DE69310148T2 - Polyethylenglykol oder polypropylenglykol enthaltend polymer - Google Patents
Polyethylenglykol oder polypropylenglykol enthaltend polymerInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein vernetztes Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol, das ein Polymer enthält, das eine einzigartige räumliche Struktur aufweist, und insbesondere für Anwendungen als Harz zur Chromatographie oder als ein Trägermaterial zur Immobilisie rung von Proteinen oder zur Synthese von Peptiden, Oligonukleotiden oder Oligosacchariden ausgebildet werden kann.
- Als die Festphasen-Peptidsynthese zuerst von Bruce Merrifield¹ eingefiihrt wurde, wurde sie an einem Träger aus 2% vernetztem Polystyrol durchgeführt, der die Herstellung eines Pentapeptides durch ein chargenweises Syntheseverfahren ermöglichte. Diese Erfindung bildete die Grundlage einer Technik, die seither Gegenstand kontinuierlicher Verfeinerung gewesen ist. Bei der Synthese längerer Peptide wurde es bald offensichtlich, daß die Vernetzung des Harzes optimiert werden muß. Die besten Ergebnisse wurden mit dem zu 1 % vernetzten Harz, das heutzutage noch bei chargenweiser Synthese verwendet wird², erhalten. Ein polareres Dimethylacrylamidharz, das für Peptidsynthesen in polaren Lösungsmitteln wie DMF geeignet ist, wurde in Sheppards Labor³ entwickelt.
- Mit der Einführung von Festphasensynthesen basierend auf Fmoc4,5 wurde das viel effizientere Verfahren im kontinuierlichen Durchfluß eine realistische Alternativ gegenüber dem Batch-Verfahren. Die zugänglichen Harzchargen waren jedoch im Durchfluß nicht stabil und kollabierten nach wenigen Synthesecyclen. Es war allgemein anerkannt, daß zunehmende Vernetzung nicht zu nützlichen Eigenschaften für die Peptidsynthese führen würde, obwohl sie die Stabilität des Harzes erhöht. Der erste im Durchfluß stabile Syntheseharz wurde durch Polymerisation des weichen Polydimethylacrylamidgels innerhalb einer Festkörpermatrix von Kieselgur&sup6; als Träger erhalten. Diese geniale Erfindung ermöglichte das Packen von Säulen, die im Durchfluß über die ganze Zeit der Synthese vollständig stabil waren.
- Das Prinzip wurde durch Ersetzen des unregelmäßigen Kieselgur durch einen regelmäßigeren, starren, zu 50% vernetzten Polystyrolschwamm, der ein aufgepfropftes Polydimethylacrylamidgel&sup7; enthält, verfeinert.
- Zur gleichen Zeit wurde eine Technik zum Aufpfropfen von Polyethylenglykol in ein zu 1 % vernetztes Polystyrol entwickelt&sup8;. Die erhaltenen Harze waren monodispers, sphärisch und, noch wichtiger, im Durchfluß stabil. Ein besser gesteuertes Aufpfropfen durch direkte Substitution der funktionellen Gruppen im Polystyrol mit modifiziertem Polyethylenglykol, das eine Aminogruppe trägt, wurde auch beschrieben&sup9;. Auf Polyethylenfilme aufge pfropftes Polystyrol, wurde für Peptidsynthesen unter unpolaren Bedingungen¹&sup0; verwendet und mit Polyhydroxylpropylacrylat beschichtetes Polypropylen¹¹ und das natürliche Polymer Baumwolle waren vielversprechend als Träger unter polaren Bedingungen¹².
- Die Herstellung eines Polymers mit kurzen vernetzten PEG-Ketten (n = 6) wurde durch inverse Suspensionspolymerisation von Polyethylenglykolmethacrylat-Makromonomeren¹³ versucht; aber mit dem hohen Gehalt an PEG (60% Vernetzer) wurde das Polymer schon während der Polymerisationsreaktion halbkristallin. Das beschriebene Polymer kurzkettiger PEG's, durch Esterverbindungen vernetzt, war für Peptidsynthesen nicht geeignet.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein neuartiges, vernetztes, PEG-enthaltendes Polymer, das speziell zur Anwendung als im Durchfluß stabiler, hochpolarer fester Träger (Trägermaterial) für Festphasensynthesen ausgebildet wurde, bereit. Das Polymer wurde so hergestellt, daß es unter Bedingungen des kontinuierlichen Durchflusses stabil und transparent ohne Absorption im aromatischen Bereich ist, um die spektrophotometrische Überwachung einer Reaktion innerhalb des Harzes zu ermöglichen. Es sollte weiterhin ein hochgradig verzweigtes Polymernetzwerk bilden, mit guten Quellungseigenschaften in polaren Lösungen, die einen unkomplizierten Aufbau von sogar langen Peptiden ermöglichen. Die Änderung der Quellung sollte während der Synthese nicht signifikant sein und die Dichte des Harzes sollte eine Mehrfachsäulen-Peptidsynthese ermöglichen. Deshalb wurde das Harz hochgradig polar ausgebildet, um die Solvatisierung des Peptids zu fördem, polaren Komponenten das Eindringen ins Innere der Perlen zu ermöglichen und die Adhäsion an Kunststoffe zu verhindern. Schließlich wurden die einfache Herstellung und die geringen Kosten für die Ausgangsmaterialien als sehr wichtig für einen erfolgreichen Syntheseharz angesehen.
- Dies wird mit dem Polymer gemäß der Erfindung erreicht, das durch Radikal-Copoly merisation von derivatisiertem, das mit einer Einheit ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Acryloylalkyl-, Acryloylaryl-, Acrylamidoalkyl- und Acrylamidoarylrest zweifach endsubstituiertem Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol mit einem Acrylamid, -nitril oder -ester gebildet wird.
