DE68914843T2

DE68914843T2 - Peptid-synthese und fester träger zur verwendung dabei.

Info

Publication number: DE68914843T2
Application number: DE68914843T
Authority: DE
Inventors: Kristoffer Almdal; Rolf Berg; Arne Holm; Robert Merrifield; Walther PEDERSEN; James Tam
Original assignee: Riso National Laboratory
Current assignee: Riso National Laboratory
Priority date: 1988-09-01
Filing date: 1989-08-31
Publication date: 1994-11-10
Anticipated expiration: 2009-09-01
Also published as: WO1990002749A1; AU4225889A; EP0433345B1; FI911029A0; DE68914843D1; NO910812D0; FI102833B; EP0433345A1; JP2807522B2; NO180198C; NO180198B; NO910812L; FI102833B1; CA1339987C; JPH04501709A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und einen festen Träger fuhr die Festphasensynthese von Peptiden oder Proteinen in hoher Ausbeute und in hoher Reinheit. Das Verfahren ist sowohl für die Synthese eines einzelnen Peptides oder Proteins wie auch für die parallele und im wesentlichen gleichzeitige Synthese einer Mehrzahl davon gut geeignet. Insbesondere betrifft die Erfinjung ein Verfahren, welches ein Polymersubstrat, das mit Polystyrolketten gepfropft ist, als festen Träger verwendet, wobei die Polystyrolketten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen können, welche unter den vorherrschenden Reaktionsbedingungen nicht reagieren, und wobei sie ein geschätztes Molekulargewicht ohne Einschluss gegebenenfalls vorhandener Substituenten von mindestens 200'000 aufweisen. Die Erfindung verwendet konventionelle chemische Methodik und ist leicht an die Synthese sowohl in analytischem (Mikrogramm) wie in präprativem (Milligramm oder mehr) Massstab anpassbar. Ferner kann die Erfindung sowohl für ansatzweisen Betrieb wie für kontinuierliche Fliessverfahren angepasst werden, die von Hand, halbautomatisch oder ganzautomatisch funktionieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die gegenwärtigen Festphasenverfahren für die Synthese von Peptiden oder Proteinen beruhen weitgehend auf der urpsürnglichen, von Merrifield entwickelten Methodik unter Verwendung eines funktionalisierten, vernetzten Styrol/Divinylbenzol-Copolymers, welches vernetztes Copolymer durch Polymerisation von Styrolmonomer, welchem einige Prozent (typischerweise etwa 2 %) Divinylbenzol zugesetzt worden waren, gebildet wurde. Dieses Copolymer ist im allgemeinen in Form von Perlen oder Partikeln, oft mit einer vorherrschenden Partikelgrösse von 20 - 80 µm erhältlich. Die von Merrifield urpsrünglich bevorzugte Funktonalisierung [siehe z.B. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)], war eine Funktionalisierung des aromatischen Ringes des Copolymers mit Chlormethylgruppen, die über die Reaktion des festen Copolymers mit SnCl&sub4;/ Chlormethylmethyläther eingeführt wurden, obwohl eine Anzahl anderer Funktionalitäten, einschliesslich Aminomethyl, α-Aminobenzyl und α-Amino-4-methylbenzyl, später verwendet wurden. Ungeachtet ihrer Natur ist der Zweck der Funktionalität üblicherweise eine Verankerungsbindung zwischen dem Copolymer-Festträger und dem E- Ende der ersten Aminosäure zu bilden, von welcher eine Kupplung an den festen Träger erwünscht ist. Neuere Verfeinerungen der Merrifield-Methodik umfassten die weitere Einführung einer bifunktionellen "Spacer"- oder " Handle"-Gruppe, deren Reaktionsfähigkeit unter anderem derart beschaffen ist, dass sie den gewünschten Erfordernissen in bezug auf die Kupplung der ersten Aminosäure an den festen Träger und/oder auf die Leichtigkeit, mit welcher die fertige, synthetisierte Peptid- oder Proteinkette vom festen Träger abgespalten wird, entspricht. Beispiele solcher "Spacer"-Gruppen schliessen die Phenylacetamidomethyl-(Pam)- und die p-Alkoxybenzylestersysteme ein. Eine kürzliche Uebersicht über die Entwicklung der Festphasen-Peptidsynthese-Methodik seit ihrer Einftihrung durch Merrified wurde von Barany et al. [Int. I. Peptide Protein Res. 30, 705-739 (987)] gegeben.
GB-A- 1.234.982 offenbart gepfropfte Polystyrolketten von viel kürzerer Länge als sie gemäss der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Kürzliche Vorstösse in der Biotechnologie insbesondere auf dem Gebiet der rekombinanten DNA, haben zu einer einzigartigen Situation geführt: die Verfügbarkeit und rasche Ansammlung vieler neuer Proteinsequenzen mit undefinierter oder unbekannter Funktion und/oder unbekannter biologischer Aktivität. Detaillierte Strukturanalyse mittels gerichteter Mutagenese oder ähnlicher Molekulartechnik erwies sich als nützlicher Zugang bezüglich der Rollen der Aminosäurereste an aktiven Stellen von Proteinen.
Spezifische Informationen über biologisch aktive funktionelle Untereinheiten, welche etwa 5 - 40 Aminosäurereste enthalten, werden jedoch vorzugsweise durch chemische Synthese erhalten. Die gegenwärtige Festphasen-Technologie genügt, um solche Peptide zuverlässig und in hoher Reinheit zu ergeben, doch erzeugt die konventionelle Methode der Festphasen-Peptidsynthese über einen "linearen" Annäherungsmodus nur ein Peptid pro Synthese.
Ein Verfahren, welches einen "gleichzeitigen" oder "parallelen" Annäherungsmodus für die Synthese von Peptiden verwendet, ist daher wünschenswert, durch welche die Erzeugung einer grossen Anzahl Peptide erleichtert würde, welche z.B. verwendet werden können, um die funktionellen Proteineinheiten zu definieren und zu kartieren. Ein grundlegendes Merkmal der Festphasentechnik der Petptidsynthese besteht darin, dass in jeder Verlängerung der Peptidkette mit einer weiteren Aminosäure alle Behandlungsstufen eine Wiederholung des vorgehenden Zyklus sind mit der möglichen Ausnahme der Aminosäurekupplungsstufe selbst, in welcher eine weitere Aminosäure, welche mit der im vorgehenden Zyklus gekuppelten identisch sein kann oder nicht, an die Peptidkette gekuppelt wird. So kann eine parallele, im wesentlichen gleichzeitige Synthese von mehr als einem Peptid erzielt werden, indem die sich wiederholenden Stufen, wie Abspaltung der Schutzgruppen, Neutralisieren und Waschen, welche für die parallelen Synthesen gemein sind, parallel durchgefuhrt werden. Die grösste technische Schwierigkeit liegt in der Erreichung der "Abschottung" von jeder Aminosäure-Kupplungsstufe, so dass keine Verunreinigung "über Kreuz" auftritt.
Kürzlich wurden zwei verschiedene Verfahren für die im wesentlichen gleichzeitige Synthese einer Anzahl von Peptiden vorgeschlagen.
Das erste dieser Verfahren [Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002 (1984) und 82, 178-82 (1985)] war für das rasche Screenen von Peptidepitopen via ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) in 96 Microliter-Vertiefungen vorgesehen. Es verwendet mit Acrylsäure gepfropfte Polyäthylenstäbe und 96 Microliter-Vertiefungen, um wachsende Peptidketten zu immonobilisieren und die "abgeschottete" Synthese durchzuführen. Obwohl dieses Verfahren hochwirksam ist, ist es in präparativem Massstab nicht anwendbar, d.h. für die Herstellung in Milligramm-Mengen. Das zweite Verfahren [Houghten, Proc. Natl. Acad- Sci. USA, 82, 5131-35 (1985)] verwendet einen "Teebeutel", welcher die traditionell verwendeten Polymerperlen enthält, um die Synthese "abzuschotten", wobei Anteile von Peptidylharz perlen in versiegelten Beutein aus feinmaschigem Polypropylennetz getrennt gehalten werden. Das letztere Verfahren ist anwendbar für die Herstellung von Milligramm- Mengen.
Die offensichtlichen Vorteile eines Verfahrens, welches die parallele und im wesentlichen gleichzeitige Synthese einer Vielzahl von Peptiden erlaubt, sind die Zeitersparnis für den Durchführenden und das Ueberflüssigsein der sich wiederholenden Arbeit, welche bei der Durchführung der Synthese Von jedem Peptid einzeln auftritt.

