CN117467638A - 橄榄色毛壳菌来源的苔色酸合酶及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物和生物医药技术领域，具体涉及橄榄色毛壳菌来源的苔色酸合酶及其编码基因和应用。具体的，本发明首次在橄榄色毛壳(Chaetomium olivaceum)SD‑80A中鉴定到两种苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB，通过构建异源表达载体，实现了对苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB的异源表达，确定了2个基因的功能，扩大了真菌代谢产物苔色酸的生物合成途径，有助于为新药开发提供先导化合物，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物和生物医药技术领域，具体涉及橄榄色毛壳菌来源的苔色酸合酶及其编码基因和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
橄榄色毛壳菌(Chaetomium olivaceum)在真菌学分类中属子囊菌纲、壳菌目、毛壳菌科、毛壳菌属。毛壳属菌株广泛分布于海洋和陆地中，是重要的生防菌株来源，对植物病原菌具有较好的拮抗作用，具有良好的开发应用前景，其生物信息、活性成分、生物合成等均是研究的热点。
苔色酸(Orsellinic acid)是一种简单的芳香聚酮类化合物，白色固体粉末，分子式为C8H8O4，相对分子质量为168.15，CAS编号为480-64-8，由乙酰辅酶A和三个单位的丙二酰辅酶A逐步缩合而成，其最早在青霉菌中分离得到，现已在植物、藻类、真菌和细菌中发现了200多种苔色酸衍生物。苔色酸及其衍生物具有抗炎、抗真菌、抗肿瘤、细胞毒性和免疫抑制等多种重要的生物活性，不仅是重要的医药中间体，并且具有开发为药物先导化合物的巨大潜力。
天然产物是创新药物发现的重要源泉，然而野生宿主中的天然产物含量往往较低，复杂天然产物的化学合成所带来的环境污染、能耗等诸多因素极大地限制了其广泛应用。因而，破解天然产物生物合成基因密码、重构其生物合成途径对于发现结构新颖的活性天然产物、提高其产量、促进创新药物的研发和应用具有非常重要的现实意义。目前，大多数苔色酸衍生物都是植物来源，但它们的含量相对较少，且难以分离和提取。通过合成生物学技术，挖掘苔色酸生物合成的核心基因苔色酸合酶基因，构建微生物细胞工厂，生物合成苔色酸及其衍生物，不仅可降低生产成本，而且为珍稀植物资源的保护和药物的开发提供了新的途径。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供两个橄榄色毛壳菌来源的苔色酸合酶的异源表达和应用。具体的，本发明从大蓝羚(Boselaphus tragocamelus)的排泄物中分离出来真菌菌株橄榄色毛壳菌(Chaetomium olivaceum)SD-80A中发现了两个苔色酸类化合物的生物合成基因簇，通过全基因组测序获得苔色酸合酶ColA、ColB及其编码基因，将其分别转入米曲霉中进行异源表达，获得苔色酸及其衍生物。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种橄榄色毛壳苔色酸合酶，所述橄榄色毛壳苔色酸合酶的氨基酸序列为如下(a1)-(a3)中任一种：
(a1)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的酶的氨基酸序列；
(a3)其它基因编码的与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上并且具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的酶活性的蛋白；
上述(a2)中，所述“一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加”为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述(a1)-(a3)中的酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
本发明的第二个方面，提供第一方面所述橄榄色毛壳苔色酸合酶的编码基因，其核苷酸序列为如下(b1)-(b3)中任一种：
(b1)SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(b2)与(a1)互补的核苷酸序列；
(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
在本发明中，具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的橄榄色毛壳苔色酸合酶命名为苔色酸合酶ColA，具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的橄榄色毛壳苔色酸合酶命名为苔色酸合酶ColB；相对应的，其编码基因分别为ColA、ColB。
本发明的第三个方面，提供一种扩增引物，所述扩增引物包括SEQ ID NO.5-12所示的核苷酸序列，具体的，所述扩增引物是基于ColA以及ColB基因所进行的设计。
本发明的第四个方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体至少包含上述橄榄色毛壳苔色酸合酶的编码基因。
