NO180198B - Peptidsyntese-fremgangsmåte og fast bærer for anvendelse i fremgangsmåten - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for syntese av et peptid eller protein, hvilken fremgangsmåte omfatter trinnene: A) tilveiebringelse av et polymert substrat podet med funksjonaliserte polystyrenkjeder, B) kopling av en N-beskyttet og eventuelt karboksyl-endederivatisert aminosyre til den funksjonaliserte polystyrenrest, hvilken funksjonalitet av nevnte N-beskyttede og eventuelt karboksylavsluttede derivatiserte aminosyre er slik tilpasset til hverandre at anker-bindingen som dannes deretter kan spaltes i det vesentlige uten nedbrytning av peptid- eller proteinkjeden som skal syntetiseres, C) fjerning av N-beskyttelsesgruppen fra en N-beskyttet amino- eller substituert aminogruppe i den koplede og H-beskyttede aminosyre, slik at reaksjonen til amino-eller den substituerte aminogruppe i den koplede aminosyre med en karboksylgruppe eller en aktivert karboksylgruppe av en ytterligere aminosyre blir lettere, D) omsetning av nevnte amino- eller substituerte aminogruppe i den sistkoplede aminosyre med en karboksylgruppe eller en aktivert karboksylgruppe av en ytterligere N-beskyttet aminosyre, slik at det dannes en peptidbinding mellom de to aminosyrerester, E) eventuelt fjerning av den N-beskyttende gruppe fra en N-beskyttet amino- eller substituert aminogruppe i den sistkoplede N-beskyttede aminosyre, slik at omsetningen av amino- eller den substituerte aminogruppe i den sistnevnte aminosyre med en karboksylgruppe eller aktivert karboksylgruppe i en ytterligere N-beskyttet aminosyre, blir lettere, F) i de tilfeller hvor trinn E) er blitt utført, gjen-tas trinn D) og E) et ønsket antall ganger, G) eventuelt fjerning av noen eller alle beskyttelses-grupper som eventuelt er igjen på aminosyrerestene i det syntetiserte peptid eller proteinkjede, H) eventuelt spaltning av bindingen som forankrer det

syntetiserte peptidet eller proteinkjede til den funksjonaliserte polystyrenrest, og

I) eventuelt fjerning av enhver ytterligere uønsket

gruppe fra det syntetiserte peptid eller proteinkjede;

et polymert substrat podet med polystyrenkjeder, hvilke polystyrenkjeder eventuelt ytterligere bærer substituenter som ikke er reaktive under de foreliggende betingelser i peptidsyntese; og

anvendelse i en analytisk fremgangsmåte av et peptidbærende polystyrenpodet polymersubstrat fremstilt fra et polystyren-podet polymersubstrat som et lysgjennomtrengelig bærermateriale som letter den spektrofotometriske over-våkning av en antigen/antistoff-reaksjon, hvilket antigen er et peptid syntetisert på, og som forblir forankret til, det polystyren-podede polymersubstsrat.

Fremgangsmåten er vel egnet både til syntese av et enkelt peptid eller protein og for parallell og i alt vesentlig simultansyntese av en mengde av disse. Spesielt vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte som anvender et polymert substrat podet med polystyrenkjeder som den faste bærer, idet polystyrenkjedene eventuelt dessuten bærer substituenter som ikke er reaktive under de fremherskende betingelser i syntesen, og som har en beregnet molekylvekt, ikke innbefattet eventuelle substituenter, på minst 200.000. oppfinnelsen anvender konvensjonelle kjemiske metoder og lar seg lett tilpasse til syntese i både analytisk skala (mikrogram) og preparativ skala (milligram eller større). Dessuten lar oppfinnelsen seg tilpasse til både satsvise og kontinuerlige fremgangsmåter som kan drives manuelt, halvautomatisk eller helautomatisk.

Tidligere fastfasemetoder for syntese av peptider eller proteiner har i høy grad vært basert på den originale metode utviklet av Merrifield, som anvender en funksjonalisert tverrbundet styren/divinylbenzenkopolymer, hvor den tverrbundede kopolymer er dannet ved polymerisering av styren-monomer tilsatt et par prosent (typisk ca. 2 %) divinylbenzen. Denne kopolymer tilveiebringes vanligvis i form av perler eller partikler, ofte med en dominerende partikkelstørrelse på 20-80 /xm. Den funksjonalisering som opprinnelig ble foretrukket av Merrifield (se f.eks. Journal of the American Chemical Society 85, 2149 (1963)), var en funksjonalisering av de aromatiske ringer i kopolymeren med klormetylgrupper, innfort via omsetning av den faste kopolymer med SnCl4/klormetylmetyleter, selv om flere andre funksjonell gruppeer, innbefattet aminometyl, a-aminobenzyl og a-amino-4-metylbenzyl etterhvert er blitt anvendt. Uansett type, er hensikten med funksjonell gruppe vanligvis å danne en forankringsbinding mellom den kopolymere faste bærer og C-terminalen i den første aminosyren som man ønsker å kople til den faste bærer. Nyere raffinnementer i Merrifield-metoden har innbefattet den ytterligere innføring, mellom en funksjonell gruppe (f.eks. en av de ovenfor nevnte funksjonell gruppe) på polystyrenkjedene og C-terminalen i den første aminosyre som skal tilkoples, av en bifunksjonell "spacer11 eller "håndtakgruppe" med en reaktivitet som er skreddersydd bl.a. for å møte ønskede krav med hensyn både til koplingen av den første aminosyre til den faste bærer og/eller til den letthet hvormed den fullstendige, syntetiserte peptid-eller proteinkjede blir spaltet fra den faste bærer. Eksempler på slike spacer grupper omfatter fenylacetamidometyl (Pam) og p-alkoksybenzylester-systemene. En nylig oversikt over ut-viklingen av metoden for fastfase-peptidsyntese siden dens introduksjon av Merrifield er gitt av Barany et al. (Int. J. Peptide Protein Res. 30, 705-739(1987)).

Nye fremskritt i bioteknologi, spesielt på området rekombinant DNA, har frembrakt en unik situasjon: tilgjengeligheten og den raske akkumulering av mange nye proteinsekvenser med udefinert eller ukjent funksjon og/eller i ukjent biologisk aktivitet. Detaljert strukturanalyse ved seterettet mutagenese eller lignende molekyl-konstruksjon har betydd en nyttig tilnærming vedrørende den rolle som aminosyrerestene spiller for de aktive setene i proteinene.

Spesifikk informasjon vedrørende biologisk aktive funksjonelle underenheter inneholdende ca. 5-40 aminosyrerester oppnås imidlertid fortrinnsvis ved kjemisk syntese. Eksisterende fastfaseteknologi er ganske tilstrekkelig til å gi slike peptider i sikkert og med høy renhet, men den vanlige metoden for fastfasepeptidsyntese via en "lineær" tilnærmingsmetode gir bare et peptid pr. syntese.

En fremgangsmåte som anvender en "simultan" eller "parallell" tilnærmingsmetode til syntesen av peptider er derfor ønskelig, for derved å gjøre det lettere å fremstille et stort antall peptider som kan anvendes f.eks. til å definere og kartlegge proteinenes funksjonelle enheter.

Et hovedtrekk ved fastfaseteknikken for peptidsyntese er at i hver forlengelse av peptidkjeden med en ytterligere aminosyre vil alle behandlingstrinn være repetitive i forhold til den foregående syklus med et mulig unntak for selve aminosyrekoplingstrinnet, hvori en ytterligere aminosyre som kan eller som ikke behøver å være identisk med den som ble koplet i den foregående syklus, blir koplet til peptidkjeden. En parallell, i alt vesentlig simultan syntese av mer enn ett peptid, kan således oppnås ved parallell gjennomføring av de repetitive trinn, såsom avbeskyttelse, nøytralisering og vasking, som er felles for de parallelle synteser. Det tekniske hovedproblem er å oppnå skille av hvert amino-syrekoplingstrinn slik at det ikke vil forekomme kryss-forurensning.

To forskjellige metoder er nylig blitt foreslått for den i alt vesentlige simultane syntese av flere peptider: Den første av disse metoder (Geysen et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81, 3998-4002 (1984) og 82, 178-82 (1985)) ble utformet for rask screening av peptidepitoper via ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) i 96-microtiter-brønner. Den anvender akrylsyrepodet polyetylen-stav og 96-mikrotiter-brønner til å immobilisere voksende peptidkjeder og til å gjennomføre den skillende syntese. Selv om den imidlertid er høyst effektiv, kan metoden ikke anvendes i preparativ skala, dvs. ved fremstilling av milligram mengde. Den andre metode (Houghton, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 82, 5131-35 (1985)) anvender en "tepose" inneholdende de tradisjonelt anvendte polymerperler til romavdelt syntese, idet porsjoner av peptidylharpiksperler blir holdt adskilt i forseglede poser av finmasket polypropylennett. Sistnevnte metode er relevant for fremstilling av milligrammengder.

De åpenbare fordeler ved on fremgangsmåte som tillater parallell og i alt vesentlig simultan syntese av en mengde peptider er den medfølgende tidsbesparelse og muligheten for å kvitte seg med det repetitive arbeid som er involvert i å gjennomføre syntese av hvert peptid individuelt.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter alle de fordelaktige trekk ved begge de ovenfor nevnte metoder og tilbyr dessuten fordelene som allerede er nevnt, ved å tilveiebringe de ønskede peptider eller proteiner i høyt utbytte og med høy renhet, og som passer like godt til syntese i både analytisk og preparativ skala. Oppfinnelsen vil i høy grad være til fordel ved studier av strukturaktivitets forhold, undersøkelser som kartlegging av antigene epitoper, bestemmelse av detaljer i samvirke mellom hormoner og reseptor, og screening for farmakologisk aktive peptidyl medikamenter, samt være av stor verdi i studier vedrørende den molekylære organisasjon av proteinenens funksjonelle underenheter generelt.

Oppfinnelsen er basert på tilveiebringelse og anvendelse av en fast bærer omfattende et polymert substrat til hvilket er podet lange og i alt vesentlige ikke tverrbundete polystyrenkjeder, som under disse betingelser og antageligvis på grunn av at de er lett sterisk tilgjengelige, fungerer som spesielt effektive fastfasebærere for de peptider som skal syntef iseres.

Oppfinnelsen gjør bruk av uløseligheten av ikke-tverrbundede polyolefiner, f.eks. polyetylen, i alle organiske løsningsmidler ved omgivende temperatur. Ettersom den podede polymer fremdeles er et termoplastisk materiale og løselig ved forhøyet temperatur, er omforming også mulig.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig. l beskyttelsesskjerna for fastfasesammenkopling av (Asp<76-> hPTH fragment (70-84) på 443 vekt % polystyren-podet

polyetylen.

