DE1950969C3 - Verfahren zur Herstellung fester Aminosäure-Produkte - Google Patents

Description

Polypeptide, die aus einer Aminosäurekette bestehen, stellen die am häufigsten vorkommenden und wichtigsten chemischen Verbindungen dar. Der Erforschung der Polypeptide wurde bisher sehr viel Aufmerksamkeit geschenkt, da Polypepiide in immer größerer Anzahl, wie man gefunden hat, hormonale Funktionen, wie im Falle des Insulins, ausüben. Sie stellen die Hauptbestandteile von Enzymen, Blutproteinen sowie vielen anderen Substanzen, die für den lebenden Organismus von Wichtigkeit sind, dar. Trotz der Leichtigkeit, mit welcher die lebende Zelle spezifische Polypeptide synthetisiert, steht der Chemiker bei der Durchführung

ίο eines solchen Verfahrens erheblichen Schwierigkeiten gegenüber. Von diesen Schwierigkeiten besteht die schwerwiegendste darin, komplizierte Reinigungsmaßnahmen in jeder Stufe der stufenweise erfolgenden Kombination von Aminosäuren, welche die Synthese darstellt, durchführen zu müssen, da das Vorliegen von Bruchstücken infolge einer unvollständigen Reaktion, von anderen Reagentien, die zur Synthese verwendet worden sind, sowie von Nebenprodukten zu einer immer stärker werdenden Verfälschung führt Da diese Reaktionen in flüssiger Phase durchgeführt werden, werden die Abtrennungsschwierigkeiten infolge der Tatsache merklich vergrößert, daß die Eigenschaften der Nebenprodukte denen des gewünschten Peptids ähnlich sind, so daß sich übliche Abtrennungsmethoden,

wie beispielsweise eine Auskristallisation, extrem schwierig gestalten.

Im Jahre 1963 wurde ein erheblicher Fortschritt bei der Polypeptid-Erzeugung erzielt (vergleiche Dr. R. B. M e r r i f i e 1 d in »J. Am. Chem. Soc.«, 85, 2145 [1963])

sowie »Biochemistry«, 3, 1385 [1963]). Diese Methode von M e r r i f i e 1 d hat eine solche Bedeutung erlangt, daß sie seither als »Merrifield-Synthese« bezeichnet wird. M e r r i f i e 1 d entwickelte eine Fest phasen-PoIypeptid-Synthese, bei deren Durchführung eine geschütz- te Aminosäure in Gegenwart von Triäthylamin mit entweder einem nitrochlormethyiierten oder chlormethylierten Gelcopolymeren aus Styrol, vernetzt mit 2% Divinylbenzol, zur Umsetzung gebracht wird. Die Aminosäure wird durch eine N-Carbobenzoxy- oder tert-Butoxycarbonylgruppe geschützt Diese Gruppe gewährleistet eine Verknüpfung der Aminosäure mit dem Copolymeren über die Carboxylfunktion, wobei letztere mit dem endständigen Chlor reagiert Das Triäthylamin absorbiert dabei den HCI:

Res—CH,CI + ZNHCHCOOH

• ReS-CH₂OCOCHNHZ

Res bedeutet die Harzbase, während Z die Schutzgruppe an der Aminosäure wiedergibt und Rt den Rest des ersten Aminosäuremoleküls darstellt. Nach der Reaktion wird die schützende Gruppe »Z« entfernt, worauf die nächste Einheit nach bekannten, hohe Ausbeute liefernden Methoden angekuppelt wird:

R₁ R₂ R₁ R₂

Res—CH₂OCOCHNH₂+ ZNHCHCOOH _Res—CH₂OCOCHNHCOC—HNHZ

In dieser Gleichung bedeutet R2 den Rest des zweiten Aminosäuremoleküls. Wiederum wird »Z« entfernt und eine dritte, »Z«-blockierte Aminosäure nach der gleichen Methode angeknüpft S

Dieses Verfahren wird so lange wiederholt, bis die gewünschte Polypeptid-Struktur erreicht worden ist Zu diesem Zeitpunkt wird das ganze Polypeptid von dem

Harz nach einer Estcrhydrolysc-Mcthodc abgespalten. Diese Methode beeinflußt nicht die Peptidbindungen.

Die bevorzugte Schutzgruppe Z besteht aus tert-Butyloxycarbonyl (t-Boc). Enthält eine Aminosäure sowohl eine «-Aminogruppe als auch eine ε· Aminognippe, so wie dies bei Lysin der Fall ist, dann wird t-Boc als Schutzgruppe für die tx-Aminogruppe und Benzyl für die ε-Aminogruppe verwendet. Bei den sich anschließenden Veresterungsreaktionen wird Dicyclohexylcarbodiimid

zur Aktivierung der Aminogruppe verwendet, wobei Methylenchlorid als Reaktionsmedium eingesetzt wird, und zwar wegen seiner das vernetzte Harz aufquellenden Wirkung. Die Schutzgruppe Z kann durch HBr in Essigsäure oder HCl in Dioxan entfernt werden, wobei der Halogenwasserstoff durch Triäthylamin neutralisiert wird.