- Ein spezielleres Polymer gemäß der Erfindung wird durch Copolymerisation eines derivatisierten Polyethylenglykols der Formel
- gebildet,
- wobei n eine Integerzahl von 4 bis 2000, q Null oder 1 und R
- -(CR'&sub2;)s-(C&sub6;R¹&sub6;)t-(CR'&sub2;)u-
- ist, wobei s, t und u jeweils Null oder eine lntegerzahl von 1-10 ist und jedes R' ein H, Alkyl-, Aralkyl- oder Arylrest ist, wobei dieser Aralkyl- oder Arylrest wahlweise am Ring mit einem Alkyl-, Hydroxyl-, Mercapto-, Nitro-, Amino-, Mono- oder Dialkylaminorest oder Halogenatom substituiert ist, wobei wenigstens eins von q, s, t, und u ungleich Null ist, mit einer Acrylverbindung der Formel
- wobei R¹ -CY-X-R&sup5; oder -CN ist, und R², R³ und R&sup4; jeweils ein H, Alkyl-, Aralkyl-, Arylrest, -CY-X-R&sup5; oder -CN ist, wobei Y gleich O oder S ist, X gleich O, S oder NR&sup6; ist, R&sup5; ein Alkyl-, Aralkyl- oder Aryrest ist und R&sup6; gleich H oder R&sup5; ist,
- und wahlweise mit einem Spacermolekül, das funktionelle Gruppen zur Anbindung von Peptiden, Proteinen, Nukleotiden oder Sacchariden enthält.
- Wenn es als ein Trägermaterial für die Synthese von Peptiden, Oligonukleotiden oder Oligosacchariden verwendet werden soll oder als ein Substrat zur Immobilisierung von Proteinen, wird in das Polymer gemäß der Erfindung ein Spacer eingebaut werden, der funktionelle Gruppen zur Anbindung von Peptiden, Proteinen, Nukleotiden oder Sacchariden enthält, entsprechend denen, die aus der Gruppe bestehend aus Amino-, Alkylamino- Hydroxyl-, Carboxyl-, Merkapto-, Sulfeno-, Sulfino-, und Sulforest und Derivaten davon ausgewählt werden.
- Ein Polymer gemäß der Erfindung, das sich besonders zur Anwendung als Trägermaterial für Synthesen im kontinuierlichen Durchfluß oder chargenweise von Peptiden, Oligonukleotiden oder Oligosaccariden eignet, wird durch Copolymerisation eines derivatisierten Polyethylenglykols der Formel I, in der n, q und R das darstellen, was vorstehend defi niert wird, mit einem Acrylamid der Formel
- gebildet und mit einem Spacermolekül der Formel
- wobei m eine Integerzahl von 4 bis 2000 ist und q und R das darstellen, was vorstehend für Formel I definiert wird.
- Bevorzugte Werte für n in der vorstehenden Formel I liegen zwischen ungefähr 20 und ungefähr 90, d.h. die Verbindung ist ein Derivat von PEGI&sub1;&sub0;&sub0;&sub0; bis PEG&sub4;&sub0;&sub0;&sub0;. Bevorzugte Werte für m in Formel II liegen zwischen ungefähr 4 und ungefähr 45, d.h. die Verbindung ist ein Derivat von PEG&sub2;&sub0;&sub0; bis PEG&sub2;&sub0;&sub0;&sub0;.
- Ein bevorzugtes Polymer gemäß der Erfindung ist aus 60% bis-2-Acrylamidoprop-1-yl- PEG&sub1;&sub9;&sub0;&sub0; (1), 20% 2-Acrylamidoprop-1-yl-(2-aminoprop-1-yl]-PEG&sub3;&sub0;&sub0; (2) und 20% N,N- Dimethylacrylamid (3) zusammengesetzt.
- Derartige Polymere gemäß der Erfindung können wiederum mit irgendeinem der normalerweise bei der Peptidsynthese verwendeten Linker derivatisiert sein. Vier gut charakterisierte Linker zur Peptidsynthese sind 4-[Fluorenylmethyloxycarbamido(2,4-dimethoxyphenyl)methyl]-phenoxyessigsäure der Formel
- und 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäure²&sup0;, die beide in TFA gespalten werden und Peptidamide beziehungsweise Peptidsäuren ergeben, 4-Hydroxymethylbenzamid²&sup0;, das mit 0,1 m NaOH gespalten wird, und 4-Hydroxymethyl-3-nitrobenzamid², das durch Photolyse gespalten wird. Die Verbindung 4 wird auch 4-[Fmoc-amino(2,4-dimethoxyphenyl)- methyl]phenoxyessigsäure genannt, wobei "Fmoc" "Fluorenylmethyloxycarbonyl" bedeutet.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Trägermaterial zur Synthese im kontinuierlichen Durchfluß oder chargenweise von Peptiden, Oligonukotiden oder Oligosacchariden, wobei der Träger ein Polymer gemäß der vorstehend beschriebenen Erfindung enthält. Ein besonderes Merkmal des Trägers gemäß der Erfindung ist, daß er auch für Synthesen, an denen Enzymreaktionen beteiligt sind, geeignet ist.
- Die Erfindung betrifft auch ein Trägermaterial zur Enzymsynthese von Oligosacchariden mit Glykosyltransferasen, wobei der Träger ein Polymer gemäß der vorstehend beschriebenen Erfindung enthält.
