DE1593880A1

DE1593880A1 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number: DE1593880A1
Application number: DE19671593880
Authority: DE
Inventors: Wissmann Dipl-Chem Dr Hans; Geiger Dipl-Chem Dr Rolf; Siedel Dipl-Chem Walter
Original assignee: Farbwerke Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1967-06-16
Filing date: 1967-06-16
Publication date: 1970-10-29
Also published as: CH512439A; NL6808183A; GB1234982A

Description

Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Es ist bekannt, Peptide an geeigneten, chemisch modifizierten, vernetzten Polystyrolen, die als unlösliche Trägersubstanzen dienen, schrittweise aufzubauen. Das Aminosäure- bzw. Peptidmolekiil, das während der Synthssereaktion mit seiner Carboxylgruppe esterartig am vernetzten Polystyrol gebunden ist, wird bei diesem Syntheseverfdren stufenweise verlängert (Merrifield: Biochemistry "JJ, 13Ö5 (196'O, vgl. auch Federation Proc. JU ^li 12 (I962) u. J. Am. Chem. Soc. _8^, 21^9 (I963))· Dieses Verfahren weist in Verbindung mit zahlreichen chemischen Umsetzungen eine sehr große. Zahl von Piltrationsschrltten auf. So erfordert beispielsweise die Synthese des Bradykinin (Merrifield, vgl. oben) I90 Filtrationen, wobei die Filtrationsgeschwindigkeit stark variiert, und zwar in Abhängigkeit vom Vernet'zungsgrad des Polystyrols, der Korngröße des-

sej-ben, den verwendeten Lösungsmitteln, der Basizität des Reaktionsmilieus und schließlich der einmischen Natur und der Kettenlänge des synthetisierten Peptids. Eine große Rolle spielt dabei die Quellung der Polystyrol-Partikel.

Im allgemeinen nimmt die Filtrationsgeschwindigkeit der ' Suspension der Peptid-Kunsthar^verbindung init steigender Kettenlänge des Peptids und mit steigender Beladung des ' Kunstharzes stark ab. Da die Filt'rationszeiten weiterhin mit der chemischen Natur der synthetisierten Peptidstufe in quantitativ nicht vorausberechenbarer Weise variiert, stellt die wechselnde und vor allem bei der Herstellung höherer Peptide zuweilen sehr geringe Filtriergeschwindigkeit - auch bei Anwendung des automatischen Verfahrens nach Merrifield (Science 150, S. (1965)) - eine erhebliche Erschwerung dieser Synthese dar.

Nach Merrifield (vgl. Science IgO ₁ S. I78 (I965)) befindet sich nur ein kleiner Teil der am vernetzten Polystyrol gebundenden Peptidkette auf der äußeren Oberfläche desselben. Der durch die Quellung des Polystyrolkornes geschaffene Raum im Inneren ist begrenzt. Bei der Synthese längerer Peptidketten muß deshalb mit sterischen Behinderungen der wachsenden Peptidkette gerechnet werden.

Es wurde nun gefunden, daß man die beschriebene Synthese auch mit an der Oberfläche mit Polystyrol gepfropften Folien oder Granulaten aus Kunststoffen, wie z.B. Polyäthylen oder Polyäthylenglykol-terephthalat ausführen kann· Die chemisch gebundene Polystyrolschicht auf,den Kunststoffträgern ist in gleicher Weise wie das nach Merrifield verwendete vernetzte Polystyrol den für die Synthese erforderlichen Umsetzungen zugänglich, besitzt

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jedoch nicht die oben erwähnten Nachteile der nach Merrifield verwendeten vernetzten Per£lpolymerisate.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden an festen Phasen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man durch eine Pfropf-Reaktion mit chemisch gebundenem Polystyrol beschichtete Kunststoff-Oberflächen, zweckmäßig die Oberflächen von Folien, Granulaten oder geeignet ausgebildeten dünnwandigen Formkörpem, st.B* vom Typ der Raschigringe, zur Festphasen-Peptidsynthese verwendet.

