FI102833B - Menetelmä peptidin tai proteiinin syntetisoimiseksi ja menetelmässä kä yttökelpoinen polystyreeniketjuilla oksastettu polymeerisubstraatti - Google Patents

Description

, 102833

Menetelmä peptidin tai proteiinin syntetieoimiseksi ja menetelmässä käyttökelpoinen polystyreeniketjuilla oksastettu polymeerisubstraätti 5 Keksinnön ala Tämä keksintö koskee menetelmää ja kiinteää substraattia peptidien ja proteiinien syntetisoimiseksi kiin-teäfaasitekniikalla korkealla saannolla ja korkealla puhtaudella. Menetelmä sopii hyvin sekä yksittäisen peptidin 10 tai proteiinin synteesiin että rinnakkaiseen ja oleellisesti yhtäaikaiseen näiden suuren joukon synteesiin. Erityisesti keksintö koskee menetelmää, jossa käytetään polystyreeniketjuilla oksastettua polymeerisubstraattia kiinteänä alustana, jotka polystyreeniketjut mahdollisesti 15 lisäksi kantavat substituentteja, jotka eivät ole reaktiivisia vallitsevissa synteesiolosuhteissa, ja joiden arvioitu molekyylipaino, mahdollisia substituentteja lukuun ottamatta, on ainakin 200 000. Keksinnössä käytetään tavanomaista kemiallista metodologiaa ja se on helposti so-20 vellettavissa sekä analyyttisen (mikrogramma) että prepa-ratiivisen (milligramma tai suurempi) asteen synteesiin. Edelleen keksintö on sovellettavissa sekä erä- että jat-kuvavirtausmenetelmiin, jotka suoritetaan manuaalisesti, puoliautomaattisesti tai täysin automaattisesti. Keksintö 25 koskee lisäksi edellä kuvatun polystyreenillä oksastetun polymeerisubstraatin käyttöä analyyttisessä menetelmässä valoa läpäisevänä kantajana.

Keksinnön taustaa

Nykyiset kiinteäfaasimenetelmät peptidien ja prote-30 iinien synteesejä varten perustuvat suuresti alkuperäiseen metodologiaan, jonka kehitti Merrifield ja jossa käytetään funktionalisoituja ristisidottuja styreeni/divinyylibent-seenisekapolymeerejä, jolloin ristisidotut sekapolymeerit on muodostettu polymeroimalla styreenimonomeeriä, johon on 35 lisätty muutama prosentti (tyypillisesti noin 2 %) divi- 2 102833 nyylibentseeniä. Tämä sekapolymeeri tarjotaan yleensä helmien tai jyvien muodossa, usein 20 - 80 μτη:η vallitsevalla partikkelikoolla. Alunperin Merrifieldin [katso esim. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)] edullinen funktionalisoin-5 ti oli sekapolymeerin aromaattisten renkaiden funktionali-sointi kloorimetyyliryhmien kanssa, jotka liitettiin kiinteän sekapolymeerin reaktiolla SnCl4/kloorimetyylimetyyli-eetterin kanssa, vaikka lukuisia muita funktionaalisia ryhmiä, mukaan lukien aminometyyli, α-aminobentsyyli ja 10 a-amino-4-metyylibentsyyli, on käytetty jälkeenpäin. Funktionaalisuuden luonteesta huolimatta sen tarkoitus on tavallisesti muodostaa ankkuroiva sidos sekapolymeerin kiinteän alustan ja ensimmäisen aminohapon C-päätteen välille, joka halutaan kytkeä kiinteään alustaan. Uudemmat Merri-15 fieldin metodologian parannukset ovat käsittäneet edelleen liittämisen polystyreeniketjussa olevan funktionaalisuuden (esim. yksi edellä mainituista funktionaalisuuksista) ja ensimmäisen kytkettävän aminohapon päätehiilen välille bi-funktionaalisen "spacer"- tai "handle"-ryhmän, joiden 20 reaktiivisuus räätälöidään inter alia saavuttamaan halutut vaatimukset suhteessa sekä ensimmäisen aminohapon kytkemiseen kiinteään alustaan ja/tai helpottamaan toimenpidettä, jolla valmis, syntetisoitu peptidi- tai proteiiniketju irrotetaan kiinteästä alustasta. Esimerkkejä tällaisista 25 spacer-ryhmistä ovat fenyyliasetamidometyyli (Pam) ja p-alkoksibentsyyliesterisysteemit. Tuoreen katsauksen, joka käsittelee kiinteäfaasipeptidisynteesimenetelmän kehitystä lähtien sen esittämisestä Merrifieldin taholta, on antanut Barany et ai. [Int. J. Peptide Protein Res. 30, 30 705-739 (1987)].

Viimeaikainen kehitys biotekniikassa, erityisesti rekombinatti-DNA:n alueella, on tuottanut ainutlaatuisen tilanteen: monien uusien proteiinisekvenssien, joilla on määrittelemätön tai tuntematon funktio ja/tai tuntematon 35 biologinen aktiivisuus, saatavuus ja nopea kasvu. Yksi- 3 102833 tyiskohtainen rakenneanalyysi paikka-ohjatulla mutagenee-silla tai samantapaisella molekyylitekniikalla on tarjonnut käyttökelpoisen lähestymisen koskien aminohapporyhmien rooleja proteiinien aktiivissa kohdissa.

5 Kuitenkin erityistä informaatiota koskien biologi sesti aktiivisia, funktionaalisia noin 5-40 aminohappo-ryhmää sisältäviä alayksikköjä saadaan edullisesti kemiallisen synteesin kautta. Nykyinen kiinteäfaasiteknologia on aivan riittävä tuottamaan sellaisia peptidejä luotettavas-10 ti ja korkealla puhtaudella, mutta kiinteäfaasipeptidisyn-teesin tavanomaiset menetelmät "lineaarisen" lähestymis-muodon kautta tuottavat vain yhtä peptidiä synteesiä kohti .

Menetelmä, joka käyttää "samanaikaista" tai "rin-15 nakkaista" lähestymismuotoa peptidien synteesiin, on siten haluttua, siten helpottaen suurien määrien peptidien valmistusta, joita voidaan käyttää määrittelemään ja kartoittamaan proteiinien funktionaalisia kokonaisuuksia.

Peptidisynteesinkiinteäfaasitekniikan perusominai-20 suus on se, että kussakin peptidiketjun pidennyksessä toisen aminohapon kanssa kaikki käsittelyvaiheet ovat edellisen kierron kertausta mahdollisesti lukuun ottamatta aminohapon kytkeytymisvaihetta itsessään, jossa toinen aminohappo, joka voi olla tai ei ole identtinen sen kanssa, 25 joka kytkettiin edeltävässä kierrossa, kytketään peptidi-ketjuun. Siten rinnakkainen, oleellisesti samanaikainen useamman kuin yhden peptidin synteesi voidaan saavuttaa käyttämällä rinnakkain toistuvia vaiheita, kuten suojauksen poisto, neutralointi ja pesu, jotka ovat yleisiä rin-30 nakkaisille synteeseille. Suurin tekninen vaikeus on kun kin aminohappojen kytkemisvaiheen lokeroinnin saavuttaminen siten, että ristikontaminaatiota ei tapahdu.

Kahta erilaista menetelmää on äskettäin ehdotettu oleellisesti lukuisten peptidien samanaikaiseen syntee-35 siin: « 102833

Ensimmäinen näistä menetelmistä [Geysen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 81, 3998-4002 (1984) ja 82, 178-82 (1985)] suunniteltiin nopeaan peptidiepitooppien seulontaan ELISA-.n (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 5 avulla 96-mikrotitrauskuopissa. Se käyttää hyväksi akryy-lihappolla oksastettua polyeteenisauvaa ja 96-mikrotit-rauskuoppaa immobilisoimaan kasvavia peptidiketujuja ja suorittamaan lokeroitu synteesi. Menetelmä on hyvin tehokas, mutta sitä ei kuitenkaan voi ole soveltaa preparatii-10 visessa mittakaavassa, siis milligrammamäärien valmistamiseen. Toinen menetelmä [Houghten, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 5131-35 (1985)] käyttää hyväkseen "teepussia", joka sisältää perinteisesti käytettyjä polymeerihelmiä synteesin lokeroimiseksi, jolloin osa peptidyylihartsihel-15 mistä pidetään erillään suljetuissa hienoseulaisissa poly-propyleeniverkkopusseissa. Jälkimmäinen menetelmä sopii milligrammamäärien valmistukseen.

Rinnakkaisen ja oleellisesti samanaikaisen suuren peptidijoukon synteesin sallivan menetelmän viimeisiä etu-20 ja ovat ajansäästö ja se, että vältytään ylenpalttisesta toistuvasta työstä, jota sisältyy kunkin peptidin synteesin itsenäiseen suorittamiseen.

Lyhyt keksinnön kuvaus Tämä keksintö käsittää kaikki edulliset kummankin 25 edellä mainitun menetelmän aspektit ja lisäksi tarjoaa jo mainittuja etuja halutun/haluttujen peptidi(e)n tai proteiini (e)n valmistamisessa korkealla saannolla ja korkealla puhtaudella, ja se on yhtä hyvin sovellettavissa sekä analyyttisen että preparatiivisen mittakaavan synteesei-30 hin. Keksintö hyödyntää suuresti tutkimusta rakenne-aktii-visuussuhteista, sellaisia tutkimuksia kuin antigeenisten epitooppien kartoitus, hormonireseptori-vuorovaikutukset ja farmakologisesti aktiivisten peptidyylilääkkeiden seulonta, ja on myös suuressa arvossa tutkimuksissa, jotka 5 102833 koskevat proteiinien fuktionaalisten alaryhmien molekylaa-rista organisaatiota yleensä.

Keksintö perustuu kiinteän alustan hankkimiseen ja käyttöön, joka alusta käsittää polymeerisubstraatin, johon 5 on oksastettu pitkiä ja oleellisesti ei-ristisidottuja po-lystyreeniketjuja, jotka näissä olosuhteissa ja todennäköisesti sen ansiosta, että niihin on steerisesti helppo päästä, toimivat erityisen tehokkaana kiinteäfaasikantajana syntetisoitaville peptideille.

10 Keksintö käyttää hyväkseen ei-ristisidottujen poly- olefiinien, esimerkiksi polyeteenin, liukenemattomuutta kaikkiin orgaanisiin liuottimiin ympäristön lämpötilassa. Koska oksastettu polymeeri on yhä termoplastista ainetta ja liukoinen kohotetuissa lämpötiloissa, uudelleenmuotoilu 15 on myös mahdollista.

Lyhyt kuvioitten kuvaus

Kuvio 1. Suo j auskaavio [Asp76]-hPTH-fragment in (70-84) kiinteäfaasikokoonpanoa varten 443 paino-% polystyree-nillä oksastetun polyeteenin pinnalla.

20 Kuvio 2. Analyyttiset HPLC-kromatogrammit seuraa- vista: (A) raaka H-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH, (B) raaka H-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH ja (C) raaka H-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH, μΒ0ΝΌΑΡΑΚ™-018:11a (300 x 3,9 mm, 10 μιη) . Puskuri 25 A: H20/ 0,0 9 5 % CF3C00H; puskuri B: 90 % asetonitriili/10 % H20/0,72 % CF3COOH; virtausnopeus 1,3 ml/min.

Kuvio 3. Mellitiini-(7-21):n ja mellitiini-(7-21)-analogien aminohapposekvenssit.

Kuvio 4. Raakojen mellitiini-(7-21):n ja analogien 30 analyyttiset HPLC-kromatogrämmien matala/korkea HF-poista- . misen jälkeen (ennen lyofilisointia). Kromatogrammi 1 on raa'alle mellitiini-(7-21):lie, siis peptidille 1, kromatogrammi 2 on raa'alle peptidille 2, jne. Puskuri A: 5 % CH3CN/95 % H20/0,0445 % TFA; puskuri B: 60 % CH3CN/40 % 35 H20/0,03 90 % TFA; lineaarinen gradientti: 5 - 95 % B:tä a 6 102833 30 minuutissa; virtausnopeus 1,5 ml/min; koi onni: Vydac C18 (0,46 x 25 cm).

Yksityiskohtainen keksinnön kuvaus

Keksintö koskee siten polystyreeniketjuilla oksas-5 tettua polymeerisubstraattia, jolle on tunnusomaista, että polystyreeniketjut mahdollisesti lisäksi sisältävät subs-tituentteja, jotka eivät ole reaktiivisia peptidisyntee-sissä vallitsevissa olosuhteissa, jolloin mahdollisia substituentteja lukuun ottamatta kaikkien polymeerien ok-10 sastettujen polystyreeniketjujen arvioitu molekyylipaino on ainakin 200 000 ja ainakin osa polystyreenillä oksastetun polymeerisubstraatin polystyreeniketjuista on funktio-nalisoitu kemiallisella funktionaalisuudella, joka helpottaa ankkuroivan sidoksen muodostumista polystyreeniosan ja 15 ainakin N-suojatun ja mahdollisesti karboksyylipäätteestä derivatisoidun aminohapon välillä.