Vorausgesetzt, daB die Reaktion eine sehr hohe Ausbeute ergeben hat, kann das Polypeptid in einfacher Weise gereinigt werden. Dies erfolgt durch Verwendung eines Oberschusses an Reaktanten, deren Entfernung in dem üblicherweise homogenen Medium Probleme aufwerfen würde, wobei jedoch diese Entfernung aus diesem System einfach verläuft, da sich das Waschen infolge der Tatsache einfach gestaltet, daß sich das Polypeptid auf den festen Harzteilchen befindet

Die gtnze Merrifieki-Synthese wurde kürzlich von Dr. Merrifield in »Scientific American«, Seite 56—75(1968) beschriebea In diesem Artikel wird ferner eine Vorrichtung geschildert, die zur Automatisierung der Synthese verwendet wird, um die mechanischen Probleme zu vereinfachen, die bei der Erzeugung relativ langkettiger Polypeptide, wie beispielsweise Insulin, auftreten.

Es gibt eine Vielzahl von Peptiden, die von Bedeutung sind. Diese Peptide enthalten 3 bis ungefähr 20 Aminosäure-Einheiten. Die Synthese dieser Peptide läßt sich nach der Merrifield-Methode durchführen. Viele dieser Peptide besitzen antibiotische oder hormonale Eigenschaften, wie aus einem Abschnitt des H. D. Law-Testes »Progress in Medicinal Chemistry«, Band 4, Seite 86—170 (Ellis and West, Editors) sowie aus einem Artikel von S. Whaley in »Advances in Protein Chemistry«, 21, Seite 1—112 (1966) hervorgeht Neben diesen fundierten Strukturen kann die Merrifield-Methode auch zur Herstellung analoger Strukturen verwendet werden, in welchen die Aminosäuren verändert werden. Ferner ist eine Anwendung auf alle Permutationstypen möglich, wobei die Aktivität des erhaltenen Peptids merklich modifiziert wird.

Das zur Durchführung der Merrifield-Synthese verwendete Harz wird aus einem locker vernetzten Polystyrol/Divinylbenzol-Polymerisat(2% DVB) hergestellt Dieses Polymere besitzt eine kleine Teilchengröße (Teilchen, die durch Siebe mit lichten Maschenweiten von 0,035—0,070 mm hindurchgehen), wodurch eine maximale Oberfläche (in der Größenordnung von 1/10 m²/g) und eine minimale Geldicke garantiert werden. Das Polypeptid bildet sich sowohl innerhalb des Gels als auch auf der Oberfläche. Um zu gewährleisten, daß ein vollständiger Polypeptid-Wuchs an beiden Flächen erfolgt, kann das Polymere nur leicht chlormethyliert werden. Wird das Polymere stärker chlormethyliert, um ihm ein größeres Konbinationsvermögen mit dem Substrat zu verleihen, dann ist das Gel infolge seiner niedrigen Porosität nicht dazu in der Lage, die größeren Mengen an Fremdsubstanz auszugleichen, so daß die Reaktionsgeschwindigkeit abnimmt und das Polymerteilchen sogar zerbrechen kann. Es wurde deshalb die Teilchengröße verkleinert, um eine größere äußere Oberfläche für den Polypeptid-Wuchs zu schaffen. Jedoch hat es sich herausgestellt, daß die Teilchen, die durch Siebe mit lichten Maschenweiten von 0,035—0,070 mm hindurchgehen (die Teilchen werden von Merrifield verwendet), schwierig zu handhaben sind. Bei den von Merrifield eingesetzten Polymeren beträgt die maximale Chlormethylierung ungefähr 1,5 Milliäquivalente Chlor pro Gramm des Harzes, wobei die Chlormethylierung hauptsächlich in einer Größenordnung von ungefähr O₁G Milliäquivalenten pro Gramm erfolgt Auch bei diesem geringen Chlonnethylierungsgrad ist es nicht möglich, eine hohe anfängliche Veresterung zu erzielen, wenn die geschützte Aminosäure in dem Äthanollösungsmittel mit dem Polymeren zur Umsetzung gebracht wird. Ausbeuten in der Größenordnung von ungefähr 30—35% waren die

ίο höchsten erzielten Ausbeuten, so daß das Endprodukt nur ungefähr 0,3—0,5 mMol Aminosäure pro Gramm des Polymeres enthält, und zwar auch dann, wenn der höchste Chlonnethylierungsgrad eingehalten wird.

Es wurde nunmehr gefunden, daß das Lösungsmittel

eine wichtige Rolle bei dieser Veresterung spielt Äthanol, das zwar zum Tragen der Aminosäure geeignet ist, beeinflußt offensichtlich die Reaktion zwischen der Aminosäure und dem Polymeren. Dies geht aus einer Analyse des Filtrats auf Chlorid, das bei der Durchführung der Merrifiekl-Svnthese nach der anfänglichen Veresterung gebildet wird, hervor. Es wurde festgestellt, daß eine erhebliche Diskrepanz zwischen der darin enthaltenen Chlormenge und derjenigen Chlormenge besteht, die theoretisch vorlie gen sollte, und zwar bezogen auf die Menge der Aminosäure auf dem Polymeren,

Daher weist die Merrifield-Methode trotz einer Reihe von Vorteilen bestimmte Nachteile hinsichtlich der Kapazität, der Einfachheit der Handhabung und des

Ausbeutepotentials auf.

Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Durchführung der Merrifield-Synthese, wobei es dieses Verfahren gleichzeitig erlaubt, eine große Teilchengröße aufrechtzuerhalten, ohne daß dabei die Oberfläche verkleinert und die Porosität vermindert wird. Dies ermöglicht eine entsprechend vereinfachte Handhabung. Es soll nun ein Verfahren zur Herstellung fester Aminosäureprodukte, bei dem als Ausgangspolymerisat bekannte kugelförmige vernetzte Polymerisate eingesetzt werden, die mindestens 50 Gew.-% alkenylaromatischer Monomereneinheiten, gegebenenfalls zusammen mit Einheiten modifizierender Monomerer enthalten, in die durch Chlormethylierung 1 bis 6 mÄq Cl/g Polymerisat eingeführt worden sind, und diese vernetzten Polymerisate mit Aminosäuren, deren Aminogruppe geschützt ist, in Gegenwart von polaren Lösungsmitteln verestert werden, gefunden, bei dem dann wenistens ungefähr 1 mMol an gebundener Aminosäure pro Gramm des Polymeren gewährleistet ist und der Ester in einer Ausbeute von 50% oder darüber gewonnen wird, wenn das eingesetzte vernetzte Ausgangspolymerisat eine Oberfläche von mehr als 5 m²/g, einen durchschnittlichen Porendurchmesser von wenigstens 30 A und eine Teilchengröße, die durch ein Sieb von 0,15 bis 1 mm lichte Maschenweite hindurchgeht, besitzt und daß die Veresterung in einem polaren inerten Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstanten von wenigstens 35 bei 20° C durchgeführt wird. Die als Ausgangspolymerisate eingesetzten vernetz ten Kügelchen werden in der gleichen Weise hergesteilt wie die regelmäßigen suspensionspolymerisierten gelartigen Kügelchen der bisher bekannten Art, mit der Ausnahme, daß die Polymerisation in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels durchgeführt wird. Das

<>5 Verfahren zur Herstellung der vernetzten Polymerisatkügelchen wird einschließlich der verwendeten Lösungsmittel, Monomeren und Verfahrensbedingungen beispielsweise in den US-PS 33 22 695, 31 47 214 und

33 26 875 sowie in den GB-PS 9 32 125 und 9 32 126 beschrieben. Geeignete Lösungsmittel für das Monomere, die in bezug auf das Polymere quellend oder nichtquellend wirken können, sind beispielsweise aliphatische Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Ketone, aromatische Kohlenwasserstoffe sowie Halogen- oder Ätherderivate dieser Substanzen. Häufig wird eine Mischung aus zwei oder mehreren Lösungsmitteln eingesetzt

Die Monomeren müssen derartig ausgewählt worden ι ο sein, daß die· erforderlichen Stellen für die Chlormethylierung geschaffen werden und auch das angestrebte Ausmaß an Vernetzung erzielt wird. Es kann sich bei den Monomeren daher um eines oder mehrere der alkenylaromatischen Monomeren plus einem geeigneten Vernetzungsmittel sowie um kleinere Mengen eines oder mehrerer Modifizieningsmonomerer handeln. Infolge ihrer leichten Verfügbarkeit sind die bevorzugten alkenylaromatischen Monomeren Styrol, Äthylstyrol und VinyltoluoL Ist das Vernetzungsmittel selbst ein alkenylaromatisches Monomeres, wie beispielsweise Divinylbenzol (DVB), dann brauchen keine Comonomeren verwendet zu werden. Andere Vernetzungsmittel, die in Mischung mit einem oder mehreren alkenylaromatischen Monomeren verwendet werden können, sind Trivinylbenzol, Glykoldimethacrylat, Trimethylolpropantrimethacrylat, Divinyloxyäthan. Bevorzugte Modifizierungsmonomere sind Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Acrylnitril und Methylmethacrylat Die minimale Menge des einzusetzenden Vernetzungsmittels hängt von den Comonomeren, dem Lösungsmittel sowie iten gewünschten Eigenschaften des Produktes ab. Die maximale Menge richtet sich nach wirtschaftlichen Faktoren (das Vernetzungsmittel ist gewöhnlich das teuerste Monomere in dem Copolymeren) sowie nach der Notwendigkeit, in ausreichendem Maße aromatische Ringe für die Chlormethylierung zur Verfügung zu haben (ein Faktor, der nicht auf Divinylbenzol zutrifft). Im allgemeinen können ungefähr 8—35%, bezogen auf das Gewicht der Monomerenmischung, verwendet worden sein, wobei jedoch die Menge in geeigneten Fällen bis auf 2% abfallen oder bis zu 50% bei Verwendung der meisten Vernetzungsmittel ansteigen kann, während die Menge bis zu 100% im Falle von Divinylbenzol betragen kann (wobei shh alle Prozentangaben auf das Gewicht beziehen).

