参与胶原的生物合成，是在已经合成的胶原的肽链中通过脯氨酸经羟化酶作用转化而来的。脯氨酸羟化酶(PHD)是胶原维持三螺旋稳定结构的基础，是胶原合成的关键步骤。肝内脯氨酸羟化酶活性随肝纤维化进展而逐渐升高。因此，干预4-羟基-脯氨酸羟化酶的酶活性已被公认为抑制过剩胶原(即纤维化)的有效途径。
脯氨酸-4-羟化酶抑制剂(Inhibitors of prolyl-4-hydroxylase)可抑制脯氨酸的羟化反应，减少前胶原三股螺旋α肽链的稳定性进而减少胶原合成。目前研究较多的是化学合成的小分子化合物S4682和HOE77(鲁非罗尼，lufironil)，两者能透过内质网膜，经水解后转化为有活性的吡啶-2，4二羧酸盐发挥作用。动物实验表明，HOE77具有良好的抗肝纤维化作用，抑制HSC的活化，导致前胶原和TIMP-1的m RNA表达下降，降低Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。该药具有嗜肝活性，能选择性阻止肝内胶原合成而对其他器官无影响。但该药Ⅱ期临床研究时发现可致白内障，因此已终止临床研究。
作为微生物、植物和动物的次级代谢产物，天然产物往往具有很好的生物活性，是药物发现最主要的灵感源泉。相对于化学合成的小分子化合物，次级代谢产物生产方式更加环保，毒副作用小。近三十年来，FDA批准的临床药物里有超过50％来源于天然产物及其衍生物(包含超过70％的抗生素以及50％的抗肿瘤药物)。但是，在肝纤维化抑制剂的研究中，直接来源于微生物的候选化合物几乎没有。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种基因工程菌，是通过基因工程技术改造植物内生真菌齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)得到的，该基因工程菌的发酵产物为新型化合物MCA17-1，其唯一手性中心为S-构型。在TGF-β诱导的肝星状细胞肝纤维化模型中，化合物MCA17-1在1μM下即可显著抑制星状细胞活化，有望成为治疗纤维化的候选药物。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：
本发明的第一个方面在于提供一种基因工程菌，为齿梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula)ΔaurA突变株中高表达基因簇17中的骨架基因PKS17的工程菌，PKS17的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
就本发明的上述目的，所述基因工程菌命名为齿梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula)MCA17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20248，保藏日期为2020年8月26日。
本发明的第二个方面在于提供上述基因工程菌的构建方法，包括：利用pFGL表达载体和强启动子tef1p，构建pFGL-tef1p-PKS17表达载体；通过农杆菌转化方法将pFGL-tef1p-PKS17转化进入齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)ΔaurA突变体中，并在齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)ΔaurA突变体中高表达PKS17。
就本发明的上述目的，pFGL-tef1p-PKS17表达载体通过以下步骤构建：
以齿梗孢霉的基因组DNA为模板，利用三对引物分别PCR扩增基因簇17中的骨架基因PKS17，得到三段PCR产物；将纯化后的三段PCR产物与BamHI消化的pFGL-neoR-tef1p用无缝克隆试剂拼接，形成pFGL-tef1p-PKS17；
其中，所述三对引物分别为：
第一引物对，如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
第二引物对，如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
第三引物对，如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
本发明的第三个方面在于提供上述基因工程菌的用途，包括：将所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵产物，命名为MCA17-1；MCA17-1的结构如下式(Ⅲ)所示，其具有内酰胺结构，唯一手性中心为S-构型；
就本发明的上述目的，所述的发酵培养包括：将所述的基因工程菌以1～5％接种量接种于到发酵培养基，在25～30℃、150～200rpm条件下，发酵10～15天，经分离纯化得到化合物MCA17-1。
就本发明的上述目的，所述的发酵培养包括：将所述的基因工程菌以1％接种量接种于到发酵培养基，在25℃、150rpm条件下，发酵14天，经分离纯化得到化合物MCA17-1。
就本发明的上述目的，所述的基因工程菌为齿梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula)MCA17。
就本发明的上述目的，所述用途还包括：将所述化合物MCA17-1或其衍生物用于制备抗肝纤维化活性的药物，尤其是天然产物药物。
就本发明的上述目的，所述化合物MCA17-1或其衍生物通过抑制由TGF-β诱导的肝星状细胞LX2的活化来抑制肝纤维化活性。
就本发明的上述目的，所述用途还包括：将化合物MCA17-1或其衍生物用于制备抗肺纤维化活性或抗肾脏纤维化活性的药物，尤其是天然产物药物。
本发明中，通过基因工程技术改造植物内生真菌齿梗孢霉(Calcarisporiumarbuscula)，获得高表达基因簇17中的骨架基因PKS17的基因工程菌，例如，MCA17。该基因工程菌的发酵产物为新化合物MCA17-1，其唯一手性中心为S-构型，体外细胞实验显示，化合物MCA17-1在1μM下即可显著抑制星状细胞活化，其本身或其衍生物有望成为治疗纤维化的候选药物。由于化合物MCA17-1可以通过该基因工程菌大规模发酵得到，成本低，环境污染少，因此，该基因工程菌和发酵产物在抗纤维化活性的药物制备中具有很好的应用开发前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明首次构建了齿梗孢霉ΔaurA突变株中高表达基因簇17中的骨架基因PKS17的工程菌，并利用其发酵得到唯一手性中心为S-构型的化合物MCA17-1，而化合物MCA17-1具有高强度抑制纤维化活性的优异性能，可用于制备肝、肺、肾脏等纤维化抑制剂及其相关药物。利用基因工程菌发酵制备抑制剂，易于大规模生产、成本低、环境污染少，且分离纯化简单，具有很好的应用开发前景。
生物材料的保藏
本发明的基因工程菌，命名为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)MCA17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20248，保藏日期为2020年8月26日。
附图说明
图1为基因簇17的骨架基因PSK17的结构示意图。
图2为实施例2中出发菌株与重组转化子的HPLC谱图。
图3为实施例3得到的化合物MCA17-1的氢谱。
图4为实施例3得到的化合物MCA17-1的碳谱。
图5为实施例3得到的化合物MCA17-1的DEPT90谱。
图6为实施例3得到的化合物MCA17-1的DEPT135谱。
图7为实施例3得到的化合物MCA17-1的HSQC谱。
图8为实施例3得到的化合物MCA17-1的HMBC谱。
图9为对实施例3得到的化合物MCA17-1进行ECD计算的结果示意图。
图10为实施例4中不同分组中LX2活化标志蛋白α-SMA表达的细胞免疫印迹检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。
本发明所用的菌株、质粒、细胞、试剂和仪器，说明如下：
本发明涉及的齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula，ATCC4603)购于美国典型培养物保藏中心(American type culture collection，ATCC)。
本发明中质粒pFGL-neoR-tef1p，也称为质粒pFGL-tef1p，为本实验室前期构建(质粒pFGL-tef1p的构建方法已在公开号为201810129024.5的中国专利中公开)，该质粒含有遗传霉素抗性基因neoR和启动子tef1p，启动子tef1p的序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
