DD133231B1 - Verfahren zur herstellung von peptiden,proteinen und proteinsequenzen - Google Patents

Description

Verfahren_zur Herstе11иг-2_УОП_Ре£^д.аеп^_Рго^е1пеп_ипа._Рго^е1п-ee^uenzen

^wendungsgebiet_der Erfindung

Chemische Herstellung von Peptiden und Proteinen, insbesondere von Peptidhormonen durch schrittweise, wiederholende Verlängerung mit den entsprechenden geschützten Aminosäuren oder Peptidfragmenten.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die bisher beschriebenen Verfahren zur Peptidsynthese sind folgende:

a) sogenannte konventionelle Verfahren (E. WÜNSCH: Angew. Chem, 85, 773 (1971):

Alle Reaktionspartner befinden sich in flüssiger Phase, wobei die auf jeder Kupplungsstufe erfolgende P.einisolierung des geschwünschten Syntheseproduktes Schwierigkeiten bereitet.

b) Peptidsynthesen am festen Träger (R.B. MERRIFIELD: Adv. in Enzymol. 32, 221 (1969); R.B. IIERRIPIELD: J. Amer. Chem. Soc. 85, 2145 (1963); R.B. MERRIPIELD: Biochemistry 3, 1385 (1964); J.M. STEWART u. J.D. YOUNG: Solid Phase Peptide Synthesis Freeman, San Francisco (1969); G. LOSSE u. K. NEUBERT: Z. Chem. Ю, 48 (1970); G. LOSSE u. R. ULBRICH: V/iss. Z. Techn. Univers. Dresden 22, 263 (1973); E. SCHRÖDER u. K. LÜBKE: The peptides I, Academic Press, 1965) Schrittweiser Peptidaufbau an einem hochmolekularen Träger, wobei die v/achsende Peptidkette stets an einem polymeren

Träger gebunden bleibt. Dadurch wird die Entfernung der im Überschuß eingesetzten geschützten Aminosäuren oder Peptidfragmente bzw. der Reaktionsmittel erleichtert; die Abtrennung der während einer Kupplung nicht umgesetzten Peptide (RumpfSequenzen) oder gebildeten Pehlsequenzen kann jedoch erst nach beendeter Synthese, nach Ablösung vom Träger, erfolgen. Aus dem so erhaltenen Peptidgemisch das gewünschte Produkt zu isolieren, stellt häufig ein großes Problem dar.

c) Polymer-Reagenz-Verfahren (M. PRIDKIN et al.: J. Amer. Chem. Soc. 90, 2953 (1968); Th. V/IELMD u. Ch. BIRR: Chimia 22, 581 (1967); G. LIMECKE u. E. HAAKE: Naturwissenschaften 55, 343 (1968):

Durch Verwendung eines an ein Polymer gebundenes Aktivierungsreagenz wird ebenfalls die Entfernung der überschüssigen Reaktionsmittel erleichtert. Hierbei besteht gegenüber dem unter b) genannten Verfahren die Möglichkeit, nicht umgesetztes Peptid auf jeder Kupplungsstufe wie bei der unter a) genannten konventionellen Methode abzutrennen. Bei diesem Verfahren ist die wachsende Peptidkette nicht an den polymeren Träger gebunden.

d) Die Peptidproduktzusammensetzung wird in erheblichem Maße durch die Eigenschaften des Trägermaterials beeinflußt. D.h. Vernetzung, Quellfähigkeit, Durchlässigkeit für eindiffundierende Moleküle, Art und Sitz der Ankergruppen innerhalb des Polymerisats sowie die mechanischen Eigenschaften (mechanische Stabilität, Piltrierbarkeit, Korngröße) spielen eine wesentliche Rolle.

Als zur Verwendung für die Peptidsynthese gebräuchliches, festes unlösliches Copolymerisat dient das von LlERRIPIELD vorgeschlagene Polystyrolharz mit 1 bis 2 % Divinylbenzol-Vernetzung und einer Korngröße von 20 bis 80 ,um, das gelporösen Charakter besitzt. Diese werden zur Bindung der wachsenden Peptidkette mit etwa 0,6 bis 2,0 Milliäquivalenten Chlormethylgruppen oder anderen Gruppen pro Gramm Harz substituiert.

Als Folge des unbefriedigenden Einflusses der genannten Trägerstruktur auf den Verlauf der damit durchgeführten Peptidsynthesen wurden zahlreiche Varianten dieses Grundtyps vorgeschlagen, um die physikalischen oder chemischen Eigenschaften des Trägers zu verbessern.

So sind auf der Basis Polystyrol-Diviny!benzol auch Popcorn-Polymerisate (G. LOSSE u. K. NEUBERT: Z. Chem. 22» 48 (197O)), Schalenharze (A. LOSSE: Tetrahedron Letters 1971, 4989; E. BAYER et al.: J. Jimer. Chem. Soc. 92, 1735 (1970); DE-OS 2 109 027) und makroporöse (makroreticulare) Polymere (M. TILAK u. C. HOLLINDEH: Org. Prep, and Proceed. Int. 3, 183 (1971); USP 1 950 969; S. SANO et al.: Biochim. Biophys. Acta 1221» ²44) erprobt worden.