Die organischen Reaktanten (d.h. die Monomeren, das Lösungsmittel und der Katalysator) werden in bekannter Weise in einem Wassersystem unter Bildung einer Dispersion mit der gewünschten Teilchengröße verrührt, wobei Wärme zur Förderung der Polymerisation einwirken gelassen wird. Die erhaltenen Kügelchen sind durchsichtig bis undurchsichtig und zeichnen sich durch das Vorliegen von Poren sowie einer meßbaren Oberfläche aus, die 2000 m² pro Gramm des Harzes betragen kann. Im Gegensatz zu den üblichen Polystyrol-Gelkügelchen, wie beispielsweise den Kügelchen, die von Merrifield vorgeschlagen werden, können die erfindungsgemäß eingesetzten Kügelchen mit sehr hohen DVB-Anteilen, und zwar bis zu 95 oder sogar 100%, hergestellt worden sein. Ein sehr geeigneter Bereich zur Herstellung der Ausgangspolymerisate mit guten physikalischen Eigenschaften und einer ausreichenden Oberfläche liegt zwischen 3 und 50% DVB, wobei 20—80% des Lösungsmittelverstrekkers, berechnet auf die gesamte organische Phase, hinzukommen. Diese Mengen richten sich teilweise nach der Natur des Verstreckungsmittels. Da im Handel erhältliches DVB 40-50% m- und p-Äthylstyrol enthält ist das Polymere gewöhnlich ein Terpolymeres aus Styrol, Äthylstyrol und DVB. Die Äthylstyrol-Komponente kann weitgehend durch Verwendung von 96% DVB vermieden werden, sie ist jedoch gewöhnlich als Bestandteil des Polymeren akzeptierbar. Im Handel erhältliches DVB kann zusammen mit einem DVB-Äthylstyrol-Copolymeren, das 60% DVB-Vernetzungsmittel enthält verwendet worden sein. Kleine Mengen an anderen Monomeren, wie beispielsweise Acrylnitril oder Methylmethacrylat können gegebenenfalls zugesetzt worden sein. Die Herstellung dieser »makro-vernetzten« Polymeren ist bekannt und ist kein Teil der Erfindung. Beispielsweise wird in der US-Patentschrift 32 26 695 die Herstellung dieser vernetzbaren Polymeren i>us Styrol besclirieben.

Die Untersuchung des Querschnittes eines typischen erfindungsgemäß eingesetzten »makro-vernetzten« Polymerisat-Kügelchens mittels des Elektronenmikroskops zeigt daß es aus einem flexiblen Gelkontinuum mit zahlreichen relativ großen Löchern, in denen kleine Kugeln in der Größenordnung von 1 μ oder weniger im Durchmesser eingebettet sind, besteht Diese Struktur ergibt die sehr große Oberfläche und die sehr hohe Porosität, so daß unter Aufquellen große Mengen an Fremdsubstanzen aufgenommen werden können. Die Kügelchen schwanken in ihrem Durchmesser innerhalb eines breiten Bereiches. Sie werden nach üblichen Siebmethoden aufgetrennt Für das Verfahren der Erfindung hat es sich am vorteilhaftesten erwiesen, Teilchen zu verwenden, die in ihrer Größe zwischen 1,00 mm und 0,15 mm, vorzugsweise einer lichten Maschenweite zwischen 1,00 mm und 0,25 mm liegen. Dieser zuletzt gemmnte Teilchengrößenbereich kann in der Weise maximiert werden, daß die Rührgeschwindigkeit während der Polymerisation gesteuert wird. Derartige Größen eignen sich für zahlreiche mechanische Manipulationen bei der Polypeptid-Herstellung und -Reinigung. Die Oberfläche der erfindungsgemäß eingesetzten Kügelchen beträgt wenigstens 5 m²/g und vorzugsweise wenigstens 50m²/g. Die Porosität (% Volumen der Poren in dem Polymerisatkörper) der Kügelchen beträgt wenigstens 10% und schwankt vorzugsweise zwischen 30 und 75 Voiumen-%, wobei die Hauptmenge der Poren einen Durchmesser von mehr als 30 A aufweist

Diese Kügelchen können nach den gleichen Methoden chlormethyliert werden, wie sie zur Chlormethylierung der Merrifield-Gelharze angewendet werden, beispielsweise durch Umsetzung mit Chlormethylmethyläther in Gegenwart von Katalysatoren, wie beispielsweise Zinndichlorid, Aluminiumchlorid oder Zinkchlorid. Andere Methoden, wie sie beispielsweise in den US-Patentschriften 3297 648 und 3311602 beschrieben werden, können ebenfalls angewendet werden.

Nachfolgend wird ein spezifisches Beispiel für die Herstellung und Chlormethylierung eines erfindungsgemäß eingesetzten vernetzten Polymeren angegeben:

Herstellung des Polymerisats A

Eine Mischung aus 96 g Styrol, 64 g eines technischen Divinylbenzols, das 50% eines aktiven Bestandteils enthalt (50% Divinylbenzol, 50% Äthylstyrol), 87 g tert-Amylalkohol und 1 g Benzoylperoxyd wird einer Lösung von 6,5 g Natriumchlorid und 0,5 g des Ammoniumsalzes eines im Handel erhältlichen Styrol/ Maleinsäureanhydrid-Copolymeren in 174 g Wasser

zugesetzt. Die Mischung wird so lange gerührt, bis die organischen Komponenten in Form feiner Tröpfchen dispergiert sind, worauf sich ein Erhitzen auf 86—88°C während einer Zeitspanne von 6 Stunden anschließt. Die erhaltenen Polymerisatperlen werden filtriert, mit s Wasser und anschließend mit Äthanol gewaschen und schließlich von dem überschüssigen Wasser, Äthanol und tert.-Amylalkohol durch Trocknen bei 100⁰C befreit. Das Produkt fällt in Form weißer undurchsichtiger kugelförmiger oder sphäroidaler Teilchen in einer ι ο Menge von 145 g an. Die Oberfläche beträgt ungefähr 90 m²/g, während der durchschnittliche Porendurchmesser zu 200 A ermittelt wird.