本发明涉及齿梗孢霉ΔaurA突变体为丝状真菌齿梗孢霉aurovertin聚酮合成酶AurA缺失株(C.arbusculaΔaurA)，为本实验室前期构建，构建方法具体请见：Xu-Ming Mao等，Efficient Biosynthesis of Fungal Polyketides Containing the Dioxabicyclo-octane Ring System，J.Am.Chem.Soc.2015,137,11904-11907。
本发明涉及的根癌农杆菌EHA105购自上海唯地生物技术有限公司。本发明涉及肝星状细胞LX2细胞购于德国Millipore公司。本发明涉及人源TGF-β1蛋白，购自北京义翘神州生物有限公司。本发明涉及奥贝胆酸(obeticholic acid,OCA)，购自MCE(MedChemExpress LLC)。
本发明所用的培养基如下：
1.固体LB培养基(1L)
蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂粉20g；121℃灭菌20分钟。
2.液体LB培养基配方(1L)
蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1L；121℃灭菌20分钟。
3.液体诱导培养基配方(1L)
葡萄糖1.8g、甘油5mL、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸8.53g、七水硫酸镁0.6g、氯化钠0.3g、二水氯化钙0.01g、硫酸亚铁0.001g、硝酸铵0.5g、pH4.8磷酸钾缓冲液0.8mL、微量元素(七水硫酸锌0.1g、五水硫酸铜0.1g、硼酸0.1g、一水硫酸锰0.1g、二水钼酸钠0.1g)5mL，pH调整到5.5。
4.固体诱导培养基配方(1L)
葡萄糖1.8g、甘油5mL、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸8.53g、七水硫酸镁0.6g、氯化钠0.3g、二水氯化钙0.01g、硫酸亚铁0.001g、硝酸铵0.5g、pH4.8磷酸钾缓冲液0.8mL、微量元素(七水硫酸锌0.1g、五水硫酸铜0.1g、硼酸0.1g、一水硫酸锰0.1g、二水钼酸钠0.1g)5mL，pH调整到5.5，琼脂粉20g。
5.马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)液体培养基配方(1L)
PDB 24g，蒸馏水1L；121℃灭菌20分钟。
6.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养基配方(1L)
PDB 24g，琼脂粉20g；121℃灭菌20分钟。
7.选择培养基配方(1L)
PDA附加0.3mg孢噻肟钠和0.1mg遗传霉素。
8.DMEM培养基、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)，购自Thermo FisherScientific。
实施例中，浓度单位μM是领域内惯用书写方式，代表μmol/L。
实施例1质粒pFGL-tef1p-PKS17的构建
对齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula，ATCC4603)进行基因组测序分析，确定其基因组序列(GenBank：WBSA01000000)；再采用antiSMASH进行分析，预测齿梗孢霉菌株含有65个生物合成基因簇。
对每个基因簇进行分析后，我们选择基因簇17(contig9:1240286-1278355)为目标基因簇。基因簇17含有一个独特的PKS－NRPS酶，为基因簇17的骨架基因。我们将PKS－NRPS酶命名为PKS17，其结构分析如图1所示，PKS17的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步，利用PCR方法扩增基因簇17中的骨架基因PKS17，从而构建质粒pFGL-tef1p-PKS17，具体如下：
以齿梗孢霉的基因组DNA(GenBank:WBSA01000000)为模板，利用如表1中所示的三对引物(3+4；5+6；7+8)(即SEQ ID NO.3～8所示的引物)，分别对基因簇17中的骨架基因PKS17进行PCR扩增，得到三段PCR产物；再将纯化后的三段PCR产物与BamHI消化的pFGL-neoR-tef1p用无缝克隆试剂盒(Vazyme,China)拼接，形成质粒pFGL-tef1p-PKS17。
PCR扩增的条件：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃2min，循环数30个；72℃5min。
表1构建质粒pFGL-tef1p-PKS17所用引物
实施例2：基因工程菌MCA17的构建
通过农杆菌转化方法将重组质粒pFGL-tef1p-PKS17转化进入齿梗孢霉ΔaurA突变体中，构建基因工程菌MCA17，具体方法如下：
1)将上述实施例1得到的重组质粒pFGL-tef1p-PKS17电转化入根癌农杆菌EHA105，涂布于含100μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的固体LB培养基上，28℃培养48h，挑单菌落PCR鉴定，得到重组农杆菌；
2)将步骤1)得到的重组农杆菌单克隆接种于5mL含100μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，200r/min，30℃过夜培养；
3)取1mL步骤2)得到的重组农杆菌培养液，离心得菌体，并用5mL含200μM乙酰丁香酮的液体诱导培养基重悬菌体至OD600约0.1-0.15，28℃避光振荡培养6h左右，使OD600达到约0.8；
4)将齿梗孢霉ΔaurA突变体菌株(又称出发菌株)接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)25℃培养7天，用含1‰吐温20的无菌水洗下真菌孢子，并用塞了无菌脱脂棉的无菌注射器过滤收集分生孢子，用血球计数板计数后，用液体诱导培养基稀释分生孢子浓度至107/mL；
5)取100μL步骤3)培养好的重组农杆菌菌液与100μL步骤4)稀释好的分生孢子悬浮液混合，共200μL均匀涂布于铺有玻璃纸的固体诱导培养基表面，25℃避光共培养48h；
6)将步骤5)共培养菌体的玻璃纸平移至选择培养基上，25℃倒置培养7天至转化子出现；
7)将步骤6)转化子通过菌落颜色筛选法，将有颜色的转化子进行HPLC检测以鉴定代谢产物，具体为：挑选有颜色转化子，经乙酸乙酯萃取后进行液相色谱检测。
高效液相色谱检测条件为：色谱柱：XDB-C18，规格：5μm，
4.6×150mm、流动相：A相：水+1‰甲酸，B相：乙腈+1‰甲酸、流动相体积比：0-20min：B相：A相＝30：70-0：100、流速：1mL/min。
重组转化子的HPLC谱如图2中ΔaurA-PKS17所示，为了进行对比，图2还给出了出发菌株的HPLC谱，如图2中ΔaurA所示。由图2可见，相较于出发菌株，重组转化子的HPLC谱中出现了新的代谢峰，表明重组转化子中该基因簇17成功激活，将该重组转化子命名为菌株MCA17(又称基因工程菌MCA17)。
将上述基因工程菌命名为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)MCA17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.20248，保藏日期为2020年8月26日。
实施例3：菌株MCA17的发酵产物的制备、纯化和结构鉴定
将基因工程菌MCA17进行发酵，得到天然产物，经分离纯化后，得到化合物MCA17-01，具体包括以下步骤：
1)将上述产生新的代谢峰的基因工程真菌菌株MCA17接种于PDA板培养基上，25℃培养5～7d，收集菌株孢子，然后，将其以1％接种量接种于装有300mL PDB培养基的1000mL锥形瓶中，25℃、150转/min摇床振荡培养12～15d，得到发酵液。
2)将发酵液通过盐酸(HCl)调节至酸性(pH值为2.0～3.0最佳)，利用等体积乙酸乙酯进行萃取，以去掉下层培养液，重复萃取三次，将萃取得到的液体进行旋蒸，获得浸膏。
3)将步骤(2)所得浸膏用甲醇溶解，通过反向C18柱进行初步分离，采用水和甲醇混合体系(水与甲醇的体积比为3:7)进行洗脱，对分离所得各组分进行高效液相色谱检测。
