DE60028539T2

DE60028539T2 - Zur verflüchtigung fähige festphasen-träger für die synthese von verbindungen

Info

Publication number: DE60028539T2
Application number: DE60028539T
Authority: DE
Inventors: H. Jeanick San Diego PASCAL; Michael J. San Diego MORAN; A. Richard Del Mar HOUGHTEN
Original assignee: Mixture Sciences Inc San Diego; Mixture Sciences Inc
Current assignee: Mixture Sciences Inc San Diego; Mixture Sciences Inc
Priority date: 1999-02-05
Filing date: 2000-01-31
Publication date: 2007-06-28
Anticipated expiration: 2020-02-01
Also published as: AU2865600A; US7396925B2; HUP0200326A2; US7067623B2; CA2362193A1; ATE328894T1; US20030135024A1; IL144545A; CZ20012790A3; CA2362193C; WO2000046238A1; DE60028539D1; IL144545A0; JP2002536383A; EP1147127A1; WO2000046238A8; JP3607200B2; US6476191B1; AU776159B2; EP1147127B1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die Erfindung betrifft Festphasensynthesen und insbesondere die Festphasensynthese an einem synthetischen Träger, der sich nach der Abspaltung des synthetisierten Stoffs von dem Träger verflüchtigt.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die Herstellung von Verbindungen unter Verwendung einer Festphasenmethode wurde zuerst von Merrifield 1963 beschrieben [Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149–2154]. Seit diesem anfänglichen, grundlegenden Konzept, bei dem eine Polystyrol-Festphase verwendet wurde, um Peptide herzustellen, ist ein breites Sortiment verschiedener fester Träger verwendet worden (d.h. Polyamide [Atherton u.a., 1975, J. Am. Chem. Soc., 97: 6584–6585], poröses Glas [Parr u.a., 1974, Justus Liebigs Ann. Chem., S. 655–666] und Mikrochip-Quarz [Fodor u.a., 1991, Science, 251: 767–773]). Obwohl sie verwendbar sind, erfordern diese Festphasen-Träger alle einen abschließenden Spaltungsschritt, bei dem die Verbindungen (Peptide, Peptidmimetika, Oligonukleotide, kleine organische Moleküle, verschiedene Heterozyklen und dergleichen) von der festen Phase abgespaltet werden, dann von dem verbrauchten festen Träger getrennt werden.
Wenn die Verbindung, der das Interesse gilt, immobilisiert verwendet werden kann (d.h. dass sie bei ihrer endgültigen Verwendung und/oder ihrer Manifestierung auf dem festen Träger verbleibt), dann wird der restliche feste Träger unproblematisch sein, wobei er genau genommen für bestimmte Untersuchungen zweckmäßig sein kann. In der Mehrzahl der Fälle muss jedoch die Verbindung, der das Interesse gilt, in Lösung verwendet werden, weshalb sie von ihrem festen Träger getrennt werden muss. Es ließen sich erhebliche Zeit- und/oder Kosteneinsparungen tätigen, wenn das Entfer nen des Festphasenmaterials nicht in einem gesonderten Schritt, der auf das Abspalten der gewünschten Verbindung von dem festen Träger (üblicherweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren) folgt, ausgeführt werden müsste. Die im Folgenden offenbarte Erfindung schafft eine Lösung für das Problem der Trennung des verbrauchten festen Trägers von dem angestrebten synthetisierten Stoff.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung nimmt die Festphasensynthese an einem festen Träger, bei der das gewünschte Produkt nach dem Abspalten von dem Feststoff und dessen Verdampfung zurückbleibt, in Aussicht. Folglich wird ein Festphasen-Syntheseverfahren in Aussicht genommen, bei dem wenigstens ein Reagens an einen Festphasen-Träger gekuppelt ist. An dem festphasen-gekuppelten Reagens wird eine Vielzahl von Reaktionen ausgeführt, um ein an die feste Phase gekuppeltes Reaktionsprodukt zu bilden, und das Reaktionsprodukt wird von dem Festphasen-Träger abgespaltet, um ein abgespaltenes Produkt zu bilden. Die Verbesserung bei dieser ansonsten üblichen Synthese besteht darin, dass man den Festphasen-Träger reagieren lässt, um eine flüchtige Verbindung bzw. flüchtige Verbindungen zu bilden, die durch Verdampfen, wie etwa durch Destillieren, von dem abgespaltenen Produkt getrennt werden. Das angestrebte abgespaltene Produkt wird vorzugsweise zurückgewonnen, wobei der feste Träger infolge seines Verdampfens nicht anwesend ist.