具体的，所述重组表达载体通过上述编码基因有效地连接到表达载体上获得，所述表达载体可以为病毒载体、质粒、噬菌体、黏粒或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体、噬菌体P1衍生的载体、酵母人工染色体或哺乳动物人工染色体；进一步优选为真菌质粒。
本发明的第五个方面，提供一株基因工程菌，所述基因工程菌为异源表达上述橄榄色毛壳苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB的菌株。
具体的，所述基因工程菌的构建方法如下：将含有上述苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB的重组表达载体转入出发菌株中即得。
其中，所述出发菌株包括但不限于细菌和真菌，在本发明的一个具体实施方式中，所述出发菌株为真菌，具体为米曲霉；更具体的，所述米曲霉为米曲霉(Aspergillusoryzae)NSAR1(niaD-，sC-，ΔargB，adeA-)，其作为一种营养缺陷型菌株，已被广泛用于丝状真菌基因的异源表达。
构建ColA以及ColB异源表达载体使用引物如SEQ ID NO.5-12所示。
本发明的第六个方面，提供上述橄榄色毛壳苔色酸合酶、上述橄榄色毛壳苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB、上述重组表达载体和/或上述基因工程菌在如下任意一种或多种中的应用：
(c1)利用苔色酸合酶生物合成苔色酸及其衍生物；
(c2)提高苔色酸合酶产苔色酸及其衍生物的效率；
(c3)扩大苔色酸及其衍生物在医药领域中的应用。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
上述技术方案首次在橄榄色毛壳(Chaetomium olivaceum)SD-80A中鉴定到两种苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB，通过构建异源表达载体，实现了对苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB的异源表达，确定了2个基因的功能，扩大了真菌代谢产物苔色酸的生物合成途径，有助于为新药开发提供先导化合物，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明ColA异源表达载体示意图。
图2为本发明ColB异源表达载体示意图。
图3为本发明ColA异源表达米曲霉菌株HPLC图谱。
图4为本发明ColB异源表达米曲霉菌株HPLC图谱。
图5为化合物苔色酸的结构式。
图6为化合物苔色酸衍生物的结构式。
图7为化合物苔色酸的质谱谱图。
图8为化合物苔色酸衍生物的质谱谱图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
从橄榄色毛壳(Chaetomium olivaceum)SD-80A中鉴定出的两种苔色酸合酶编码基因。通过对SD-80A开展全基因组测序和生物信息学分析，得到了ColA以及ColB的详细基因信息，ColA核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，ColA氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；ColB核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，ColB氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB的米曲霉异源表达工程菌，其构建方法包括如下步骤：
(1)构建含有ColA以及ColB基因的异源表达载体：以橄榄色毛壳(Chaetomiumolivaceum)SD-80A基因组序列为模板，利用引物序列SEQ ID NO.5-8扩增ColA片段；利用引物序列SEQ ID NO.9-12扩增ColB片段；使用KpnI酶切质粒pUARA2_Fw作为载体，利用无缝克隆的方式将其分别进行连接；
(2)将构建好的异源表达载体利用PEG法转入米曲霉原生质体；
(3)利用载体所带有的Arg营养缺陷，进行菌落PCR筛选阳性突变子即得。
其中，所述步骤(2)中，所述橄榄色毛壳即为橄榄色毛壳(Chaetomium olivaceum)SD-80A。
上述构建方法获得的ColA以及ColB基因的米曲霉异源表达工程菌，检测到在ColA以及ColB基因转入米曲霉后，实现了ColA以及ColB基因的表达。
需要说明的是，本发明虽然提供了一种基于异源表达苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB获得苔色酸的米曲霉异源表达工程菌的方法，但是基于本发明的发明构思，其他异源表达ColA以及ColB基因进而获得相应基因工程菌的方法同样属于本发明的保护范围之内。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述橄榄色毛壳菌来源的苔色酸合酶基因ColA以及ColB在如下任意一种或多种中的应用：
(c1)利用苔色酸合酶生物合成苔色酸及其衍生物；
(c2)提高苔色酸合酶产苔色酸及其衍生物的效率；
(c3)扩大苔色酸及其衍生物在医药领域中的应用。
所述(c3)中，所述应用具体包括：为基于ColA以及ColB合成苔色酸及其衍生物的相关新药研发提供先导化合物。因此，具体的，所述应用可以为提高苔色酸及其衍生物在制备苔色酸相关药物中的应用效果。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
生物材料来源：