Das Verfahren gemäß der Erfindung bietet gegenüber den bisher bekannten Methoden der Festkörper-Peptidsynthese u.a folgende Vorteile:

Bei Verwendung von kleingeschnittenen gepfropften Folien und Formkörpern im bisherigen ansatzweisen Verfahren wird eine wesentlich höhere FiItriergeschwindigkeit erzielt, die während der ganzen Synthese konstant bleibt. Die bisher üblichen Glasfritten können bei geeigneter Formgebung der Synthese-Granulate bzw. Folien oder Formkörper durch Gitter, bzw. Lochplatten oder Schlitzplatten ersetzt werden. - Bei Verwendung von Folien kann der Filtrationsschritt auch durch einfaches Herausnehmen der Folie aus der betreffenden Lösung ersetzt werden*

Die Verwendung von Folien gestattet ferner die Durchführung der Synthese als kontinuierliches Verfahren, bei dem die Folie in der in Zeichnung 1 dargestellten Weise die hintereinander geschalteten Synthese- und Waschbäder passiert, wobei "die Verweilzeiten der Folie in den mitVeinzelnen Reaktionslösungen gefüllten Be-

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- k - Fw

hältern durch den Folienweg ( = Verweilzeit) im Reaktionsbehälter der erforderlichen Umsetzungszeiten angepaßt werden können.

Die Reaktionszeiten für die Herstellung der für die Synthese erforderlichen Acylaminosäure-Kunstharzver-

Jien .
bindungen sind, wie ausYgraphischen Darstellung (2) hervorgeht, bei Verwendung der erfindungsgemäßen Folien kleiner als bei der bisherigen Verfahrensweise.

Der räumliche Aufbau der,Pfropfpolymerisate trägt durch das Fehlen von Vernetzungsstellen in den Polystyrol-Kettenmolekülen den sterischen Verhältnissen bei der Synthese von langen Polypeptidketten Rechnung.

Die Herstellung der Pfropfpolymerisate erfolgt in der üblichen Weise (vgl. z.B. llouben-Weyl, Methoden der Organ.Chemie, Bd. I⁷L/!, S. 82⁷H G. Greber, Makromolekulare Chemie Bd. 101 (I967), S. 1O⁷L-!⁷*⁷!) zum Beispiel durch Umsetzen der mit UV-Licht, "J^-Strahlen , Elektronenstrahlen oder auch mit Ozon vorbehandelten Kunststoffe mit Styrol bei 60-Ö0°C:

Geeignete Kunstharze im Sinne der vorliegenden Erfindung sind solche, die in organischen Lösungsmitteln wie Eisessig, Dimethylformamid, Dimethylacetamid und. in niederen aliphatischen Chlorkohlenwasserstoffen sowie in Benzol und Styrol bei Zimmertemperatur oder mäßig erhöhter-Temperatur praktisch unlöslich sind, an der Oberfläche keine wesentlichen Mengen an acylierbaren Gruppen enthalten und bei Raumtemperatur gegenüber wasscsrfreier Salzsäure, Bromwasserstoff säure und Trifluoressigsäure über einen begrenzten Zeitraum (mindestens 3Stdn.) stabil sind.

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Die Pfropfreaktion wird ioi allgemeinen: bei Temperaturen von O-85 C, vorzugsweise bei 6O<-So C durchgeführt._% Die Reaktionszeiten betragen l/k bis 20 Stunden. Die während dieser Zeit aufgepfropfte Polystyrolmenge liegt, je nach der Reaktionsteinpe'ratur,, Reaktionszeit, Art und Intensität der Aktivierung der Folie zwischen 5 und mehreren 100 % des Foliengewi chutes.- ■ ; - - ··■ - ,