Ein besonders bevorzugter fester Träger ist Kieselerde. Das Abspalten des Produkts von dem festen Träger und das Bilden der flüchtigen Verbindung werden typisch in einem einzigen Schritt ausgeführt, obwohl separate Schritte benutzt werden können.
Die vorliegende Erfindung hat verschiedene Vorteile und Vorzüge.
Ein Vorteil ist die Einfachheit der Reaktionsschritte, die in der Weise ausgeführt werden, dass der übliche Filtrationsschritt, der bei früheren Festphasensynthesen notwendig war, nicht erforderlich ist.
Ein Vorteil eines in Aussicht genommenen Verfahrens besteht darin, dass Verluste an dem angestrebten Produkt, die wegen des Einschlusses des angestrebten Produkts innerhalb des gewöhnlich verbrauchten festen Trägers oder Filters auftreten können, nicht auftreten.
Ein weiterer Vorteil ist, dass die üblichen abschließenden Extraktionsschritte, um das Produkt von dem festen Träger zu entfernen, die bei früheren Festphasensynthesen nach dem Abspalten von dem festen Träger notwendig waren, hier nicht erforderlich sind.
Noch weitere Vorteile und Vorzüge der betrachteten Erfindung sind dem Fachmann aus der folgenden Darstellung ersichtlich.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es wird ein Festphasen-Syntheseverfahren geschaffen, bei dem die üblichen Festphasensynthese-Schritte zur Synthese eines Peptids, Peptidmimetikums, Glykoproteins, Oligonukleotids, kleiner organischer Moleküle oder eines heterozyklischen Produkts ausgeführt werden, wie im Folgenden niedergeschrieben ist. Die Verbesserung besteht hier in der Trennung des abgespaltenen Produkts von dem festen Träger durch Umwandlung des Festphasen-Trägers in einen flüchtigen Stoff, der durch Verdampfen von dem angestrebten Reaktionsprodukt getrennt wird, so dass die gewöhnlich angewendete Trennung des angestrebten Produkts von dem verbrauchten Festphasen-Träger durch Filtration oder Extraktion überflüssig ist.
Folglich ist, wenn eine Festphasen-Peptidsynthese als Beispiel genommen wird, wenigstens ein Reagens, wie etwa eine seitenketten- und N-geschützte Aminosäure, an den festen Träger gekuppelt. An diesem festphasen-gekuppelten Reagens wird eine Vielzahl von Reaktionen durchgeführt, wie etwa ein Entfernen des N-terminalen Schutzes, ein Kuppeln einer weiteren seitenketten- und N-geschützten Aminosäure und ein Entfernen des N-terminalen Schutzes bei dem resultierenden Produkt, um ein festphasen-gekuppeltes Reaktionsprodukt zu bilden. Alle vorhandenen Seitenketten-Schutzgruppen werden entfernt, und die Verbindung zwischen festem Träger und angestrebtem Produkt wird gespaltet, um ein abgespaltenes Produkt zu bilden. Aus dem verbrauchten festen Träger wird eine flüchtige Verbindung gebildet. Bei einer bevorzugten Verfahrensweise für die Peptidsynthese wird HF verwendet, um vorhandene Seitenketten-Schutzgruppen zu entfernen, das Produkt vom festen Träger abzuspalten und die flüchtige(n) Verbindung(en) aus dem verbrauchten festen Träger zu bilden.
