DE1950969A1 - Feste Aminosaeure-Produkte zur Durchfuehrung von Polypeptid-Synthesen und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Rohm & Haas Company, Philadelphia, Pa. 19105 / USA

Fee te Aminosäure-Produkte zur Durchführung von PoIypeptid-Synthesen und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung betrifft Polypeptld-Synthesen und besieht sioh insbesondere sowohl auf ein polymeres Substrat als auch auf Verfahrensbedingungen but Durchführung derartiger Synthesen. Insbesondere befasst sloh die Erfindung mit der neuen Verwendung speBifisoher Har«formen, mit welchen Aminosäuren wahrend der Polypeptid-Bildung verknüpft werden, sowie mit Löeungemittelsystemen, welche während der anfänglichen Vernetiungareaktion verwendet werden.

Polypeptide, die aus einer Aminosäurekette bestehen, stellen die am häufigsten vorkommenden und wichtigsten chemischen Verbindungen dar. £er Brforsohung der Polypeptide wurde bisher

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sehr viel Aufmerksamkeit geschenkt, da Polypeptide in immer grosser er Anzahl, wie man gefunden hat, hormonale Punktionen, wie im Falle des Insulins, ausüben. Sie stellen die Hauptbestandteile von Enzymen, Blutproteinen sowie vielen anderen Substanzen, die für den lebenden Organismus von Wichtigkeit sind, dar. Trotz der Leichtigkeit, mit welcher die lebende Zelle spezifische Polypeptide synthetisiert, steht der Chemiker bei der Durchführung eines solchen Verfahrens erheblichen Schwierigkeiten gegenüber. Von diesen Schwierigkeiten besteht die schwerwiegendste darin, komplizierte ReinigungsmaSnahmen in jeder Stufe der stufenweise erfolgenden Kombination von w Aminosäuren, welche die Synthese darstellt» durchführen au müssen, da das Vorliegen von Bruchstücken infolge, einer unvollständigen Eeaktion, von anderen Reagentien, die zur Synthese verwendet worden sind, sowie von. Nebenprodukten zu einer immer stärker werdenden Verfälschung führt. Da diese Reaktionen in flüssiger Phase durchgeführt werden, werden die Abtrennungsschwierigkeiten infolge der Tatsache merklich vergröseert, dass die Eigenschaf ten der Nebenprodukte denen des gewünschten Peptide ähnlich sind, so dass sich übliche Abtrennungsmethoden, wie beispielsweise eine Auskristallisation, extrem schwierig gestalten.

Im Jahre 1963 wurde ein erheblicher Fortschritt bei der PoIypeptid-Brzeugung erzielt (vergleiche Dr. R. B. Merrifield in ⁿJ. Am. Ohem. Soc», 85, 2145 (1963» sowie »Biochemistry¹¹, 3, 1385 (1965)). Diese Methode von Merrifield hat eine solche Bedeutung erlangt, dass sie seither als "Merrifield-Synthese" bezeichnet wird. Merrifield entwickelte eine Festphasen-Polypeptid-Synthese, bei deren Durchführung eine ge~ sohütste Aminosäure in Gegenwart von Triäthylamin mit entweder einem nitroohlormethylierten oder chlormethylierten Geloopolymeren aus Styrol, vernetzt mit 2 ί> Diviny!benzol, aur

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Umsetzung gebracht wird. Die Aminosäure wird durch eine K-Carbobenzoxy- oder tert.-Btttoxyearljonylgruppe geschützt. Biese Gruppe gewährleistet eine Verknüpfung der Aminosäure mit dem Copolymere?! ober die CarboxyIfunktion, wobei letztere mit dem endständigen Chlor reagiert. Das Triethylamin absorbiert dabei den HJl:

(1) Res - GHgCl + ZMHCHSOOH — y Res-CHgOCOQHHHZ

Res bedeutet die Harzbase, während Z die Schutzgruppe an der Aminosäure wiedergibt und H₁ den Rest des ersten Aminosäuremoleküls darstellt. Kaeh der Reaktion wird die schützende Gruppe "Z" entfernt» worauf die nächste Einheit nach bekannten, hohe Ausbeute liefernden Methoden angekuppelt wird;

R R "■'■■■'" ■

(2) Res - CH₂OCOCHHH₂ * ZKHCHGOOH '

Res-CHgOCOCHKHCOC-HMZ

In dieser Gleichung bedeutet R₂ den Rest des zweiten AminosäuremolekUlsο Wiederum wird "Zⁿ entfernt Uöd eine dritte, «Z "-blockierte Aminosäure nach der (gleichen Methode angeknüpft.

Dieses Verfahren wird solange wiederholt, bis die gewünschte Polypeptid-Struktur erreicht worden ist. Zu diesem Zeitpunkt wird das ganze P'alypeptiü von dem Harz nach einer Esterhydrolyse-Methode abgespalten. Diese Methode beeinflusst nicht die Peptidbindungen.