Keksintö koskee myös menetelmää peptidin tai proteiinin syntetisoimiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että 20 A) tarjotaan polymeerisubstraatti, joka on oksas tettu polystyreeniketjuilla, jotka mahdollisesti lisäksi kantavat substituentteja, jotka eivät ole reaktiivisia vallitsevissa synteesiolosuhteissa, jolloin mahdollisia substituentteja lukuun ottamatta oleellisesti kaikkien po-25 lymeeriin oksastettujen polystyreeniketjujen arvioitu molekyylipaino on ainakin 200 000 ja ainakin osa polystyreenillä oksastetun polymeerisubstraatin polystyreeniket juista on funktionalisoitu kemiallisella funktionaalisuudella, joka helpottaa ankkuroivan sidoksen muodostusta polysty-30 reeniosan ja ainakin N-suojatun ja mahdollisesti karbok-syylipäätteestä derivatisoidun aminohapon välillä, B) kytketään N-suojattu ja mahdollisesti karboksyy-lipäätteestä derivatisoitu aminohappo funktionalisoituun polystyreeniosaan, jolloin funktionaalisuus ja N-suojattu 35 ja mahdollisesti karboksyylipäätteestä derivatisoitu ami- 7 102833 nohappo ovat sopivia toisiinsa siten, että muodostunut ankkuroiva sidos voidaan myöhemmin poistaa oleellisesti ilman syntetisoitavan peptidi- tai proteiiniketjun hajoamista, 5 C) poistetaan N-suojaryhmä kytketyn ja N-suojatun aminohapon N-suojatusta amino- tai substituoidusta amino-ryhmästä siten, että kytketyn aminohapon amino- tai subs-tituoidun aminoryhmän reaktiota toisen aminohapon karbok-syyliryhmän tai aktivoidun karboksyyliryhmän kanssa helpo-10 tetaan, D) saatetaan viimeksi kytketyn aminohapon amino-tai substituoitu aminoryhmä reagoimaan toisen N-suojatun aminohapon karboksyyliryhmän tai aktivoidun karboksyyli-ryhmän kanssa siten, että peptidisidos muodostuu kahden 15 aminohappo-osan välille, E) mahdollisesti poistetaan N-suojaryhmä viimeksi kytketyn N-suojatun aminohapon N-suojatusta amino- tai substituoidusta aminoryhmästä siten, että jälkimmäisen aminohapon amino- tai substituoidun aminoryhmän reaktiota 20 toisen N-suojatun aminohapon karboksyyliryhmän tai akti voidun karboksyyliryhmän kanssa helpotetaan, F) niissä tapauksissa, joissa vaihe E) suoritetaan, toistetaan vaiheet D) ja E) haluttu määrä kertoja, G) mahdollisesti poistetaan jotkin tai kaikki suo- 25 jaryhmät, jotka mahdollisesti ovat jäljellä syntetisoidun peptidi- tai proteiiniketjun aminohappo-osissa, H) mahdollisesti poistetaan syntetisoidun peptidi-tai proteiiniketjun ja funktionalisoidun polystyreeniosan välinen ankkuroiva sidos, 30 ja I) mahdollisesti poistetaan mikä tahansa muu ei-ha-luttu ryhmä syntetisoidusta peptidi- tai proteiiniketjus-ta.

Ilmaus polymeerisubstraatti tässä yhteydessä käy-35 tettynä merkitsee mitä tahansa sopivaa polymeeriä, joka 8 102833 voidaan oksastaa kuten kuvattiin ja joka sinänsä on oleellisesti liukenematon synteesissä käytettyyn reaktiovällaineeseen ja inertti sen suhteen. Sopivia polymeerejä voidaan valita esimerkiksi seuraavista: polyamidit, kuten 5 nailon, polyimidit, poly(paraksylyleenit), poly(halogeeni-fluorialkaanit), kuten poly(tetrafluorieteeni) tai poly-(klooritrifluorieteeni), fenoli-formaldehydipolymeerit ja polyolefiinit, kuten polypropyleeni ja polyeteeni. Poly-meerisubstraatit voidaan muodostaa mihin tahansa sopivaan 10 muotoon, esimerkiksi levyksi, kalvoksi, helmeksi, pelletiksi, laataksi, renkaaksi, putkeksi, sauvaksi tai verkoksi. Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edullisissa toteutusmuodoissa peptidin tai proteiinin syntetisoimiseksi polymeerisubstraatti on pienitiheyksistä polyeteeniä levyn 15 tai kalvon muodossa, vaikka kokeet osoittavat (vide infra), että suuritiheyksinen polyeteeni on myös sopiva.

Polymeerisubstraattiin oksastetut polystyreeniket-jut voivat olla itse polystyreenistä muodostettua tai käsittävät polystyreeniä, joka on substituoitu jossakin mää-20 rin substituenteilla, jotka eivät ole reaktiivisia vallitsevissa synteesiolosuhteissa. Sopivia substituentteja voivat olla esimerkiksi alkyylisubstituentit, kuten metyyli, etyyli, propyyli tai butyyli, alkoksisubstituentit, kuten metoksi, etoksi, propoksi tai butoksi, tai aryylioksisubs-25 tituentit, kuten fenoksi. Substituutio on edullisesti substituutio aromaattisiin renkaisiin yhdellä tai kahdella substituentilla, esimerkiksi yksi tai useampi edellä mainituista substituenteista, vaikka substituutio ei-aromaat-tisiin vinyyliryhmästä peräisin oleviin hiiliatomeihin voi 30 myös olla kuviteltavissa. Tämän keksinnön mukaisen menetelmän edullisissa toteutusmuodoissa peptidin tai proteiinin syntetisoimiseksi, kun polymeerisubstraatti on näissä tapauksissa polyeteeni, oksastetut polystyreeniketjut ovat substituoimattoman polystyreenin ketjuja.

9 102833

Uskotaan olevan erityisen edullista, että polymee-risubstraattiin oksastetut polystyreeniketjut ovat mole-kyylipainoltaan, mahdollisia polystyreeniketjuissa läsnäolevia substituentteja lukuun ottamatta, ainakin 200 000.

5 Toisessa tämän keksinnön mukaisessa näkökulmassa polystyreeniket jut, jotka täyttävät tämän edellytyksen, voidaan sopivasti muodostaa oleellisesti radikaali-indusoidussa reaktiossa polymeerinsubstraatin ja valinnaisesti substi-tuoidun styreenimonomeerin, jota on läsnä monomeerin 10 liuoksessa orgaanisessa liuottimessa, välillä. Kokeet ovat osoittaneet (vide infra), että kun polyeteenilevy tai -kalvo oksastetaan polystyreeniketjuilla olosuhteissa, joissa polyeteenilevy tai -kalvo upotetaan styreenimonomeerin liuoksiin liuottimessa, kuten metanoli, jolloin 15 konsentraatio voi vaihdella ja radikaali-indusoitu reaktio aikaansaadaan γ-säteilyllä, tapahtuu sekä oksastusta että oksastamattornien (siis vapaiden) polystyreeniketjujen muodostusta. Kun tällä hetkellä ei ole ilmeistä, suoraa tietä määrittää tarkasti oksastettujen polystyreeniketjujen mo-20 lekyylipainoa, muodostuneiden oksastamattornien polysty reeniket jujen molekyylipaino voidaan helposti määrittää esimerkiksi niin kutsutulla "koon perusteella poissulkevalla kromatografiällä". On havaittu, että kun käytetään puhdasta styreenimonomeeriä, jolloin siis metanolia ei ole 25 läsnä, tietyissä γ-säteilyolosuhteissa muodostuvien, levyn suljettujen (ja siitä dikloorimetaanilla uutettujen) ok-sastamattomien polystyreeniket jujen (ilmaistaan tämän jälkeen "homopolymeerinä") molekyylipaino on enimmäkseen noin 180 000, ja että hallitseva homopolymeerin molekyylipaino 30 kasvaa styreenimonomeeri/metanoli-liuoksen metanolipitoi- suuden kasvaessa; esimerkiksi 70:30 (v/v) metanoli/styreeni -suhteessa hallitseva molekyylipaino (M^) on noin l 000 000.

Tulokset, jotka saatiin polystyreenillä oksastetul-35 la polyeteenilevyllä eri oksastusasteella, antavat vahvoja 10 102833 merkkejä siitä, että levyyn suljetun homopolymeerin ja oksastettujen polystyreeniketjujen molekyylipainot vastaavat toisiaan melko hyvin, kuten seuraavassa selitetään tarkemmin : 5 Koon perusteella poissulkevalla kromatografiällä saadaan yhdisteiden molekyylipainon ja retentiotilavuuden välinen suhde, niin kutsuttu "kalibrointikäyrä". Tietyn fraktion, esimerkiksi polystyreenihomopolymeerin, molekyy-lipaino tietyllä retentiotilavuudella määritetään vertai-10 lemalla retentiotilavuuksia tunnettuun molekyylipainon omaavien polystyreenivakioiden retentiotilavuuksiin. Kuitenkin, koska saatavilla ei ole tunnetun molekyylipainon omaavia polystyreenillä oksastettuja polyeteenivakioita, parasta mitä voidaan tehdä on vertailla polystyreeniva-15 kioiden retentiotilavuuksia samoissa liuosolosuhteissa.

Oksastettu levy, homopolymeeri ja polystyreeniva-kiot voidaan liuottaa, esimerkiksi kuumaan ksyleeniin, ja useissa sellaisissa kokeissa eniten läsnäolevan homopolymeerin fraktion (Mpeak) havaittiin olevan noin 1 000 000. 20 Mpejjj-arvo, joka saatiin polystyreenillä oksastetulle poly- eteenilevylle edellä mainitun vertailun perusteella polystyreenivakioiden retentiotilavuuksilla oli noin 3 000 000 ja ylöspäin [voi olettaa, että tietty osuus yksittäisistä polyeteeniketjuista voidaan oksastaa useammalla kuin yh-25 dellä polystyreeniosalla, ja polystyreenillä oksastetulle polyeteenille edellä olevalla tavalla määritetty M^-arvo voi siten olla samanlainen tai korkeampi kuin vastaavalle okklusoidulle polystyreenihomopolymeerille].

Muita todisteita edellä kuvatun molekyylipainon ar-30 viointimenetelmän oikeellisuudesta voidaan myös johtaa edellä mainituista kokeista seuraavasti:

Tietyn fraktion, i, runsaus, ni# molekyylipainolla Mj on suhteessa jakaantumiskäyrän korkeuteen retentiotila-vuudessa, joka vastaa Mj:tä. Niin katsottu "painollinen 35 keskiarvomolekyylipaino", Mw, määritellään kaavalla: „ 102833 Μ„ = Σ rij x Mj2 / Σ rij x Mj, kun taas niin kutsuttu "numerollinen keskiarvomolekyyli-paino", M„, määritellään kaavalla: 5 Μη = ΣηίχΜι/Ση|

Nykyinen teoria, joka koskee radikaali-indusoitua polymerisaatiota ennustaa Mw/M„-suhteeksi ("polyhajaantu-10 vuus") 2,0. Arvo noin 2 löydettiin homopolymeerille, ja polystyreenillä oksastetulle polyeteenille löydetty arvo oli noin 2, mikä voidaan pitää osoituksena siitä, että polystyreeniketjut, jotka on oksastettu polyeteenisubstraattiin, ovat kasvaneet olennaisesti samalla tavalla kuin 15 homopolymeeri, antaen siten lisää uskoa edellä hahmotel tuun molekyylipainon arviointimenetelmään. Arvioidut mo-lekyylipainot, jotka mainitaan tässä selityksessä ja vaatimuksissa, arvioitiin edellä kuvatulla tavalla.

Siten uskotaan, että muodostettujen okkludoitujen 20 homopolymeerien molekyylipainot läheisesti heijastavat määrätyissä olosuhteissa (liuotin, styreenikonsentraatio, lämpötila, 7-säteilyn intensiteetti ja γ-säteilyn kesto) samoissa olosuhteissa muodostuneiden oksastettujen polystyreeniket juj en molekyylipainoja, ja homopolymeerille 25 määritetyt molekyylipainot on siten otettu oksastettujen polystyreeniketjujen molekyylipainon arvioiksi.

Uskotaan myös, että oksastuskohtien tiheyteen poly-meerisubstraatin pinnalla, siis polystyreeniket jujen kiinnityskohtien lukumäärä yksikköpinta-alaa kohti, kuten myös 30 oksastettujen polystyreeniketjujen määrään, vaikuttavat vahvasti oksastusolosuhteet, erityisesti oksastusproses-sissa käytettävän orgaanisen liuottimen luonne. Hydroksyy-liä sisältävät orgaaniset liuottimet, erityisesti alkoholit, kuten metanoli, ovat suhteellisen hydrofiilisiä ja 35 pidetään siten heikkoina liuottimina, joita voidaan valita 102833 12 liuottamaan suhteellisen hydrofobisen substanssin, kuten styreenimonomeerin. Siten monomeerin solvatoinnin aste sellaisessa liuottimessa odotetaan olevan suhteellisen alhainen verrattaessa solvatoinnin asteeseen, joka olisi 5 odotettavissa enemmän hydrofobisesti orgaanisen liuottimen kanssa, esimerkiksi halogenoidun alifaattisen hiilivedyn, kuten dikloorimetaanin kanssa (diklooriimetaani on edullinen reaktioliuotin kiinteäfaasipeptidisynteesimetodolo-giassa, sekä yleisesti että tämän keksinnön yhteydessä). 10 Uskotaan, että huono oksastettujen polystyreeniketjujen paisuminen tai solvatoituminen liuottimessa, kuten metano-lissa, oksastusprosessin aikana pitää kasvavien polystyreeniket jujen liikkuvuutta alhaisena ja johtaa siten diffuusion kontrolloiman ketjunlopetusprosessin hidastumiseen 15 ja edesauttaa siten erityisen pitkien polystyreeniketjujen kasvua.

Oksastettujen polystyreeniket juj en korkean molekyy-lipainon miellyttävä piirre tämän keksinnön yhteydessä on se, että kun ne funktionalisoidaan, niiden voidaan otaksua 20 käyttäytyvän, suhteessa niiden reaktiivisuuden osalta liuenneita reagensseja kohti, hyvin suuresti niin kuin ne olisivat oksastamattomia (siis vapaita) funktionalisoituja polystyreeniketjuja homogeenisessa liuoksessa; helppous, jolla tämän keksinnön mukaan muodostetut funktionalisoi-25 dut, oksastetut polystyreeniketjut voivat reagoida liuenneiden reagenssien kanssa, mukaan lukien suojattujen ja valinnaisesti derivatisoitujen aminohappojen kanssa, voidaan siten pitää optimaalisena. Ilmeinen huomattava ris-tisidosten puuttuminen polystyreeniketjuissa, jotka on 30 oksastettu polyolefiiniin, helpottaa laajaa ketjujen paisumista tai solvatoitumista kloorihiilivetyliuottimessa (tämän keksinnön edullisessa toteutusmuodossa dikloorime-taani) kuten yleensä on edullista kiinteäfaasipeptidisyn-teeseissä. Kuten aikaisemmin mainittiin, tavanomaisissa 35 "Merrifield-tyyppiseen" metodologiaan perustuvissa kiin- 9 13 102833 teäfaasipeptidisynteesimenetelmissä, käytetty kiinteä tuki on tavallisesti funktionalisoitu ristisidottu styreeni/di-vinyylibentseenisekäpolymeeri, joka on muodostunut styree-nimonomeerin polymerisoinnilla, johon monomeeriin on li-5 sätty muutama prosentti (tyypillisesti noin 2 %) divinyy-libentseeniä. Tämä ristisitominen vähentää funktionalisoi-dun sekapolymeerimatriisin paisumisen tai solvatoitumisen astetta suhteessa siihen, joka vallitsee tämän keksinnön mukaisesti muodostuneiden funktionalisoitujen, oksastettu-10 jen polystyreeniketjujen ja siten vastaavasti vähentää aikaisemman matriisin reaktiivisuutta.