4)将步骤(3)中HPLC检测到的与新的代谢峰一致的组分进行旋蒸富集，然后将富集之后的浸膏用30％甲醇溶解，通过分离纯化设备—半制备仪器(大连依利特P3537002370半制备高效液相色谱仪)进行定向分离目标代谢峰，得到纯度为95％以上的化合物，命名为MCA17-1。
将步骤(4)得到的化合物MCA17-1溶液旋干得到其浸膏，经DMSO溶解后，进行核磁共振检测，得到：一维NMR核磁共振氢谱如图3所示，一维NMR核磁共振碳谱如图4所示，二维核磁共振DEPT90如图5所示，二维核磁共振DEPT135如图6所示，二维核磁共振HSQC如图7所示，二维核磁共振HMBC如图8所示。
根据核磁数据(图3～图8)的鉴定结果，可以确定化合物MCA17-1的分子量为277，其结构如下式(Ⅰ)所示，
由于该化合物有一个手性碳原子，因此具有两种可能构型：R-型和S-型，分别如式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示。
进一步，对步骤(4)得到的化合物MCA17-1进行电子圆二色谱(ECD)和旋光检测，得到ECD谱，如图9中Exptl.ECD Of MCA17-1所示；同时，计算上述如式(Ⅱ)和式(Ⅲ)所示的两种不同构型的化合物的电子圆二色谱(ECD)理论值，分别如图9中Calcd.ECD Of(3R)-MCA17-1和Calcd.ECD Of(3S)-MCA17-1所示。比较三条谱线，发现化合物MCA17-1的ECD谱与S-型化合物对应的ECD谱吻合比较好，在225-450纳米处都是负的第一科顿效应(CottonEffect)，由此可以确定化合物MCA17-1的绝对构型为S-型(其唯一手性中心为S-型)。
此外，化合物MCA17-1还具有以下特征：
紫外吸收的最大吸收波长在385nm。经甲醇溶解呈黄色。
实施例4：化合物MCA17-1的抗纤维化活性性能研究
用含2％FBS的DMEM培养基培养肝星状细胞LX2细胞，置于37℃、饱和湿度、含5％CO2的细胞培养箱中进行常规培养，按照1:2传代；当肝星状细胞LX2生长密度为80％～90％时，加入1.5ml胰蛋白酶，3分钟后，加入1.5ml DMEM培养基终止，将细胞收集在15ml离心管中；将该收集有细胞的15mL离心管300g离心3分钟，取20μL细胞液体用细胞计数仪进行细胞计数；用DMEM培养基将细胞重悬至150000cell/ml，混匀，按500μl/孔加入已铺好Matrigel胶的24孔板(型号#3524)中；细胞贴壁后，换含0.5％FBS的DMEM培养基饥饿培养12h；向各孔中分别加入不同分组的化合物溶液，500μl/孔，混匀，置于37℃培养箱，孵育24小时；用PBS缓冲液洗细胞两遍，每孔加入100μl 1×的上样缓冲液(loading buffer)，细胞收样于1.5ml EP管中；100℃煮样品10分钟，离心后放入-20℃冰箱待用。内参为GAPDH。
不同分组化合物共六组，分别为：
NC组：0.5％FBS的DMEM培养基加入一定体积的DMSO，稀释200倍；
TGF-β组：0.5％FBS的DMEM培养基配制浓度为10ng/ml的TGF-β溶液，再向TGF-β溶液中加入一定体积的DMSO，稀释200倍；
OCA(50μM)组：用含0.5％FBS的DMEM培养基配制浓度为10ng/ml的TGF-β溶液，再向TGF-β溶液中加入一定体积的OCA，稀释200倍，OCA终浓度为50μM；
OCA(20μM)组：用含0.5％FBS的DMEM培养基配制浓度为10ng/ml的TGF-β溶液，再向TGF-β溶液中加入一定体积的OCA，稀释200倍，OCA终浓度为20μM；
MCA17-1(1μM)组：用含0.5％FBS的DMEM培养基配制浓度为10ng/ml的TGF-β溶液，再向TGF-β溶液中加入一定体积的MCA17-1，稀释200倍，终浓度为1μM；
MCA17-1(10μM)组：用含0.5％FBS的DMEM培养基配制浓度为10ng/ml的TGF-β溶液，再向TGF-β溶液中加入一定体积的MCA17-1，稀释200倍，终浓度为10μM。
将收取的细胞蛋白样品用10％的SDS-PAGE胶进行细胞免疫印迹实验，对LX2活化标志蛋白α-SMA进行检测，结果如图10所示。
由图10可见：TGFβ单独刺激组中，α-SMA表达明显升高，说明TGFβ造模成功；化合物MCA17-1组和OCA组中，α-SMA表达明显低于TGFβ单独刺激组，说明化合物MCA17-1组和OCA组均能抑制由TGFβ刺激带来的α-SMA表达升高，这意味着肝星状细胞LX2的活化得到了抑制。并且，在1μM下化合物MCA17-1即可明显抑制星状细胞活化，这意味着MCA17-1有望成为治疗纤维化的候选药物。进一步，其化学修饰的相应衍生物也具有抗纤维化活性，同样有望成为治疗纤维化的候选药物。
序列表
<110> 浙江大学
中国科学院上海药物研究所
<120> 一种基因工程菌及其构建方法和用途
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12498
<212> DNA
<213> 齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)
<400> 1
atgacgaaaa cgacatcgtc gtcctcagag cccatagcca tcgtgggtag tggttgtcgg 60
tttccaggcg gtgccagttc accctcttcc ctgtggaagc tgcttgaaaa ccctcgtgac 120
ttatgtaaag aaatctcatc ggaccggttt aacacaacgg gcttctatca ccacgatggc 180
gccaggcacg gaactaccaa tgttcgccac tcatacctgc tggatgagga tgtgcgtgtg 240
tttgacgccg cgtttttcaa tatcagtgcc aacgaggccg aagcaatcga tccgcagcag 300
cgcctgctct tggagacggt gtacgaagcg ctcgaggctg gcggacaccc tctcgaccgt 360
ttacgaggat ctgacacgtc ggtttacgta ggcaccatga gtaagtattt cgtttctatg 420
caccacctcg atcaaacttt ccgtccttgt taagagttat gctcctctga agactcggcc 480
gagtttggaa aagaggaact ccaataactt tactgagacg aggagctgat gtgactatgg 540
ctaactcgcc tgttccctag ccgtcgatta ccacgacact cttctacgag accacaacac 600
catcccgaaa tacttcgcca cgggaatcaa cagggctatc atctcaaata gagtctcgta 660
cttcttcgac tggcacggac cgagcatgac cattgacacg gcatgttcgt cgagtttgat 720
tgccgtgcac cagggtgtgc aatccctgcg caacggcgaa tcacagatat ccgtggcatg 780
tggtacgcaa gtcctcctgg ggtatgatat gtacatcggt gagagcaagc tgaaaatgct 840
ttctcccaac ggccggtcgc ggatgtggga tgcggatgcg gatggctacg cccgcggcga 900
aggcgtggcg gctgttgtca tgaagcgctt aagcgatgct attgccgacg gcgaccacat 960
cgaatgcatc atccgggaga caggtgccaa ccaagacggc ttctcgaacg gcatcactgt 1020
tcccagcacg gaggcccagg cggctcttat ccgccggacg tacgccaaag ccaacttgga 1080
ccctgaaaac aatcctagcc atcgaccgca gtacttcgaa gcgcacggga ctgggactca 1140
agctggagac ccaaaggaag ccgctgctat atacgaggct ttgggtcgac acaaccatgc 1200
tgccggcacc acacctctct acgtagggtc tatcaagacg gtcgtcggcc acctcgaagg 1260
tgccgcgggc ctggcaggtt tgctgaaggc ctccaacagc attcagaaag ggctcatccc 1320