Fig. 2 analytisk PHLC kromatogram for (A) rått H-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH, (B) rått H-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH, og (C) rått H-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH på mBONDAPAK™ C18 (300 x 3,9 mm, 10 jxm) . Buffer A: H2O/0,095 % CF3COOH; buffer B: 90 % acetonitril/10 % H2O/0,072 % CF3COOH; strømningshastighet 1,3 ml/min. Fig. 3 aminosyresekvenser for melittin (7-21) og melitin-analoger (7-21). Fig. 4 analytiske PHLC kromatogramer for rå-melitin (7-21) og analoger etter lav/høy HF-spalting (før lyofilisering). Kromatogram 1 er for rå-melitin (7-21), dvs. peptid 1, kromatogram 2 er for rått peptid 2, osv. Buffer A: 5 % CH3CN/95 % H2O/0,0445 % TFA; buffer B: 60 % CH3CN/40 % H2O/0,0390 % TFA; lineær gradient: 5-95 % av B på 30 minutter;

strømningshastighet 1,5 ml/min; kolonne: Vydac C18 (0,46 x 25 cm) .

Den innledningsvis beskrevne fremgangsmåte er særpreget ved at den estimerte moelkylvekt av hovedsakelig alle polystyrenkjedene podet til polymeren, ikke innbefattende eventuelle substituenter, er minst 200.000, i det minste en del av polystyrenkjedene til det polystyrenpodede polymersubstrat er funksjonalisert med en kjemisk funskjonalitet som letter dannelsen av en forankringsbinding mellom polystyrenresten og en i det minste N- beskyttet og eventuelt karboksylende-derivatisert aminosyre, og at polystyren-kjedene eventuelt bærer ytterligere substituenter som ikke er reaktive under de foreliggende betingelser i syntesen.

Betegnelsen polymersubstrat som anvendt i den foreliggende sammenheng betegner en hvilken som helst egnet polymer som kan podes som beskrevet og som i seg selv er i alt vesentlig uløselig i og inert i forhold til de reaksjonsmedier som anvendes i syntesen. Egnede polymerer kan velges f.eks. fra polyamider, så som nylon, polyimider, polyparaxylilener, polyhalogenfluoralkener, så som polytetrafluoretylen eller polyklortrifluoretylen, penolformaldehydpolymerer og poly-olifiner, som som polypropylen og polyetylen. Polymersubstratet kan utformes i en hvilken som helst egnet form, f.eks. en folie, film, perle, pellet, skive, ring, rør, stav eller nett. I foretrukne utførelser av fremgangsmåter for peptid- eller proteinsyntese ifølge den foreliggende oppfinnelse er polymersubstratet lavtetthets polyetylen i form av en folie eller film, selv om eksperimenter antyder (vide infra) at høytetthets polyetylen også er egnet.

De polystyrenkjeder som podes til polymersubstratet, kan være kjeder av selve polystyren eller av polystyren som er substituert i en viss utstrekning med substituenter som ikke er i stand til reaksjon under de betingelser som er fremherskende i syntesen. Slike substituenter kan passende være f.eks. alkylsubstituenter, så som metyl, etyl, propyl eller butyl, alkoksysubstituenter så som metoksy, etoksy, propoksy og butoksy, eller aryloksysubstituenter, så som fenoksy. Substitusjonen vil fortrinnsvis ta form av substitusjon i de aromatiske ringene med en eller flere substituenter, f.eks. en eller flere av de ovennevnte substituenter, selv om substitusjon på ikke-aromatiske karbonatomer av vinylgruppen opprinnelse også kan tenkes. I foretrukne utførelser av fremgangsmåter for peptid-eller proteinsyntese ifølge den foreliggende oppfinnelsen hvor polymersubstratet i disse tilfeller er polyetylen, vil de podede polystyrenkjedene være kjeder av ikke-substituert polystyren.

Det innledningsvis nevnten polymere substrat podet med polymerkjeder er særpreget ved at den estimerte molekylvekt av hovedsakelig alle polystyrenkjedene odet til polymeren, ikke innbefattende eventuelle substituenter, er minst 200.000, idet minst en del av polystyrenkjedene i det polystyrenpodede polymersubstrat er funksjonaliserte med en kjemisk funksjonalitet som letter dannelsen av en forankringsbinding mellom polystyrenresten og en i det minste N-beskyttet og eventuelt karboksyende-derivatisert aminosyre.

I et ytterligere trekk ifølge den foreliggende oppfinnelse kan polystyrenkjeder som oppfyller denne betingelsen, passende dannes ved en i alt vesentlig radikal initiert omsetning mellom polymersubstratet og eventuelt substituert styrenmonomer som er tilstede i en løsning av monomerern i et organisk løsningsmiddel. Eksperimenter har vist at når en polyetynelfolie eller film blir podet med polystyrenkjeder under betingelser hvor polyetylenfolien eller filmen er neddykket i løsninger med varierende konsentrasjon av styrenmonomer i et løsningsmiddel så som metanol, og den radikal-initierte omsetningen blir oppnådd ved "y-stråling, vil det ikke bare foregå en podningsreaksjon, men det vil bli dannet ikke-podede (dvs. frie) polystyrenkjeder. Selv om det for tiden ikke er noen åpenbar, likefrem metode til nøyaktig å bestemme molekylvekten for selve de podede polystyrenkjedene, kan molekylvekten for de dannede ikke-podede polystyrenkjedene lett bestemmes ved f.eks. såkalt "størrelseseksklusjons-kromatografi". Det er blitt funnet at når det anvendes ren styrenmonomer, dvs. at ingen metanol er til stede, vil molekylvekten av de ikke-podede polystyrenkjedene (heretter betegnet som "homopolymer") okkludert i folien (og ekstrahert fra folien med diklormetan) og som dannes under et visst sett av 7-strålings betingelser, overveiende være ca. 180.000, og at homopolymerens fremherskende molekylvekt vil øke med økende metanolinnhold i styrenmonomer/metanolløsningen; f.eks. vil den dominerende molekylvekten (Mtopp) i 70:30 (v/v) metanol/styren være ca. 1.000.000.

Resultater oppnådd med polystyrenpodet polyetylenfolie podet i forskjellige grader gir sterke indikasjoner på at molekylvekten for homopolymeren okkludert i folien og molekylvekten for de podede polystyrenkjedene stemmer ganske godt overens, som det skal forklares mere detaljert i det følgende: Størrelseeksklusjonkromatografi etablerer et forhold mellom forbindelsenes molekylvekt og retensjonsvolum, den såkalte "kalibreringskurve". Molekylvekten for en gitt fraksjon av f.eks. polystyrenhomopolymer med et spesielt retensjonsvolum blir bestemt ved sammenligning med retensjonsvolumer for polystyrenstandarder med kjent molekylvekt. Siden imidlertid ingen polystyrenpodede polyetylenstandarder med kjent kjedemolekylvekt er tilgjengelig, vil det beste som kan gjøres være å sammenligne med retensjonsvolumene for polyetylenstandarder under de samme løsningsbetingelser.

Den podede folie, homopolymeren og polystyrenstandardene kan løses f.eks. i varm xylen, og i flere slike eksperimenter ble molekylvekten for den mest forekommende fraksjon (Mtopp) av homopolymeren funnet å være ca. 1.000.000. Mtopp verdien funnet for den polystyrenpodede polyetylenfolien på basis av ovennevnte sammenligning med retensjonsvolumer av polystyrenstandarder, var ca. 3.000.000 og oppover (det kan regnes med at en viss andel av de individuelle polyetylenkjedene kan podes med mer enn en polystyrengruppe, og at Mtopp verdien bestemt på måten ovenfor for den polystyrenpodede polyetylen derfor kan være lik med eller høyere enn den for den tilsvarende okkluderte polystyren homopolymer.

Ytterligere sannsynlighet for gyldigheten av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for molekylvektbestemmelse kan også avledes av de ovenfor nevnte eksperimenter som følger: Forekomsten, nL, av en spesiell fraksjon, i, med molekylvekt Mi er proporsjonal med høyden av fordelingskurven ved det retensjonsvolum som tilsvarer ML. Den såkalte "vektmidlere molekylvekt", M„, er da gitt ved: mens den såkalte "tallmidlere molekylvekt", Mn, er gitt ved:

Foreliggende teori vedrørende radikalinitiert polymerisering regner med et M^Mn forhold ("polydispersiteten") på 2.0. En verdi på ca. 2 ble funnet for homopolymeren, og verdien funnet for den polystyrenpodede polyetylen var også ca. 2, som kan tas som en indikasjon på at polystyrenkjedene podet til polyetylensubstratet, har vokst i alt vesentlig på samme måte som homopolymeren, hvilket gir ytterligere tiltro til den fremgangsmåte for molekylvektbestemmelse som er skissert ovenfor. De beregnede molekylvektene som det refereres til-i den foreliggende beskrivelse og krav, ble beregnet på ovenfor beskrevne måte.

Det antas derfor at molekylvekten for okkludert homopolymer dannet under et gitt sett av betingelser (løsnings-midler, styrenkonsentrasjon, temperatur, 7-strålingsintensitet og varighet av ^-bestrålingen) meget nær vil reflektere molekylvekten for de podede polystyrenkjedene som er dannet under det samme sett av betingelser, slik at molekylvekten som er bestemt for homopolymeren kan tas som en beregning av molekylvekten for de podede polystyrenkjedene.

Det blir også antatt at tettheten av podeseter på overflaten av et polymersubstrat, dvs. antallet punkter for tilknytning av polystyrenkjeder pr. enhet av overflateareal, såvel som utstrekningen av tverrbindingen av de podede polystyrenkjedene, blir sterkt påvirket av de betingelser som podingen foregår under, spesielt av egenskapene til det organiske løsningsmiddel som anvendes i podeprosessen. Hydroksylorganiske løsningsmidler, spesielt alkoholer så som metanol, er relativt hydrofile, og blir derfor antatt å være blandt de dårligere løsningsmidler som kan velges for å løse en relativt hydrofob substans så som styren monomer. Graden av solvatisering av monomeren med et slikt løsningsmiddel er derfor ventet å være relativt lav, sammenlignet med den grad av solvatisering som ville forventes med et mere hydrofobt organisk løsningsmiddel, f.eks. et halogenert alifatisk hydrokarbon så som diklormetan (diklormetan er nemlig et foretrukket reaksjonsløsningsmiddel i metoden for fastfase-peptidsyntese, både generelt og i sammenheng med den foreliggende oppfinnelse). Det antas at dårlig svelling eller solvatisering av de podede polystyrenkjedene under podeprosessen i et løsningsmiddel så som metanol vil holde mobiliteten for de voksende polystyrenkjedene på et lavt nivå og derved føre til retardasjon av de diffusjonskontrollerte kjedetermineringsprosessene og således lette veksten av spesielt lange polystyrenkjeder.