Keksinnön mukaan on edullista, että oleellisesti kaikkien polymeeriin oksastettujen polystyreeniketjujen arvioitu molekyylipaino, lukuun ottamatta valinnaisia 15 substituentteja, on 300 000 - 1 600 000, erityisesti 400 000 - 1 400 000, edullisesti 600 000 - 1 200 000. Nykyisin edulliseksi arvioitu oleellisesti kaikkien polystyreeniket jujen molekyylipaino on 700 000 - 1 000 000. Uskotaan, että 400 000:n, korkeammat arvioidut molekyylipainot 20 ovat erityisen edullisia, mutta toisaalta oksastetuilla polystyreeniketjuilla, joilla on hyvin iso arvioitu molekyylipaino, noin 1 000 000 ja enemmän, näyttää olevan haitallinen vaikutus polymeerisubstraatin mekaanisiin ominaisuuksiin, erityisesti kun substraatti on, kuten usein on 25 edullista, levyn tai kalvon muodossa.

Polymeerisubstraatin polystyreeniket jun oksastusas-te, siis polystyreenin osuus painoprosentteina suhteessa polymeerisubstraattiin, riippuu tietenkin polystyreeniket-jujen pituudesta, oksastuskohtien tiheydestä ja polymeeri-30 substraatin ulottuvuuksista, ja se voi vaihdella laajoissa rajoissa. Siten esimerkiksi levyn tai kalvon ollessa kyseessä, jossa polymeerin paksuus on 25 - 100 μπι, polystyreeniket jun oksastusaste voi olla esimerkiksi noin 5 -noin 800 % painosta, kuten noin 10 - noin 700 %. Sekä hy-35 vin alhaiset että suuret polystyreeniketjun oksastusas- 14 102833 teet, kuten myös näiden väliset oksastusasteet, ovat arvokkaita tämän keksinnön edullisten toteutusmuotojen yhteydessä.

Siten analyyttisiin tarkoituksiin, joissa on taval-5 lisesti haluttua pystyä syntetisoimaan proteiinin pepti-disekvenssejä pienessä mittakaavassa, tyypillisesti mikro-grammamääriä, voidaan esimerkiksi käyttämällä suhteellisen alhaisen polystyreeniketjujen oksastusasteen, kuten esimerkiksi 5 - 200 %, tavallisesti 10 - 60 % (polymeeri- 10 substraatti levyn tai kalvon paksuus 25 - 100 μτη) ja edul lisesti kontrolloidun, usein alhaisen funktionalisointi-asteen omaavaa polymeerisubstraattia varmistaa kontrolloidun muodostuvien peptidi(e)n määri(e)n rajoittamisen.

Polystyreenillä oksastettu polyeteenilevy tai kal-15 vo, joka on muodostettu kuten on edullista tämän keksinnön yhteydessä, on erityisen edullinen peptidikemian tai biokemian analyyttiseltä näkökannalta siksi, että se on hyvin valoa läpäisevä, erityisesti näkyvää valoa läpäisevä, mikä helpottaa spektrofotometristen tekniikoiden käyttöä, esi-20 merkiksi antigeeni/vasta-aine-reaktioiden monitorointia (esimerkiksi ELISA-tekniikalla), joita voidaan monitoroida värireaktioilla ja joissa antigeeni voi olla erityinen peptidisekvenssi, joka on syntetisoitu ja joka jää ankkuroiduksi kiinteään tukeen.

25 Preparatiivisia tarkoituksia varten, joissa pepti din tai proteiinin korkeimman mahdollisen saannon saavuttaminen on selvästi haluttua, on edullista käyttää korkeinta käytännöllistä oksastusastetta. Käytännön kannalta ylempi raja levyn tai kalvon, jonka paksuus on 25 - 100 30 μτη, (kuten on käytetty edullisten toteutusmuotojen mukaisesti) muodossa olevan polymeerisubstraatin oksastusasteen osalta on usein noin 500 - 600 % painosta, vaikka erityiset sovellutukset voivat tehdä haluttavaksi ylittää tämä raja, kuten oksastusaste noin 700 %. Toisaalta, tällaista 35 ohutta levyä tai kalvoa ajatellen käytännölliset oksastus- 15 102833 asteet eivät ole tavallisesti alle noin 40 %. Useisiin käytännöllisiin tarkoituksiin tällaisen ohuen levyn tai kalvon oksastusaste on noin 100 - 600 % ja usein 200 -600 % ja preparatiivisia tarkoituksia varten usein edulli-5 sesti 200 - 400 % painosta, mikä näyttää olevan sopiva raja sekä funktionalisoitua oksastettua levyä käyttäen suoritettujen peptidisynteesien saannon että tehokkuuden kannalta ja oksastetun levyn tai kalvon mekaanisen vahvuuden kannalta.

10 Kuten tulee olemaan ilmeistä keksintöä kuvaavista esimerkeistä, voidaan saada erityisen korkeita saantoja hyvin puhtaita peptidejä esimerkiksi käyttämällä keksinnön mukaisen menetelmän edullisia toteutusmuotoja, joissa käytetään hyväksi funktionalisoituja polystyreenillä oksas-15 tettua polyeteenilevyä tai -kalvoa, joka on muodostunut ohuen levyn tai kalvon muodossa olevasta polyeteenisubst-raatista paksuuden ollessa 50 μτη:η läheisyydessä ja oksastetun asteen ollessa 400 - 500 %:n läheisyydessä.

Kuten edellä on mainittu, muodostetaan erään kek-20 sinnön sovellutusmuodon mukaisesti polystyreenillä oksastettu polymeerisubstraatti oleellisesti radikaali-indusoidulla reaktiolla polymeerisubstraatin ja valinnaisesti substituoidun styreenimonomeerin välillä, jota monomeeria on monomeerin orgaanisen liuottimen liuoksessa. Kuten myös 25 edellä mainittiin, jotta saadaan pitkiä oleellisesti ei-ristisidottuja polystyreeniketjuja, on edullista toteuttaa oksastus liuottimessa, jossa kasvavat polystyreeniketjut paisuvat tai solvatoituvat heikosti, kuten hydroksyyliä sisältävässä orgaanisessa liuottimessa, erityisesti alko-30 holissa. Edullisia alkoholeja tähän tarkoitukseen ovat CM-alifaattiset alkoholit. Käytännössä metanolin on havaittu olevan sopivin liuotin, mutta pidetään mahdollisena, että myös esimerkiksi etanoli, propyyli- ja isopropyylialkoho-lit sekä n-butyyli-, iso-butyyli-, sec-butyyli- ja tert-35 butyylialkoholit ovat käyttökelpoisia.

16 102833

Valinnaisesti substituoidun styreenin tilavuuspro^-senttiosuudella (% v/v) oksastukseen käytetyssä liuotti-messa, kuten liuottimessa, joka paisuttaa tai solvatoi heikosti kasvavia polystyreeniketjuja, esimerkiksi hydrok-5 syyliä sisältävä liuotin, kuten edellä on selitetty, erityisesti edellä esitetyn kaltainen alkoholi, kuten esimerkiksi metanoli, on tietty vaikutus muodostuneen oksastetun polystyreeniketjun molekyylipainoon, siten että ainakin tiettyyn pisteeseen asti liuottimen ketjun pituutta piden-10 tävä vaikutus on sitä suurempi, mitä suurempi on liuottimen tilavuusprosenttiosuus liuoksessa. Siten kun valinnaisesti substituoidun styreenin tilavuusprosenttiosuus liuoksessa voi vaihdella hyvin laajoissa rajoissa, kuten välillä 1 - 95 %, tämä tilavuusprosenttiosuus on tavalli-15 sesti rajoissa 10 - 90 %, tavallisemmin 20 - 80 %. Hyvin mielenkiintoinen raja-alue valinnaisesti substituoidun styreenin tilavuusprosenttiosuudelle liuoksessa on 5 -50 %, ja kuten esimerkeistä käy ilmi 25 - 35 %, toisin sanoen noin 30 % tilavuudesta, on havaittu käytännössä anta-20 van tukea erinomaisille ominaisuuksille. Osoitus riippuvuudesta styreenin tilavuusprosenttiosuuden metanolissa oksatusprosessin aikana ja syntyvän arvioidun polystyree-niketjujen pituuden välillä ilmenee alla mainituista kokeista valinnaisesti substituoidun styreenin tilavuuspro-25 senttiosuuden metanolissa ja saadun homopolymeerin mole-kyylipainon välillä γ-säteilyannoksen ja annosnopeuden ollessa vakio.

Oksastusprosessi on hyvin sopivaa suorittaa γ-sä-teilytyksellä ilman happea ja oleellisesti ympäristön läm-30 pötilassa tai hieman kohotetussa lämpötilassa, paineen ollessa sama kuin nestemäisten komponenttien kokonaishöyryn-paine, valinnaisesti täydennettynä inertin kaasun, kuten argonin kohtalaisella paineella, kokonaispaineen ollessa noin 1 ilmakehä. Sopiva tapa poistaa happi reaktiosystee-35 mistä on altistaa systeemi toistetuille jäädytys-sulatus- * 17 102833 kierroille korkeavakuumilaitteessa. γ-säteilytys suoritetaan sopivasti annosnopeudella noin 1 - noin 100 000 Gy/ tunti, erityisesti noin 200 - 5 000 Gy/tunti, kuten noin 300 - 1 000 Gy/tunti. Uskotaan, että säteilyn intensitee-5 tiliä on huomattava merkitys oleellisesti ei-ristisidottu-jen polystyreeniketjujen halutun konfiguraation saamisen kannalta, jos intensiteetti on liian suuri, vapaan radikaalin muodostuminen on niin suuri, että oksastusta tapahtuu enemmän lyhyisiin ketjuihin ja ehkä suuremmalla risti-10 sitomisasteella, joita kumpaakaan ei tavallisesti haluta.

Kokonaisuudessaan kantajan ketjunpituuden, oksas-tuksen ja optisten ominaisuuksien (jotka ovat erityisen tärkeitä kun tuki on levy tai kalvo) optimointi suoritetaan polymeerin, valinnaisesti substituoidun styreenimono-15 meerin, reaktioseoksen, säteilyn annosnopeuden ja sätei-lytyksen aikaisen lämpötilan valinnan kautta.

Vaikka edellä kuvattu menetelmä, johon kuuluu γ-sä-teilyn käyttö, on nykyisin edullinen menetelmä, on ajateltu, että polystyreenillä oksastetut kalvot voidaan sopi-20 vasti valmistaa käyttämällä erilaisia strategioita, joihin kuuluu tavanomaisia radikaali-initiaattoreita, kuten pe-roksideja, esimerkiksi vetyperoksidi, bentsoyyliperoksidi tai diasetyyliperoksidi, tai atsoyhdisteet radikaalin muo-dostuslähteenä. Muita radikaalin muodostuslähteitä, joita 25 voidaan käyttää, ovat esimerkiksi otsoni ja UV-säteily; toinen erityisen mielenkiintoinen radikaalinmuodostuslähde on elektronisäde. Tärkeä asia on se, että radikaalin kehittämiseen käytetty menetelmä on sellainen, joka sopii suhteellisen hyvin kontrolloidulle polystyreeniketjujen 30 radikaali-initioidulle kasvulle. Uskotaan, että edellä mainitut olosuhteet, jotka koskevat käytetyn liuottimen ominaisuuksien tärkeyttä, soveltuvat myös näiden vapaiden radikaalien initiointiperusteiden yhteydessä.

On myös ajateltu, että voi olla mahdollista tuottaa 35 polystyreeni/polyeteenilohkosekapolymeerejä, jotka ovat 1. 102833 käyttökelpoisia tässä keksinnössä, tavalla, jossa ei käytetä radikaali-initiointia. Siten on esimerkiksi mahdollista käyttää aniönista polymerisointia butadieenin ja styreenin lohkosekapolymeerin syntetisoimiseksi, jossa 5 kahden lohkon ketjun pituus voidaan täsmällisesti kontrolloida. On mahdollista hydrogenoida tämä polymeeri sellaisella tavalla, että polybutadieenilohko muutetaan poly-eteeniksi. Muodostuneella polyeteenillä on sellainen säännöllinen rakenne, että se kiinteässä olomuodossa muodostaa 10 suuritiheyksistä polyeteeniä. Menetelmälle on kriittistä, että sekapolymeerin polyeteeniosan pitäisi muodostaa koherentti kalvo. On ajateltu, että tämä voidaan saada aikaan seuraavalla tavalla: eteeni/styreenilohkosekapolymeeri liuotetaan liuottimeen, johon polystyreeniosa liukenee 15 huoneenlämpötilassa ja korkeammissa lämpötiloissa, mutta johon polyeteeniosa liukenee vain kun liuotin on kuumaa. Esimerkki sellaisesta liuottimesta on ksyleeni. Polymee-riliuos laitetaan muottiin ja jäähdytetään hitaasti alle lämpötilan, jossa polyeteeni saostuu. Kun polyeteenikalvo 20 on muodostunut, jäljelle jäänyt liuotinosa poistetaan.

On edelleen ajateltu, että jäljempänä kuvattu vaihtoehtoinen valmistusmenetelmä voidaan laajentaa muiden po-lystyreeni/polyolefiinilohkosekapolymeerien valmistamiseen, esimerkiksi polystyreeni/polypropeenilohkosekapoly-25 meereihin, käyttämällä hyväksi muita dieenimonomeerejä kuin butadieeniä, esimerkiksi 2-metyyli-l,3-pentadieeniä polystyreeni/polypropeenilohkosekapolymeerin ollessa kyseessä.