Von diesen weisen die makroreticularen Polymerisate gegenüber gelporösen Harzen eine größere Oberfläche und eine leichtere Zugänglichkeit ihres Porengerüstes für größere Moleküle auf, wodurch ein schnelles Eindiffundieren der Reaktanten ermöglicht wird, ohne daß die Polymerstruktur wie bei gelporösen Harzen vorher durch Quellen aufgelockert zu werden braucht. Hieraus sollte sich eine Unabhängigkeit der Porenstruktur von Lösungsmitteleffekten und damit ein eventueller günstigerer Syntheseverlauf ergeben.

Bei der vergleichenden Erprobung ergibt sich, daß einmal die Diffusion der Reaktionskomponenten in die feste Phase keine wesentliche Bedeutung besitzt und daß zum anderen diese Polymerisate zwar für Peptidsynthesen geeignet sind, aber in ihrer Leistungsfähigkeit die Merrifield-Polystyrolharze nicht erreichen können.

Die Durchführung der Peptidsynthese am festen Träger ist vom Prinzip her mit einer Reihe von Forderungen an das Trägermaterial und an den Verlauf der Synthese selbst verbunden, da eine erfolgreiche Synthese nur erreicht v/erden kann, wenn jeder Reaktionsschritt einerseits quantitativ und andererseits selektiv erfolgt. Diese Bedingungen sind in der Praxis

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nur bedingt realisierbar. Daher weist die Pestphasenmethode, trotz ihrer unbestrittenen Reihe von Vorteilen, bestimmte Nachteile hinsichtlich der Synthesedurchführung und insbesondere der Endproduktzusammensetzung auf. Diese v/erden hervorgerufen einmal durch chemische Gegebenheiten, wie unvollständig «yerlaufende Umsetzungen und Nebenreaktionen und zum anderen durch physikalische Gegebenheiten, bedingt durch die Trägereigenschaften.

D_as Ziel der Erfindung ist es, die Nachteile der bekannten Trägermaterialien, wie Starrheit des Gerüstes der makroreticularen Harze, ungünstiges Verhalten der Gelpolymere und die starke Beeinflussung durch Lösungsmitteleffekte zu verringern und damit einen besseren Verlauf der Peptidsynthese zu erreichen.

Aufgabe:

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile der bekannten Trägermaterialien, die zur Peptidsynthese am polymeren Träger verwendet v/erden, so zu verringern, daß dadurch ein besserer Verlauf der Peptidsynthese erzielt und damit das jeweilige Peptid in höherer Reinheit und in größerer Ausbeute erhalten v/erden kann.

Merkmale_der_Erfindung

Erfindungsgemäß werden polymere Träger benutzt, deren Grundgerüst aus vernetzten Polyvinyl-Kohlenwasserstoffen besteht und eine heterogen aufgeweitete G_elstruktur mit latenter Porosität besitzt, so daß die am polymeren Träger aufzubauenden Polypeptide sterisch sich nicht behindern können und zwischen den Peptidketten keine unerwünschten Reaktionen auftreten. Zur Bildung der aktiven Stellen im Polymeren wird das Copolymere in einem Lösungsmittel gequollen und mit Monochlordimethyläther chlormethyliert oder andere geeignete Methoden zur Schaffung aktiver Zentren im Polymeren angewandt (z.B. mit Benzhydrylamin).

Die so hergestellten polymeren Grundkörper werden mit einer geschützten Aminosäure verknüpft und bilden die Basis für den Aufbau von Polypeptiden,

Die Synthese dieser polymeren Trägermaterialien erfolgt durch Copolymerisation von ИопоѵіпуIverbindungen und einem geringen Anteil von PolyvinyIverbindungen unter gleichzeitiger Anwesenheit von nicht an der Polymerisationsreaktion teilnehmenden Substanzen, wobei die Polymerisation so durchgeführt wird, daß es zur Ausbildung einer heterogen aufgeweiteten Gelstruktur mit latenter Porosität kommt. Die Zusammensetzung der Monomeren und der Zusatzstoffe wird so gewählt, daß ein relativ heterogenes, aber weitmaschiges Polymerengefüge entsteht. Diese Harze besitzen im ungequollenen Zustand keine mit den üblichen Methoden meßbare Oberfläche und keine makroporöse Struktur. Andererseits ist das Quellverhalten und insbesondere die Atmungsdifferenz gegenüber den bekannten Gelharzen stark verändert, so daß ungünstige Wirkungen auf das Diffusions- und Reaktionsverhalten bei der Peptidsynthese vermieden werden.

Die Herstellung der polymeren Träger erfolgt vorzugsweise nach der Methode der Suspensionspolymerisation, d.h. eine ölige polymerisierbar Phase wird in einer wäßrigen Phase mittels Rühren oder Schütteln zu kleinen kugelförmigen Tröpfchen verteilt und durch 7ärmezufuhr die Polymerisation ausgelöst. YJährend der Polymerisation werden die Tröpfchen verfestigt und es entstehen kleine Perlen. Der Durchmesser der Kügelchen kann variiert werden und ist abhängig von der Rührgeschwindigkeit und anderen Parametern. Es können Polymere mit einem Durchmesser von 10 bis 1000 ₍u eingesetzt v/erden, wobei vorzugsweise ein Durchmesser der Kugeln zwischen 40 und 300 p. gewählt wird.

