DE3586765T2

DE3586765T2 - Immunogenische hav-peptide.

Info

Publication number: DE3586765T2
Application number: DE8585401750T
Authority: DE
Inventors: Joshua S Boger; Emilio A Emini; Joseph Hughes
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1984-09-11
Filing date: 1985-09-09
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2005-09-10
Also published as: CA1270099A; DE3586765D1; EP0175613A2; EP0175613A3; JPS61246199A; US4596674A; EP0175613B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Hepatitis A ist eine Leberkrankheit, die, obwohl sie im allgemeinen nicht tödlich endet, lange Perioden einer entkräftenden Krankheit hervorrufen kann. Diese Krankheit wird im allgemeinen durch direkten Kontakt mit einer infizierten Person oder durch mit HAV kontaminierten Trinkwasser und/oder Lebensmitteln übertragen.
Es ist kein leicht erhältliches Immunogen verfügbar, welches neutralisierende Antikörper gegen das Virus induziert. Das Virus selbst ist schwierig zu kultivieren und die Herstellung ausreichender Mengen für die Verwendung als lebende oder abgetötete Vakzine ist gegenwärtig nicht möglich.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ein Peptid, das die Aminosäurereste 13 bis 24 des VP1 Strukturproteins des HAV enthält, wurde synthetisiert und chemisch an ein Trägerproteinmolekül konjugiert. Das Konjugat des Peptids mit dem Träger löst bei Tieren die Bildung von Antikörpern aus, die an die Hepatitis A Virions gebunden werden und die die Infektivität des Virus neutralisieren. Das Peptid ist als synthetisches Immunogen verwendbar, das spezifisch die Bildung von den HAV neutralisierenden Antikörpern induziert.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

I. AUSWAHL DER PEPTIDSEQUENZEN

Immunogenische Peptidsequenzen aus drei Bereichen der Hepatitis A VP1-Peptidsequenz wurden identifiziert. Diese Peptide umfassen einen Kern einer der folgenden Sequenzen, in denen die Nummer die Stellung der Aminosäuren in der HAV-VP1-Proteinsequenz angibt:
Sie können an beiden Enden durch Aminosäuren, die in den natürlichen Sequenzen enthalten sind, bis zu den aufgeführten Sequenzen, die mit umfaßt werden, erweitert werden:
Zusätzlich kann zu jeder Sequenz an den N- oder C-Terminus, entweder an einen von ihnen oder an beiden, eine oder mehrere Linkeraminosäuren angefügt werden, wie Lys (mit einer freien oder mit einer photoreaktiven Gruppe substituierten Seitenkette), Tyr, Cys, Glu oder Asp, um die Konjugation an einen Träger zu erleichtern. Zusätzlich kann die Sequenz noch eine oder mehrere Spaceraminosäuren, beispielsweise Gly, Ala oder Nle, umfassen, die zwischen der natürlichen Sequenz und den Linkeraminosäuren, oder am H- oder C-Terminus selbst, angeheftet sind. Die endständigen Peptidgruppen können freie oder mit einer p-Benzoylbenzoylgruppe (oder mit einer anderen photoreaktiven Gruppe) substituierte Aminogruppen, N-Acetylreste (oder andere Alkylcarboxyreste) und freie Carboxylgruppen oder Amidgruppen sein.
Bevorzugte Sequenzen sind:
Cys kann entweder als freies Thiol (zur Bindung an den Träger) oder als Acm-Derivat vorliegen. BB bedeutet den p-Benzoylbenzoylrest.