Die Polymerisate werden bei Raumtemperatur oder mäßi^g erhöhter Temperatur nach der Pfropfreaktion durch gründliches Waschen mit geeigneten Lösungsmitteln von· homopolynieren Styrol befreit. Geeigne-te Lösungsmittel hierzu sind z.B.Benzol, Methylenchlorid, und niedere aliphatische Chlorkohlenwasserstoffe. ■·..--

Das getrocknete Polymere wird dann mit Halogenmethylmethyl-äther, vorzugsweise mit Ohlormethyl-methyläther und Zinn IV-chlorid in bekannter Weise (Merrifield, Biochemistry 31(!96A) S. I388) halogenmethyliert, bzw. chlormethyliert und dann in der dort beschriebenen Weise in Acy'laminosäure-KunststOffderivate und Acylpeptid-Kunststoffderivate übergeführt. Die Abspaltung des fertigen Acylpeptids vom Pfropfpolymeren erfolgt bei in Trifluoressigsäure unlöslischen Pfropfpolymeren wie bei Merrifield beschrieben. Bei in Trifluoressigsäure löslichen Pfropfpolymeren werden Peptid und Pfropfpolymeres nach dem Abdampfen der Trifluoressigsäure-Lösungen durch Verteilung in geeigneten Lösungsmitteln (z.B. 2-ehlorphenol/Wasser bei Polyäthylenglykoltherephthalat-Polystyröl-Pfropfpolymeren) getrennt.

Wird die Peptidsynthese an Folien durchgeführt, so können diese entweder in kleingeschnittener Form wie beschrieben

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ο ο ο η

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ansatzweise verarbeitet werden, wobei die Abmessungen der Folienstücke jeweils wenige Millimeter betragen. Es können jedoch auch ganze Folienstreifen in die jeweilige Reagenzlösung eingehängt werden, bzw. in der schon beschriebenen Weise durch in der Reihenfolge ihrer Anwendung hintereinander geschalteten -Synthe.se-. und-Waschbäder gezogen werden.

Eine Reagenzien sparende Anordnung zur Umsetzung von ganzen Folien zeigt die Zeichnung 3· Hier wird die Folie durch zwei Glasplatten zwischen zwei mit den Synthesereagenz abgefeuchtete Papierstreifen gepreßt.

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Beispiel 1

α) Pfropfpolymerisation von Styrol auf Polyäthylenfolie

Mit ^Strahlen aus einer CogQjf-Strahlenquelle werden 100 cm einer 0,05 mm starken Hochdruckpolyäthylen-Fοlie bestrahl. (Gesamtdosis 10 Megarad). Anschließend wird die Folie unter Stickstoff in 2OO ml Styrol 5 Stunden auf 80°C erwärmt und nach Entnahme aus der viskosen Styrol-Polystyrol-Mischung zur Entfernung von Styrol und Homopolymerisat 5 Stunden im Soxhlet-Apparat mit Essigsäureäthylester extrahiert. Dann wird im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Gewichtszunahme der Folie betrug 110 %. Eine in derselben Weise behandelte Niederdruckpolyäthylen-Folie gleicher Stärke zeigte etwa 2O % Gewichtszunahme.

b) Pfropfpolymerisation von Styrol auf Polyäthylenglykolterephthalat-Folie

In einem zylindrischen Reaktionsgefäß wurden 6, j'i g einer 0,1 mm dicken Polyäthylen-terephthalat-Folie, die zuvor 2 Stunden in üblicher Weise mit Ozon behandelt worden war, in 350 g Styrol unter Stickstoff IO Stunden bei 8o°C gehalten. Anschließend wurde, wie unter a) beschrieben, aufgearbeitet. Die Menge des aufgepfropften Polystyrols betrug 2.h % der Einwaage.

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b_ft) Pfropfpolymerisation von Styrol auf ejLner Verbundfolie aus Polyäthylenglykol-terephthalat und Polyäthylen.