Et attraktivt trekk ved den høye molekylvekt for de podede polystyrenkjedene i sammenheng med den foreliggende oppfinnelse er at når de er funksjonalisert, kan de antas å oppføre seg, med hensyn til sin reaktivitet overfor løste reagens, i stor utstrekning som om de var ikke-podede (dvs. frie) funksjonaliserte polystyrenkjeder i homogen løsning; den letthet hvormed funksjonaliserte podede polystyrenkjeder som er dannet ifølge den foreliggende oppfinnelse kan reagere med løste reagenser, innbefattet beskyttede og eventuelt derivatiserte aminosyrer, kan derfor betraktes som optimal. Det tilsynelatende betydelige fravær av tverrbinding mellom polystyrenkjedene podet til polyolefinet, vil lette utstrakt svelling eller solvatisering av kjedene med et klorhydro-karbonløsningsmiddel (i en foretrukket utførelse ifølge den foreliggende oppfinnelse diklormetan) så som vanligvis foretrukket i fastfasepeptidsyntese. Som tidligere nevnt er den faste bæreren som anvendes i fremgangsmåter for konvensjonell fastfasepeptidsyntese ved anvendelse av metode av "Merrifield-type", vanligvis en funksjonalisert tverrbundet styren/divinylbenzen kopolymer, idet den tverrbundede kopolymer er blitt dannet ved polymeriseringen av styren-monomer hvortil er blitt tilsatt et par prosent (typisk ca. 2 %) divinylbenzen. Denne tverrbinding reduserer graden av svelling eller solvatisering av den funksjonaliserte kopolymer matrix i forhold til den som er fremherskende for funksjonaliserte, podede polystyrenkjeder som er dannet ifølge den foreliggende oppfinnelse, og reduserer derved tilsvarende reaktiviteten av den førstnevnte matrix.

Ifølge oppfinnelsen blir det foretrukket at den beregnede molekylvekt av i alt vesentlig alle de polystyrenkjedene som er podet til polymeren, ikke innbefattet eventuelle substituenter, er i området 300.000 til 1.600.000, spesielt 400.000 til 1.400.000, fortrinnsvis 600.000 til 1.200.000. Den for tiden foretrukne beregnede molekylvekt for i alt vesentlig alle polystyrenkjedene er 700.000 til 1.000.000. Det blir antatt at de høyere beregnede molekylvektene på 400.000 og høyere er spesielt fordelaktige, men på den annen side synes podingen av polystyrenkjeder med de høyeste beregnede molekylvektene på ca. 1.000.000 og mer å ha en skadelig virkning på polymersubstratets mekaniske egenskaper, spesielt når substratet, som det ofte foretrekkes, er i form av en

folie eller film.

Graden av polystyrenkjedepoding i polymersubstratet, dvs. vekt % av polystyren i forhold til polymersubstratet, avhenger naturligvis av polystyrenkjedenes lengde, tettheten av podesetene og polymersubstratets dimensjoner, og kan variere innenfor vide grenser. I tilfelle f.eks. en folie eller film av polymersubstrat med en tykkelse i området 25 til 100 ura. kan således graden av polystyrenkjedepoding være f.eks. fra 5 til 800 vekt %, så som fra 10 til 700 %. Både svært lave og svært høye grader av polystyrenkjedepoding, såvel som midlere podingsgrader, er av verdi i sammenheng med foretrukne utførelser ifølge den foreliggende oppfinnelse.

For analytiske formål, hvor det vanligvis ønskes å være i stand til å syntetisere peptidsekvenser av proteiner i liten skala, typisk mikrogramskala, vil således tilveiebringelse av f.eks. et polymersubstrat med en relativt lav grad av polystyrenkjedepoding, så som f.eks. 5 - 200%, vanligvis 10 til 60% (for en folie eller film av polymersubstrat med tykkelse i området 25 til 100 pm), og fortrinnsvis med en kontrollert, ofte lav grad av funksjonalisering, sikre kontrollert begrensning av de dannede peptidmengder.

Polystyrenpodet polyetylenfolie eller -film fremstilt som foretrukket innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse, er spesielt fordelaktig når det gjelder analytiske forhold ved peptidkjemi eller -biokjemi, ved at dens høye grad av transparens for lys, spesielt synlig lys, letter anvendelse av spektrofotometriske teknikker, f.eks. for overvåkingen (f.eks. ved ELISA teknikk) av antigen/antistoff reaksjoner som kan overvåkes ved en påfølgende fargereaksjon og hvori antigenet kan være en spesiell peptidsekvens som er syntetisert på og som forblir forankret til den faste bærer.

For preparative formål, hvor oppnåelse av det høyest mulige utbytte av et peptid eller et protein er klart ønskelig, er det fordelaktig å anvende den høyeste praktisk mulige podingsgrad. Utifrå et generelt synspunkt vil den praktiske øvre grense for podingsgraden for en folie elle film av polymersubstrat med en tykkelse i området 25 til 100 /xm

(som anvendt ifølge foretrukne utførelser) ofte være ca. 500 til 600 vekt %, selv om spesielle anvendelser kan gjøre det ønskelig å overskride dette området, så som til en podingsgrad på ca. 700%. På den annen side vil de laveste praktisk mulige podingsgrader vanligvis ikke v«:re lavere enn ca. 40% for en slik tynn folie eller film. For de fleste praktiske formål vil podingsgraden for en slik tynn folie eller film være i området på ca. 100 til 600% og vil ofte være i området 200 til 600%, og for preparative formål ofte fortrinnsvis 200 til 400 vekt%, som synes å være et egnet område både når det gjelder utbytte og effektivitet av peptidsyntese gjennomført ved anvendelse av funksjonalisert podet folie og når det gjelder mekanisk styrke av den podede folie eller film.

Som det vil fremgå av eksemplene som illustrerer oppfinnelsen, kan det oppnås ekstraordinært høye utbytter av svært rene peptider, f.eks. ved anvendelse av foretrukne utførelser av fremgangsmåter ifølge den foreliggende oppfinnelse som anvender funksjonalisert polystyrenpodet polyetylenfolie eller -film dannet utifrå et polyetylen-substrat i form av en tynn folie eller film med tykkelsen omkring 50 fim og med en podingsgrad i området 400 til 500%.

I et trekk ifølge oppfinnelsen blir, som nevnt ovenfor, det polystyrenpodede polymersubstratet dannet ved en i alt vesentlig radikal-initiert omsetning mellom polymersubstratet og eventuelt substituert styrenmonomer som er tilstede i en løsning av nevnte monomer i et organisk løsningsmiddel. Som også nevnt ovenfor er det fordelaktig, når det gjelder å oppnå lange, i alt vesentlig ikke-tverrbundede polystyrenkjeder, og gjennomføre podingen i et løsningsmiddel hvori de voksende polystyrenkjedene blir dårlig svellet eller solvatisert, så som et hydroksylorganisk løsningsmiddel, spesielt en alkohol. Foretrukne alkoholer for dette formål er C1- 4 alifatiske alkoholer. I praksis er metanol blitt funnet å være et mest egnet løsningsmiddel, men det blir overveiet at også f.eks. etanol, propyl- og isopropropylalkoholer, og n-butyl-, iso-butyl-, sec-butyl- og tert-butyl-alkoholer vil kunne anvendes. Volumprosenten (% v/v) av eventuelt substituert styren i den løsning som anvendes for podingen, så som en løsning i et løsningsmiddel som sveller eller solvatiserer de voksende polystyrenkjedene dårlig, f.eks. et hydroksylløsningsmiddel som forklart ovenfor, spesielt en alkohol som forklart ovenfor, så som f. eks. metanol, har en markert innflytelse på molekylvekten av de podede polystyrenkjedene som dannes, ved at, i det minste opptil et visst punkt, den kjedelengdeøkende virkningen av løsningsmiddelet er større, jo høyere volumprosenten av løsningsmiddelet er i løsningen. Selv om volumprosenten av eventuelt substituert styren i løsningen kan være innenfor et svært bredt område, så som mellom 1 og 95%, vil denne volumprosenten således vanligvis være i området 10 til 90%, mere vanligvis 20 til 80%. Et svært interessant område for volumprosenten av det eventuelt substituerte styren i løsningen er mellom 25 og 50%, og som det vil fremgå av eksemplene, er et område på 25 til 35%, med andre ord ca. 30 volumprosent, blitt funnet i praksis å gi bærere med utmerkede egenskaper. En indikasjon på forholdet mellom volumprosenten av styen i metanol under podeprosessen og de resulterende beregnede polystyrenkjedelengder, fremkommer av de nedenfor nevnte eksperimenter over forholdet mellom voluprosenten av den eventuelt substituerte styren og molekylvekten av den dannede homopolymer ved konstant "Y-strålings dose og doserate.

Podefremgangsmåten blir svært passende gjennomført ved t-bestråling i fravær av oksygen og ved i alt vesentlig omgivende temperatur eller svakt forhøyet temperatur, mens trykket er lik det samlede damptrykk av de flytende komponenter, eventuelt supplementert med et moderat trykk av en inert gass så som argon, slik at det samlede trykk deretter kommer opp i ca. 1 atmosfære. En egnet måte til fjerning av oksygen fra reaksjonssystemet er å underkaste systemet for gjentatte fryse- tine sykler på et høyvakuum apparat. "Y-bestrålingen blir passende gjennomført med en doserate i området fra ca. 1 til ca. 100.000 Gy/time, spesielt ca. 200 - 5000 Gy/time, så som ca. 300 til 1.000 Gy/time. Det antas at intensiteten av bestrålingen er av betydelig viktighet for å oppnå den ønskelige konfigurasjon med lange i alt vesentlig ikke tverrbundede polystyrenkjeder; dersom intensiteten er for høy, vil fri radikaldannelsen være så høy at podingen vil ha tendens til å involvere et høyere antall av kortere kjeder og muligens en høyere grad av tverrbinding, som begge vanligvis ikke er ønsket.

I det hele tatt blir optimaliseringen av kjedelengden, podingen, og de optiske egenskapene for bærere (som er spesielt viktig når bæreren er en folie eller en film) gjennomført via valget av polymer, eventuelt substituert styrenmonomer, reaksjonsblanding, strålingsdoserate, og temperaturen under bestrålingen.