II. PEPTIDSYNTHESEN

Die hier beschriebenen Peptide werden mittels der sequenziellen Festphasensynthese, beginnend vom C-Terminus, gemäß den von Barany & Merrifield in "The Peptides", Vol. 2, Ed. E. Gross & J. Meienhofer, Seiten 1 bis 284, Academic Press, New York, N.Y., (1980) beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines Beckmann 990B Peptid Synthesizer hergestellt, wobei die Arbeitsgänge gemäß den beigefügten Programmen durchgeführt wurden. Die polymeren Körner, von denen ausgegangen wird, bestehen aus mit p-Methylhydrylamin funktionalisiertem Polystyrol-Divinylbenzol (PS-DUB, 1% quervernetzt, siehe Steward et al., "Peptides 1976" Ed., A. Loffet, Seiten 285 bis 290, Editions de 1'Universit de Bruxelles, Belgien, (1976), falls der C-Terminus ein Amid sein soll, oder aus chlormethylfunktionalisiertem PS-DVB, wenn der C-Terminus eine freie Säure sein soll. Die C-terminale Aminosäure der gewünschten Sequenz wird an das Harz in Form ihres an der Aminogruppe geschützten und, falls erforderlich, an der Seitenkette geschützten Derivats ankondensiert, und zwar entweder als ein Amid gemäß den gleichen Verfahrensweisen, die für die Kettenverlängerung verwendet werden, wenn es sich um ein p-Methylbenzhydrylaminharz handelt, oder über eine Esterbindung, wie von Barany & Merrifield beschrieben (siehe oben), wenn es sich um ein chlormethylsubstituiertes Harz handelt. Die anfängliche Aminosäurebeladung des eingesetzten Harzes beträgt 0,1-1,1 mMol/g. Falls es sich um ein Benzhydrylaminharz handelt, werden die verbleibenden noch offenen Aminogruppen mit Acetanhydrid/ Pyridin blockiert, bevor man mit der Kettenverlängerung beginnt.
Nach Entfernung der Aminoschutzgruppe unter Verwendung entweder von 25-40%iger TFA in CH&sub2;Cl&sub2;, die 1% EDTA enthält, oder von 4N HCl in Dioxan, wird das geschützte Derivat der nächsten Aminosäure zugegeben, falls erforderlich zusammen mit einem Kupplungsreagens wie DCC, und zusammen mit Zusatzstoffen wie HBT. Die als Reaktionspartner verwendete Aminosäure kann in Form einer Aminosäure mit aktivierter Carboxylgruppe, beispielsweise als Nitrophenylester, als Aminosäureazid und dergleichen, eingesetzt werden. Eine Kupplungsreaktion kann wiederholt werden, um eine vollständige Umsetzung zu erreichen. Die Abspaltung der Schutzgruppen und die Zugabe der nächsten Aminosäure wird durchgeführt, bis die gewünschte Sequenz gebildet ist. Bei den Kondensationsreaktionen, bei denen mit DCC aktiviertes Gln oder Asn verwendet wird, werden zwei Äquivalente von HBT eingesetzt, um eine Dehydratisierung der Seitenkette zu unterdrücken. Die Abspaltung der Boc-Schutzgruppe der α-Aminogruppe des Gln an der wachsenden Kette wird vorzugsweise mit HCl in Dioxan durchgeführt und die nächste geschützte Aminosäure wird unter Anwendung eines Programms der inverser Zugabe gekuppelt, indem nämlich das Kondensationsmittel im Falle von DCC, zum Harz vor der Aminosäurenkomponente zugegeben wird. Dies unterdrückt eine Nebenreaktion, die Bildung von Pyroglutaminsäure.
Die Auswahl der Schutzgruppen wird teils von den Kondensationsbedingungen, teils von den Aminosäure- und Peptidkomponenten, die an der Reaktion beteiligt sind, vorgeschrieben. Die gewöhnlich verwendeten Aminoschutzgruppen umfassen solche, die der Fachwelt wohlbekannt sind, wie beispielsweise Urethanschutzgruppen wie die Benzyloxycarbonylgruppe (CBZ), die tert.-Butoxycarbonylgruppe (Boc) und ähnliche. Boc wird bevorzugt zum Schutz der α-Aminogruppe bei den Aminosäuren verwendet, deren endständige Carboxylgruppe zur Reaktion gebracht werden soll. Die Boc- Schutzgruppe wird, wie oben erwähnt, leicht mit TFA entfernt, oder mit anderen Säuren wie HCl (3molar in Dioxan).
Die epsilon-Aminogruppe von Lys kann mit der CBZ-gruppe geschützt werden, vorzugsweise mit der 2-Cl-CBZ-Gruppe. Die OH-Gruppe von Tyr wird vorzugsweise mit der 2,6-Cl&sub2;-Bzl- Gruppe geschützt, obwohl auch die Bzl-Gruppe verwendet werden kann, wenn sich der Tyr-Rest in der Nähe des N-Terminus der gewünschten Sequenz befindet. Die OH-Gruppe von Thr und Ser kann mit der Bzl-Gruppe geschützt werden. Arg wird mit der Nitrogruppe geschützt. Glu und Asp werden in Form ihrer Benzylester geschützt. His wird als sein DNP-Derivat geschützt. Cys wird als sein Acm-Derivat geschützt. Diese Gruppen sind relativ stabil gegen die Einwirkung von TFA, das bei jeder Stufe zur Entfernung der Boc-Gruppe verwendet wird. Nach Bildung der Peptidsequenz können diese Schutzgruppen, mit Ausnahme von Acm und DNP, mittels HF oder durch Hydrierung entfernt werden. Die DNP-Gruppe wird vorzugsweise mittels Thiophenol (10%ig in DMF), als letztes Programm am Harz, entfernt, obwohl diese Umsetzung auch in Lösung mit dem freien Peptid durchgeführt werden kann. Die Acm-Gruppe kann von dem freien Peptid mit Hg entfernt werden, wobei das freie Cys erhalten wird, oder mit J&sub2;, wobei das Disulfid erhalten wird.
Nach Bildung des Peptids am Harz kann es mittels verschiedener wohlbekannter Methoden, die für das spezielle Harz geeignet sind, von diesem entfernt werden, vorzugsweise unter Verwendung von flüssiger HF mit einer "low-high" Verfahrensweise, wie sie von Tam et al., Int. J. Peptide Protein Res., 21: 57-65, 1983, und von den dort erwähnten Referenzen beschrieben wird. Zur Reinigung der Peptide wird die Sephadex Sizing Chromatographie (G-15, G-25 und G-50, abhängig von der Größe des Peptids) entweder in 50%iger oder in 2 H Essigsäure, verwendet, sowie die Reverse-Phase-HPLC an C-18 reverse-Phase-Säulen, erforderlichenfalls unter Verwendung von Gradientenelutionen mit verdünnter TFA (0,1%) oder Trimethylaminphosphat (pH 3,2) oder Acetonitril.
Die Peptidprodukte werden in erster Linie durch Aminosäureanalysen charakterisiert, die nach 70stündiger Hydrolyse in 6N HCl an einem Beckmann 121MB oder oder an einem Beckmann 6300 Analysator durchgeführt wird. Das Peptidprodukt wird mit HPLC überprüft und man findet im allgemeinen eine Reinheit von 50-70%.