Vaikka polystyreenillä oksastettu polymeerisubst-30 raatti voi olla missä tahansa sopivassa muodossa, kuten edellä kuvattiin, keksinnön hyvin mielenkiintoisia toteutusmuotoja ovat sellaiset, joissa se on levyn tai kalvon muodossa. Itse polymeerisubstraatin paksuus, esimerkiksi polyeteenisubstraatin, joka on levyn tai kalvon lähtöaine, 35 voi vaihdella laajoissa rajoissa ja on tavallisesti noin 19 102833 10 - 10 000 μτη, useimpiin tarkoituksiin edullisesti 25 -1 000 μπτ, ja tyypillisesti 25 - 100 μτη, kuten 25 - 75 μτη. Oksastusprosessi johtaa tietenkin paksuuden kasvuun. Siten, mitä paksumpi levy tai kalvo, sitä suurempi paksuuden 5 prosenttinen kasvu on määrätyissä oksastusolosuhteissa. Ohuen oksastetun levyn tai kalvon paksuus voi olla esimerkiksi 25 - 200 μτη.

Koska levyn tai kalvon muodossa oleva oksastettu polymeeri on termoplastinen materiaali ja liukoinen koho-10 tetuissa lämpötiloissa, on uudelleenmuotoilu oksastuspro-sessin jälkeen ymmärretty mahdollisuutena. Siten polysty-reenillä oksastetun polyeteenilevyn tai -kalvon ollessa kyseessä, kuten tämän keksinnön yhteydessä on edullista, on mahdollista liuottaa levy tai kalvo sopivaan liuotti-15 meen ja antaa liuoksen jäähtyä ja liuottimen haihtua, jolloin saadaan uusi polymeerikantajan "valos", esimerkiksi ohuempi levy tai kalvo, jolla on oksastettuja polysty-reeniketjuja. Sopiva liuotin on sellainen joka sopivan korkeassa lämpötilassa liuottaa polymeerikantajan oksas-20 tettuine polystyreeniketjuineen (vaikka oksastus pysyy) ja joka jäähdyttäessä alempaan lämpötilaan ei enää kykene pitämään polymeerisubstraattia liuoksessa, mutta yhä tehokkaasti paisuttaa tai solvatoi polystyreeniketjuja. Esimerkki sellaisesta, esimerkiksi polystyreenillä oksaste-25 tulla polyeteenille käyttökelpoisesta liuottimesta on ksy-leeni tai ksyleenien seos.

Levyllä tai kalvolla on useita etuja peptidi- tai proteiinisynteesin käytännön toteuttamisessa. Siten voidaan esimerkiksi levy tai kalvo helposti leikata sopiviin 30 kokoihin järjestettäväksi käytettävään reaktioastiaan, kuten mihin tahansa tunnettuun kiinteäfaasipeptidisyntee-sireaktioastiaan, mukaan lukien pullot, dekantterit, mik-rodekantterit, suppilot, syvennykset, kolonnit tai verkot.

Kalvo- tai levykantaja tekee mahdolliseksi suunni-35 telia uusia käytännöllisiä tapoja suorittaa peptidisyntee- 20 102833 siä. Siten esimerkiksi useita levyn tai kalvon paloja voidaan järjestää yhteisen kantajan päälle ja siten pitää yhdessä erilaisten peptidisynteesivaiheiden ajan, jolloin ne esimerkiksi ovat yhdessä alttiina erilaisille reagens-5 seille ja pesuliuottimille, tai palat voidaan järjestää sarjaan, jolloin kukin sarja saatetaan alttiiksi erityiselle reaktioväliaineitten yhdistelmälle.

Tämä jälkimmäinen helpottaa tehokkaasti "lokeroin-tia", jossa kaksi tai useampi peptidi voidaan valmistaa 10 rinnakkain ja oleellisesti samanaikaisesti.

Siten yksi keksinnön toteutusmuoto tarjoaa erityisen käytännöllisen menetelmän "lokeroidulle" peptidien ja proteiinien synteeseille, tämän näkökulman perustuessa polystyreenillä oksastetun levyn tai kalvon käyttöön kiin-15 teäfaasipeptidisynteesissä kantajana. Tämä keksinnön to teutusmuoto voidaan ilmaista menetelmänä yhden tai useamman peptidin tai proteiinin syntetisoimiseksi, joka menetelmä syntetisoitaessa kahta useampaa peptidiä tai proteiinia sallii rinnakkaisen ja oleellisesti samanaikaisen 20 halutun lukumäärän peptidien ja proteiinien synteesin, ja joka menetelmä käsittää sen, että A) otetaan käyttöön suuri määrä oleellisesti identtisiä polymeerisubstraatteja, jotka on oksastettu polysty-reeniketjuilla, jotka valinnaisesti kantavat lisäksi subs- 25 tituentteja, jotka eivät ole reaktiivisia vallitsevissa synteesiolosuhteissa, ainakin osan kunkin polystyreeniltä oksastetun polymeerisubstraatin polystyreeniketjuista ollessa funktionalisoituja kemiallisella funktionaalisuudella, joka helpottaa ankkuroivan sidoksen muodostumista po-30 lystyreeniosien ja ainakin N-suojatun ja valinnaisesti karboksyylipäätteestä derivatisoidun aminohapon välillä, B) mahdollisesti eristetään fyysisesti näiden monien polystyreenillä oksastettujen polymeerisubstraattien jäsenet kahteen tai useampaan joukkoon, kukin käsittäen 35 yhden tai useamman jäsenen mainitusta suuresta määrästä, 21 102833 kytketään N-suojattu ja valinnaisesti karboksyylipäätteestä derivatisoitu aminohappo suuren määrän kunkin jäsenen tai, milloin sopivaa, kunkin joukon kunkin jäsenen funk-tionalisoituihin polystyreeniosiin käytetyn N-suojatun ja 5 valinnaisesti karboksyylipäätteestä derivatisoidun aminohapon ollessa identtinen suuren joukon kaikille jäsenille tai, milloin sopivaa, kaikille yhden joukon jäsenille, ja, kun sopivaa, edelleen ollen yhden seuraavien vaihtoehtojen mukainen: 10 (i) identtinen kaikille joukoille, (ii) kun joukkojen määrä on suurempi kuin kaksi, identtinen ainakin kahdelle joukolle, (iii) erilainen kullekin joukolle, jolloin funktionalisuus ja N-suojattu ja valinnaisesti 15 karboksyylipäätteestä derivatisoitu aminohappo sopivat toisilleen siten, että muodostunut ankkuroiva sidos voidaan myöhemmin pilkkoa oleellisesti ilman syntetisoitavan peptidi- tai proteiiniketjun hajoamista, C) käsitellään kutakin suuren joukon jäsentä tai, 20 milloin sopivaa, kunkin joukon kutakin jäsentä N-suojaryh- män poistamiseksi kytketyn ja N-suojatun aminohapon N-suo-jatusta amino- tai substituoidusta aminoryhmästä siten, että kytketyn aminohapon amino- tai substituoidun amino-ryhmän reaktiota muun N-suojatun aminohapon karboksyyli-25 ryhmän tai aktivoidun karboksyyliryhmän kanssa helpotetaan, D) saatetaan suuren joukon kunkin jäsenen tai, milloin sopivaa, kunkin joukon kunkin jäsenen funktionalisoituun polystyreeniosaan viimeksi kytketyn aminohapon amino- 30 tai substituoitu aminoryhmä reagoimaan toisen N-suojatun aminohapon karboksyyliryhmän tai aktivoidun karboksyyli-ryhmän kanssa, jolloin muodostuu peptidisidos amino- tai substituoidun aminoryhmän ja karboksyyliryhmän tai aktivoidun karboksyyliryhmän välille, toisen N-suojatun amino-35 hapon ollessa identtinen kaikille suuren joukon jäsenille 22 102833 tai, milloin sopivaa, kaikille yhden joukon jäsenille, ja; milloin sopivaa, edelleen ollessa yhden tai kolmen edellä vaiheen B) yhteydessä mainitun vaihtoehdon mukainen, E) käsitellään valinnaisesti kutakin suuren joukon 5 jäsentä tai, milloin sopivaa, kaikkia kunkin sanotun joukon jäsentä siten, että poistetaan N-suojaryhmä viimeksi kytketyn N-suojatun aminohapon N-suojatusta amino- tai substituoidusta aminoryhmästä, siten että jälkimmäisen aminohapon amino- tai substituoidun aminoryhmän reaktiota 10 muun suojatun aminohapon karboksyyliryhmän tai aktivoidun karboksyyliryhmän kanssa helpotetaan, F) niissä tapauksissa, joissa vaihe E) on suoritettu, toistetaan vaiheet D) ja E) haluttu määrä kertoja, G) käsittellään valinnaisesti suuren joukon kutakin 15 jäsentä tai, milloin sopivaa, kunkin joukon kutakin jäsentä, jotta siten poistetaan jokin tai kaikki suojaryhmät, jotka mahdollisesti ovat jäljellä syntetisoidun peptidi-tai proteiiniketjun aminohappo-osissa, H) käsitellään valinnaisesti kutakin suuren joukon 20 jäsentä tai, milloin sopivaa, kunkin joukon kutakin jäsentä, sidoksen pilkkomiseksi, joka ankkuroi syntetisoidun peptidi- tai proteiiniketjun kunkin suuren joukon jäsenen tai, milloin sopivaa, kunkin joukon kunkin jäsenen funk-tionalisoituihin polystyreeniosiin, ja 25 I) poistetaan valinnaisesti ei-haluttu mikä tahansa ryhmä syntetisoidusta peptidi- tai proteiiniketjusta.

Yksi käytännöllinen tapa käsitellä levyn tai kalvon muodossa olevaa polymeerikantajaa lokerointitarkoituksia varten on leikata levy tai kalvo haluttuun määrään paloja, 30 jotka sitten merkitään lähtemättömästi, esimerkiksi gra-fiittipohjaisen musteen avulla, joka sulatetaan levyn tai kalvon pinnan osaan. Toinen mahdollisuus on, että eri palat pidetään yhdessä ja samassa suuressa levyn tai kalvon palassa ja sitten käsitellään erilaisia alueita (jotka 35 ovat sopivasti merkitty kuten edellä on kuvattu) yhdessä 23 102833 tai erikseen. On ilmeistä, että yhden toteutusmuodon mukaan voidaan antaa palojen jäädä yhteen ja samaan kalvoon silloin, kun toteutettavat käsittelyt ovat samoja, ja sitten kalvo jaetaan alayksiköihin, kun toteutettavat vaiheet 5 ovat erilaisia.

Kemiallinen funktionaalisuus, joka helpottaa ankkuroivan sidoksen muodostumista ainakin N-suojatun ja valinnaisesti derivatisoidun aminohapon ja funktionalisoidun polystyreeniosan välillä, on sopivasti sellaisen ryhmän 10 jäsen, joka käsittää kloori-, bromi- ja jodisubstituoidut alkyylit, aminosubstituoidut alkyylit, amino- ja aryylisubstituoidut alkyylit, amino- ja alkyyliaryylisubstituoidut alkyylit, 15 hydroksisubstituoidut alkyylit, tai on näistä johdettu, jolloin funktionaalisuus, kun se on johdettu mistä tahansa edellä mainitusta ryhmästä, on funktionaalisuus, jolla on spacer-ryhmä siten, että syntetisoitu peptidi- tai proteiiniketju on lohkaistavissa po-20 lystyreeniosasta oleellisesti ilman ketjun hajoamista.

Keksinnön sopivien toteutusmuotojen mukaan kloori- substituoitu alkyyli on kloorimetyyli, aminosubstituoitu alkyyli on aminometyyli, amino- ja alkyylisubstituoitu aryyli on of-aminobentsyyli (bentshydryyliamino) , amino- ja 25 alkyyliaryylisubstituoitu alkyyli valitaan ryhmästä, joka käsittää a-amino-2-, a-amino-3- ja a-amino-4-metyylibent-syylin (jälkimmäisemmän ollessa myös tunnettu 4-metyyli-bentshydryyliaminona), ja hydroksisubstituoitu alkyyli on hydroksimetyyli.

30 Koskien ensimmäistä polystyreenillä oksastetun po- lymeerisubstraatin funktionalisointia, enemmän kuin viisikymmentä menetelmää on kuvattu perinteisen kiinteäfaasi-peptidisynteesin yhteydessä (katso Barany 1979, s. 1-284, ja Stewart ja Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. 35 painos., Pierce Chemical Company, Illinois, 1984), joista 24 1 0 2 8 3 3 reaktiosta kloorimetyyl'i- (kloorimetyyli metyylieetteri / SnCl4-reaktion kautta, aminometyyli- (N-hydroksimetyyli-ftaali-imidireaktioh kautta; katso Mitchell et ai., Tetrahedron Lett., 3795, (1976)) ja bentshydryyliamino- (Piettä 5 ja Marshall, J. Chem. Soc., 650 (1970)) ryhmät ovat laa jimmin käytettyjä. Muihin reaktiivisiin funktionalisuuk-siin, joita on alunperin lisätty, käsittävät 4-metyyli-bentshydryyliaminon ja 4-metoksibentshydryyliaminon. Kaikki nämä vakiintuneet menetelmät ovat periaatteessa käyttö-10 kelpoisia tämän keksinnön yhteydessä. Tämän keksinnön yhteydessä edulliset peptidi- tai proteiinisynteesimenetel-mät käyttävät aminometyyliä alkuperäisenä funktionaalisuutena, koska aminometyyli on erityisen edullinen suhteessa "spacer"- tai "handle"-ryhmien liittämiseen johtuen amino-15 metyylifunktionaalisuuden aminoryhmän reaktiivisuudesta oleellisesti kvantitatiivisen amidisidosten muodostumisen osalta karboksyyliryhmiin toisessa spacer-ryhmän muodostavan reagenssin päässä. Suuri joukko relevantteja spacer-tai handle-ryhmiä muodostavia bifunktionalisia reagensseja 20 on kuvattu (katso Barany et ai., Int. J. Peptide protein res., 30, 705 - 739 (1987), erityisesti reagenssit, jotka ovat reaktiivisia aminoryhmän, kuten aminometyylifunktion aminoryhmän suhteen, mukaan lukien 4-(halogeenialkyyli)-aryyli-alempi alkaanihappo, kuten 4-(bromimetyyli)fenyyli-25 etikkahappo, Boc-aminoasyyli-4-(oksimetyyli)aryyli-alempi alkaanihappo, kuten Boc-aminoasyyli-4-(oksimetyyli)fenyy-lietikkahappo, N-Boc-p-asyylibentshydryyliamiini, kuten N-Boc-p-glutaroyylibentshydryyliamiini, N-boc-4'-alempi alkyyli-p-asyylibentshydryyliamiini, kuten N-Boc-4' -metyy-30 li-p-glutaroyylibenthydryyliamiini, N-Boc-4'-alempi alkok- si-p-asyylibentshydryyliamiini, kuten N-Boc-4'-metoksi-p-glutaroyylibentshydryyliamiini ja 4-hydroksimetyylifenoksi -alempi alkaanihappo, kuten 4-hydroksimetyylifenoksi-etikkahappo.