Selv om den ovenfor beskrevede fremgangsmåten innbefattende ^-bestråling er den for tiden foretrukne fremgangsmåte, blir det overveiet at polystyrenpodede filmer passende kan fremstilles ved anvendelse av en forskjellig strategi som innbefatter konvensjonelle radikalinitiatorer, så som peroksider, f.eks. hydrogenperoksid, benzoylperoksid eller diacetylperoksid, eller azoforbindelser som de radikaldannende prinsipper. Andre radikaldannende prinsipper som kan anvendes, er f.eks. ozon og uv-stråling; et annet spesielt interessant radikaldannende prinsipp er en elektronstråle. Det som er viktig er at den anvendte fremgangsmåte for radikaldannelsen er en som er egnet for relativt godt kontrollert radikal-initiert vekst av polystyrenkjedene. Det antas at de betingelser som er nevnt ovenfor vedrørende viktigheten av egenskapene for det anvendte løsningsmiddel, også gjelder i forbindelse med disse friradikalinitieringsprinsipper.

Det blir også overveiet at det kan være mulig å fremstille polystyren/polyetylen blokk kopolymerer som kan være nyttige for den foreliggende oppfinnelse på en måte som ikke gjør anvendelse av radikalinitiering. F. eks. er det således mulig å anvende anionisk polymerisering for å syntetisere en blokk kopolymer av butadien og styren, hvori kjedelengden av de to blokkene kan kontrolleres presist. Det er mulig å hydrogenere denne polymer på en slik måte at polybutadienblokken blir omdannet til polyetylen. Det dannede polyetylen vil ha en slik regulær struktur at det i fast tilstand vil danne høytetthetspolyetylen. Det er kritisk for denne fremgangsmåte at polyetylendelen av kopolymeren bør danne en koherent film. Det blir overveiet at dette kan oppnås på følgende måte: etylen/styrenblokk kopolymeren blir løst i et løsningsmiddel hvori polystyrendelen er løselig ved romtemperatur og høyere temperaturer, men hvori polyetylendelen bare er løselig når løsningsmiddelet er varmt. Et eksempel på et slikt løsningsmiddel er xylen. Polymerløsningen blir plassert i en form og langsomt avkjølt til under den temperatur hvorved polyetylen felles ut. Når polyetylenfiImen er blitt dannet, blir resten av løsningsmiddelet fjernet.

Det blir videre overveiet at sistnevnte skisserte alternative fremstillingsmetode kan utvides til fremstilling av andre polystyren/polyolefin blokk kopolymerer, f.eks. polystyren/polypropylen-blokk-kopolymerer, ved anvendelse av dienmonomerer forskjellige fra butadien, f.eks. 2-metyl-l,3-pentadien i tilfelle polystyren/polypropylen blokk kopolymer.

Selv om det polystyrenpodede polymersubstratet kan være i en hvilken som helst passende form, så som forklart ovenfor, er svært interessante utførelser av oppfinnelsen slike hvori det tar form av en folie eller film. Tykkelsen av selve polymersubstratet, f.eks. et polytylensubstrat, som er utgangsmateriale for en slik folie eller film, kan variere innenfor et vidt område og vil vanligvis være fra 10 til 10000 jim, for de fleste formål fortrinnsvis i området 25 til 1000 /xm, og typisk i området 25 til 100 /im så som 25 til 75 /ra. Podeprosessen fører naturligvis til en økning av tykkelsen. Jo tynnere en folie eller en film er, jo høyere vil således den prosentvise økning i tykkelsen være for et gitt sett av podebetingeIser. Som eksempel kan en tynn podet folie eller film ha en tykkelse i området 25 til 200 /im.

Ettersom den podede polymer i form av folie eller film er et termoplastisk materiale og løselig ved forhøyet temperatur, blir omforming etter at podeprosessen er fullstendig, overveiet som en mulighet. Når det gjelder en polystyrenpodet polyetylenfolie eller film, som foretrukket i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse, er det derfor mulig å løse folien eller filmen i et egnet løsningsmiddel og la løsningen få avkjøle seg og løsningsmiddelet fordampe for å oppnå et nytt "avstøp" av polymerbæreren, f.eks. som en tynnere folie eller film, med de podede polystyrenkjedene. Det egnede løsningsmiddel er et som ved passende høy temperatur løser polymerbæreren med sine podede polystyrenkjeder (men med bibehold av podingen) og som ved avkjøling til lavere temperatur ikke lenger er i stand til å beholde polymersubstratet i løsningen, men som fremdeles effektivt sveller eller solvatiserer polystyrenkjedene. Et eksempel på et slikt løsningsmiddel som kan anvendes f.eks. for polystyrenpodede polyetylen, er et xylen eller en blanding av xylener.

En folie eller film har flere fordeler ved praktisk gjennomføring av peptid- eller proteinsyntese. Folie eller film kan således f.eks. lett skjæres ut i egnede størrelser for tilpasning i de anvendte reaksjonsbeholdere, så som en hvilken som helst type av kjente reaksjonsbeholdere for fastfase peptidsyntese, omfattende flasker, begere, mikro-begere, trakter, brønner, kolonner eller nett.

Film- eller foliebæreren gjør det mulig å utforme nye praktiske måter til håndtering av peptidsyntesen. Således kan f.eks. et antall folie- eller filmstykker arrangeres på en felles bærer og således holdes sammen under de forskjellige trinnene i peptidsyntesen, f.eks. ved sammen å bli utsatt for de forskjellige reagenser og vaskeløsningsmidler, eller stykkene kan ordnes i sett slik at hvert sett blir underkastet en spesiell kombinasjon av reaksjonsmedier.

Denne sistnevnte mulighet letter effektiv "kompartmen-talisering" hvorved to eller flere peptider kan fremstilles på en parallell og i alt vesentlig simultan måte.

I et trekk tilveiebringer oppfinnelsen således en spesielt praktisk metode for "kompartmentalisert" syntese av peptider og proteiner, idet dette trekk er basert på anvendelse av en polystyrenpodet folie eller film som bærer for fastfase peptidsyntesen. Dette trekk ifølge oppfinnelsen kan uttrykkes som en fremgangsmåte for syntese av et eller flere peptider eller proteiner, hvilken fremgangsmåte, når to eller flere peptider eller proteiner skal syntetiseres, tillater den parallelle og i alt vesentlige simultane syntese av det ønskede antall peptider og proteiner, idet fremgangsmåten omfatter: A) tilveiebringelse av en mengde av i alt vesentlig identiske polymersubstrater podet med polystyrenkjeder, idet nevnte polystyrenkjeder eventuelt dessuten bærer substituenter som ikke er reaktive under de fremherskende betingelser i syntesen, og minst en del av polystyrenkjedene i hvert poly-styrepodet polymersubstrat er funksjonalisert med en kjemisk funksjonell gruppe som befordrer dannelsen av en forankringsbinding mellom polystyrengruppene og en i det minste N-beskyttet og eventuelt karboksylterminalderivatisert aminosyre B) eventuell fysisk segregering av bestanddelene av nevnte mengde av polystyrenpodede polymersubstrater i to eller flere sett, hvert omfattende ett eller flere bestanddeler av nevnte mengde, kobling av en N-beskyttet og eventuelt karboksylterminalderivatisert aminosyre til de funksjonaliserte polystyrengruppene i hvert bestanddel av nevnte mengde eller, hvor det lar seg anvende, hver enkelt bestanddel i hvert sett, idet den anvendte N-beskyttede og eventuelt karboksylterminalderivatiserte aminosyre er identisk for alle bestanddelene i mengden eller, hvor det lar seg anvende, alle bestanddelene i et sett, og, hvor det lar seg anvende, ytterligere er i samsvar med et av følgende alternativer:

(i) identiske for alle settene,

(ii) når antallet av nevnte sett er større enn 2, identiske for i det minste to av settene,

(iii) forskjellige for hvert sett,

idet nevnte funksjonelle gruppe og nevnte N-beskyttede og eventuelt karboksylterminalderivatiserte aminosyrer er tilpasset til hverandre slik at den dannede forankringsbinding etterhvert kan spaltes i alt vesentlig uten nedbrytning av peptidet eller proteinkjeden som skal syntetiseres

C) behandling av hver enkelt bestanddel av nevnte mengde eller, hvor det lar seg anvende, hver enkelt bestanddel av

hvert nevnte sett slik at den N-beskyttende gruppen kan fjernes fra en N-beskyttet amino-eller substituert aminogruppe i den koplede og N-beskyttede aminosyre, slik at omsetningen av aminogruppen eller den substituerte aminogruppen i den koplede aminosyre med en karboksylgruppe eller en aktivert karboksylgruppe i en ytterligere N-beskyttet aminosyre blir befordret D) omsetning av nevnte amino- eller substituerte aminogruppe i den aminosyre som sist ble koplet til de funksjonaliserte polystyrengruppene i hver bestanddel av nevnte mengde eller, hvor det lar seg anvende, i hver bestanddel av nevnte mengde eller, hvor det lar seg anvende, i hver bestanddel av hvert sett med en karboksylgruppe eller en aktivert karboksylgruppe i en ytterligere N-beskyttet aminosyre, slik at det dannes en peptidbinding mellom nevnte amino- eller substituerte aminogruppe og nevnte karboksylgruppe eller aktiverte karboksylgruppe, idet nevnte ytterligere N-beskyttede aminosyre er identisk for alle bestanddelene i mengden eller, hvor det lar seg anvende, alle bestanddelene i et sett, og hvor det lar seg anvende, ytterligere er i samsvar med et av de tre alternativer nevnt ovenfor i forbindelse med trinn B) E) eventuell behandling av hver bestanddel av nevnte mengde eller, hvor det lar seg anvende, hver bestanddel av hvert nevnte sett slik at den N-beskyttende gruppe kan fjernes fra en N-beskyttet amino- eller substituert aminogruppe i den sist koplede N-beskyttede aminosyre, slik at omsetningen av aminogruppen eller den substituerte aminogruppe i sistnevnte aminosyre med en karboksylgruppe eller aktivert karboksylgruppe i en ytterligere N-beskyttet aminosyre blir befordret F) i de tilfeller hvor trinn E) er blitt gjennomført, repetisjon av trinnene D) og E) et ønsket antall ganger, G) eventuell behandling av hvert bestanddel av nevnte mengde eller, hvor det lar seg anvende, hver bestanddel av hvert nevnte sett for å fjerne noen eller alle beskyttende grupper som muligens blir tilbake på aminosyregruppene i den syntetiserte peptid- eller proteinkjede H) eventuell behandling av hver enkelt bestanddel av nevnte mengde eller, hvor det lar seg anvende, hver enkelt bestanddel av hvert nevnte sett for å spalte bindingen som forankrer den syntetiserte peptid- eller proteinkjede til de funksjonaliserte polystyrengruppene i hver enkelt bestanddel av nevnte mengde eller, hvor det lar seg anvende, av hver enkelt bestanddel av hver nevnte sett

og

I) eventuell fjerning av en eventuell ytterligere uønsket gruppe fra en syntetisert peptid- eller proteinkjede.