III. KONJUGATIONSVERFAHREN

Um die Immunogenität des Peptids zu steigern, werden die hier beschriebenen Peptide gewöhnlich kovalent an ein größeres Molekül, das als Träger dient, gebunden ("konjugiert"). Die Träger können Proteine umfassen wie heterologe Serumalbumine, Hämocyanin der Keyhole- Napfschnecke, Diphterietoxoid usw., oder synthetische Polymere wie Poly (D-Glu, D-Lys). Die Anlagerung des Peptids an den Träger kann mit verschiedenen Methoden erfolgen, einschließlich Verknüpfung durch ein Lys des Peptids unter Verwendung von Glutaraldehyd (Reichlin, Methods Enzymol. 70: 159-165, 1980) oder eines DCC Verfahrens (z. B. Atassi et al., Biochem. Biophys. Acta 670: 300-302, 1981), durch ein Asp oder Glu des Peptids unter Verwendung von DCC (Bauminger et al., Methods Enzymol. 70: 151-159, 1980), durch ein Tyr des Peptids unter Verwendung von bis-diazotiertem Benzidin (Walter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77: 5197-5200, 1980), durch photochemische Anlagerung (Parker et al., Cold Spring Harbor Symposium - Modern Approaches to Vaccines, Ed. Chanock & Lerner, Cold Sprig Harbor Press, New York, 1983, im Druck), oder durch ein Cys des Peptids (Liu et al., Biochem. 18: 690-697, 1979). Die Peptid-Träger-Konjugate werden vom Überschuß des freien Peptids mittels Dialyse oder Gelfiltration getrennt. Der Gehalt des Peptids, mit dem der Träger beladen ist, kann entweder unter Verwendung eines radioaktiven Tracers bestimmt werden, um die Menge der Beladung in einem gesonderten Verfahren festzustellen, oder durch eine quantitative Aminosäurenanalyse des Konjugats, im Vergleich zu dem nicht beladenen Träger. Wenn die letztgenannte Methode verwendet wird, ist es günstig, eine spezielle nicht natürlich vorkommende Aminosäure, wie Nle, in das Peptid am N-Terminus oder am C-Terminus zu inkorporieren, die dann als quantitative Markierung für die Peptidinkorporierung dienen kann, wenn sie mittels der Aminosäurenanalyse des Konjugats gemessen wird. Dieses Nle kann auch als Spacer zwischen dem Antigen und einer beliebigen inkorporierten Aminosäure, wie Cys, Lys oder Tyr, dienen, um die Anlagerung zu erleichtern, wie oben beschrieben.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung, sowohl frei als auch konjugiert, können in einem physiologisch annehmbaren Träger an beeinflußbare Säugetierspezies verabreicht werden, um sie gegen die HAV Erkrankung zu schützen.

BEISPIEL I

Synthese von N-Acetyl-L-tyrosyl-L-norleucyl-L-seryl-L- threonyl-L-glutamyl-L-glutaminyl-Lasparaginyl-L-valyl-L- prolyl-L-aspartyl-L-prolyl-L-glutaminyl-L-valyl-glycyl-L- (S-acetamidomethyol)-cysteinamid

Die obige Sequenz wurde an einem Beckmann 990B Peptid Synthesizer oder an einem p-Methylbenzhydrylaminharz gemäß den allgemeinen Festphasensyntheseverfahren, wie sie von Barany & Merrifield in "The Peptides", Vol. 2, Ed., E. Gross & J. Meienhofer, Seiten 1-284, Academic Press, Hew York, N.Y., 1980, beschrieben wurden, synthetisiert. Im speziellen Fall wurde das p-Methylbenzhydrylaminharz (nominaler Amingehalt von 0,414 mMol N per g) mit Boc-(Acm)-Cys, von dem ausgegangen wird, beladen, wobei Programm 2 (Wiederholung der Kupplung) verwendet wurde, worauf nichtumgesetzte aktive Aminogruppen mit Acetanhydrid/ Pyridin (10 Äquivalente von beiden) gecappt und Programm 4 durchgeführt wurde. Dieses Ausgangsharz wurde mittels Elementaranalyse untersucht und ein Gehalt von 0,3 mM/g Boc-(Acm)-Cys gefunden, ermittelt durch die Schwefelanalyse. Die Synthese wurde in einem Maßstab von 1 mM (3,33 g Boc-(Acm)-Cys-NH-Harz) fortgesetzt, wobei aufeinanderfolgend geschützte Aminosäuren zu dem wachsenden N-Terminus zugegeben wurden, und zwar gemäß den Programmen 1 (für die Abspaltung der Boc-Gruppe und für die Kupplung, 2 (für die Wiederholung der Kupplung), 5 und 6 (Kupplung und deren Wiederholung folgend auf Gln) und 3 und 4 (für die terminale Acetylierung unter Verwendung von 10 Äquivalenten Acetanhydrid/Pyridin). Die Boc-Gruppe wurde durchwegs für den zeitweiligen Schutz der α-Aminogruppe verwendet. Die Seitenketten von Asp und Glu wurden als Benzylester geschützt. Die Seitenketten von Ser und Thr wurden als Benzylether geschützt. Die Seitenkette von Tyr wurde als 2,6-C1&sub2;-Benzylether geschützt. Bei allen Kupplungen und wiederholten Kupplungen wurde ein Überschuß von 2,5 Äquivalenten gegenüber der Peptidkette eingesetzt. 2 Wiederholungen der Kupplung wurden bei jedem Reaktionsschritt durchgeführt. Bei den Kupplungen und deren Wiederholungen wurde DCC mit einem Zusatz von HBT zu jeder Aminosäurelösung zugegeben (von beiden 2,5 Äquivalente gegenüber dem nominalen Ausgangsharz). Das vervollständigte Harz wog, im Vakuum getrocknet, 4,85 g.
1,85g dieses Peptidharzes wurden mit HF in einem "low-high" Verfahren, wie es von Tam et al.,Int. J. Peptid Protein Res., 21: 57-65, 1983, beschrieben ist, zur Abspaltung und Entfernung der Schutzgruppen behandelt. Kurze Beschreibung: Das Harz wurde in das Gefäß eines Standard-HF-Reaktionsapparates (Peninsula Laboratories) gegeben. Zu dem Harz wurden 1,5 ml m-Kresol und 6,5 ml Dimethylsulfid hinzugefügt. Es wurde auf -78ºC gekühlt und 2,5 ml HF wurden in das Reaktionsgemisch hineinkondensiert. Dieses wurde 2 Stunden bei 0ºC gerührt und HF wurde durch Ansaugen von Wasser über 30 Minuten bei 0ºC entfernt, worauf 45 Minuten lang bei Raumtemperatur weiter Wasser angesaugt wurde, um das Dimethylsulfid zu entfernen. Nach Verreiben mit Ether und Trocknen wurde das Harz in den HF-Apparat zusammen mit 1,5 ml m-Kresol zurückgegeben, auf -78ºC gekühlt und 20 ml HF wurden hineinkondensiert. Es wurde 1 Stunde bei 0ºC gerührt, wonach HF durch Ansaugen von Wasser bei 0ºC entfernt wurde. Das Harz und das Produkt wurden gewaschen, mit Petrolether dekantiert, mit Ethylacetat verrieben und filtriert. Der feste Rückstand wurde dann in 50 ml 50%iger Essigsäure suspendiert, wodurch das Peptid solubilisiert wurde, und direkt auf eine G-15 Sephadex-Chromatographiesäule, hergestellt und eluiert mit 50%iger Essigsäure, aufgegeben. Die Säule zeigte zwei große Peaks und das Material, das direkt nach dem Leervolumen eluiert wurde, wurde vereinigt und auf einen Film abgestreift.
Dieses rohe Peptid wurde auf eine G-50 Sephadex-Chromatographiersäule, gefüllt und eluiert mit 50%iger Essigsäure, aufgegeben. Die Fraktionen wurden mit "reverse phase" HPLC (C-I8 Säule, 0,1% TFA/Acetonitril Gradientenelution) untersucht und die Fraktionen, die die Hauptmenge des bei 210 nm absorbierenden Materials enthielten, wurden vereinigt und eingedampft. Dieses Material wurde gefriergetrocknet und ergab 244 mg des im Titel genannten Peptids, das mit HPLC als einzige Hauptkomponente, die keine weitere Reinigung erforderte, ermittelt wurde. Die Aminosäureanalyse ergab: Asx (Asp + Asn) 2,07, Thr 1,00, Ser 0,94, Glx (Glu + Gln) 2,99, Pro 2,42 (eine Beeinflussung durch Cys-Abbauprodukte macht diese Zahl zu groß), Gly 1,6, Val 2,11, Tyr 0,90 und Nle 0,93. Das Produkt besteht zu 82% aus Peptid, (der Rest sind Salze und Wasser) basierend auf einem Molekulargewicht von 1729,9.