So, wie „Reaktionsprodukt" hier gebraucht wird, ist damit der Stoff bezeichnet, der an dem Festphasenträger gebildet und an diesen gebunden wird. Das Reaktionsprodukt kann Schutzgruppen aufweisen, die an es gebunden sind, oder diese Schutzgruppen können beseitigt sein.
Das „abgespaltene Produkt" ist jener Stoff, der bei dem Spalten der Bindung zwischen dem Festphasenträger und dem Reaktionsprodukt erhalten wird. Das abgespaltene Produkt ist üblicherweise frei von Schutzgruppen, muss dies jedoch nicht sein. Außerdem ist das abgespaltene Produkt typisch protoniert, wenngleich eine Protonierung kein näher bestimmendes Merkmal eines abgespaltenen Produkts ist.
Ein „verbrauchter fester Träger" ist der Stoff, der nach dem Abspalten des angestrebten Reaktionsprodukts von dem Träger übrig bleibt. Wie nachstehend erörtert ist, wird der feste Träger vorzugsweise gleichzeitig mit der Bildung des abgespaltenen Produkts in eine flüchtige Verbindung überführt. In diesem bevorzugten Fall gibt es gewöhnlich keinen verbrauchten festen Träger.
Beispielsweise ist poröses Glas als ein fester Träger verwendet worden, um ein Peptid bei Abspaltung des angestrebten Produkts, was durch Reaktion des festphasengebundenen Peptids mit Methanol und Triethylamin zustande gebracht wurde, herzustellen [Parr u.a., 1974, Justus Liebigs Ann. Chem., S. 655–666.]. Hingegen kann, anders als bei Verwendung eines Reagens, das die Verbindung von dem Träger abspaltet, woraufhin ein Filtrieren des verbrauchten festen Trägers von der angestrebten Verbindung folgt, wie von Parr u.a. durchgeführt, bei Anwendung eines in Aussicht genommenen Verfahrens das poröse Glas durch flüssigen oder gasförmigen Fluorwasserstoff vollständig in flüchtiges Siliziumtetrafluorid (SiF₄, Kp: –86°C) umgewandelt werden, das erwärmt oder einem Vakuum ausgesetzt werden kann, um die Trennung zu bewirken. Die Anwendung eines in Aussicht genommenen Verfahrens lässt die angestrebte Verbindung im Reaktionsgefäß zurück, wobei sich der feste Träger aus porösem Glas als SiF₄ verflüchtigt.
Dieses Konzept vereinfacht die Herstellung von einzelnen Verbindungen oder Gemischen von Verbindungen oder die Herstellung von einzelnen Verbindungen, Gruppen von Verbindungen oder kombinatorischen Bibliotheken von Gemischen in großen Serien [Plunkett u.a., 1995, J. Org. Chem., 60: 6006–6007; Houghten, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5131–5135; Houghten u.a., 1991, Nature, 354: 84–86; Pinilla u.a., 1992, BioTechniques 13: 901–905; Ostresh u.a., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 11138–11142; Dooley u.a., 1994, Science, 266: 2019–2022; und Eichler u.a., 1995, Molecular Medicine Today 1: 174–180]. Außerdem ist, wenn mit Gemischen von Verbindungen gearbeitet wird, die Gefahr, dass ein Teil der Verbindungen während des Verfahrens zum Trennen von der festen Phase (Filtrieren oder Zentrifugieren) verloren geht, auf ein Minimum herabgesetzt.
Die vorliegende Erfindung nimmt außerdem die Verwendung von so genannten nicht spaltbaren Linkern in Verbindung mit derartigen verdampfbaren festen Trägern in Aussicht. Ein nicht spaltbarer Linker ist ein Linker, der am abgespaltenen Produkt gebunden bleibt, jedoch vom Träger abgespalten wird. Diese Verwendung führt nach der Abspaltung zu einer modifizierten Verbindung (Verbindung an Linker gebunden), die an sich von Interesse sein kann oder die erforderlichenfalls weiter modifiziert werden kann.