tccgaacctt tccttcagcc gcttgaaccc taagattgag ccgttttata agggcttgca 1380
ggttcccacg agtcttaccc agtggccaac actccccaaa ggagttcctc gacgagtaag 1440
cgtcaacagt ttcggtatgt actgctgaga gtctcaaatt cagtatttgt tttacacgtg 1500
tccaactaac cataatctct tgcacgcagg gtttggaggt gctaacgccc acgccatttt 1560
ggaagagcat atgccatctg cttccgactc ccaacatgac gacaactcgt ctgttctgac 1620
cccttttgtc ttctcagccc ttaccgagac atctctggtt gcccttctgg agcagtactc 1680
ccgggttctg aaggctcgtt ctgatggcat ccatggcccc gacttggctt ggaccctgca 1740
ctcgcgcagg agccaactcc ccaccagagc gagcttcact gcgtcgacca tccaacagct 1800
gagcgccaag atcgatgaaa agcttgctgc tgtcaaaagt aatacaggca tggcgatagg 1860
cattcgctcc agcggcaagc cggcagtatc tcgcgtccta ggcgtgttta caggtcaagg 1920
tgctcagtgg ccagcaatgg gagcacagtt gattcgctcc tcaaatttcg tttctcatag 1980
gatccagcat ctcgaagaat ctttggacac cctaccgcct gctgatcgcc cagagtggag 2040
cctccgtgga gagatgctgg ctggaaatga tacgtcgcgc atcgctgagg cggcgctttc 2100
gcagccttta tgtacagccg tgcagattgt tcttgttgat cttctgcagg cggccgggat 2160
taccttcgcc gccgtcgtgg gccattcctc cggagaaatc gcggcggcgt atgctgctgg 2220
cttcctctcg gctcatgatg ctatccgagt cgcttactat cgtggactat atgctcgact 2280
agctggcaat aaagccaatg gccagaaagg ggctatgctt gcagtcggca cgtcctggga 2340
agatgcgcaa gagcttgtca gtctgcaagc tttcaagggt cgacttgcta tcgctgcgca 2400
taactcatca gccagtgtga ccttgtcggg agatgcagat gccgtcgtgc acgcaaagaa 2460
gctgctagac gagcagaaga aattcgccag gctattaaag gtcgacaccg cctatcactc 2520
tcaccatatg ctcccatgcg gcaatgcata catcgatgcg ctgcgagcct gtggggtccg 2580
cgtcaatcgt gatcgaagca gtgcctgcaa gtggttttca agtgtggttc ccggtgctga 2640
gagcatggag cctgtacaag ggcttcaaga cgtctactgg aaagataaca tgactagcgc 2700
agttttgttt gctgacgctg tcaagaatgc catctcgagt gatgaacaga taaaccttgt 2760
tctcgaagtc gggccccatc cagcactcaa aggcccagcc acacagaaca tcgccgatgt 2820
gcgaccaacc cctgttccat attatggcgt ggttgagtcg tgggaaagac gatgtcgatg 2880
ccttctccga aactctaggc gctgtgtgga cactcctggg tgccaaggca gttgacttgt 2940
cgtcctttga ccgggtcgtg acgggcgaat cacgaaccca cgagctggtg gtcgacctgc 3000
catcctacca gtgggaccac gggagaattc actggagtga atcgcgccgg tcgaagaaga 3060
ttcgtgggag gaagcagttt ccacatgaat tgcttggtgt tttgtctcca gagtccaaca 3120
accacgacat gcgctggtcc aatattctca aagtgtccga gatcccctgg atggaaggcc 3180
atcagctgca aggcctgatt gtgttccctg ccgcaggcta tgtcgcaatg gctatagaag 3240
catgccgcag tcttgctggt gacaaggcag tggagctttt cgagctccat gacctctcca 3300
tcccaagagc catcactttc gacgagggag aggcatcggg cgtcgaaatc ctcgctacgc 3360
tgacggctat tgagcactat ccagacgaga ccatcacggc tagcttctca atttactctg 3420
ccccgaacgt cagcaccgga tcggatcacg acatggagct tgtggcaagt ggaactgtta 3480
aaatattgct tggtaaccca cacccagcag cattgccctg tgctgtcgcg gttgaagact 3540
ataatatgac cgaagtcgat gccgaccgcg tttatgacat gttctctgag ctagggtatg 3600
gctacactgg tcccttccga ggaatgtctg cgacgaagcg cagacttaac caggcttctg 3660
ctttggtgga cacgtacagc tactcggatg atgagtctac cttctatctg gtacatccga 3720
gcatgctcga cgtcgccata caattgtcga tgctcgcgta ctcgtctcca ggagacgaac 3780
gtctctggtc tctccatgtt ccgacaagcg ttcgcaccat tcgagtcaac ccagaggtgt 3840
gcacagcact ctcaaccacc ggatctcgag tcccaatctc cactacactc aatggcgatg 3900
tagactcttt cgtagccagc atcgacatat ttagtgaaga tggtgaacaa ggtatgatcc 3960
aggtcgaaga cctgactctg aaacctttcg cccctgctac cgcggctgag gatcgttgga 4020
tgtactcgtc tacaaagctc gacgtggcgg ccccagacgc atctttcctg gtgaattcga 4080
aattggaact tccatctgtg ggcgaaacag aggttgcagc tgcatgcgag agaatctcgt 4140
attactactt gcgcaaatgg aaatcagaca tcacggacca cgaatgggcg aactccagcc 4200
aaccacatca tctacatctt cgcaactttg tcgaccacac gatttcccgc gcgtccaccg 4260
gacagcaccc gaccctcaag aggcaatggg caaacgatag cgagcaagat atcagagagg 4320
tgatatccag tcatccggat gatgccaccg tcaaactcct cgcggtagtc ggggagacta 4380
ttccagctgc ggtgcgaggc cagacagcaa tactcgagca tatggaattg aatggtctcc 4440
tcgaagacta ctatagcaaa ggtctcagct acgaaagata ctattcgttc ttgacaggca 4500