BEISPIEL 2

Synthese eines Konjugats von Ac-Tyr-NIe-Ser-Thr-Glu-Gln- Asn-Val-PrO-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Cys-NH&sub2; an Rinder-Serumalbumin

Die obige Peptidsequenz wurde an ein durch m-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) substituiertes Derivat von Rinder-Serumalbumin (BSA) gemäß den von Liu et al., Biochem. 18: 690-697, 1979, beschriebenen Verfahren konjugiert. Dieses MBS-Derivat von BSA, von dem ausgegangen wird, kann genauso hergestellt werden, wie es Liu et al. für Ovalbumin beschreiben, wobei MBS und BSA in einem Phosphatpuffer vom pH 7,0 eingesetzt und mittels Sephadex- Säulenchromatographie gereinigt werden. Für große Chargen des BSA-MBS-Additionsprodukts ("MB-BSA") ist eine Dialyse für die Entfernung der überschüssigen Reaktionspartner geeigneter. Die Zahl der Maleinimidogruppen, die an jedes BSA angelagert sind, wurde nach der von Liu et al. dargestellten Methode ermittelt, sie betrug 2-2,5 basierend auf dem mit einer Aminosäureanalyse ermittelten Peptidgehalt.
Für die Konjugation an MB-BSA wurde das im Beispiel 1 beschriebene Peptid mit geschütztem Cys in sein Cys-Analoges mit freier Mercaptogruppe überführt. Dies wurde in zwei Reaktionsschritten durchgeführt: Zuerst wurde die Acm-Gruppe entfernt und das Mercaptan zum symmetrischen Disulfid mittels J&sub2; oxydiert, dieses symmetrische Disulfid wurde mit Dithiothreit (DTT) zum freien Cys-Peptid reduziert. Kurze Beschreibung: Es wurden 50 mg des im Beispiel 1 beschriebenen Peptids mit geschütztem Cys in 1,8 ml von 99%iger Essigsäure (1% Wasser) plus einem Tropfen DMF gelöst, wobei die Lösung 0,29 mM J&sub2; enthielt. Diese Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und die Reaktion wurde durch Zugabe von 200 mg feuchten Zinkstaubs unterbrochen. Die Suspension wurde filtriert und der feste Rückstand mit 50%iger Essigsäure gewaschen. Das Filtrat wurde direkt auf eine G-50 Sephadex-Chromatographiesäule aufgegeben, gefüllt und eluiert mit 50%iger Essigsäure. Die Fraktionen des ersten großen Peaks wurden vereinigt und gefriergetrocknet, 24 mg des symmetrischen, mit einer Disulfidbrücke verknüpften Peptids wurden erhalten.
5 mg dieses Disulfidpeptiddimeren wurden durch Auflösen in 1 ml Phosphatpuffer vom pH 6,0 unter Argon, Zugabe von 1,5 mg DTT und Rühren über 30 Minuten reduziert. Diese Lösung wurde direkt auf eine kurze G-25 Sephadex- Chromatograhiesäule (Volumen insgesamt 7 ml), gefüllt und eluiert bei 0ºC mit einer entgasten Pufferlösung vom pH 6, aufgegeben. Der mit dem Leervolumen eluierte Peak wurde gesammelt, wobei eine Verunreinigung mit dem langsamer laufenden DTT-Peak vermieden wurde, und 100 mg des MB-BSA wurden sofort zugegeben. Diese Reaktion wurde über Nacht bei 0ºC gehalten und durch Zugabe von 20 ul 2-Mercaptoethanol unterbrochen. Das Gemisch der unterbrochenen Reaktion wurde auf eine G-100 Sephadex-Chromatographiesäule, gefüllt und eluiert mit einem Phosphatpuffer vom pH 6,0, aufgegeben. Der doppelte Peak, der das monomere BSA-Konjugat und höhere Polymere des BSA-Konjugats im Verhältnis 1:1 darstellt, wurde vereinigt und 4 Tage bei 5ºC gegen mehrfach ausgetauschtes Wasser dialysiert.