Dieses Copolymere kann gegebenenfalls zur Abtrennung der Teilchen gesiebt werden, die zwischen 1 mm und 0,15 mm fallen. Diese Teilchen eignen sich besonders zur Durchführung der anschließenden Maßnahmen. Sogar die kleinsten Kügelchen besitzen eine makrovernetzte Struktur und eignen sich ebenfalls zur Durchführung der anschließenden Maßnahmen, besitzen jedoch weniger günstige Handhabungseigenschaften. Wird die Rührgeschwindigkeit entsprechend ausgewählt, dann fallen über 80% der Kügelchen in den 1- bis 0,25-mm-Größenbereich. Diese Teilchen sind besonders geeignet für mechanische Operationen bei den weiteren Stufen der Polypeptid-Herstellung.

Chlormethylierung des Polymerisats A

100 g einer 1 — 0,15-mm-Fraktion der Polymerisatkügelchen werden in 1 1 Äthylendichlorid über Nacht eingeweicht. Dieser Mischung werden 150 g Chlorme-

Tabelle 1

Chlormethylierte »makro-vernetzte« Substrate

thylmethyläther zugesetzt, worauf die gerührte Mischung auf 35°C erhitzt wird. Dann werden 8 Portionen (jeweils 2,5 ml) Zinn(II)-chlorid in 10-Minuten-Intervallen unter Rühren zugesetzt. Dabei wird die Temperatur auf 40°C gehalten. Die Mischung wird anschließend erhitzt und bei dieser Temperatur 5 Stunden lang gerührt. Das Harz wird von der flüssigen Phase abfiltriert und auf dem Filter mit einigen 200-ml-Portionen Dioxan, dann mit 75% Dioxan in Wasser, 75% Dioxan in 2 n-Chlorwasserstoffsäure, entionisiertem Wasser, 4%igem Natriumhydroxyd und anschließend mit Wasser so lange gewaschen, bis die Waschlösung neutral ist. Schließlich wird das Polymerisat mit 1 1 Methanol gewaschen, trockengesaugt und anschließend im Vakuum bei 80° C weiter getrocknet. Auf diese Weise erhält man 120 g eines chlormethylierten Polymerisats, das, wie die Analyse ergibt, 10% Cl enthält.

Der Chlormethylierungsgrad kann durch die Reaktionstemperatur, die Menge an Chlormethylmethyläther sowie das eingesetzte Lösungsmittel gesteuert werden. Geeignete Lösungsmittel sind nichtreaktive Flüssigkeiten, wie beispielsweise chlorierte Kohlenwasserstoffe, Äther oder chlorierte Äther oder Nitroverbindungen.

Nach der vorstehend beschriebenen Methode können andere vernetzte chlormethylierte Polymerisatkügelchen hergestellt werden (vergleiche die nachfolgende Tabelle I), welche wechselnde Chlormethylierungsgrade aufweisen, und zwar bis zu 21% (6 Milliäquivalente) Chlor enthalten und Teilchengrößen zwischen 1 und 0,15 mm besitzen, wobei wenigstens 80% in den 1- bis 0,25-mm-Bereich fallen:

Polymerisat Styrol

Divinylbenzol

Äthylstyro!

Lösungsmittel i Lösungsmittel 2

Chlor

mÄq/g

A	60	20	20	tert.-Amylalkohol	35	keines
B	50	30	20	Hexan-2-o!	35	keines
C	95	3	2	4-Methylpentan-2-ol	43	keines
D	50	30	20	Kerosin	46	Toluol
E	92	5	3	Methyläthylketon	33	Toluol
F	25	45	30	Octan	33	Toluol
G	17	50	33	4-Methylpentan-2-ol	33	keines
H	50	30	20	Kerosin	37	o-Dichlorbenzol
I	50	30	20	Kerosin	37	Toluol
]	75	25	0	Äthylhexanol	24	Diäthylbenzol

24
33
33

37
37
36

10,0 2,82

8,4 2,40

19,8 5,59

4,86 1,36

21,3

6,0

8,7

9,5

19,5

12,0

5,91

1,69

2,45

2,68

5,5

3,4

^a) % der gesamten organischen Phase (Monomeres +Lösungsmittel).

Tabelle Il

Physikalische Eigenschaften »makro-vernetzter« Harze vor der Chlormethylierung

Polymerisat	Oberfläche	Porosität	Porengröße
	m2/g	Volumen-%
A	90	_	durchschnittlich 220 A
C	10	67
D	270	61	1000-10 000 A — 36%
			100—1000 A - 48%
			weniger als 100 A — 16%
G	300	47	durchschnittlich 90 A
H	200	43	1000-10 000 A — 9%
			lOO-lOOOA-79%
			weniger als 100 A — 12%

Jedes der vorstehend angegebenen Polymerisate eignet sich zur Durchführung der Merrifield-Synthese, da diese Polymeren einfach zu handhaben sind und ein erhebliches Ausmaß an potentiellen Reaktionsstellen aufweisen. In bestimmten Fällen, beispielsweise im Falle s D und G, wird nur eine leichte Chlormethylierung durchgeführt, um zu Proben zu gelangen, did direkt mit der Unterlage verglichen werden können, welche M e r r i f i e I d zur Durchführung seiner Forschungsarbeiten verwendete. Das Ausmaß der Chlormethylierung ι ο wird in der Weise variiert, daß zwischen 1 und 6 mÄq Chlor pro Gramm des Harzes zur Verfügung gestellt werden.