KURZE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung umfasst alle vorteilhaften Aspekte der beiden oben genannten Verfahren und bietet ausserdem die bereits erwähnten Vorteile, das oder die gewünschte(n) Peptid(e) oder Protein(e) in hoher Reinheit zu ergeben und gleich gut geeignet zu sein für Synthesen im analytischen wie im präparativen Massstab. Die Erfindung wird Studien über Struktur-Aktivitätsabhängigkeiten, Untersuchungen wie das Kartieren von antigenen Epitopen, die Bestimmung von Einzelheiten von Hormon-Rezeptor-Wechselwirkungen und die Auswhal pharmakologisch aktiver Peptidyl-Arzneimittel begünstigen und ebenso von grossem Wert sein für Untersuchungen über die molekulare Organisation funktioneller Untereinheiten von Proteinen im allgemeinen.
Die Erfindung beruht auf der Bereitstellung und Verwendung eines festen Trägers, welcher ein Polymersubstrat umfasst, an welches lange und im wesentlichen unvernetzte Polystyrolketten gepfropft sind, welche unter diesen Bedingungen und voraussichtlich infolge des leichten sterischen Zungangs zu ihnen als besonders wirksame Festphasenträger für die zu synthetisierenden Peptide funktionieren.
Die Erfindung nützt die Unlöslichkeit unvernetzter Polyolefine, z.B. Polyäthylen, in allen organischen Lösungsmitteln bei Raumtemperatur. Da das gepfropfte Polymer noch immer ein thermoplastisches Material und bei erhöhten Temperaturen löslich ist, ist auch eine Umformung möglich.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1. Schutzschema für die Festphasen-Kombination von [Asp&sup7;&sup6;]-hPTH-Fragment (70-84) auf 443 Gewichtsprozent polystyrolgepfropftem Polyäthylen.
Fig. 2. Analytisches HPLC-Chromatogramm von (A) rohem H-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH, (B) rohem H-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH und
(C) rohem H-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr- Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH auf µBONDAPAK C&sub1;&sub8; (300 x 3,9 mm. 10 µm). Puffer A : H&sub2;O/0,095% CF&sub3;COOH; Puffer B : 90 % Acetonitril/ 10% H&sub2;O/0,072% CF&sub3;COOH Fliessgeschwindigkeit 1,3 ml/Min.
Fig. 3. Die Aminosäuresquenzen von Melittin(7-21)-Analogen.
Fig. 4. Analytisches HPLC-Chromatogramm von rohem Melittin-(7-21) und Analogen nach nieder/hoch-HF-Spaltung (vor Lyophilisierung). Chromatogramm 1 ist dasjenige für rohes Melittin-(7-21), d.h. Peptid 1, Chromatogramm 2 ist dasjenige für rohes Peptid 2 usw. Puffer A : 5 % CH&sub3; / 95 % H&sub2;O / 0,0445 % TFA; Puffer B : 60 % CH&sub3;CN / 40 % H&sub2;O / 0,390 % TFA; linearer Gradient : 5-95 % von B in 30 Min.; Fliessgeschwindigkeit : 1,5 ml / Min.; Säule : Vydac C&sub1;&sub8; (0,46 x 25 cm).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren für die Synthese eines Peptides oder Proteins gegeben, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst
A) Bereitstellen eines Polymersubstrates, das mit Polystyrolketten gepfropft ist, wobei die Polystyrolketten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen, die unter den in der Synthese vorherrschenden Bedingungen nicht reagieren, wobei das geschätzte Molekulargewicht im wesentlichen aller auf das Polymer gepfopften Polystyrolketten ohne Einschluss gegebenenfalls vorhandener Substituenten mindestens 200'000 ist, wobei mindestens ein Teil der Polystyrolketten des mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrates mit einer chemischen Funktionalität funktionalisiert ist, welche die Bildung einer verankerten Bindung zwischen dem Polystyrolbestandteil und einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure erleichtert,
B) Kuppeln einer N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxlende derivatisierten Aminosäure an den funktionalisierten Polystyrolbestandteil, wobei die Funktionalität und die N-geschützte und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierte Aminosäure so aufeinander eingestellt sind, dass die gebildete verankernde Bindung anschliessend im wesentlichen ohne Abbau der zu synthetisierenden Peptid- oder Proteinkette gespalten werden kann,
C) Entfernen der N-Schutzgruppe von einer N-geschützten Amino- oder substituierten Aminogruppe der gekuppelten und N-geschützten Aminosäure, so dass die Reaktion der Amino- oder substituierten Aminogruppe der gekuppelten Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder einer aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren Aminosäure erleichtert ist,
D) Umsetzen der Amino- oder substituierten Aminogruppe der zuletzt gekuppelten Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder einer aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure, um eine Peptidbindung zwischen den beiden Aminosäurebestandteilen zu bilden,
E) gegebenenfalls Entfernen der N-Schutzgruppe von einer N-geschützten Amino- oder substituierten Aminogruppe der zuletzt gekuppelten N-geschützten Aminosäure, so dass die Reaktion der Amino- oder substituierten Aminogruppe der letzteren Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure erleichtert ist,
F) in den Fällen, in denen Schritt E) ausgeführt worden ist, Wiederholen der Schritte D) und E) sooft dies gewünscht ist,
G) gegebenenfalls Entfernen von einigen oder allen Schutzgruppen, die möglicherweise an den Aminosäurebestandteilen der synthetisierten Peptid- oder Proteinkette verblieben sind,
H) gegebenenfalls Spalten der Bindung, welche die synthetisierte Peptid- oder Proteinkette mit dem funktionlisierten Polystyrolbestandteil verankert, und
I) gegebenenfalls Entfernen jeder weiteren unerwünschten Gruppe von der synthetisierten Peptid- oder Proteinkette.
Der Ausdruck "Substrat", wie er im vorliegenden Zusammenhang verwendet wird, bedeutet jedes geeignete Polymer, welches wie beschrieben gepfropft werden kann und welches im wesentlichen unlöslich in und inert gegen die in der Synthese verwendeten Medien ist. Geeignete Polymere können zum Beispiel ausgewählt werden aus Polyamiden, wie Nylon, Polyimiden, Poly(para-xylylenen), Poly (halogenfluoralkenen), wie Poly(tetrafluoräthylen) oder Poly(chlortrifluoräthylen), Phenol-formaldehydpolymeren und Polyolefinen, wie Polypropylen und Polyäthylen. Das Polymersubstrat kann zu jeder geeigneten Form, z.B. einer Folie, eines Films, einer Perle, eines Pellets, einer Scheibe, eines Rohres, eines Stabes oder eines Netzes verarbeitet werden. In bevorzugten Ausführungsformen der Verfahren für die Peptid- oder Proteinsynthese gemäss der vorliegenden Erfindung ist das Polymersubstrat Polyäthylen von niederer Dichte in Form von Folien oder Filmen, doch zeigen Versuche (siehe unten) dass Polyäthylen hoher Dichte ebenfalls geeignet ist.
Die an das Polymersubstrat gepfropften Polystyrolketten können Ketten von Polystyrol selbst oder von Polystyrol, das bis zu einem gewissen Ausmass mit Substituenten, die unter der in der Synthese vorherrschenden Bedingungen nicht reaktionsfähig sind, substituiert wurden, sein. Solche Substituenten können mit Vorteil zum Beispiel Alkylsubstituenten, wie Methyl, Aethyl, Propyl oder Butyl, Alkoxysubstituenten, wie Methoxy, Aethoxy, Propoxy und Butoxy, oder Aryloxysubstituenten, wie Phenoxy, sein. Die Substitution erfolgt vorzugsweise in Form einer Substitution in den aromatischen Ringen durch einen oder mehrere Substituenten, z.B. einen oder mehrere der oben genannten Substituenten, doch kann auch die Substitution an nicht-aromatischen Kohlenstoffatomen von Vinylgruppenursprung in Betracht gezogen werden. In bevorzugten Ausführungsformen der Verfahren für die Synthese von Peptid oder Protein gemäss der Erfindung, bei welchen das Polymersubstrat Polyäthylen ist, sind die gepfropften Polystyrolketten Ketten von unsubstituiertem Polystyrol.
Es wird als besonders vorteilhaft erachtet, dass die an das Polymersubstrat gepfropften Polystyrolketten ein Molekulargewicht ohne Einschluss der gegebenenfalls an den Polystyrolketten vorhandenen Substituenten von mindestens 200'000 aufweisen. In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können Polystyrolketten, welche diese Bedingung erfüllen, bequem gebildet werden durch eine im wesentlichen radikal-initiierten Reaktion zwischen dem Polymersubstrat und gegebenenfalls substituiertem Styrolmonomer, das in einer Lösung des Monomers in einem organischen Lösungsmittel zugegen ist. Versuche haben gezeigt (siehe unten), dass wenn eine Polyäthylenfolie oder ein Polyäthylenfilm mit Polystyrolketten unter Bedingungen, bei welchen die Polyäthylenfolie oder der Polyäthylenfilm in Lösungen von verschiedenen Konzentrationen von Styrolmonomer in einem Lösungsmittel, wie Methanol, eingetaucht ist, gepfropft wird, wobei die radikal-initiierte Reaktion durch γ-Strahlung erzielt wird, nicht nur eine Pfropfreaktion auftritt, sondern nicht-gepfropfte (d.h. freie) Polystyrolketten gebildet werden. Während es gegenwärtig keinen klaren, direkten Weg zur genauen Bestimmung des Molekulargewichtes der gepfropften Polystyrolketten selbst gibt, kann das Molekulargewicht der gebildeten nicht-gepfropften Polystyrolketten leicht bestimmt werden, z.B. mit der sogenannten "Grössen-Exklusions-Chromatographie". Es wurde gefunden, dass wenn reines Styrolmonomer verwendet wird, d.h. kein Methanol zugegen ist, das Molekulargewicht der nicht. gepfropften Polystyrolketten (im folgenden als "Homopolymer" bezeichnet), die in der Folie eingeschlossen sind (und aus der Folie mit Dichlormethan extrahiert werden) , welche unter einem bestimmten Satz von γ-Strahlungsbedingungen gebildet werden, vorherrschend etwa 180'000 beträgt, und dass das vorherrschende Molekulargesicht des Homopolymers mit zunehmendem Methanolgehalt der Styrolmonomer/Methanol-Lösung ansteigt; beispielsweose beträgt das vorherrschende Molekulargewicht (Mpeak) in 70:30 (Vol/Vol) Methanol/Styrol etwa 1'000'000.
Die mit polystyrolgepfropfter Polyäthylenfolie, welche in verschiedenem Ausmass gepfropft wurde, erhaltenen Resultate geben starke Hinweise, dass das Molekulargewicht des in der Folie eingeschlossenen Homopolymers und dasjenige der gepfropften Polystyrolketten ganz gut übereinstimmen, wie ausführlicher im folgenden erklärt wird:
Die Grössen-Exklusions-Chromatographie ergibt eine Abhängigkeit zwischen Spezies-Molekulargewicht und Retentionsvolumen, die sogenannte "Kalibrierkurve". Das Molekulargewicht einer gegebenen Fraktion von z.B. Polystyrolhomopolymer mit einem besonderen Retentjonsvolumen wird bestimmt durch Vergleich mit Retentionsvolumina für Polystyrolstandard von bekantem Molekulargewicht. Da jedoch kein Standard für polystyrolgepfropftes Polyäthylen von bekanntem Molekulargewicht vorhanden ist, ist das Beste, das getan werden kann, mit den Retentionsvolumina von Polystyrolstandards unter denselben Lösungsbedingungen zu vergleichen.
Die gepfropfte Folie, das Homopolymer und die Polystyrolstandards können gelöst werden, z.B. in heissem Xylol, und in mehreren solchen Versuchen wurde gefunden, dass das Molekulargewicht der grössten Fraktion des Homopolymers etwa 1'000'000 beträgt. Der Grund des oben beschriebenen Vergleichs mit Retentionsvolumina von Polystyrolstandard gefundene Mpeak-Werte für die polystyrolgepfropfte Polyäthylenfolie betrug etwa 3'000'000 und mehr [es ksnn in ßetracht gezogen werden, dass ein gewisser Anteil der einzelnen Polyäthylenketten mit mehr als einem Polystyrolbestandteil gekuppelt sein kann, und der auf die obige Weise bestimmte Mpeak-Wert für polystyrolgepfropfte Polyäthylen kann folglich ähnlich oder höher sein als derjenige für das entsprechende eingeschlossene Polystyrol-Homopolymer].
Ein weiterer Beweis für die Gültigkeit des oben beschriebenen Verfahrens für die Schätzung des Mulekulargewichtes kann auch von den oben erwähnten Versuchen wie folgt abgeleitet werden:
Die Menge, n&sub1;, einer bestimmten Fraktion, i, vom Molekulragewicht Mi ist proportional zur Höhe der Verteilkurve am Retentionsvolumen, welches Mi entspricht. Das sogenannte "Gewichtsdurchschnitts-Molekulargwicht" Mw ergibt sich dann aus:
Mw - Σ ni x Mi² / Σ ni x Mi
während das sogenannte "Nummerndurchschnitts-Molekular gewicht", Mn sich ergibt aus:
Mn - Σ ni x Mi / Σ ni
Die allgemein verbreitete Theorie über radikalinitiierte Polymerisation sagt ein Mw/Mn-Verhätlnis (die "Polydispersität") von 2,0 voraus. Ein Wert von etwa 2 wurde für das Homopolymer gefunden, und der für das polystyrolgepfropfte Polyäthylen gefundene Wert betrug auch etwa 2, was als Hinweis betrachtet werden kann, dass die an das Polyäthylensubstrat gepfropften Polystyrolketten im wesentlichen in derselben Weise wuchsen wie das Homopolymer, wodurch dem oben beschriebenen Molekulargewichts-Schätzungsverfahren weitere Glaubwürdigkeit verliehen wird. Die geschätzten Molekulargewichte, auf welche in der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen bezug genommen wird, würden in dieser Weise geschätzt.
Es wird somit angenommen, dass das Molekulragewicht von eingeschlossenem Homopolymer, das unter einem gegebenen Satz von Bedingungen (Lösungsmittel, Styrolkonzentration, Temperatur, γ-Strahlungsintensität und Dauer der %-Bestrahlung) gebildet wurde, das Molekulargewicht der unter demselben Satz von Bedingungen gebildeten gepfropften Polystyrolketten gut wiederspiegelt, so dass das für das Homopolymer bestimmte Molekulargewicht als Schätzung des Molekulargewichtes der gepfropften Polystyrolketten genommen wird.
Es wird ferner angenommen, dass die Dichte der Pfropfstellen auf der Oberfläche eines Polymersubstrates, d.h. die Anzahl Befestigungspunkte von Polystyrolketten pro Oberflächeneinheit, wie auch das Ausmass der Vernetzung der gepfropften Polystyrolketten durch die Bedingungen, unter welchen das Pfropfen erfolgt, stark beeinflusst wird, insbesondere durch die Natur eines im Pfropfverfahren verwendeten Lösungsmittels. Hydroxylgruppen enthaltende organische Lösungsmittel, insbesondere Alkohole, wie Methanol, sind verhältnismässig hydrophyl und sind daher voraussichtlich unter dem schlechteren Lösungsmittel, welches zur Auflösung einer verhältnismässig hydrophoben Substanz, wie Styrolmonomer gewählt werden können. Der Solvatisierungsgrad des Monomers durch ein solches Lösungsmittel wird daher als verhältnismässig niedrig erwartet im Vergleich mit dem Solvatisierungsgrad, welcher mit einem hydrophoberen organischen Lösungsmittel zu erwarten ist, z.B. einem halogenierten aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie Dichlormethan (Dichlormethan ist ein bevorzugtes Reaktionslösungsmittel in der Festphasen-Peptidsynthesen-Methodik, sowohl im allgemeinen wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung). Es wird angenommen, dass schlechtes Quellen oder Solvatisieren der gepfropften Polystyrolketten während des Pfropfverfahrens in einem Lösungsmittel wie Methanol die Mobilität der wachsenden Polystyrolketten niedrig hält, wodurch eine Verzögerung der diffusionsgesteuerten Kettenbeendigungsverfahren hervorgerufen wird und damit das Wachstum von besonders langen Polystyrolketten erleichtert wird.
Ein attraktives Merkmal des hohen Molekulargewichtes der gepfropften Polystyrolketten im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie, wenn sie funktionsalisiert sind, sich wahrscheinlich in bezug auf ihre Reaktionsfähigkeit gegenüber gelösten Reagentien weitgehend so benehmen, wie wenn sie nichtgepfropfte (d.h. freie) funktionalisierte Polystyrolketten in homogener Lösung wären; die Leichtigkeit, mit welcher funktionisierte, gepfropfte Polystyrolketten, die gemäss der vorliegenden Erfindung gebildet wurden, mit gelösten Reagenzien, einschliesslich geschützten und gegebenenfalls derivatisierten Aminosäuren, reagieren können, kann daher als optimal betrachtet werden.