25 102833

Tietyt funktionaalisuudet, kuten bentshydryyliamino, 4-metyylibentshydryyliamino ja 4-metoksibentshydryy-liamino, jotka voidaan liittää syntetisoidun peptidi- tai proteiiniketjuun lohkaisutarkoituksiin kiinteästä kanta-5 jasta siten, että peptidi- tai proteiiniketjun C-pääte on amidimuodossa, ei vaadi spacer-ryhmän tuomista, ja mitä tahansa sellaista funktionaalisuutta voidaan käyttää tämän keksinnön yhteydessä.

Vaihtoehtoinen strategia spacer- tai handle-ryhmien 10 liittämiseksi, on niin sanottu "esi-muodostettu handle"-strategia [katso Tam et ai., Synthesis, 955-57 (1979)], joka tarjoaa täydellisen kontrollin ensimmäisen aminohapon kytkemiseen, ja poistaa komplikaatioiden mahdollisuuden, joka tulee ei-haluttujen funktionaalisten ryhmien läsnä-15 olosta, jotka ryhmät eivät liity peptidi- tai proteiini-synteesiin. Tässä strategiassa spacer- tai handle-ryhmät, yleisesti saman tyyppiset spacer- tai handle-ryhmät kuten edellä on kuvattu, saatetaan reagoimaan ensimmäisen aminohapon kanssa, joka halutaan ankkuroitumaan kiinteään kan-20 tajaan, aminohapon ollessa N-suojattu ja valinnaisesti suojattu muissa sivuketjuissa, jotka eivät ole oleellisia halutun peptidi- tai proteiiniketjun rakentamisen suhteen. Sopivia N-suojaryhmiä ovat Boc, tavallisesti yhdessä bent-syyliryhmien kanssa sivuketjujen suojaamiseksi, ja Fmoc, 25 tavallisesti yhdessä t-butyylin kanssa minkä tahansa sivuketjun suojaamiseksi (Boc = t-butyylioksikarbonyyli;

Fmoc = 9-fluorenyylimetyylioksikarbonyyli), vaikka useita muitakin mahdollisuuksia on olemassa, jotka ovat yhtä hyvin tunnettuja tavanomaisessa kiinteäfaasipeptidisyntee-30 sissä.

Siten niissä tapauksissa, joissa spacer- tai handle-ryhmä on haluttu, ensimmäinen aminohappo, joka kytketään kiinteään kantajaan, voi olla joko kytketty vapaaseen reaktiiviseen spacer-ryhmän päähän, joka ryhmä on 35 sidottu alkuperäiseen liitettyyn funktionaalisuuteen, esi- 25 102833 merkiksi aminometyylin, tai voidaan saattaa reagoimaan spacer-ryhmän muodostavan reagenssin kanssa, joka vuorostaan saatetaan reagöitetaan alkuperäisen liitetyn funktionaalisuuden kanssa.

5 Kun ensimmäinen kytkettävä aminohappo on täysin kytkeytynyt, seuraava vaihe kiinteäfaasisynteesissä on systemaattinen halutun peptidi- tai proteiiniketjun lisääminen. Tähän kuuluu toistuvia suojauksen poisto/kytkentä-kiertoja. Väliaikainen suojaryhmä, kuten Boc- tai Fmoc-10 ryhmä kuten edellä kuvattiin, viimeksi kytketyssä aminohapossa poistetaan kvantitatiivisesti sopivalla käsittelyllä, esimerkiksi happolyysillä, kuten trifluorietikkahapol-la, Boc:n tapauksessa, tai emäskäsittelyllä, kuten piperi-diinillä, Fmoc:n tapauksessa, jolloin vapautetaan viimeksi 15 kytketyn aminohapon N-päätteen amiinifunktio.

Seuraava haluttu N-suojattu aminohappo kytketään sitten viimeksi kytketyn aminohapon N-päätteeseen. Tämä aminohapon C-päätteen kytkeminen viimeksi kytketyn aminohapon N-päätteeseen voidaan suorittaa useilla tavoilla, 20 esimerkiksi tarjoamalla tuleva aminohappo muodossa, jossa karboksyyliryhmä on aktivoitu millä tahansa usealla menetelmällä, mukaan lukien aktiivisen esterijohdannaisen esi-muodostaminen, tai anhydridin esimuodostaminen. Vaihtoehtoisesti tulevan aminohapon karboksyyliryhmä voidaan saat-25 taa suoraan reagoimaan viimeksi kytketyn aminohapon N-päätteen kanssa kondensointireagenssin avulla, esimerkiksi disykloheksyylikarbodi-imidin tai sen johdannaisen avulla.

Kun haluttu peptidi- tai proteiiniketju, mukaan lu-30 kien suojaryhmät, on valmistettu, seuraava vaihe on tavallisesti peptidi- tai proteiiniketjujen aminohappo-osien suojauksen poisto ja syntetisoidun peptidin tai proteiinin lohkaiseminen kiinteästä kantajasta. Nämä prosessit voivat tapahtua oleellisesti samanaikaisesti, siten tarjoten va-35 paan peptidin halutussa muodossa. Vaihtoehtoisesti niissä 27 1 0 2 8 3 3 tapauksissa, joissa suoritetaan kahden erillisen synteti-soidun peptidi- tai proteiiniketjun kondensointi, on mahdollista valitsemalla sopiva spacer-ryhmä synteesin alussa lohkaista halutut peptidi- tai proteiiniketju niiden vas-5 taavista kiinteistä kantajista, jolloin molemmat peptidi-tai proteiiniketjut yhä sisältävät sivuketjujen suojaryh-mät, ja lopuksi poistamalla sivuketjujen suojaryhmät, esimerkiksi kytkemällä kaksi sivuketjusuojattua peptidi- tai proteiiniketjua muodostamaan pitempi peptidi- tai proteii-10 niketju. Kolmas mahdollisuus, joka on erityisen relevantti esimerkiksi peptidikemian tai -biokemian analyyttisten seoksien tapauksessa, on poistaa sivuketjujen suojaryhmät lohkaisematta ankkuroivaa sidosta, joka pitää ketjun kiinteässä kantajassa.

15 On otettu huomioon, että polystyreenillä oksastetut polyeteenisubstraatit, jotka ovat analogisia tämän keksinnön mukaisille, mutta käsittävät linker- tai spacer-ryh-miä, jotka ovat sopivia kysymyksessä olevalle erityiselle kemian alalle, voivat olla arvokkaita yksittäisen tai 20 usean biopolymeerimolekyylin, muiden kuin peptidien, synteesissä. Yksi esimerkki olisi oligonukleotidien synteesi, näiden ollessa käsitteellisesti yksinkertaisia syntetisoida, koska tavallisesti vaaditaan vain neljä erilaista reaktiolokeroa, yksi kuitenkin neljää osallistuvaa nuk-25 leotidiyksikköä varten (siis A, T, G ja C DNA-fragmenteille, tai A, G, C ja U RNA-fragmenteille) . Tällaiset synteesit voidaan suorittaa rinnakkain ja oleellisesti samanaikaisesti analogisella tavalla kuin on kuvattu tämän keksinnön yhteydessä.

30 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä, käytetyt lyhenteet ovat seuraavat:

LYHENTEIDEN LISTA

Boc: tert-butyylioksikarbonyyli C1Z: 2-klooribentsyylioksikarbonyyli 35 DCC: N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidi 102833 28 DCU: N,N'-disykloheksyyliurea DIEA: N,N-di-isopropyylietyyliamiini DMF: N,N-dimetyyliformamidi FABMS: nopea atomipommitus-massaspektrometria 5 HOBt: 1-hydroksibentsotriätsoli HPLC: korkean erotuskyvyn nestekromatografia

Pam: fenyyliasetamidometyyli PE: polyeteeni PP: polypropeeni 10 SEC: koon perusteella poissulkeva kromatogra- f ia SPPS: kiinteäfaasipeptidisynteesi TFA: trifluorietikkahappo TFMSA: trifluorimetaanisulfonihappo 15 THF: tetrahydrofuraani

Erilaisille aminohapoille käytetyt lyhenteet ovat IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature'n [J. Biol. Chem., 247, 977-983 (1972)] suositusten mukaisia ja viittaavat kaikissa tapauksissa aminohappojen L-konfigu-20 raatioon.

Esimerkki 1

Yleinen menetelmä polystyreenillä oksastettujen po-lyeteenilevyjen valmistamiseksi

Styreeniä (99 % Aldrich) ohjattiin emäksisen alu-25 miniumoksidin läpi; joissakin tapauksissa se edelleen tis lattiin natrium- tai kalsiumhydridistä. 20 ml 30-%:ista (v/v) puhdistettua styreenin liuosta metanolissa laitettiin ampulliin yhdessä suorakulmaisen pienitiheyksisen PE-levyn suikaleen kanssa, joka oli pesty n-heksaanilla. Käy-30 tetyn levyn paksuus oli 54 μπι. Liuoksesta poistettiin kaasu täysin toistamalla jäädytys-sulatuskiertoa korkeavakuu-milinjassa ja sitten ampulli suljettiin vakuumissa. Sitten ampulli sisältöineen säteilytettiin koboltti-gamma-sätei-lytysvälineellä. Säteilytys suoritettiin kahdessa vaihees-35 sa, ampulli siirrettiin yhdestä säteilylähteen paikasta 102833 29 toiseen kahden vaiheen välillä mahdollisimman homogeenisen annosjakauman varmistamiseksi. Annosmäärä oli noin 400 Gy/ tunti. Suurin käytetty annosmäärä oli 417 Gy/tunti ja alhaisin 339 Gy/tunti. Säteilytyksen jälkeen levy uutettiin 5 Soxhlet-laitteessa dikloorimetaanilla ja kuivattiin. Tarkasti määritetyt arvot on lueteltu taulukossa 1. On huomion arvoista, että vaikka säteilytysannoksen ja oksastus-asteen välillä on selvä vastaavuus, arvoissa on paljon hajontaa. Tämä johtuu osaksi niin sanotusta "jälkivaikutuk-10 sesta", polymerisointiprosessi jatkuu jossakin määrin sen jälkeen, kun säteilytys on loppunut. Esimerkkinä tästä vaikutuksesta levyä sisältävä ampulli, joka oli sätei-lytetty kokonaisannoksella 3,4 kGy, jolloin saatiin 450 %:sti oksastettu levy, jätettiin säteilylähteen ulko-15 puolelle 10 tunniksi kahden säteilytysvaiheen välillä. Edelleen ampulli avattiin vasta 10 päivää säteilytyksen loppumisen jälkeen. Samanlaista menetelmää käytettiin levylle, jota säteilytettiin 2,0 kGy:n säteilytysannoksella, jolloin saatiin 230 %:n oksastus.

20 „ 102833 TAULUKKO 1 PE-levyjen oksastus metanoli/styreenissä (70 % v/v) PE-levyn Säteilytys- Oksastus- CH2Cl2:lla uuton 5 massa (g) annos (kGy) %* kesto (tunteja) (Säteilytys aika tunneissa) 10 0,2288 5,6 (14,0) 547 30 0,290 4,0 (10,0) 443 96 0,3322 3,4 (9,0) 450 330 0,2742 3,0 (8,1) 220 240 0,3866 2,9 (8,0) 285 170 15 0,3400 2,7 (6,7) 231 90 0,2398 2,4 (6,0) 173 120 0,3399 2,0 (6,0) 230 185 3,3502 1,7 (4,8) 200 182 0,3710 1,7 (5,0) 180 260 20 0,3456 1,0 (3,0) 75 56 0,3385 1,0 (3,0) 55 1145 0,3831 0,98 (2,8) 80 119 *oksastus-% = 25 [(lopullisen levyn massa) - (polyeteenin massa)] x 100/(polyeteenin massa) *Levyn pinta vahingoittui ampullin sulkemisen aikana.

On myös valmistettu levyjä, joiden oksastus-% on 30 46, 129 ja 331, vastaavasti.

Esimerkki 2

Menetelmä non-woven-huovan oksastamiseksi, joka huopa on tehty polypropeeniytimen ja korkeatiheyk-sisen polyeteenikerroksen käsittävistä kuiduista 35 Non-woven PP/PE-huopaa pestiin n-heksaanilla ja säteilytettiin suljetussa ampullissa, joka sisälsi kaasu- 31 102833 tonta 30 % (v/v) puhdistetun styreenin liuosta metanolis-sa, tavalla, joka on täysin analoginen esimerkissä 1 kuvatun yleisen menetelmän kanssa. Tulokset on annettu taulukossa 2.