Eine Verbundfolie (lÖÖ/* Polyäthylen auf 50 /u Polyäthylenglykol-terephthalat) wurde wie unter 1 a) beschrieben bestrahlt, und dann 2,5 Stunden'bei 80 mit Styrol umgesetzt. Anschließend wird wie unter la) beschrieben aufgearbeitet und getrocknet. Die Gewichtszunahme durch aufgepfropftes Polystyrol betrug 21 %.

c) Chlormethylierung

JU Die unter b) beschriebene gepfropfte Folie wurde in Streifen von 6 cm Breite und 8 cm Länge geschnitten, mehrfach in Längsrichtung gefaltet und in einem mit Magnetrührer und Chlorcalcium-Trockenrohr ausgestatteten zylindrischen Glasgefäß 1 Stunde lang unter 50 ml Chlorinethyl-methyläther gerührt. Dann wurde auf 0°C abgekühlt und eine bei 0°C bereitete Lösung von 0,9 g Zinntetrachlorid in 25 ml Chlormethyl-methyl-äther zugegeben. Anschließend wurde noch 1/2 Stunde bei 0 C unter Feuchtigkeitsausschluß nachgerührt. Schließlich ließ man das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen. Nach Entnahme aus dem Reaktionsgemisch wurden die Folien nacheinander mit Üioxan/Vasser, Dioxan/3nSalzsäure, Dioxan, Methanol und wasserfreiem Äther gewaschen und hierauf bei Raumtemperatur im Vakuum getrocknet. Chlorgehalt: 2,8 %, entsprechend 0,79 mMol Chlor pro g Folie.

Polyäthylenß) Die Chlormethylierung der unter a) genanntenYFolie wurde

in gleicher Weise durchgeführt und lieferte Produkte mit einem Chlorgehalt von 9,3 %.

« Die Chlormethylierung der unter 1 b,ß, genannten Verbundfolie (nach Ic/ durchgeführt) lieferte ein Produkt mit 5,3 % Cl (=» 1,5 MiBimol Chlormethylgruppen/g Folie.

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ORIGINAL

_ 9 - ^Fw

Beispiel 2

BOC-Gly-Kunstharzverbindung

a) Mit chlormethylierter Polyäthylenfolie

In einer Lösung von 95 nig BOC-Gly-Lithiumsalz in 5 ml Dimethylformamid wurden 2^0 mg der unter lc,ß)beschriebenen Folie suspendiert und bei 80°C gerührt. Nach 10, 20, und l8o Minuten wurden Proben der Folie entnommen und jeweils hintereinander dreimal je 3 Minuten lang unter Rühren mit 10 ml Äthanol, Wasser und Methanol suspendiert und filtriert. Anschließend wurde im Vakuum über Phosphor· pentoxid getrocknet. Die aus eingewogenen Mengen dieser Folien durch saure Hydrolyse, wie bei Merrifield, Biochemistry 3, I385i (196%),"beschrxeben.wieder in Freiheit gesetzten Aminosäuremengen wurden bei diesem und den folgenden Versuchen im, Unichrora-Aniinosäureanalysator (Beckman) quantitativ bestimmt. Die Hydrolysenbedingungen waren wie folgt: 18 Stunden Dioxan/Konz. HCl 1:1, 110°C Einschlußrohr, Filtrieren, Abdampfen i.V. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle"zusammengefaßt: i

Reaktionszeit (Min.): 10 ²⁰ 75 I80

uMol/mg Aminosäure- ι

Kunstharzverbindung: 0,02 0,07 0,275 O,68o

b) Mit choriuethylierter Polyäthyleo-terephthalat-Folie.