Die anscheinend praktisch gänzliche Abwesenheit von Vernetzung zwischen den an das Polyolefin gepfropften Polystyrolketten erleichteret starke Quellung oder Solvatisierung der Ketten durch ein Chlorkohlenwasser-Stoff-Lösungsmittel (in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Dichlormethan), wie es in Festphasen-Peptidsynthesen allgemein bekannt ist. Wie bereits erwähnt, ist in konventionellen Festphasen-Peptidsyntheseverfahren unter Anwendung der Methodik vom "Merrifield-Typus" der verwendete feste Träger üblicherweise ein funktionalisiertes, vernetztes Styrol/Divinylbenzol-Copolymer, wobei das vernetzte Copolymer durch Polymerisation von Styrolmonomer, zu welchem einige Prozent (typischerweise etwa 2 %) Divinylbenzol zugesetzt worden waren, gebildet worden. Diese Vernetzung reduziert den Grad an Quellung oder Solvatisation der funktionalisierten Copolymermatrix im Verhältnis zu demjenigen, der für funktionalisierte, geopfropfte Polystyrolketten, die nach der vorliegenden Erfindung gebildet wurden, vorherrschen, und reduziert dadurch entsprechend die Reaktionsfähigkeit der erstgenannten Matrix.
Gemäss der Erfindung wird bevorzugt, dass das geschätzte Molekulargewicht von im wesentlichen allen, an das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluss gegebenenfalls vorhandener Substituenten im Bereich von 300'000 - 1'600'000, insbesondere 400'000 - 1'400'000 und bevorzugt 600'000 - 1'200'000 liegt. Das gegenwärtig bevorzugte geschätzte Molekulargewicht von im wesentlichen allen der Polystyrolketten beträgt 700'000 - 1'000'000. Es wird angenommen, dass die höheren geschätzten Molekulargewichte von 400'000 und mehr besonders vorteilhaft sind, doch scheint andererseits das Pfropfen von Polystyrolketten mit den höchsten geschätzten Molekulargewichten von etwa 1'000'000 und höher einen schädlichen Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des Polymersubstrates auszuüben, insbesondere, wenn das Substrat in der Form einer Folie oder eines Films vorliegt, wie dies oft bevorzugt wird.
Der Grad an Polstyrolkettenpfropfung des Polymersubstrates, das heisst das Gleichgewichtsverhältnis von Polystyrol zum Polymersubstrat, hängt natürlich von der Länge der Polystyrolketten, der Dichte der Pfropfstellen und den Dimensionen des Polymersubstrates ab und kann in weiten Grenzen variieren. So kann, im Fall von z.B. einer Folie oder einem Film von Polymersubstrat mit einer Dicke im Bereich von 25 bis 100 µm, der Grad an Polystyrolkettenpfropfen z.B. von etwa 5 bis etwa 800 Gewichtsprozent betragen, wie von etwa 10 % bis etwa 700 %. Sowohl sehr niedere wie sehr hohe Grade an Polystyrolpfropfen, wie auch mittlere Pfropfengrade sind wertvoll im Zusammenhang mit bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
So sichert für analytische Zwecke, bei welchen es üblicherweise wünschenswert ist, Peptidsequenzen von Proteinen in kleinem Massstab zu synthetisieren, typischerweise in Mikrogramm-Mengen, die Bedingung für zum Beispiel ein Polymersubstrat mit einem verhältnismässig niederen Grad an Polystyrolkettenpfropfen, wie zum Beispiel 5 bis 200 %, üblicherweise 10 bis 60 % (für eine Folie oder einen Film aus Polymersubstrat mit einer Dicke im Bereich von 25 bis 100 µm), und vorzugsweise mit einem gesteuerten, oft niederen Ausmass an Funktionalisierung, gesteuerteBeschränkung der Menge(n) an Peptid(en), die gebildet werden.
Polystyrolgepfropfte Polyäthylenfolien oder Filme, hergestellt wie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt, sind besonders vorteilhaft in bezug auf analytische Aspekte der Peptidchemie oder -biochemie, indem ihr hoher Grad an Durchlässigkeit für Licht, insbesondere sichtbares Licht, die Verwendung von spektrofotometrischen Techniken, z.B. für die Ueberwachung (z.B. durch eine ELISA-Technik) von Antigen/Antikörper- Reaktionen erleichtert, welche durch eine anschliessende Farbreaktion überwacht werden können, und in welchem das Antigen eine besondere Peptidsequenz sein kann, welche auf den festen Träger synthetisiert wurde und daran verankert bleibt.
Für präparative Zwecke, bei welchen die Erzielung der höchstmöglichen Ausbeute eines Peptides oder Proteins klar wünschenswert ist, ist es vorteilhaft, den höchstenpraktikablen Pfropfungsgrad zu verwenden. Von einem allgemeinen Gesichtspunkt aus liegt die praktische obere Grenze des Pfropfungsgrades für eine Fclie oder einen Film aus Polymersubstrat mit einer Dicke im Bereich von 25 bis 100 µm (wie gemäss bevorzugten Ausführungsformen verwendet) oft bei etwa 500 bis 600 Gewichtsprozent, obwohl es besondere Anwendungen wünschenswert machen können, diesen Bereich zu überschreiten, wie bis zu einem Pfropfungsgrad von etwa 700 %. Andererseits wird der niedrigste praktikable Pfropfungsgrad üblicherweise nicht unter etwa 40 % für eine solche dünne Folie oder einen entsprechenden Film sein. Für die meisten praktischen Zwecke wird der Pfropfungsgrad von einer solch dünnen Folie oder einem entsprechenden Film im Bereich von etwa 100 bis 600 % liegen und wird oft im Bereich von etwa 100 bis 600 % liegen und für präparative Zwecke vorzugsweise auf 200 bis 400 Gewichtsprozent betragen, was ein geeigneter Bereich sowohl vom Stand der Ausbeute und des Wirkungsgrades der unter Verwendung funktionalisierter, gepfropfter Folien durchgeführen Peptidsynthesen, wie auch vom Standpunkt der mechanischen Stärke der gepfropften Folie oder des gepfropften Films zu sein scheint.
Wie aus den Beispielen, welche die Erfindung illustrieren, ersichtlich wird, sind aussergewöhnlich hohe Ausbeuten an hochreinen Peptiden erhältlich, zum Beispiel unter Verwendung bevorzugter Ausführungsformen vom Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung, welche funktionalisierte polystyrolgepfropfte Polyäthylenfolien oder entsprechende Filme verwenden, die auf einem Polyäthylensubstrat in der Form einer dünnen Folie oder eines dünnen Films mit einer Dicke in der Nähe von 50 µm und mit einem Pfropfungsgrad in der Nähe von 400 bis 500 % gebildet wurden.
Wie oben erwähnt, wird in einem Aspekt der Erfindung das polystyrolgepfropfte Polymersubstrat durch eine im wesentlichen radiallinitierte Reaktion zwischen dem Polymersubstrat und gegebenenfalls substituierten Styrolmonomer, welches in einer Lösung von diesem Monomer in einem organischen Lösungsmittel zugegen ist, gebildet. Wie ebenfalls oben erwähnt, ist es von Vorteil, um lange im wesentlichen nicht vernetzte Polystyrolketten zu erhalten, die Pfropfung in einem Lösungsmittel durchzuführen, in welchem die wachsenden Polystyrolketten schlecht gequollen oder solvatisiert werden, wie einem hydroxylgruppenhaltigen organischen Lösungsmittel, insbesondere einem Alkohol. Bevorzugte Alkohole für diesen Zweck sind C&sub1;&submin;&sub4;-aliphatische Alkohole. In der Praxis wurde Methanol als am besten geeignete Lösungsmittel befunden, doch wird auch in Betracht gezogen, zum Beispiel Aethanol, Propyl- und Isopropylalkohole sowie n-Butyl-, iso-Butyl-, sec-Butyl- und tert.-Butylalkohole anzuwenden.
Der Volumenprozentsatz (% Vol/Vol) an gegebenenfalls substituiertem Styrol in der für die Pfropfung verwendeten Lösung, wie einer Lösung in einem Lösungsmittel, welches die wachsenden Polystyrolketten schlecht quellen oder solvatisieren, z.B. ein hydroxylgruppenhaltiges Lösungsmittel, wie oben erklärt, insbesondere ein Alkohol, wie oben ausgeführt, wie z.B. Methanol, übt einen merklichen Einfluss auf das Molekulargewicht der gebildeten gepfropften Polystyrolketten, indem mindestens bis zu einem gewissen Ausmass die verlängernde Wirkung des Lösungsmittels auf die Kettenlänge grösser ist, je grösser der Volumenprozentsatz des Lösungsmittels in der Lösung ist. Während der Volumenprozentsatz an gegebenenfalls substituiertem Styrol in der Lösung innerhalb eines sehr breiten Bereiches, wie zwischen 1 und 95 %, variieren kann, wird dieser Volumenprozentsatz üblicherweise im Bereich von 10 bis 90 %, insbesondere 20 bis 80 % liegen. Ein sehr interessanter Bereich für den Volumenprozentsatz an gegebenenfalls substituierem Styrol in der Lösung liegt zwischen 25 und 50 %, und wie aus den Beispielen ersichtlich sein wird, wurde ein Bereich von 25 bis 35 %, in anderen Worten etwa 30 Volumenprozent, in der Praxis als geeignet befunden, um Träger mit ausgezeichneten Eigenschaften zu ergeben. Ein Hinweis auf das Verhältnis zwischen dem Volumenprozentsatz an Styrol in Methanol während des Pfropfungsverfahrens und der resultierenden geschätzten Polystyrolkettenlänge erscheint von den unten erwähnten Versuchen über das Verhältnis zwischen dem Volumenprozentsatz an gegebenenfalls substituiertem Styrol in Methanol und dem Molekulargewicht des erzeugten Homopolyers bei einer konstanten γ-Strahlungsdosis und Dosisgeschwindigkeit.
Das Pfropfungsverfahren wird auf sehr geeignete Weise durchgeführt durch γ-Bestrahlung in Abwesenheit von Sauerstoff und bei annähernder Raumtemperatur oder leicht erhöhter Temperatur, wobei der Druck gleich dem gesamten Dampfdruck der flüssigen Komponenten, gegebenenfalls ergänzt durch einen schwachen Druck eines inerten Gases, wie Argon, beträgt, wobei der Gesamtdruck dann etwa 1 Atmosphäre beträgt. Ein geeigneter Weg, um Sauerstoff aus dem Reaktionssystem zu entfernen, besteht darin, das System wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen in einer Hochvakuumvorrichtung zu unterwerfen. Die γ-Bestrahlung wird auf geeignete Weise bei einer Dosisgeschwindigkeit im Bereich von etwa 1 bis etwa 100'000 Gy/Stunde, insbesondere etwa 200 bis 5000 Gy/ Stunde, wie etwa 300 bis 1000 Gy/Stunde durchgeführt. Es wird angenommen, dass die Intensität der Bestrahlung von beträchtlicher Wichtigkeit für die Erzielung der wünschenswerten Konfiguration mit langen, im wesentlichen nicht-vernetzten Polystyrolketten ist; wenn die Intensität zu hoch ist, wird die Bildung freier Radikale sehr hoch, dass die Pfropfung dazu neigt, eine grössere Anzahl kürzerer Ketten und vielleicht einen höheren Grad an Vernetzung zu ergeben, was beides üblicherweise nicht erwünscht ist.
Gesamthaft erfolgt die Optimierung der Kettenänge, der Pfropfen und der optischen Eigenschaften des Trägers (welche besonders wichtig sind, wenn der Träger eine Folie oder ein Film ist) über die Auswahl des Polymers, gegebenenfalls substituierten Styrolmonomers, des Reaktionsgemisches, der Bestrahlungsdosis-Geschwindigkeit und der Temperatur während der Bestrahlung. Während das oben beschriebene Verfahren, welches strahlung umfasst, die gegenwärtig bevorzugte Methode darstellt, wird in Betracht gezogen, das polystyrolgepfropfte Filme auf geeignete Weise hergestellt werden können unter Verwendung einer anderen Strategie, welche konventionelle Radikalinitiatoren, wie Peroxide, z.B. Wasserstoffperoxid, Benzoylperosid oder Diacetylperoxid, oder Azoverbindungen als radikalbildende Prinzipien einsetzen. Andere radikalbildende Prinzipien, welche verwendet werden könnenn sind z.B. Ozon und UV- Strahlung; ein anderes besonders interessantes radikalbildende Prinzip ist ein Elektronenstrahl. Wichtig ist, dass die zur Radikalerzeugung verwendete Methode eine solche ist, welche geeignet ist für verhältnismässig gut gesteuertes radikalinitiiertes Wachstum der Polystyrolketten. Es wird angenommen, dass die oben erwähnten Bedingungen bezüglich der Wichtigkeit der Eigenschaften des verwendeten Lösungsmittels auch im Zusammenhang mit diesenfreien Radikalinitiierungsprinzipien gelten.
Es wird auch in Betracht gezogen, dass es möglich sein kann, polystyrol/Polyäthylen-Blockcopolymere zu erzeugen, welche nützlich sind für die vorliegende Erfindung in einer Weise, welche kein Gebrauch macht von Radikalinitiierung. So ist es beispielsweise möglich anionische Polymerisation zu verwenden, um ein Blockcopolymer von Butadien und Styrol zu synthetisieren, in welchen die Kettenlänge der beiden Blocks genau gesteuert werden kann. Es ist möglich, dieses Polymer in solcher Weise zu hydrieren, dass der Polybutadienblock in Polyäthylen umgewandelt wird. Das gebildete Polyäthylen wird eine derart gleichmässige. Struktur aufweisen, dass es in festem Zustand Polyäthylen von hoher Dichte bildet. Es ist für dieses Verfahren kritisch, dass der Polyäthylenteil des Copolymers einen kohäre.nten Film bildet. Es wird in Betracht gezogen, dass dies auf folgende Weise erhalten werden kann : das Aethylen/ Styrol-Blockcopolymer wird in einem Lösungsmittel gelöst, in welchem der Polystyrolteil bei Raumtemperatur und höheren Temperaturen löslich ist, aber in welchen der Polyäthylenteil nur löslich ist, wenn das Lösungsmittel heiss ist. Ein Beispiel eines solchen Lösungsmittels ist Xylol. Die Polymerlösung wird in eine. Form verbracht und langsam auf eine Temperatur gekühlt, bei welcher Polyäthylen ausfällt. Wenn der Polyäthylenfilm gebildet worden ist, wird der Rest des Lösungsmittels entfernt.
Es wird ferner in Betracht gezogen, dass die zuletzt beschriebene alternative Herstellungsmethode ausgedehnt werden kann auf die Herstellung von anderen Polystyrol/Polyolefin-Blockcopolymeren, z.B. Polystyrol/Polypropylen-Blockcopolymeren, durch Anwendung von anderen Dienmonomeren als Butadien, z.B. 2-Methyl- 1,3-pentadien im Fall von Polystyrol/Polypropylen-Blockcopolymer.
Während das polystyrolgepfropfte Polymersubstrat, wie oben erklärt, in jeder geeigneten Form vorliegen kann sind jene Ausführungsformen der Erfindung sehr interessant, in welchen es die Form einer Folie oder eines Filmes einnimmt. Die Dicke des Polymersubstrates selbst, z.B. eines Poiyäthylensubstrates, welches das Ausgangsmaterial für eine solche Folie oder einen solchen Film bildet, kann innerhalb eines weiten Bereiches variieren und beträgt im allgemeinen von 10 bis 10'000 µm, liegt für die meisten Zwecke vorzugsweise im Bereich von 25 bis 1000 µm und typischerweise im Bereich von 25 bis 100 µm, wie 25 bis 75 µm. Das Pfropfverfahren führt selbstverständlich zu einer Erhöhung der Dicke. Je dünner daher eine Folie oder ein Film ist, umso grösser wird die prozentuale Zunahme der Dicke für einen gegebenen Satz an Pfropfbedingungen sein. Beispielsweise kann eine dünne gepfropfte Folie oder ein solcher Film eine Dicke im Bereich von 25 bis 200 µm aufweisen.
Da das gepfopfte Polymer in der Form einer Folio oder eines Filmes ein thermoplastisches Material ist und bei erhöhten Temperaturen löslich ist, wird das Umformen nach Beendigung des Pfropfverfahrens als Möglichkeit in Betracht gezogen. So ist es im Fall einer polystyrolgepfropften Polyäthylenfolie oder eines solchen Films, wie sie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bevorzugt werden, möglich, die Folie oder den Film in einem geeigneten Lösungsmittel aufzulösen und die Lösung abkühlen und das Lösungsmittel, verdampfen zu lassen, um einen "Guss" des Polymerträgers, z.B. eine dünnere Folie oder einen dünneren Film, mit den gepfropften Polystyrolketten zu erhalten. Ein geeignetes Lösungsmittel ist ein solches, welches bei genügend hoher Temperatur den Polymerträger mit seinen gepfropften Polystyrolketten löst (aber unter Beibehaltung der Pfropfung) und welches ein Abkühlen auf eine niedrigere Temperatur nicht mehr fähig ist, das Polymersubstrat in Lösung zu halten, jedoch die Polystyrolketten noch immer wirksam quillt oder solvatisiert. Ein Beispiel eines solchen Lösungsmittels, welches z.B. für polystyrolgepfropftes Polyäthylen nützlich ist, ist ein Xylol oder ein Gemisch von Xylolen.
Eine Folie oder ein Film weist eine Anzahl von Vorteilen in der praktischen Durchführung von Peptid oder Proteinsynthesen auf. So kann z.B. eine Folie oder ein Film leicht in geeignete Grössen zur Anordnung in den verwendeten Reaktionsgefässen, wie jede Art bekannter Festphasenpeptidsynthese-Reaktionsgefässen, einschliesslich Kolben, Becher, Mikrobecher, Trichter, Schalen, Säulen oder Netzen, geschnitten werden.
Der Film- oder Folienträger ermöglicht es, neue praktische Wege zur Handhabung der Peptidsynthese zu entwickeln. So kann z.B. eine Anzahl Folienoder Filmstücke auf einen gemeinsamen Träger angeordnet und auf diese Weise während der verschiedenen Stufen der Peptidsynthese zusammengehalten werden, z.B. indem sie zusammen den verschiedenen Reagenzien und Waschlösungsmitteln ausgesetzt werden, oder die Stücke können zu Sätzen angeordnet werden, wobei jeder Satz einer besonderen Kombination von Reaktionsmedien ausgesetzt wird.
