DE69521815T2

DE69521815T2 - Proteinsynthese mittels nativer chemischer ligation (07.01.97)

Info

Publication number: DE69521815T2
Application number: DE69521815T
Authority: DE
Inventors: E. Dawson; B. Kent; W. Muir
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1995-05-04
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2015-05-05
Also published as: AU711451B2; SI0832096T1; MX9708500A; JP3599346B2; WO1996034878A1; GR3036895T3; DK0832096T3; CA2218620A1; EP0832096A4; EP0832096B1; ES2161885T3; AU2474095A; DE69521815D1; PT832096E; CA2218620C; ATE203248T1; EP0832096A1; JPH11508874A

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren und Zwischenstufen für das chemische Ligieren zweier Oligopeptide Ende-an-Ende mit einer Amidbindung. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung Verfahren und Zwischenstufen für das chemische Ligiereri von Oligopeptiden, wobei ein unoxidiertes N-terminales Cystein eines ersten Oligopeptids mit einem C-terminalen Thioester eines zweiten Oligopeptids unter Bildung einer β-Aminothioester-Zwischenstufe kondensiert, die spontan unter Bildung einer Amidbindung und des Ligationsprodukts intramolekular umgruppiert wird.

Rechte der Regierung

Die hier offenbarte Erfindung wurde zum Teil durch die Zuschüsse Nummer R01 GM 48897- 01, Nummer P01 GM 48870-03 und Nummer GM 50969-01 von den National Institutes of Health unterstützt. Die Regierung der Vereinigten Staaten kann gewisse Rechte an dieser Erfindung haben.

Hintergrund

Proteine können chemisch, ribosomal in einem zellfreien System oder ribosomal innerhalb einer Zelle synthetisiert werden. Fortschritte auf jedem dieser Gebiete haben den Zugang zu vielen Proteinen signifikant verbessert, aber haben auch das Verlangen nach noch weiteren Verbesserungen angeregt.
Proteine verdanken ihre diversen Eigenschaften den präzise gefalteten dreidimensionalen Strukturen ihrer Polypeptidketten. Die dreidimensionale Struktur eines Proteins bestimmt seine funktionellen Merkmale. Allerdings ist es gegenwärtig schwierig, die biologischen Eigenschaften eines Proteins allein aus seiner dreidimensionalen Struktur vorherzusagen und/oder vollständig zu erklären. Ein besseres Verständnis, wie die Struktur die biologischen Eigenschaften eines Proteins bestimmt, kann durch systematisches Variieren der kovalenten Struktur des Moleküls und Korrelieren der Effekte mit der gefalteten Struktur und der biologischen Funktion erreicht werden. Demgemäß besteht ein gesteigerte Nachfrage nach verbesserten synthetischen Techniken zum Synthetisieren neuer Proteine und Proteinanaloge.
Techniken, welche aus der, auf rekombinanter DNA basierenden, Molekularbiologie abgeleitet sind, können angewandt werden, um die Expression von Proteinen in gentechnisch veränderten Mikroorganismen zu erleichtern. Die Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese, wie offenbart von M. Smith (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1994): Band 33, S. 1214), ermöglicht die Herstellung großer Zahlen von modifizierten Proteinen in nützlichen Mengen für die systematische Untersuchung, z. B. C. Eigenbrot und A. Kossiakoff, Current Opinion in Biotechnology (1992): Band 3, S. 333. Der Einsatz von innovativen Vorgehensweisen erhöht den Umfang an Aminosäuren, welche in Expressionssysteme eingebunden werden können, und verspricht, die Anwendbarkeit der biosynthetischen Modifikation der kovalenten Struktur von Proteinen bedeutend auszuweiten (C. J. Noren et al., Science (1989): Band 244, S. 182 (1989); J. A. Ellman et al., Science (1992): Band 255, S. 197). Allerdings scheint es Einschränkungen zu geben, welche der Natur der ribosomalen Proteinsynthese innewohnen (V. W. Cornish, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994): Band 91, S. 2910).
Die chemische Synthese von Proteinen hat ebenfalls zur Erforschung der Beziehung zwischen Proteinstruktur und Funktion beigetragen. Die schrittweise Festphasensynthese hat die de novo-Herstellung kleiner Proteine zugelassen (T. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech. (1993): Band 4, S. 420). Es gibt auch mehrere Beispiele der Anwendung von schrittweiser Festphasensynthese von ganzen Proteinen, um die molekulare Grundlage der biologischen Funktion zu erforschen (M. Miller et al., Science (1989): Band 246, S. 1149; A. Wlodawer et al., Science (1989): Band 245, S. 616; L. H. Huang et al., Biochemistry (1991): Band 30, 5. 7402; und R. Rajarathnam et al., Science (1994): Band 264, S. 90).
Auch eine Semi-Synthese durch die konformations-unterstützte Religation von Peptidfragmenten kann in speziellen Fällen eingesetzt werden, um die Struktur/Funktion-Beziehung von Proteinen zu untersuchen (R. E. Offord, "Chemical Approaches to Protein Engineering", in Protein Design and the Development of New Therapeutics and Vaccines, Hrsg.: J. B. Hook, G. Poste (Plenum Press, New York, 1990) S. 253-282; C. J. A. Wallace et al., J. Biol. Chem. (1992): Band 267, S. 3852). Eine bedeutende Erweiterung des Semi-Synthese-Vorgehens ist die Verwendung enzymatischer Ligation von klonierten oder synthetischen Peptidsegmenten (L. Abrahmsen, et al., Biochemistry (1991): Band 30, S. 41 S 1; T. K: Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994): im Druck befindlich). Obwohl die obenstehenden Vorgehensweisen erfolgreich auf die Synthese von Proteinen und Proteinanalogen angewandt worden sind, berichten T. W. Muir et al., daß ein fortwährendes Interesse an der breiteren Anwendung der Werkzeuge der organischen Chemie auf die Untersuchung von Proteinen besteht (Curr. Opin. Biotech. (1993): Band 4, S. 420).