Beispielhafte nicht spaltbare Linker können unter Verwendung von amino-C₂-C₆-alkyl-gepfropften Glaskügelchen als fester Träger hergestellt werden, um eine Verbindung, wie etwa ein Peptid, herzustellen. Beispielhafte Aminopropyl-Glaskügelchen mit unterschiedlichen Porengrößen, Korngrößen (Maschenzahlen) und Stoffmengen (Mikromol) eines primären Amins pro Gramm Glas (μmol/g) sind im Handel von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri (USA), als Aminopropylkieselgel erhältlich, von dem es heißt, dass es 1–2 mmol/g Stickstoff enthält.
Folglich liefert die Verwendung von mit Aminopropyl gepfropften Glaskügelchen, um das an den festen Träger gebundene Peptid zu bilden, woraufhin eine Behandlung mit HF folgt, ein Peptid mit einer C-terminalen Trifluorsilylpropylamido-[-CO-NH-CH₂-CH₂-CH₂-SiF₃-]Gruppe, die leicht hydrolysiert werden kann, um die entsprechende Kieselsäuregruppe [-CO-NH-CH2-CH2-CH2-Si(OH)₃] zu bilden. Diese Verbindung kann nach einer teilweisen oder vollständigen Polymerisation durch die -Si(OH)₃-Gruppe als Konjugat für die Immunisierung bei der Herstellung von Antikörpern gegen das Peptid von Interesse verwendet werden. Außerdem können derartige Stoffe für die Affinitätsreinigung von polyklonalen Antikörpern, die gegen das Peptid oder die Verbindung von Interesse erzeugt werden, verwendbar sein. Das Siliziumatom kann nach solchen Hydrolysen auch als eine -Si(OH)₂F- oder -Si(OH)F₂-Gruppe vorliegen, die ebenfalls bei einer Polymerisation oder einer anderen Reaktion verwendet werden kann.
Zusätzlich zu einer Aminopropyl-Gruppe werden noch weitere verkettende Gruppen in Aussicht genommen. Beispielsweise kann 3-Merkaptopropyl-Trimethoxysilan [HS-CH₂-CH₂-CH₂-Si(OCH₃)₃], das von Hüls America Inc., Piscataway, New Jersey (USA), erhältlich ist, an poröse Glaskügelchen gekuppelt werden, um 3-merkaptopropyl-gepfropftes Glas (thioliertes Glas) zu schaffen. Eine Reaktion des thiolierten Glases mit bis-N-BOC-2-Aminoethyldisulfid liefert nach dem Entfernen der Schutzgruppen ein mit einem primären Amin endendes Disulfid. Das primäre Amin kann verwendet werden, um Peptide in einer üblichen Festphasensynthese zu synthetisieren. Nach Abschluss der Synthese liefert ein Behandeln des Glases, woran das Reaktionsprodukt gebunden ist, mit einem Reduktionsmittel und dann HF ein Peptid, das eine C-terminale Amidoethylmerkapto-Gruppe aufweist, und einen verdampfbaren Rückstand des festen Trägers. Das mit der Amidoethylmerkapto-Gruppe endende Peptid kann leicht eine Reaktion mit einem antigenen Trägermolekül eingehen, das zuvor mit m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimidester (ICN Biochemicals Inc., Costa Mesa, Kalifornien (USA)) oder Succinimidyl-4-(N-Maleimidomethyl)Zyklohexan-1-Carboxylat (SMCC, Pierce Chemical Co., Rockford, IL) reagiert hat, um ein immunogenes Konjugat zu bilden.