- Weiterhin betrifft die Erfindung ein Trägermaterial zur Immobilisierung von Proteinen, wobei der Träger ein Polymer gemäß der vorstehend beschriebenen Erfindung enthält. Zusätzlich betrifft die Erfindung ein Harz zur Anwendung bei chromatographischen Trennungen, wie der Gelpermeationschromatographie und der Ionenaustauschchromatogaphie, wobei das Harz ein Polymer gemäß der vorstehend beschriebenen Erfindung enthält.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Synthese im kontinuierlichen Durchfluß oder chargenweise von Peptiden, Oligonukleotiden oder Oligosacchariden, wobei das Peptid, Oligonukleotid oder Oligosaccharid während der Synthese an einem Trägermaterial befestigt ist, der ein Polymer gemäß der vorstehend beschriebenen Erfindung enthält, und am Ende der Synthese von diesem Trägermaterial abgespalten wird. Aufgrund der besonderen Eigenschaften des Polymers gemäß der Erfindung eignet sich dieses Verfahren auch für Synthesen, die Enzymreaktionen einbeziehen, und insbesondere für eine Enzymsynthese eines Oligosaccharids mit einer Glykosyltransferase.
- Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Immobilisierung eines Proteins, wobei das Protein an einem Trägermaterial befestigt ist, der ein Polymer gemäß der vorstehend beschriebenen Erfindung enthält.
- Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Durchführen von chromatographischen Trennungen, das die Verwendung eines Harzes zur Chromatographie aufweist, das ein Polymer gemäß der vorstehend beschriebenen Erfindung enthält.
- Im folgenden wird das Polymer gemäß der Erfindung kurz als das PEGA-Harz oder PE- GA-Polymer bezeichnet.
- Abb. 1 ist eine schematische Darstellung des PEGA-Polymers, wobei die Polyacrylamidhauptketten bzw. -backbones vertikal dargestellt werden und die vernetzten PEG- Einheiten horizontal dargestellt werden.
- Abb. 2 zeigt einen Teil der chemischen Struktur des PEGA-Polymers.
- Abb. 3 zeigt im oberen Teil die Sequenz 5 des Test-Decapeptidfragments aus dem Acyl- Carrierprotein 65-74, das in dem Beispiel synthetisiert wurde, und im unteren Teil einen Graph, der die Transmissionsspektren von drei der Acylierungsreaktionen und eine HPLC-Spur des Rohproduktes darstellt.
- Abb. 4 bildet die starke aber begrenzte Quellung des PEGA-Polymers ab.
- Das PEGA-Polymer hat verglichen mit anderen Polymeren eine einzigartige Struktur auf Grund des extrem hohen Gehalts von vernetzenden langkettigen PEG. Das Polymer bildet ein hochgradig und einheitlich verzweigtes Netzwerk sehr langer, flexibler, ineinander geschlungener Ketten, was ein hohes Maß an Quellung auf eine spezifische und sehr gut definierte Perlengröße ermöglicht. Die Struktur kann durch die schematische Darstellung, die in Abb. 1 gezeigt wird, beschrieben werden, wobei die Polyacrylamid-backbones vertikal dargestellt sind und die vernetzenden PEG-Einheiten horizontal dargestellt sind. Verzweigungspunkte wurden durch einen Punkt angezeigt.
- Die gute Quellung und die langen und flexiblen Ketten ergeben ein gelähnliches und hartes Polymer mit sehr guten Diffusionseigenschaften im Inneren des Netzwerks. Der sehr hohe Gehalt und dominierende Einfluß des PEG auf die Eigenschaften des Polymers ergibt ein Harz, das gleichermaßen gut in polaren Lösungsmitteln, z.B. Wasser, N,N- Dimethylformamid, Acetonitril und Trifluoressigsäure, und unpolaren Lösungsmitteln, z.B. Dichlormethan und Chloroform, quillt.
- So ist das basen- und säurestabile Polymer gemäß der vorliegenden Erfindung durch sein sehr starkes Quellpotential in vielen Lösungsmitteln sehr unterschiedlicher Polarität (z.B. CH&sub2;Cl&sub2; oder Wasser) charakterisiert, das sich von der hohen Solvatationsenergie der Hauptkomponente des Polymers, Polyoxyethylen (PEG), in diesen Lösungsmitteln ableitet. Diese amphiphatische Eigenschaft des PEG kommt von seiner Flexibilität und der Fähigkeit, gefaltete Strukturen zu bilden mit entweder polaren oder hydrophoben Oberflächen. Die Verwendung eines hohen Gehalts (60-70%) gut definierten Diacrylamido-PEG's zur Vernetzung des Polymers führt zu einem einheitlichen und relativ großen Quellvolumen (z.B. das 13fache des Volumens des trockenen Polymers mit PEG 1900) in den meisten Lösungsmitteln. Das Prinzip der starken aber begrenzten Quellung wird in Abb. 4 gezeigt, wobei das gefaltete PEG sich wie gefaltete Federn verhält, die durch die große Kraft der PEG-Solvatation vollständig gedehnt werden und so ein vollständig durchlässiges Polymer mit großen und einheitlichen inneren Hohlräumen bilden, die ermöglichen, daß Massetransport und chemische Reaktionen innerhalb des Polymers mit kinetischen Parametern, die den in Lösung beobachteten ähneln, durchgeführt werden. Der extrem polare Charakter, die Quellung in Wasser und die großen Poren des gelähnli chen Polymers ermöglichen die Verwendung von Enzymen bei Reaktionen an dem Träger. So wurde gezeigt, daß eine β-1-4 Galaktosyltransferase Galaktosyl-UDP auf ein an ein Harz gebundenes N-Acetylglukosamin übertragen konnte. Diese Eigenschaften werden gegenwärtig weiter ausgewertet.