Diese letztere Möglichkeit erleichtert eine wirksame "Abschottung", durch welche zwei oder mehrere Peptide in einer parallelen und im wesentlichen gleichzeitigen Weise hergestellt werden können.
In einem Aspekt ergibt somit die Erfindung eine besonders praktische Methode zur "Abschottungs"- Synthese von Peptiden und Proteinen, wobei dieser Aspekt auf der Verwendung einer polystyrolgepfropften Folie oder eines solchen Films als Festphasen- Peptidsyntheseträgers beruht. Dieser Aspekt der Erfindung kann als ein Verfahren für die Synthese von einem oder mehreren Peptiden oder Proteinen ausgedrückt werden, welches Verfahren, wenn zwei oder mehrere Peptide oder Proteine synthetisiert werden sollen, die parallele und im wesentlichen gleichzeitige Synthese der gewünschten Anzahl an Peptiden und Proteinen erlaubt, wobei dieses Verfahren umfasst:
A) Bereitstellen einer Vielfalt von im wesentlichen identischen Polymersubstraten, welche mit Polystyrolketten gepfropft sind, wobei diese Polystyrolketten gegebenenfalls weitere Substituenten tragen, welche unter den in der Synthese vorherrschenden Bedingungen nicht reagieren, mindestens ein Teil der Polystyrolketten von jeden polystyrolgepfropften Polymersubstrat mit einer chemischen Funktionalität funktionalisiert ist, welche die Bildung einer verankernden Brücke zwischen den Polystyrolbestandteilen und einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure erleichtert,
B) gegebenenfalls das physikalische Auftrennen der Mitglieder dieser Vielzahl von polystyrolgepfropften Polymersubstraten um zwei oder mehr Sätze, von denen jeder einen oder mehrere Mitglieder dieser Vielzahl enthält, Kuppeln einer N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure an die funktionalisierten Polystyrolbestandteile jedes Mitgliedes der Vielzahl, oder soweit anwendbar, jedes Mitglied von jedem Satz, wobei die eingesetzte N-geschützte und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierte Aminosäure für alle Mitglieder der Vielzahl identisch ist, und, soweit anwendbar, alle Mitglieder eines Satzes ausserdem mit einer der folgenden Alternativen übereinstimmen:
(i) identisch für alle Sätze,
(ii) wenn die Anzahl der Sätze grösser als zwei ist, identisch für mindestens zwei der Sätze,
(iii) verschieden für jeden Satz, wobei die Funktionalität und die N-geschützte und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierte Aminosäure so aufeinander eingestellt sind, dass die gebildete verankernde Brücke anschliessend abgespalten werden kann, im wesentlichen ohne Abbau der zu synthetisierenden Peptid- oder Proteinkette,
C) Behandeln jedes Mitgliedes der Vielzahl, oder soweit anwendbar, jedes Mitglied jedes Satzes, um die N-Schutzgruppe von einer N-geschützten Aminooder substituierten Aminogruppe der gekuppelten und N-geschützten Aminosäure zu entfernen, so dass die Reaktion der Amino- oder substituierten Aminogruppe der gekuppeleten Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder einer aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure erleichtert wird,
D) Umsetzen der Amino- oder substituierten Aminogruppe der Aminosäure, die zuletzt an die funktionalisierten Polystyrolbestandteile jedes Mitgliedes der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitgliedes von jedem Satz gekuppelt worden ist, mit einer Carboxylgruppe oder einer aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure um eine Peptidbindung zwischen dieser Amino- oder substituierten Aminogruppe und dieser Carboxylgruppe oder aktivierten Carboxylgruppe zu bilden, wobei diese weitere N-geschützte Aminosäure für alle die Mitglieder der Vielzahl oder, soweit anwendbar, alle die Mitglieder von einem Satz identisch ist, und, soweit anwendbar, ausserdem mit einer der drei oben im Zusammenhang mit Stufe B) genannten Alternativen übereinstimmt,
E) gegebenenfalls Behandeln jedes Mitgliedes der Vielzahl, oder soweit anwendbar, jedes Mitgliedes von jedem Satz, um die N-Schutzgruppe von einer N- geschützten Amino- oder substituierten Aminogruppe der zuletzt gekuppelten N-geschützten Aminosäure zu entfernen, so dass die Reaktion der Amino- oder substituierten Aminogruppe der letztgenannten Aminosäure mit einer Carboxylgrupp oder aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure erleichtert wird,
F) in jenen Fällen, in welchen Stufe E) durchgeführt wurde, Wiederholen der Stufen D) und E) so oft wie erwünscht,
G) gegebenenfalls Behandeln jedes Mitgliedes der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitgliedes von jedem Satz, um einige oder alle gegebenenfalls an den Aminosäurebestandteilen der synthetisierten Peptid- oder Proteinkette verbliebenen Schutzgruppen zu entfernen,
H) gegebenenfalls Behandeln jedes Mitgliedes der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitgliedes von jedem Satz, um die Brücke abzuspalten, welche die synthetisierte Peptidoder Proteinkette an die funktionalisierten Polystyrolbestandteile jedes Mitgliedes der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitgliedes von jedem Satz verankert,
und
I) gegebenenfalls Entfernung jeder weiteren unerwünschten Gruppe von einer synthetisierten Peptidoder Proteinkette.
Ein praktischer Weg zur Handhabung des Polymerträgers in der Form einer Folie oder eines Films zu Abschottungszwecken besteht darin, die Folie oder den Film in eine gewünschte Anzahl Stücke zu zerschneiden, welche sodann unauslöschlich bezeichnet werden, z.B. mit Hilfe einer Tinte auf Graphitbasis, welche in die Oberfläche von einem Teil der Folie oder des Films eingeschmolzen wird. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die verschiedenen Stücke auf einem und demselben grossen Stück Folie oder Film zugegen zu haben und die verschiedenen Flächen (welche auf geeignete Weise wie oben beschrieben bezeichnet sind) je nach Bedarf zusammen oder getrennt zu behandeln. Offensichtlich besteht eine Ausführungsform darin, den Stücken zu erlauben, auf einem und demselben Film zu verbleiben, so lange die auszuführenden Behandlungen dieselben sind, um dann den Film in Untereinheiten aufzuteilen, wenn die auszuführenden Stufen verschieden sind.
Die chemische Funktionalität, welche die Bildung einer verankernden Brücke zwischen einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls derivatisierten Aminosäure und dem funktionalisierten Polystyrolbestandteil erleichtert, ist geeigneterweise ein Mitglied der Gruppe, umfassend:
chlor-, brom- und jodsubstituiertes Alkyl,
aminosubstituiertes Alkyl,
amino- und arylsubstituiertes Alkyl,
amino- und alkylarylsubstituiertes Alkyl,
hydroxysubstituiertes Alkyl,
oder ist von einem solchen Mitglied abgeleitet, wobei die Funktionalität, falls von einem der Mitlieder dieser Gruppe abgeleitet, eine Funktionalität ist mit einer Spacergruppe, so dass eine synthetisierte Peptid- oder Proteinkette von dem Polystyrolbestandteil abspaltbar sein wird im wesentlichen ohne Abbau dieser Kette.
Gemäss geeigneten Ausführungsformen der Erfindung ist chlorsubstituiertes Alkyl Chlormethyl, aminosubstituiertes Alkyl ist Aminomethyl, amino- und alkylsubstituiertes Aryl ist α-Aminobenzyl (Benzhydrylamino), amino- und alkylarylsubstituiertes Alkyl ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus α-Amino-2-, α-Amino-3- und α-Amino-4-methylbenzyl (das letztere ist auch bekannt als 4-Methylbenzylhydrylamino), und hydroxysubstituiertes Alkyl ist Hydroxymethyl.
In bezug auf die initiale Funktionalisierung des polystyrolgepfropften Polymersubstrates wurden mehr als fünfzig Methoden im Zusammenhang mit traditionellen Festphasen-Peptidsynthesen beschrieben (siehe Barany und Merrifield in The Peptides, Vol. 2, Academic Press, New York, 1979, Seiten 1-284, und Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflage, Pierce Chemical Company, Illinois, 1984) , von welchen Reaktionen für die Einführung von Chlormethyl (über eine Chlormethylmethyläther-/SnCl&sub4;-Reaktion) Aminomethyl (über eine N-Hydroxymethylphthalimid-Reaktion; siehe Mitchell et al., Tetrahedron lett., 3795, (1976)) und von Benzhydrylaminogruppen (Pietta und Marshall, J. Chem. Soc., 650 (1970)) die am häufigsten angewandten sind. Andere reaktionsfähige Funktionalitäten, welche zu Beginn eingeführt wurden, umfassen 4-Methylbenzhydrylamino und 4-Methoxybenzhydrylamino. Alle diese bewährten Methoden sind im Prinzip nützlich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. Bevorzugte Ausführungsformen für Peptid- oder Proteinsyntheseverfahren innerhalb der vorliegenden Erfindung verwenden Aminomethyl als initiale Funktionalität, weil Aminomethyl besonders vorteilhaft ist in bezug auf die Einverleibung von "Spacer"- oder " Handle"-Gruppen infolge der Reaktionsfähigkeit der Aminogruppe der Aminomethyl-Funktionalität in bezug auf die im wesentlichen quantitative Bildung von Aminobindungen an eine Carboxylsäuregruppe an einem Ende des spacerbildenden Reagens. Eine grosse Anzahl relevanter spacer- oder handelbildender funktioneller Reagenzien wurden beschrieben (siehe Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739 (1987)), insbesondere Reagenzien, welche gegenüber Aminogruppen reaktionsfähig sind, wie die Aminogruppe in der Aminomethylfunktion, einschliesslich eine 4-(Halogenalkyl)-aryl-niederfettsäüre, wie 4-(Brommethyl)- phenylessigsäure, einer Boc-aminoacyl-4-(oxymethyl)- aryl-niederfettsäure, wie Boc-aminoacyl-4-(oxymethyl)- phenylessigsäure, N-Boc-p-acylbenzhydrylamin, wie N-Boc- p-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'-niederalkyl-p-acyl- benzhydrylamin, wie N-Boc-4'-methyl-p-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'-niederalkoxy-p-acylbenzhydrylamin, wie N-Boc-4'-methoxy-p-glutaroylbenzhydrylamin und 4-Hydroxymethylphenoxy-niederfettsäure, wie 4-Hydroxymthylphenoxyessigsäure.
Gewisse Funktionalitäten, wie Benzyhdrylamin, 4-Methylbenzhydrylamin und 4-Methoxybenzhydrylamin, welche zwecks Abspaltung einer synthetisierten Peptid- oder Proteinkette von dem festen Träger einverleibt werden können, so dass das C-Ende der Peptid- oder Proteinkette in Amidform ist, erfordern keine Einführung einer Spacergruppe, und jede solche Funktionalität kann mit Vorteil im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Eine alternative Strategie in bezug auf die Einführung von Spacer- oder Handle-Gruppen ist die sogenannte "pre-formed handle"-Strategie [s. Tam et al., Synthesis, 955-57 (1979)], welche eine vollständige Steuerung über die Kupplung der ersten Aminosäure bietet und die Möglichkeit von Komplikationen ausschliesst, welche durch die Gegenwart unerwünschter funktioneller Gruppen entstehen können, welche nicht zur Peptid- oder Proteinsynthese gehören. In dieser Strategie werden Spacer- oder Handle-Gruppen, im allgemeinen Spacer- oder Handle- Gruppen desselben Typus wie oben beschrieben, mit der ersten Aminosäure umgesetzt, von welcher eine Verankerung an den festen Träger erwünscht wird, wobei die Aminosäure N-geschützt und gegebenenfalls an anderen Seitenketten geschützt wird, welche nicht in bezug auf den Aufbau der gewünschten Peptid- oder Proteinkette beteiligt sind. Geeignete N-Schutzgruppen sind Boc, üblicherweise in Kombination mit Benzylgruppen für den Schutz von Seitenketten, und Fmoc, üblicherweise in Kombination mit t-Butyl für den Schutz jeglicher Seitenketten (Boc = t-Butyloxycarbonyl; Fmoc = 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl), obwohl eine Anzahl anderer Möglichkeiten besteht, welche alle in konventionellen Festphasen-Peptidsynthesen gut bekannt sind.
In jenen Fällen, in welchen eine Spacer- oder Handle- Gruppe erwünscht ist, kann somit die erste an den festen Träger zu kuppelnde Aminosäure entweder an das freie reaktionsfähige Ende einer Spacer-Gruppe gekuppelt werden, welche an die anfänglich eingeführte Funktionalität gebunden wurde, z.B. Aminomethyl, oder kann mit dem spacerbildenden Reagens umgesetzt werden, welches seinerseits dann mit der anfänglich eingeführten Funktionalität umgesetzt wird.
Nach der Beendigung der Kupplung der ersten zu kuppelnden Aminosäure, besteht die nächste Stufe der Festphasensynthese aus der systematischen Erarbeitung der gewünschten Peptid-oder Proteinkette. Diese Erarbeitung umfasst wiederholte Cyclung der Schutzgruppenentfernung und der Kupplung. Die temporäre Schutzgruppe, wie eine Boc- oder Fmoc-Gruppe, wie oben beschrieben, an der zuletzt gekuppelten Aminosäure wird quantitativ mit einer geeigneten Behandlung, z.B. durch Acidolyse, wie mit Trifluoressigsäure, im Fall von Boc, oder durch Basenbehandlung, wie mit Piperidin, im Fall von Fmoc, entfernt, um die N-endständige Amincfunktion der zuletzt gekuppelten Aminosäure freizusetzen.
Die nächste gewünschte N-geschützte Aminosäure wird sodann an das N-Ende der zuletzt gekuppelten Aminosäure gekuppelt. Diese Kupplung des C-Endes einer Aminosäure mit dem N-Ende der zuletzt gekuppelten Aminosäure kann auf verschiedene Weise erhalten werden, z.B. durch. Zuführen der ankommenden Aminosäure in einer Form mit der durch irgend eine von verschiedenen Methoden aktivierten Carboxylgruppe, einschliesslich der anfänglichen Bildung eines aktiven Esterderivates, oder der anfänglichen Bildung eines Anhydrides. Alternativ kann die Carboxylgruppe der anfänglichen Aminosäure direkt mit dem N-Ende der zuletzt gekuppelten Aminosäure umgesetzt werden unter Zuhilfenahme eines Kondensationsreagens, z .B. Dicyclohexylcarbodiimid oder Derivate davon.
Nach der fertigen Vereinigung der gewünschten Peptidoder Proteinkette, einschliesslich Schutzgruppen, ist üblicherweise die nächste Stufe die Entfernung der Schutzgruppe von den Aminosäurebestandteile der Peptid- oder Proteinkette und die Abspaltung des synthetisierten Peptides oder Proteins vom festen Träger. Diese Verfahren können im wesentlichen gleichzeitig erfolgen, wodurch das freie Peptid in der gewünschten Form erhalten wird. Alternativ ist es möglich, in Fällen, in welchen Kondensation von zwei getrennt synthetisierten Peptid- oder Proteinketten durchzuführen ist, durch Auswahl einer geeigneten Spacer-Gruppe zu Beginn der Synthese die gewünschten Peptid- oder Proteinketten von ihren jeweiligen festen Trägern abzuspalten, wobei Peptid- oder Proteinketten noch immer ihre Seitenketten- Schutzgruppen enthalten, und schliesslich die Seitenkettenschutzgruppen entfernt werden nach z.B. Kupplung der beiden seitenkettengeschützten Peptid- oder Proteinketten, um eine längere Peptid- oder Proteinkette zu bilden. Eine dritte Möglichkeit, welche besonders zutrifft, z.B. im Fall von analytischen Aspekten der Peptidchemie oder -biochemie, besteht darin, die Seitenkettenschutzgruppen von dersynthetisierten Peptid- oder Proteinkette zu entfernen, ohne die verankernde Brücke abzuspalten, welche die Kette an den festen Träger bindet.
Es ist vorgesehen, dass polystyrolgepfropfte Polyäthylensubstrate analog denjenigen der vorliegenden Erfindung, welche aber Linker- oder Spacer-Gruppen enthalten, die an die jeweilige besondere Chemie angepasst sind, in der Synthese von anderen einfachen oder mehrfachen Biopolymermolekülen als Peptide nützlich sein können. Ein Beispiel wäre die Synthese von Oligonucleotiden, wobei diese im Grunde einfach zu synthetisieren sind, da nur vier verschiedene Reaktionsabteile üblicherweise erforderlich sind, eines für jedes der vier involvierten Nucleotideinheiten (d.h. A, T, G und C für DNA-Fragmente, oder A, G, C und U für RNA-Fragmente). Solche Synthesen können in einer parallelen und im wesentlichen gleichzeitigen Weise durchgeführt werden in analoger Weise zu der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beschriebenen.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, wobei die verwendeten Abkürzungen die folgenden sind