Die bevorzugte Schutzgruppe Z besteht aus tert.-Butyloxycarbonyl (t-Boo). Enthält eine Aminosäure sowohl eine a-Aminogruppe als auch.eine 6-Aminögruppe, so wie dies bei lysin der

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Ist 9 ämin χνίτά. tHBoc als Schutzgruppe for die

rad" l@asfl für die 6-Aminogruppe wwendet« .Bei den sicli aneeoliesseiiden Terösterimgsreaktloneja wird Meyclo- hmzfX@wn3>®ältw±ä sur Aktivierung der Aminogruppe verwendet, w@MI XffrthyleBG&Lorid als Reaktiossmedium eingesetzt wird, und «war wegen seiner das vemetste Harz aufquellenden WIrkffiig. Sie Schutzgruppe Z kann durch HBr in Essigsäure oder HOl in J)±Q2m?ß entfernt werden, wobei der Halogenwasserstoff dureh Sriätfejlamin neutralisiert wird.

dass die Reaktion eine sehr hohe Ausoeute ergeoexj hat, kann das Polypeptid in einfacher Weise gereinigt werden« Sies erfolgt durch Verwendung eines Überschusses an Heaktanten, deren Entfernung in dem Üblicherweise homogenen Medium Probleme aufwerfen würde, wobei jedoch diese Entfernung aus diesem System einfach verläuft, da sieh das Waschen infolge der Tatsache einfach gestaltet, dass sich das Polypeptid auf den festen Harzteilchen befindet.

Die ganze Merrifield-Synthese wurde kürslich von Dr. Merrifield in «Soientifiö American«, Seite 56-75 (1968) beschrieben. In diesem Artikel wird ferner eine Torrichtung geschildert, die zur Automatisierung der Synthese verwendet wird, um die mechanischen Probleme su vereinfachen, die bei der Erzeugung relativ langkettiger Polypeptide, wie beispielsweise Insulin, auftreten.

Es gibt eine Vielaahl von Peptlden, die von Bedeutung sind_c Diese Peptide enthalten 3 bis ungefähr 20 Aminosäure-Einheiten, Die Synthese dieser Peptide lässt sich nach der Merrifield-Methode durchführen. Viele dieser Peptide besitzen antibiotische oder hormonale Eigenschaften, wie aus einem Abschnitt

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des Η» D, Law-Seates »Prograss ia Medicinal Chemistry", Band 4» Seite 86-170 (Sllis and West, Bditors) sowie aus einem Artikel von S₀ Whaley in "Advances in Protein Chemistry", 21, Seite 1-112 (1966) hervorgeht. Heben diesen fundierten Struk~ türen kann die Merrifield-Methode auch zur Herstellung analoger Strukturen verwendet werden, in welchen die Aminosäuren verändert werden. Ferner ist eine Anwendung auf alle Permutationstypen möglich, wobei die Aktivität des erhaltenen Peptide merklich modifiziert wird.

Das zur Durchführung der Merrifield-Synthese verwendete Harz wird aus einem locker vernetzten Polystyrol/Dlvinylbenzol-Harz (2 ^ DVB) hergestellt. Dieses Harz besitzt eine kleine Teilehengrösse {Teilchen„ die durch Siebe mit lichten Maschenweiten von 0,035 - 0,070 mm (200 - 400 mesh) hindurchgehen), wodurch eine maximale Oberfläche (in der Grossen-Ordnung von 1/10 m /g) und eine minimale Geldieke garantiert werden. Das Polypeptiö bildet sich sowohl innerhalb des Gels als auch auf der Oberfläche. Um au gewährleisten, dass ein vollständiger Polypeptiä~Wuehs an beiden Pläohen erfolgt, kann das Harz nur leicht chlonaethyllert warden«, Wird das Harz stärker chlormethyliert» w® ihm.©in grösseres Kombinationsvermögen mit dem Substrat si* verleihen,, iann ist das Gel infolge seiner niedrigen Porosität nicht fiasa in der lage, die grösseren M&agen-an Iremdsubstana aussugleiohen,, so dass die Heaktionsgeschwinäigkeit abniMiat mid das Harzteilchan sogar zerbrechen kenn, Is wurde vorgeschlagen» die !Peilchengrösse su verkleinern _t w& eine grössex·© äuesere Oberfläche für den Polypeptid-Viuche au' achaf.fen. Jedoch hat es sich herausgestellt, dass die !!teilchen, die durch Siebe mit lichten Maschenweiten von 0,035 ~ 0_s0?0 mm (200 - 400 mesh) hindurchgehen (die Teilehen werden von Merrifield verwendet), schwierig »u handhaben sind. Bei den von Merrifield einge-