Wie vorstehend werden 3g der unter 1 c) beschriebenen Folie mit einer Lösung von 3 MolBOC-Gly-Iiithiumsalz in 10 ml Dimethylformamid umgesetzt. Die folgende Tabelle gibt die Umsätze und Reaktionszeiten wieder i\ ■

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BAD ORIGINAL ¹¹ /10

gebundene BOC-Aminosäure

Zeit (Stdn.) Mol/mg mMol/m² Folie

1	0,019
2	0,026
4	O,o4o
7 1/2	0,066
28	0,084

2,86

5,88 9,20

11,90

c) Mit einer chlormethylierten Verbundfolie aus Polyethylenterephthalat und Polyäthylen

Die Umsetzung der unter 1 cfli beschriebenen chlormethylierten Verbundfolie mit BOC-Glycin-Lithimssalz wie unter Beispiel 2 a) beschrieben, jedoch mit einer Ujaaetzungszeit von 4,5 Stunden bei 80° C lieferte ein Produkt mit 0,525 Millimol BOC-Glycin /g Folie.

Beispiel 3

α) BOC-Ala-Kunstharzverbindung

3 g der unter Ic ^beschriebenen ctilorsiethylierten PoIyäthylen-Polie wurden wie oben (Beispiel 2 a) ausgeführt, mit 28 ml einer O_t34 molaren Lösung von BOC-Ala-^ithiumsalz

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W —~

in Dimethylformamid umgesetzt. Die Reaktionszeiten und Umsätze waren wie folgt:

Zeit (Min.) Mol/mg gebundene DOC- niMol/m Folie

Aminosäure

45 0,402 . 98,5

HO 0,588 67,4

230 1,500 252,0

b) BOC-Ala-Kunstharzverbindung

Eine nach 1 c^hergestellte chlormethylierte und mit Styrol geprppfte Polyäthylen-terephthalat-Folie wird wie in Zeichnung 3 beschrieben zwischen 2 Filtrierpapiere (Schleicher & Schüll 2O43 b MgI) gelegt, die mit je 1 mi 0,5-m BOC-Alanin-methyldicyclohexylaminsalzlösung eingefeuchtet sind. Anschließend werden Papierstreifen und Folie, wie aus der Zeichnungyersichtlich, zwischen zwei Glaspaltten zusammengepreßt und in einem Trockenschrank auf 80 C erhitzt. Um die Lösungsmittelverluste durch Verdunstung auszugleichen, wird über die heraushängenden Teile der beiden Papierstreifen aus einem Vorratsgefäß Dimethylformamid zugeführt (siehe Zeichnung"3) .Nach Beendigung der Reaktion wird die Folie entnommen,Jeweils dreimal mit 10 ml Äthanol, Wasser und Methanol gewaschen und getrocknet. Aminosäuregehalt: 0,063 mMol/g = 10,5 mMol/ni .

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Beispiel h

BOC-Leu-Kun sth arzverb indung

Zu der Lösung von 2,1 inMol t^BGC-Leu-Methyl-dicyclohexyleminsalz; in 10 ml Dimethylformamid wurden 3 S unter 1 c^>) beschriebenen chlorine thylier ten Polyäthylen* terephthalat-Folie in Kleingeschnittener Form gegeben» Dann wurde unter Rühren 6 Stunden auf 00 C «rhitasi« Anschließend ^iurde» wie im Beispiel J> ti) beschrieben, auf gearbeitet * Ausbeute 2^7 g Folie >
0,127 fAMol/tng BOC-Leu-lCunstharKverbindung.

Beispiel 5

BOC-Phe-Kunstharzverbindung

In einer Lösung von I₁A g t-BOC-Phenylalanitt-methyl-dicyclo· hexyl-aminsaljz > in 10 ml Dimethylformamid wurden 'i,Ö g der chlormethylierteh Polio aus Beispiel 1 c)u^)suependlert und 0 Stunden bei 80°G gehalten. Anschließend wurde, wie im Beispiel gabeschrieben, auf gearbeitet. Aminos Hur ».gehalt: 0,232 fiMol/mg BOC-Phe-Kunatharaverbindung»

Beispiel 6

Nitrophenylsulfenyl-Leu-61y~Kunötharzverbindung (ä

In 5 ml einer In Lögung von wasserfreier Salzsäure in Eia-

eiirer

esaig wurden 150 mr /nach Beispiel 2 a) hergestellten und kleingeschnittenen BOC-Gly».Folie (mit einem Aminosäuregehal t von 1,05 j*uöl/uift.> suspendiert. Nach i/2-stUrtdigöni Kühron

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BAD ORSGifMAL

hei Raumtemperatur wurde vom Lösungsmittel abgesaugt, und dreimal mit je 5 |ul Eises.sig unter jeweils drei-

vSchüttein undanschließendem minUtigen^"Dekantieren gewaschen. Dann wurde in gleicher Weise mit Äthanol und mit Methylenchlorid erewaschen.