橄榄色毛壳(Chaetomium olivaceum)SD-80A为本实验室筛选鉴定的一株毛壳属菌株，其在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC No.40420，保藏日期为2022年11月10日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该菌株在CN116144637A中已经公开。真菌基因组提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，高保真DNA聚合酶等购自于南京诺唯赞公司，PDA培养基和PDB培养基等购自于青岛海博公司。
实施例1：橄榄色毛壳菌苔色酸合酶ColA基因在米曲霉中的异源表达
1.橄榄色毛壳菌ColA基因米曲霉异源表达的工程菌构建
(1)异源表达载体构建
将橄榄色毛壳SD-80A接种于PDB培养基，28℃培养3天后，使用真菌基因组提取试剂盒提取其基因组，以该基因组为模板，使用引物SEQ ID NO.5(CCGGAATTCGAGCTCGGTACCATGCCTGCCTCGGGAGAA)和SEQ ID NO.6(TCGGTGTAACCAAGCCAGCG)扩增序列上游片段，使用引物SEQ ID NO.7(CGCTGGCTTGGTTACAC)和SEQ ID NO.8(TACTACAGATCCCCGGGTACCCTAATTGATTGCCTTCTCAATGTAACG)扩增序列下游片段，使用KpnI酶切质粒pUARA2_Fw作为载体，利用无缝克隆的方式将其进行连接(图1)。
(2)米曲霉原生质体制备
将四营养缺陷的米曲霉(Aspergillus oryzae)NSAR1接种在产孢平板上，于30℃避光培养箱静置培养7-12天进行产孢；
将孢子悬浮液5ml加到平板上，用涂布棒轻轻刮取孢子，倒入滤网中过滤收集孢子，随即用悬浮液将其制成1x108 cell/mL；
取上述所制孢子液1mL加入100mL DPY培养基中，置于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养2天；
配制酶解溶液：将100mg Yatalase酶溶解于20mL SolutionⅠ溶液中，0.22μM滤膜过滤除菌；
将孢子萌发成的幼嫩菌丝球在过滤器中过滤，用无菌水洗涤2次除去残留培养基，将其加入至酶解溶液中，30℃，200rpm震荡培养1-2小时，裂解至上清呈秽浊状；
用滤网将酶解好的菌液转移至新的50mL离心管中，置于4℃，800×g冷冻离心机中离心5min；
去除上清液，加入20mL，0.8M NaCl悬浮清洗两次，置于4℃，800×g冷冻离心机中离心5min；
悬浮清洗第二次时，用血球计数板在显微镜下计算原生质体数目，随后4℃，800×g离心5min，用SolutionⅡ/SolutionⅢ＝4:1的体系将原生浓度调整为2x108cell/mL。
(3)原生质体转化
取200μL原生质体溶液于50ml离心管中，加入10μg质粒轻轻混匀，冰上静置20min；
加入1mL SolutionⅢ，用枪头轻轻混匀，室温静置20min；
加入10mL的SolutionⅡ轻轻混匀，4℃，800×g离心10min；
去除上清液，加入1mL SolutionⅡ混悬，取200μL加入到对应的筛选平板中央，随后迅速加入5mL top agar，快速混匀，30℃倒置培养3-5天。
(4)转化子筛选
转化后将单菌落单独传代至新的筛选平板上，挑取幼嫩菌丝裂解后作为模板，使用引物SEQ ID NO.5-8进行PCR验证，测序验证正确性。
2.ColA基因米曲霉工程菌株次级代谢产物的分析
将米曲霉工程菌株接种到CD-Arg平板上生长3-5天，接种于MPY-Arg培养基中，于30℃200rpm的摇床中生长3-4天，以此作为种子液；
将上述种子液中菌球接种到40瓶500mL锥形瓶中的大米培养基(40g大米/瓶)中，在30℃的培养箱中静置培养30天；
使用等体积的乙酸乙酯超声萃取发酵物5次，减压浓缩后获得粗浸膏，称取10mg粗浸膏溶于1mL色谱甲醇，使用0.22μM针式过滤器过滤，使用HPLC进行色谱分析(图3)；
将粗提物进行纯化，采用硅胶柱色谱与石油醚：乙酸乙酯(100:0，80:20，60:40，40:60，20:80，0:100，v/v)作为洗脱剂进行梯度洗脱，共洗脱为6个馏分(Fr.1-6)；Fr.4进一步使用HPLC制备柱获得苔色酸(图5)，随后进行质谱检测对化合物进行表征(图7)。
实施例2：橄榄色毛壳菌苔色酸合酶ColB基因在米曲霉中的异源表达
1.橄榄色毛壳菌ColB基因米曲霉异源表达的工程菌构建
(1)异源表达载体构建
将橄榄色毛壳SD-80A接种于PDB培养基，28℃培养3天后，使用真菌基因组提取试剂盒提取其基因组，以该基因组为模板，使用引物SEQ ID NO.9(CCGGAATTCGAGCTCGGTACCATGGAGGCCAAACTCGACG)和SEQ ID NO.10(GGCATTGTAGCTAACGCCCTCTGCGAGTTTCTCAAA)扩增序列上游片段，使用引物SEQ ID NO.11(TGGATGATTTTGAGAAACTCGCAGAGGG)和SEQ ID NO.12(TACTACAGATCCCCGGGTACCTCAATCTAGAAGGGCCTCCTTCA)扩增序列下游片段，使用KpnI酶切质粒pUARA2_Fw作为载体，利用无缝克隆的方式将其进行连接(图2)。
(2)米曲霉原生质体制备
将米曲霉NSAR1接种在产孢平板上，于30℃避光培养箱静置培养7-12天进行产孢；
将孢子悬浮液5ml加到平板上，用涂布棒轻轻刮取孢子，倒入滤网中过滤收集孢子，随即用悬浮液将其制成1x108 cell/mL；
取上述所制孢子液1mL加入100mL DPY培养基中，置于30℃恒温振荡培养箱中200rpm培养2天；
配制酶解溶液：将100mg Yatalase酶溶解于20mL SolutionⅠ溶液中，0.22μM滤膜过滤除菌；