- Ein Teil der chemischen Struktur des Polymers wird in Abb. 2 zeigt. Andere Arten von Spacern können mit Acryloylchlorid derivatisiert und eingebaut werden, um die funktionelle Gruppe in das Harz einzuführen, die eine Amino-, Carbonoxy-, Phosphonsäure-, Sulfonsäure-, Mercapto- oder Hydroxylgruppe sein kann. In einer anderen Ausführungsform kann sie in einem nicht funktionalisierten Harz vollständig weggelassen werden.
- Dieses kann zum Beispiel in der Gelpermeationschromatographie angewendet werden und das Harz mit geladenen Gruppen kann in der lonenaustauschchromatographie angewendet werden. Dies ist möglich, da dieses Harz im Gegensatz zu anderen Gelharzen des Polydimethylacrylamid- oder Polystyroltyps im Durchfluß stabil ist.
- Das Verfahren zur Herstellung des Polymers der Erfindung ist darin einzigartig, daß ein aminofunktionalisiertes, im Durchfluß stabiles, hochgradig quellendes Polymer mit einem konstanten Quelvolumen in einem einzigen Radikal-Polymerisationsschritt erhalten wird. Die Anwendung der effizienten auf Acrylamid basierenden Radikalpolymerisation ermög licht die Bildung von vollständig einheitlichen sphärischen Perlen mit einer engen Größenverteilung (175-200 µm), die für im Durchflußmodus ausgeführte, schnelle, chemische Reaktionen in der Festphase erforderlich sind. Das Polymer enthält keine Esterbindungen, was eine Voraussetzung für ein Polymer ist, das in einer Vielfalt von chemischen Reaktionen verwendet wird, an denen starke und nukleophile Basen (z.B. Piperidin oder wäßrige Lösungen von Alkalimetalhydroxiden) sowie starke Säuren (z.B. Trifluoressigsäure oder HF) beteiligt sind.
- Copolymerisation von bis-2-Acrylamidoprop-1-yl-PEG&sub1;&sub9;&sub0;&sub0; (1), 2-Acrylamidoprop-1-yl(2- aminoprop-1-yl]-PEG&sub3;&sub0;&sub0; (2) und N,N-Dimethylacrylamid (3) stellt ein Harz, das die meisten der vorstehend angegebenen Kriterien erfüllt, bereit. Verbindung 1 wurde mit einer 67%igen Ausbeute durch Reaktion von in Dichlormethan und Triethylamin (2 Äquivalente) gelöstem bis-2-Aminoprop-1-yl-PEG&sub1;&sub9;&sub0;&sub0; bei 0ºC mit Acryloylchlorid (2 Äquivalenten) hergestellt. Das Gemisch wurde nach 30 min gefiltert und auf das halbe Volumen konzentriert. Diethylether (4 Volumen) wurden hinzugefügt und das Produkt mit einer geringen Menge an Et&sub3;N HCl auskristallisiert. Es wurde durch Futration gewonnen, mit Diethylether gewaschen, getrocknet und durch ¹H-NMR-Spektroskopie charakterisiert. Ein ähnliches Verfahren mit tropfenweiser Zugabe von Acryloylchlorid (1 Äquivalent) zu Triethylamin und bis-2-Aminoprop-1yl-PEG&sub3;&sub0;&sub0; in Dichlormethan wurde zur Herstellung der Verbindung 2 angewendet. Das Produkt konnte nicht auskristallisiert werden, aber es wurde mehrere Male mit Diethylether bei 20ºC gerührt und nach Abkühlen auf -30ºC dekantiert. Restlicher Diethylether wurde unter Vakuum entfernt und man erhielt 74% eines Produktes, das der Integration eines ¹H-NMR-Spektrums zufolge eine Acrylamido- und eine Aminogruppe je PEG-Molekül enthält.
- ¹H-NMR in CDCl&sub3; relativ zu CHCl&sub3; = 7,30 ppm, δ ppm (J Hz) für 1; Acrylamid 6,33 (17,0, 2H, CH&sub2;-trans), 5,64 (10,0, 2H, CH&sub2;-cis), 6,19(17,0, 10,0, 2H, CH); 2- Amidopropyl 1,24 (6,6, 6H, CH&sub3;); 4,19-4,16 (m, 2H, CH), 3,50 (6,6,10,6, CH&sub2;), 3,66 (m, 190H, PEG), 2 hatte ähnliche chemische Verschiebungen und die Integration war korrekt. Et&sub3;N HCl konnte aus 1 durch Aufteilung auf CH&sub2;Cl&sub2; und Wasser entfernt werden. Das bis-Acrylamido-PEG&sub3;&sub0;&sub0; ist in Wasser unlöslich und kann somit aus 2 vor der Polymerisation entfernt werden.
- Der Gehalt des Sirups an bis-Acrylamido- und Diamino-PEG&sub3;&sub0;&sub0;-Derivat wurde auf etwa jeweils 15 % geschätzt.