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setzten Härgexi beträgt die maximale Chlormethylierung ungefähr 1,5 MillläquiTSlente Chlor pro Crraima des Barges^ wobei di© Chlormethylierung hauptsächlich la einer GrrosEenordnung von ungefähr O„ 6 Milliaq-oXY&lenten pro Gramm erfolgt» Auch "bei diesem geringen Ghloimethylierusigagr&d ist es nicht mögliche eine hohe anfängliche Veresterung sau erzielest wesm-die blockierte Aminosäure la dem ÄthaHollöstmgsmittel mit der Earsbase sur" ümsetzuiig gebracht wi3?ci. Ausbeuten in der GrSosexior&üung -won xwgetähv 30 - 35 $ wa^en die höchsten eraieltea AiisbeutQKj so dass das Endprodukt nur, ungefähr 0*3 ~ 0,$ mMol Aminosäure pro Gramm dea Harzes enthält, und avrar auch dann_P wenn der höchste Ohlonaethylierungsgrad eingehalten wird. Es wurde nunmehr gefunden^ dass das Lösungsmittel eine wichtig© Rolle bei diesem Yeresterungstyp spielt. Ithancl? das äswar sum !Tragen der Aminosäure geeignet ist, beeinflusst offensichtlich öle Reaktion zwischen der Aminosäure "und dem EarSo D£©a' geht aus @ixi@r Aiialyea des IPiltrafs auf - OhI ©rid _P ums h@3* to? Pasehführuag cl©r He^s-If ield-Synthese »ach- der ©afängl£öh@a Tereetesimg gebildet wird» herror, ISs wurde festgestellt j" daes eisse ©rhebllohe Diekrepaiis* zwischen der itein ©atliaiteaeB Ohl@3?ra©sge uafi ä@:»?5©nigen Ohlormenge feesteht» die the©^©tieeli vorliegen ©@llte_f imä mr&v bes-ogen die

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verkleinert und öle Porosität vermindert wi3?t_ö Dies ermöglicht eine entsprechend vereinfachte Handhabung,, In den Rahmen der Erfindung fällt ein Verfahren ssur Synthetisierung von Polypeptiden unter Verwendung von Harzkügelehen mit einer solchen Grosse, dass die Kügelchen durch Siebe mit lichten Maaohenweiten von ungefähr 0,15 um oder darunter hindurch» gehen. Auf diese Weise wird wenigstens ungefähr 1 siMol an gebundener Aminosäure pro Gramm des Harzes gewährleistet₀ Das erfindüngsgemässe Verfahren ermöglicht die Umse taxing eines chlormethylierten Harekügelchens mit einer in geeigneter Weise blockierten Aminosäure zur Gewinnung des entsprechenden Esters in einer Ausbeute von 50 # oder darüber.

Erfindungsgemäss werden makroretikulare vernetsste Polystyrol-Kügelchen als Harzgrundlage bei der Durchführung der Merrifield-Synthese verwendet. Zu Beginn wird das chlormsthylierte Harz mit blockierter Aminosäure in Gegenwart eines hoch« polaren Lösungsmittels, dessen Dielektrizitätskonstante grosser als 35 bei 20°0 ist, ohlormethyliert.

Makroretikuläre Kügelchen werden in der gleiohen Weise hergestellt wie die regelmäßigen Suspensionspolymerisierten gelartigen Kügelchen der bisher bekannten Art, mit der Ausnahme, dass die Polymerisation in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels durchgeführt wird. Sas Verfahren aur Herstellung makroretikularer Harekttgelchen wird einsohlieeslioh der verwendeten Lösungemittel» Monomeren und Verfahrenebedingungen beispielsweise in den US-Patentschriften 3 322 695, 3 147 214 und 3 326 875 sowie in den britischen Patentschriften 932,125 und 932*126 beschrieben. Geeignete Lösungsmittel für das Monomere, die in Bezug auf das Polymere quellend oder nioht-quellend wirken können, sind beispielsweise

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aliphatische Kohlenwasserstoffe, Alkohole, Ketöne _t aromatische Kohlenwasserstoffe sowie Halogen- oder Ätherderivate dieser Substanzen. Häufig wird eine Mischung aus zwei oder mehreren Lösungsmitteln eingesetzt.

Die Monomeren müssen derartig ausgewählt werden, dass die erforderlichen Stellen für die Chlormethylierung geschaffen werden und auch das angestrebte Ausmaß an Vernetzung erzielt wird. Es kann sich bei den Monomeren daher um eines oder mehrere der alkenylaromatischen Monomeren plus einem geeigneten Vernetzungsmittel sowie um kleinere Mengen eines oder mehrerer Modifizierungsmonomerer handeln. Infolge ihrer leichten Verfügbarkeit sind die bevorzugten alkenylaroma tischen Monomeren Styrol, Äthylstyrol und Vinyl toluol. Ist das Vernetzungsmittel selbst ein alkenylaromatisohes Monomeres, wie beispielsweise Diviny!benzol, dann brauchen keine Comonemeren verwendet werden. Andere Vernetzungemittel, die in Mischung mit einem oder mehreren alkeny!aromatischen Monomeren verwendet werden können, sind Irivinylbenzol, Glykoldimethaorylat, Irimethylolpropantrimethacrylat, Divinyloxyäthan oder dergleichen. Bevorzugte Modifizierungsmönomere sind Vinylchlorid, Vinylidenchlorid, Acrylnitril und Methylmethaorylat. Die minimale Menge des einzusetzenden Vernetzungsmittels hängt von den 0©monomeren, dem Lösungsmittel sowie den gewünschtes Eigenschaften des Produktes ab. Die maximale Menge richtet sich nach wirtschaftlichen Paktoren (das Vernetzungsmittel ist gewöhnlich das teuerste Monomere in dem Copolymeren) sowie nach der Notwendigkeit, in ausreichendem Maße aromatische Ringe ^v für die Chlormethylierung zur Verfügung zu haben (ein !Faktor, der nicht auf Divinylbenzol zutrifft). Im allgemeinen können ungefähr 8 - 35 &$ bezogen auf das Gewicht der Monomerenmisohung, verwendet werden, wobei jedooh die Menge in geeigneten