将孢子萌发成的幼嫩菌丝球在过滤器中过滤，用无菌水洗涤2次除去残留培养基，将其加入至酶解溶液中，30℃，200rpm震荡培养1-2小时，裂解至上清呈秽浊状；
用滤网将酶解好的菌液转移至新的50mL离心管中，置于4℃，800×g冷冻离心机中离心5min；
去除上清液，加入20mL，0.8M NaCl悬浮清洗两次，置于4℃，800×g冷冻离心机中离心5min；
悬浮清洗第二次时，用血球计数板在显微镜下计算原生质体数目，随后4℃，800×g离心5min，用SolutionⅡ/SolutionⅢ＝4:1的体系将原生浓度调整为2x108cell/ml。
(3)原生质体转化
取200μL原生质体溶液于50ml离心管中，加入10μg质粒轻轻混匀，冰上静置20min；
加入1mL SolutionⅢ，用枪头轻轻混匀，室温静置20min；
加入10mL的SolutionⅡ轻轻混匀，4℃，800×g离心10min；
去除上清液，加入1mL SolutionⅡ混悬，取200μL加入到对应的筛选平板中央，随后迅速加入5mL top agar，快速混匀，30℃倒置培养3-5天。
(4)转化子筛选
转化后将单菌落单独传代至新的筛选平板上，挑取幼嫩菌丝裂解后作为模板，使用引物SEQ ID NO.9-12进行PCR验证，测序验证正确性。
2.ColB基因米曲霉工程菌株次级代谢产物的分析
将米曲霉工程菌株接种到CD-Arg平板上生长3-5天，接种于MPY-Arg培养基中，于30℃200rpm的摇床中生长3-4天，以此作为种子液；
将上述种子液中菌球接种到40瓶500mL锥形瓶中的大米培养基(40g大米/瓶)中，在30℃的培养箱中静置培养30天；
使用等体积的乙酸乙酯超声萃取发酵物5次，减压浓缩后获得粗浸膏，称取10mg粗浸膏溶于1mL色谱甲醇，使用0.22μM针式过滤器过滤，使用HPLC进行色谱分析(图4)；
将粗提物进行纯化，采用硅胶柱色谱与石油醚：乙酸乙酯(100:0，80:20，60:40，40:60，20:80，0:100，v/v)作为洗脱剂进行梯度洗脱，共洗脱为6个馏分(Fr.1-6)；Fr.4进一步使用HPLC制备柱获得苔色酸和苔色酸衍生物(图5和图6)，随后进行质谱检测对化合物进行表征(图8)。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一种橄榄色毛壳苔色酸合酶，其特征在于，所述橄榄色毛壳苔色酸合酶的氨基酸序列为如下(a1)-(a3)中任一种：
(a1)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的酶的氨基酸序列；
(a3)其它基因编码的与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上并且具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的酶活性的蛋白。
2.一种橄榄色毛壳苔色酸合酶的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列为如下(b1)-(b3)中任一种：
(b1)SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
(b2)与(a1)互补的核苷酸序列；
(b3)与(b1)或(b2)所示的核苷酸序列具有≥90％一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
3.一种扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括SEQ ID NO.5-12所示的核苷酸序列。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体至少包含权利要求2所述橄榄色毛壳苔色酸合酶的编码基因。
5.一株基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为异源表达权利要求2所述橄榄色毛壳苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB的菌株。
6.如权利要求5所述基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法如下：将含有权利要求2所述苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB的重组表达载体转入出发菌株中即得。
7.如权利要求6所述基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株包括细菌和真菌。
8.如权利要求7所述基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株为米曲霉；构建ColA以及ColB异源表达载体使用引物如SEQ ID NO.5-12所示。
9.权利要求1所述橄榄色毛壳苔色酸合酶、权利要求2所述橄榄色毛壳苔色酸合酶编码基因ColA以及ColB、权利要求4所述重组表达载体和/权利要求5-8所述基因工程菌在如下任意一种或多种中的应用：
(c1)利用苔色酸合酶生物合成苔色酸及其衍生物；
(c2)提高苔色酸合酶产苔色酸及其衍生物的效率；
(c3)扩大苔色酸及其衍生物在医药领域中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述(c3)中的应用包括：为基于ColA以及ColB合成苔色酸及其衍生物的相关新药研发提供先导化合物。
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