tggtgaagca gatgacgtat cgatatcccc acgccaggat tcttgagata ggtaagagtt 4560
gtcattcaac cacactaatc gaatgtaccc ttggcaggct ttgacaaata ctaatcttga 4620
gtatcaggaa ctggaatgag cgggcccaca aagtcaatta ttgaggctat tgcgagtcgt 4680
gggggtgcca tggtctccta cacctacaca agcacgtcat cagagagcct gaagagggca 4740
acagatgttt ccatacattc agcgatcata tgacattcaa ggtgttggac gtcgagcaag 4800
atccaaccgg ccaaggatat gaggcacact cgtacgacat tatcatcgcc tccaacgctt 4860
tacatgctac gaccctcgct tcagaagaca ttagagaata ctcggcagct gttaaagccg 4920
ggaggatatc ttgcgctgct tgaaatgacc gacaacaacc cggttcgttc ggcaactatt 4980
atgggtgggc ttccttcttg gtggattggt gtttctgatg gccgtaagta tgcgccaacc 5040
gtagcgcctg gggtatggca tgcggtcatg cgcaaggctg gattcggagg catcgacacc 5100
atcactccaa agaatggggg ctccaacata gcttggccgt tttccgtcat ggctgcccag 5160
gcaatcgacg accaagtgct cttcctgcga cggcctcttt cgtcgccgtc tccctcagtc 5220
gtcattgaca gcctagttat cctcggcact gaaagctacg agagttcccg gatcgccgaa 5280
gaagtctctg acagcctcag gcgcttctgt ggcaacatcg tcattctcaa tggcctgcct 5340
actgagtctg aagcgcagac tctggatcca atgagtacct tcatcaacct cgtcgatctc 5400
gactcgccca ttttcaaggc tatgacaagc gaaaaaatgg ctggcctgaa gcgactcttt 5460
gaactagcca gacacgtctt gtggctcact catggcgctc agctgggcga ggagccctac 5520
tatgctgcaa gtttggcctt ttgccgctcg ctgacaaatg agtcaacaca tatcagcttc 5580
aacgcccttg acgtctcaaa tcttgacgat ggcgtctcca aggtcatagc tgagcaaatc 5640
ctacggcagt gtgctcttga agaatgggac caaaaacagc tcctgtggtc gaaggagcct 5700
gagacctttc tccacaacgg gaagctactg ctccctcgca tcattccgaa tatcggccag 5760
aatgccagat taaactctag caggcgtgtc atcacgaaca cggtgccagc gtcatcgtcc 5820
gacttctcac tgatttcaga taatgccgcc acgctgcccc gactggtgga agatattttg 5880
ccacccaggg cgactaaaga tagccctgcg gtcctcgttg gggtggactc ctcaagcttg 5940
atggcactcc gtgtcgctcc tgatacattt ttattccttg ccgttggtaa agaagatgcc 6000
tcagggtgcc ccgttgttgt gttatcgacc gcgaattctc gtaggacagc accggtggca 6060
tccctgccag tagctgatat caacatcact aatgttaatc atctacacgt tgctatcgca 6120
agcgagcttc tagctacatc cttgatccgg gacctagctc cggggagccg catattaatc 6180
aacctttcag gaaaagatcg cttcctcgca gcagccctag agcgaggggc tgccgccaaa 6240
gatgtcaggg tcaccttctc atatgccgct gacgaaagcg acggcgacaa tattgaagat 6300
atggacccat cttggattag attaggtgct cgtataccaa ggcatgttat gcgaagaaag 6360
ttagtcccgg tgcagccaac gcatttcctc gacttaacta cacgttctgg agttcgttca 6420
aagagtggcg taggtctaaa tattgcgcag gttctgtcac cggattgcaa gcagattgat 6480
acgtcagacc tcacccagcg gcaagcctac ctgcctccgc tgattgatcg cgaggttttg 6540
gtcgatcagc ttcaagatgc cgttgtcggt gccaaggaag ccatgtcagt gtcgaacaat 6600
gaggaggaaa gcgtccagga catcagtctt catctgcacc aacttcatga cccgtctaca 6660
cctcaccaca tgacgagtgt tgtgcaatgg ccagtgaatg gaccagtcag cgtagaggca 6720
cgccctatga atggcgaaaa tatcttttcc aaggacaaaa cctatgtgtt atttggtctt 6780
agcggccagg taggacagtc gctttgtgag tggatggtat ctaatggagc agggtgtgtg 6840
tgcttgacga gccgtcatcc aaaggtcgac cagaagtggc tcgattcttt ccagggaacc 6900
agctcaaccg tgaaggtctt ggcggctgat atcaccgaca aggacagtct ggatggagtc 6960
ctcgagacca tcagagcaac ctgtccaccg atcgccggtg tcgctaatgg agccaatgtc 7020
ctgaatgacg cgccattcag tgcaatgtct accgaaatga tgctgcaagc cctgggaccc 7080
aagatcgacg ggtcgtataa tctggaccag gctttctaca atgatgaact cgatttcttc 7140
atcttgttct cgtctatatc gtgtgtcatt gggacagcag gccagtctaa ttatgtggct 7200
gcaaatggct acatgaacgg tcttgccagg cagaggcgac gacgtggcct agccgcgtct 7260
gcatttgaca tcggcctcat tctcggaatc ggtttagcgg aggcggctgg ccaacatgtc 7320
gtcgactcac tacgaaagta cggtattata cccctctccg agccagatgt ccggctagcg 7380
ttcgcagaag gaatccaagt cggctattca aacctggagg acgaagagcc cggcgccatc 7440
cctgccgcag tgatgacgag cggtctccgc accataacat ctgacgagac gaacattgta 7500
tggtataaca accctatatt ttcacacctt gtcatcgaca ccaaagacgc agatggtgcc 7560
gaggatgagt ctagaaacaa ggtcgccgct ctccctgtca aggagcagat tgctagggca 7620
gaaacgaaag aagcagcctt ggaagtagtc aaaggtaagc caaaagcaac ttttgaagca 7680