LISTE DER ABKÜRZUNGEN

Boc: tert.-Butyloxycarbonyl
ClZ: 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
DCC: N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
DCU: N,N'-Dicyclohexylharnstoff
DIEA: N,N'-Diisopropyläthylamin
DMF: N,N'-Dimethylformamid
FABMS: "Fast atom bomardment"-Massenspektrometrie
HOBt: 1.Hydroxybenzotriazol
HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol
HPLC: Hochleistungs-Flüssigchromatographie
Pam: Phenylacetamidomethyl
PE: Polyäthylen
PP: Polypropylen
SEC: Grössen-Exclusionschromatographie
SPPS: Festphasen-Peptidsynthese
TFA: Trifluoressigsäure
TFMSA: Trifluormethansulfonsäure
THF: Tetrahydrofuran
Die für die verschiedenen Aminosäuren verwendeten Abkürzungen entsprechen den Empfehlungen der IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature [J. Biol. Chem., 247, 977-983 (1972)] und beziehen sich in allen Fällen auf die L-Konfiguration der Aminosäuren.

Beispiel 1

Allgemeines Verfahren für die Herstellung von mit Polystyrol gepfropften Polyäthylenfolien.
Styrol (99 % Aldrich) wurde durch basisches Aluminiumoxid hindurchgeführt; in einigen Fällen wurde es ferner aus Natrium oder aus Calciumzydrid destilliert. 20 ml einer 30 %igen (Vol/Vol) Lösung von gereinigtem Styrol in Methanol wurde zusammen mit einem rechteckigen Streifen einer PE-Folio von niederer Dichte, welche mit n-Hexan gewaschen worden war, in eine Ampulle verbracht. Die verwendete Folie wies eine Dicke von 54 µm auf. Die Lösung wurde sorgfältig entgast,durch wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen auf einer Hochvakuumlinie, und die Ampulle wurde sodann unter Vakuum versiegelt. Die Ampulle und die Inhalte wurden sodann in einer Kobalt-gamma-Bestrahlungsvorrichtung bestrahlt. Die Bestrahlung wurde in zwei Stufen durchgeführt, wobei die Ampulle von einem Ort in der Strahlenquelle zu einem anderen zwischen den beiden Stufen bewegt wurde, um eine möglichst homogene Dosisverteilung zu sichern. Die Dosisleistung betrug etwa 400 Gy/Stunde. Die höchste verwendete Dosisleistung betrug 417 Gy/Stunde, und die niederste 339 Gy/Stunde. Nach Bestrahlung wurde die Folie in einem Soxhlet-Apparat mit Dichlormethan extrahiert und getrocknet. Spezifische Daten sind in Tabelle 1 aufgelistet. Es ist zu bemerken, dass obwohl eine klare Beziehung zwischen der Strahlungsdosis und dem Ausmass der Pfropfung besteht, eine starke Streuung der Daten auftritt. Dies ist besonders auf die sogenannte "Nachwirkung" zurückzuführen, bei welcher die Polymerisation in gewissem Mass weitergeht, nachdem die Bestrahlung aufgehört hat. Als Beispiel dieser Wirkung wurde die Ampulle, welche die mit einer Gesamtdosis von 3,4 kGy bestrahlte Folie enthielt, um eine zu 450 % gepfropfte Folie zu ergeben, ausserhalb der Strahlungsquelle während 10 Stunden zwischen den beiden Bestrahlungsstufen belassen. Ferner wurde die Ampulle zuerst 10 Tage nach Beendigung der Bestrahlung geöffnet. Ein ähnliches Verfahren wurde verwendet für das mit einer Gesamtdosis von 2,0 kGy bestrahlte Folie, um eine 230 %ige Pfropfung zu ergeben. TABELLE 1 Pfropfen von PE-Folien in Methanol/Styrol (70 % Vol/Vol) Masse der PE- Folie Bestrahlungsdosis (kGY) [Bestrahlungszeit in Stunden] Pfropfung Prozent Dauer der Extraktion mit CH&sub2;Cl&sub2; Pfropfung % = [(Masse der Endfolie) - (Masse des Polyäthylens)] x 100/(Masse des Polyäthylens) Die Oberseite der Folie wurde während des Verschlusses der Ampulle beschädigt.Folien mit 46, bzw. 129 und 331 Pfropf-Prozent wurden ebenfalls hergestellt.

Beispiel 2

Verfahren zum Pfropfen auf ungewobenem Filz, hergestellt aus Fasern bestehend aus einem Polypropylen kern und einer weiteren Schicht aus Polyäthylen hoher Dichte.
Das ungewobene PP/PE-Filz wurde mit n-Hexan gewaschen und in einer geschlossenen Ampulle, welche eine entgaste 30 %ige (Vol/Vol) Lösung von gereinigtem Styrol in Methanol enthielt, in einer vollständig analogen Weise wie im allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, bestrahlt. Die Resultate sind in Tabelle 2 gegeben. TABELLE 2 Pfropfen von PP/PE-ungewobenem Filz in Methanol/Styrol (70:30 Vol/Vol) Masse des PP/ PE-Filzes Bestrahlungsdosis (kGY) [Bestrahlungszeit in Stunden Pfropfung Prozent Dauer der Extraktion mit CH&sub2;Cl&sub2; Pfropfung % = [(Masse der Endfolie( - (Masse des Polyäthylens)] x 100/(Masse des Polyäthylens)

Beispiel 3

Einfluss des Methanol/Styrol-Verhältnisses auf die Menge der gepfropften Polystyrolkette.
Die folgenden Resultate wurden erhalten bei der Bestrahlung von Polyäthylenfolien von niederer Dichte in verschiedenen Methanol/Styrol-Gemischen (5 kGy-Dosis, 400 Gy/Stunde Dosisleistung, Raumtemperatur): Prozent Methanol im Lösungsmittel (Vol/Vol) Peak-Molekulargewicht des Homopolymers
Es ist ersichtlich, dass das Molekulargewicht (bestimmt durch Grössenexclusionschromatographie auf vernetztem Styrol/Divinylbenzol-Säulenmaterial) der Homopolymerfraktion, welche unter den gepfropften Ketten der mit Polystyrol gepfropften Aethylenfolien eingeschöossen sind und auf den Folien mit Dichlormethan extrahiert werden, als eine Funktion des Methanol/Styrolverhältnisses in der Lösung zunimmt. Gleichzeitig neigt die Molekulargewichtsverteilung dazu, für hohe Methanol/ Styrol-Verhältnisse enger zu werden.

Beispiel 4

Versuche über die Schätzung des Molekulargewichtes der gepfropften Polystyrolketten.
Das aus den Folien extrahierte Polystyrolhomopolymer wurde durch SEC gekennzeichnet. Das extrahierte Polystyrol zeigt typischerweise eine Molekulargewichtsverteilung mit zwei Erhöhungen. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass Polystyrol sowohl in der Folge wie in der umgebenden Lösung während der Bestrahlung gebildet wird. Wenn eine Folie kurz in Difluormethan gewaschen wird, bevor die Soxhlet-Extraktion durchgeftihrt wird, ist die Menge der Fraktion mit niederem Molekulargewicht stark herabgesetzt im Verhältnis zu derjenigen der Fraktion mit hohem Molekulargewicht. Molekulargewichtsdaten für die Fraktion mit hohem Molekulargewicht des extrahierten Homopolymers sind in Tabelle 3 gegeben. Typische Probengrössen betrugen von O, 01 mg bis 0,2 mg Polymer. FUr das Homopolymer aus den Folien, welche im Ausmass von 173 bzw. 220, 231 und 450 Gewichtsprozent gepfropft worden waren, wurde eine 60 cm -Säule aus Toyo Soda TSK GMH6 ftir die SEC bei Umgebungstemperatur mit THF als Eluierungsmittel und einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute verwendet. Für das Homopolymer aus der Folie, die im Ausmass von 443 Gewichtsprozent gepfropft war, wurde eine 50 cm -Säule aus Shodex A80-M für die SEC bei 50ºC mit Xylol als Lösungsmittel und einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,5 ml/Minute verwendet. Diese Zusammenstellung wurde auch verwendet für die SEC des gebildeten gepfropften Polymers, wobei aber jetzt bei 90ºC und mit einer Durchflussgeschwindigkeit von etwa 0,3 ml/Minute gearbeitet wurde. Die gepfropften Folien sind löslich in heissem Xylol. Molekulargewichtsdaten für mit Polystyrol gepfropften Polyäthylen auf den fünf gepfropften Folien sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Alle angegebenen Molekulargewichtsdaten wurden berechnet unter Verwendung einer Eichkurve, welche auf Polystyrol- Standards mit Molekulargewichten von 2800 g/Mol bis 8'000'000 g/Mol beruhen, wobei die Form der Eichkurve durch ein Polynomial dritter Ordnung eingepasst wurde. Die Verwendung einer Eichkurve erster Ordnung (linear) führt zu ähnlichen Resultaten. Es ist zu beachten, dass, während die für das Styrolhomopolymer erhaltenen Molekulargewichte absolut sind, die für das gepfropfte Copolymer erhaltenen Molekulargewichte nicht absolut sind. Im Fall der Shodex A80-M-Säule, war eine Extrapolation der Eichkurve notwendig, um die beobachteten extrem hohen Molekulargewichte zu berechnen. Diese Extrapolation kann zu einer Unterschätzung des Gewichtsdurchschnitts- Molekulargewicht und demzufolge auch der Polydispersität führen. Das ungepfropfte Polyäthylen wurde durch Hochtemperatur-SEC unter Verwendung von 1,2,4-Trichlorbenzol als Eluierungsmittel gekennzeichnet. Die folgenden Werte wurden erhalten : Mw 4 x 10&sup4; g/Mol und Mw/Mn = 5. Die letzteren Daten wurden erhalten unter Verwendung einer auf Polystyrol-Standardsberuhenden Eichkurve.
Die Daten für die Polystyrolhomopolymeren zeigen, dass das Molekulargewicht unempfindlich ist auf die gesamte Strahlungsdosis, während für das mit Polystyrol gepfropfte Polyäthylen das gemessene Molekulargewicht weitgehend proportional zu der Dosis ist. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass die sehr langen Kettenpfropfungen während des ganzen Bestrahlungsverfahrens gebildet werden und dass im wesentlichen nur die Anzahl an Pfropfungen durch die Dosis beeinträchtigt wird. TABELLE 3 Molekulargewichtsdaten für die aus den bestrahlten Folien extrahierte Fraktion des Polystyrolhomopolymers mit hohem Molekulargewicht Pfropfung Prozent Bestrahlungsdosis (kGy) gewichtsmässiges durchschnittliches Molekulargewicht gewichtsmässiges durchschnittliches Molekulargewicht dividiert durch zahlenmässiges durchschnittliches Molekulargewicht TABELLE 4 Molekulargewichtsdaten für das polystyrolgepfropfte Polyäthylen aus den bestrahlten Folien Pfropfung Prozent Bestrahlungsdosis Mw = gewichtsmässiges durchschnittliches Molekulargewicht Mw/Mn = gewichtsmässiges durchschnittliches Molekulargewicht dividiert durch zahlenmässiges durchschnittliches Molekulargewicht Mpeak = Molekulargewicht am Gipfelpunkt des Chromatogrammes.