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Fallen Ms auf 2 f° abfallen oder bis zu 50 $> bei Verwendung der meisten Vernetzungsmittel ansteigen kann, während die Menge bis zu 100 # im Falle von Divinylbenzol betragen kann (wobei sich alle Prozentangaben, auf das Gewicht beziehen).

Sie organischen Reaktanzen (d„h. die Monomeren, das Lösungemittel und der Katalysator) werden in einem Wassersystem unter Bildung einer Dispersion mit der gewünschten Seilchen* grösse verrührt, wobei. Wärme zur Förderung der Polymerisation einwirken gelassen wird« Die erhaltenen Kügelchen sind durchsichtig bis undurchsichtig und zeichnen sich durch das Vorliegen von Poren sowie einer messbaren Oberfläche aus, die 2000 m pro Gramm des Harzes betragen kann₀ Im Gegensatz zu den übliohen Polystyrol-GeIkügelcnen, wie beispielsweise den Kügelohen, die von Merrif leid vorgeschlagen werden, können die erfindungsgemässen makroretikularen KU-gelohen mit sehr hohen DVB-Anteilen, und zwar bis zu 95 oder sogar 100 & hergestellt werden· Ein sehr geeigneter Bereich zur Herstellung von Materialien mit guten physikalischen Eigenschaften und einer ausreichenden Oberfläche liegt zwischen 3 und 50 # DVB, wobei 20 - 80 $> des Xiösungsmittelverstreokers, berechnet auf die gesamte organische Phase, hinzukommen. Diese Mengen richten sich teilweise nach der Natur des Verstreckungsmittels. Da im Handel erhältliches DVB 40 - 50 $> m- und p-JLthylstyrol enthält, ist das Polymere gewöhnlich ein Serpolymeres aus Styrol, Äthyls ty r öl und DVB. Die Äthylstyrol-Komponente kann weitgehend durch Verwendung von 96 % DVB vermieden Werden, sie ist jedoch gewöhnlich als Bestandteil des Polymeren akzeptierbar. Im Handel erhältliches DVB kann zusammen mit einem DVB^lthylstyrol-Oopolymeren, das 60 P DVB-Vernetzungsmittel enthält, verwendet werden. Kleine Mengen an anderen Monomeren, wie beispielsweise Acrylnitril oder Methylmethäorylat, können gegebenenfalls zugesetzt werden_r

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Makroretikulare Polymere werden in vielen Veröffentlichungen und Patenten geschrieben. Sie Bierstellung dieser Polymeren ist bekannt und ist kein Seil der vorliegenden Erfindung« Beispielsweise wird in der US-PatGutschrift 3 226 695 die Herstellung makroretikülarer Harze aus Styrol beschrieben.

Sine Untersuchung eines Querschnittes eines typischen makröretikularen Xttgelohens mittels des Elektronenmikroskops zeigt, dass es aus einem flexiblen Gelkontinuum mit zahlreichen relativ grossen Löchern, in denen kleine Kugeln in der Gros β en Ordnung von 1 Jk. oder weniger im Surohmesser eingebettet sind, bestehtο Siese Struktur ergibt die sehr grosse Oberfläche und die sehr hohe Porosität» so dass unter Aufquellen grosee Mengen an Premdsubs tanzen aufgenommen werden können. Sie makroretikularen Eügelchen schwanken in ihrem Durchmesser innerhalb eines breiten Bereiches. Sie werden naoh üblichen Siebmethoden aufgetrennt. Srfindungsgemäss hat es sich am vorteilhaftesten erwiesen, Seilchen zu verwenden, die in ihrer ßrösae zwischen ungefähr 18 und ungefähr 100 mesh (US-Slebreihe) liegen, wobei die bevorzugteste Seilchengrösse zwischen 18 und 60 mesh liegt (18 mesh entspricht einer lichten Haeohenwelte von 1,00 mm, 100 mesh entspricht einer Höhten Masohenweite von 0,15 mm und 60 mesh entspricht einer lichten Masohenweite von 0,25 mm). Dieser zuletzt genannte leilehengrössenbereioh kann in der Weise maxlmiert werden, dass die Rührgesohwindigkeit während der Polymerisation gesteuert wird. Serartige Grossen eignen sich für zahlreiche mechanische Manipulationen bei der Polypeptid-Herstellung und -Reinigung, Sie Oberfläche der erfindungsgemässen Kugelchen beträgt wenigstens 5 m /g und vorzugsweise wenigstens 50 m /g. Sie Porosität (^ Volumen der Poren in dem Harzkörper oder in den Harzkörpern) der lügeichen beträgt wenigstens 10 £ und

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schwankt vorzugsweise swischen 30 und 75 Volumen-^, wobei die Hauptmenge der Boren einen Durchmesser von mehr als 30 Ä aufweist.