caacatacta atttgataca actagaatgc ttctctacga agctgcgtat tgtcctgcaa 7740
agtgcggatc aggaaattgc ctatgatgcc ccccttgtcg aacttggcat cgactcgctc 7800
gttgctgtgg aggtgcggtc ctggtttttg aagacgctca aggttgatat tccggttctg 7860
aaactggtcg gcgggtcatc tctcgacgag gtctgcgaac tagccatgaa gaaactgccc 7920
gaggaccttg tagcccagat tgggacgacc gctgccgagt ctacgcagcc catcattacg 7980
cctcctaagc cgaagccgca gccgccgcaa aaacctcaat ctgcaaatag cggcgggtca 8040
acctctccat ctgagtacga gaactcgact caaggcctac gaactccacc accagtggac 8100
acaccaatct ccacgacaac gccagtgtca ttgtccgtga ggtttcctca caaggatgag 8160
gtgacggact ccacgaagcc cagcactagc acattcgtca agagccagcc catatcgatc 8220
ggtcagtctc ggttctggtt tctccgtctc ctggtggagg atccgactac attcaacgtg 8280
gccttgagct tccgtatgaa cggcgcggtg cgtgttggcg atttagagag agcccttcgt 8340
gttgtgactg caagacacga atcactgcgt acatgtttcg ttggggacga agaagaggca 8400
gaccaggcgt ctcagaatgt tttggcacgc tctcaggtca aacttgagcg aaaatccatc 8460
acttcggtgg aagaggctac agccgagtac gtgaagctgc gggctcatga atttgacctg 8520
tcgagcgggc ccctgctacg actaatgctt ctcacattat cgccgacttc tcattacctt 8580
ctcgcctgct accaccacat tataatggat atggcaagct tccagatcct cacttcagaa 8640
ttagaaaagg tctacaatgg ccagccactc gggcccccgc ccagccaata ccctgatttc 8700
tcggcggttc aacgacaaac gctcgagaga ggggaactga atgacgagct caagtactgg 8760
cagggcgttt ttccagctgg agagcagcct ccagtcctac cgcttcttcc catggctcgg 8820
tcaaactcta gactagcgat gaccaactac gcagttcatc aggtaggcat tgaactcgag 8880
ccagcattgg ccgcgcgtat caagtccgtc tccagagcac agaggtcgac gtcattccac 8940
ttctacctag cagcattcaa ggcgatgcta ttttccttta cggatgctca agatctgact 9000
attggcattg ctgatgccaa ccgcaacgat agcgacgtga ttggcagcat cggcttcttc 9060
ctgaacctac tcaccctgcg gttccgtcgg caaccaaatc aaacctttgc agatgctgtg 9120
gttgaagccc gcaatactgc ctacgcagca ctaggaaact cacgcctccc gtttgatgtg 9180
ctactcaaag agctgaatgt ggcgcgttct tcatcgtaca gcccgttctt ccaggcattc 9240
ttcgactata gacaacaggc cagtgacagg cagacctggt gcaattgcca gtttgatcta 9300
gcggagctgc atccaggaag aacggcatat gacatctcac tggatgtagc tgacctcggg 9360
tcaaatgtcc acgtcagtct ccgggtacag aaaggcctgt atgacctgac agcggcaaat 9420
ctattgctgg agacatatgc acacttgatc aatgttctcg ctcaagatat gtcgctcact 9480
cttgaggaaa ctcctctatt cagcgaggaa cagcttaccc gctctgttga agttggccga 9540
ggtcctagca tggcctcgga ttggcctgca acactgcctc atcgcatcga ccagatttcc 9600
cgggacaatt ccagcaaggt tgcgctcatg gacggccttg gcaacagtat cacgtattct 9660
gacatgatca agcgcataga ggcgatatct gaggcactag cacatgccgg cgttggcccc 9720
gcctctcgcg tgctcgtctt ccaacaggcg tctaccgact ggatatgctc tatgcttgct 9780
atcatgcgca tcgggggtgt ctatgtgcct ctagacctcc gcaaccccat cccacgcctg 9840
gcggcccagg cagatcactg ccagccaagc gccgtcttag ctgacggcac cacggtcaac 9900
gacgcgcctc agctcaaggt tgccactgtc atcaacgtga ctcgggttcc gtcttcaccc 9960
ctcggactcg cgtcaccaac gttgcgcatc cagagtcgcc tgcggctatc ctatacacca 10020
gtggctctac aggtaccccc aagggcatca tcattcgaca ctctggcatc cggaacgaga 10080
tggagggtta cacaaagaca tataaacttg gggccgagcg tgtcttgcag cagagcgcat 10140
tcacctttga cttttccgtg gaccaaatct tgcactggcc tcgtcaatgg cggtatggtg 10200
tacgtggttc cctctagcaa gcgtggcgat ccggtctcta taacggaaat cattcggcag 10260
cattctatta cgtacaccaa ggtcacgccc tcggaatact ccatgtggat gcagtacggc 10320
ggcgataacc ttcggcaagc atccagctgg cgtttcgcct ttggaggtgg tgagcctctg 10380
acgaagacga tactgcgtca gtttgccgaa ctaaatcttg ggcagctagc tctgcacaat 10440
tcgtacgggc cggccgagat ttccattgcg tcgcacaagg ggctaattga ctaccgcaaa 10500
tcgagcaaag agacgtcccc agaggaggac gtgcctgtgc cgtgcgggtt ttctctaccc 10560
aactacgcaa catatattct ggacgagaag ctaaagccgc tacctattgg gatgccagga 10620
gaggtggtca tcggcggcgc tggcgtatct ctcggctacc tgacgaaccc agacctcact 10680
gctcgcgtgt ttttgttgaa cccttatgtg actagcgaac acatcgtcaa cggctggacc 10740
aggatgcatc gcacagggga tatcggacat ctgcaagagg atggatctct tgttttccgg 10800
aaccgcgttg aaggcgacac acagattaag ctgcggggtc ttcgcgtcga tctgcgagac 10860