Der Disulfid enthaltende BOC-geschützte Bindungsgruppen-Vorläufer kann durch übliche Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann 2-Aminoethyldisulfid eine Reaktion mit zwei Mol 2-(tert-Butoxycarbonyloxylamino)-2-phenylazetonitril oder N-(tert-Butoxycarbonyloxy)phthalimid oder eines ähnlichen Reagens eingehen, um bis-N-BOC-2-Aminoethyldisulfid zu bilden.
Von verschiedenen Reduktionsmitteln ist wohlbekannt, dass sie zum Aufspalten der Disulfid-Bindung verwendbar sind. Beispielhafte Reagenzien schließen Natriumborhydrid, 2-Merkaptoethanol, 2-Merkaptoethylamin, Dithiothreitol und Dithioerythritol ein. Merkaptanhaltige Karbonsäuren mit zwei bis drei Kohlenstoffatomen und ihre Alkalimetall- und Ammoniumsalze sind ebenfalls verwendbar. Diese Reagenzien schließen Thioglykolsäure, Thiomilchsäure und 3-Merkaptopropionsäure ein. Beispielhafte Salze schließen Natriumthioglykolat, Kaliumthioazetat, Ammonium-3-Merkaptopropionat und (2-Hydroxyethyl)ammoniumthioglykolat ein.
Außerdem wird die Verwendung von spaltbaren Bindungsgruppen, die sowohl von dem abgespaltenen Produkt als auch von dem festen Träger trennen, in Aussicht genommen. Eine Gruppe spaltbarer Linker enthält eine Benzylgruppe und Silizium. Bei Behandlung mit spezifischen Reagenzien können solche spaltbaren Linker in Gase oder flüssige Formen überführt werden, die bei verschiedenen nutzbaren Temperaturen und Drücken leicht verdampft werden können. Solche Bindungsgruppen sind folglich spaltbar und bilden flüchtige Verbindung(en) bei einer Reaktion von HF mit dem festen Träger.
Beispielsweise können Linker wie etwa Cl-CH₂C₆H₄-(CH₂)_3-5-SiCl₃, Cl-CH₂C₆H₄-(CH₂)_3-5-Si(CH₃)Cl₂, Cl-CH₂C₆H₄-(CH₂)_3-5-Si(CH₃)₂Cl, Cl-CH₂C₆H₄-SiCl₃ und Cl-CH₂-C₆H₄-Si(OCH₃)₃ eine Reaktion mit Glaskügelchen (oder einem anderen Material auf SiO₂-Basis) eingehen, um Glaskügelchen mit aufgepfropftem α-Chlorbenzyl-C₃-C₅-Alkyl bzw. Glaskügelchen mit aufgepfropftem α-Chlorbenzyl zu bilden, die eine oder mehrere Siloxan-Bindungen mit dem Träger aufweisen. Beispielhafte α-Chlorbenzyl-C₃-C₅-Alkyl-Chlorsilane und α-Chlorben zylchlor- oder -methoxysilane sind von Hüls America Inc., Piscataway, New Jersey (USA), erhältlich. Dieser gepfropfte Glasträger kann dann durch die Chlormethylgruppe mit verschiedensten Verbindungen, wie etwa geschützten Aminosäuren, Aminen, Alkoholen und dergleichen, eine Reaktion eingehen, um Benzylethergruppen zu bilden. In dem Fall, in dem n = 1 ist und eine Methylengruppe zwischen dem Ring und dem Siliziumatom vorhanden ist, kann dieser Linker durch Behandeln mit gasförmigem oder flüssigem Fluorwasserstoff in das flüchtige para(Trifluorsilylmethyl)benzylfluorid [F-CH₂C₆H₄-CH₂-SiF₃] umgewandelt werden.
Obwohl hier als Beispiele poröses Glas oder andere auf Kieselerde basierende feste Träger benutzt werden, wird davon ausgegangen, dass eine große Auswahl von polymeren und/oder anderen festen Stoffen auf eine ähnliche Weise verwendet werden kann. Folglich werden die angestrebten festphasensynthetisierten Verbindungen von ihrer festen Phase abgespaltet, wobei der verbrauchte feste Träger vollständig, bis zur Flüchtigkeit, durch Produkte abgebaut wird, was eine deutliche Vereinfachung des gesamten Syntheseverfahrens einbringt.