Beispiel 5

Umformung einer mit Polystyrol gepfropften Polyäthylenfolie.
Ein Stück zu 173 % gepfropften Folie (siehe Tabelle 1) wurde in Xylol bei 100ºC gelöst, und die Lösung wurde in eine Teflon-Form bei 80ºC gegossen. Nach langsamem Verdampfen des Xylols entstand ein sehr dünner Film. Infolge der extremen Dünne des Films war es nicht möglich, irgend etwas anderes als kleine Stücke (1 bis 2 mm²) des Films zu erhalten. Diese kleinen Stücke zerfielen jedoch nicht, wenn sie Dichlormethan ausgesetzt wurden. Dies bedeutet, dass eine kontinuierliche Polyäthylenphase wieder gebildet wurde.

Beispiel 6

Aminomethylierung (Funktionalisierung) von mit Polystyrol gepfropften PE-Folien.
Acht rechteckige Streifen gleicher Grösse (1,4 x 4,5 cm) auf zu 443 % mit Polystyrol gepfropfter Polyäthylenfolie (1,30 g total) wurden in ein 60 ml SPPS-Reaktlonsgefäss auf einem manuell betriebenen SPPS-Schüttelapparat verbracht und mit 40 ml TFA/ CH&sub2;Cl&sub2; (1:1 Vol/Vol) während 3 x 5 Minuten gewaschen. Eine Lösung von 0,35 g (1,9 mMol) N-Hydroxymethyl)phthalimid (97 %iger Reinheit; EGA-CHEMIE) in 40 ml TFA/CH&sub2;CL&sub2; (1:1 Vol/Vol) wurde zu den gewaschenen Folien zugesetzt, und das Gemisch wurde während 10 Minuten geschüttelt. 10 ml TFMSA/TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (10:45:45 Vol/Vol/Vol) wurden langsam im Laufe von 4 bis 5 Stunden zugesetzt und das Schütteln wurde während weiteren 3 Stunden fortgesetzt. Die Folien wurden durch Filtration isoliert und nacheinander mit dem folgenden gewaschen : TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1:1 Vol/Vol) (120 ml), CH&sub2;Cl&sub2; (240 ml), Methanol (160 ml) und Aethanol (160 ml). Sie wurden sodann in 40 ml Aethanol, welches 10 % Hydrazin (Fluka) enthielt, während 12 Stunden bei 70ºC geschüttelt. Die Folien wurden vom heissen Gemisch abfiltriert und nacheinander mit dem folgenden gewaschen (mit 20 Minuten langem Schütteln für jede Wäsche) : heisses Aethanol (3 x 40 ml) , heisses DMF (3 x 40 ml), heisses DMF (3 x 40 ml), heisses Aethanol (3 x 40 ml), heisses Methanol (3 x 40 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (3 x 40 ml) . Schliesslich wurden die Folien mit 40 ml DIEA/CH2CI2 (1:9 Vol/Vol) während 2 x 5 Minuten behandelt, mit 200 ml CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und bei Zimmertemperatur getrocknet. Insgesamt 4 spektrometrische Ninhydrin-Farbtests zeigten 1,00 mMol NH&sub2;/g Folie (0,99 bzw. 0,96, 1,02 und 1,01 mMol/g) und die Elementaranalyse ergab 1,07 mMol N/g pro Folie.
Die folgenden mit Polystyrol gepfropften Polyäthylenfolien wurden ebenfalls aminomethyliert:
331 % gepfropfte Folie: Substitution = 0,21 mMol NH&sub2;/g Folie
547 % gepfropfte Folie: Substitution = 0,46 mMol NH&sub2;/g Folie
129 % gepfropfte Folie: Substitution = 0,50 mMol NH&sub2;/g Folie
46 % gepfropfte Folie: Substitution = 0,02 mMol NH&sub2;/g Folie
285 % gepfropfte Folie: Substitution = 0,6 mMol NH&sub2;/g Folie

Beispiel 7

Herstellung von BocGln-4-(oxymethyl)-Pam-Folie.
0,63 g Aminomethyl-Folie (Substitution 1,0 mMol/g Folie; 443 % Pfropfung) wurde in 30 ml DMF/ CH&sub2;Cl&sub2; (1:2 Vol/Vol) während 3 x 3 Minuten in einem 60 ml Reaktionsgefäss auf einen SPPS-Schüttelapparat vorgewaschen. 0,98 g Boc-Gln-4-(oxymethyl)-phenylessigsäure (2,5 mMol, 4 Aequivalente) und 0,38 g HOBt (2,5 mMol, 4 Aequivalente) wurden in 20 ml DMF/ CH&sub2;Cl&sub2; (1:1 Vol/Vol) gelöst und in einem Ro hrchen mit Schraubenverschluss während 3 Minuten bei 0ºC gerührt. 0,52 g DCC wurden in 10 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und zu dem Gemisch zugesetzt. Nach Rühren während 25 Minuten bei 0ºC wurde DCU abfiltriert, und das Filtrat wurde zu der vorgewaschenen Aminomethyl-Folie zugesetzt und während 2 Stunden geschüttelt. Die Folien wurden abfiltriert, mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen, mit DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (5:95 Vol/Vol) neutralisiert, mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und getrocknet. Die Abwesenheit von positiven Ninhydrin-Tests zeigte die quantitative Kupplung, was ebenfalls nach der Entfernung der Boc-Gruppe durch die folgende Behandlung bestätigt wurde: 30 ml TFA/ CH&sub2;Cl&sub2; (1:1 Vol/Vol) während 1 x 2 Minuten und 1 x 30 Minuten, 30 ml CH&sub2;Cl&sub2; während 6 x 1 Minute, 30 ml DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (5:95 Vol/Vol) während 2 x 5 Minuten und 30 ml CH&sub2;Cl&sub2; während 4 x 1 Minute. Zwei Ninhydrin-Tests zeigten sodann, dass das Ausmass an -NH&sub2;- Substitution 0,76 mMol NH&sub2;/g Folie (0,74 bzw. 0,77 imMol/g) betrug, was sehr nahe am theoretischen Wert von 0,78 mMol NH&sub2;/g Folie liegt.

Beispiel 8

Peptidsynthese: (a) Vereinigung von geschütztem menschlichem [Asp&sup7;&sup6;] -Parathyroidhormon-Fragmenten 80-84, 75-84 und 70-84 auf mit 443 Gewichtsprozent Polystyrol gepfropfter Polyäthylen-Folie.
BocGln-OCH&sub2;-Pam-Folie (0,80 g, 443 % Pfropfung, 0,58 mMol GIn) wurde in ein 60 ml Reaktionsgefäss auf einen SPPS-Schüttelapparat verbracht. Geschütztes hPTH 70-84 (siehe Fig. 1) wurde vereint unter Verwendung des folgenden synthetischen Protokolls.
(1) CH&sub2;Cl&sub2;, 35 ml, 3 x 1 Minute;
(2) TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1:1 Vol/Vol), 35 ml, 3 x 1 Minute;
(3) TFA/CH&sub2;Cl&sub2; (1:1 Vol/Vol), 35 ml, 30 Minuten;
(4) CH&sub2;Cl&sub2;, 35 ml, 6 x 1 Minute;
(5) DIEA/CH&sub2;Cl&sub2; (1:19 Vol/Vol), 35 ml, 3 x 2 Minuten;
(6) CH&sub2;Cl&sub2;, 35 ml, 6 x 1 Minute;
(7) 3 bis 10 mg-Proben wurden für die Ninhydrin-Analyse abgeschnitten;
(8) geschützte Aminosäure wurde als vorgebildetes symmetrisches Anhydrid (3 Aequivalente, 0,05 M) in 35 ml DMF/CH&sub2;Cl&sub2; (1:4 Vol/Vol), unter Rühren während 2 Stunden gekuppelt;
(9) CH&sub2;Cl&sub2;, 35 ml, 4 x 2 Minuten;
(10) 3 bis 10 mg -Proben wurden abgeschnitten und durch Wiederholung von (5) und (6) vor der Ninhydrin-Analyse neutralisiert.
Alle Kupplungen waren einzelne Kupplungen. Die Ueberwachung der Synthese unter Verwendung des quantitativen Ninhydrin-Testes [ursprünglich entwickelt für Peptid-Synthese auf Perlen; siehe z.B. Sarin et al., Anal. Biochem. 117, 147 (1981)] wurde mit Erfolg angewendet (Tabelle 5) und mit Ausnahme (aus unbekannten Gründen) des Resultates für die zweite Aminosäure-Kupplung (d.h. mit Bildung von Boc-Ser&sup8;³(Bzl)- Gln&sup8;&sup4;-OCH&sub2;-Pam-Folie) zeigten sich befriegende Werte für die Kupplungswirksamkeit in jeder Kupplungsstufe. TABELLE 5 Quantitative Ninhydrin-Ueberwachunga der Festphasen-Synthese von geschütztem mensachlichem Parathyroidhormon- Fragment (70-84) auf mit 443 Gewichsprozent Polystyrol gepfropftem Polyäthylen Gekuppelter Rest Kupplung Entfernung der Schutzgruppen verbleibende freie Aminogruppen geschätzte Prozent Vollendung gemessene Substitution Theoretische Substitution
a Durchschnittliche Werte beruhen auf 2-4 Ninhydrinanalysen nach Kupplung und Entfernung der Schutzgruppen in jedem Zyklus, ausgedrückt als mMol/g Peptid-Folie.
b Keine Reste wurden wieder gekuppelt, aber die Kupplung von Boc-Ser(Bzl) war gefolgt von der vollständigen Acetylierung verbleibender freier Aminogruppen unter Verwendung von N-Acetylimidazol in Methylenchlorid.
c Diese geschätzten Werte sind berechnet im Verhältnis zu der theoretischen Substitution nach Kupplung des Boc-geschützten Restes, und schliessen die Korrektur für unvollständige Kupplung des vorgängigen Restes nicht ein.
d X = -OCH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-CH&sub2;-COOH
(b) Abspaltung, Reinigung und Identifizierung von synthetischem hPTH-(80-84).
90 mg H-Lys-(ClZ)AlaLys(ClZ)Ser(Bzl)GlnOCH&sub2;-Pam- Folie wurden mit 5 ml wasserfreiem HF/Anisol (9:1 Vol/ Vol) während 1 Stunde bei 0ºC behandelt, um gleichzeitig die Seitenketten von den Schutzgruppe zu befreien und das Peptid von der Folie abzuspalten. Extraktionen mit Aether, um organische Komponenten, wie Anisol und alkylierte Anisole zu entfernen, waren gefolgt von Extraktionen von 10 % wässeriger Essigsäure. Die Lyophilisierung ergab 24,0 mg rohes Produkt von hoher Reinheit [siehe HPLC-Chromatogramm in Fig. 2 (A)].
Das rohe Produkt wurde in zwei Stufen auf einer präparativen C&sub1;&sub8; -Säule (300 x 19 mm) gereinigt. Puffer einschliesslich TFA wurden unter vermindertem Druck verdampft, und das Produkt wurde in Wasser wieder gelöst; die Lösung wurde filtriert und lyophilisiert, um 17,8 mg H-LysAlaLysSerGln-OH zu ergeben, wie durch Aminosäureanalyse (Tabelle 6) und FABMS-Molekularge wichtmessungen (Tabelle 7) bestätigt.
Die gesamte synthetische Ausbeute betrug etwa 84 % und die Ausbeute an reinem Peptid betrug etwa 69 % basierend auf der quantitativen Aminosäureanalyse.
(c) Spaltung, Reinigung und Idenfizierung von synthetischem hPTH-(75-84).
93 mg H-ValAsp(OBzl)ValLeuThr(Bzl)Lys(ClZ)Ala- Lys(ClZ)Ser(Bzl)GlnOCH&sub2;-Pam-Folie wurde auf dieselbe Weise wie für hPTH-(80-84) beschrieben behandelt, wobei 36,6 mg rohes Produkt [siehe HPLC-Chromatogramm in Fig. 2 (B)], und schliesslich 27,2 mg gereinigtes Peptid erhalten wurden, identifiziert durch Aminosäureanalyse (Tabelle 6) und Molekulargewichtsmessung (Tabelle 7). Die gesamte synthetische Ausbeute betrug etwa 85 %, und die Ausbeute an reinem Peptid betrug etwa 69 %, basierend auf der quantitativen Aminosäureanalyse.
(d) Abspaltung, Reinigung und Identifizierung von synthetischem hPTH-(70-84).
Das hPTH-(70-.84)-Fragment wurde von 96 mg der Peptidfolie auf dieselbe Weise, wie in (b) und (c) oben,freigesetzt [siehe HPLC-Chromatogramm in Fig. 2 (C)]. Die gesamte synthetische Ausbeute betrug etwa 83 % und die Ausbeute an reinem Peptid betrug 26 mg (etwa 63 %). Das reine Peptid wurde durch Aminosäureanalyse (Tabelle 6) und Molekulargewichtsmessungen (Tabelle 7) identifiziert. TABLLE 6 Aminosäurezusammensetzung von gereinigten synthetischen hPTH-Verbindungen Aminosäure Molares Verhältnis
Hydrolysen wurden in versiegelten, evakuierten Röhrchen mit 5,7 M HCl, welches 0,05 % Phenol enthielt, bei 110ºC während 20 Stunden durchgeführt. Die Analyse durch HPLC unter Verwendung von fluoreszierendem Nachweis (338/450 nm) anschliessend an die Behandlung (post-Säule) mit einem o-phthaldialdehydderivatisierenden Reagens.
a Werte in Klammern sind theoretisch.
b Thr- und Ser-Werte wurden nicht korrigiert für den Verlust während der Hydrolyse. TABELLE 7 Molekulargewichte von hPTH-Verbindungen Molekulargewicht Peptid gemessen berechnet
Bestimmt durch Quadropol-Masssenspektrometrie. Die berechneten m/z-Werte betragen für C 12,000 u und H 1,008 u.