Die ölige Phase besteht aus einem Gemisch von Monomeren, Inertmitteln und Polymerisationsinitiatoren. Die Auswahl der Monomeren muß derart erfolgen, daß in der sich bildenden Matrix die erforderlichen aktiven Zentren zur Bindung der Aminosäuren bereits vorhanden sind, bzw. durch polymeranalogfe Reaktionen eingeführt v/erden können. Solche

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Monomeren sind zum Beispiel: Halogenalkylviny!verbindungen, wie Chlormethylstyrol, Vinylaromaten wie Styrol, Vinyltoluol, Vinyläthylbenzol, Vinylbenzophenon, Viny!benzylalkohol, Acryl- und Ally !verbindungen, wie Methylmethacrylat und Allylchlorid, B_ei den Monomeren kann es sich daher um ein oder mehrere der Alkeny!verbindungen handeln, die mit einem geeigneten Vernetzungsmittel copolymerisiert werden. Solche sind Divinylbenzol, Trivinylbenzol, Glykoldimethacrylat, Divinyloxyäthan, Butadien usw.

Damit das Copolymere die für die Peptidsynthese geeignete sterische Struktur erhält, werden dem Monomerengemisch bestimmte Anteile von Inertsubstanzen zugesetzt, die selbst an der Polymerisationsreaktion nicht teilnehmen, aber durch 7/echselwirkung mit den Polymerketten zu einer optimalen Matrix führen. Solche Inertmittel sind Substanzen, die mit den Monomeren mischbar sind, die Polymeren aber nur teilweise aufquellen. Dadurch erfolgt während des Polymerisationsvorgangs eine teilweise Trennung von bereits gebildetenPolymeren und Intertmitteln, was zur Ausbildung der heterogenen Struktur führt. Für die Copolymerisation von vinylaromatischen V_erbindungen werden vorzugsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe mit einer C-Zahl von Cg bis C.. als Inertmittel eingesetzt. Für die Copolymerisation von AcryIverbindungen werden vorzugsweise aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol usw. verwendet. Von besonderer Wichtigkeit für die Synthese der erfindungsgemäßen Harze ist die Wahl der Mengenverhältnisse von Monomeren, Vernetzern und Inertmitteln. Hierbei ist zu vermeiden, daß die verwendeten Mengenverhältnisse zur Ausbildung makroreticularer (poröser) Strukturen führen (DE-OS 1 950 969)· Ein geeigneter Bereich zur Herstellung erfindungsgemäßer polymerer Materialien liegt bei 0,1 bis 3 Gew.-^ь, vorzugsweise bei 0,5 bis 2 Ge\v.-% Vernetzer, z.B. Divinylbenzol und bei einem Inertmittelanteil von 20 bis 50 ^S. Die erhaltenen Harze sind durchsichtig und enthalten das Inertmittel in heterogener Verteilung. Die Entfernung erfolgt vor bzw. während der sich anschließenden polymeranalogen Reaktion durch Extraktion bzv/. Destillation.

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Bei Verwendung von Halogenalky!vinylaromaten als Monomeres können die so hergestellten Harze ohne weitere. Behandlung zur Peptidsynthese eingesetzt werden. Polymere, die keine reaktiven Zentren für die Bindung mit geschützten Aminosäuren besitzen, werden nach an sich bekannten Methoden in die entsprechenden Chlormethyl-, o.a., Hydroxymethyl- (M. BODANSZKY et al.: Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966)), bzw. Benzhydrylamin-Derivate (P. RIVAILLE et al.: HeIv. Chin. Acta 54, 296 (1971); P. PIETTA et al.: Gazz. Chim. Italians 103, 483 (1973); P. PIETTA et al.: J. Org. Chem. 39, 44 (1974); V. HRUBY et al.: J. Med. Chem. Vb₉ 624 (1973); M. BODANSZKY et al.: Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966)) überführt .

Uberraschender.veise zeigen die auf diese Weise hergestellten Trägermaterialien wesentlich bessere Eigenschaften im Hinblick auf den Einsatz zur Peptidsynthese, als die bisher bekannten Harze. So besitzen sie im Gegensatz zu den makroreticularen (porösen) Trägern keine Porosität und innere Oberfläche. Weiterhin weist das Harzgerüst der neuen Trägermaterialien, ebenfalls im Gegensatz zu den genannten makroreticularen Trägern, eine hohe Flexibilität und Beweglichkeit sowie eine geringere Vernetzung auf, die sich vorteilhaft auf die Synthese von Peptiden, vorzugsweise auf die Synthese sehr langkettiger Polypeptide auswirken.

Gegenüber den Gelpoylmeren, v/ie sie z. B. von 1.!ERRIPIELD vorgeschlagen und üblicherweise zur Peptidsynthese verwendet werden, zeichnen sich die neuen Harze durch eine geringere Volumendifferenz zwischen quellenden und nichtauellenden Lösungsmitteln und durch eine verbesserte Kinetik aus, Eigenschaften, die sich bei der durchzuführenden Peptidsynthese als sehr günstig erweisen, da hiermit einmal die Lösungsmitteleffekte verringert werden und zum anderen die Reaktanten besser reagieren können. Als Folge der verbesserten Eigenschaften der neuen Trägermaterialien ergibt sich bei den durchgeführten verschiedenen Peptidsynthesen ein Peptid-Endprodukt, das in wesentlich höherer Reinheit und größerer Ausbeute, bezogen auf die eingesetzte Polymermenge,

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anfällt, als bei Verwendung bisher bekannter Trägertypen

In Verbindung mit der höheren Reinpeptid-Ausbeuto sinkt gleichzeitig die Anzahl der Hebenbestandteile, so daß auch der Reinigungsaufwand beachtlich abnimmt.