Sie makroretikularen Kügelchen können nach den gleichen Kethoaen chlormethyliert werden, wie sie but Chlormethylierung der Merrifield-Gelharze angewendet werden, beispielsweise durch Umsetzung mit Chlormethylmethyläther in Gegenwart von Katalysatoren, wie beispielsweise Zinn(II)-chlorid, Aluminiumchlorid, Zinkchlorid oder dergleichen. Andere Methoden, wie sie beispielsweise in den US-Patentschriften 3 297 648 und 3 311 602 beschrieben werden, können ebenfalls angewendet werden.

Nachfolgend wird ein spezifisches Beispiel für die Herstellung und Chlormethylierung eines makroretilcularen erf indungsgemäesen Polymeren angegeben:

Beispiel 1

Herstellung der Harzformulierunfi A

Eine Mischung aus 96 g Styrol, 64 g eines technischen Divinylbenzols, das 50 96 eines aktiven Bestandteils enthält (50 # Divinylbenzol, 50 # Äthylstyrol), 87 g tert.-Amylalkohol und 1 g Benzoylperoxyd wird einer Lösung von 6,5 g Natriumchlorid und 0,5 g des Ammoniumsalzes eines im Handel erhältlichen Styrol/Maleinsäureanhydrid-Oopolymeren (Amberlite W-1, Rohm und HaaB Company) in 174 g Wasser zugesetzt. Die mischung wird solange gerührt, bis die organischen Komponenten in Form feiner Tröpfchen dispergiert sind, worauf sich ein Erhitzen auf 86 - 88°0 während einer Zeitspanne von 6 Stunden ansohlieeet. Sie erhaltenen Polymerenperlen werden filtriert, mit Wasser und ansohliessend mit Äthanol gewaschen und sohliesslioh von

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dem überschüssigen Wasser» Ithanol und tert«-Amylalkohol durch Trocknen bei 100⁰O befreit. Das Produkt fällt in Form weisaer undurchsichtiger kugelförmiger oder spheroidaler teilchen in einer Menge von 145 g an. Die Oberfläche beträgt ungefähr 90 m²/g, während der durchschnittliche Porendurchmesser zu 200 1 ermittelt wird.

Dieses Copolymere kann gegebenenfalls zur Abtrennung der Teilchen gesiebt werden, die zwischen 18 und 100 mesh fallen. Diese Teilchen eignen sich besonders zur Durchführung der anschliessenden Maßnahmen. Sogar die kleinsten Kügelohen besitzen eine makroretikulare Struktur und eignen sich ebenfalls zur Durchführung der anschliessenden Maßnahmen, besitzen jedoch weniger günstige Handhabungseigenschaften. Wird die Rührgeschwindigkeit entsprechend ausgewählt, dann fallen über 80 # der Kügelchen in den 18- bis öO-mesh-Gröesenbereieh. Diese Seilchen.sind besonders geeignet für mechanische Operationen bei der Durchführung der weiteren Stufen der Polypeptid-Heretellungo

Ohlormethjlierun^ der Pormulierun^ A

100 g einer 18-100 mesh-Sxaktion der Polymerenkügelchen werden in 1 1 Ithylendiehlorid über Nacht eingeweicht. Dieser Mischung werden 150 g Chlormethylmethyläther zugesetzt, worauf die gerührte Mischung auf 35°.O erhitzt wird. Dann werden 8 Portionen (jeweils 2,5 ml) Zinn(II)-Chlorid in 10 Minuten-Intervallen unter Rühren zugesetzt. Dabei wird die Temperatur auf 40⁰C gehalten. Die Mischung wird ansohliessend erhitzt und bei dieser !Temperatur 5 Stunden lang gerührt. Das Harz wird von der flüssigen Phase abfiltriert und auf dem Filter mit einigen 200 ml-Portionen Dioxan, dann mit 75 $> Dioxan in Wasser» 75 $> Dioxan in 2n-0hlörwasserstoffsäure, entionisiertem Wasser, 4 tigern Natriumhydroxyd und ansohlieesend mit Wasser solange

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gewaschen, bis die Waschlösung neutral ist. Schliesslich wird das Harz mit 1 1 Methanol gewaschen, trockengesaugt und anschliessend im Vakuum bei 80⁰C weiter getrocknet« Auf diese Weise erhält man 120 g eines chlormethylierten Harzes, das, wie die Analyse ergibt, 10 # 01 enthält.

Der Chlormethylierungsgrad kann durch die Reaktionstemperatur, die Menge an Ohlormethylmethyläther sowie das eingesetzte !lösungsmittel gesteuert werden. Geeignete !lösungsmittel sind nicht-reaktive Flüssigkeiten, wie beispielsweise chlorierte Kohlenwasserstoffe, Äther oder chlorierte Äther, Nitroverbindungen oder dergleichen, < ■ .