5 TAULUKKO 2 PP/PE nonwoven-huovan oksastus metanoli/styreenissä (70:30 v/v) 10 PP/PE-huovan Säteilytys- Oksastus CH2Cl2:lla massa (g) annos (kGy) %* uuton kesto (säteilytys- (tunteja) aika tunneissa) 15 0,2400 1,6 (4,5) 86 124 0,2084 2,1 (6,0) 106 72 *0ksastus-% = [(lopullisen levyn massa) - (polyeteenin massa)] 20 x 100/(polyeteenin massa)

Esimerkki 3

Metanoli/styreeni-suhteen vaikutus polystyreeniket-jun pituuteen 25 Seuraavat tulokset saatiin pienitiheyksisten poly- eteenilevyjen säteilytyksessä erilaisissa metanoli/styree-ni-seoksissa (5 kGy annos, 400 Gy/tunti annosnopeus, huoneenlämpötila) : 30 % metanolia Homopolymeerin huippu- liuottimessa (v/v) molekyylipaino 0 180 000 20 300 000 40 500 000 35 70 800 000 32 102833 Nähdään, että homopolymeerifraktion molekyylipainö (määritetty koon perusteella poissulkevalla kromatogra-fiällä ristisidotulla styreeni/divinyylibentseeni-kolonni-materiaalilla), joka homopolymeeri on suljettu polystyree-5 nillä oksastettujen polymeerilevyjen oksastettujen ketjujen sisään ja uutettu levyistä dikloorimetaanilla, kasvaa liuoksen metanoli/styreeni-suhteen funktiona. Samaan aikaan molekyylipainojakauma pienenee korkeilla metanoli/ styreeni-suhteilla.

10 Esimerkki 4

Kokeita oksastettujen polystyreeniketjujen molekyy- lipainojen arvioinnissa

Levyistä uutettu polystyreenihomopolymeeri karakterisoitiin SECrllä. Uutetulla polystyreenillä on tyypilli-15 sesti molekyylipainojakauma, jossa on kaksi pullistumaa. Tämä johtuu siitä, että polystyreeniä muodostuu säteily-tyksen aikana sekä levyssä että ympäröivässä liuoksessa. Jos levy pestään lyhyesti dikloorimetaanilla ennen Soxhlet-uuton suorittamista, alhaisen molekyylipainon 20 omaavan fraktion määrä pienenee suuresti suhteessa korkean molekyylipainon omaavan fraktion määrään. Molekyylipaino-arvot uutetun homopolymeerin korkean molekyylipainon fraktiolla on annettu taulukossa 3. Tyypilliset näytekoot olivat 0,01 - 0,2 mg polymeeriä. Homopolymeeri1le, jotka oli-25 vat levyistä, jotka oli oksastettu määriin 173, 220, 231 ja 450 paino-%, vastaavasti, käytettiin SEC:iä varten 60 cm:n Toyo Soda TSK GMH6 -kolonnia ympäristön lämpötilassa THF eluenttina ja virtausnopeudella 0,5 ml/min. Homopoly-meerille levyistä, jotka oli oksastettu määrään 443 pai-30 no-%, käytettiin SECrlle 50 cm:n Shodex A80-M:ää 50 °C:ssa ksyleeni liuottimena ja virtausnopeudella 0,5 ml/min. Tätä järjestelyä käytettiin myös muodostuneen polymeerin SEC:lie, mutta nyt toimimalla 90 °C:ssa virtausnopeudella noin 0,3 ml/min. Oksastetut levyt liukenevat kuumaan ksy-35 leeniin. Polystyreenillä oksastetun polyeteenin molekyyli- 33 1 0 2 8 3 3 painoarvot viidestä oksastetusta levystä on annettu taulukossa 4. Kaikki annetut molekyylipainoarvot laskettiin käyttämällä kalibrointikäyrää, joka perustui polystyreeni-vakioihin, joiden molekyylipaino oli 2 800 - 8 000 000 5 g/mol, jolloin kalibrointikäyrän muoto oli sovitettu kolmannen asteen polynomille. Ensimmäisen asteen (lineaarinen) kalibrointikäyrä johtaa samanlaisiin tuloksiin. Pitää ottaa huomioon, että styreenihomopolymeerille saadut mole-kyylipainot ovat absoluuttisia, mutta oksastetulle sekapo-10 lymeerille saadut molekyylipainot eivät ole absoluuttisia. Käytettäessä Shodex A80-M -kolonnia kalibrointikäyrän ekstrapolointi oli tarpeellista, jotta voitiin laskea havaitut erittäin korkeat molekyylipainot. Tämä ekstrapolointi voi johtaa molekyylipainojen painollisen keskiarvon 15 aliarvioimiseen ja niin muodoin myös polyhajonnan aliarvioimiseen. Oksastamaton polyeteeni karakterisoitiin korkeassa lämpötilassa SEC:llä käyttämällä 1,2,4-trikloori-bentseeniä eluenttina. Seuraavat arvot saatiin: Mw = 4 x 104 g/mol ja Mw/Mn = 5. Jälkimmäiset arvot saatiin käyttä-20 mällä polystyreenivakioihin perustuvaa kalibrointikäyrää.

Polystyreenihomopolymeerien arvot osoittavat, että molekyylipaino ei ole herkkä kokonaissäteilyannokselle, kun taas polystyreellä oksastetulle polyeteenille mitatut molekyylipainot ovat pitkälti verrannollisia annokseen. 25 Nämä huomiot osoittavat, että hyvin pitkiä ketjuoksastuk-sia muodostuu koko säteilytyksen aikana ja annos vaikuttaa oleellisesti vain oksastusten määrään.

34 102833 *TAULUKKO 3

Molekyylipainoarvot säteilytetyistä levyistä uutetuille polystyreenihomopolymeerin korkean molekyylipainon omaa-ville fraktioille 5 -

Oksastus- Säteilyannos m/ M^M,,5 % (kGy) (xlO45 mol/g) 10 - 450 '3,4 1,4 2,2 443 4,0 2,6 3,7 231 2,7 1,2 2,3 220 3,0 1,2 2,2 15 173 2,4 1,1 2,2 #MW = painollinen molekyylipainojen keskiarvo *MW/Mn = painollinen molekyylipainojen keskiarvo jaettuna numeerisella molekyylipainojen keskiarvolla 20 TAULUKKO 4

Molekyylipainoarvot polystyreenillä oksastetulle polyetee-nille säteilytetyistä levyistä 25 Oksastus- Säteilyannos M*1 M^/M,,5 Mpeak* % (kGy) (xlO-6 (xlO-6 mol/g) mol/g) 450 3,4 7,0 1,6 7,2 30 443 4,0 6,6 1,8 6,1 231 2,7 2,9 2,2 3,5 220 3,0 4,7 1,6 4,5 173 2,4 4,1 1,6 3,1 35 #MW = painollinen molekyylipainojen keskiarvo *Mw/Mn = painollinen molekyylipainojen keskiarvo jaettuna numeerisella molekyylipainojen keskiarvolla *Mpeak = molekyylipaino kromatogrammin huipun kohdalla 35 102833

Esimerkki 5

Polystyreenillä oksastettujen polyeteenilevyjen uudelleen muotoilu

Pala 173-%:ista oksastuslevyä (vertaa taulukko 1) 5 liuotettiin ksyleeniin 100 °C:ssa ja liuos kaadettiin tef-lonmuottiin 80 °C:ssa. Ksyleenin hitaan haihdutuksen jälkeen muodostui hyvin ohut kalvo. Kalvon erityisen ohuuden vuoksi ei ollut mahdollista saada mitään muuta kuin pieniä kalvon paloja (1 - 2 mm:n neliö). Kuitenkin nämä pienet 10 palat eivät hajonneet, kun ne saatettiin alttiiksi dikloo-rimetaanille. Tämä merkitsee, että jatkuva polyeteenifaasi muodostuu uudelleen.

Esimerkki 6

Polystyreenillä oksastettujen PE-levyjen aminome-15 tylointi (funktionalisointi)

Kahdeksan samankokoista suorakulmaista liuskaa (1,5 x 4,5 cm) 443-%:ista polystyreenillä oksastettua levyä (1,30 g yhteensä) laitettiin 60 ml:n SPPS-reaktioas-tiaan manuaalisessa SPPS-ravistelijassa ja pestiin 40 2 0 ml :11a TFA/CH2Cl2: ta (1:1 v/v) 3x5 minuuttia. Liuos, jossa oli 0,35 g (1,9 mmol) N-(hydroksimetyyli)ftaalimidia (97 % puhtaus; EGA-CHEMIE) 40 ml:ssa TFA/CH2Cl2:ta (1:1 v/v), lisättiin pestyihin levyihin ja seosta sekoitettiin 10 min. 10 ml TFMSA/TFA/CH2C12:ta (10:45:45 v/v/v) lisät-25 tiin hitaasti 4-5 tunnin aikana ja sekoitusta jatkettiin toiset 3 tuntia. Levyt eristettiin suodattamalla ja pestiin peräkkäin seuraavilla: TFA/CH2C12 (1:1 v/v) (120 ml), CH2C12 (240 ml) , metanoli (160 ml) ja etanoli (160 ml) . Niitä ravisteltiin 40 ml:ssa etanolia, jossa oli 10 % hyd-30 ratsiinia (Fluka), 12 tuntia 70 °C:ssa. Levyt suodatettiin kuumasta seoksesta ja pestiin peräkkäin (20 min sekoitus kussakin pesussa) seuraavilla: kuuma etanoli (3 x 40 ml), kuuma DMF (3 x 4 0 ml) , kuuma etanoli (3 x 40 ml) , kuuma metanoli (3 x 4 0 ml) ja CH2C12 (3 x 40 ml) . Lopuksi levyjä 35 käsiteltiin 40 ml :11a DIEA/CH2C12: ta (1:9 v/v) 2x5 mi- 36 102833 nuuttia, pestiin 200 ml:lla CH2Cl2:ta ja kuivattiin huoneenlämpötilassa. Yhteensä 4 spektrofotometrista ninhyd-riiniväritestiä osoitti 1,00 mmol NH2/g levyä (0,99, 0,96, 1,02 ja 1,01 mmol/g, vastaavasti) ja alkuaineanalyysi 5 osoitti 1,07 mmol N/g levyä.

Seuraavat polystyreenillä oksastetut polyeteenile-vyt on myös aminometyloitu: 331 % oksastettua levyä: substituutio = 0,21 mmol NH2/9 levyä.

547 % " " " 0,45 " n " 10 129 % " " " 0,50 " " " 46 % " " " 0,02 " " " 285 % " " " 0,6 "" "

Esimerkki 7 15 BocGln-4-(oksimetyyli)-Pam-levyn valmistaminen 0,63 g aminometyylilevyä (substituutio =1,0 mmol/g levyä; 443-%:isesti oksastettua) esipestiin 30 ml:ssa DMF/CH2C12: tta (1:2 v/v) 3x3 minuuttia 60 ml: n reaktioas-tiassa SPPS-ravistimessa. 0,98 g Boc-Gln-4-(oksimetyyli)-20 fenyylietikkahappoa (2,5 mmol, 4 ekvival.) ja 0,38 g HOBt:tä (2,5 mmol, 4 ekvival.) liuotettiin 20 ml:aan DMF/CH2C12:ta (1:1 v/v) ja sekoitettiin kierrekorkillisessa putkessa 3 minuuttia 0 °C:ssa. 0,52 g DCC:tä liuotettiin 10 ml-.aan CH2Cl2:ta ja lisättiin seokseen. 25 minuutin se-25 koittamisen jälkeen 0 °C:ssa DCU suodatettiin pois ja suo-dos lisättiin esipestyyn aminometyylilevyyn ja sekoitettiin 2 tuntia. Levyt suodatettiin, pestiin CH2Cl2:lla, neutraloitiin DIEA/CH2C12:11a (5:95 v/v), pestiin CH2C12:11a ja kuivattiin. Positiivisen ninhydriinitestin puuttuminen 30 osoitti kvantitatiivista kytkeytymistä, joka varmistui myös Boc-ryhmän seuraavalla käsittelyllä poistamisen jälkeen: 30 ml TFA/CH2C12 (1:1 v/v) 1x2 min ja 1 x 30 min, 30 ml CH2C12 6x1 min, 30 ml DIEA/CH2Cl2 (5:95 v/v) 2x5 min ja 30 ml CH2C12 4x1 min. 2 ninhydriinitestiä osoitti 35 sitten -NH2-substituutioasteen olevan 0,76 mmol NH2/g levyä 37 102833 (0,74 ja 0,77 mmol/g, vastaavasti), joka oli hyvin lähellä teoreettista arvoa 0,78 mmol NH2/g levyä.

Esimerkki 8

Peptidisynteesi: (a) ihmisen suojatun [Asp76]-para -5 tyroidihormonin fragmenttien 80-84, 75-84 ja 70.-84 kokoonpano 443 paino-% polystyreenillä oksastetulla polyeteenilevyllä

BocGln-Pam-levy (0,80 g, 443 % oksastettu, 0,58 mmol Gin) laitettiin 60 ml:n reaktioastiaan SPPS-raviste-10 lijassa. Suojattu hPTH 70-84 (katso kuvio 1) koottiin käyttämällä seuraavaa synteettistä protokollaa: (1) CH2C12, 3 5 ml, 3x1 min; (2) TFA/CH2C12 (1:1 v/v) , 35 ml, 3x1 min; (3) TFA/CH2C12 (1:1 v/v), 35 ml, 30 min; 15 (4) CH2C12, 3 5 ml, 6x1 min; (5) DIEA/CH2C12 (1:19 v/v) , 35 ml, 3 x 2 min; (6) CH2C12, 35 ml, 6x1 min; (7) 3 - 10 mg näytteet leikattiin pois ninhydriinianalyy-siä varten; 20 (8) suojattu aminohappo kytkettiin esimuodostettuun sym metriseen anhydridiin (3 ekviv., 0,05 M) 35 ml:ssa DMF/ CH2C12 (1:4 v/v), sekoittaen 2 tunnin ajan; (9) CH2C12, 35 ml, 4x2 min; (10) 3 - 10 mg näytteet leikattiin pois ja neutraloitiin 25 toistamalla (5) ja (6) ennen ninhydriinianalyysiä.

Kaikki kytkemiset olivat yksittäisiä kytkemisiä. Synteesin monitorointia käyttämällä kvantitatiivista nin-hydriinitestiä [alunperin kehitetty peptidisynteesille helmissä; katso esimerkiksi Sarin et ai., Anal. Biochem., 30 117, 147 (1981)] sovellettiin menestyksellisesti (taulukko 5) , ja se osoitti lukuun ottamatta (tuntemattomista syistä johtuen) toisen aminohapon kytkeytymistä (so. Boc-Ser83-(Bzl)Gln^-OCHj-Pam-levyn muodostaminen) tyydyttäviä arvoja kytkeytyrnistehokkuudene kussakin kytkemisvaiheessa.