Dieses Produkt wurde gefriergetrocknet und 119 mg des Peptid-BSA-Konjugats wurden erhalten. Die Aminosäureanalyse ergab einen Peptidgehalt von etwa 85% mit einer Beladung von 0,42 Peptiden pro BSA-Einheit, berechnet aufgrund der Nle-Aminosäureanalyse. AUFSTELLUNG DER STUFEN FÜR EINE CHARGE VON 1 MILLIMOL STUFE REAGENS/LÖSUNGSMITTEL KUPPLUNG: PROGRAMM 1 MISCHUNGSZEIT VOL. (ml) (Min.) 10% TEA in Isopropanol Boc-Aminosäure und HBT (2,5 Äquival. von beiden) in 2 : 1 DMF/CH&sub2;Cl&sub2;, mischen und anhalten (kein Durchfluß) Methanol STUFE REAGENS/LÖSUNGSMITTEL WIEDERHOLUNG DER KUPPLUNG: PROGRAMM 2 MISCHUNGSZEIT VOL. (ml) (Min.) Boc-Aminosäure und HBT (2,5 Äquival. von beiden) in 2 : 1 DMF/CH&sub2;Cl&sub2;, mischen und anhalten (kein Durchfluß) Methanol STUFE REAGENS/LÖSUNGSMITTEL KUPPLUNG OHNE DCC: PROGRAMM 3 MISCHUNGSZEIT VOL. (ml) (Min.) 10% TEA in Isopropanol Aktiver Ester der Boc-Aminosäure oder Acetanhydrid/Pyridin (2,5 Äquival. von beiden) in 2 : 1 DMF/CH&sub2;Cl&sub2;Methanol Die Kupplung kann in einigen Fällen bis zu 18 Stunden dauern. STUFE REAGENS/LÖSUNGSMITTEL WIEDERHOLUNG DER KUPPLUNG OHNE DCC: PROGRAMM 4 MISCHUNGSZEIT VOL. (ml) (Min.) Aktiver Ester der Boc-Aminosäure oder Acetanhydrid/Pyridin (2,5 Äquival. von beiden) in 2 : 1 DMF/CH&sub2;Cl&sub2;Methanol Die Kupplung kann in einigen Fällen bis zu 18 Stunden dauern. STUFE REAGENS/LÖSUNGSMITTEL KUPPLUNG, INVERSE ZUGABE: PROGRAMM 5 MISCHUNGSZEIT VOL. (ml) (Min.) 10% TEA in Isopropanol 0,5 M DCC in CH&sub2;Cl&sub2;, Mischen und Anhalten (kein Durchfluß) Boc-Aminosäure und HBT (2,5 Äquival. von beiden) in 2 : 1 DMF/CH&sub2;Cl&sub2;, Methanol STUFE REAGENS/LÖSUNGSMITTEL WIEDERHOLUNG DER KUPPLUNG MIT INVERSER ZUGABE: PROGRAMM 6 MISCHUNGSZEIT VOL. (ml) (Min.) 0,5 M DCC in CH&sub2;Cl&sub2;, mischen und anhalten (kein Durchfluß) Boc-Aminosäure und HBT (2,5 Äquival. von beiden) in 2 : 1 DMF/CH&sub2;Cl&sub2;, Methanol STUFE REAGENS/LÖSUNGSMITTEL ABSPALTUNG VON DNP: PROGRAMM 7 MISCHUNGSZEIT VOL. (ml) (Min.) 10% Thiophenol in DMF 10% TEA in CH&sub2;Cl&sub2; Methanol

ABKÜRZUNGEN

Abkürzung Bedeutung
Ala L-Alanin
Arg L-Arginin
Asn L-Asparagln
Asp L-Asparaginsäure
Cys L-Cystein
Gln L-Glutamin
Glu L-Glutaminsäure
Gly Glycin
His L-Histidin
Ile L-Isoleucin
Leu L-Leucin
Lys L-Lysin
Met L-Methionin
Nle L-Norleucin
Phe L-Phenylalanin
Pro L-Prolin
Ser L-Serin
Thr L-Threonin
Trp L-Tryptophan
Tyr L-Tyrosin
Val L-Valin
Ac Acetyl
Acm Acetamidomethyl
Boc tert.Butoxycarbonyl
Bzl Benzyl
2,6-C1&sub2;-Bzl 2,6-Diochlorbenzyl
CBZ Benzylöxycarbonyl
2-Cl-CBZ 2-Chlorbenzyloxycarbonyl
DNP 2, 4-Dinitrophenyl
NO&sub2; Nitro

ABKÜRZUNGEN (Fortsetzung)

Abkürzung Bedeutung
DCC Dicyclohexylcarbodiimid
DMF Dimethylformamid
HBT 1-Hydroxybenzthiazol
MBS m-Maleinimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimid-ester
TFA Trifluoressigsäure
TEA Triethylamin
BB p-Benzoylbenzoyl

BEISPIEL 2

Impfung von Tieren mit dem synthetischen Peptid-Träger- Konjugat

Weiße New-Zealand-Kaninchen und Hartley-Meerschweinchen wurden mit dem Peptid-Träger-Konjugat geimpft. Jedes Tier erhielt drei Impfungen in Abständen von zwei Wochen. Die ersten Impfungen wurden mit kompletten Freundschen Adjuvans ergänzt und den Kaninchen intradermal, den Meerschweinchen subcutan appliziert. Alle folgenden Impfungen erfolgten subcutan mit inkompletten Freundschen Adjuvans. Jede Impfung enthielt 1,0 mg des Peptid-Träger-Konjugats in 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung. Von den Versuchstieren wurden Seren direkt vor der Impfserie und zwei Wochen nach der dritten Injektion hergestellt. Die Seren wurden, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, analysiert.