Saoh der in Beispiel 1 beschriebenen Methode können andere makroretikulare ohlormethylierte Polymerenkügelohen hergestellt werden (vergleiche die nachfolgende Tabelle I), welche wechselnde Chlormethylierungsgrade aufweisen, und zwar bis zu 21 ^ (6 Milliäquivalente) chlor enthalten und !Deilohengrössen zwischen 18 und 1QO mesh besitzen, wobei wenigstens 80 fo in den 18- bis 60 mesh-Bereich fallen:

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Tabelle I

	Fi m	a	«p-	Sty- :	Chlormethylierte ©akroretikulare	tert«-Amylal	Ä	mittel 2	-	Substrate	Chlor.	10,0	* / *	ι
			A	60	1- ltiiyl- Lösuaga- , styrol, mittel f 1	kohol Hexan-2-ol	35		24	8,4	MMMHMK . 2,82
	O	B	50	20	4-Metijylpen- tan-2-ol	35	keiaes	33	19,8	2β40
	O co	0	95	20	Saroain	43	keinee	33	4,86	5,59
	_*'		50	.·■ _ 2	Metbyläthyl-	46	Solttol	.-	21,3	1,36
	(O	E	92.	20	Oktim	33	Toluol	• 37	6,0	5,91
	c© O	T	25	-' 3	4-^Ie thylpen- ■fcaa—2~ol	33.	toluol	37	8,7	1,69
	«"*		17	30	Kerosis	33	keiaes	j» 36	9,5	2,45,
	;	H	50	33	'Kerosin	37	o-DicJaor-	L)	19,5	2,68
BAD <		I	• 50	20	Ä"1?iiylly?xanol	37	beiieol	12,0	5.·,5-
				20		24	Soluol		3,4
O P		£ der eeeasi	0	ü Phase (Monomere	s ■*■	Dlätbylbej zol
		fta&lsehe]	Τ·Καηηρ·Ητη4 -fc-h^-
	beutel _έ_
20
50
3
30
5
45
50
30
30
25
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Tabelle II

Physikalische ] > vor	Oberfläche,	Eigenschaften inakroretikularer Harze der Methylohlorierung	Porengrösse
Formu lierung	90	Porosität, Volumen-^	durchschnittlich 220 S
A	10
σ	270	67	1000 - 10000 Ä ~ 36 # 100 - 1000 X - 48 $> weniger als 100 X- 16
	300	61	durchschnittlich 90 Ä
α	200	47	1000 - 10000 £ - 9 % loo - 1000 Ä - 7g i> weniger als 100 S. - 12
H	43

Jede der vorstehend angegebenen Formulierungen eignet sich zur Durchführung der Merrifield-Synthese, da diese Formulierungen einfach zu handhaben sind und ein erhebliches Ausmaß an potentiellen Reaktionsstellen aufweisen« In bestimmten Fällen, beispielsweise im Falle der Formulierungen D und G, wird nur eine leichte Chlormethylierung durchgeführt, um zu Proben zu gelangen, die direkt mit der Unterlage verglichen werden können, welche Merrifield but Durchführung seiner Forschungsarbeiten verwendete. Das Ausmaß der Chlormethylierung wird im allge- . meinen in der Weise variiert, dass zwischen 1 und 6 mXq Chlor pro Gramm des Harzes zur Verfügung gestellt werden.

Wie vorstehend beschrieben, eignet sich jede der Formulierungen der labeile I für eine Verwendung zur Durchführung der Merrifield-Synthese, d.h. jede Formulierung ist einer Aminosäureveresterung durch das Chlorid fähig. Zur Bildung des Esters der ersten Aminooäure-Binheit ist es notwendig, zuerst die Aminofunktion der Säure zu schützen. Dies erfolgt in zweck-

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massiger Welse nach bisher bekannten Methoden, von welchen die beste darin besteht, ein tert.-Butoxyearbonyl (t«Boo)-Derivat

der Formel

OR

It t

(OHj)₅OOCKHOH0OOH

Worin R für den Rest des Aminosäuremoleküls steht, zu bilden. Aus dem Harz, !Äquivalent oder mehr .!Dri&thylarain und einer Menge t-Boo-Aminosäure, welche dem Xriäthylamin äquivalent ist, wird in einem geeigneten Lösungemittel für die Reaktion eine Mischung hergestellt. Bisher wurden Äthanol oder Äthylacetat als Lösungsmittel zur Durchführung dieser Reaktion verwendet, wobei Ausbeuten an dem t-Boe-Aminoester des Harzes . anfielen, die bestenfalls bei ungefähr 35 fi lagen.

Unter Anwendung dieser Methode mit Äthanol als Lösungsmittel wird der nachfolgend beschriebene Versuch durchgeführt, um die Verwendung der ohlormethylierten grossen Seilchen gemäss vorliegender Erfindung mit der Methode von Merrifield zu vergleichen.