gtcgagacca atatgatctc gactgctggg ggtgtcctga aagaagtcgt cgtcacgctt 10920
cgtgaaggtg atcctgacta tcttgtcgca cacgtcgtct tcgccccgca gcacaacggt 10980
ggcgacaagg atgccttcct agaacaactt ctcagccgtc ttccaattcc ccagtacatg 11040
atacccgtgc tggcgatccc gctcgataac cttcctttaa ccaaccactc caaagtcgat 11100
cgcaagtcca tcaagaacct agctctgcct aggcgagtca agctagtcga tgatgccgaa 11160
gacgacgatg cagacttggc cgagaccatg acgcggctaa ggaagctgtg gcgggaggct 11220
cttcctgaca gcgagaaact cggacttgcc atgacggcgt cgactagctt cttcctggtc 11280
ggcggtaact ctctgctagt agtccgactc cagtcacgaa tccgccaggt cttcaacgtc 11340
gctgtccgcc taatcgacct cctcggcgcc aacacgctcg gacagatggc gcgcaagatt 11400
gaggaaagcc ccagtgtcaa cctcatcgac tgggatttag agaccactcc gccatctatt 11460
cccagcttcc tcaaggacct ttctgcgagg aaggagacag agggcaagac tgtgctggtg 11520
actggtgcga cgggcaatct tgcaaaacat ttattcccgc tgctgccagc ggatccgcgc 11580
gtgggcaaaa ttcactgcgt cgtgcgggac aagccgcgcc agggcaacct cttctcccac 11640
cccaaggtgg tctaccatgt cggcgacctg tctctcccgc tgctcggcct tggcgtggac 11700
gagttccgcg gcctggccga ccaggtggac gtggtgctgc acctcggcgc ggttcgctcg 11760
ttctgggaca actaccacat gctgcgccct accaacgttc acccaactaa ggagctcgtc 11820
aagctggcgg cagcacggcg aatccccatc cacttcatct cgacctcggg tgttctgaca 11880
cgggaggaag tacaggctga tggagtcgcg tcttcggcgg cggctaatga gccccctgcc 11940
gatggctcag aaggctacat tgcatccaaa tgggccagcg agcgccttct ggagcgttct 12000
gcggcgagcg agctggcagt gccgtcctcc atctaccgcc tcctcccttc gtcagcccag 12060
gcgcaggcgc agccacaaca tctaaagcgc caggcactgg acgaaatcgt gcgctgtatt 12120
gaccttgctg gcgtgatgcc cgattgcaca ggctgggagg gtcgcatgga cttgatttct 12180
gctgagctgg tggccgtgtg gctatgcgag tctctgctca agtccaggtc tggctcagcg 12240
caaacaggag aggctgcgaa tggtacagag atggccgtta cccggttctc acattgcgcg 12300
agctccatca ccatccaggt agacgagctc aaggcgtttg tcgaagagca gagaggaaag 12360
gagagccgtc tcaagcggct acctattctc aaatggatgg gtcgtatcaa ggcggttggt 12420
ttctcgtaca tcttggcgtc tcaggaggca acagtcggaa gcaccgaggg gggagctagg 12480
cttagatcgc gaagatga 12498
<210> 2
<211> 2869
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttggctatc acctatatcg agataggagt ccaacgagtt tctattactc tatacgggcc 60
tggctgaccg ttcgaccacc tgggcggact ctcgggcttc ttgttgggac gagaggcgga 120
ttgttttcgg ttatgaggag gctgttgtgt cggggtgggc agtcaggtgg gtggaagaaa 180
ctggcgggct ggcaggacag ctggcagaca ggcagacggt tttcgggtag ctgcatctgg 240
tgatgcttca gctgtcggtc gttggtggtt actggtgggt attgtacacg cacgctgtag 300
gtgattcggg aggcgtcagg gattcgtatc gtcttcttgg tcgcaggtat cggccgtact 360
gacattacag ttacttatga ggtcgggata tgcctgctcc tcttgtgagc tgttgaggca 420
gagaatacca agcacatggc tggtttgact cccgatatcc atggagtctc tgctcaagtc 480
tgtgcaagct cttttgcgtt tgtgtgactg ttttagtcac caacccaatg gtttgagtgt 540
cgatggtgtt tggtaaggca tcgcaaaagg agaaagctaa atcgagggcg ctgccctaga 600
tctcgtcatg gctgaggctc atcgcagtta cgccatgact ggaaattgag catatagaat 660
gaagacagca aaagtagcat tcaaaggggc gagagacttt atcatgtgca aacgtagtgt 720
gtgtatgtgt cttaggtatc taattcgcag gagatccata tccacggcac ttccaccaca 780
atcggctcta ggtagtactc aaaagcagct ctttgtggct ttgtgggcca gggtaataag 840
gaccgaaagc caaaagggtg atactactcg cccctcgaag ctgcaagacc catttcgaac 900
cggaatttcg cgcggcaaac atatctttta ctttttctac tccgtatggc gctgtcttag 960
cgctagcggg agagatgaat tttctgcagc tccaagtgtg ggcacagact tggcggaaga 1020
aaaaagcacc ctagtgtcct ggccccgcgg tcgaagacaa catggttgat tgagcatagt 1080
acatgatgcc gacttacctc gacttatatc gtgttgattt aatatacaat cacttacgat 1140
ccgtggatgt ttctgtaaat ttcctaaatc tctagatatt tgccaaattt ctttcaaaga 1200
ttgtcgtgtt aacaaaagta aacactctac cagtttacgc tacgcgcctg gaaaatggta 1260
ctatcggtca tgccggtgag actcgaggca aaacactctg cgaacccctg cagatgcagg 1320
ttaaccgccc gctggagcct ctgaactccg tggcaatcgt acttggtgac tgcttgatag 1380
gcaagcaagt aacggagaga agtggcaagg ctttgtggtg gggtatgacg tttgggttga 1440