Wie vorstehend beschrieben, eignet sich jedes der Polymeren der Tabelle I für die Durchführung der Merrifield-Synthese, d. h., jedes Polymere ist einer Aminosäureveresterung durch das Chlorid fähig. Zur Bildung des Esters der ersten Aminosäure-Einheit ist es notwendig, zuerst die Aminofunktion der Säure zu schützen. Dies erfolgt in zweckmäßiger Weise nach bisher bekannten Methoden, von welchen die beste darin besteht, ein tert.-Butoxycarbonyl (t-Boc)-Derivat der Formel

OR is

Il I

(CH₃)₃COCNHCHCOOH

worin R für den Rest des Aminosäuremoleküls steht, zu bilden. Aus dem Polymeren, 1 Äquivalent oder mehr Triethylamin und einer Menge t-Boc-Aminosäure, welche dem Triäthylamin äquivalent ist, wird in einem geeigneten Lösungsmittel für die Reaktion eine Mischung hergestellt. Bisher wurden Äthanol oder Äthylacetat als Lösungsmittel zur Durchführung dieser Reaktion verwendet, wobei Ausbeuten an dem t-Boc-Aminoester des Harzes anfielen, die bestenfalls bei ungefähr 35% lagen.

Unter Anwendung dieser Methode mit Äthanol als Lösungsmittel wird der nachfolgend beschriebene Versuch durchgeführt um die erfindungsgemäß verwendeten chlormethylierten großen Teilchen mit der Methode von Merrifieldzu vergleichen.

Vergleichsversuch 1

Eine Mischung aus 1 g (136 mÄq) der Polymerisatkügelchen D in Tabelle 1,0,274 g (1,45 mMol) t-Boc-L-Alanin, 0,147 g Triäthylamin und 20 ml Äthanol wird 24 Stunden am Rückfluß gehalten. Die erhaltenen Kügelchen wiegen nach dem Waschen mit Äthanol und nach dem Trocknen 1,042 g. Eine Probe wird in der Weise hydrolysiert, daß sie in einer 1 :1-Mischung aus Dioxan und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure während einer Zeitspanne von 24 Stunden am Rückfluß gehalten wird. Die Analyse durch die Ninhydrin-Methode zeigt einen Gehalt von 0,43 mMol Alania Das Ausgangspolymere enthält 136 mÄq Chlor, so daß die Ausbeute 32% beträgt

Dies ist die normale Ausbeute der Merrifield-Methode unter Verwendung von Äthanol oder Äthylacetat als Lösungsmittel auch bei Einsatz eines üblichen Gelharzes.

Im Hinblick auf die gleichen relativ niedrigen Ausbeuten, die sowohl unter Verwendung der Merrifieldschen als auch der erfindungsgemäß eingesetzten Polymerisate erzielt werden, wird eine Analyse des Filtrats unternommen, wobei man feststellt daß eine erhebliche Diskrepanz hinsichtlich der Chloridmenge in

45 dem Filtrat und der Aminosäuremenge auf dem Harz besteht, obwohl die entsprechenden Mengen theoretisch in molarer Hinsicht gleich sein sollten. Zur Ermittlung der Ursache dieser Unstimmigkeit werden die Polymerisate C und D unter anderem während längerer Zeitspannen am Rückfluß gekocht. Nach 24 Stunden findet man eine merkliche Chloridmenge in dem Filtrat, die bei 6stündigen Testintervallen anschließend ansteigt. Nach 38 Stunden hat das Polymere C 0,5 mMol Chlorid pro Gramm und das Polymere D 0,96 mMol Chlorid pro Gramm verloren. Daraus ist zu schließen, daß in geringem Ausmaß eine Nebenreaktion zwischen dem chlormethylierten Polymeren und dem Lösungsmittel Äthanol während der Veresterung stattfindet, wobei die Kontinuität dieser Reaktion aus der konstanten Chloridmenge hervorgeht, die beim Kochen am Rückfluß austritt. Um dieses Problem auf ein Minimum herabzusetzen und damit die Ausbeuten zu erhöhen, werden kein Äthanol und Äthylacetat mehr verwendet, sondern durch ein inertes Lösungsmittel ersetzt Es wurde gefunden, daß inerte Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstanten von mehr als 35 bei 20⁰C, beispielsweise Acetonitril, Acetamid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid oder Nitromethan, am geeignetsten sind. Von diesen Lösungsmitteln wird Acetonitril bevorzugt, da sein Siedepunkt von 82° C in dem günstigsten Bereich beim Arbeiten unter Rückfluß liegt Bei Verwendung dieses Lösungsmittels zur Rückflußbehandlung tritt ein minimaler Verlust der Chloridfunktion der chlormethylierten Harzunterlage auf, wobei die Veresterungsausbeuten wenigstens bei 50% oder darüber liegen. Diese Ausbeute kann in reproduzierbarer Weise über diese Menge hinaus gesteigert werden, wenn ungefähr 1,5 Äquivalente t-Boc-Aminossäure und Triäthylamin, bezogen auf die Chloridmenge, vorliegen. Die Art der auf die Unterlage (t-Boc-Form) zu veresternden Aminosäure beeinflußt den Reaktionsgrad nicht da Alanin, Valin und Phenylalanin jeweils die gleiche Ausbeute ergeben. Die folgenden Beispiele erläutern die Wirkungen von Acetonitril als Lösungsmittel, von überschüssigen Aminosäurereaktanten oder von einem überschüssigen chlormethylierten Harz bei der Durchführung der Veresterungsreaktion.