- Das Polymer wurde in granulierter und in Perlenform mit jeweils einem hohen PEG- Gehalt und unter Zugabe von 20% N,N-Dimethylacrylamid hergestellt, um benachbarte Verzweigungspunkte in dem Acrylpolymer zu vermeiden. Die 20% des Monoamins 3 wurden hinzugefügt, um eine Substitution von annähernd 0,1 mmol/ml in dem endgültigen, gequollenen Harz zu erhalten. So wurden 1(3 g), 2 (1 g) und 3 (1 ml) in DMF (5 ml) und Wasser (3 ml) gelöst. Die Lösung wurde 15 min lang mit Argon gespült. Ammoniumperoxydisulfat (800 mg) in Wasser (2 ml) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde 5 min gerührt und konnte dann 5 h lang polymerisieren. Es wurde abgeschnitten und durch ein feines rostfreies Stahlnetz mit einer Maskengröße von 0,8 mm granuliert. Die Feingutfraktion wurde 3 Mal mit Ethanol (100 ml) dekantiert. Es wurde auf einem Filter mit Wasser (100 ml), Natriumhydroxid (im, 50 ml), Wasser (200 ml), DMF (50 ml) und Ethanol (100 ml) gewaschen und trocken gesaugt. Das Harz wurde gefriergetrocknet und ergab 84% Ausbeute. Das Harzgranulat quoll auf 6 ml/g in DMF. Es quoll bis zu einem ähnlichen Grad in Dichiormethan, in TFA, in Alkoholen und in Wasser, und zeigte so einen weiten Bereich für Anwendungen.
- In einer anderen Ausführungsform wurde das Harz in Perlenform hergestellt, im wesentlichen wie von Kanda et al. 14 beschrieben. Die Polymerperlen wurden wie vorstehend beschrieben behandelt und ergaben 70% feiner Perlen, die auf 8 mug in DMF quollen. Die Harzperlen wurden am besten als Aufschlämmung in DMF gehandhabt, da die trockenen Perlen eine Tendenz zur Adhäsion an Glas und Metall hatten. Sie hafteten jedoch überhaupt nicht an Kunststoffen oder Teflon.
- Die Harzperlen (200 mg) wurden in eine Glassäule gepackt und mit Fmoc-Gly-O-Pfp und dann mit 4-[Fmoc-amino(2,4-dimethoxyphenyl)methyl]phenoxyessigsäure, (4; Rink- Linker¹&sup5;, 160 mg) mit dem TBTU-Verfahren¹&sup6; derivatisiert. Nach 20 min wurde Dhbt-OH hinzugefügt, das vollständigen Ablauf der Reaktion anzeigte und Essigsäureanhydrid (40 µl) wurden hinzugefügt. Der Schutz des Harzes wurde entfernt und das Test-Decapeptidfragment aus dem Acylcarrierprotein 65-74 (5; Abb. 3) wurde mit dem Dhbt-Esterverfahren¹&sup7; auf einem speziell konfigurierten Gerät zur Peptidsynthese synthetisiert, wobei die Reaktion mit einem Festphasenspektrophotometer¹&sup8; verfolgt wurde. In Abb. 3 werden Transmissionskurven von drei der Acylierungsreaktionen gezeigt. Das Peptid wurde als Rohprodukt mit 31 mg Ausbeute durch Spaltung mit 92% TFA, 3% Anisol, 1% EDT, 1% Thioanisol und 3% H&sub2;O isoliert. Die aufgezeichneten Reaktionszeiten wurden mit den Reaktionszeiten derselben Synthese auf dem Polyamidharz¹&sup9; mit Kieselgur als Träger, in Klammern dargestellt, verglichen: Gly 2 min, Asn 3 min (30 min), Ile 43 min (60 min), Tyr 3 min (36 min), Asp 3 min (20 min), Ile 73 min (30 min), Ala 5 min (20 min), Ala 5 min (20 min), Gln 10 min (60 min), Val 65 min (> 1440 min). Die letzte Zugabe von Val zu GIN ist auf Grund von Aggregationen im Harz als besonders schwierig bekannt, die eine vollständige Acylierung nur mit Vorsichtsmaßnahmen und Zugabe von Wasserstoffbindungen spaltenden Mitteln zulassen. Mit dem PEGA-Harz war sie in 65 min vollständig abgelaufen und HPLC und Aminosäure- und Sequenzanalyse zeigen keine Anwesenheit des Desvalinpeptides, das üblicherweise bei diesen Synthesen beobachtet wird. Ähnliche Reaktionszeiten und Ergebnisse wurden mit dem Harzgranulat erhalten.
- Bis-Aminopropyl-PEG&sub1;&sub9;&sub0;&sub0; (300 g, 150 mmol, 300 mmol NH&sub2;) wurde in Triethylamin (41,7 ml, 300 mmol) und Dichlormethan (350 ml) gelöst und Acroylchlorid (24,37 ml, 300 mmol) wurde langsam unter Kühlen auf 0-15ºC innerhalb von 40 min unter effizientem Rühren hinzugefügt. Danach wurde das Gemisch 20 min lang gerührt. Nach dem Futrieren und Waschen mit CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) wurde das kombinierte Filtrat unter 10 und 0,1 Torr verdampft (40ºC). Et&sub2;O (800 ml) wurde hinzugefügt. Das Produkt wurde gerührt und dann gekühlt und konnte bei -78ºC unter Rühren kristallisieren und wurde dann über Nacht bei -20ºC stehen gelassen. Futrieren und Verreiben mit mehr Et&sub2;O (500 ml) gefolgt von Futrieren und Waschen mit Et&sub2;O (300 ml) ergab 308 g des Produktes.
- Bis-Aminopropyl-PEG&sub3;&sub0;&sub0; (100 ml, 0,5 Mol NH&sub2;-Gruppen) wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) aufgelöst und Acroylchlorid (10 ml, 0,12 mol) gelöst in CH&sub2;Cl&sub2; (150 ml) wurde langsam unter Argon bei 0ºC und Kühlen auf Eis über eine Zeitspanne von 90 min hinzugefügt. Das Gemisch wurde 20 min lang gerührt und erst bei 10 Torr und dann bei 0,1 Torr verdampft und ergab einen dicken Sirup. Dieses Rohgemisch wurde für die Polymerisation verwendet.