Stephen Kent et al. stellte vor kurzem die chemische Ligation von ungeschützten Peptidsegmenten als einen verbesserten Weg zur Gesamtsynthese von Proteinen vor (M. Schnolzer, et al., Science (1992): Band 3256, S. 221). Die chemische Ligation beinhaltet die chemoselektive Reaktion von ungeschützten Peptiden unter Erhalt eines Produktes mit einer unnatürlichen Grundgerüststruktur an der Ligationsstelle. Die Verwendung von ungeschützten Peptiden hat die der klassischen chemischen Synthese eigentümlichen Schwierigkeiten umgangen, nämlich komplexe Kombinationen von Schutzgruppen, welche zur beschränkten Löslichkeit vieler synthetischer Zwischenstufen führen; z. B. K. Akaji, et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985): Band 33, S. 184. Im Gegensatz dazu hat uns die chemische Ligationstechnik gestattet, guten Nutzen aus der Fähigkeit, Peptide von 50 oder mehr Resten Länge routinemäßig herzustellen, zu reinigen und zu charakterisieren, zu ziehen. Unter Einsatz optimierter schrittweiser Festphasenverfahren ist die Herstellung von Peptiden bis zu 60 Resten bei guter Ausbeute und hoher Reinheit Routine. In günstigen Fällen können Peptide von mehr als 80 Resten hergestellt werden (M. Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res. (1992): Band 40, S. 180-193).
Der Schlüsselaspekt des obenstehenden Vorgehens zur chemischen Ligation ist die Verwendung einer chemoselektiven Reaktion, um Peptide spezifisch und unzweideutig durch Bildung einer unnatürlichen (d. h. Nicht-Peptid-) Grundgerüststruktur an der Ligationsstelle zu verknüpfen. Dies hat die leichte Herstellung eines breiten Umfangs von Grundgerüstmodifizierten Proteinen, einschließlich Analogen von Proteindomänen, gestattet, zum Beispiel ligiertem 10F3, dem Integrin-bindenden Modul von Fibronectin: 95 Reste (M. Williams et al., J. Am. Chem. Soc. (1994): in Druck). Der katalytische Beitrag von Substratklappe-Substrat-Wasserstoffbrücken in HIV-1-Protease ist durch die chemische Synthese eines Homodimeren der 99-Reste-Untereinheiten dieses Proteins mittels chemischer Ligation aufgeklärt worden (M. Baca, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S., (1993): Band 90, S. 11638). Die chemische Ligation hat sich auch als nützlich für die routinemäßige, reproduzierbare Synthese großer Mengen von Proteinen in hoher Reinheit mit voller biologischer Aktivität erwiesen (20). (R. C. deLisle Milton, et al., "Synthesis of Proteins by Chemical Ligation of Unprotected Peptide Segments: Mirror-Image Enzyme Molecules, D- & L-HIV Protease Analogs", in Technigues in Protein Chemistry IV, Academic Press, New York, S. 257-267 (1992)).
Chemische Ligation kann auch für die unmittelbare Herstellung von proteinartigen Molekülen von ungewöhnlicher Topologie angewandt werden, zum Beispiel Vier-Helix-Bündel- Matrizen-assembliertes synthetisches Protein (MG 6647 Da) (P. E. Dawson et al., J. Am. Chem. Soc. (1993): Band 115, S. 7263); homogenes mehrwertiges künstliches Protein (MG 19916 Da) (K. Rose, J. Am. Chem. Soc. (1994): Band 3116, S. 30); künstliche Neoprotein- Nachahmung der zytoplasmatischen Domänen eines mehrkettigen Integrinrezeptors (MG 14194 Da) (T. W. Muir, et al., Biochemistry (1994): Band 33, S. 7701-7708; und Peptid- Dendrimer (MG 24205 Da) (C. Rao et al., J. Am. Chem. Soc. (1994): Band 116, S. 6975). Der Bereich der durch diese Technik zugänglichen Proteine ist durch die Größe der synthetischen Peptidsegmente begrenzt.
Eine nützliche Ausweitung würde auftreten, wenn man direkten synthetischen Zugang zu, mit nativem Grundgerüst versehenen, Polypeptidketten bis zu der Größe von typischen Proteindomänen hätte (A. L. Berman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994): Band 91, S. 4044). Chemische Ligation würde dann zur Anwendung kommen, um diese Domänen zusammenzubinden, um die Welt der Proteine auf eine allgemeine Weise zu erforschen.
Eine modulare Strategie für die Gesamtsynthese von Proteinen ist entwickelt worden, basierend darauf, daß die konvergente chemische Ligation von ungeschützten Peptiden offenbart wurde von L. E. Canne et al. (vorgestellt auf dem "Annual Meeting of the Protein Society, San Diego, Juli 1994). Proteindomänen (Module) wurden durch chemische Ligation von Segmenten mit 50-70 Resten hergestellt; diese Domänen wurden dann zusammengeheftet, um das Zielprotein zu ergeben. Wechselseitig kompatible Ligations-Chemien sind erforderlich: Intra-Domänen-Ligation sollte optimalerweise eine stabile peptidartige Bindung ergeben; Inter-Domänen-Ligation wird eine breitere Variation von Eigenschaften der an der Ligationsstelle gebildeten Struktur tolerieren. Dawson et al., Science 266, Seiten 776-779, erörtern ein einfachereres Verfahren der nativen chemischen Ligation.
Die geradlinige totale chemische Synthese von Proteinen stellt die Verwirklichung eines wichtigen Ziels der organischen Chemie dar. Sie lässt die aufregende Aussicht auf eine durch den allgemeinen synthetischen Zugang ermöglichte, unbegrenzte Variation der kovalenten Proteinstruktur entstehen und wird der Erforschung der strukturellen Basis von Eigenschaften, wie der Faltung, Stabilität, katalytischen Aktivität, Bindung und biologischen Wirkung, einen neuen Anstoß geben.
Was benötigt wird, ist eine Technik der nativen chemischen Ligation, welche die Bildung einer nativen Peptidbindung an der Ligationsstelle mit den Vorteilen von chemoselektiver Reaktion ungeschützter Peptide kombiniert. Diese Ligationschemie der zweiten Generation würde die Größe von nativen Grundgerüst-Polypeptiden, welche durch totale chemische Synthese direkt zugänglich sind, bedeutend erhöhen. Sie könnte nutzbringend auf eine weiten Bereich von synthetischen Zielen angewandt werden, einschließlich Proteinen von moderater Größe, und sie gestattet den direkten Zugang zu funktionellen Proteindomänen. Native chemische Ligation ist ein Grundstein eines allgemeinen modularen Vorgehens zur chemischen Totalsynthese von Proteinen. Darüber hinaus ist sie mit der Verwendung von sowohl chemisch synthetisierten Peptiden als auch aus anderen Quellen abgeleiteten Peptidsegmenten kompatibel.