Die vorliegende Erfindung nimmt als eines von vielen Beispielen die Verwendung von Festphasen-Polymeren in Aussicht, wie etwa von Poly(benzylether), der in der Formel A gezeigt ist, wobei n eins bis größer als 100 000 ist und X das Reaktionsprodukt ist, das durch eine Ester-, Amid-, Urethan-, Harnstoff-, Amin- oder andere Bindung an den Träger gebunden ist, oder von einem ähnlichen Polymer, das ein Vernetzungsmittel wie etwa 1,3,5-Trihydroxytoluol enthält.
Formel A
Bei einer Spaltung mit einer starken Säure oder einer Auswahl von Reduktionsmitteln, wie zum Beispiel Wasserstoff, in Gegenwart von Palladiumazetat oder eines Palladiummetall-Hydrierkatalysators wird nicht nur die Bindung zwischen dem Polymer und der angestrebten Verbindung X aufgespaltet, sondern es werden auch die Bindungen aufgespaltet, welche das Festphasen-Polymer an sich bilden. Die Verwendung von Fluorwasserstoff als Spaltmittel schafft die flüchtige Verbindung, die in der Formel B dargestellt ist, als Primärprodukt.
Formel B
Der vorgesehene Poly(benzylether) kann durch wohlbekannte Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise werden 1,4-Benzoldimethanol und eine geeignete starke Base wie etwa t-Butoxid mit einem Dihalo-Toluol wie etwa a,a'-Dichlor-p-Xylol in einem geeigneten Lösungsmittel wie etwa Ethylenglykoldietyl- oder -dimethylether zur Reaktion gebracht. Der Vernetzer ist mit null bis ungefähr 10 Gew.-%, stärker bevorzugt mit ungefähr 1 bis ungefähr 5 Gew.-%, vorhanden. Nach der Polymerisation können Halomethylgruppen zu den Phenylringen hinzugefügt werden, um weitere Stellen zum Binden des Reaktionsprodukts zu schaffen. Beispielsweise können Chlormethylgruppen hinzugefügt werden, indem durch eine Reaktion des Polymers mit Chlormethylmethylether in Gegenwart von Aluminiumchlorid oder eines ähnlichen Friedel-Crafts-Katalysators chlormethyliert wird.
Wie zuvor erwähnt worden ist, wird bevorzugt, das Reaktionsprodukt in einem einzigen Schritt von dem festen Träger abzuspalten. Wo beispielsweise Fluorwasserstoff zusammen mit einem porösen Kieselerde-Träger bei einer Peptidsynthese verwendet wird, kann das Hinzufügen von HF zu einem an den Träger gebundenen Peptid mit geschützter Seitenkette ein Entfernen der Schutzgruppen, Abspalten des Peptids von dem Träger und Umwandeln des verbrauchten Kieselerde-Trägers in die flüchtige Verbindung SiF₄ in einem einzigen Schritt bewirken, obwohl mehrere verschiedene Reaktionen in diesem einen Schritt ablaufen. Es wird außerdem in Aussicht genommen, dass das Entfernen der Seitenketten-Schutzgruppen gesondert durchgeführt wird, wobei für diese Reaktion Trifluoressigsäure verwendet wird. Außerdem wird in Aussicht genommen, das Abspalten des Reaktionsprodukts von dem Träger als einen gesonderten Schritt durchzuführen, wie zum Beispiel durch die Verwendung von Triethylamin und Methanol, worauf die Reaktion mit HF folgt, um das Spaltprodukt-Peptid und SiF₄, das dann durch Verflüchtigung entfernt wird, zu bilden.