- 1 (150 g) und 2 (100 g) wurden unter Rühren im Argonstrom in Wasser (570 ml) gelöst. N,N-Dimethylacrylamid (frisch, 30 g) wurde hinzugefügt und das Spülen wurde 5 min lang fortgesetzt. Hexan (1685 ml) und CCl&sub4; (1140 ml) wurden in der Polymerisationsapparatur gemischt und mit Argon gespült. Der Apparat wurde auf 65-77ºC erhitzt. (NH&sub4;)&sub2;S&sub2;O&sub8; (4,29) in H&sub2;O (15 ml) wurde zu dem wäßrigen Polymerisationsgemisch bei 20ºC unter Rühren mit Argon hinzugefügt. Sorbitanmonolau rat (3,6 g in 15 ml DMF) wurde hinzugefügt und das Gemisch wurde unter Rühren mit 550-600 U/min (T = 50ºC) in die Apparatur überführt. Nach 2 min Rühren bei 550 U/min wurde N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (12 ml) hinzugefügt und das Rühren wurde fortgesetzt, während die Temperatur auf 65ºC angehoben wurde. Nach 30 min wurde das Rühren auf 600 U/min erhöht und 4h lang fortgesetzt. Das Harz wurde gekühlt und in einem 12 cm 35 cm Filter mit einem Ventil futriert und mit Methanol (1 l) und Wasser (2 l) gewaschen. Es wurde durch ein Stahlnetz passiert, wurde zurück in den Filter überführt und mit Wasser (8 l) und Methanol (2,5 l) gewaschen. Das Methanol kann durch Lyophilisation entfernt werden.
- -Synthese der Glykopeptide wurde in DMF mit einem speziell konfigurierten, vollautomatischen Gerät zur Peptidsynthese im kontinuierlichen Durchfluß oder durch die "Kunststoffspritzentechnik" (wie nachstehend beschrieben) unter Verwendung des PEGA-Harzes {358} (0,07 mmol/g) durchgeführt. Aminosäuren wurden als ihre Pfp-Ester (3 Äquiv.) gekoppelt, wobei Dhbt-OH (1 Äquiv.) als nukleophiler Hilfsstoff hinzugefügt wurde, oder als ihre Dhbt-Ester (3 Äquiv.). Die Seitenketten wurden mit But für Serin, Threonin und Tyrosin geschützt. Aufhebung des Nα-Fmoc-Schutzes wurde durch Behandlung mit 20% Piperidin in DMF 30 min lang bewirkt und die Acylierungszeiten wurden mit einem Festphasen-Spektrophotometer bei 440 nm bestimmt. Glycin wurde direkt an das Harz gekoppelt, gefolgt von der Kopplung des Rink-Linkers durch das TBTU-Verfahren {413}. Die erste Aminosäure wurde gekoppelt und unveränderte Aminogruppen wurden vor dem Koppeln der zweiten Aminosäure durch Zugabe von Acetanhydrid mit einer Cap-Gruppe versehen. Nach Aufheben des Schutzes der letzten Aminosäure wurde das Harz aus der Säule entfernt, mit Dichlormethan gewaschen und über Nacht gefriergetrocknet. Die Abspaltung des Peptids oder des Glycopeptides von dem Trägermaterial wurde durch Behandlung mit einem Gemisch von TFA, Wasser und Radikalfänger durchgeführt, wie im einzelnen bei den individuellen Peptiden beschrieben. Nach der Abspaltung wurde das Harz auf einen Glasfilter ausgegossen und drei Mal mit TFA gewaschen, gefolgt von 95% wäßriger Essigsäure. Die vereinigten Futrate wurden aufkonzentriert und der Rückstand wurde durch mehrfaches Verreiben mit Diethylether, der dekantiert wurde, verfestigt. Lösungsmittelrückstände wurden unter vermindertem Druck entfernt und das Peptid wurde durch präparative HPLC gereinigt.
- Das gereinigte, acetylierte Glykopeptid wurde in trockenem Methanol (1 mg cm&supmin;³) gelöst und 1 mol dm&supmin;³ Natriummethoxid in Methanol wurde hinzugefügt, bis ein angefeuchtetes pH-Papier den pH-Wert 11 anzeigte. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur 2 h lang gerührt, mit kleinen Stücken festen CO&sub2;'s neutralisiert und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in Wasser (1 mg cm&supmin;³) gelöst und durch präparative HPLC gereinigt.