Zusammenfassung

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf ein Verfahren zur nativen chemischen Ligation. Das Verfahren der nativen chemischen Ligation erleichtert die chemische Synthese von Proteinen und großen Oligopeptiden. Das Prinzip der "nativen chemischen Ligation" ist im Schema 1 gezeigt. Der erste Schritt besteht in der chemoselektiven Reaktion eines ungeschützten synthetischem Peptid-α-Thioesters mit einem anderen ungeschützten Peptidsegment, enthaltend einen N-terminalen Cys-Rest, um ein Thioester-verknüpftes Intermediat als das anfängliche kovalente Produkt zu erhalten. Ohne Änderung in den Reaktionsbedingungen durchläuft dieses Intermediat eine spontane, schnelle intramolekulare Reaktion unter Bildung einer nativen Peptidbindung an der Ligationsstelle. Das Vollängen- Polypeptid-Zielprodukt wird ohne weitere Manipulation in der gewünschten Endform erhalten. Der durch das Verfahren der nativen chemischen Ligation bereitgestellte allgemeine synthetische Zugang erweitert in großem Maß den Umfang der Variation der kovalenten Struktur des Proteinmoleküls.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zum Ligieren eines ersten Oligopeptids mit einem zweiten Oligopeptid Ende-an-Ende zur Herstellung eines Oligopeptidproduktes. Die ersten und zweiten Oligopeptide werden in einer Reaktionslösung, einschließlich eines katalytischen Thiols, vermischt. Das katalytische Thiol ist ein konjugiertes Thiol, welches direkt an einem aromatischen oder heteroaromatischen Ring gebunden ist, und sich von dem Thiol unterscheidet, aus welchem der C-terminale Thioester rein gedanklich gebildet ist. Bevorzugte katalytische Thiole schließen Thiophenol, 1-Thio-2-nitrophenol, 2-Thiobenzoesäure, 2-Thiopyridin, 4-Thio-2-pyridincarbonsäure und 4-Thio-2-nitropyridin ein. Das erste Oligopeptid schließt einen C-terminalen Thioester ein. Das zweite Oligopeptid schließt ein N-terminales Cystein mit einer nichtoxidierten Sulfhydryl-Seitenkette ein. Die nichtoxidierte Sulfhydryl- Seitenkette des N-terminalen Cysteins wird dann mit dem C-terminalen Thioester kondensiert, um ein intermediäres Oligopeptid zu bilden, welches das erste und zweite Oligopeptid mit einer β-Aminothioester-Bindung verbindet. Die β-Aminothioester-Bindung des intermediären Oligopeptids durchläuft danach eine intramolekulare Umgruppierung, wodurch das Oligopeptid-Produkt hergestellt wird, welches das und zweite Oligopeptid mit einer Amidbindung verbindet. Schema 1
Das obenstehend geschilderte Oligopeptid mit einem C-terminalen Thioester wird nach einem Verfahren hergestellt, welches ein Harz mit einem Linker mit einem nichtoxidierten Thiol mit einem Boc-Aminosäuresuccinimidester unter Reaktionsbedingungen zur Herstellung eines Boc-Aminothioesterharzes vermischt. Ein Oligopeptid wird dann auf das Boc- Aminothioesterharz durch schrittweise Festphasen-Peptidsynthese angebracht. Wenn das Oligopeptid vollständig ist, wird das Boc-Aminothioesterharz mit HS abgespalten, um ein Oligopeptid mit einem C-terminalen Thiol herzustellen. Das C-terminale Thiol wird dann zu einem Oligopeptid mit einem C-terminalen Thioester umgewandelt.
Der Oligopeptid-Thioester (α-COSR-Einheit) von Schema 1 kann ohne weiteres aus einem entsprechenden Oligopeptid-Thiol (-αCOSH) erzeugt werden, das durch hoch-optimierte schrittweise SPPS auf einem Thioesterharz hergestellt wurde. Das Thioesterharz wurde hergestellt mittels des Verfahrens von L. E. Canne et al., Tetrahedron Letters (1995): Band 36, S. 1217-1220, was hierin durch den Bezug darauf einbezogen ist. Das Verfahren von Canne verwendet das Thioesterharz, offenbart von Blake und Yamashiro (J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res. (1981): Band 17, S. 273; D. Yamashiro, et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1988): Band 31, S. 322). Peptidprodukte wurden gespalten, gereinigt und durch herkömmliche Verfahren charakterisiert (M. Schnolzer, et al., Int. 1 Pept. Protein Res. (1992): Band 40, S. 180-193).
Die Methodik von Yamashiro aktiviert eine Thiocarboxylgruppe auf einem geschützten Oligopeptid mit Diaryldisulfiden, wodurch man Acyldisulfide erhält (Yamashiro et al., Int. J. Peptide Protein Res. (1922): Band 31, S. 322-334). Diese C-terminal-Peptid-Acyl-Disulfide sind hochreaktive elektrophile Intermediate, welche angegriffen werden von und anschließend gekoppelt werden mit einer α-Aminogruppe auf dem N-Terminus eines zweiten Peptids, wodurch native Peptidbindungen gebildet werden. Die berichteten Kopplungsausbeuten unter Verwendung von 2,2'-Dipyridyldisulfid als dem Aktivator der Thiocarboxylgruppe ergeben das gewünschte α-IB-92 Produkt in 45%iger Ausbeute. Die Gesamtausbeuten, basierend auf dem Ausgangsharz, für eine 3-Segment-Synthese von α-IB-92 werden mit 8% angegeben, wohingegen eine 2-Segment-Synthese 11% ergab.
Aufgrund der hohen Reaktivität der Diaryl-Disulfid-Bindung erfordert das Yamashiro-Vorgehen umfassendes Schützen und Entschützen von in dem Peptidemolekül vorhandenen Aminosäureresten. Die Lysingruppe wird beispielsweise, wegen der reaktiven Aminfunktionalität, als ein Citraconylderivat geschützt. Darüber hinaus wird eine Msc-Gruppe oder tBOC-Gruppe verwendet, um jedwede terminale Aminfunktionalitäten, die im Molekül vorhanden sind, zu schützen.
Die hierin dargelegte Erfindung erfordert nicht die Verwendung von irgendwelchen Schutzgruppen für die Kopplung von zwei Oligopeptiden, weil ein weniger reaktives (und somit chemoselektiveres) Thioesterelektrophil anstelle der Acyldisulfid-Einheit (Yamashiro's Vorgehen) verwendet wird. In dem intramolekularen Kopplungsschritt erfordert dieses Thioesterelektrophil eher eine nukleophilere Sulfhydryleinheit als ein freies Amin. Die nukleophile Sulfhydryleinheit kann auf Cysteinresten gefunden werden. Da die Amino- und Hydroxylfunktionalitäten gegenüber dem Thioesterelektrophil relativ unreaktiv sind, wird eine selektive Kopplung der zwei ungeschützen Oligopeptide mit der Cystein-Sulfhydryleinheit erreicht. Die Sulfhydryleinheit auf dem Cystein von Peptid 2 wird zuerst den Thioester von Peptid 1 angreifen und ein gekoppeltes Thioester-Intermediat bilden. Dieses gekoppelte Thioester-Intermediat wird damit einhergehend durch die freie α-Aminogruppe aus dem Cystein angegriffen und vollzieht eine spontane Umgruppierung unter Bildung der nativen Peptidbindung. Die Ausbeuten werden deshalb durch Eliminieren der Schritte zum Schützen und Entschützen vergrößert, da unerwünschte Nebenreaktionen verringert werden (Schema 1).
Die Thioestereinheit wird aus einer Vorläufer-Thiosäure hergestellt, welche durch optimierte schrittweise Festphasen-Peptidsynthese auf einem Aminomethylharzträger, ausgestattet mit einem Thioesterharz-Linker, erhalten wird. Die Vorläufer-Thiosäure wird anschließend in flüssigem HF bei 0ºC in einer Stunde erzeugt (Yamashiro, et al., Int. J Pept. Protein Res. (1988): Band 31, S. 322).