BEISPIEL 3

Analyse von Seren auf ihre Antipeptid-IgG-Antikörper

Jede Serumprobe wurde mittels eines Enzymimmunoassays (ELISA) analysiert. Das synthetische Peptid (50 mg/Loch) in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) wurde an die Löcher einer Polystyrolplatte bei 4ºC 18 Stunden lang adsorbiert. Die folgenden Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der Peptidadsorption wurde jedes Loch mehrmals mit PBS gewaschen, 0,5% Gelatine in PBS wurden hinzugefügt und man ließ eine Stunde adsorbieren. Die Löcher wurden dann einmal mit PBS gewaschen und jede Serumprobe wurde in einer Verdünnung von 1:20 in PBS in Duplikatlöcher zugegeben, das Serum ließ man dann zwei Stunden lang mit dem absorbierten Peptid reagieren. Die Löcher wurden dann einmal mit der 0,5%igen Gelatinelösung, zweimal mit einer 0,02%igen Lösung des Detergent Tween-20 und dreimal mit PBS gewaschen
Eine 1:250 verdünnte Lösung von 1,0 mg/ml von Ziegen-Antikaninchen-IgG-Antikörpern oder von Ziegen-Antimeerschweinchen-IgG-Antikörpern, kovalent an alkalische Phosphatase gebunden, wurde dann in die entsprechenden Löcher gegeben, worauf man sie zwei Stunden reagieren ließ. Die Löcher wurden dann zweimal mit 0,02%iger Tween-20-Lösung in PBS, zweimal mit PBS und dreimal mit Wasser gewaschen. In jedes Loch wurde eine Lösung von 0,1% p-Nitrophenylphosphat in 10%igem Diethanolamin, pH 9,8, die 0,5 mM MgCl&sub2;·6H&sub2;O enthielt, gegeben. Die nachfolgende Reaktion ließ man dann bei 37ºC 30 Minuten lang vonstatten gehen, worauf sie durch Zugabe von Natriumhydroxid beendet wurde.
Je größer die gegenseitige Beeinflussung der Antikörper in dem Testserum mit dem Peptidsubstrat ist, umso größer ist die Menge an alkalischer Phosphatase, die an die Vertiefungen gebunden ist. Das Enzym Phosphatase vermittelt die Spaltung des p-Nitrophenylphosphats zu einer molekularen Substanz, welche das sichtbare Licht bei einer Wellenlänge von 405 nm absorbiert. Daher besteht eine direkte Beziehung zwischen der Absorption des Lichts von 405 nm am Schluß der ELISA Reaktion und der Menge des an das Peptid gebundenen Antikörpers.
Alle Kaninchen und Meerschweinchen, die mit dem synthetischen Peptid-Träger-Konjugat geimpft worden waren, entwickelten Antikörper, die imstande waren, das Peptid zu binden.

BEISPIEL 4

Analyse von Seren auf ihre Antihepatitis-A-Virion-IgG- Antikörper

Jede Serumprobe wurde mittels ELISA analysiert. Monoklonale Antikörper der Maus, spezifisch für HAV (0,5 uG), wurden in PBS an alle Löcher einer Polystyrolplatte bei 4ºC 18 Stunden lang adsorbiert. Anschließend wurden die Löcher zweimal mit PBS gewaschen und 400 mg/Loch gereinigter HAV in PBS hinzugefügt, man ließ es bei 4ºC an den Antikörper binden. Alle folgenden ELISA-Schritte wurden wie im Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.
Alle mit dem synthetischen Peptid-Träger-Konjugat geimpften Ratten und Meerschweinchen entwickelten Antikörper, die imstande waren, an das Hepatitis A Virion zu binden.

BEISPIEL 5

Analyse von Seren auf ihre Antikörper, die mit polyspezifischen Antikörpern aus humanen Anti-HAV-Immunseren konkurrieren

Der kompetitive Assay wurde unter Verwendung des im Handel erhältlichen HAVAB-Assay-Kit der Abbott Labs., Chicago, Illinois, durchgeführt.
Die meisten Kaninchen und Meerschweinchen, die mit dem synthetischen Peptid-Träger-Konjugat geimpft worden waren, entwickelten Antikörper, die imstande waren, mit Antikörpern aus humanen Anti-HAV-Immunseren zu konkurrieren.

BEISPIEL 6

Analyse von Seren auf ihre Antikörper, welche an das denaturierte, gereinigte VP1 Strukturprotein des HAV binden

Die Reaktivität der Antipeptid-Antikörper mit den gereinigten Strukturproteinen des HAV wurde mit einem Immuno-Blot- Assay bestimmt. Die HAV-Proteine wurden mittels Elektrophorese in Polyacrylamidgelen gemäß Laemmli et al., Nature 277: 680-685, 1970, abgetrennt. Die Proteine wurden dann auf Nitrocellulosemembrane transferiert, wobei ein TE 42 Transphor von Hoefer Scientific Instruments und ein Transferpuffer aus 100 mM TRIS, pH 7,5, 16 mM Glycin in 20%igem Methanol für einen vierstündigen Transfer bei einer mittleren Spannung von 60 Volt verwendet wurden. Die Nitrocellulosemembran wurde dann mit 3% Gelatine in 20 mM TRIS, pH 7,5, und 500 mM NaCl (TBS) blockiert. Die Membran wurde anschließend mit dem 1:50 verdünnten zu prüfenden Antiserum inkubiert. Dann wurde wiederholt mit TBS, das 0,1% des Detergents Tween-20 enthielt, gewaschen. J¹²&sup5;-Protein A wurde dann für 2,0 Stunden auf die Membran gegeben, worauf mehrmals mit TBS und Detergent gewaschen wurde. Die Membran wurde sorgfältig getrocknet und die mit den HAV-Proteinen assoziierte Radioaktivität, ein Resultat der Antikörperbindung, wurde durch Exposition auf einen Röntgenfilm sichtbar gemacht. Alle Tiere, die mit dem synthetischen Peptid-Träger-Konjugat geimpft worden waren, entwickelten Antikörper, die das denaturierte VP1-Protein binden konnten.