En praktisk måte til håndtering av polymerbæreren i form av en folie eller film for kompartmentaliseringsformål er å kutte folien eller filmen i et ønsket antall stykker som deretter merkes uutslettelig, f.eks. ved hjelp av grafittbasert blekk smeltet inn i overflaten av en del av folien eller filmen. En annen mulighet er å ta de forskjellige stykkene tilstede på et og det samme store stykke folie eller film, og deretter behandle de forskjellige områdene (som er passende merket som beskrevet ovenfor) sammen eller separat i hvert enkelt tilfelle. En utførelse er åpenbart å la stykkene forbli på en og samme film sålenge som behandlingene som skal gjennomføres er de samme, og deretter dele opp filmen i underenheter når de trinn som skal gjennomføres er forskjellige.

Den kjemiske funksjonelle gruppe som befordrer dannelsen av en forankringsbinding mellom en i det minste N-beskyttet og eventuelt derivatisert aminosyre og den funksjonaliserte polystyrengruppe, er passende en bestanddel av, eller er avledet av en bestanddel av gruppen omfattende:

Klor-, brom- og jod-substituert alkyl,

amino-substituert alkyl,

amino- og aryl-substituert alkyl,

amino- og alkylaryl-substituert alkyl,

hydroksy-substituert alkyl,

idet den funksjonelle gruppe, dersom den er avledet av en hvilken som helst av nevnte grupper, er en funksjonell gruppe med en spacergruppe slik at en syntetisert peptid- eller

proteinkjede vil la seg spalte fra polystyrengruppen i alt vesentlig uten nedbryting av nevnte kjede.

Ifølge hensiktsmessig utførelse av oppfinnelsen er klor-substituert alkyl klormetyl, amino-substituert alkyl er aminometyl, amino- og alkyl-suDstituert aryl er a-aminobenzyl (benzhydrilamino), amino- og alkylaryl-substituert alkyl er valgt fra gruppen bestående av a-amino-2-, a-amino-3- og a-amino-4-metylbenzyl (sistnevnte er også kjent som 4-metylbenzhydrilamino), og hydroksy-substituert alkyl er hydroksymetyl.

Når det gjelder den initielle funksjonalisering av det polystyrenpodede polymersusbstrat, er mer enn 50 fremgangsmåter beskrevet i forbindelse med tradisjonell fastfase peptidsyntese (se Barany og Merrifield i The Peptides, Vol. 2, Academic Press, New York, 1979, pp. 1-284, og Stewart og Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. utgave, Pierce Chemical Company, Illinois, 1984), hvori reaksjoner for innføring av klormetyl (via en klormetyl metyleter/SnCl4 reaksjon, aminmetyl (via en N-hydroksymetylftalimid reaksjon; se Mitchell et al., Tetrahedon Lett., 3795, (1976)) og benzydrilaminogrupper (Pietta og Marchall, J. Chem. Soc, 650

(1979)) er de som anvendes i størst ustrekning. Andre reaktive funksjonelle grupper som er blitt innført til å begynne med, omfatter 4-metylbenzhydrilamino og 4-metoxybenzhydrilamino. Alle av disse etablerte fremgangsmåter er i prinsippet anvendbare innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse. Foretrukne utførelser av fremgangsmåter for peptid- eller proteinsyntese innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse anvender aminometyl som initialfunksjonen gruppe, ved at aminometyl er spesielt fordelaktig med hensyn til innføring av "spacer" eller "håndtakgrupper" p.g.a. reaktiviteten av aminogruppen i aminometyl funksjonell gruppe med hensyn til den i alt vesentlig kvantitative dannelse av amidbindinger til en karboksylsyregruppe i den ene enden av det spacerdannende reagens. Et kolossalt antall relevante spacer- eller håndtaks-dannende bifunksjonelle reagenser er beskrevet (se Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res., 30, 705-739 (1987), spesielt reagenser som er reaktive overfor aminogrupper, så som aminogruppen i aminometylfunksjonen, omfattende en 4-(halogenalkyl)aryl-lavere alkansyre så som 4-(brommetyl)fenyl-eddiksyre, en Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)aryl-lavere alkansyre så som Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)fenyleddiksyre, N-Boc-p-acylbenzhydrilamin, så som N-Boc-4'-metyl-p-glutaroylbenz-hydrilamin, N-Boc-4'-lavere alkyl-p-acyl-benzhydrilamin så som N-Boc-4' metylglutaroylbenz-hydrilamin, N-boc-4'-lavere alkoksy-p-acylbenzhydrilamin så som N-Boc-4'-metoksy-p-glutaroyl-benzhydrilamin og 4-hydroksymetylfenoksy-lavere alkansyre så som 4-hydroksymetylfenoksy eddiksyre.

Visse funksjonelle grupper, så som benzhydrilamino, 4-metylbenzhydrilamino og 4-metoksybenzhydrilamino som kan innføres med den hensikt å spalte av en syntetiset peptid-eller proteinkjede fra den faste bærer slik at C-terminalen i peptid- eller proteinkjedene er i amidform, krever ingen innføring av en spacergruppe, og en eventuell slik funksjonell gruppe kan fordelaktig anvendes innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse.

En alternativ strategi vedrørende innføring av spacer-eller håndtaksgrupper er strategien for det såkalte "for-dannede håndtak" (se Tam et al., Synthesis, 955-57, (1979)), som tilbyr fullstendig kontroll over koplingen av den første aminosyre, og utelukker muligheten for komplikasjoner som skriver seg fra tilstedeværelsen av uønskede funksjonelle grupper uten sammenheng med peptid- eller proteinsyntesen. I denne strategi blir spacer- eller håndtaksgrupper, vanligvis spacer- eller håndtaksgrupper av den samme type som beskrevet ovenfor, omsatt med den første aminosyre som man ønsker å forankre til den faste bærer, idet aminosyren er N-beskyttet og eventuelt beskyttet på andre sidekjeder som ikke er relevante når det gjelder oppbygging av den ønskede peptid-eller proteinkjede. Egnede N-beskyttende grupper er Boe, vanligvis i kombinasjon med benzylgrupper for beskyttelse av sidekjedene, og Fmoc, vanligvis i kombinasjon med t-butyl for beskyttelse av eventuelle sidekjeder (Boe = t-butyloksykarbonyl; Fmoc = 9-fluorenylmetyloksykarbonyl), selvom det eksisterer flere andre muligheter som er vel kjent i konvensjonell fastfase peptidsyntese.

I de tilfeller hvor en spacer- eller håndtaksgruppe er ønskelig, kan den første aminosyre som skal koples til den faste bæreren således enten kobles til den frie reaktive ende av en spacergruppe som er blitt bundet til den initielt inn-førte funksjonelle gruppe, f.eks. aminometyl, eller den kan omsettes med det spacerdannende reagens, som i sin tur deretter blir omsatt med den initielt innførte funksjonelle gruppe.

Etter fullføring av koblingen av den første aminosyre som skal sammenkoples, er det neste trinn i fastfasesyntesen den systematiske utarbeiding av den ønskede peptid- eller proteinkjede. Denne utarbeiding omfatter gjentatte avbeskyttelses/- koblingssykler. Den midlertidige beskyttelsesgruppe, såsom en Boc-eller Fmoc gruppe som beskrevet ovenfor, på den sist tilkoblede aminosyre, blir kvantitativt fjernet ved en egnet behandling, f.eks. ved acidolyse, som f.eks. med trifluor-eddiksyre i tilfelle Boe, eller ved basebehandling som f.eks. med piperidin i tilfelle Fmoc, for å frigjøre den N-terminale aminfunksjon i den sist tilkoplede aminosyre.

Den neste ønskede N-beskyttede aminosyre blir deretter koblet til N-terminalen i den sist tilkoblede aminosyre. Denne tilkobling av C-terminalen i en aminosyre med N-terminalen i den sist tilkoblede aminosyre kan oppnås på flere måter, f.eks. ved å fremskaffe den innkommende aminosyre i en form med karboksylgruppen aktivert på en hvilken som helst av flere fremgangsmåter, omfattende den initielle dannelse av et aktivt esterderivat, eller den initielle dannelse av et anhydrid. Alternativt kan karboksylgruppen i den innkommende aminosyre omsettes direkte med N-terminalen i den sist tilkoblede aminosyre ved hjelp av et kondensasjonsreagens, f.eks. dicykloheksylkarbodiimid eller derivater derav.

Etter den fullførte sammenkobling av den ønskede peptid-eller proteinkjede, innbefattet beskyttende grupper, vil det neste trinn vanligvis være avbeskyttelse av aminosyregruppene i peptid- eller proteinkjeden, og spalting av det synteriserte peptid eller protein fra den faste bærer. Disse fremgangsmåter kan finne sted i alt vesentlig simultant, og derved tilveiebringe det frie peptid i den ønskede form. Alternativt, i tilfelle i hvor kondensasjon av to separat syntetiserte peptid- eller proteinkjeder skal utføres, er det mulig ved å velge en egnet spacergruppe ved begynnelsen av syntesen, å spalte de ønskede peptid- eller proteinkjeder fra sine respektive faste bærere, idet både peptid- eller proteinkjedene fremdeles innbefatter sine sidekjedebeskyttende grupper, og tilslutt fjerne de sidekjedebeskyttende gruppene, etter f.eks. tilkobling av de to sidekjedebeskyttede peptid-eller proteinkjedene for å danne en lengere peptid- eller proteinkjede. En tredje mulighet som er spesielt relevant f.eks. når det gjelder analytiske forhold i peptidkjemien eller - biokjemien, er å fjerne de sidekjedebeskyttende gruppene fra den syntetiserte peptid- eller proteinkjede uten å spalte forankringsbindingen som holder kjeden fast i den faste bærer.