Das abgespaltene Produkt wird vorzugsweise direkt gewonnen, jedoch vor einer weiteren Verwendung gewöhnlich chromatographisch gereinigt. Jedoch wird auch in Aussicht genommen, dass das abgespaltene Produkt weitere Reaktionen eingehen kann, ohne aufbereitet oder weiter gereinigt zu werden.
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um die vorliegende Erfindung weiter zu veranschaulichen, nicht um sie zu beschränken.
Beispiel 1: Stabilität eines Peptids in Gegenwart von Siliziumtetrafluorid
Das Peptid J21-7 (H-NSSSSQFQIHGPR-OH; SEQ ID NO: 1) wurde auf Merrifield-Harz mit herkömmlicher Peptid-Chemie (BOC-Chemie) durch gleichzeitige Synthese mehrerer Peptide (Simultaneous Multiple Peptide Synthesis, Houghten, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 5131–5135) synthetisiert. Dann wurden die Seitenketten-Schutzgruppen des Peptids entfernt, und gleichzeitig wurde das Peptid mit Fluorwasserstoff in Gegenwart und Abwesenheit von Glaskügelchen von dem Harz abgespaltet, um die Unschädlichkeit von Siliziumtetrafluorid für das Peptid zu verifizieren. Es wurden zwei verschiedene Sorten von im Handel erhältlichen gepfropften Glaskügelchen für den Versuch benutzt (Aminopropyl-Glaskügelchen einer Maschenzahl von 80–120, 77 μmol/g und Aminopropyl-Glaskügelchen einer Maschenzahl von 200–400, 152 μmol/g Sigma Chemical Co.). Die Ergebnisse sind nachstehend in der Tabelle 1 verzeichnet.
Tabelle 1
Wie aus der obigen Tabelle ersichtlich ist, wurde kein wägbarer Rückstand zurückgewonnen, wenn nur Glaskügelchen mit HF behandelt wurden (Tabelle 1: Beutel Nr. M2 und M5). Der Masseverlust der Beutel während der Spaltung entsprach genau der Masse der Glaskügelchen in den Beuteln zuzüglich der Masse der gegen HF unbeständigen Schutzgruppen. Mittels Massenspektroskopie (MS) und Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPCL) wurde keine Veränderung des Peptids festgestellt, wenn in Gegenwart von Glaskügelchen (Beutel M9 im Vergleich mit den Beuteln M4 und M7) gespaltet wurde.
Beispiel 2: Charakterisierung eines an Glaskügelchen synthetisierten Peptids
Das Peptid H-YGGFLR-NH₂ (SEQ ID NO: 2) wurde an zwei verschiedenen Sorten von aminopropyl-gepfropften Glaskügelchen [Aminopropyl-Glaskügelchen, Maschenweite 80–120, 77 μmol/g (A) und Aminopropyl-Glaskügelchen, Maschenweite 200–400, 152 μmol/g (B)] mit herkömmlicher Peptid-Chemie (BOC-Chemie wie im Beispiel 2) in einem kleinen Reaktionsgefäß, in das am Boden ein Frittefilter eingesetzt war, synthetisiert.
Dann wurden mit flüssigem Fluorwasserstoff die Seitenketten-Schutzgruppen des Peptids entfernt, und gleichzeitig wurde das Peptid von dem Träger abgespaltet, begleitet von der Bildung von SiF₄. Die Ergebnisse sind nachstehend in der Tabelle 2 verzeichnet. Tabelle 2
-CH2-CH2-CH2-SiF₃: = 127,1
-CH2-CH2-CH2-Si(OH)₃: = 121,1
HPLC-Spuren des unbehandelten Materials zeigten das Vorhandensein des gleichen Hauptpeaks bei beiden Chargen. Die Massenspektralanalyse des Hauptpeaks, der in der HPLC-Spur beobachtet wurde, lässt auf eine relative Molekülmasse von 831,85 schließen. Die Differenz von 120,85 Einheiten im Vergleich zu der erwarteten relativen Molekülmasse von 711 untermauert die Struktur H-YGGFLR-NH-CH₂-CH₂-CH₂-Si(OH)₃ für die letzte Verbindung, da sie angibt, dass eine Hydrolyse der Trifluorsilylgruppe stattgefunden hatte, obwohl auch terminales -Si(OH)₂F oder -Si(OH)F₂ vorliegen könnte.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Festphasen-Synthesenverfahren, wobei wenigstens ein Reagens an eine Festphasen-Verbindung gekuppelt ist, eine Vielzahl von Reaktionen nach dem Festphasen-gekuppelten Reagens ausgeführt wird, um ein Reaktionsprodukt zu bilden und das Reaktionsprodukt aus dem Festphasen-Träger abgespalten wird, um ein gespaltenes Produkt zu bilden, dadurch gekennzeichnet, dass der Festphasen-Träger von dem gespaltenen Produkt durch Verflüchtigung der so gebildeten flüchtigen Verbindung getrennt wird.