BEISPIEL 7

Analyse von Seren auf ihre spezifisch die HAV-Infektivität neutralisierende Aktivität

Nierenzellen von neugeborenen Cynomolgusaffen (NBCmk) wurden aus vorrätigen gefrorenen Kulturen auf eine 96-Lochplatte in einer Konzentration von 1·10&sup4; Zellen/Loch unter Verwendung von 0,2 ml/Loch von EMEM (Eagle Minimum Essential Medium) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) aufgegeben und in einem mit einem Wasserbad stabilisierten CO&sub2; Inkubator bei 35ºC mit 5% CO&sub2; in einer befeuchteten Atmosphäre 5 bis 7 Tage inkubiert, bis eine Konfluenz von 80 bis 90% erreicht war.
Das Virusmaterial, das in diesen Assays verwendet wurde, war vorher in dem gleichen Zelltyp gezüchtet worden, der auch für den Assay verwendet wurde (also NBCmk Virenmaterial nur in NBCmk Zellen). Obwohl auch unbehandeltes HAV-Material, das nach den früher beschriebenen Verfahren (U.S.Patent 4.164.566) hergestellt wird, in diesen Assays verwendet werden könnte, kann ein empfindlicherer Titer einer neutralisierenden Antikörperwirksamkeit festgestellt werden, wenn HAV mit dem Detergent Natriumlaurylsulfat (SLS) behandelt wird. Für diese Behandlung wurde SLS aus einer 20%igen Vorratslösung zu dem HAV-Material bis zu einer Endkonzentration von 0,1% zugegeben. Das Virus wurde damit sorgfältig gemischt und bei 37ºC 60 Minuten inkubiert. Das Virus wurde dann über einen Zeitraum von 36 Stunden dialysiert, wobei die phosphatgepufferte Kochsalzlösung dreimal gewechselt wurde, und zwar 4 1 pro Wechsel für 3 bis 4 ml HAV. Die Lösung des Virus wurde dann aus dem Dialysierbehälter entfernt, steril filtriert und in kleinen aliquoten Mengen (0,3 bis 0,5 ml) bei -20ºC aufbewahrt.
An dem Tag, an dem der Neutralisationsassay durchgeführt wurde, wurde das aufbewahrte Virus zu mehreren 5 bis 10fachen Verdünnungen (EMEM-Medium wurde für diese Verdünnungen verwendet) verdünnt. Serum oder die flüssige Zellkultur, die monoklonale Antikörper enthielt, wurde zu den Verdünnungen des HAV entweder in kleinen Kunststoffröhrchen oder auf Mikrotiterplatten zugegeben; normalerweise wird 0,1 ml von jeder verdünnten Lösung des Virus zugegeben und das Serum wird, in der oben angegebenen Weise von 1:4 bis 1:200 verdünnt (oder sogar höhere Verdünnungen für einige hyperimmune Tierseren) zugegeben. Die Mischung des Virus und des Antiserums wurde dann 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Das Kulturmedium wurde von den Testzellen abgesaugt und die vorinkubierte Virus-Antikörper-Mischung zugegeben, wobei für jede Verdünnung gesonderte Mikropipettenspitzen verwendet wurden, um eine Kontamination zu vermeiden. Die Mikrotiterplatten der Zellen wurden auf einer Schüttelmaschine 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und dann ohne Schütteln 3 Stunden bei 35ºC inkubiert. Das Medium wurde dann abgesaugt und frisches EMEM mit 0,5% FCS, 2 mM Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 ug/ml Streptomycin wurde zugegeben (0,25 ml/Loch einer 96 Loch-Mikrotiterplatte).
Die Zellen wurden bei 35ºC in einem mit einem Wasserbad stabilisierten CO&sub2; Inkubator inkubiert. Den Zellen wurden am 5. Tag nach der Infektion mit HAV frische Nährlösung zugeführt, wobei zuerst das Medium durch Absaugen entfernt und dann frisches EMEM mit fötalem Kälberserum, Glutamin, Penicillin und Streptomycin, wie oben beschrieben, zugegeben wurde.
Die Zellen wurden nach der Infektion fixiert, die NBCmk-Zellen am siebenten Tag und die LCC-MK-2-Zellen am zehnten bis vierzehnten Tag nach der Infektion. Für diesen Schritt wurde das Medium abgesaugt und die Zellen vorsichtig dreimal mit je 0,2 ml PBS/Loch gewaschen. Aceton wurde zugegeben, um die Zellen bei 200 Kl/Loch zu fixieren, und dann sehr schnell abgesaugt, so daß die gesamte Kontaktzeit des Acetons mit den Zellen weniger als 60 Sekunden betrug. Die Platten wurden an der Luft getrocknet, um das Aceton ganz zu entfernen.
Mit J¹²&sup5; markierte Antikörper gegen HAV (HAVAB, Abbott) wurden zu jedem Loch zugegeben, und zwar 0,040 ml/Loch (ungefähr 0,15 Mikrocurie/Loch). Die Platte wurde 60 Minuten auf einer Schüttelmaschine bei Raumtemperatur und dann 3 Stunden ohne Schütteln bei 35ºC inkubiert. Das J¹²&sup5; Antiserum wurde dann abgesaugt und die Löcher dreimal mit je 0,3 ml PBS/Loch gewaschen. Die Platten wurden dann zehnmal unter langsam fließendem Wasser gewaschen. Nach Trocknen der Platten, entweder an der Luft oder schnell in einem Trockenschrank, wurde mit ihnen ein Röntgenfilm mit einer verstärkenden Folie belichtet. Diese Belichtung erfolgte bei -70ºC und dauerte von 10 Stunden bis zu 3 Tagen.
Die Kontrollen umfaßten 1.) nicht infizierte Zellen für die Leerwert-Markierung mit dem J¹²&sup5; Antikörper-Präparat, 2.) verdünnte Lösungen des Virus, zu denen kein Antiserum zugegeben wurde, um den Titer des Virus zu bestimmen, und 3.) Seren vor und nach der Impfung von Mäusen, Ratten, Krallenaffeo oder Schimpansen, von denen vorher gezeigt worden war, daß sie entweder negativ oder positiv für die Verwendung als HAV neutralisierende Antiseren sind.
Um den neutralisierenden Titer der Seren oder monoklonalen Antikörper zu bestimmen, wurde zuerst der Titer des unbehandelten Virus bestimmt, wobei die radioaktive Markierung (Schwärzung des Röntgenfilms) der verdünnten Viruslösungen mit der Markierung der nicht infizierten Zellen verglichen wurde. Dann wurde die höchste Antikörperverdünnung, die eine Wachstumshemmung des Hepatitis A Virus (oder weniger Antigenbildung pro Loch) ergab, bestimmt, indem die Löcher, die den Hepatitis A Virus mit den Testseren enthielten, mit dem Virenwachstum des Virus allein verglichen wurden. Dies wurde entweder visuell gemacht oder mit einem Densitometer, um den radioaktiven Film auszuwerten und so die Prozentangaben für die Wachstumshemmung genauer zu bestimmen.
Mit dem vorhergehenden Assay wurde gezeigt, daß sowohl die monoklonalen Antikörper als auch die Seren von mit HAV immunisierten Wirten eine den Virus neutralisierende Wirkung aufweisen.
Alle Kaninchen und Meerschweinchen, die mit dem synthetischen Peptid-Träger-Konjugat geimpft worden waren, entwickelten eine die HAV-Infektivität neutralisierende Wirkung.