Det regnes med at polystyrenpodede polyetylensubstrater analoge med dem ifølge den foreliggende oppfinnelse, men omfattende linker- eller spacer grupper tilpasset til den spesielle aktuelle kjemi, kan være verdifulle ved syntese av enkelte eller multiple biopolymer molekyler forskjellige fra peptidene. Et eksempel vil være syntese av oligonucleotider, da disse er begrepsmessig enkle å syntetisere siden det vanligvis kreves bare fire forskjellige reaksjonskomparte-menter, et for hver av de fire involverte nucleotidenhetene

(dvs. A, T, G og C for DNA fragmenter, eller A, G, C og U for RNA fragmenter). Slik syntese kunne utføres på parallell og i alt vesentlig simultan måte, på en måte som er analog med den som er beskrevet innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen, hvor de anvendte forkortelser er som følger:

LISTE OVER FORKORTELSER

Boe: tert-butyloksykarbonyl

C1Z: 2-klorbenzyloksykarbonyl

DCC: N,N'-dicykloheksylkarbodiimid

DCU: N,N'-dicykloheksylurea

DIEA: N,N-diisopropyletylamin

DMF: N,N-dimetylformamid

FABMS: Hurtig atom bombardement massespektrometri

HOBt: 1-hydroksybenzotriazol

HPLC: høytrykks-veske kromatografi

Pam: fenylacetamidometyl

PE: polyetylen

PP: Polypropylen

SEC: størrelse-eksklusjons kromatografi

SPPS: fastfase peptidsyntese

TFA: trifluor eddiksyre

TFMSA: trifluormetansulfonsyre

THF: tetrahydrofuran

De anvendte forkortelser for de forskjellige aminosyrer er i samsvar med anbefalingene til IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature (J. Biol. Chem., 247, 977-983 (1972), og refererer i alle tilfeller til aminosyrer med L-konfigurasjon.

EKSEMPEL 1

Generell fremgangsmåte for fremstilling av polystyrenpodet polyetylenfo1ie.

Styren (99 % Aldrich) ble ledet gjennom basisk aluminium-oksyd; i noen tilfeller ble den ytterligere destillert fra natrium eller kalsiumhydrid. 20 ml av en 30 % (v/v) løsning av renset styren i metanol ble plassert i en ampulle sammen med en rektangulær stripe av lavtetthets PE folie som var blitt vasket i n-hexan. Den anvendte folie hadde en tykkelse på 54 /im. Løsningen ble inngående avgasset ved gjentatte fryse-tinesykler på en høyvakuum linje, og ampullen ble deretter forseglet under vakuume. Ampullen og innholdet ble deretter bestrålt i en kobolt gamma bestrålingsenhet. Bestrålingen ble utført i to trinn, idet ampullen ble flyttet fra et sted i bestrålingskilden til et annet mellom de to trinnene, for å sikre en dosefordeling så homogen som mulig. Doseraten var ca. 400 Gy pr. time. Den høyest anvendte doserate var 417 Gy pr. time og den laveste 339 Gy pr. time. Etter bestråling ble folien ekstrahert i et Soxhlet apparat med diklormetan og tørket. Spesifikke data er oppført i tabell 1. Det er bemerkelsesverdig at selvom det er en klar korrelasjon mellom bestrålingsdosen og utstrekningen av podingen, er det mye spredning i datamengden. Dette er delvis på grunn av den såkalte "ettervirkning", idet polymeriserings-prosessen fortsetter i en viss utstrekning etter at bestrålingen er stanset. Som eksempel på denne effekt ble ampullen inneholdende folien bestrålt med en samlet dose på 3,4 kGy for å gi en 450 % podet folie, etterlatt på utsiden av bestrålingskiIden i 10 timer mellom de to bestrålingstrinnene. Dessuten ble ampullen åpnet først 10 døgn etter fullføring av bestrålingen. En lignende fremgangsmåte ble anvendt for folien bestrålt med en samlet dose på 2.0 kGy til å gi 230 % poding.

100/(masse av polyetylen)

§ : Toppen av folien ble skadet under lokkingen av ampullen.

Folier med en pode % på henholdsvis 46, 129 og 331, er også blitt fremstilt.

EKSEMPEL 2

Fremgangsmåte for poding på ikke-vevet filt laget av fibere bestående av en polypropylenkjerne og et annet sjikt av høytetthets polyetylen.

Den ikke-vevede PP/PE filt ble vasket med n-hexan og bestrålt i en lukket ampulle inneholdende en avgasset 30 %

(v/v) løsning av renset styren i metanol, på en måte fullstendig analog med den generelle fremgangsmåte beskrevet i eksempel 1. Resultatene er gitt i tabell 2.

EKSEMPEL 3

Inflydelse av metanol/styrenforhold på kjedelengden i podet polystyren.

Følgende resultater ble oppnådd for bestråling av lavtetthets polyetylenfolier i forskjellige

metanol/styrenblandinger (5 kGy dose, 400 Gy/time doserate, romtemperatur) :

Det kan sees at molekylvekten (bestemt ved størrelses-eksklusjonskromatografi på kolonnematerialet av tverrbundet styren/divinylbenzen) av homopolymerfraksjonen okkludert blandt de podede kjedene i de polystyrenpodede polyetylen-foliene og ekstrahert fra foliene med diklormetan, har økt som funksjon av metano1/styrenforhoIdet i løsningen. På samme tid har molekylvektfordelingen hatt en tendens til å bli snevrere for høye metanol/styren-forhold.

EKSEMPEL 4

Eksperimenter for beregning av molekylvekten av de podede polystyrenkj edene.

Polystyren-homopolymeren ekstrahert fra foliene ble karakterisert ved SEC. Den ekstraherte polystyren viser typisk en molekylvektfordeling med to buler. Dette er p.g.a det faktum at polystyren er dannet både i folien og i den omgivende løsning under bestrålingen. Dersom en folie blir vasket kort i diklormetan før Soxhlet ekstraksjonen blir utført, vil mengden av den lavmolekylære fraksjonen bli betydelig redusert i forhold til mengden av den høymolekylære fraksjonen. Molekylvektdata for den høymolekylære fraksjon av den ekstraherte homopolymer er gitt i tabell 3. Typiske prøvestørrelser var fra 0,01 mm til 0,2 mm polymer. For homopolymeren fra foliene podet i en utstrekning på henholdsvis 173, 220, 231 og 450 vekt % ble det anvendt en 60 cm kolonne av Toyo Soda TSK GMH6 for SEC ved omgivende temperatur med THF som elueringsmiddel og en strømningshastighet på 0,5 ml/min. For homopolymeren fra folien podet i en utstrekning på 443 vekt % ble det anvendt en 50 cm kolonne av Shodex A80-M for SEC ved 50°C med xylen som løsningsmiddel og en strømningshastighet på 0,5 ml/min. Dette oppsett ble også anvendt for SEC av den dannede podede polymer, men nu operert ved 90°C og med en strømningshastighet på ca. 0,3 ml/min. De podede foliene er løselige i varm xylen. Molekylvektdata for polystyrenpodet polyetylen fra de 5 podede foliene er gitt i tabell 4. Alle de gitte molekylvektdata ble beregnet ved anvendelse av en kalibreringskurve basert på polystyrenstandarder med molekylvekter fra 2.800 g/mol til 8.000.000 g/mol, idet formen på kalibreringskurven ble tilpasset med et tredje ordens polynom. Anvendelse av en første ordens (lineær) kalibreringskurve fører til lignende resultater. Det bør bemerkes at mens de molekylvekter som ble oppnådd for styren homopolymeren er absolutte, er de oppnådde molekylvekter for podekopolymeren ikke absolutte. Når det gjelder Shodex A80-M kolonnen var ekstrapolering av kalibreringskurven nødvendig for å beregne de observerte ekstremt høye molekylvekter. Denne ekstrapolering kan føre til undervurdering av den vektmidlere molekylvekt og derfor også av polydispersiteten. Den upodede polyetylen ble karakterisert ved høytemperatur SEC ved anvendelse av 1,2,4-triklorbenzen som elueringsmiddel. Følgende verdier ble oppnådd: M^, = 4 x IO<4> g/mol og M^Mn = 5. Sistnevnte data ble oppnådd ved anvendelse av en kalibreringskurve basert på polystyrenstandarder.

Data for polystyren-homopolymerene viser at molekylvekten er ufølsom for den samlede strålingsdose, mens for den polystyrenpodede polyetylen den målte molekylvekt stort sett er proporsjonal med dosen. Disse observasjoner viser at de svært langkjedede podingene blir dannet under hele bestrålings-fremgangsmåten og at i alt vesentlig bare antallet podinger blir påvirket av dosen.

EKSEMPEL 5

Omdanning av en polystyren-podet polyetylenfolie.

Et stykke av en 173 % podet folie (se tabell 1) ble løst

i xylen ved 100°C, og løsningen helt i en teflon form ved 80°C. Etter langsom fordampning av xylenen ble det dannet en svært tynn film. På grunn av filmens ekstreme tynnhet var det ikke mulig å oppnå annet enn små biter (1 til 2 mm firkanter) av filmen. Disse små bitene disintegrerte imidlertid ikke når de ble utsatt for diklormetan.. Dette betyr at en kontinuerlig polyetylenfase er dannet på nytt.

EKSEMPEL 6

Aminometylering (funksjonalisering) av polystyren-podede PE folier.

Åtte like store rektangulære striper (1,5 x 4,5 cm) av 443 % polystyrenpodet polyetylenfolie (tilsammen 1,30) ble plassert i en 60 ml SPPS reaksjonbeholder på en manuell SPPS ryster, og vasket med 40 ml av TFA/CH2C12 (1:1 v/v) i 3 x 5 minutter. En løsning av 0,35 g (1,9 mmol) N-(hydr oksymetyl) - ftalimid (97 % renhet; EGA-kjemi) i 40 ml av TFA/CH2C12 (1:1 v/v) ble tilsatt til de vaskede folier, og blandingen ble rystet i 10 minutter. 10 ml av TFMSA/TFA/CH2C12 (10:45:45 v/v/v) ble tilsatt langsomt i løpet av en 4 - 5 timers periode, og rystingen ble fortsatt i ytterligere 3 timer. Foliene ble isolert ved filtrering og vasket i rekkefølge med følgende: TFA/CH2C12 (1:1 v/v) (120 ml), CH2C12 (240 ml), metanol (160 ml), og etanol (160 ml). De ble deretter rystet i 40 ml etanol inneholdende 10 % hydrazin (Fluka) i 12 timer ved 70°C. Foliene ble filtrert fra den varme blandingen og vasket i rekkefølge (med 20 minutters rysting for hver vasking) med følgende: Varm etanol (3 x 40 ml), varm DMF (3 x 40 ml), varm etanol (3 x 40 ml), varm metanol (3 x 40 ml), og CH2C12 (3 x 40 ml). Tilslutt ble foliene behandlet med 40 ml av DIEA/CH2C12 (1:9 v/v) i 2 x 5 minutter, vasket med 200 ml av CH2C12, og tørket ved romtemperatur. Tilsammen 4 spektrofotometriske ninhydrinfargetester viste 1,00 mmol NH2/g folie (henholdsvis 0,99, 0,96, 1,02 og 1,01 mmol/g), og elementæranalyse angav 1,07 mmol N/g folie.