Festphasen-Syntheseverfahren nach Anspruch 1, wobei der genannte Festphasen-Träger Kieselerde ist.
Festphasen-Syntheseverfahren nach Anspruch 1, wobei der genannte Festphasen-Träger ein Poly(Benzylether) ist.
Festphasen-Syntheseverfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte, wenigstens eine an den genannten Festphasen-Träger gekuppelte Reagens eine Aminosäure ist.
Festphasen-Syntheseverfahren nach Anspruch 4, wobei das genannte gespaltene Produkt ein Peptid oder Glykoprotein ist.
Festphasen-Syntheseverfahren nach Anspruch 1, wobei das genannte, wenigstens eine an den genannten Festphasen-Träger gekuppelte Reagens ein Saccharid oder Heterozyklus ist.
Festphasen-Syntheseverfahren nach Anspruch 6, wobei das genannte gespaltene Produkt ein Oligosaccharid, bzw. ein Heterozyklus ist.
Festphasen-Syntheseverfahren nach Anspruch 1, wobei das Reaktionsprodukt von dem genannten Festphasen-Träger abgespalten wird und der Festphasen-Träger eine Reaktion eingeht, um in einem einzigen Schritt eine flüchtige Verbindung zu bilden.
Festphasen-Syntheseverfahren gemäß Anspruch 8, wobei der genannte einzige Schritt durch die Reaktion des Festphasen-gekuppelten Reaktionsprodukts mit Fluorwasserstoff ausgeführt ist.
Festphasen-Syntheseverfahren gemäß Anspruch 1, enthaltend den zusätzlichen Schritt der Rückgewinnung des gespaltenen Produkts.
Festphasen-Syntheseverfahren gemäß Anspruch 2, wobei das genannte wenigstens eine an den genannten Festphasen-Kieselerde-Träger gekuppelte Reagens durch eine Bindungsgruppe an den genannten Träger gekuppelt ist und der genannte Festphasen-Kieselerde-Träger eine Reaktion mit Fluorwasserstoff eingeht, um eine flüchtige Verbindung zu bilden.
Festphasen-Syntheseverfahren gemäß Anspruch 11, wobei die genannte Bindungsgruppe spaltbar oder nicht spaltbar ist.
Festphasen-Syntheseverfahren gemäß Anspruch 12, wobei die genannte spaltbare Bindungsgruppe nach der genannten Reaktion mit Fluorwasserstoff eine flüchtige Verbindung bildet.
Festphasen-Syntheseverfahren gemäß Anspruch 11, wobei: die genannte Bindungsgruppe spaltbar ist und der genannte Kieselerde-Festphasen-Träger aus reagierten α-Chlorbenzyl C₃-C₅-Alkyl-aufpolymerisierten Glaskügelchen besteht.
Festphasen-Syntheseverfahren gemäß Anspruch 3, wobei der genannte Festphasen-Träger in Formel A dargestellt ist, in welcher n für eins bis größer als 100.000 und X für das Reaktionsprodukt
Formel A steht.