Eine Vorgehensweise für die Synthese des Thioester-Linkers unter Anwendung einer schrittweisen Festphasen-Peptidsynthese ist von Blake (Blake, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981): Band 78, S. 4055) und Yamashiro (Yamashiro, et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1988): Band 31, S. 322) berichtet worden. Dieses Verfahren ist jedoch unerwünscht, weil es die Umwandlung von Boc-Aminosäuresuccinimidestern in die entsprechenden Boc- Aminothiosäuren mit Schwefelwasserstoff erfordert. Eine hierin berichtete verbesserte Methodik verwendet den Boc-Aminosäuresuccinimidester direkt und vermeidet deswegen die Unannehmlichkeit und Risiken von Schwefelwasserstoffgas (Kent et al., Tetrahedron Lett. (1995): Band 36, S. 1217).
In diesem Verfahren (Schema 2) wird das Thiol 3 erzeugt aus der Reaktion des Chlorids 2 (Yamashiro et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1988): Band 31, S. 322) mit Thioharnstoff, worauf eine Hydrolyse des resultierenden Thiouroniumsalzes in wässriger Base folgt. Das Thiol 3 ist eine allgemeine Zwischenstufe, welche mit einem breitem Bereich von im Handel erhältlichen Boc-Aminosäuresuccinimidestern umgesetzt werden kann, um den gewünschten Thioester-Linker 1 herzustellen, welcher zweckmäßigerweise als das Dicyclohexylamin (DCHA)-Salz isoliert wird.
Modelluntersuchungen wurden mit kleinen Peptiden vorgenommen, um das native chemische Ligations-Vorgehen zu untersuchen. Um bei der Erforschung des Reaktionsmechanismus zu helfen, wurde das Peptid Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-α-COSBzl mit Ac-Cys umgesetzt. Die genaue Masse des resultierenden Ligationsproduktes wurde durch Electrospray-Massenspektrometrie bestimmt und war konsistent mit einem Thioester-verknüpften Peptid als dem Ligationsprodukt, erzeugt durch nukleophilen Angriff der Ac-Cys-Seitenkette auf die a-Thioestereinheit des Peptids. Die Reaktion von Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-α-COSBzl mit H-Cys-Arg-Ala- Glu-Tyr-Ser (enthaltend eine unblockierte funktionelle a-NH&sub2;-Gruppe) lief bei einem pH- Wert von 6,8 rasch ab (unterhalb pH 6 schritt die Reaktion sehr langsam voran, was die Beteiligung der ionisierten Thiolatform der Cys-Seitenkette nahelegt) und ergab ein Einzelprodukt der erwarteten Masse. Diesem Produkt fehlte Anfälligkeit gegen Nukleophile und es hatte die Fähigkeit, disulfidverknüpfte dimere Peptide zu bilden, was unzweifelhaft die Bildung einer nativen Amidbindung an der Ligationsstelle anzeigte. Diese Untersuchungen waren mit dem in Schema 1 gezeigten Mechanismus konsistent, in welchem das anfängliche Thioester-Ligationsprodukt wegen der raschen Umgruppierung unter Bildung einer stabilen Peptidbindung nicht als eine diskrete Zwischenstufe angesehen wurde. Die einfache intramolekulare Reaktion resultiert aus der günstigen geometrischen Anordnung der α-NH&sub2;-Gruppe in Bezug auf den in der anfänglichen chemoselektiven Ligationsreaktion gebildeten Thioester. Schema 2
Die Anwendung einer solchen "Entropie-Aktivierung" zur Peptidbindungs-Bildung beruht auf den von Brenner aufgestellten Prinzipien (M. Brenner, in Peptides. Proceedings of the Eighth European Peptide Symposium, Hrsg.: H. C. Beyerman (North Holland, Amsterdam, 1967) S. 1-7). Das Konzept der "Entropie-Aktivierung" für Peptidbindungs-Bildung ist in jüngerer Zeit von D. S. Kemp et al. (J. Drg. Chem. (1993): Band 58, S. 2216) und von C. -F. Liu et al. (J Am. Chem. Soc. (1994): Band 116, S. 4149) aufgenommen worden.
Mehrere Modellpeptide sind durch das Verfahren der nativen chemischen Ligation synthetisiert worden. Die erfolgreiche Synthese dieser Modellpeptide belegt, daß native chemische Ligation allgemein auf Peptide mit dem vollen Umfang an normalerweise in Proteinen gefundenen funktionellen Gruppen anwendbar ist. Sogar freie interne Cys-Reste können in jedem der reagierenden Segmente vorhanden sein. Interne Cys-Reste können einen Esteraustausch mit der Peptid-a-Thioester-Komponente eingehen; jedoch ist diese Reaktion unproduktiv, weil keine Umgruppierung zur Amidbindung stattfinden kann, der gebildete Thioester leicht reversibel ist und ein produktiver Teil des reagierenden Systems bleibt. Wie hierin offenbart, ist die native chemische Ligation auf die Reaktion an einem N-terminalen Cys-Rest begrenzt. Es ist wichtig, das Seitenketten-Thiol von diesem Cys daran zu hindern, unter Bildung eines disulfidverknüpften Dimers zu oxidieren, weil dies in der Ligation unreaktiv ist. Ein Überschuß an Thiol, ensprechend zur Thioesterabgangsgruppe, wurde verwendet, um die Cys-Reste in reduzierter Form zu halten, ohne die Ligationsreaktion zu stören. Das aminoterminale Peptidsegment muß durch chemische Synthese hergestellt werden, um es mit der notwendigen α-COSR-Funktionalität auszustatten. Darüber hinaus sollte diese Komponente für eine optimale Ligation eine ungehinderte (d. h. nicht β- verzweigte) C-terminale Aminosäure aufweisen. Solubilisierende Mittel, wie Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid störten die Ligation nicht und konnten verwendet werden, um die Konzentration von Peptidsegmenten zu erhöhen und somit die Reaktionsgeschwindigkeit zu vergrößern.
Weitere Modellreaktionen zeigen, daß die Verwendung von besseren Thioesterabgangsgruppen zu schnelleren Ligationsreaktionen führt. Wir wendeten diese Beobachtung auf die native chemische Ligation von Peptiden aus der extrazellularen Domäne eines humanen Cytokinrezeptors (R. D'Andrea, et al., Blood (1994): Band 83, S. 2802) wie gezeigt in Schema S. an. Die Verwendung der 5-Thio-2-nitrobenzoesäure(-SNB)-Abgangsgruppe, entsprechend der reduzierten Form von Elman's Reagenz, ergab eine rasche Reaktion bei hoher Ausbeute. Wie nachstehend im Zusammenhang mit Schema 5 beschrieben, wurde beobachtet, daß die Reaktion zwischen den Peptidsegmenten in weniger als 5 Minuten im wesentlichen zu ihrer Vervollständigung gekommen waren, wobei man das 50-Rest-Produkt mit einer nativen Peptidbindung an der Ligationsstelle erhielt. Somit kann die rasche native chemische Ligation durch die Verwendung einer Thioesterabgangsgruppe mit geeignet eingestellten Eigenschaften erreicht werden. Schema 5 NATIVE CHEMISCHE LIGATION - REAKTIONSGESCHWINDIGKEIT
Die Anwendung des nativen chemischen Ligationsverfahrens auf die Totalsynthese eines Proteinmoleküls wurde durch die Herstellung von humanem Interleukin 8 (IL-8) veranschaulicht (M. Baggiolini et al., FEBS Lett. (1989): Band 307, S. 97; I. Clark-Lewis et al., J. Biol. Chem. (1994): Band 269, S. 16075 (1994); I. Clark-Lewis, et al. Biochemistry (1991): Band 30, S. 3128; und K. Rajarathnam et al. (1994), Biochemistry (1994): Band 29, S. 1689). Die 72 Aminosäuren lange Polypeptidkette enthält vier Cys-Reste, welche zwei funktionell kritische Disufidbrücken in dem nativen Proteinmolekül bilden. Die Totalsynthese von IL-8 ist in Schema 7 gezeigt. Die zwei ungeschützten synthetischen Peptidsegmente reagierten sauber, wodurch man die Vollängenpolypeptidkette in reduzierter Form ohne weitere chemische Manipulation erhielt (9). Diese erfolgreiche Ligation war besonders bedeutsam, weil die 33- und 39-Reste-IL-8-Segmente jeweils zwei Cys-Reste enthielten und zusammen 18 der 20 genetisch kodierten, in Proteinen anzutreffenden, Aminosäuren beinhalteten. Schema 7