Igen

Anschließend wurde 10 Minuten mit einer ') % Lösung von Lithiuiii-trichlorphenolat in Methylenchlorid (10 ml) gerührt» Nach Absaugen wurde die HpN-Gly-Kiinstharzverbindung dreimal mit je 5 ml Methylenchlorid gewaschen und dann unter Rühren in einer Lösung von 232 mg (= 1 inMol) NPS-Leucin in 5 ml MethylenChlorid suspendiert. Nach 10 Minuten wurden 210 mg Üicyclohexylcarbodiiniid zugesetzt, nach zweistündigem Rühren abgesaugt und wie oben beschrieben mit Äthanol und anschließend mit Methylenchlorid gewaschen. Schließlich wurde im Vakuum über Ι^₂^ς bei 6o getrocknet. Auswaage ΐ6θ mg. Aminosäureanalyse: GIy: 0,77Ο MMol/mg Kunstharzverbindung

Leu: 0,728 jUMol/mg " "

Beisjiiel 7

H₀N-LeU-GIy-OH.HBr

Die Abspaltung des Peptide vom Kunstharz orTolgte, wie bei Merrii'iold, Biochemistry 3.» 13Ö5 ( 196'i) , beschrieben, mit einer Losung von wasserfrei um Bromwasserstoff in Trifluoressigsäure unter Durchleiten von Bromwaasorstoffgae. Nach Abdampfen der Trifluoreßsigsäurelösung hinterblieb das papier ehr oma Lo graph i«ch ei nhe i tlicfi e Dipeptid-JIydrobromid (Rf ^ 0,20 tin ijyabem Pyridin/Wasser 1:1).

Beispiel ü

8AO LeU-GIy-NH₀ ,Ali

_ ,—^l Π C) 9 8 Λ A / 1 7 7 8

aus Beispiel 6 100 mg d.e-r l'ep tid-Kunetharzverbindung^^wur den

Γ; Ο J J

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in 20 ml flüssigem Ammoniak bei Raumtemperatur in einem Glas-Kleinautoklaven der Firma Schott & Gen. mit einem Magnetrührer 20 Stunden gerührt. Nach Kühlung auf -35°C wurde der Autoklav geöffnet und das Ammoniak bei. Normaldruck unter allmählichem Erwärmen auf Raumtemperatür vorsichtig abgedampft. Dann wurde über P₀O im Vakuum getrocknet, in 5 ml einer O₁2 η Lösung von wasserfreier Salzsäure in wasserfreiem Diäthyläther aufgenommen und 20 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend wurde im Vakuum bei Raumtemperatur abgedampft. Der Rückstand enthielt das papier-chromatographisch einheitliche Dipeptidamid-Hydrochlorid. (R = 0,78 im System Pyridin/ Wasser 1:1).

00984 47 177 B- _{ßAD 0H|G},_NAL ^/15

Claims

US

Paten t a η s ρ r ii c h e

1} Verfahren zur Herstellung von Peptiden an festen Phasen, dadurch, gekeimzeidmet , daß man durch eine Pfropfreaktion iuit chemisch gehundeneiii Polystyrol beschichtete Kunststoff~ oberflächen zur Festphasen-Peptldsynthese verwendet,
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kujik ist off οία er fläch en solche von Folien, Granulaten oder dünnwandigen Formkörporii verwendet.
3) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Formkörper vom Typ der Raschigringe verwendet.

9:8 4.47 1 77 8-

gAD

.Jb.

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