Beispiel 9

Rasche parallele Synthese von mehreren Peptidanalogen:
(a) Markierung von Folien.
Aminomethylierte, mit 285 Gewichtsprozent Polystyrol gepfropftenPolyäthylen-Folien (0,6 mMol NH&sub2;/g Folie) wurden in 13 einzelne Stücke geschnitten (jedes Stück 1,5 x 3 cm, etwa 50 µm Dicke, etwa 40 mg) und einzeln mit Hilfe von Tinte auf Graphitbasis markiert. Ein Stück Polyäthylenfilm wurde über jede markierte Oberfläche gelegt und unter Verwendung eines elektrisch erhitzten Schweissapparates in die gepfropfte Folie eingeschmolzen. Schliesslich wurden die Folien in 50 % TFA/CH&sub2;Cl&sub2; während 20 Minuten geschüttelt, um zu überprüfen, dass alle Markierungen genügend eingeschweisst waren.
(b) Gleichzeitige Synthese von Melittin-(7-21) und zwölf Analogen auf markierten Folien.
Geschütztes Melittin-(7-21), d.h.
und zwölf Analoge, abgeleitet durch Substitutionen an den Stellungen 12 und 14 (Sequenzen der freien Peptide sind in Fig. 3 aufgelistet) wurden alle stufenweise auf einermarkiertenFolie vereint. Die gemeinsamen Stufen der Entfernung der Schutzgruppen, der Neutralisierung, des Waschens und des Kuppelns von identischen Aminosäuren wurden gleichzeitig in einem einzigen Reaktionsgefäss durchgeführt, während die Kupplung von verschiedenen Aminosäuren in getrennten Gefässen durchgeführt wurde.
Ein Standard-Festphasenverfahren wurde angewandt unter Verwendung von doppelter DCC-Kupplung (3,5 Aequivalente, 0,05 M, in 30 % DMF/CH&sub2;Cl&sub2;) von allen Resten mit Ausnahme Boc-Gln und Boc-Asn, welche doppelt gekuppelt wurden als HOBt-Ester in 30 % DMF/ CH&sub2;Cl&sub2; und Boc-Leu¹³ bis Gln¹&sup4;, welches als ein symmetrisches Anhydrid in 20 % DMF/CH&sub2;Cl&sub2; doppelt gekuppelt wurde.
Nach der Entfernung der N-endständigen Boc- Gruppe erfolgte die Entfernung der Schutzgruppen und die Freisetzung der Peptide von Folien durch die nieder/hoch-HF-Methode [Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105, 6442 (l983)j. Die freien 15-Restpeptide wurden erhalten in Gesamtsynthese-Ausbeuten von ca. 70 %. Fig. 4 zeigt HPLC-Chromatogramme der dreizehn ungereinigten Peptiden. Alle Peptide wurden in 1-2 Stufen auf einer semi-präparativen C&sub1;&sub8;-Säule gereinigt. Als Beispiel wurden 3,2 mg reines Melittin- (7-21) von 1 cm² (23,2 mg) vollgeschützter Peptid- Folie erhalten. Die Identität der Peptide wurde durch Aminosäureanalyse (Tabelle 8) und Molekulargewichtsmessungen (Tabelle 9) überprüft. TABELLE 8 Aminosäurezusammensetzung von gereinigtem Melittin-(7-21) und seinen Analogen Aminosäure Molares Verhältnisa Pept. Fortsetzung der Tabelle 8 Aminosäure Pept
Die Peptide wurden in 5,7 M HCl bei 110ºC während 18 Stunden in versiegelten, nicht-evakuierten Röhrchen hydrolysiert, mit Ausnahme von Peptid 1, welches während 24 Stunden in einem evakuierten Röhrchen hydrolysiert wurde. Nach Filtration wurden die Hydrolysate auf einem Beckmann-6300-Aminosäureanalysator analysiert.
a Werte in Klammern sind theoretisch.
b Thr- und Ser-Werte wurden nicht korrigiert für den Verlust während der Hydrolyse.
c Tryptophan wurde nicht bestimmt.
d Peptid analog Nummer 10 wurde nicht analysiert. TABELLE 9 Molekulargewichte von Melittin-(7-21)-Analogena Peptid Molekulargewicht gemessen berechnet a Bestimmt durch ²&sup5;²Cf-Fissionsfragmentzeit der Flugmassenspektrometrie auf dem Durchschnitt der häufigsten Isotopen. b = gemessen - berechnet.

Claims

1. Verfahren zur Synthese eines Peptids oder eines Proteins, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

A) Bereitstellen eines Polymersubstrats, das mit Polystyrolketten gepfropft ist, wobei die Polystyrolket ten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen, die unter den in der Synthese vorherrschenden Bedingungen nicht reagieren, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten mindestens 200.000 ist, wobei mindestens ein Teil der Polystyrolketten des mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrates mit einer chemischen Funktionalität funktionalisiert sind, welche die Bildung einer verankernden Bindung zwischen dem Polystyrolbestandteil und einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure erleichtert,

B) Kuppeln einer N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure an den funktionalisierten Polystyrolbestandteil, wobei die Funktionalität und die N-geschützte und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierte Aminosäure so aufeinander eingestellt sind, daß die gebildete verankernde Bindung anschließend im wesentlichen ohne Abbau der zu synthetisierenden Peptid- oder Proteinkette gespalten werden kann,

C) Entfernen der N-Schutzgruppe von einer N-geschützten Amino- oder substituierten Aminogruppe der gekuppelten und N-geschützten Aminosäure, so daß die Reaktion der Amino- oder substituierten Aminogruppe der gekuppelten Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder einer aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren Aminosäure erleichtert ist,

D) Umsetzen der Amino- oder substituierten Aminogruppe der zuletzt gekuppelten Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder einer aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure, um eine Peptidbindung zwischen den beiden Aminosäurebestandteiihn zu bilden,

E) gegebenenfalls Entfernen der N-Schutzgruppe von einer N-geschützten Amino- oder substituierten Aminogruppe der zuletzt gekuppelten N-geschützten Aminosäure, so daß die Reaktion der Amino- oder substituierten Aminogruppe der letzteren Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure erleichtert ist,

F) in den Fällen, in denen Schritt E) ausgeführt worden ist, Wiederholen der Schritte D) und E) sooft dies gewünscht ist,

G) gegebenenfalls Entfernen von einigen oder allen Schutzgruppen, die möglicherweise an den Aminosäurebestandteilen der synthetisierten Peptid- oder Proteinkette verblieben sind,

H) gegebenenfalls Spalten der Bindung, welche die synthetisierte Peptid- oder Proteinkette mit dem funktionalisierten Polystyrolbestandteil verankert,

und

I) gegebenenfalls Entfernen jeder weiteren unerwünschten Gruppe von der synthetisierten Peptid- oder Proteinkette.

2. Verfahren zur Synthese von einem oder mehreren Peptiden oder Proteinen, welches, wenn zwei oder mehrere Peptide oder Proteine synthetisiert werden sollen, die parallele und im wesentlichen gleichzeitige Synthese der gewünschten Anzahl von Peptiden und Proteinen ermöglicht, wobei das Verfahren umfaßt:

A) Bereitstellen einer Vielzahl von im wesentlichen identischen Polymersubstraten, die mit Polystyrolketten gepfropft sind, wobei die Polystyrolketten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen, die unter den in der Synthese vorherrschenden Bedingungen nicht reagieren, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß der gegebenenfalls vorhandenen Substituenten, mindestens 200.000 beträgt, wobei mindestens ein Teil der Polystyrolketten von jedem mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrat mit einer chemischen Funktionalität funktionalisiert sind- welche die Bildung einer verankernden Brücke zwischen den P0lystyrolbestandteilen und einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure erleichtert,

B) gegebenenfalls das physikalische Auftrennen der Mitglieder der Vielzahl von mit Polystyrol gepfropften Polymersubstraten in zwei oder mehrere Gruppen, von denen jede eines oder mehrere Mitglieder der Vielzahl umf aßt, Kuppeln einer N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure an die funktionalisierten Polystyrolbestandteile jedes Mitglieds der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitglieds jeder Gruppe, wobei die eingesetzte N-geschützte und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierte Aminosäure für alle Mitglieder der Vielzahl oder, soweit anwendbar, alle Mitglieder einer Gruppe identisch ist, und, soweit anwendbar, darüber hinaus mit einer der folgenden Alternativen übereinstimmt:

i) identisch für alle Gruppen,

ii) wenn die Anzahl der Gruppen größer als zwei ist, identisch für mindestens zwei der Gruppen,

iii) verschieden für jede Gruppe,

wobei die Funktionalität und die N-geschützte und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierte Aminosäure so aufeinander eingestellt sind, daß die gebildete verankernde Bindung anschließend in wesentlichen ohne Abbau der zu synthetisierenden Peptid- oder Proteinkette gespalten werden kann,

C) Behandeln jedes Mitglieds der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitglieds jeder Gruppe, um die N-Schutzgruppe von einer N-geschützten Amino- oder substituierten Aminogruppe der gekuppelten und N-geschützten Aminosäure zu entfernen, so daß die Reaktion der Amino- oder substituierten Aminogruppe der gekuppelten Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder einer aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure erleichtert ist,

D) Umsetzen der Amino- oder substituierten Aminogruppe der Aminosäure, die zuletzt an die funktionalisierten Polystyrolbestandteile jedes Mitglieds der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitglieds jeder Gruppe gekuppelt worden ist, mit einer Carboxylgruppe oder einer aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure, so daß eine Peptidbindung zwischen der Amino- oder substituierten Aminogruppe und der Carboxylgruppe oder aktivierten Carboxylgruppe gebildet wird, wobei die weitere N-geschützte Aminosäure für alle Mitglieder der Vielzahl oder, soweit anwendbar, alle Mitglieder einer Guppe identisch ist und, soweit anwendbar, ferner mit einer der drei oben im Zusammenhang mit Schritt B) erwähnten Alternativen übereinstimmt,

E) gegebenenfalls Behandeln jedes Mitglieds der Vieizahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitglieds jeder Gruppe, um die N-Schutzgruppe von einer N-geschützten Aminooder substituierten Aminogruppe der zuletzt gekuppelten N-geschützten Aminosäure zu entfernen, so daß die Reaktion der Amino- oder substituierten Aminogruppe der letzteren Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder aktivierten Carboxylgruppe einer weiteren N-geschützten Aminosäure erleichtert ist,

F) in den Fällen, in denen Schritt E) ausgeführt worden ist, Wiederholen der Schritte D) und E), sooft dies gewünscht wird,

G) gegebenenfalls Behandeln jedes Mitglieds der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitglieds jeder Gruppe, um einige oder alle Schutzgruppen zu entfernen, die möglicherweise an den Aminosäurebestandteilen der synthetisierten Peptid- oder Proteinkette verblieben sind,

H) gegebenenfalls Behandeln jedes Mitglieds der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitglieds jeder Gruppe, um die Bindung zu spalten, welche die synthetisierte Peptid- oder Proteinkette mit den funktionalisierten Polystyrolbestandteilen jedes Mitglieds der Vielzahl oder, soweit anwendbar, jedes Mitglieds jeder Gruppe verankert,

und

I) gegebenenfalls Entfernen jeder weiteren unerwünschten Gruppe von einer synthetisierten Peptid- oder Proteinkette.

3. Verfahren zur Herstellung eines mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrats, welches ein Peptid oder Protein trägt, welches darauf synthetisiert worden ist, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt:

A) Bereitstellen eines mit Polystyrolketten gepfropften Polymersubstrats, wobei die Polystyrolketten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen, welche unter den in der Synthese vorherrschenden Bedingungen nicht reagieren, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten, mindestens 200.000 beträgt, wobei mindestens ein Teil der Polystyrolketten des mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrats mit einer chemischen Funktionalität funktionalisiert sind, welche die Bildung einer verankernden Bindung zwischen dem Polystyrolbestandteil und einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure erleichtert,

B) Kuppeln einer N-geschützten und gegebenenfall5 am Carboxylende derivatisierten Aminosäure an den funktionalisierten P0lystyrolbestandteil, wobei die Funktionalität und die N-geschützte und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierte Aminosäure so aufeinander eingestellt sind, daß die gebildete verankernde Bindung anschließend im wesentlichen ohne Abbau der zu Synthetisierenden Peptid- oder Proteinkette gespalten werden kann,

D) Umsetzen der Amino- oder substituierten Aminogruppe der zuletzt gekuppelten Aminosäure mit einer Carboxylgruppe oder einer aktivierten Carboxylgruppe ei ner weiteren N-geschützten Aminosäure, um eine Peptidbindung zwischen den zwei Aminosäurebestandteilen zu bilden,

F) in den Fällen, in denen Schritt E) ausgeführt worden ist, Wiederholen der Schritte D) und E), sooft dies gewünscht ist,

und

G) gegebenenfalls Entfernen von einigen oder allen Schutzgruppen, die möglicherweise an den Aminosäurebestandteilen der synthetisierten Peptid- oder Proteinkette verblieben sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin eines der mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrate durch eine im wesentlichen radikal-gestartete Reaktion zwischen dem Polymersubstrat und gegebenenfalls substituiertem Styrolmonomer, welches in einer Lösung des Monomers in einem organischen Lösungsmittel vorhanden ist, gebildet wurde.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das organische Lösungsmittel, welches verwendet wurde, um das gegebenenfalls substituierte Styrolmonomer aufzulösen, ein Alkohol ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Alkohol Methanol ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Volumenprozentsatz (% Vol./Vol.) von gegebenenfalls substituiertem Styrol in der Lösung, welche verwendet wurde, so ist, daß 25 < % Vol./Vol. < 35.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten, ohne Einschluß von gegebenenfalls vorhandenen Substituenten, im Bereich von 300.000 bis 1.600.000 liegt.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das mit Polystyrol gepfropfte Polymersubstrat aus einem Polymersubstrat in Form einer Folie oder eines Films mit einer Dicke im Bereich von 25 bis 100 µm gebildet worden ist, und das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 5 bis 800 Gew. -% liegt.

10. Verfahren nach Anspruch 9f worin das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 100 bis 600 Gew.-% liegt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das mit Polystyrol gepfropfte Polymersubstrat in Form einer Folie oder eines Films vorliegt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das mit Polystyrol gepfropfte Polymersubstrat aus einem Polymersubstrat in Form einer Kugel, eines Pellets, einer Scheibe, eines Rings, eines Rohrs, eines Stabs oder eines Netzes hergestellt wurde.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die chemische Funktionalität, welche die Bildung einer verankernden Bindung zwischen einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls derivatisierten Aminosäure und dem funktionalisierten Polystyrolbestandteil erleichtert

ein chlor-, brom- oder iod-substituiertes Alkyl,

ein amino-substituiertes Alkyl,

ein amino- und aryl-substituiertes Alkyl,

ein amino- und alkylaryl-substituiertes Alkyl, oder

ein hydroxy-substituiertes Alkyl

ist oder davon abgeleitet ist, wobei die Funktionalität, falls sie von einem dieser abgeleitet ist, eine Funktionalität mit einer Abstandshaltergruppe ist, so daß eine synthetisierte Peptid- oder Proteinkette von dem Polystyrolbestandteil im wesentlichen ohne Abbau der Kette abgespalten werden kann.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin die chemische Funktionalität, welche die Bildung einer verankernden Bindung erleichtert,

Chlormethyl,

Aminomethyl,

α-Aminobenzy1,

α-Amino-2-, α-Amino-3- oder α-Amino-4-methylbenzyl, oder

Hydroxymethyl

ist oder davon abgeleitet ist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Polymer ein Polyolefin ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin das Polyolefin Polyethylen ist.