Für die Herstellung von Peptiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Aminosäurekette entweder stufenweise aus den verschiedenen Aminosäurederivaten oder unter Einsatz von Peptidfragmenten nach bekannten Verfahren aufgebaut werden. Der Peptidaufbau beginnt durch die Bindung der C-terminalen Aminosäure an die reaktiven Zentren des Trägermaterials, wobei bekannte Methoden Anwendung finden. Anstelle der C-terminalen Aminosäure kann auch ein Peptid, z.B. ein Di- oder Tripeptid in gleicher Meise an den Träger gebunden werden, woraufhin die gewünschte Aminosäurekette mit Aminosäuren oder bzw. und Peptiden vervollständigt wird. Die Verknüpfung der Aminosäuren und/oder Peptidfragmente erfolgt in der Weise, daß man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter cv-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer am Träger gebundenen Aminosäure oder einem Peptid mit freier л -Aminogruppe umsetzt.

Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in einen aktivierten Ester, wie beispiels\veise p-Nitrophenyl-, N-Hydroxysuccinimid-, 2.4.,5-Trichlorphenyl-, Pentachlorphenyl-, 8-Hydroxychinolinester (gegebenenfalls unter Beifügung von weiter aktivierenden Zusatzstoffen), ein Säureanhydrid, —azid, -imidazolid oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimides (gegebenenfalls unter Zusatz von weiter aktivierenden Zusatzstoffen), oder Ν,Ν-Carbonyldiimidazols, aktiviert werden.

An der Reaktion nicht beteiligte, freie funktioneile Gruppen werden zweckmäßigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion oder flüssigem Fluorwasserstoff leicht abspaltbarer Reste, wobei man die für die Peptidsynthese bekannten Gruppen verwendet, z.B. die Benzyl-, p-Chlorbenzyl-, 2.6-Dichlorbenzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-LIethoxybenzyl-, Benzhydryl-, tertiär-Butyl-, Tosyl-, Dinitrophenyl-, Nitro-Gruppe.

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Als Aminoschutzgruppen sind beispielsweise zu nennen: aliphatisch^ Oxyсarbony!gruppen, wie z, B« Cyclohexyloxycarbonyl-, Adamantyloxycarbonyl- und in erster Linie tertiär-Buty1oxycarbonyl-(Бос-), oder von der Kohlensäure bzw. Thiokohlensäure sich ableitende Gruppen, wie gegebenenfalls im aromatischen Rest substituierte Carbobenzoxygruppen (z. B. Carbobenzoxy-, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy-, p-LIethoxycarbobenzoxy-), ferner o-Nitrophenylsulfenyl- und gegebenenfalls substituierte Aralkylgruppen (Dipheny!methyl- oder Triphenylmethylgruppen beispielsv/eise )-

Zur Abspaltung der «£-Amino-Schutzgruppen finden Trifluoressigsäure/Dichlormethan, Trifluoressigsäure allein, HCl in Eisessig oder Dioxan bevorzugt Anwendung. Andere Spaltungsreagenzien und deren Abspaltungsbedingungen zur Entfernung spezifischer Amino-Schutzgruppen sind in E. SCHRÖDER u. K. LÜBKE: The peptides I, Academic Press, 1965, S. 72-75 beschrieben.

Nachdem das gewünschte Peptid aufgebaut wurde, kann die Bindung mit dem polymeren Trägermaterial auf bekannte Weise, wie Bromwasserstoff/Eisessig, Ammonolyse, Alkoholyse, Hydrazino-Iyse, bevorzugt aber mit Hilfe von verflüssigtem Fluorwasserstoff bei 0 C bis Raumtemperatur, gegebenenfalls unter Zusatz von z. B. Anisol, Llercacptoäthanol, aufgespalten werden.

Bei Anwendung von Chlormethyl-Polymerisaten erhält man bei der Ablösung des Peptides vom Träger mittels flüssigem Fluorwasserstoff eine C-terminale Carboxylfunktion, bei Benzhydrylamin-Polymeren eine C-terminale Amidfunktion. Das so erhaltene Rohpeptid wird nach Befreiung von noch vorhandenen Schutzgruppen durch Anwendung geeigneter Reinigungsverfahren (säulenchromatographische und andere Reinigungsoperationen, wie Umfallen u.a.) aufgereinigt.

Das erfindungsgemäße Verfahren soll in nachstehenden Ausführungsbeispielen erläutert werden, ohne daß die Erfindung auf diese Beispiele zu beschränken ist.