Beispiel 2

Eine Mischung aus 1 g (1,56 mÄq) der HarzMgelohen der Formu« lierufig D in Tabelle I, 0,274 g (1»45 mMol) t-Bop-L-Alanin, 0,147 g Xriäthylamin und 20 ml Äthanol wird während einer Zeitspanne von 24 Stunden am Hliokfluss gehalten. Me erhaltenen Kügelchen wiegen nach dem Waschen mit Äthanol und nach dem Trocknen 1„042 g. Eine Probe wird in der Welse hydrolysiert, dass sie in einer 1:1-Mieohung aus Dioxan und konzentrierter Chlorwasserstoffsäure während einer Zeitspanne von 24 Stunden am Rückfluss gehalten wird. Die Analyse auf Analin durch die Ninhydrin-Methode zeigt einen Gehalt von 0,43 mMol Alanin.

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Das Ausgangsharz enthält 1,36 mä,q Chlor» so dass die Ausbeute 32 # beträgt.

Dies ist die normale Ausbeute bei der Durchführung der Merrifield-Methode unter Verwendung von Äthanol oder Äthylacetat als !lösungsmittel sowie unter Einsatz eines üblichen Gelharzes.

Im Hinblick auf die gleichmässig relativ niedrigen Ausbeuten, die sowohl unter Verwendung der Merrifield* sehen als auch der erfindungsgemässen Unterlagen erzielt werden, wird eine Analyse des Filtrate unternommen, wobei man feststellt» dass eine erhebliche Diskrepanz hinsichtlich der Chloridmenge in dem FiItrat und der Aminosäuremenge auf dem Harz besteht, obwohl die entsprechenden Mengen theoretisch in molarer Hinsicht gleich sein sollten. Zur Ermittlung der Ursache dieser Unstimmigkeit werden die Formulierungen.C und T> unter anderem während längerer Zeitspannen am Rückfluss gekocht. Nach 24 Stunden findet man eine merkliche Chloridmenge in dem PiItrat, die bei 6-BtUndigen TestIntervallen anschliessend ansteigt. Nach 38 Stunden hat die Formulierung C 0,5 mHol Chlorid pro Gramm und die Formulierung.D 0,96 mMol Chlorid pro Gramm verloren. Daraus ist zu schlisssen, dass in geringem Ausmaß eine Hebenreaktion zwischen dem ohlormethylierten Harz und dem Lösungsmittel Äthanol während der Veresterung stattfindet, wobei die Kontinuität dieser Reaktion aus der konstanten Chloridmenge hervorgeht, die beim Kochen am Rückfluss austritt. Um dieses Problem auf ein Minimum herabzusetzen und damit die Auebeuten zu erhöhen, werden kein Äthanol und Äthylacetat mehr verwendet, sondern durch ein inertes !lösungsmittel ersetzt. Bs wurde gefunden, dass inerte Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von mehr als 35 bei 2O⁰C, bei-* spielBweiae Acetonitril, Acetamid, Dimethylformamid, Dimethyl-

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acetamid oder Uitromethan, am geeignetsten sind«, Yon diesen lösungsmitteln wird Acetonitril bevorzugt, da sein Siedepunkt von 82⁰O in dem günstigsten Bereich sur Durchführung von Rückflussreaktionen liegt. Bei Verwendung dieses Lösungsmittels zur Rückfluss "behandlung tritt ein minimaler Verlust der Ohloridfunktion der chlormethylierten Harzunterlage auf, wobei die Veresterungsausbeuten wenigstens bei 5P $> oder darüber liegen. Diese Ausbeute kann in reproduzierbarer Weise über diese Menge hinaus gesteigert werden, wenn ungefähr 1,5 Äquivalente t-Boc-Aminosäure und Iriäthylamin, besögen auf die Ohloridmenge, vorliegen. Die Art der auf die Unterlage (t-Boe-Porm) su veresternden Aminosäure beeinflusst nicht den Reaktionsgrad j, da Alanin, Valin und Phenylalanin jeweils die gleiche Ausbeute ergeben. Die folgenden Beispiele. erläutern die Wirkungen von Acetonitril als Lösungsmittel, von überschüssigen Aminoaäurereaktanten oder von einem überschüssigen chlormethylierten Harss bei der Durchführung der Vöresterungsreaktion.»

Beispiel ?

Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel zur Durchführung der, Veresterung ^₁ ^_{1 m i iw Λ} "_m . _{m ι} - _m

Eine Mischung aus 1g (2,68 mÄq) der Harzkügelohen der Formulierung H in ÜJabelle I, 0₉71 g (2,68 mlfoX) t-Boo-L-Phenylanalin, 0,27 g Triäthylamin und 20 ml Acetonitril wird während einer Zeitspanne von 24 Stunden unter Rühren am Rückfluss gehalten. Die Reaktionsmischung^ wird abfiltriert· Die erhaltenen Eügelohen wiegen nach dem Waschen mit Äthanol 1»35O g. Eine Analysedes Eiltrats auf Ghloriäionen sowie einer Probe des Harzes auf Phenylalanin seigt, dass das insgesamt gewonnene Hare 1,62 mMol Phenylalasin, entsprechend

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einer 60 $£igen Esterausbeute, enthält. Bine Untersuchung dee Infrarotspektrums des Harzes in Form einer KBr-Seheibe sseigt einen starken Carbonylpeak bei 1730 cm" entsprechend der Esterfunktion.