35 38 102833 TAULUKKO 5

Ihmisen suojatun paratyroidihormonifragmentin (70-84) kiinteäfaasisynteesin 443 % polystyreenillä oksastetulla polyeteenillä kvantitatiivinen ninhydriinimonitorointi8 5 -

Kytkeytyminenb Suojauksen poisto Jäljelle jääneet Teoreet- 10 vapaat Arvioi- Mitattu tinen amino- tuc substi- substi-

Kytketty ryhmät % täy- tuutio tuutio ryhmä (μιηοΐ/g) dellisyys (znmol/g) (mmol/g) 15 84 BocGlnXd 0,0 100 0,76 ± 0,02 0,78 83 BocSer (Bzl) 38,0 94,0 0,35 ± 0,04 0,69 82 BocLys(2C1-Z) 1,6 99,7 0,54 ± 0,03 0,57 81 BocAla 0,6 99,9 0,52+0,03 0,55 80 BocLys(2C1-Z) 1,2 99,7 0,53 ± 0,02 0,47 20 79 BocThr(Bzl) 0,0 100 0,44 ± 0,03 0,43 78 BocLeu 0,4 99,9 0,39 ± 0,01 0,41 77 BocVal 0,0 100 0,39 ± 0,03 0,40 76 BocAsp(OBzl) 0,0 100 0,35 ± 0,01 0,37 75 BocVal 0,2 99,9 0,31 ± 0,02 0,35 25 74 BocAsp(OBzl) 0,7 99,8 0,31 ± 0,02 0,33 73 BocAla 0,0 100 0,29 + 0,01 0,33 72 BocLys(2C1-Z) 1,1 99,6 0,30 ± 0,02 0,30 71 BocAsp(OBzl) 1,3 99,5 0,28 ± 0,02 0,28 70 BocAla 0,0 100 0,23 ± 0,01 0,27 30 - “Keskiarvot perustuvat 2-4 ninhydriinianalyysiin kunkin kerroksen kytkemisen ja suojauksen poiston jälkeen ilmaistuna mmol/g:na peptidilevyä.

bYhtään ryhmää ei uudelleenkytketty, mutta Boc-35 Ser(Bzl):n kytkemistä seurasi täydellinen vapaiden amino-happoryhmien asetylointi käyttämällä N-asetyyli-imidatso-lia meteenikloridissa.

39 102833 'Nämä arvioidut arvot lasketaan suhteessa teoreetti^ seen substituutioon Boc-suojatun ryhmän kytkemisen jälkeen, eivätkä sisällä korjausta epätäydellisestä edeltävän ryhmän kytkemisestä.

5 dX = -OCH2-C6H4-CH2-COOH.

(b) Synteettisen hPTH- (80-84) :n lohkaisu, puhdistaminen ja identifiointi 90 mg H-Lys (ClZ)AlaLys (C1Z) Ser (Bzl)GlnOCH2-Pam-levyä 10 käsiteltiin 5 ml :11a vedetöntä HF/anisolia (9:1 v/v) 1 tunti 0 °C:ssa sivuketjun suojaryhmien poistamiseksi ja peptidin lohkaisemiseksi levystä samanaikaisesti. Uuttoja eetterillä orgaanisten komponenttien, kuten anisolin ja alkyloitujen anisolien, poistamiseksi seurasi uutto 15 10-%:iseen etikkahapon vesiliuokseen. Lyofilisointi antoi 24,0 mg raakatuotetta korkealla puhtaudella [katso HPLC-kromatogrammi kuviossa 2 (A) ] .

Raakatuote puhdistettiin kahdessa vaiheessa prepa-ratiivisella Cl8-kolonilla (300 x 19 mm) . TFA:ta sisältävät 20 puskurit haihdutettiin pois alennetussa paineessa ja tuote liuotettiin uudelleen veteen; liuos suodatettiin ja lyofi-lisoitiin, jolloin saatiin 17,8 mg H-LysAlaLysSerGln-OH, kuten aminohappoanalyysi (taulukko 6) ja FABMS molekyyli-painomittaukset (taulukko 7) vahvistivat.

25 Kokonaissynteesisaanto oli noin 84 % ja puhtaan peptidin saanto oli noin 69 % perustuen kvantitatiiviseen aminohappoanalyysiin.

(c) Synteettisen hPTH-(75-84) lohkaiseminen, puhdistus ja identifiointi 30 93 mg H-ValAsp(OBzl)ValLeuThr(Bzl)Lys(ClZ)AlaLys- (ClZ) Ser (Bzl) Gln-OCH2-Pam-levyä käsiteltiin samalla tavalla kuin hPTH-(80-84):ää, jolloin saatiin 36,6 mg raakatuotetta [katso HPLC-kromatogrammi kuviossa 2 (B)], ja lopuksi 27,2 mg puhdistettua peptidiä, identifioitu aminohappo-35 analyysillä (taulukko 6) ja molekyylipainomittauksilla 40 102833 (taulukko 7). Kokonaissynteesisaanto oli noin 85 % ja puhtaan peptidin saanto oli noin 69 %, perustuen kvantitatiiviseen aminohappoanalyysiin.

(d) synteettisen hPTH-(70-84):n lohkaiseminen, puh-5 distus ja identifiointi hPTH-(70-84)-fragmentti vapautettiin 96 mg:sta pep-tidilevyä samalla tavalla kuin (b):ssä ja (c):ssä edellä [katso HPLC-kromatogrammi kuviossa 2 (C) ] . Kokonaissyn teesisaanto oli arviolta 83 % ja puhtaan peptidin saanto 10 oli 26 mg (arviolta 63 %). Puhdas peptidi identifioitiin aminohappoanalyysillä (taulukko 6) ja molekyylipainomit-tauksilla (taulukko 7) .

TAULUKKO 6 15 Puhdistettujen synteettisen hPTH-yhdisteiden aminohappo koostumus

Aminohappo _Mooli suhde8_ 20 hPTH-(70-84) hPTH-(75-84) hPTH-(80-84)

Asp 2,94 (3) 1,01 (1)

Thrb 0,99 (1) 0,95 (1) 25 Serb 1,05 (1) 0,81 (1) 0,94 (1)

Glu 1,31 (1) 1,03 (1) 1,07 (1)

Ala 3,00 (3) 1,00 (1) 1,00 (1)

Vai 2,00 (2) 2,00 (1)

Leu 2,03 (1) 1,00 (1) 30 Lys 3,08 (3) 1,98 (1) 1,89 (2)

Hydrolyysit suoritettiin suljetussa, tyhjiöidyissä putkissa 5,7 M HCl:n kanssa, joka sisälsi 0,05 % fenolia, 35 110 °C, 2 tuntia. Analyysi HPLC:llä käyttäen fluoresens- 41 102833 sidetektiota (338/450 nm) , käsittelyn jälkeen (kolonnin jälkeen) o-ftaalidialdehydiderivatisoivalla reagensilla. aArvot suluissa ovat teoreettisia.

bThr- ja Ser-arvoja ei korjattu hydrolyysin aikaisen 5 hävikin suhteen.

TAULUKKO 7 hPTH-yhdisteiden molekyylipainot 10 Peptidi _Molekwlipaino_ mitattu laskettu hPTH-(80-84) 560,3 560,3 hPTH-(75-84) 1088 1088 15 hPTH-(70-84) 1588 1588 Määritetty kvadrupolisella massaspektrometrialla. Lasketut m/z-arvot ovat suhteessa C = 12,000 u ja H = 20 1,008 u.

Esimerkki 9

Useiden peptidianalogien nopea rinnakkainen synteesi (a) levyjen merkitseminen 25 Aminometyloidut 285 paino-% polystyreenillä oksas tetut polyeteenilevyt (0,6 mmol NH2/g levyä) leikattiin kolmeentoista erilliseen palaan (kukin pala: 1,5 x 3 cm, noin 50 μτη-.η paksuus, noin 40 mg) ja merkittiin yksittäisesti grafiittipohjaisen musteen avulla. Pala polyeteeni-30 kalvoa laitettiin kunkin merkityn pinnan päälle ja sulatettiin oksastettuun levyyn käyttämällä sähköisesti kuumennettua sulkemislaitetta. Lopuksi levyjä ravistettiin 50-%:isessa TFA/CH2C12:ta 20 minuuttia, jotta tarkistettaisiin, että kaikki merkinnät olivat sopivasti sulkeutuneet. 35 (b) Mellitiini-(7-21):n ja kahdentoista analogin samanaikainen synteesi merkityillä levyillä 42 102833

Suojattu mellitiini-(7-21) , siis 7 12 14

Boc-Lys(ClZ)-Val-Leii-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Gly-Leu-Pro-Ala- 21 5 Leu-Ile-Ser(Bzl)-Trp(CHO)-Ile-Lys(ClZ)-Pam-levy, ja kaksitoista analogia, jotka saatiin paikkojen 12 ja 14 substituutiolla (vapaiden peptidien sekvenssit on listattu kuviossa 3) koottiin kukin askeleittain merkityille le-10 vyille. Suojauksen poiston, neutraloinnin, pesun ja identtisten aminohappojen kytkemisen yhteiset vaiheet suoritettiin samanaikaisesti yhdessä reaktioastiassa, kun taas erilaisten aminohappojen kytkeminen suoritettiin erillisissä astioissa.

15 Käytettiin tavanomaista kiinteäfaasimenettelyä suo rittaa kaikkien ryhmien kaksois DCC -kytkemistä (3,5 ek-viv., 0,05 M, 30 % DMF/CH2C12:ssa) paitsi Boc-Gln ja Boc-Asn, jotka kaksoiskytkettiin HOBt-esterinä 30 % DMF/ CH2Cl2:ssä, ja Boc-Leu13 - Gin14, jotka kaksoiskytkettiin 20 symmetrisinä anhydrideinä 20 % DMF/CH2C12:ssä.

N-pääte-Boc-ryhmän poistamisen jälkeen peptidien suojauksen poistaminen ja vapautus levyistä suoritettiin matala/korkea HF -menetelmällä [Tam et ai., J. Am. Chem. Soc., 105, 6442 (1983)]. Vapaat 15-ryhmäpeptidit saatiin 25 noin 70 %:n kokonaissynteesisaannolla. Kuvio 4 näyttää kolmentoista puhdistamattoman peptidin HPLC-kromatogram-mit. Kaikki peptidit puhdistettiin 1-2 vaiheessa puoli-preparatiivisella C,8-kolonnilla. Esimerkkinä, 3,2 mg puhdasta mellitiini-(7-21):ta saatiin 1 cm2:stä (23,2 mg) täy-30 sin suojattua peptidilevyä. Peptidien tunnistaminen vahvistettiin aminohappoanalyysillä (taulukko 8) ja molekyy-lipainomittauksilla (taulukko 9).

43 102833 TAULUKKO 8

Puhdistetun mellitiini-(7-21):n ja sen analogien aminohappokoostumus 5 Aminohappo _Mooli suhde8_ _peptidi 1 pept. 2 pept. 3 pept. 4 pept. 5

Lys 1,95 (2) 1,69 (2) 1,77 (2) 2,83 (3) 1,47 (2)

Vai 0,65 (1) 0,82 (1) 0,87 (1) 0,87 (1) 0,87 (1)

Leu 2,97 (3) 2,85 (3) 2,94 (3) 2,67 (3) 2,86 (3) 10 Thrb 1,87 (2) 1,89 (2) 1,93 (2) 1,70 (2) 1,84 (2)

Gly 1,08 (1) 1,03 (1) 2,04 (2) 1,07 (1) 1,12 (1)

Pro 0,98 (1) 0,98 (1)

Ala 1,00 (1) 1,00 (1) 1,00 (1) 1,00 (1) 1,00 (1)

Ile 1,93 (2) 1,75 (2) 1,81 (2) 1,75 (2) 1,77 (2) 15 Serb 0,90 (1) 0,96 (1) 0,97 (1) 1,00 (1) 0,98 (1)

Trpc

Asp - - - - (1) peptidi 6 pept. 7 pept. 8 pept. 9 pept. 10d 2 0 -

Lys 1,87 (2) 1,71 (2) 1,83 (2) 1,93 (3) (2)

Vai 0,88 (1) 0,81 (1) 0,88 (1) 0,87 (1) (1)

Leu 2,92 (3) 2,93 (3) 3,90 (4) 3,06 (3) (3)

Thrb 1,87 (2) 1,90 (2) 1,88 (2) 2,06 (2) (2) 25 Gly 1,09 (1) 1,08 (1) 1,05 (1) 1,26 (1) (1)

Ala 1,00 (1) 1,00 (1) 1,00 (1) 1,00 (1) (1)

Ile 1,82 (2) 1,80 (2) 1,83 (2) 1,95 (2) (2)

Serb 0,95 (1) 1,88 (2) 0,95 (1) 1,01 (1) (1)

Trp' 30 Asp 1,04 (1)

Phe - 0,91 (1) (1) 44 102833 peptidi 11 pept. 12 pept. 13

Lys 1,75 (2) ' 1,66 (2) 2,62 (3)

Vai 1,75 (2) 0,81 (1) 0,89 (1) 5 Leu 2,73 (3) 3,70 (4) 3,71 (4)

Thrb) 1,92 (2) 1,62 (2) 1,93 (2)

Gly 1,05 (1)

Ala 1,00 (1) 1,00 (1) 1,00 (1)

Ile 1,73 (2) 1,73 (2) 1,80 (2) 10 Serb 0,97 (1) 1,00 (1) 0,95 (1)

Trpc

Glu - 1,12 (1) 15 Peptidit hydrolysoitiin 5,7 M HCl:ssä 110 °C:ssa 18 tuntia suljetuissa ei-tyhjiöitetyissa koeputkissa, paitsi peptidi 1, joka hydrolysoitiin 24 tuntia tyhjiöitetyssä koeputkessa. Suodatuksen jälkeen hydrolysaatit analysoitiin Beckman 6300 -aminohappoanalysaattorilla.