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1. Synthese des polymeren Grundgerüstes

In einem 2 Liter-Planschliffbecher, der mit einem Rückflußkühler und einem Heizregelsjrstem bestückt ist, wird eine Mischung aus 313,7 g Styrol, 12,7 g Divinylbenzol der Zusammensetzung 51,2 ^c/o Divinylbenzol und 48,8 % Athylstyrol, 175 g Parex-Benain und 1,5 g Azodiisobuttersäuredinitril in 1000 ml Y/asoer, dem 5 g Mg(OH)₂ und 0,2 g Sapol zugesetzt wurden, mittels Rühren suspendiert. Die Rührgeschwindigkeit wird so eingestellt, daß die sich bildenden kugelförmigen Tröpfchen einen mittleren Durchmesser von 60 .,u besitzen. Anschließend wird die Temperatur auf 70 C gesteigert und solange konstant gehalten, bis der Gelpunkt vorüber ist (ca. 5 Stunden), dann wird auf 95 ⁰C erhitzt und 4 Stunden nachpolymerisiert. Die erhaltenen Polymerperlen werden filtriert, durch Waschen mit 0,5-proz, Schwefelsäure vom anhaftende Suspensionsstabilisator befreit und zur Entfernung des Inertmittels mit Wasserdampf behandelt« Schließlich wird das Produkt bei 100 ⁰C getrocknet. Gegebenenfalls kann das Polymerisat in den Grenzen zwischen 40 μ und 100 ,u gesiebt werden. Es liegt in Form gelartiger durchsichtiger Kugeln von hoher Festigkeit vor. Mit den bekannten Methoden läßt sich weder eine meßbare innere Oberfläche noch ein Porenvolumen nachweisen. Die vorteilhaften strukturellen Eigenschaften der Polymeren zeigen sich in einer hohen Quellgeschwindigkeit und einer Toluolquellung von 800 ml/100 g Polymerisat. Die Ausbeute betragt 305 g Harz.

2« Chlormethylierung des polymeren Grundgerüstes

a) In einem beheizbaren Rührgefäß mit Rückflußkühler werden 100 g Polymerisat in 900 ml Dichlormethan zwei Stunden lang gequollen. Dieser Mischung werden 35 g Monochlordimethyläther und 5 g Zinn-lV-chlorid zugesetzt und unter Rühren auf 40 C erwärmt. Bei dieser Temperatur wird 3 Stunden chlormethyliert. Das Harz wird anschließend von der flüssigen Phase abfiltriert und auf dem Filter zunächst zweimal

rait 200 ml Dioxan und anschließend dreimal mit 250 ml Methanol gewaschen. Das zuletzt ablaufende !!ethanol ist chloridfrei· Danach wird vom anhaftende!Methanol abgesaugt und an der Luft 25 Stunden lang getrocknet. Auf diese V/eise erhält man 110 g eines chlormethylierten Styrol-Divinylbenzol-Copolymeren, das einen Chlorvvert von 5,5 % Chlor hat.

Der Chlormethylierungsgrad kann bei Bedarf durch Variation der Chloräthermenge, Reaktionstemperatur, Reaktionszeit und Katalysatormenge in den Grenzen von 1 % bis 23 % Chlor gesteuert werden.

Ъ) 100 g Polymerisat v/erden bei Raumtemperatur in 4-00 ml ?;asserfreiem Dichlormethan eine Stunde lang unter Rühren gequollen, dann gibt man bei 18 C (Innentemperatur) innerhalb von 12 Minuten eine Llischung von 9,0 ml Zinn-IV-chlorid, 40 ml Chlormethylmethyläther und 200 ml wasserfreiem Dichlormethan zu und rührt das Gemisch bei 18 C (Innentemperatur) eine Stunde lang. /Inschließend wird schnell abgesaugt und mit jeweils kleinen Portionen gewaschen:

600	ml	Dioxan - Wasser	3:1
600	ml	Dioxan - 3 N HCl	3:1
360	ml	Dioxan - Wasser	1:1
360	ml	Dioxan - 7/asser	1:3
600	ml	Wasser
360	ml	Dioxan - Wasser	1:3
360	ml	Dioxan - Wasser	•1:1
360	ml	Dioxan - Wasser	3:1
600	ml	Dioxan
360	ml	Dioxan - Methanol	3:1
360	ml	Dioxan - Methanol	1:1
360	ml	Dioxan - !!ethanol	1:3
$00	ml	Methanol

Anstelle von Dioxan kann auch Aceton Verwendung finden. Die weitere Aufarbeitung erfolgt v/ie unter a) beschrieben.

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3. Bindung der C-terninalen Aminosäure oder des entsprechenden Di- oder Tripeptides an die reaktiven Zentren des Harzes

a) 5 Gramm Chlorate thylat, hergestellt wie im Beispiel 2 beschrieben, mit einem Chlorgehalt von 1,5 Milliäquivalent pro Gramm werden zu einer lösung von 7»5 Milliäquivalent Boc~Alanin (oder eine andere H ' -geschützte Aminosäure bzw, II '-geschütztem Di- oder Tripeptid) und 7,0 Milliäquiv alent Triethylamin (oder: Diisopropylamin, Diisopropyläthylamin, Cäsiumcarbonat usw.) in 20 ml absolutem Äthanol nach einer zehnminütigen Einwirkungszeit gegeben. Nun erhitzt man das Gemisch unter Rückfluß und Schütteln bzw. Vibrieren mit einem Vibromischer auf 75 ⁰C für 24 Stunden. Nach dem Abkühlen ist über eine G3-Glasfilterfritte abzusaugen und das Harz bis zur Chlorid-Freiheit des Filtrates mit Anteilen von je 15 ml folgender Lösungsmittel zu waschen:

dreimal Methanol, zweimal Wasser, zweimal Methanol, dreimal Wasser, einmal Methanol, zweimal V/asser, zweimal Methanol, zweimal Wasser, fünfmal Methanol.