Følgende polystyrenpodede polyetylenfolier er også blitt aminometylert:

EKSEMPEL 7

Fremstilling av BocGln-4-(oksymetyl)-Pam-folie.

0,63 g aminometyl-folie (substitusjon = 1,0 mmol/g folie; 443 % poding) ble for-vasket i 30 ml DMF/CH2C12 (1:2 v/v) i 3 x 3 minutter i en 60 ml reaksjonsbeholder på en SPPS ryster. 0,98 g Boc-Gln-4-(oksymetyl)fenyleddiksyre (2,5 mmol, 4 ekvivalenter) og 0,38 g HOBt (2,5 mmol, 4 ekvivalenter) ble løst i 20 ml DMF/CH2C12 (1:1 v/v) og rystet i et skrulukket rør i 3 minutter ved 0°C. 0,52 g DCC ble løst i 10 ml CH2C12 og tilsatt til blandingen. Etter omrøring i 25 minutter ved 0°C ble DCU filtrert fra, og filtratet ble tilsatt til den forvaskede aminometylfolie og rystet i 2 timer. Foliene ble filtrert, vakset med CH2C12, nøytralisert med DIEA/CH2C12 (5:95 v/v), vasket med CH2C12 og tørket. Fraværet av positive nihydrintester indikerte kvantitativ kopling, hvilket også ble bekreftet etter fjerning av Boe gruppen ved følgende behandling: 30 ml TFA/CH2C12 (1:1 v/v) i 1 x 2 minutter og 1 x 30 minutter, 30 ml CH2C12 i 6 x 1 minutt, 30 ml DIEA/CH2C12 (5:95 v/v) i 2 x 5 minutter, og 30 ml CH2C12 i 4 x 1 minutt. 2 ninhydrin tester anga deretter graden av -NH2 substitusjon til å være 0,76 mmol NH2/g folie (henholdsvis 0,74 og 0,77 mmol/g), som er svært nært til den teroretiske verdi på 0,78 mmol NH2/g folie.

EKSEMPEL 8

Peptidsyntese: (a) Sammenkobling av beskyttede humane [Asp<76>]-paratyriud hormon fragmenter 80-84, 75-84 og 70-84 på 443 vekt % polystyrenpodet polyetylenfolie.

BocGln-OCH2-Pam-folie (0,80 g, 443 % poding, 0,58 mmol Gin) ble plassert i et 60 ml reaksjonskar på en SPPS ryster. Beskyttet hPTH 70-84, (se fig. 1) ble sammenkoblet ved

anvendelse av følgende synteseprotokoll:

(1) CH2C12, 35 ml, 3x1 minutter; (2) TFA/CH2C12 (1:1 v/v), 35 ml, 3x1 minutter; (3) TFA/CH2C12 (1:1 v/v), 35 ml, 30 minutter; (4) CH2C12, 35 ml, 6x1 minutter; (5) DIEA/CH2C12 (1:19 v/v) , 35 ml, 3x2 minutter; (6) CH2C12, 35 ml, 6x1 minutter; (7) 3 til 10 mg prøver ble kuttet av for ninhydrinanalyse; (8) beskyttet aminosyre ble koblet som fordannet symetrisk anhydrid (3 ekvivalenter, 0,05 Molar) i 35 ml DMF/CH2C12 (1:4 v/v), med omrysting i 2 timer; (9) CH2C12, 35 ml, 4x2 minutter; (10) 3 til 10 mg prøver ble kuttet av og nøytralisert ved repetisjon av (5) og (6) før ninhydrinanalyse.

Alle koblingene var enkeltkoblinger. Overvåking av syntesen ved anvendelse av den kvantitative ninhydrintest [opprinnelig utviklet for peptidsyntese på perler; se f.eks. Sarin et al., Anal. Biochem., 117, 147 (1981)] ble anvendt med hell (tabell 5), og med unntak (av ukjente grunner) av resultatet for den andre aminosyrekoblingen (dvs. med dannelse av Boc-Ser<83> (Bzl) Gln84-OCH2-Pam-folie) , viste den tilfreds-stillende verdier for koblingseffektiviteten i hvert koblings-trinn. 90 mg av H-lys(C1Z)AlaLys(C1Z)Ser(Bzl)GlnOCH2-Pam-folie ble behandlet med 5 ml vannfri HF/anisol (9:1 v/v) i 1 time ved 0°C for simultant å avbeskytte de sidekjedebeskyttede gruppene og spalte peptidet fra folien. Ekstraksjoner med eter for å fjerne organiske komponenter såsom anisol og akylete anisoler, ble etterfulgt av ekstraksjon over i 10 % vandig eddiksyre. Lyofilisering gav 24,0 mg rått produkt med høy renhet [se HPLC kromatogram i fig. 2 (A)].

Det rå produkt ble renset i to trinn på en preparativ C18 kolonne (300 x 19mm). Buffere omfattende TFA ble dampet av under redusert trykk, og produktet ble løst igjen i vann; løsningen ble filtrert og lyofilisert, og gav 17,8 mg av H-LysAlaLys-SerGln-OH, som bekreftet ved aminosyreanalyse (tabell 6) og FABMS molekylvektmålinger (tabell 7).

Det samlede synteseutbytte var ca. 84 %, og utbytte av rent peptid var ca. 69 % basert på den kvantitative aminosyreanalyse.

(c) Spalting, rensing og identifikasjon av syntetisk hPTH -

(75 - 84).

93 mg av H-ValAsp(OBzl)ValLeuThr(Bzl)Lys(ClZ)AlaLys-(C1Z)Ser(Bzl)Gln-OCH2-Pam-folie ble behandlet på samme måten som for hPTH - (80-84), og gav 36,6 mg rått produkt [se HPLC kromatogram i fig. 2 (B)], og tilslutt 27,2 mg renset peptid, identifisert ved aminosyreanalyse (tabell 6) og molekylvektmålinger (tabell 7). Det samlede synteseutbytte var ca. 85 %, og utbyttet av rent peptid var ca. 69 %, basert på kvantitativ aminosyreanalyse. (d) Spalting, rensing og identifikasjon av syntetisk pPTH-(70-84) . hPTH (70-84) fragmentet ble frigjort fra 96 mg av peptidfolie på samme måten som i (b) og (c) ovenfor [se HPLC kromatogram i fig. 2 (C)]. Det samlede synteseutbyttet var ca. 83 %, og utbyttet av rent peptid var 26 mg (ca. 63 %). Det rene peptid ble identifisert ved aminosyreanalyse (tabell 6) og molekylvektmålinger (tabell 7).

Hydrolysene ble gjennomført i forseglede evakuerte rør med 5,7 molar HC1 inneholdende 0,05 % fenol, 110°C, 20 timer. Analyse ved PHLC ved anvendelse av fluorscencepåvisning (338/450 nanometer etter behandling (etter-kolonnen) med et o-ftaldi-aldehyd derivatiseringsmiddel.

a Verdier i parentes er teoretiske.

b Thr" og Ser" verdier ble ikke korrigert for tap under hydrolyse.

Bestemt ved kvadruppelmasse spektrometri. De beregnede m/z verdier er for C = 12.000 u og H = 1,008 u.

EKSEMPEL 9

Hurtig parallellsyntese av multiple peptidanaloger:

(a) Merking av folie.

Aminometylert 285 vekt% polystyrenpodet polyetylenfolie (0,6 mmol NH2/g folie) ble skåret i 13 adskilte biter (hver bit: 1,5 x 3 cm, ca. 50 /xm tykkelse, ca. 40 mg) og merket enkeltvis ved hjelp av grafittbasert blekk. Et stykke polye-tylenf i lm ble plassert på toppen av hver merkede overflate og smeltet inn i den podede folie ved anvendelse av et elektrisk oppvarmet forseglingsapparat. Til slutt ble foliene rystet i 50 % TFA/CH2C12 i 20 minutter for å kontrollere at alle merkelapper var korrekt forseglet inn. (b) Simultan syntese av melittin- (7-21) og tolv analoger på merkede folier.

Beskyttet mellitin - (7-21), dvs.

og tolv analoger avledet ved substitusjoner i posisjonene 12 og 14 (sekvensene for de frie peptidene er oppført i figur 3) ble alle sammenkoblet trinnvis på en merket folie. De vanlige trinn med avbeskyttelse nøytralisering vasking og kobling av identiske aminosyrer ble gjennomført simultant i en enkelt reaksjonsbeholder, mens koblingen av forskjellige aminosyrer ble utført i separate beholdere.

En standard fastfase prosedyre ble anvendt, ved bruk av dobbelt DCC kobling (3,5 ekvivalenter, 0,05 molar, i 30 % DMF/CH2C12) av alle rester bortsett fra Boc-Gln og Boc-Asn, som ble dobbelt koblet som HOBt estere i 30 % DMF/CH2C12, og Boc-Leu<13> til Gin<14>, som ble dobbelt koblet som et symmetrisk anhydrid i 20 % DMF/CH2C12.

Etter fjerning av den N-terminale Boe gruppe, ble avbeskyttelse og frigjøring av peptidene fra foliene gjennomført ved lav/høy HF metoden (Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105, 6442 (1983)). De frie 15-resters peptidene ble oppnådd i samlet synteseutbytte på ca. 70 %. Fig. 4 viser HPLC kromatogrammer for de 13 urensede peptidene. Alle peptider ble renset i 1 til 2 trinn på en semi-preparativ C18 kolonne. Som eksempel ble oppnådd 3,2 mg ren mellitin (7-21) fra en cm<2 >(23,2 mg) av fullstendig beskyttet peptidfolie. Identiteten av peptidene ble verifisert ved aminosyreanalyse (tabell 8) og molekylvektmålinger (tabell 9).

Peptidene blir hydrolisert i 5,7 molar HC1 ved 110°C i 18 timer i forseglede ikke-evakuerte ror, bortsett fra peptid 1 som ble hydrolysert i 24 timer i et evakuert ror. Etter filtrering ble hydrolysatene analysert på en Beckman 6300 aminosyreanalysator.

a Verdier i parentes er teoretiske.

b Thr- og Ser- verdier ble ikke korrigert for tap under

hydrolyse,

c Tryptofan ble ikke bestemt.

d Peptidanalog nr. 10 ble ikke analysert.