Beispiel 1

Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel
zur Durchführung der Veresterung

Eine Mischung aus 1 g (2,68 mÄq) der Kügelchen des Polymeren H in Tabelle I, 0,71 g (2,68 mMol) t-Boc-L-Phenylanalin, 0,27 g Triäthylamin und 20 ml Acetonitril wird während einer Zeitspanne von 24 Stunden unter Rühren am Rückfluß gehalten. Die Reaktionsmischung wird abfiltriert Die erhaltenen Kügelchen wiegen nach dem Waschen mit Äthanol 1350 g. Eine Analyse des Filtrats auf Chloridionen sowie einer Probe des Polymeren auf Phenylalanin zeigt daß das insgesamt gewonnene Produkt 1,62 mMol Phenylalanin, entsprechend einer 60°/oigen Esterausbeute, enthält Eine Untersuchung des Infrarotspektrums in Form einer KBr-Scheibe zeigt eine starke Carbonylbande bei 1730 cm-¹ entsprechend der Esterfunktion.

In ähnlicher Weise werden Ausbeuten von 60—80% erhalten, wenn eine Mischung aus den chlormethylierten Kügelchen, t-Boc-L-Phenylalanin und Triäthylamin auf Temperaturen zwischen 75 und 100° C in Dimethylformamid, Nitromethan, Dimethylacetamid bzw. Acet-

amid erhitzt wird. Diese Lösungsmittel lassen sich sehr leicht durch Waschen der Kügelchen mit Wasser oder Äthanol entfernen.

B e i s ρ i e 1 2

Kombinierte Wirkungen von Acetonitril als Lösungsmittel und überschüssiger geschützter Aminosäure

Eine Mischung aus 1 g (2,40 mÄq) der Kügelchen des Polymeren B in Tabelle 1,0,68 g (3,6 mMol) t-Boc-L-Ala- ι» nin, 0,36 g (3,6 mMol)Triäthylamin und 20 ml Acetonitril wird 24 Stunden lang unter Rühren am Rückfluß gekocht. Die Mischung wird filtriert, wobei 1,27 g an umgesetzten Polymerkügelchen erhalten werden. Die Analyse dieser Kügelchen auf Alanin zeigt eine i.s Gesamtausbeute von 1,67 mMol Alanin, das mit den Kügelchen reagiert hat. Dies entspricht einer 70%igen Ausbeute des t-Boc-L-Alaninesters.

Dieses Beispiel zeigt die leichte Verbesserung, die dann erzielt wird, wenn ein Überschuß an geschützter Aminosäure und dem tertiären Amin verwendet wird. Unter diesen Bedingungen kann die Verwendung von Äthanol oder Äthylacetat eine bis zu ungefähr 40%ige Ausbeute zur Folge haben, während die Verwendung von Nitromethan, Acetamid, Dimethylacetamid oder Dimethylformamid als Lösungsmittel bei 8O⁰C etwa dieselben Ausbeuten liefert, die bei Verwendung von Acetonitril erhalten werden, d. h. Ausbeuten von 60-70%.

1°

Vergleichsversuch 2

Wirkung eines Überschusses an chlormethyliertem
Harz zusammen mit Äthanol als Lösungsmittel

Eine Mischung aus 1 g (5,59 mÄq) der Kügelchen des Polymeren C, 0,274 g (1,45 mMol) t-Boc-L-Alanin, 0,147 g (1,45 mMol) Triäthylamin und 20 ml Äthanol wird während einer Zeitspanne von 24 Stunden unter Rohren am Rückfluß gehalten. Die in einer Menge von 1,143 g erhaltenen Kügelchen werden filtriert, getrocknet und analysiert Die Ausbeute an Alanin, und zwar 03 mMol, entspricht einer 55%igen Ausbeute, bezogen auf das Ausgangs-t-Boc-L-Alanin. Daraus geht hervor, daß die Ausbeute in Äthanol niedriger als die Ausbeute ist, die in Acetonitril erhalten wird, und zwar auch dann, wenn das chlormethylierte Harz in einem über 3fachen Überschuß gegenüber den anderen Reagentien eingesetzt wird. Die Verwendung derartig großer Überschüsse an dem chlormethylierten Harz ist unerwünscht, und zwar infolge der großen Masse sowie der damit verbundenen Kosten. Außerdem erzeugen Nebenreaktionen des überschüssigen Halogens eine unerwünschte Funktionalität

Beispiel 3

Wirkung von überschüssigem geschütztem L-Alanin
mit Acetonitril als Lösungsmittel

Eine Mischung aus 1 g (5,59 mÄq) der Kügelchen des Polymeren C, 1,36 g (7,5 mMol) t-Boc-L-Alanin, 0,76 g (7,5 mMol) Triäthylamin und 20 ml Acetonitril wird 24 Stunden lang am Rückfluß gehalten. Die Mischung wird filtriert, worauf die Kügelchen mit Äthanol gewaschen werden. Dabei erhält man 1,688 g an umgesetzten chlormethylierten Kügelchen. Eine Analyse auf L-AIanin ergibt eine Ausbeute in den Kügelchen von 4,8 mMol entsprechend einer Ausbeute von 86% an kombiniertem Alanin.

Beispiel 4

Wirkung eines Überschusses an geschütztem L-Valin
mit Acetonitril als Lösungsmittel

Eine Mischung aus 1 g (2,68 mÄq) der Kügelchen des Polymeren H, 0,78 g (3,6 mMol) t-Boc-L-Valin, 0,365 g (3,6 mMol) Triäthylamin und 20 ml Acetonitril wird 24 Stunden lang am Rückfluß gehalten, worauf die Mischung nach der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Arbeitsweise aufgearbeitet wird. Eine Analyse zeigt eine Ausbeute von 1,66 mMol (70%) an gebundenem Valin in den .1,265 g der veresterten Kügelchen. Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit den Ergebnissen, die bei der Verwendung von Alanin und Phenylalanin erzielt werden.