Das so erhaltene Produkt wird zunächst an der Luft, dann über Phosphorpentoxid getrocknet. Die Bestimmung des Restchlorgehaltes des Polymerisates läßt auf einen Boc-Alanin-Gehalt von etwa 0,7 Milliäquivalent pro Gramm Harz schließen, !lach Abspaltung der Boc-Gruppe mittels Trifluoressigsäure/Dichlormethan (1:1), wie unter Beispiel 4 beschrieben, wird nach Umsetzung mit Pyridin-hydrochlorid der Gehalt an freier Aminogruppe nach DORIiAH (L.C. DORMAH: Tetrahedron Letters, 1,969, 2319) titriert. Hiernach wurden 0,57 Milliäquivalent Boc-Alanin pro Gramm Harz angeestert.

b) б Gramm Benzhydrylamin-Polymerisat, hergestellt wie in (P. RIVAILLE et al.: HeIv. Chim. Acta 54, 296 (1971); P. PIETTA et al.: Gazz. Chim. Italians 103, 483 (1973);

P. PIETTA et al.: J. Org. Chem. 39, 44 (1974); V. HRUBT et al.: J. Med. Chem. 16, 624 (1973)) beschrieben, mit einem

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Gehalt an reaktionsfähiger Aminogruppe von 1 Milliäquivalent pro Gramm werden in ein für die Peptidsynthese geeignetes Reaktionsgefäß (vgl. z.B. J.M. STEWART u. J.D. YOUNG: Solid Phase Peptide Synthesis Freeman, San Francisco (1969); E, SCHRÖDER u. K. LÜBKE: The peptides I, Academic Press, 1965) überführt. Die mechanische Durchmischung der Reaktanten wird mittels eines Vibromischers durchgeführt. Die Menge an Lösungs- und Reaktionsmittel beträgt 60 Milliliter.

Nach einer dreimaligen Vorwaschung mit Dichlormethan gibt man eine Lösung von 30 mmol Boc-Glycin in Dichlormethan hinzu, das mit 15 mmol Dicyclohexylcarbodiimid für eine Stunde zur Reaktion gebracht und vom ausgeschiedenen Dicyclohesylharnstoff befreit wurde und läßt die so voraktivierte Aminosäure 60 Minuten lang einwirken. Nach Filtration wird das Harz gewaschen; dreimal je 3 Minuten mit: Dichlormethan

Chloroform-Methanol (2:1)

Dichlormethan,

Einwirkung einer mit 7»5 mmol Dicyclohexylcarbodiimid voraktivierten Lösung von 15 mmol Boc-Glycin in Dichlormethan (s.o.), Wiederholung des vorgenannten Y/aschvorganges und eine dritte Umsetzung mit einer voraktivierten Lösung von 7,0 mmol Boc-Glycin und 3,5 mmol Dicyclohexylcarbodiimid. Nach Durchführung des oben genannten '.Yaschvorganges erfolgt eine Umsetzung mit einem Gemisch aus 6 ml Sssigsäureanhydrid, 3 ml Pyridin und 31 ml Dichlormethan für 30 Minuten, um eventuell noch vorhandene reaktionsfähige Aminogruppen des Trägers zu acetylieren und damit für nachfolgende unerwünschte Reaktionen zu blockieren. Nach einer sechsmaligen Waschung mit Dichlormethan wird zur Bestimmung noch vorhandener basischer Gruppen eine Umsetzung nach DORI-IAl·! mit Pyridin-hydrochlorid mit nachfolgender titrimetrischer Bestimmung des Chloridgehaltes als Triäthylammoniumchlorid durchgeführt. Dieser Vorgang, die nachfolgende Boc-Schutzgruppenabspaltung mit Bestimmung der am Träger gebundenen Boc-Glycin-Menge ist dem S_chema in Beispiel 4 zu entnehmen.

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- H

4. Schema des Peptidaufbaus

Nr. Lösungsmittel bzw. Reaktionsmittel

Einwir- Anzahl kungszeit der Be-(Min.) handlungen

60	1
3	3
3	3
3	3

1 Dichlormethan

2 Umsatz mit voraktivierter Boc-Aminosäure in Dichlormethan-Dimethylformamid

3 Dichlorme than/Dime thy !formamid

4 ChloroformAlethanol (2:1)

5 Dichlormethan

6 Trifluoressigsäure-Dichlormethan

(1:1,2)

7 Trifluoressigsäure-Dichlormethan

(1:1,2)

8 Trifluoressigsäure-Dichlormethan

(1:1,2)