Das gereinigte Produkt wurde gefaltet und oxidiert, wie früher beschreiben, wodurch man IL- 8 mit einer Masse von genau 4 Dalton weniger als derjenigen des ursprünglichen Ligationsproduktes erhielt, was die Bildung von zwei Disulfidbrücken anzeigte. Die Eigenschaften dieses gefaltenen Produktes waren identisch zu jenen von früher untersuchten authentischen IL-8-Proben. Eine Titration in einem Assay auf Neutrophilen-Elastase-Freisetzung zeigte, daß die Wirksamkeiten (ED50 = 0,3 nM) und Maximalantworten des gefalteten, ligierten [Ala33]IL-8 und des entsprechenden durch herkömmliche Synthese erhaltenen Moleküls nicht unterscheidbar und identisch zu IL-8 von nativer Sequenz waren. Dieses Ergebnis bestätigte unzweideutig die Bildung einer Peptidbindung an der Ligationsstelle, weil die Thioester-zu-Amid-Umgruppierung stattgefunden haben muß, um die freie Cys³&sup4;-Seitenkette zu ergeben, welche die native Disulfidbrücke bildete (siehe Schema 7).
Proteine werden gewöhnlich durch Expression in gentechnisch veränderten Mikroorganismen unter Verwendung der Verfahren der rekombinanten DNA-basierenden Molekularbiologie untersucht. Verfahren, wie orts-gerichtete Mutagenese, haben einen größeren Einfluß auf die Fähigkeit gehabt, große Anzahlen von modifizierten Proteinen in nützlichen Mengen für eine systematische Untersuchung herzustellen. Innovative Vorgehensweisen haben den Spielraum an Aminosäuren vergrößert, welcher in Expressionsystemen eingebaut werden kann, und versprechen, die Anwendbarkeit der biosynthetischen Modifikation der kovalenten Struktur von Proteinen signifikant zu erweitern. Jedoch scheint es der Natur der ribosomalen Proteinsynthese innewohnende Beschränkungen zu geben.
Wieland offenbart ein Verfahren zum Synthetisieren von Dipeptiden unter Verwendung eines Thioester-Intermediats (Wieland et al., Liebigs Ann. Chem. (1953): Band 580, S. 159). Wieland verwendet die Reaktion von S-Glycyl- (oder anderen unverzweigten Aminoacyl-) Thiophenolen mit Cystein. Somit greift die Sulfhydrylgruppe auf dem Cysteinrest zuerst den Thioester des S-Glycyl-Thiophenols an und bildet ein gekoppeltes Thioester-Intermediat. Dieses gekoppelte Thioester-Intermediat wird gleichzeitig von der freien α-Aminogruppe aus dem Cystein angegriffen und vollzieht eine spontane Umgruppierung unter Bildung der nativen Peptidbindung.
Eine Beschränkung des Wieland-Vorgehens ist die Größe der verwendeten Moleküle (nur Monoaminosäuren werden an Cystein gekoppelt) und leitet sich aus der für die Synthese des Thioesters verwendeten Methodik ab. Um den Thioester zu bilden, erfordert Wielands Vorgehen die Aktivierung der terminalen Carbonsäure als ein gemischtes Anhydrid, Säurechlorid oder als Thiosäure. Ein Problem entsteht, wenn eine saure Gruppe in einem Aminosäurerest, wie Asp (D) und Glu (E), vorhanden ist. In diesen Fällen erzeugt das Wieland-Verfahren eine unerwünschte Nebenreaktion und erfordert deshalb eine komplexe Schutzgruppenstrategie, insbesondere wenn Oligopeptide synthetisiert werden.
Die hierin beschriebene Erfindung eliminiert die Notwendigkeit für eine komplizierte Schutzgruppenstrategie, da die Oligopeptid-Thioester-Einheit aus einer Vorläufer-Thiosäure abgeleitet ist. Diese Vorläufer-Thiosäure (Peptid-α-COSH) wird durch eine standardmäßige schrittweise Festphasen-Peptidsynthese auf einem Aminomethyl-Harzträger, ausgestattet mit einem Thioesterharz-Linker, synthetisiert. Die Vorläufer-Thiosäure wird von dem Linker/Harz nahezu quantitativ (99%) in flüssigem HF bei 0ºC während 1 Stunde abgespalten.
Das Thioesterpeptid (Peptid-α-COSR) kann auf zwei allgemeinen Wegen synthetisiert werden:
(1) Reaktion eines rohen lyophilisierten Thiosäure-Peptids (Peptid-α-COSH) mit Ellman's- Reagenz (5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure, erhältlich von Aldrich Company) bei pH 5,5 (2,0 Äquivalente), 6 M Guanidin in 100 mM Na-Acetat-Puffer. Dies ergibt das SNB-Thioester- Peptid (Peptid-α-COSNB), welches anschließend mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RPHPLC) gereinigt wird.
(2) Reaktionen eines rohen lyophilisierten Thiosäure-Peptids (Peptid-α-COSH) mit Benzylbromid bei pH 4,0, 6 M Guanidin und 100 mM Na-Acetat-Puffer. Der Benzyl-Thioester (Peptid-α-COSBn) wird dann mittels RPHPLC gereinigt.
Die obenstehend angegebenen Bedingungen erlauben die Bildung eines ungeschützten Oligonukleotids, welches mit dem aktivierten Thioester ausgestattet ist. Eine anschließende Reaktion mit einem zweiten Peptid, enthaltend einen terminalen Cysteinrest, gestattet eine einfache Kopplung unter Bildung einer nativen Peptidbindung und kann Oligopeptidketten von 100 oder mehr Aminosäureresten erzeugen (Schema 1).
In günstigen Fällen hat die chemische Synthese bereits wichtige Beiträge zur Erforschung der Beziehung der Proteinstruktur zur Funktion geleistet. Die schrittweise Festphasensynthese hat die de novo-Herstellung kleiner Proteine gestattet (14), und es gab mehrere bemerkenswerte Beispiele der Anwendung dieses Verfahrens der Totalproteinsynthese zur Erforschung der molekularen Grundlage von biologischer Funktion. Ein anderes Verfahren, welches in speziellen Fällen die Anwendung der Chemie auf die Untersuchung von Proteinen erlaubte, ist eine Semi-Synthese mittels der konformationsmäßig unterstützten Religation von Peptidfragmenten. Eine bedeutende Erweiterung des Semisynthese-Vorgehens ist die Verwendung enzymatischer Ligation von klonierten oder synthetischen Peptidsegmenten. Obwohl diese Verfahren derzeitig strikte Einschränkungen aufweisen, besteht fortwährend ein ernsthaftes Interesse an der umfassenderen Anwendung der Werkzeuge der organischen Chemie auf die Untersuchung von Proteinen.
Native chemische Ligation stellt genau diese Fähigkeit zur Verfügung. Sie kombiniert die Bildung einer nativen Peptidbindung an der Ligationsstelle mit den Vorteilen der chemoselektiven Reaktion von ungeschützten Peptiden. Diese Ligationschemie der zweiten Generation erhöht in drastischer Weise die Größe von Polypeptiden mit nativem Grundgerüst, welche direkt durch chemische Totalsynthese zugänglich sind. Sie kann nützlicherweise auf einen weiten Spielraum an synthetischen Zielen, einschließlich Proteinen von mittlerer Größe, angewandt werden, und sie gestattet den direkten Zugang zu funktionellen Proteindomänen. Native chemische Ligation ist ein Grundstein eines allgemeinen modularen Vorgehens zur chemischen Totalsynthese von Proteinen. Darüber hinaus ist sie mit der Verwendung von sowohl chemisch synthetisierten Peptiden als auch aus anderen Quellen abgeleiteten Peptidsegmenten kompatibel.
Die unmittelbare chemische Totalsynthese von Proteinen repräsentiert die Realisierung eines wichtigen Zieles der organischen Chemie. Sie ermöglicht die uneingeschränkte Variation der kovalenten Proteinstruktur, ermöglicht durch einen allgemeinen synthetischen Zugang, und liefert einen neuen Anstoß für die Erforschung der strukturellen Grundlage von Eigenschaften, wie Faltung, Stabilität, katalytischer Aktivität, Bindung und biologischer Wirkung.
In einer alternativen Ausführungsform kann das carboxyterminale Peptidsegment oder Protein-Modul durch standardmäßige rekombinante DNA-Methoden exprimiert werden; vorausgesetzt das Produkt enthielte einen N-terminalen Cys-Rest, könnte es mit dem synthetischen aminoterminalen Peptid-α-COSR unter Anwendung der hierin beschriebenen nativen chemischen Ligation umgesetzt werden, wodurch man ein Produkt erhält, in welchem ein Teil des Proteins aus der chemischen Synthese und ein Teil aus der ribosomalen Synthese abstammen würde.