17. Peptid- oder Protein-tragendes mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat, welches durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 16 hergestellt ist.

18. Polymersubstrat, welche- mit Polystyrolketten gepfropft ist, und an welches ein Peptid oder Protein gekuppelt ist, wobei die Polystyrolketten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen, welche unter den in der Peptidsynthese vorherrschenden Bedingungen nicht reagieren, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten mindestens 200.000 ist, wobei mindestens ein Teil der Polystyrolketten des mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrats eine verankernde Bindung tragen, über die das Peptid oder Protein gekuppelt ist.

19. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 18, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten im Bereich von 300.000 bis 1.600.000 liegt.

20. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 18 oder 19, welches aus einem Polymersubstrat in Form einer Folie oder eines Films mit einer Dicke im Bereich von 25 bis 100 µm hergestellt wurde, und in welchem das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 5 bis 800 Gew.-% liegt.

21. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 20, worin das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 100 bis 600 Gew.-% liegt.

22. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach einem der Ansprüche 18 bis 21, welches in Form einer Folie oder eines Films vorliegt.

23. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 18 oder 19, welches aus einem Polymersubstrat in Form einer Kugel, eines Pellets, einer Scheibe, eines Rings, eines Rohrs, eines Stabs oder eines Netzes hergestellt wurde.

24. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach einem der Ansprüche 18 bis 23, worin das Polymer ein Polyolefin ist.

25. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 24, worin das Polyolefin Polyethylen ist.

26. Polymersubstrat, das mit Polystyrolketten gepfropft ist, wobei die Polystyrolketten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen, die unter den in der Peptidsynthese vorherrschenden Bedingungen nicht reagieren, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten mindestens 200.000 ist, wobei mindestens ein Teil der Polystyrolketten des mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrats mit einer chemischen Funktionalität funktionalisiert sind, welche die Bildung einer verankernden Bindung zwischen dem Polystyrolbe standteil und einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure erleichtert.

27. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 26, worin das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten im Bereich von 300.000 bis 1.600.000 liegt.

28. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 26 oder 27, welches aus einem Polymersubstrat in Form einer Folie oder eines Films mit einer Dicke im Bereich von 25 bis 100 µm hergestellt wurde, und in welchem das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 5 bis 800 Gew.-% liegt.

29. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 28, worin das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 100 bis 600 Gew.-% liegt.

30. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach einem der Ansprüche 26 bis 29, welches in Form einer Folie oder eines Films vorliegt.

31. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 26 oder 27, welches aus einem Polymersubstrat in Form einer Kugel, eines Pellets, einer Scheibe, eines Rings, eines Rohrs, eines Stabs oder eines Netzes hergestellt wurde.

32. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach einem der Ansprüche 26 bis 31, worin die chemische Funktionalität, welche die Bildung einer verankernden Bindung zwischen einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls derivatisierten Aminosäure und dem funktionalisierten Polystyrolbestandteil erleichtert,

ein chlor-, brom- oder iod-substituiertes Alkyl,

ein amino-substituiertes Alkyl,

ein amino- und aryl-substituiertes Alkyl,

ein amino- und alkylaryl-substituiertes Alkyl, oder

ein hydroxy-substituiertes Alkyl

ist oder davon abgejeitet ist, wobei die Funktionalität, wenn sie von einem dieser abgeleitet ist, eine Funktionalität mit einer Abstandshaltergruppe ist, so daß eine synthetisierte Peptid- oder Proteinkette von dem Polystyrolbestandteil im wesentlichen ohne Abbau der Kette abgespalten werden kann.

33. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 32, worin die chemische Funktionalität, welche die Bildung einer verankernden Brücke erleichtert,

Chlormethyl,

Aminomethyl,

α-Aminobenzyl,

α-Amino-2-, α-Amino-3-, oder α-Amino-4-methylbenzyl, oder

Hydroxymethyl

ist oder davon abgeleitet ist.

34. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 32 oder 33, worin die Funktionalität von einem aminogruppenhaltigen Bestandteil abgeleitet ist, der ausgewählt ist aus: amino-substituiertem Alkyl; amino- und aryl-substituiertem Alkyl; und amino- und alkylarylsubstituiertem Alkyl; und die Funktionalität eine Abstandshaltergruppe umfaßt, die abgeleitet ist von einer niederen 4-(Halogenalkyl)aryl-alkansäure, einer niederen Boc-aminoacyl-4-(oxymethyl)-aryl-alkansäure, einem N-Boc-p-acylbenzhydrylamin, einem N-Boc-4'-nieder-alkyl- p-acylbenzhydrylamin, einem N-Boc-4'-nieder-alkoxy-p- acylbenzhydrylamin oder einer niederen 4-Hydroxymethylphenoxy-alkansäure.

35. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach einem der Ansprüche 26 bis 34, worin das Polymer ein Polyolefin ist.

36. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 35, worin das Polyolefin Polyethylen ist.

37. Verfahren zur Herstellung eines funktionalisierten, mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrats nach einem der Ansprüche 26 bis 36, umfassend das Unterziehen eines in eine Lösung aus gegebenenfalls substituiertem Styrolmonomer in einem organischen Lösungsmittel eingetauchten Polymersubstrats einer Behandlung, die zur Bildung von freien Radikalen führt, so daß Polystyrolketten auf das Polymersubstrat aufgepfropft werden, und das Funktionalisieren von mindestens einem Teil der Polystyrolketten mit einer chemischen Funktionalität, welche die Bildung einer verankernden Bindung zwischen dem Polystyrolbe standteil und einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure erleichtert.

38. Verfahren zur Herstellung eines mit Polystyrolketten gepfropften Polymersubstrates, an welches eine mindestens N-geschützte Aminosäure gekuppelt ist, wobei die Polystyrolketten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen, die unter den in der Peptidsynthese vorherrschenden Bedingungen nicht reagieren, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten mindestens 200.000 ist, wobei mindestens ein Teil der Polystyrolketten des mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrats eine verankernde Bindung tragen, über welche die mindestens N-geschützte Aminosäure gekuppelt ist, wobei das Verfahren umfaßt das Unterziehen eines in eine Lösung von gegebenenfalls substituiertem Styrolmonomer in einem organischen Lösungsmittel eingetauchten Polymersubstrats einer Behandlung, welche zur Bildung von freien Radikalen führt, so daß Polystyrolketten auf das Polymersubstrat aufgepfropft werden, das Funktionalisieren von mindestens einem Teil der Polystyrolketten mit einer chemischen Funktionalität, welche die Bildung einer verankernden Bindung zwischen dem Polystyrolbestandteil und einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls am Carboxylende derivatisierten Aminosäure erleichtert, und das Reagierenlassen der Funktionalität, so daß eine verankernde Bindung zu einer mindestens N-geschützten Aminosäure gebildet wird.

39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, worin die Behandlung, die zu der Bildung von freien Radikalen führt, Gammabestrahlung ist.

40. Verfahren nach Anspruch 39, worin die Gammabestrahlung durchgeführt wird unter Verwendung einer Gammastrahlungsdosisleistung von etwa 300 bis etwa 1000 Gy/Stunde.

41. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 40, worin das organische Lösungsmittel ein Alkohol ist.

42. Verfahren nach Anspruch 41, worin der Alkohol Methanol ist.

43. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 42, worin der Volumenprozentsatz (% Vol./Vol.) von gegebenenfalls substituiertem Styrol in der Lösung so ist, daß 25 < % Vol./Vol. < 35.

44. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 43, worin das Pfropfen so durchgeführt wird, daß sich ein geschätztes Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer aufgepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten im Bereich von 300.000 bis 1.600.000 ergibt.

45. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 44, worin das Polymersubstrat in Form einer Folie oder eines Films mit einer Dicke im Bereich von 25 bis 100 µm vorliegt, und das Pfropfen so durchgeführt wird, daß sich ein Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 5 bis 800 Gew. -% ergibt.

46. Verfahren nach Anspruch 45, worin das Pfropfen so durchgeführt wird, daß sich ein Ausmaß der Polystyrolketten pfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 100 bis 600 Gew. -% ergibt.

47. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 44, worin das Polymersubstrat in Form einer Folie oder eines Films vorliegt.

48. Verfahren nach Anspruch 47, worin das Polymersubstrat eine Dicke von 25 bis 100 µm hat.

49. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 44, worin das Polymersubstrat in Form einer Kugel, eines Pellets, einer Scheibe, eines Rings, eines Rohrs, eines Stabs oder eines Netzes vorliegt.

50. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 49, worin die chemische Funktionalität, welche die Bildung einer verankernden Bindung zwischen einer mindestens N-geschützten und gegebenenfalls derivatisierten Aminosäure und dem funktionalisierten Polystyrolbestandteil erleichtert

ein chlor-, brom- oder iod-substituiertes Alkyl,

ein amino-substituiertes Alkyl,

ein amino- und aryl-substituiertes Alkyl,

ein amino- und alkylaryl-substituiertes Alkyl, oder

ein hydroxy-substituiertes Alkyl

ist oder davon abgeleitet ist, wobei die Funktionalität, wenn sie von einem dieser abgeleitet ist, eine Funktionalität mit einer Abstandshaltergruppe ist, so daß eine synthetisierte Peptid- oder Proteinkette von dem Polystyrolbestandteil im wesentlichen ohne Abbau der Kette abgespalten werden kann.

51. Verfahren nach Anspruch 50, worin die chemische Funktionalität, welche die Bildung einer verankernden Bindung erleichtert,

Chlormethyl,

Aminomethyl,

(α-Aminobenzyl,

α-Amino-2-, (α-Amino-3- oder α--Amino-4-methylbenzyl, oder

Hydroxymethyl

ist oder davon abgeleitet ist.

52. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, worin die Funktionalität abgeleitet ist von einem aminogruppenhaltigen Bestandteil, ausgewählt aus: amino-substituiertem Alkyl; amino- und aryl-substituiertem Alkyl; und amino- und alkylaryl-substituiertem Alkyl; und die Funktionalität behandelt wird, um die Funktionalität mit einer Abstandshaltergruppe zu versehen, die abgeleitet ist von einer niederen 4-(Halogenalkyl)aryl-alkansäure, einer niederen Boc-aminoacyl-4-(oxymethyl)aryl-alkansäure, einem N-Boc-p-acylbenzhydrylamin, einem N-Boc-4'-niederalkyl-p-acylbenzhydrylamin, einem N-Boc-4'-niederalkoxy-p-acylbenzhydrylamin oder einer niederen 4-Hydroxymethylphenoxy-alkansäure.

53. Verfahren nach einem der Ansprüche 37 bis 52, worin das Polymer ein Polyolefin ist.

54. Verfahren nach Anspruch 53, worin das Polyolefin Polyethylen ist.

55. Polymersubstrat, gepfropft mit Polystyrolketten und an das eine mindestens N-geschützte Aminosäure gekuppelt ist, wobei die Polystyrolketten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen, die unter den in der Peptid-Synthese vorherrschenden Bedingungen nicht reagieren, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten mindestens 200.000 beträgt, wobei mindestens ein Teil der Polystyrolketten des mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrats eine verankernde Bindung tragen, über welche die mindestens N-geschützte Aminosäure gekuppelt ist.

56. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 55, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten im Bereich von 300.000 bis 1.600.000 liegt.

57. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 55 oder 56, welches aus einem Polymersubstrat in Form einer Folie oder eines Films mit einer Dicke im Bereich von 25 bis 100 µm hergestellt wurde, und in welchem das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 5 bis 800 Gew. -% liegt.

58. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 57, worin das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 100 bis 600 Gew.-% liegt.

59. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach einem der Ansprüche 55 bis 58, welches in Form einer Folie oder eines Films vorliegt.

60. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 55 oder 56, welches aus einem Polymersubstrat in Form einer Kugel, eines Pellets, einer Scheibe, eines Rings, eines Rohrs, eines Stabs oder eines Netzes hergestellt wurde.

61. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach einem der Ansprüche 55 bis 60, worin das Polymer ein Polyolefin ist.

62. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 61, worin das Polyolefin Polyethylen ist.

63. Polymersubstrat, welches mit Polystyrolketten gepfropft ist, wobei die Polystyrolketten gegebenenfalls weiter Substituenten tragen, wobei das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten mindestens 200.000 ist.

64. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 63, worin das geschätzte Peak-Molekulargewicht der auf das Polymer gepfropften Polystyrolketten ohne Einschluß gegebenenfalls vorhandener Substituenten im Bereich von 300.000 bis 1.600.000 liegt.

65. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 63 oder 64, welches aus einem Polymersubstrat in Form einer Folie oder eines Films mit einer Dicke im Bereich von 25 bis 100 µm hergestellt wurde, und in welchem das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 5 bis 800 Gew. -% liegt.

66. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 65, worin das Ausmaß der Polystyrolkettenpfropfung des Polymersubstrats im Bereich von 100 bis 600 Gew.-% liegt.

67. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach einem der Ansprüche 63 bis 66, welches in Form einer Folie oder eines Films vorliegt.

68. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 63 oder 64, welches aus einem Polymersubstrat in Form einer Kugel, eines Pellets, einer Scheibe, eines Rings, eines Rohrs, eines Stabs oder eines Netzes hergestellt wurde.

69. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach einem der Ansprüche 63 bis 68, worin das Polymer ein Polyolefin ist.

70. Mit Polystyrol gepfropftes Polymersubstrat nach Anspruch 69, worin das Polyolefin Polyethylen ist.

71. Verwendung eines Peptid-tragenden, mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrats nach einem der Ansprüche 17 bis 25 in einem analytischen Verfahren als lichtdurchlässiges Trägermaterial, welches die spektralphotometrische Verfolgung einer Antigen/Antikörperreaktion erleichtert, wobei das Antigen ein Peptid ist, welches auf dem mit Polystyrol gepfropften Polymersubstrat synthetisiert wurde und daran verankert bleibt.

72. Verwendung nach Anspruch 71, wobei die Verfolgung die Verwendung einer ELISA-Methode nach sich zieht.