20 aArvot suluissa ovat teoreettisia.

bThr- ja Ser-arvoja ei korjattu hydrolyysin aikaisen hävikin suhteen.

cTryptofaania ei määritetty. dPeptidianalogia numero 10 ei analysoitu.

25 102833 4 5 TAULUKKO 9

Mellitiini-(7-21)-analogien molekyylipainot®

Peptidi _Molekwlipaino_ 5 mitattu laskettu erotus*1 1 1640,5 1640,0 +0,5 2 1640,1 1640,0 +0,1 3 1600,0 1599,9 +0,1 10 4 1671,2 1671,1 +0,1 5 1658,0 1658,0 0,0 6 1657,0 1657,0 0,0 7 1630,2 1630,0 +0,2 8 1656,1 1656,0 +0,1 15 9 1690,0 1690,1 -0,1 10 1690,3 1690,1 +0,2 11 1642,2 1642,0 +0,2 12 1727,4 1727,1 +0,3 13 1727,3 1727,2 +0,1 2 0 - “Määritetty ^Cf-fissiofragmentin lentoajalla massaspektrometrisesta yleisimpien läsnäolevien isotooppien keskiarvosta.

berotus = mitattu - laskettu.

Claims (23)

46 102833

1. Menetelmä peptidin tai proteiinin syntetisoimi-seksi, tunnettu siitä, että 5 A) tarjotaan polymeerisubstraatti, joka on oksas tettu polystyreeniketjuilla, jotka mahdollisesti lisäksi kantavat substituentteja, jotka eivät ole reaktiivisia vallitsevissa synteesiolosuhteissa, jolloin mahdollisia substituentteja lukuun ottamatta oleellisesti kaikkien po-10 lymeeriin oksastettujen polystyreeniketjujen arvioitu mo-lekyylipaino on ainakin 200 000 ja ainakin osa polystyree-nillä oksastetun polymeerisubstraatin polystyreeniketjuis-ta on funktionalisoitu kemiallisella funktionaalisuudella, joka helpottaa ankkuroivan sidoksen muodostusta polysty-15 reeniosan ja ainakin N-suojatun ja mahdollisesti karbok-syylipäätteestä derivatisoidun aminohapon välillä, B) kytketään N-suojattu ja mahdollisesti karboksyy-lipäätteestä derivatisoitu aminohappo funktionalisoituun polystyreeniosaan, jolloin funktionaalisuus ja N-suojattu 20 ja mahdollisesti karboksyylipäätteestä derivatisoitu ami nohappo ovat sopivia toisiinsa siten, että muodostunut ankkuroiva sidos voidaan myöhemmin poistaa oleellisesti ilman syntetisoitavan peptidi- tai proteiiniketjun hajoamista,

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että polystyreenillä oksastettu polymeerisubstraatti muodostetaan altistamalla polymeeri-substraatti, joka on upotettu mahdollisesti substituoidun styreenimonomeerin liuokseen orgaanisessa liuottimessa, käsittelyyn, joka johtaa vapaiden radikaalien muodostumi-25 seen siten, että polystyreeniketjut oksastuvat polymeeri- substraattiin.

2. C) poistetaan N-suojaryhmä kytketyn ja N-suojatun aminohapon N-suojatusta amino- tai substituoidusta amino-ryhmästä siten, että kytketyn aminohapon amino- tai subs-tituoidun aminoryhmän reaktiota toisen aminohapon karbok-syyliryhmän tai aktivoidun karboksyyliryhmän kanssa helpo-30 tetaan, D) saatetaan viimeksi kytketyn aminohapon amino-tai substituotu aminoryhmä reagoimaan toisen N-suojatun aminohapon karboksyyliryhmän tai aktivoidun karboksyyli-ryhmän kanssa siten, että peptidisidos muodostuu kahden 35 aminohappo-osan välille, 47 102833 E) mahdollisesti poistetaan N-suojaryhmä viimeksi kytketyn N-suojatun aminohapon N-suojatusta amino- tai substituoidusta aminoryhmästä siten, että jälkimmäisen aminohapon amino- tai substituoidun aminoryhmän reaktiota 5 toisen N-suojatun aminohapon karboksyyliryhmän tai aktivoidun karboksyyliryhmän kanssa helpotetaan, F) niissä tapauksissa, joissa vaihe E) suoritetaan, toistetaan vaiheet D) ja E) haluttu määrä kertoja, G) mahdollisesti poistetaan jotkin tai kaikki suo-10 jaryhmät, jotka mahdollisesti ovat jäljellä syntetisoidun peptidi- tai proteiiniketjun aminohappo-osissa, H) mahdollisesti poistetaan syntetisoidun peptidi-tai proteiiniketjun ja funktionalisoidun polystyreeniosan välinen ankkuroiva sidos, 15 ja I) mahdollisesti poistetaan mikä tahansa muu ei-ha-luttu ryhmä syntetisoidusta peptidi- tai proteiiniketjus-ta.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittely, joka johtaa vapaiden radikaalien muodostumiseen, on gammasäteilytys, jota 30 käytetään annoksena noin 200 - 5 000 Gy/tunti.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että orgaaninen liuotin on CM-ali-faattinen alkoholi, edullisesti metanoli.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että mahdollisesti substituoidun 48 102833 styreenin tilavuusprosenttimäärä (% v/v) liuoksessa on sellainen, että 20 s % v/v s 80.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mahdollisesti substituoidun 5 styreenin tilavuusprosenttimäärä (% v/v) liuoksessa on sellainen että 25 s % v/v s 35.

7. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mahdollisia substituentteja lukuun ottamatta oleellisesti kaikkien 10 polymeeriin oksastettujen polystyreeniketjujen arvioitu molekyylipaino on 400 000 - 1 400 000.

8. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että polysty-reenillä oksastettu polymeerisubstraatti on valmistettu 15 polymeerisubstraatista levyn tai kalvon muodossa, jonka paksuus on 25 - 100 μτη, ja polymeerisubstraatin polystyreeniket juilla oksastusaste on 100 - 600 paino-%.

9. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemialli- 20 nen funktionaalisuus, joka helpottaa ankkuroivan sidoksen muodostumista ainakin N-suojatun ja mahdollisesti deriva-tisoidun aminohapon ja funktionalisoidun polystyreeniosan välillä, on kloori-, bromi- tai jodisubstituoitu alkyyli, mu- 25 kaan lukien kloorimetyyli, aminosubstituoitu alkyyli, mukaan lukien aminome- tyyli, amino- tai aryylisubstituoitu alkyyli, mukaan lukien a-aminobentsyyli, 30 amino- tai alkyyliaryylisubstituoitu alkyyli, mu kaan lukien o,-amino-2-, a-amino-3- ja a-amino-4-metyyli-bentsyyli, tai hydroksisubstituoitu alkyyli, mukaan lukien hydrok-simetyyli, tai 35 on näistä johdettu, jolloin funktionaalisuus, kun se on « 102833 johdettu mistä tahansa edellä mainituista ryhmistä, on funktionaalisuus, jossa on spacer-ryhmä siten, että syntetisoitu peptidi- tai proteiiniketju on lohkaistavissa polystyreeniosasta oleellisesti ilman ketjun hajoamista.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että funktionaalisuus on peräisin aminoryhmän sisältävästä osasta, joka on aminosubstituoitu alkyyli, amino- tai aryylisubstituoitu alkyyli tai amino-tai alkyyliaryylisubstituoitu alkyyli, ja funktionaalisuus 10 käsittää spacer-ryhmän, joka on 4-(halogeenialkyyli)aryy- li-alempi alkaanihappo, kuten 4-(bromimetyyli)fenyylietik-kahappo, Boc-aminoasyyli-4-(oksimetyyli)aryyli-alempi alkaanihappo, kuten Boc-aminoasyyli-4-(oksimetyyli)fenyyli-etikkahappo, N-Boc-p-asyylibentshydryyliamiini, kuten N-15 Boc-p-glutaroyylibentshydryyliamiini, N-Boc-4'-alempi al- kyyli-p-asyylibentshydryyliamiini, kuten N-Boc-4' -metyyli-p-glutaroyylibenthydryyliamiini, N-Boc-4'-alempi alkoksi-p-asyylibentshydryyliamiini, kuten N-Boc-4'-metoksi-p-glu-taroyylibentshydryyliamiini ja 4-hydroksimetyylifenoksi-20 alempi alkaanihappo, kuten 4-hydroksimetyylifenoksietikka- happo.

11. Polystyreeniket juilla oksastettu polymeeri substraatti, tunnettu siitä, että polystyreeniketjut mahdollisesti lisäksi sisältävät substituentteja, jotka 25 eivät ole reaktiivisia peptidisynteesissä vallitsevissa olosuhteissa, jolloin mahdollisia substituentteja lukuun ottamatta kaikkien polymeerien oksastettujen polystyreeni-ketjujen arvioitu molekyylipaino on ainakin 200 000 ja ainakin osa polystyreenillä oksastetun polymeerisubstraa-30 tin polystyreeniketjuista on funktionalisoitu kemiallisel la funktionaalisuudella, joka helpottaa ankkuroivan sidoksen muodostumista polystyreeniosan ja ainakin N-suojatun ja mahdollisesti karboksyylipäätteestä derivatisoidun aminohapon välillä. so 102833

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen polystyreenillä oksastettu polymeerisubstraatti, tunnettu siitä, että mahdollisia substituentteja lukuun ottamatta oleellisesti kaikkien polymeeriin oksastettujen polystyreeniket- 5 jujen arvioitu molekyylipaino on 400 000 - 1 400 000.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen polystyreenillä oksastettu polymeerisubstraatti, tunnettu siitä, että se on valmistettu polymeerisubstraatista levyn tai kalvon muodossa, jonka paksuus on 25 - 100 μιη, ja jon- 10 ka polymeerisubstraatin polystyreeniketjun oksastusaste on 5 - 800 paino-%.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen polystyreenillä oksastettu polymeerisubstraatti, tunnettu siitä, että polymeerin polystyreeniketjun oksastusaste on 100 - 15 600 %.

15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 11 - 14 mukainen polystyreenillä oksastettu polymeerisubstraatti, tunnettu siitä, että se on levyn tai kalvon muodossa .

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen polystyreenillä oksastettu polymeerisubstraatti, tunnettu siitä, että sen paksuus on 25 - 1000 μιη.

17. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 11 - 16 mukainen polystyreenillä oksastettu polystyreenisubstraatti, 25 tunnettu siitä, että kemiallinen funktionaalisuus, joka helpottaa ankkuroivan sidoksen muodostumista ainakin N-suojatun ja mahdollisesti derivatisoidun aminohapon ja funktionalisoidun polystyreeniosan välillä, on kloori-, bromi- tai jodisubstituoitu alkyyli, mu- 30 kaan lukien kloorimetyyli, aminosubstituoitu alkyyli, mukaan lukien aminome- tyyli, amino- tai aryylisubstituoitu alkyyli, mukaan lukien a-aminobentsyyli, 35 amino- tai alkyyliaryylisubstituoitu alkyyli, mu- 51 102833 kaan lukien a-amino-2-, ar-amino-3- ja a-amino-4-metyyli-bentsyyli, tai hydroksisubstituoitu alkyyli, mukaan lukien hydrok-simetyyli, tai 5 on näistä johdettu, jolloin funktionaalisuus, kun se on johdettu mistä tahansa edellä mainituista ryhmistä, on funktionaalisuus, jossa on spacer-ryhmä siten, että syntetisoitu peptidi- tai proteiiniketju on lohkaistavissa po-lystyreeniosasta oleellisesti ilman ketjun hajoamista.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen polystyreenillä oksastettu polymeerisubstraatti, tunnettu siitä, että funktionaalisuus on peräisin aminoryhmän sisältävästä osasta, joka on aminosubstituoitu alkyyli, amino- tai aryylisubstituoitu alkyyli tai amino- tai alkyyliaryyli-15 substituoitu alkyyli, ja funktionaalisuus käsittää spacer-ryhmän, joka on johdettu seuraavista: 4 -(halogeenialkyy-li)aryyli-alempi alkaanihappo, kuten 4-(bromimetyyli)fe-nyylietikkahappo, Boc-aminoasyyli-4-(oksimetyyli)aryyli-alempi alkaanihappo, kuten Boc-aminoasyyli-4-(oksimetyy-20 li)fenyylietikkahappo, N-Boc-p-asyylibentshydryyliamiini, kuten N-Boc-p-glutaroyylibentshydryyliamiini, N-Boc-4'-alempialkyyli-p-asyylibentshydryyliamiini, kuten N-Boc-4'-metyyli-p-glutaroyylibenthydryyliamiini, N-Boc-4'-alempi-alkoksi-p-asyylibentshydryyliamiini, kuten N-Boc-4' -metok-25 si-p-glutaroyylibentshydryyliamiini ja 4-hydroksimetyyli- fenoksi-alempi alkaanihappo, kuten 4-hydroksimetyylifenok-sieti kkahappo.

19. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 11 - 18 mukainen polystyreenillä oksastettu polystyreenisubstraatti, 30 tunnettu siitä, että polymeeri on polyolefiini, edullisesti polyeteeni.

20. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 11 - 19 mukaisen peptidiä kantavan polystyreenillä oksastetun poly-meerisubstraatin käyttö analyyttisessä menetelmässä valoa 35 läpäisevänä kantaja-aineena, joka helpottaa spektrofoto- 52 102833 metristä antigeeni/vasta-aine-reaktion monitorointia, jolloin antigeeni on peptidi, joka syntetisoidaan polystyree-nillä oksastettuun polymeerisubstraattiin ja joka jää siihen ankkuroituna.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen käyttö, tun nettu siitä, että monitorointi käsittää ELISA-teknii-kan käytön.

22. Patenttivaatimuksen 20 tai 21 mukainen käyttö, tunnettu, siitä, että polymeerisubstraatti, jota 10 käytetään polystyreenillä oksastukseen on levyn tai kalvon muodossa, jonka paksuus on 2 5 - 100 /nm ja on oksastettu polystyreeniketjuilla 5 - 200 %:n määrään.

23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että polymeerisubstraatti, jota käyte- 15 tään polystyreenillä oksastukseen, on oksastettu polystyreeniket juilla 10 - 60 %:n määrään. 53 102833