9 Dichlormethan

10 Chloroform

11 Triäthylamin-Chloroform (1:9)

12 Chloroform

13 Dichlormethan

14 0,3M-Pyridin·HCl in Dichlormethan

15 Dichlormethan

16 Chloroform-Methanol (2:1)

17 Chloroform

18 Prüfung auf Chlorid-Freiheit

19 Triäthylamin-Chloroform (1:9)

20 Chloroform

21 Dichlormethan

20

20 3 3 5 3 3 5 3 3 3

5 3 3

Erläuterungen zum Peptidaufbau

Die mechanische Durchmischung der Reaktanten erfolgt im allgemeinen durch Drehung des Reaktionsgefäßes um seine waagerechte Achse. Es wurde nun gefunden, daß es wesentlich günstiger ist, die Durchmischung mittels Vibromischung durchzuführen, da hiermit der Aufbau des Reaktionsgefäßes mit seinen Zu- und Ableitungen stationär durchgeführt werden kann. Weiterhin erweist es sich als besonders vorteilhaft, wenn anstelle der sonst üblichen abwechselnden Anwendung von quellenden und nichtquellenden Lösungsmitteln bei Verwendung dec neuen Trägermaterials beim Peptidaufbau vorwiegend nur quellend v/irkende Lösungsmittel (vorzugsweise: Dichlormethan, Dimethylformamid, Chloroform) unf für Zwischenwaschungen ein Chloroform-Methanol-Gemisch angewandt werden» Es gelangen pro Milliäquivalent reaktionsfähiger Aminogruppen etwa 20 Milliliter Lösungs- bzw. Reaktionsmittel zum Einsatz» Dicyclohexylcarbodiimid wird als 1-molare Lösung in Dichlormethan verwendet.

Beim direkten Einsatz von Dicyclohexylcarbodiimid als Aktivierungskomponente ist bei Ur. 2 des Schemas anstelle "voraktivierter Вос-Aminosäure" die Lösung von 3 Milliäquivalenten Boc-Aminosäure zuzugeben, die 3 Minuten lang auf den Träger einwirkt, bevor man die Lösung von 3 Milliäquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid zufügt. Die Reaktionszeit beträgt 60 bis 180 Minuten.

Die "Voraktivierung" selbst erfordert die getrennt durchzuführende einstündige Reaktion von б Milliäquivalenten geschützter Aminosäure mit 3 Llilliäquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid und Abtrennung des gebildeten Harnstoffs. Bei Anwendung aktivierter Ester sind diese bei Hr. 2 in gleicher Weise wie die "voraktivierte- Aminosäure" einzusetzen, bei Reaktionszeiten von 180 bis 300 Minuten. Alle Umsetzungen können gegebenenfalls unter Zusatz von weiter aktivierenden Stoffen durchgeführt werden. Der Verlauf der Kupplung der Aminosäure und/oder Peptidfragmente wird durch Bestimmung der noch nicht umgesetzten freien

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Aminogruppen verfolgt, wobei vorzugsweise die Bestimmungsmethode nach DORIiM (L.C. DORLIAN: Tetrahedron Letters, 2969, 2319) mittels Pyridin-hydrochlorid Anwendung findet. Hierzu werden die Schritte Nr. 6 Ьіз Nr. 13 ausgelassen und zur Titration gelangen die Schritte Nr. 19 bis Nr. 21. Bei unvollständiger Umsetzung wird der Kupplungsvorgang so oft wiederholt, bis die Bestimmung der freien Aminogruppen einen konstanten Wert ergibt. Erst dann erfolgt Abspaltung der H^-Schutzgruppe, Bestimmung des Gesamtgehaltes an freien Aminogruppen und Ankupplung der nächsten Aminosäure bzw. Peptidfragmentes, wobei die im Schema aufgeführten Schritte zur Anwendung gelangen.

Beispielsweise werden zur Herstellung des Luteinisierungshormon-Releasingfaktors (LH-RH) tert.-Boc-Aminosäurederivate für die peptidbildende Reaktion in der folgenden Reihenfolge verwendet, wobei auch entsprechend hergestellte Peptidfragmente eingesetzt werden können:

N^-Boc-Glycin, N^-Boc-L-Prolin, N^-Boc-N^^nitro -tosyl)-L-Arginin, N^-Boc-L-Leucin, N⁰^-BoC-GIyсin, N^-Boc-O-BenzyKoder O-Dichlorbenzyl )~L-Tyrosin, N ⁰^- 0-Benzyl(oder O-tert. Butyl)-L-Serin, N^-Boc-L-Tryptophan, N*-Boc-N^Im-tosyl(oder dinitrophenyl )-L-Histidin, N⁶^-Z-L-Pyroglutaminsäure(oder freie Pyroglutaminsäure). In gleicher 'Veise wie der Peptidaufbau an einem Benzhydrylamin-Harz durchgeführt wird, kann dieser auch an einem chlormethylierten Träger erfolgen, wobei z. B. beim LH-RH Boc-Glycin nach Beispiel 3a an den Träger gebunden wird. Das nach Beispiel 3a an den Träger gebundene Boc-Alanin dient beispielsweise zum Aufbau der Insulin-B-Ketten-Sequenz B 24 B 30, wozu tert.-Boc-Aminosäurederivate oder entsprechende Peptidfragmente für die peptidbildende Reaktion in der folgenden Reihenfolge zum Einsatz gelangen: N*-Boc-L-Alanin, K* -Boc-N^ -Z-(oder -Cyclohexyloxycarbonylo.ä.)-L-Lysin, N* -Boc-L-Prolin, N* -Boc-O-Benzyl-L-Threonin, N**· -Boc-O-BenzyKoder O-Dichlorbenzyl )-L-Tyrosin, N⁰⁶ -Boc-L-Phenyl alanin, N **" -Boc-L- Phenyl alanin.