Ausführliche Beschreibung

Peptid-α-Thiosäure-Bildung

Ein typisches Verfahren für die Bildung und Anwendung des Thioesterharz-Linkers zur Verwendung in der Festphasensynthese von Peptid-α-Thiosäuren ist wie folgend beschaffen: (Kent et al., Tetrahedron Lett. (1995): Band 36, S. 1217).
4-(α-Mercaptobenzyl)phenoxyessigsäure, Dicyclohexylamin (3) Schema 2. Eine Mischung von 2, gebildet unter Verwendung der Bedingungen, wie etabliert von Yamashiro et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1988): Band 31, S. 322-334, (7,5 Gramm., 27 mmol), Thioharnstoff (2,3 g, 30 mmol) und Ethanol (100 ml) wurde bis zum Rückfluß erwärmt (Bedingungen wie berichtet von Koenig et al., J. Org. Chem. (1958): Band 23, S. 1525-1530). Nach 4 Stunden war die Umwandlung zu dem Thiouroniumsalz im wesentlichen vollständig, wie mittels Dünnschichtchromatographie bzw. TLC (90 : 5 : 5 Chloroform : Methanol : Essigsäure) gezeigt wurde. 10 N NaOH (30 ml) wurden zugesetzt, und der Rückfluß 2-3 Stunden lang fortgesetzt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch im Vakuum auf ungefähr die Hälfte des Originalvolumens konzentriert, mit konzentrierter HCl angesäuert (bis pH 2,0), und mit Ethylacetat extrahiert (4 · 30 ml). Die kombinierten Ethylacetat-Extrakte wurden mit gesättigtem NaCl (1 · 30 ml) gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Die flüchtigen Materialien wurden im Vakuum entfernt. Das resultierende Öl wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst, und jedwedes unlösliche Material wurde abfiltriert. DCHA (Dicyclohexylamin - erhältlich von Aldrich Company), (6,0 ml, 30 mmol), wurde dem Filtrat unter Rühren zugesetzt. Innerhalb weniger Minuten begann eine weißer Feststoff auszufallen. Diethylether (150 ml) wurde zugesetzt, und die Suspension mehrere Stunden lang bei -20ºC gekühlt. Der resultierende weiße Feststoff wurde filtriert, mit Diethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet, wodurch man 3 erhielt (10,3 g, 23 mmol, 84%): ¹H NMR (CDCl&sub3;): δ 7,30 (m, 7H), 6,82 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 5,39 (br s, 1H), 4,40 (s, 2H), 2,81 (m, 2H), 2,23 (br s, 1H, ex D&sub2;O), 1,88-1,02 (comp m, 2OH); FAB MS (Cäsiumion): berechnet für [C&sub2;&sub7;H&sub3;&sub7;NO&sub3;S, H&spplus;] 456,2572, gefunden 456,2572. Berechnete Analyse für C&sub2;&sub7;H&sub3;&sub7;NO&sub3;S: C 71,17; H 8,18; N 3,07; S 7,04. Gefunden: C 71,11; H 8,41; N 3,08; S 7,09.
Allgemeine Synthese von Boc-Aminothioester-Linker (1), Dicyclohexylaminsalz (Schema 2). Eine Mischung von 3 (3,67 mmol), Boc-Ala-OSu (erhältlich von Novablochem Corp.) (3,68 mmol), DIEA (Diisopropylethylamin - 5,74 mmol), Dimethylformamid (35 ml) und Methylenchlorid (4 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach mehreren Stunden löste sich die anfängliche weiße Suspension vollständig auf, wodurch man eine klare farblose Lösung erhielt. Nach 24 Stunden wurde die Reaktionsmischung in 1 N HCl (150 ml) gegossen und mit Ethylacetat (4 · 35 ml) extrahiert. Die kombinierten Ethylacetat-Extrakte wurden mit 1 N HCl (2 · 30 ml), H&sub2;O (1 · 30 ml), gesättigter NaCl (1 · 30 ml) gewaschen und über MgSO&sub4; getrocknet. Die flüchtigen Bestandteile wurden im Vakuum entfernt. Das resultierende Öl wurde durch Flash-Chromatographie (925 : 50 : 25 Chloroform : MeOH : Essigsäure) gereinigt, wodurch man ein mit Essigsäure kontaminiertes Öl erhielt. Um die restliche Essigsäure zu entfernen, wurde das Öl in Chloroform (40 ml) gelöst und mit 0,1 N HCl (7 · 10 ml), gesättigtem NaCl (1 · 10 ml) gewaschen, und über MgSO&sub4; getrocknet. Flüchtige Bestandteile wurden im Vakuum entfernt, wodurch man 1 als ein Öl erhielt. Dieses Öl wurde in Diethylether (10 ml) gelöst, zu welchem Dicyclohexylamin (1 Äquivalent) zugesetzt wurde. Hexan (100 ml) wurde unter Rühren zugesetzt, um das Dicyclohexylaminsalz von 1 als ein dickes Öl aus jeglichem nicht-umgesetzten Dicyclohexylamin zu trennen. Lösungsmittel wurden von dem Öl dekantiert, und das Öl wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (30-40 ml) gelöst. Die resultierende Lösung wurde im Vakuum konzentriert, wodurch man das Dicyclohexylaminsalz 1 als einen weißen schaumigen Feststoff erhielt (Schema 2).
Ein Beispiel der Verknüpfung und Synthese auf dem Harz ist das folgende: 4-[a-(Boc-Ala- S)Benzyl]phenoxyessigsäure (0,80 mmol) wird in 9 ml Methylenchlorid zu 1,00 g Aminomethylharz (0,40 mmol) zugesetzt und bei 0ºC mit 1,33 ml 0,6 M DCCI (Dicyclohexylcarbodiimid) in Methylenchlorid 15 Minuten lang und bei 24ºC 30 Minuten lang behandelt. Das Produkt wird dann standardmäßigen Festphasen-Peptidsynthese-Bedingungen unterzogen (Kent et al., Tetrahedron Letters (1995): Band 36, S. 1217; J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res. (1981): Band 17, S. 273). Sobald die gewünschte Kette synthetisiert ist, wird das Peptidharz (ungefähr 45 umol Original-Beladung) in 8 ml flüssigem HF (0,8 ml Anisol) 1 Stunde lang bei 0ºC behandelt. Nach Eindampfen mit Stickstoff, wird der Rückstand mit Ethylacetat gewaschen. Der Feststoff wird anschließend in Wasser (ungefähr 15 ml) bei 0ºC gerührt, während der pH-Wert mit festem Ammoniumbicarbonat auf 6,0 eingestellt wird. Eine Filtration und Lyophilisierung ergibt das Thiosäure-Rohprodukt, welches durch präparative HPLC in 30 mg-Ansätzen weiter gereinigt werden kann.

Herstellung des Thioester-terminalen Peptidsegments

Das α-COSR-Thioesterpeptid kann auf zwei allgemeine Weisen synthetisiert werden:
(1) Reaktion eines rohen lyophilisierten Thiosäurepeptids mit Ellman's Reagenz (5,5'- Dithiobis-2-nitrobenzoesäure, erhältlich von Aldrich Copmpany) bei pH 5,5 (2,0 Äquivalente), 6 M Guanidin in 100 mM Na-Acetat-Puffer. Dies ergibt das SNB-Thioester-Peptid, welches anschließend durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (RPHPLC) gereinigt wird.
(2) Reaktion eines rohen, lyophilisierten Thiosäure-Peptids mit Benzylbromid bei pH 4,0, 6 M Guanidin und 100 mM Na-Acetat-Puffer. Der Benzyl-Thioester wird dann durch RPHPLC gereinigt. Schema 3
Die obenstehend angegebenen Bedingungen erlauben die Bildung eines ungeschützten Oligonukleotids, welches mit dem aktivierten Thioester ausgestattet ist. Die anschließende Reaktion mit einem zweiten Peptid, enthaltend einen endständigen Cysteinrest, gestattet eine einfache Kopplung unter Bildung einer nativen Peptidbindung und kann Oligopeptidketten von 100 oder mehr Aminosäureresten erzeugen (Schema 1).