Claims (23)

1. Fremgangsmåte for syntese av et peptid eller protein, hvilken fremgangsmåte omfatter trinnene: A) tilveiebringelse av et polymert substrat podet med funksj onaliserte polystyrenkj eder, B) kopling av en N-beskyttet og eventuelt karboksyl-endederivatisert aminosyre til den funksjonaliserte polystyrenrest, hvilken funksjonalitet av nevnte N-beskyttede og eventuelt karboksylavsluttede derivatiserte aminosyre er slik tilpasset til hverandre at anker-bindingen som dannes deretter kan spaltes i det vesentlige uten nedbrytning av peptid- eller proteinkjeden som skal syntetiseres, C) fjerning av N-beskyttelsesgruppen fra en N-beskyttet amino- eller substituert aminogruppe i den koplede og N-beskyttede aminosyre, slik at reaksjonen til amino-eller den substituerte aminogruppe i den koplede aminosyre med en karboksylgruppe eller en aktivert karboksylgruppe av en ytterligere aminosyre blir lettere, D) omsetning av nevnte amino- eller substituerte aminogruppe i den sistkoplede aminosyre med en karboksylgruppe eller en aktivert karboksylgruppe av en ytterligere N-beskyttet aminosyre, slik at det dannes en peptidbinding mellom de to aminosyrerester, E) eventuelt fjerning av den N-beskyttende gruppe fra en N-beskyttet amino- eller substituert aminogruppe i den sistkoplede N-beskyttede aminosyre, slik at omsetningen av amino- eller den substituerte aminogruppe i den sistnevnte aminosyre med en karboksylgruppe eller aktivert karboksylgruppe i en ytterligere N-beskyttet aminosyre, blir lettere, F) i de tilfeller hvor trinn E) er blitt utført, gjen-tas trinn D) og E) et ønsket antall ganger, G) eventuelt fjerning av noen eller alle beskyttelses-grupper som eventuelt er igjen på aminosyrerestene i det syntetiserte peptid eller proteinkjede, H) eventuelt spaltning av bindingen som forankrer det syntetiserte peptidet eller proteinkjede til den funksjonaliserte polystyrenrest, og I) eventuelt fjerning av enhver ytterligere uønsket gruppe fra det syntetiserte peptid eller proteinkjede; karakterisert ved at den estimerte molekylvekt av hovedsakelig alle polystyrenkjedene podet til polymeren, ikke innbefattende eventuelle substituenter, er minst 200.000, i det minste en del av polystyrenkjedene til det polystyrenpodede polymersubstrat er funksjonalisert med en kjemisk funksjonalitet som letter dannelsen av en forankringsbinding mellom polystyrenresten og en i det minste N-beskyttet og eventuelt karboksylende-derivatisert aminosyre, og at polystyrenkj edene eventuelt bærer ytterligere substituenter som ikke er reaktive under de foreliggende betingelser i syntesen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at polymersubstratet podet til polymerkjedene fremstilles ved å underkaste et polymersubstrat neddykket i en løsning av eventuelt substituert styrenmonomer i et organisk løsningsmiddel, en behandling som fører til dannelsen av frie radikaler, slik at polystyren-kjedene podes til polymersubstratet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at behandlingen som fører til dannelsen av frie radikaler er gammastråling anvendt i en dose fra ca. 200 til ca. 5.000 Gy/time.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det organiske løsnings-middel er en C1_4alifatisk alkohol, fortrinnsvis metanol.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at volumprosentdelen (% v/v) av eventuelt substituert styren i løsningen er slik at 20 < % v/v < 80.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at volumprosentdelen (% v/v) av eventuelt substituert styren i løsningen er slik at 25 < % v/v < 35.

7. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-6, karakterisert ved at den estimerte molekylvekt av i det vesentlige alle polystyrenkjedene podet til polymeren, ikke innbefattende eventuelle substituenter, ligger i området 400.000 - 1,400.000.

8. Fremgangsmåte ifølge hvert av de foregående krav, karakterisert ved at det polystyren-podede polymersubstrat er blitt fremstilt fra et polymersubstrat i form av et ark eller film med tykkelse i området 25 - 100 ixm, og at graden av polystyrenkjedepoding i polymersubstratet ligger i området 100 - 600 vekt%.

9. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-8, karakterisert ved at den kjemiske funksjonalitet som letter dannelsen av en forankringsbinding mellom en minst N-beskyttet og eventuelt derivatisert aminosyre og den funksjonaliserte polystyrenrest, er et element fra, eller er avledet fra et element i gruppen bestående av: klor-, brom- og iod-substituert alkyl, innbefattende klormetyl, aminosubstituert alkyl, innbefattende aminometyl, amino- og arylsubstituert alkyl, innbefattende a-aminobenzyl, amino- og alkylarylsubsitutert alkyl, innbefattende a-amino-2-, a-amino-3- og a-amino-4-metylbenzyl, og hydroksysubstituert alkyl, innbefattende hydroksymetyl, idet funksjonaliteten, om den er avledet fra noen i nevnte gruppe, er en funksjonalitet med en avstandsgruppe, slik at en syntetisert peptid- eller proteinkjede vil være spaltbart fra polystyrenresten i det vesentlige uten nedbrytning av nevnte kjede.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at funksjonaliteten er avledet fra en aminogruppeholdig rest valgt fra aminosubstituert alkyl, amino- og aryl-subsituert alkyl, og amino- og alkylaryl-substitert alkyl, og funksjonaliteten omfatter en avstandsgruppe utledet fra et element i gruppen bestående av 4-(halogenalkyl)aryl-lavere alkansyrer såsom 4-(brommetyl)-fenyleddiksyre, Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)aryl-lavere alkansyrer såsom Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)fenyleddiksyre, N-Boc-p-acylbenzhydrylaminer såsom N-Boc-p-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'-lavere alkyl-p-acylbenzhydrylaminer såsom N-Boc-4'-metyl-p_-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'-lavere alkoksy-p_-acylbenzhydrylaminer såsom N-Boc-4' -metoksy-p_-glytaroylbenz-hydrylamin og 4-hydroksymetylfenoksy-lavere alkansyrer såsom 4-hydroksymetylfenoksyeddiksyre.

11. Polymert substrat podet med polystyrenkjeder, hvilke polystyrenkjeder eventuelt ytterligere bærer substituenter som ikke er reaktive under de foreliggende betingelser i peptidsyntese, karakterisert ved at den estimerte molekylvekt av hovedsakelig alle polystyrenkjedene podet til polymeren, ikke innbefattende eventuelle substituenter, er minst 200.000, idet minst en del av polystyrenkjedene i det polystyrenpodede polymersubstrat er funksjonaliserte med en kjemisk funksjonalitet som letter dannelsen av en forankringsbinding mellom polystyrenresten og en i det minste N-beskyttet og eventuelt karboksyende-derivatisert aminosyre.

12. Styrenpodet polymersubstrat ifølge krav 11, karakterisert ved at den estimerte molekylvekt av hovedsakelig alle polystyrenkjedene podet til polymeren, ikke innbefattet eventuelle substituenter, er i området 400.000 til 1,400.000.

13. Polystyrenpodet polymersubstrat ifølge krav 11 eller 12, karakterisert ved at den er fremstilt fra et polymersubstrat i form av et ark eller film med tykkelse i området 25 - 1000 /im, og hvori graden av polystyrenkj edepoding av polymersubstratet er i området 5-800 vekt%.

14. Polystyrenpodet polymersubstrat ifølge krav 13, karakterisert ved at graden av polystyrenkjedepoding i polymeren er i området 100 - 600%.

15. Polystyrenpodet polymersubstrat ifølge krav 11-14, karakterisert ved at det foreligger i form at et ark eller film.

16. Polystyrenpodet polymersubstrat ifølge krav 15, karakterisert ved at det har en tykkelse på 25 - 100 /im.

17. Polystyrenpodet polymersubstrat ifølge krav 11-16, karakterisert ved at den kjemiske funksjonalitet som letter dannelsen av en forankringsbinding mellom en i det minste N-beskyttet og eventuelt derivatisert aminosyre og den funksjonaliserte polystyrenrest er et element fra, eller er utledet fra, et element i gruppen bestående av klor-, brom- og iod-substituert alkyl, innbefattende klormetyl, amino-substituert alkyl, innbefattende aminometyl, amino- og aryl-substituert alkyl, innbefattende a-aminobenzy1, amino- og alkylaryl-substituert alkyl, innbefattende a-amino-2-, a-amino-3- og a-amino-4-metylbenzyl, og hydroksy-substituert alkyl, innbefattende hydroksymetyl, idet funksjonaliteten, om den er avledet fra noen i nevnte gruppe, er en funksjonalitet med en avstandsgruppe slik at en syntetisk peptid- eller proteinkjede vil være spaltbar fra polystyrenresten hovedsakelig uten nedbrytning av nevnte kjede.

18. Polystyrenpodet polymersubstrat ifølge krav 17, karakterisert ved at funksjonaliteten er utledet fra en aminogruppeholdig rest valgt fra aminosubstituert alkyl, amino- og aryl-substituert alkyl, og amino- og alkylaryl-substituert alkyl, og funksjonaliteten omfatter en avstandsgruppe utledet fra et element fra gruppen bestående av 4-(halogenalkyl)aryl-lavere alkansyrer såsom 4-(brommetyl)-fenyleddiksyre, Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)aryl-lavere alkansyrer såsom Boc-aminoacyl-4-(oksymetyl)fenyleddiksyre, N-Boc-p-acylbenzhydrylaminer såsom N-Boc-p-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'-laverealkyl-p-acylbenzhydrylaminer såsom N-Boc-4'-metyl-E-glutaroylbenzhydrylamin, N-Boc-4'- laver ealkoksy-p_-acylbenzhydrylaminer såsom N-Boc-4'-metoksy-p-glutaroylbenzhydrylamin og 4-hydroksymetylfenoksy-lavere alkansyrer såsom 4-hydroksymety1fenoksyedd iksyre.

19. Polystyrenpodet polymersubstrat ifølge krav 11-18, karakterisert ved at polymeren er et polyolefin, fortrinnsvis polyetylen.

20. Anvendelse i en analytisk fremgangsmåte av et peptidbærende polystyrenpodet polymersubstrat fremstilt fra et polystyrenpodet polymersubstrat ifølge kravene 11-19, som et lysgjennomtrengelig bærermateriale som letter den spektrofotometriske overvåkning av en antigen/antistoff-reaksjon, hvilket antigen er et peptid syntetisert på, og som forblir forankret til, det polystyrenpodede polymersubstrat.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvilken overvåkning medfører bruk av en ELISA-teknikk.

22. Anvendelse ifølge krav 20 eller 21, hvor polymersubstratet som anvendes for polystyrenpoding foreligger i form av et ark eller film med tykkelse i området 25- 100 tim og er podet med polystyrenkjeder i en grad på 5 - 200%.

23. Anvendelse ifølge krav 22, hvor polymersubstratet som anvendes for polystyrenpodingen er podet med polystyrenkjeder i en grad på 10 - 60 %.