Aus den vorstehenden Beispielen ist zu ersehen, daß die Umwandlung der chlorjnethylierten »makro-vernetzten« Kügelchen zu veresterten Kügelchen bei Durchführung der bisher bekannten Methoden wenigstens so hoch ist wie bei Verwendung von üblichen Kügelchen, und zwar trotz des 10- bis 2Ofach größeren Durchmessers. Außerdem kann diese Umwandlung bei Einhaltung der in den Beispielen geschilderten Bedingungen mehr als verdoppelt werden. Ferner sind die Kügelchen mechanisch stabil. Sie stauben nicht und zerbrechen auch nicht während des Filtrierens, Rührens oder während anderer Maßnahmen, die zur Durchführung der Esterbildung eingehalten werden müssen.

Es ist gewöhnlich zweckmäßig, mit einer viel größeren Menge an veresterter Aminosäure pro Gramm der Polymerenkügelchen zur Durchführung der anschließenden Polypeptid-Synthese zu beginnen, und zwar mit einer größeren Menge im Vergleich zu den bisher eingesetzten Mengen. Bei Verwendung des 2% DVB-Styrolgelharzes, das von M e r r i f i e 1 d eingesetzt wird, schwankt die Menge von ungefähr 0,2—0,5 mMol • Aminosäure pro Gramm des Polymeren. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können normalerweise 1 —4 mMol der Aminosäure pro Gramm des Polymeren zur Herstellung der meisten Polypeptide verwendet werden, und zwar zur Herstellung von Polypeptiden, welche 3—20 Aminosäure-Einheiten aufweisen. Zur Herstellung von Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 2000 ist ein größerer Funktionalitätsgrad zweckmäßig. Dies wird am besten durch Begrenzung des Ausmaßes der Chlormethylierung erreicht

Zur Herstellung des Polypeptide wird die Schutzgruppe in bekannter Weise zuerst entfernt, worauf anschließend nach den bisher bekannten Methoden Aminosäure-Einheiten angefügt werden. Diese Reaktionen verlaufen mit den erfindungsgemäß hergestellten festen Aminosäureprodukten genauso gut wie bei Verwendung der bisher bekannten Gelharze. Die großen Kügelchen behalten ihre Beschaffenheit bei und lassen sich in einfacher Weise filtrieren und handhaben. Sie nehmen ohne weiteres das Mehrfache ihres eigenen Gewichts an Polypeptid auf, ohne daß dabei sichtbare Veränderungen mit Ausnahme eines Ansteigens des Durchmesser zu erkennen sind. Die größere ursprüngliche Kapazität der Kügelchen, die durch einen höheren Chlormethylierungsgrad erreicht wird, läßt sich in dem fertigen Polypeptid realisieren.

Da die tatsächliche Polypeptid-Synthese nach der anfänglichen Veresterung von M e r r i f i e 1 d vollständig beschrieben worden ist, braucht auf diese Synthese nicht näher eingegangen zu werden. Bei Verwendung der erfindungsgemäß veresterten chlormethylierten

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Polymerunterlagen können die folgenden Peptid-Syste- Tetrapeptide:

me hergestellt und von der Harzunterlage in der von L-Phenylalanyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-alanin

M e r r i f i e 1 d gezeigten Weise abgespalten werden: L-Alanyl-L-phenylalanyl-L-alanyl-L-phenylalanin

c L-Leucyl-L-alanyl-glycil-L-valin

Dipeptide: -^s ., ./ ^{y 6y}

Nonapeptide:

L-Alanyl-L-phenylalanin (L-Phenylalanyl)2(L-alanyl)6-L-alanin

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung fester Aminosäureprodukte, bei dem als Ausgangspolymerisat bekannte kugelförmige vernetzte Polymerisate eingesetzt werden, die mindestens 50 Gew.-% alkenylaromatischer Monomereneinheiten, gegebenenfalls zusammen mit Einheiten modifizierender Monomerer enthalten, in die durch Chlormethylierung 1 bis 6 mÄq Cl/g Polymerisat eingeführt worden sind, und diese vernetzten Polymerisate mit Aminosäuren, deren Aminognippe geschützt ist, in Gegenwart von polaren Lösungsmitteln verestert werden, dadurch gekennzeichnet, daB das eingesetzte vernetzte Ausgangspolymerisat eine Oberfläche von mehr als 5 mVg, einen durchschnittlichen Porendurchmesser von wenigstens 30 A und eine Teilchengröße, die durch ein Sieb von 0,15 bis 1 mm lichte Maschenweite hindurchgeht, besitzt und daß die Veresterung in einen! polaren inerten Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstanten von wenigstens 35 bei 20⁰C durchgeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein vernetztes Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres, das chlormethyliert worden ist, mit einer Aminosäure, deren ot- Aminognippe durch eine tertiäre Butoxycarbonylgruppe geschützt ist, in Acetonitril als inertem Lösungsmittel verestert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das vernetzte Polymere eine Oberfläche von wenigstens 50 m²/g besitzt und eine durchschnittliche Porengröße von wenigstens 90 A aufweist

4. Verwendung der festen Aminosäureprodukte, hergestellt gemäß Anspruch 1 bis 3, zur Durchführung der Polypeptidsynthese.