Beispiele

Beispiel 1

Das Modellpeptid Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSH (Sequenz Nr.: 1) wird durch optimierte schrittweise Festphasen-Peptidsynthese auf einem Aminomethylharz hergestellt. Der Thioesterharz-Linker wird durch eine verallgemeinerte Version hergestellt, wie übernommen aus Kent et al., Tetrahedron Letters (1995): Band 36, S. 1217; J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res. (1981): Band 17, S. 273; D. Yamashiro und C. H. Li, ebenda (1988): Band 31, S. 322. Sobald die gewünschte Kette synthetisiert ist, wird das Peptidharz (ungefähr 45 umol Original-Beladung) in 8 ml flüssigem HF (0,8 ml Anisol) 1 Stunde lang bei 0ºC behandelt. Nach Eindampfen mit Stickstoff, wird der Rückstand mit Ethylacetat gewaschen. Der Feststoff wird anschließend bei 0ºC in Wasser (ungefähr 15 ml) gerührt, während der pH- Wert mit festem Ammoniumbicarbonat auf 6,0 eingestellt wird. Filtration und Lyophilisierung ergibt das Thiosäure-Rohprodukt, welches weiter durch präparative HPLC in 30 mg-Ansätzen gereinigt werden kann.
Das Thioester-terminale Peptidsegment wird anschließend aus dem Thiosäurefragment durch chemische Synthese hergestellt, wodurch es mit der notwendigen α-COSR-Funktionalität ausgestattet wird, worin R eine Alkylgruppe, wie Benzyl, 5-Thio-2-nitrobenzoesäure (-SNB), Thiophenol etc. ist. Die Verwendung von besseren Thioester-Abgangsgruppen führte zu schnelleren Ligationsreaktionen. So wird das Modellpeptid Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSH (Sequenz Nr.: 1) zuerst zu dem Thiobenzylester umgewandelt durch Umsetzen mit Benzylbromid (15 Äquivalente) in 6,0 M Guanidin-HCl, pH 4,6, Natriumacetatpuffer, unter Bildung von Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSBn (Sequenz Nr.: 3). Das resultierende Peptid wird unter standardmäßigen Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Bedingungen unter Verwendung von ungefähr 20-45% Acetonitril bei 1% pro Minute gereinigt; wobei bei 214 nm überwacht wird.
Für das Peptid H-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (Sequenz Nr.: 2) gestatten Festphasenverfahren die Herstellung von Peptiden bis zu 60 Resten bei guter Ausbeute und hoher Reinheit, wie beschrieben in M. Schnolzer, P. Alewood, D. Alewood, S. B. H. Kent, Int. J. Pept. Protein Res. (1992): Band 40, S. 180.
Um den Reaktionsmechanismus zu erforschen, wurde das Peptid Leu-Tyr-Arg-Ala-GlyαCOSBn (Bn, Benzyl; Sequenz Nr.: 3) mit Ac-Cys (enthaltend eine blockierte funktionelle α-NH&sub2;-Gruppe - im Handel erhältlich von Novablochem Corp.) umgesetzt. Die exakte Masse des resultierenden Ligationsproduktes Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOS-CH&sub2;C(NHAc)CO&sub2;H (Sequenz Nr.: 4) wurde durch Elektrospray-Massenspektrometrie bestimmt und war konsistent mit einem Thioester-verknüpften Peptid als dem Ligationsprodukt, erzeugt durch nukleophilen Angriff der Ac-Cys-Seitenkette auf die α-Thioestereinheit des Peptides.
Schließlich schritt die Reaktion von Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-αCOSBn (Sequenz Nr.: 3) mit Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (Sequenz Nr.: 2, enthaltend eine unblockierte funktionelle α-NH&sub2;- Gruppe) rasch bei pH 6,8 voran (unter pH 6,0 schritt die Reaktion sehr langsam voran, was die Beteiligung des ionisierten Thiolates der Cys-Seitenkette bei pH 6,8 nahelegt; Schema 3) und ergab ein Einzelprodukt der erwarteten Masse. Die Peptide Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly- αCOSBn + Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser wurden in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 6,8, 6,0 und 4,7 bei 25ºC umgesetzt. Nach 1 Stunde waren die Reaktionen wie folgend vorangeschritten: bei pH 6,8 > 95%; bei pH 6,0 ungefähr 10%; und bei pH 4,7 ungefähr 1,0% des ligierten Produktes Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (Sequenz Nr.: 5). Wie durch HPLC beobachtet, zeigt das Schema 3 die pH-Abhängigkeit der Reaktion nach 1 Stunde und bei 25ºC. Diesem Produkt fehlte die Anfälligkeit gegenüber Nukleophilen und es hatte die Fähigkeit, Disulfid-verknüpfte dimere Peptide zu bilden, was unzweifelhaft die Bildung einer nativen Amidbindung an der Ligationsstelle zeigt.
Ein anderes, unveröffentlichtes Modell unter Verwendung des 2-Thioessigsäure-Derivates Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-SCH&sub2;COOH (Sequenz Nr.: 6 - gebildet aus dem Angriff der Thiosäure Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-SH (Sequenz Nr.: 1) auf 2-Bromessigsäure in Methylenchlorid) + Cys- Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (Sequenz Nr.: 2) wurde bei pH 6,8 in 0,2 M Phosphatpuffer bei 45ºC ligiert. Nach 1,0 Stunden war die Reaktion zu 80% vorangeschritten, wie beobachtet im Schema 4 mittels HPLC. Die Isolierung von Oxidationsprodukten aus dem ligierten Leu-Tyr- Arg-Ala-Gly-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (Sequenz Nr.: 5 und unreagiertem Cys-Arg-Ala- Glu-Tyr-Ser verdeutlichte die Gegenwart eines freien Thiol-Ligationsproduktes.
Das native chemische Ligationsverfahren ist allgemein auf Peptide anwendbar, welche den vollen Bereich von funktionalen Gruppen, der normalerweise in Proteinen zu finden ist, enthalten. Selbst freie interne Cys-Reste können in jedem der beiden reagierenden Segmente vorhanden sein. Interne Cys-Reste können einen Esteraustausch mit der Peptid-α-Thioester- Komponente eingehen; allerdings ist diese Reaktion unproduktiv, weil keine Umgruppierung zur Amidbindung stattfinden kann, der gebildete Thioester ohne weiteres reversibel ist und ein produktiver Teil des reagierenden Systems bleibt.
Das native chemische Ligationsverfahren ist auf die Reaktion an einem Amino-terminalen Cys-Rest eingeschränkt. Um das Seitenkettenthiol von diesem Cys daran zu hindern, unter Bildung eines disulfidverknüpften Dimeren zu oxidieren, wird ein Überschuß an Thiol, entsprechend zu der Thioester-Abgangsgruppe, verwendet, um die Cys-Reste in reduzierter Form zu halten, ohne daß die Ligationsreaktion gestört wird. Darüber hinaus werden kleine Mengen an Thiolen von niedrigem Molekulargewicht, wie Thiophenol, zu der Kopplungsreaktionsmischung zugegeben, um eine reduzierende Umgebung aufrecht zu erhalten.
Die Zugabe von Thiolen erhöht die Reaktivität des Thioesters, insbesondere wenn das zugesetzte Thiol eine bessere Abgangsgruppe als der vor-gebildete Thioester ist. Ein Beispiel dieser Beobachtung besteht, wenn der Benzylester durch Zugabe von Thiophenol zu der Reaktion in einen Phenylester umgewandelt wird. Reaktionsausbeuten und -geschwindigkeiten werden wesentlich erhöht. Nach 7 Stunden mit Benzylmercaptan, ergab zum Beispiel die Barnase-Reaktion 25%, wohingegen die Thiophenol-Behandlung an derselben Reaktionsmischung 90% ergab.
Die Zugabe von Thiolen zu der Ligationsmischung hält die Reaktionsmischung auch in einer reduzierten Form. Dies verhindert die Oxidation der reaktiven N-terminalen Cys-Reste, und wenn interne Cys-Reste vorhanden sind, verringern die Thiole die Bildung von intramolekularen Disulfidbindungen. Darüber hinaus steigert die reduzierende Umgebung die Stabilität des Thioestersegments (Ligationsreaktionen können über Nacht bei wenig oder keiner Hydrolyse bei pH 7,5 voranschreiten). Schema 4
Datum: Mittw., 2. Feb 1994 3:19 PM
Data: LYRAG-SCH2COO+CRAEYS10-001
Probe: PH6.8phos 45degC
Methode: PhilO-67%
Iniektions-Vol.: 20
Probennahme-Intervall: 0,2 Sekunden
Daten: Analyse: Kanal A

Beispiel 2

K41-Protease von HIV-1 (unveröffentlichte Bedingungen)

Ligationsreaktionen werden auf mehreren Wegen durchgeführt. Ein optimiertes Verfahren für eine Ligationsreaktion, beinhaltend einen (5-Thio-2-nitrobenzoesäure)-SNB-Thioester besteht darin, die zwei Peptide, HIV (1-40)-COSNB (Sequenz Nr.: 11, gebildet unter hierin angegebenen Standardbedingungen) und HIV (41-99) (Sequenz Nr.: 12, gebildet unter hierin angegebenen Standardbedingungen) als Feststoffe in dasselbe Reaktionsgefäß abzuwiegen und 6,0 M Guanidin-HCl, pH 6,5, mit 100 mM Na-Acetat zuzusetzen (die ungefähre Peptidkonzentration beträgt 7-13 mg/ml von jedem Peptid).
Nach 5 Minuten werden ungefähr 2,0% Thiol zugegeben. Zwei Thiolkatalysatoren sind verwendet worden, nämlich Benzylmercaptan (bildet den Benzylthioester in situ; Sequenz Nr.: 13) und Thiophenol (bildet den Phenylthioester in situ; Sequenz Nr.: 14). Bei der Ligation von HIV-PR ergab die Reaktion mit Benzylmercaptan mehr als 60% Produktausbeute in 40 Stunden, wohingegen das Thiophenol mehr als 80% Produktausbeute in 10 Stunden ergab, wodurch die K41-Protease von HIV-1 (Sequenz Nr.: 15) gebildet wurde.
Von der anschließenden Behandlung mit TCEP wurde festgestellt, bei der Reinigung und Analyse von Produkt durch Reduzieren der Thiophenol- und Benzylmercaptan- Disulfidprodukte, welche dazu neigen, gemeinsam mit Peptidprodukten zu eluieren, hilfreich zu sein. Das Produkt wurde durch standardmäßige Umkehrphasen-HPLC, wie obenstehend beschrieben, gereinigt und durch Elektronenspray-Massenspektroskopie charakterisiert (Schema 9).