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Dieser Peptidaufbau kann gegebenenfalls mit den entsprechenden Aminosäuren oder Peptidfragmenten weitergeführt werden, bis die Insulin-B-Kette gebildet worden ist. In gleicher Weise synthetisiert man die Insulin-A-Kette bzw· Fragmente der Kette, oder biologisch aktive Peptide, wie beispielsweise Thyreotropes-Releasing-Hormon (TRH), Somatostatin, Enkephaline

5. Peptidabspaltung vom polymeren Träger

a) mittels Fluorwasserstoff

Das nach dem Schema aufgebaute Peptid-Harz ist gründlich zu waschen und zu trocknen. Ca. 2 Gramm Peptid-Polymer werden mit etwa 10 Milliliter redestilliertem, wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von redestilliertem Anisol (ca. 0,3 bis 1,5 Milliliter) bzw. Mercaptoäthanol für die Dauer von 30 bis 60 Minuten bei 0 ⁰C behandelt, wobei das Peptid von den restlichen Schutzgruppen und vom Harz befreit wird.

Fluorwasserstoff und flüchtige Substanzen entfernt man durch imlegen von Hochvakuum, behandelt den Rückstand mit Äther (zur Entfernung von Anisol u.a.), löst das Peptid in 2-proz. Essigsäure und filtriert vom Restpolymer. Die vereinigten essigsauren Lösungen ergeben nach Lyophilisation ein festes Produkt, das aus dem gebildeten Peptid besteht. Gegebenenfalls ist das so erhaltene Peptid durch Anwendung geeigneter Verfahren noch aufz-ureinigen.

b) mittels Ammonolyse

Erfolgt der Aufbau eines Peptides, das eine C-terminale Säureamid-Gruppe enthält (z.B. LH-RH), an einem chlormethylierten Polymerisat, ist die Peptidablösung vom Träger mittels Ammonolyse durchzuführen.

Hierzu gibt man das Peptid-Polymer, z. B. 6 Gramm, in eine Druckflasche, fügt 5 bis 10 Milliliter Dichloride than und gegebenenfalls katalytische Mengen eines Reaktionsbeschleunigers, beispielsweise Diäthylenglykol, hinzu, dann 500 Milliliter bei -3 ⁰C mit Ammoniak gesättigtem Methanol.

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Nachdem das Gemisch etwa 24 bis 72 Stunden bei Raumtemperatur stand, entfernt man das überschüssige Ammoniak durch Anlegen eines Vakuums, saugt über eine Glasfilterfritte ab, wäscht das zurückbleibende Harz gründlich mit Methanol und engt die vereinigten Filtrate i.V. bei 35 ⁰C ein. Zur Entfernung der Schutsgruppen v/ird der über P.0-_o getrocknete feste Rückstand mit flüssigem Fluorwasserstoff (ca. 15 bis 20 Milliliter, Zusatz von 0,3 Milliliter Anisol) 60 Minuten lang bei 0 ⁰C behandelt. Man entfernt Fluorwasserstoff durch Anlegen eines Pumpenvakuums, extrahiert den Rückstand mit Äther, um Anisol u. ä. zu entfernen, löst das Peptid in 2-proz. Essigsäure, filtriert vom Rest-Polymer und lyophilisiert die vereinigten Filtrate. D_as so erhaltene, von allen Schutzgruppen befreite Peptid ist gegebenenfalls noch aufzureinigen.

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Claims (7)

Erfindungs '-

1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, Proteinen, Proteinsequenzen mit hoher Reinheit und Ausbeute aus den entsprechenden Aminosäure- oder Peptidfragmentderivaten durch schrittweisen Peptidaufbau an einem polymeren Träger, gekennzeichnet dadurch, daß als fester Träger aktive Gruppen enthaltene, heterogen aufgeweitete Copolymere mit latenter Porosität auf der Basis von Mono- und Polyviny!verbindungen verwendet werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die heterogen aufgeweitete Gelstruktur mit latenter Porosität des polymeren Trägers durch Polymerisation der Monomeren in Gegenwart von Inertmitteln erreicht wird.

3« Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß als MonovinyIverbindungen Styrol- bzw. Acry!säurederivate verwendet werden.

4* Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß 0,1 bis 3 Gewichtsprozent, vorzugsweise 0,5 bis 2 Gewichtsprozent PolyvinyIverbindungen, wie Divinylbenzol, Trivinylbenzol oder Glykoldiacrylate verwendet v/erden.

5. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß als Inertmittel vorzugsweise 20 bis 50 Gewichtsprozent aliphatische Kohlenwasserstoffe der Fraktionen Cg bio Cj. bei Styrolpolymeren, bzw. niedermolekulare Kohlenwasserstoffe bei Acrylsäurederivat-Copolymeren verwendet werden.

6. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, da3 als aktive Gruppen vorzugsweise Chlormethyl- bzw. Benzhydrylaniin-Gruppen verwendet werden.

7. Verfahren nach Punkt 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß beim Peptidaufbau vorzugsweise nur quellend wirkende Lösungsmittel bzw. ein Chloroform-I/iethanol-GemiGch verwendet v/erden.