- Peptid 28 und Glykopeptid 29 wurden durch Verwendung der Kunstoffspritzentechnik synthetisiert, die eine einfache und preiswerte Alternative zu automatischen Geräten zur Peptidsynthese darstellt. Die Technik wird hier an der Synthese des Dipeptids H-Asn- Phe-NH&sub2; 28 erläutert. Eine 20 cm³ Wegwerfkunststoffspritze A (ohne Kolben) wurde mit einem gesinterten Teflonfilter versehen (Porengröße 70 µm) und der Auslaß wurde mit dem Auslaß einer 50 cm³ Kunststoffspritze B über einen Teflonschlauch mit Luer-Adap tern verbunden. Spritze B wurde als Abfalispritze verwendet, um Lösungsmittel zu entfernen. PEGA-Harz (0,5 g, 0,07 mmol/g) wurde in Spritze A gegeben und konnte in DMF (10 cm³) quellen, das vorsichtig von oben hinzugefügt wurde und von unten durch Saugen mit Spritze B entfernt wurde. Nα-Fmoc-L-Gly-OPfp (49 mg, 0,105 mmol) und Dhbt-OH (5,7 mg, 0,035 mmol) wurden in DMF (4 cm³) aufgelöst und das Gemisch wurde auf das Harz ausgegossen. Nach der Kopplung wurde das Harz mit DMF (8 4 cm³) gespült bevor der Nα-Fmoc Schutz aufgehoben wurde. Piperidin in DMF (20%, 2 4 cm³) wurde in zwei Schritten zu dem Harz hinzugefligt. Der erste Teil wurde schnell durch das Harz gesaugt, gefolgt von der Zugabe des zweiten Teils, der nach 30 min entfernt wurde. Nach gründlichem Spülen mit DMF (8.4 cm³) wurden Rink-Linker (57 mg, 0,105 mmol), TBTU (34 mg, 0,105 mmol) und N-Ethylmorpholin (26 mm³, 0,21 mmol) in DMF (4 cm³) gelöst und zu dem Harz hinzugefügt. Nach 2 h wurde das Harz mit DMF (8 4 cm³) gespült bevor der N-Fmoc Schutz aufgehoben und mit Nα-Fmoc-L-Phe-OPfp und Nα-Fmoc-L-Asn- OPfp, wie vorstehend beschrieben, gekoppelt wurde. Nach endgültiger Aufhebung des Schutzes wurde das Peptidharz mit Dichlormethan gespült und gefriergetrocknet, vor der Spaltung des Peptids von dem Trägermaterial mit TFA 1 Ethandithiol / Thioanisol / Anisol / Wasser (67/1/1/2,7/2,7) und ergab rohes Dipeptid 28.
- Die mit 28 und 29 bezeichneten Verbindungen wurden mit der Kunststoffspritzentechnik wie beschrieben synthetisiert. Bei der Synthese von 29 wurde das H-Phe-Harz mit 27 (80 mg, 0,07 mmol) gekoppelt und ergab das Peptid-Harz A.
- Die Festphasensynthese wurde auf einem speziell konfigurierten, vollautomatischen Gerät zur Peptidsynthese im kontinuierlichen Durchfluß gemäß des allgemeinen Verfahrens durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. PEGA-Harz (0,5 g, 0,07 mmol/g) wurde verwendet. Zwei Äquivalente von 7 (80 mg, 0,07 mmol) wurden mit einem Äquivalent an Dhbt-OH (5,7 mg, 0,035 mmol) verwendet. Nach der vollständigen Kopplung (4 h) wurde der Rückstand 7 zurückgewonnen (48 mg, 0,04 mmol). D-Alanin wurde als freie Säure durch das TBTU-Verfahren eingebaut {413}. Nach der Spaltung vom Harz mit TFA / Ethandithiol / Thioanisol / Anisol / Wasser (67 / 1 / 1 / 2,7 / 2,7) (22 cm³, 2 h, Umgebungstemperatur) und Verreiben mit Ether, wurde das verfestigte Rohglykopeptid, Hepta- O-acetat 30 (36 mg, 87%-basierend auf 7) durch präparative HPLC, unter Verwendung von 10% Lösungsmittel B 20 min lang gereinigt, gefolgt von einem linearen Gradienten von 10-60% des Lösungsmittels B während 100 min (Retentionszeit 59,6 min). Die Ausbeute an 30 betrug 11 mg (27%). Deacetylierung mit Natriummethoxid, wie vorstehend beschrieben, gefolgt von Reinigung mit präparativer HPLC unter Verwendung von 0% Lösungsmittel B 10 min lang, gefolgt von einem linearen Gradienten von 0-30% Lösungsmittel B über 60 min (Retentionszeit 30,6 min) ergab die reine mit 31 bezeichnete Verbindung (5,5 mg, 17%). ¹H- und ¹³C-NMR-Daten sind in Tabelle 7 und Tabelle 8 dargestellt. Aminosäureanalysen (theoretische Werte in Klammern): Ala 1,00 (1), Asn 0,88 (1), Ser 1,06 (1), Thr 4,17 (4), Tyr 0,89 (1). Tabelle 7: ¹H-NMR chemische Verschiebungen (ppm) und Kopplungskonstanten (Hz) von 32a und 31b, bei 500 MHz und 600 MHz und 300 K gemessen. Interner Standard: Essigsäure bei 2,03 ppm
- a 5.2 mg in 10% CD&sub3;COOD/H&sub2;O (600 mm³, pH 2.27).
- b 4.6 mg in 10% CD&sub3;COOD/H&sub2;O (600 mm³, pH 2.41).
- c ungefährer Wert Tabelle 8: Ausgewählte ¹³C-NMR chemische Verschiebung (ppm) von 32a und 31b, gemessen bei 125,77 MHz und 300K Interner Standard: Essigsäure bei 20,0 ppm
- a 15.0 mg in 10% CD&sub3;COOD/H&sub2;O (600 mm³, pH 2.72).
- b 4.6 mg in 10% CD&sub3;COOD/H&sub2;O (600 mm³, pH 2.41).
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Claims (21)
1. Vernetztes, Polyethylenglykol oder Polypropylenglykol enthaltendes Polymer, das
durch Radikal-Copolymerisation von derivatisiertem, mit einer Einheit ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem Acryloylalkyl-, Acryloylaryl-,
Acrylamidoalkyl- und Acrylamidoarylrest zweifach endsubstituiertem Polyethylenglykol oder
Polypropylenglykol mit einem Acrylamid, -nitril oder -ester gebildet ist.