Beispiel 3

Barnase-Beispiel (unveröffentlichte Bedingungen)

Die zwei Peptide Barnase(1-48)-SNB (Sequenz Nr.: 16, gebildet unter hierin angegebenen Standardbedingungen) und Barnase(49-110) (Sequenz Nr.: 17, gebildet unter hierin angegebenen Standardbedingungen) wurden als Feststoffe in dasselbe Reaktionsgefäß abgewogen und in pH 7,5-Puffer (6M Guanidin, 100 mM Phosphat) gelöst. Unmittelbar nach dem Lösen der Peptide wurden 2% Benzylmercaptan (bildet den Benzylthioester in situ; Sequenz Nr.: 18) oder 4% Thiophenol (bildet den Phenylthioester in situ; Sequenz Nr.: 19) zugesetzt. Nach 7 Stunden schritt die Benzylmercaptan-Reaktion um 25% voran und die Thiophenol-Reaktion schritt um > 90% voran, wodurch Barnase(1-110) (Sequenz Nr.: 20) gebildet wurde. Das Produkt wurde durch Standard-Umkehrphasen-HPLC, wie obenstehend beschrieben, gereinigt (Schema 10).
Die Zugabe von Thiolen erhöht die Reaktivität des Thioesters, insbesondere wenn das zugesetzte Thiol eine bessere Abgangsgruppe als der vor-geformte Thioester ist. Ein Beispiel dieser Beobachtung besteht, wenn der Benzylester durch Zugabe von Thiophenol zu der Reaktion in einen Phenylester umgewandelt wird. Reaktionsausbeuten und -geschwindigkeiten werden wesentlich erhöht. Zum Beispiel ergab, nach 7 Stunden mit Benzylmercaptan, die Barnase-Reaktion 25%, wohingegen die Thiophenol-Behandlung an derselben Reaktionsmischung 90% ergab, wodurch Barnase (1-110) (Sequenz Nr.: 20) gebildet wurde.
Die Zugabe von Thiolen zu der Ligationsmischung hält die Reaktionsmischung auch in einer reduzierten Form. Dies verhindert die Oxidation der reaktiven N-terminalen Cys-Reste, Schema 9 Mutante K41 = Protease von HIV-1 synthetisiert durch native chemische Ligation
und wenn interne Cys-Reste vorhanden sind, reduzieren die Thiole die Bildung von intramolekularen Disulfidbrücken. Darüber hinaus erhöht die reduzierende Umgebung die Stabilität des Thioestersegmentes (Ligationsreaktionen können über Nacht bei geringer oder gar keiner Hydrolyse bei einem pH-Wert von 7,5 erfolgen). Schema 10 BARNASE K39 1-48COSR + 49(CYS)-110

SEQUENZ-AUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: The Scripps Research Institute
(B) STRASSE: 10666 North Torrey Pines Road, Suite 220, Mail Drop TPC 8
(C) STADT: La Jolla
(D) STAAT: CA
(E) LAND: U.S.A.
(F) PLZ (ZIP): 92037
(G) TELEFON: 619-554-2937
(H) TELEFAX: 619-554-6312
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: PROTEINSYNTHESE MITTELS NATIVER CHEMISCHER LIGATION
(iii) ANZAHL VON SEQUENZEN: 20
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Floppy-Disk
(B) COMPUTER: IBM-PC-Kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(v) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: PCT/US
(B) EINREICHUNGSDATUM: 4. MAI 1995

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 1:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) KENNZEICHEN bzw. MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 5
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSH /note = "wobei COSH Thiosäure ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 2:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 6 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 2:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 3:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: S Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 5
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSBn /note = "wobei COSBn Benzylthioester ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 3:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 4:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 5
(C) WEITERE INFORMATION: /label = X /note = "wobei X N-Acetyl-Cystein-Thioester ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 4:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 5:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 5:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 6:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 5 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 5
(C) WEITERE INFORMATION: /label = SCH2COOH /note = "wobei SCH2COOH 2-Thioessigsäure ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 6:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 7:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 33
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSH /note = "wobei COSH Thiosäure ist."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 1
(C) WEITERE INFORMATION: /label = Msc /note = "wobei Msc 2-Methylsulfonyl-ethyloxy-carbonyl ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 7:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 8:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 33
(D) WEITERE INFORMATION: /label = COSBn /note = "wobei COSBn Benzylthioester ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 8:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 9:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 39 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 9:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 10:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 72 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 72
(C) WEITERE INFORMATION: /label = SH4 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 10:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 11:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 40
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSNB /note = "wobei COSNB 5-Thio-2-nitrobenzoesäureester ist."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 27
(C) WEITERE INFORMATION: /label = Xaa /note = "wobei Xaa 2-Aminobuttersäure ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 11:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 12:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 59 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 27
(C) WEITERE INFORMATION: /label = Xaa /note = "wobei Xaa 2-Aminobuttersäure ist."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 55
(C) WEITERE INFORMATION: /label = Xaa /note = "wobei Xaa 2-Aminobuttersäure ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 12:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 13:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 40
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSBn /note = "wobei COSBn ?? ist."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 40
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSBn /note = "wobei COSBn Benzylthioester ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 13:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 14:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 40 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: - einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 40
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSPh /note = "wobei COSPh Phenylthioester ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 14:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 15:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 99 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 67
(C) WEITERE INFORMATION: /label = Xaa /note = "wobei Xaa 2-Aminobuttersäure ist."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 95
(C) WEITERE INFORMATION: /label = Xaa
/note = "wobei Xaa 2-Aminobuttersäure ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 15:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 16:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 48 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 48
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSNB /note = "wobei COSNB 5-Thio-2-nitrobenzoesäureester ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 16:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 17:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 62 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 17:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 18:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 48 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 48 -
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSBn /note = "wobei COSBn Benzylthioester ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 18:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 19:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 48 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte-Stelle
(B) LOKALISIERUNG: 48
(C) WEITERE INFORMATION: /label = COSPh /note = "wobei COSPh Phenylthioester ist." (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 19:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID Nr.: 20:

(i) SEQUENZ-CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 110 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRANGART: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜL-TYP: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr.: 20:

Claims

1. Verfahren zum Ligieren eines ersten Oligopeptids mit einem zweiten Oligopeptid Ende an Ende zur Herstellung eine Oligopeptid-Produkts, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

Schritt A: Mischen des ersten und zweiten Oligopeptids in einer Reaktionslösung, wobei das erste Oligopeptid einen C-terminalen Thioester einschliesst, das zweite Oligopeptid ein N- terminales Cystein mit einer nichtoxidierten Sulfhydryl-Seitenkette einschliesst; danach

Schritt B: Kondensieren der nichtoxidierten Sulfhydryl-Seitenkette des N-terminalen Cysteins mit dem C-terminalen Thioester zur Bildung eines intermediären Oligopeptids, welches das erste und zweite Oligopeptid mit einer β-Aminothioester-Bindung verbindet;

und im Anschluss

Schritt C: Umgruppieren der β-Aminothioester-Bindung des intermediären Oligopeptid- Peptids von Schritt B zur Herstellung des Oligopeptid-Produkts, welches das erste und das zweite Oligopeptide mit einer Amidbindung verbindet,

dadurch gekennzeichnet, dass ein katalytisches Thiol der Reaktionslösung in Schritt A hinzugegeben wird, wobei das katalytische Thiol (a) ein konjugiertes Thiol oder Thiolat ist, welches direkt an einem aromatischen oder heteroaromatischen Ring gebunden ist, (b) in einer katalytischen Konzentration vorliegt, und (c) sich von dem Thiol unterscheidet, aus welchem der C-terminale Thioester rein gedanklich gebildet ist.

2. Verfahren wie in Anspruch 1 beschrieben, in welchem das katalytische Thiol eine bessere Abgangsgruppe ist als das Thiol, aus welchem der C-terminale Thioester rein gedanklich gebildet ist.

3. Verfahren wie in Anspruch 1 oder Anspruch 2 beschrieben, in welchem in Schritt A das katalytische Thiol gewählt ist aus der Thiophenol, 1-Thio-2-nitrophenol, 2-Thiobenzoesäure, 2-Thiopyridin, 4-Thio-2-pyridincarbonsäure und 4-Thio-2-nitropyridin umfassenden Gruppe.

4. Verfahren wie in Anspruch 3 beschrieben, in welchem in Schritt A das konjugierte Thiol Thiophenol ist.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, in welchem das Oligopeptid mit einem C-terminalen Thioester durch ein Verfahren hergestellt wird. umfassend die folgenden Schritte:

Schritt A: Vorsehen eines Harzes mit einem Linker mit einem nichtoxidierten Thiol;

Schritt B: Vorsehen eines Boc-Aminosäuresuceinimidesters; danach

Schritt C: Vermischen des Harzes aus Schritt A und des Boc-Aminosäuresuccinimidesters aus Schritt B unter Reaktionsbedingungen zur Herstellung eines Boc-Aminothioesterharzes; im Anschluss

Schritt D: Anbringen eines Oligopeptids auf dem Boc-Aminothioesterharz durch schrittweise Festphasen-Peptidsynthese; danach

Schritt E: Abspalten des Boc-Aminothioesterharzes von Schritt D mit HF zur Herstellung eines Oligopeptids mit einem C-terminalen Thiol; und danach

Schritt F: Umwandeln des Oligopeptids mit einem C-terminalen Thiol aus Schritt E zu dem Oligopeptid mit einem C-terminalen Thioester.