ggggcagatg gatgaggcca ggtgggatgc tgaaaaggat tttgagatgc gagcggatag 1500
catagtgaag atgctctagg ttaacagcta agagagcagg atgatatcca gaggagccta 1560
agagtccgtc tttgcctcgc ctgaactact gctgaaatta agttctattt tcgcgttgaa 1620
ggtggtgtcc agccttgtgg caacaaggcg tgactcacac cgtgattcgc cccgaaggta 1680
gccatgaata tgagcacgta cgagcagcgg tcagcctgac gaccagagac agtggtgaaa 1740
cctttttttc cctcgtgttg ggctggcggt tgggcagaat gcaagcaatt ttttctgttg 1800
ccaatccggt cgaaactgct agcctgctgc gaattttttt tctcactgtt ccatcgaggc 1860
tccacccgca atgtatgtac ctgctatcag agagcatgta ccttgactgg ttggtgacca 1920
tatgagcgct aaaattgttt tcgaggggga ctgttgtttt ggtaggcgct gagcttttga 1980
tgcaaaagcc tgatgggaga tattcgagaa tatccatcgg gggatttcgt cggtgaggaa 2040
tatcgtgatg ggtaaattgg ttggaggata tgtaaggcga gatagacgta gatgctgtga 2100
tacttgacga ttggccaatc tacgtgccta gcccggggat gtcatcgtcc ctggcgctct 2160
gctattgcca ccttggtgct ccccgttaac catgatcatg agccaggcgg cgcaaggcgc 2220
aactcaaaac agttattttc tagttgaaag ctagttgctg cgaatagtct gtgcgtgtat 2280
ttgtattgtc cagcagagct tcaggctttc ctcactgggg gaagtcatca aaatctttcc 2340
tgactcttcg ccaaccctct tgctccttcc tccatcttgc gctgaaagtc accaccacca 2400
tctctgacgc cctgaggtgt cctaatcgca gcctctgatt ggtccaggga gccagatttg 2460
agaaaaacct gccagtgcgc gggcgaaaaa ggaacatctg ccgtgttagg gctagtccac 2520
acagcccaca aggaggggca cagtaggcgc ctgttgttgc cccgcgcgag cagcgaccgt 2580
cctcacccca cctcccctcc accaaccttt ttaaatctcc tcctccctcc tcctcattgc 2640
gaattttttc ctcttcgctc ctcgtctcgc atacccggtt caagcatccg atctgcgaat 2700
tttgtatgta ttgccttccg tttcactgct ttaaacttca tcatcaagag atgatgatga 2760
agagaagaag cagcatcatc tggaagaacc acgcaactaa ccgcctatga ccagactccc 2820
tttcgtcttg acgaacactt agttacttca aacactcaca accgcaaaa 2869
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttatcgtcgt catccttgta atctcatctt cgcgatctaa gcctagctcc cccc 54
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagaggcaga ccaggcgtct cagaatgttt tggcacgctc tcaggtcaaa ct 52
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaacattct gagacgcctg gtctgcctct tcttcgtccc caacgaaaca tg 52
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccacatcatc tacatcttcg caactttgtc gaccacacga tttcccgcgc g 51
<210> 7
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcgacaaag ttgcgaagat gtagatgatg tggttggctg gagttcgc 48
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttacttcaa acactcacaa ccgcaaaaat gacgaaaacg acatcgtcgt cc 52
Claims (9)
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为齿梗孢霉ΔaurA突变株中高表达基因簇17中的骨架基因PKS17的工程菌，PKS17的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌命名为齿梗孢霉(Calcarisporium arbuscula)MCA17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20248，保藏日期为2020年8月26日。
3.如权利要求1～2中任一项所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括：利用pFGL表达载体和强启动子tef1p，构建pFGL-tef1p-PKS17表达载体；通过农杆菌转化方法将pFGL-tef1p-PKS17转化进入齿梗孢霉ΔaurA突变体中，并在齿梗孢霉ΔaurA突变体中高表达PKS17。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，pFGL-tef1p-PKS17表达载体通过以下步骤构建：以齿梗孢霉的基因组DNA为模板，利用三对引物分别PCR扩增基因簇17中的骨架基因PKS17，得到三段PCR产物；将纯化后的三段PCR产物与BamHI消化的pFGL-neoR-tef1p用无缝克隆试剂拼接，形成pFGL-tef1p-PKS17；其中，所述三对引物分别为：
第一引物对，如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
第二引物对，如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；
第三引物对，如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
5.如权利要求1～2中任一项所述的基因工程菌的用途，其特征在于，将如权利要求1～2任一项所述的基因工程菌在发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵产物为化合物MCA17-1；化合物MCA17-1的结构如下式(Ⅲ)所示，其唯一手性中心为S-构型；
6.如权利要求5所述的基因工程菌的用途，其特征在于，所述的发酵培养包括：将所述的基因工程菌以1～5％接种量接种于发酵培养基，在25～30℃、150～200rpm条件下，发酵10～15天，经分离纯化得到化合物MCA17-1。
7.如权利要求5所述的基因工程菌的用途，其特征在于，所述的发酵培养包括：将所述的基因工程菌以1％接种量接种于发酵培养基，在25℃、150rpm条件下，发酵14天，经分离纯化得到化合物MCA17-1。
8.如权利要求5所述的基因工程菌的用途，其特征在于，还包括：将化合物MCA17-1用于制备抗肝纤维化活性的药物。
9.如权利要求8所述的基因工程菌的用途，其特征在于，化合物MCA17-1通过抑制由TGF-β诱导的肝星状细胞LX2的活化来抑制肝纤维化活性。
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