Claims

1. Peptide enthaltend die folgenden Aminosäuresequenzen:

A-A-Glu-Gln-Asn-Val-Pro-Asp-Pro-X-X,

B-B-Glu-Ser-Arg-His-Thr-Ser-Y-Y oder

C-C-Asn-Ser-Asn-Asn-Lys-Glu-Tyr-Z-Z

in denen A L-S-Thr, L-S-Ser-Thr, L-S-Val-Ser-Thr,

L-S-Thr-Val-Ser-Thr, L-s-Thr-Thr-Val-Ser-Thr oder

L-S-Ser-Thr-Thr-Val-Ser-Thr und

X Gln-S-L, Gln-Val-S-L oder Gln-Val-Gly-S-L,

B L-S-Gly, L-S-Pro-Gly, L-S-Lys-Pro-Gly,

L-S-Leu-Lys-Pro-Gly, L-s-Glu-Leu-Lys-Pro-Gly oder

Pro-Glu-Leu-Lys-Pro-Gly und

Y Asp-S-L, Asp-His-S-L, Asp-His-Met-S-L oder

Asp-His-Met-Ser-S-L und

C L-S-Phe, L-S-Thr-Phe, L-S-Phe-Thr-Phe,

L-S-Thr-Phe-Thr-Phe oder L-S-CysThr-Phe-Thr-Phe und

Z Thr-S-L, Thr-Phe-S-L, Thr-Phe-Pro-S-L, Thr-Phe-Pro-Ile-S-L

oder Thr-Phe-Pro-Ile-Thr-S-L bedeuten,

worin die Reste A, B, C, X, Y oder Z vorhanden sein oder fehlen können, und worin der Rest L vorhanden sein oder fehlen kann und eine oder mehrere Linkeraminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe Lys mit einer freien oder mit einer photoreaktiven Gruppe acylierten Seitenkette, Tyr, Cys, Glu oder Asp, darstellt, der Rest S vorhanden sein oder fehlen kann und eine oder mehrere Spaceraminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe Gly, Ala oder Nle darstellt, und die endständige Gruppe des Peptids eine freie Aminogruppe, eine durch eine p-Benzoylbenzoylgruppe oder eine andere photoreaktive Gruppe substituierte Aminogruppe, oder einen N-Acetylrest oder einen anderen Alkylcarboxylrest oder eine freie Carboxylgruppe oder Amidgruppe darstellt.

2. Ein Peptid gemäß Anspruch 1 enthaltend eine der folgenden Aminosäuresequenzen:

worin die Reste A, B, C, X, Y und Z die im Anspruch 1 definierten Bedeutungen besitzen.

3. Ein Peptid gemäß Anspruch 1 enthaltend eine der folgenden Aminosäuresequenzen:

worin BB den p-Benzoylbenzoylrest bedeutet.

4. Ein Peptid gemäß Anspruch 1, das an ein Trägerprotein konjugiert ist.

5. Ein Peptid gemäß Anspruch 2, das an ein Trägerprotein konjugiert ist.

6. Ein Peptid gemäß Anspruch 3, das an ein Trägerprotein konjugiert ist.

7. Ein Peptid gemäß Anspruch 4, worin das Trägerprotein Serumalbumin, Hämocyanin der Keyhole- Napfschnecke, Diphtherietoxoid oder ein synthetisches Polyamid ist.

8. Ein Peptid gemäß Anspruch 5, worin das Trägerprotein Serumalbumin, Hämocyanin der Keyhole- Napfschnecke, Diphtherietoxoid oder ein synthetisches Polyamid ist.

9. Ein Peptid gemäß Anspruch 6, worin das Trägerprotein Serumalbumin, Hämocyanin der Keyhole- Napfschnecke, Diphtherietoxoid oder ein synthetisches Polyamid ist.