2. Polymer gemäß Anspruch 1, das durch Copolymerisation eines derivatisierten
Polyethylenglykols der Formel
wobei n eine Integerzahl von 4 bis 2000, q Null oder 1 und R
-(CR'&sub2;)&sub8;-(C&sub6;R'&sub6;)t-(CR'&sub2;)u-
ist, wobei s, t und u jeweils Null oder eine Integerzahl von 1-10 ist und jedes R' ein
H, Alkyl-, Aralkyl- oder Arylrest ist, wobei dieser Aralkyl- oder Arylrest wahlweise am
Ring mit einem Alkyl-, Hydroxyl-, Mercapto-, Nitro-, Amino-, Mono- oder
Dialkylaminorest oder Halogenatom substituiert ist, wobei wenigstens eins von q, s, t
und u ungleich Null ist; mit einer Acrylverbindung der Formel
wobei R¹ -CY-X-R&sup5; oder -CN ist; und R², R³ und R&sup4; jeweils ein H, Alkyl-, Arakyl-,
Arylrest, -CY-X-R&sup5; oder -CN ist, wobei Y gleich O oder S ist, X gleich O, S oder NR&sup6;
ist, R&sup5; ein Alkyl-, Aralkyl- oder Arylrest ist und R&sup6; gleich H oder R&sup5; ist, und wahlweise
mit einem Spacermolekül, das funktionelle Gruppen zur Anbindung von Peptiden,
Proteinen, Nukleotiden oder Sacchariden enthält, gebildet ist.
3. Polymer gemäß Anspruch 2, in das ein Spacer eingebaut ist, der funktionelle
Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino-, Alkylamino-,
Hydroxyl-, Carboxyl-, Mercapto-, Sulfeno-, Sulfino-, Sulfogruppe und Derivaten
davon, enthält.
4. Polymer gemäß Anspruch 2, das durch Copolymerisation eines derivatisierten
Polyethylenglykols der Formel I, in der n, q und R das darstellen, was in Anspruch 2
definiert wird, mit einem Acrylamid der Formel
gebildet ist und mit einem Spacermolekül der Formel
wobei m eine Integerzahl von 4 bis 2000 ist und q und R das darstellen, was für
Formel I in Anspruch 2 definiert wird.
5. Polymer gemäß Anspruch 4, das aus 60% bis-2-Acrylamidoprop-1-yl-PEG&sub1;&sub9;&sub0;&sub0; (1),
20% 2-Acrylamidoprop-1-yl[2-aminoprop-1-yl]-PEG&sub3;&sub0;&sub0; (2) und 20% N,N-
Dimethylacrylamid (3) zusammengesetzt ist.
6. Polymer gemäß Anspruch 4, das mit irgendeinem der normalerweise bei der
Peptidsynthese verwendeten Linker derivatisiert ist.
7. Polymer gemäß Anspruch 6, wobei der Linker 4-[Fluorenylmethyloxycarbamido-(2,4-
dimethoxyphenyl)methyl]-phenoxyessigsäure der Formel
4-Hydroxylmethylphenoxyessigsäure, 4-Hydroxylmethylbenzamid oder 4-
Hydroxylmethyl-3-nitrobenzamid ist.
8. Trägermaterial zur Synthese von Peptiden im kontinuierlichen Durchfluß oder
chargenweise, wobei der Träger ein Polymer gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-
7 enthält.
9. Trägermaterial zur Synthese von Oligonukleotiden im kontinuierlichen Durchfluß
oder chargenweise, wobei der Träger ein Polymer gemäß irgendeinem der
Ansprüche 1-5 enthält.
10. Trägermaterial zur Synthese von Oligosacchariden, wobei der Träger ein Polymer
gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-5 enthält.
11. Trägermaterial gemäß irgendeinem der Ansprüche 8-10, wobei der Träger zur
Synthese durch Enzymreaktionen geeignet ist.
12. Trägermaterial gemäß Anspruch 10 zur Enzymsynthese von Oligosacchariden mit
Glykosyltransferasen.
13. Trägermaterial zur Immobilisierung von Proteinen, wobei der Träger ein Polymer
gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-5 enthält.
14. Harz zur Anwendung bei chromatographischen Trennungen, wobei das Harz ein
Polymer gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-5 enthält.
15. Verfahren zur Synthese eines Peptids im kontinuierlichen Durchfluß oder
chargenweise, wobei das Peptid während der Synthese an einem Trägermaterial
befestigt ist, das ein Polymer gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-7 enthält, und
am Ende der Synthese von diesem Trägermaterial abgespalten wird.
16. Verfahren zur Synthese eines Oligonukleotids im kontinuierlichen Durchfluß oder
chargenweise, wobei das Oligonukleotid während der Synthese an einem
Trägermaterial befestigt ist, das ein Polymer gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-5
enthält, und am Ende der Synthese von diesem Trägermaterial abgespalten wird.
17. Verfahren zur Synthese eines Oligosaccharids im kontinuierlichen Durchfluß oder
chargenweise, wobei das Oligosaccharid während der Synthese an einem
Trägermaterial befestigt ist, das ein Polymer gemäß irgendeinem der Ansprüche 1-5
enthält, und am Ende der Synthese von diesem Trägermaterial abgespalten wird.
18. Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 15-17, bei dem die Synthese eine
Enzymreaktion beinhaltet.
19. Verfahren gemäß Anspruch 17 zur Enzymsynthese eines Oligosaccharids mit einer
Glykosyltransferase.
20. Verfahren zur Immobilisierung eines Proteins, bei dem das Protein an einem
Trägermaterial befestigt wird, das ein Polymer gemäß irgendeinem der Ansprüche
1-5 enthält.
21. Verfahren zum Durchführen chromatographischer Trennungen, das die Verwendung
eines Chromatographieharzes aufweist, das ein Polymer gemäß irgendeinem der
Ansprüche 1-5 enthält.
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