In ähnlicher Weise werden Ausbeuten von 60 - 80 $ erhalten, wenn eine Mischung aus den chlormethylierten Kügelchen, t-Boc-L-Phenylalanin und Triäthyl&min auf Temperaturen zwischen 75 und 100⁰C in Dimethylformamid» Hitromethan, Dimethylacetamid bzw» Acetamid erhitzt wird. Biese lösungsmittel lassen sich sehr leicht durch Väschen der Kügelchen mit Wasser oder Äthanol entfernen.

Beispiel 4

Kombinierte Wirkungen von Acetonitril als Lösungsmittel und überschüssiger geschützter Aminosäure ,

Eine Mischung aus 1 g (2,40 mag.) der Harzkügelohen der Formulierung B in Sabelle I, 0,68 g (3,6 mHol) t-Bοe-L-AlanIn₉ 0,36 g (3,6 mMol) Sriäthylamin und 20 ml Acetonitril wird 24 Stunden lang unter Rühren am Rückfluss gekocht. Die Mischung wird filtriert, wobei 1,27 g an umgesetzten Harakügelchen erhalten werden. Die Analyse dieser Kügelchen auf Alanin zeigt eine Gesamtausbeute von 1,67 mMol Alanin, das mit den Kügelohen reagiert hat. Dies entspricht einer 70 jSigen Ausbeute des t-Boc-L-Alanineaters.

Dieses Beispiel zeigt die leichte Verbesserung, die dann erzielt wird, wenn ein Überschuss an geschützter Aminosäure und dem tertiären Amin verwendet wird. Unter diesen Bedingungen kann die Verwendung von Äthanol oder Äthylacetat eine bis zu ungefähr 40 $ige Ausbeute zur Folge haben, während die Verwendung von Hltromethan, Acetamid, Dirnethylacetamid

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oder Dimethylformamid ale Lösungsmittel bei 80°Ö etwa dieselben Ausbeuten liefert, die bei Verwendung von Acetonitril erhalten werden, d.h. Ausbeuten von 60 - 70 #.

Beispiel 5

Wirkung eines Überschusses an chlorine thyliertem Harz zusammen mit Äthanol als "Lösungsmittel ,„ . ,.

Eine Mischung aus 1 g (5_t59 mÄq.) der Harzkügelchen der Formulierung 0, 0,274 g (1»45 mHol) t-Boc-L-Alanln, 0,147 g (1,45 mMül) feiäthylamin und 20 ml Äthanol wird während einer Zeitspanne von 24 Stunden unter Rühren am Rückfluss gehalten. Sie in einer Menge von 1,143 g erhaltenen Kügelchen werden filtriert, getrocknet und analysiert. Die Ausbeute an Alanin, und zwar 0,8 mMol, entspricht einer 55 #Lgen Ausbeute, beeogen auf das Ausgangs-t-Boo-L-Alanin. Saraus geht hervor, dass die Ausbeute in Äthanol niedriger als die Ausbeute ist, die in Acetonitril erhalten wird, und zwar auch dann, wenn das chlorme thy Herte Harz in einem über 3-fachen überschuss gegenüber den anderen fieagentien eingesetzt wird. Die Verwendung derartig grosser Überschüsse an dem ohlormethylierten Harz ist unerwünscht, und zwar infolge der grossen Kasse sowie der damit verbundenen Kosten«. Ausserdem erzeugen Nebenrealctionen des übersohüssigan Halogens eine unerwünschte Punktionali tat.

Beispiel 6 -

Wirkung von überschüssiger blockierter Amlnosäure-L-Alanln Acetonitril als

Eine Mischung aus 1 g (5,59 mÄq) der Harzkügelchen der Formulierung C, 1,36 g (7,5 mMol) t-Boo-L-Alanin, 0,76 g (7»5 mMol) Sriäthylamin und 20 ml Acetonitril wird 24 Stunden lang am Rückfluss gehalten. Die Mischung wird filtriert, worauf die

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Kügelchen mit Äthanol gewaschen werden. Babel erhält man 1,688 g an umgesetzten chlormethylie'rten KUgelohen. Sine Analyse auf L-Alanin ergibt eine Ausbeute in den Kttgelohen von 4,8 niMol entsprechend einer Ausbeute von 86 # an kombiniertem Alanin,

Beispiel 7

Wirkung eines Überschusses an blockierter Aminosäure-L-Valin mit Acetonitril als Lösungsmittel)

Sine Mischung aus 1 g (2,68 mÄq) der BarzkÜgelchen der Formulierung H₉ 0,78 g (3,6 mMol) t-Boc-L-Valin, 0,365 g (3,6 mMol) Sriäthylamin und 20 ml Acetonitril wird 24 Stunden lang am Rückfluss gehalten, worauf die Mischung nach der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Arbeltsweise aufgearbeitet wird. Eine Analyse zeigt eine Ausbeute von 1,66 mMol (70 S^) an gebundenem Valin in den 1,265 g der veresterten Kügelchen· Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit den Ergebnissen, die bei der Verwendung von Alanin und Phenylalanin erzielt werden.

Aus den vorstehenden Beispielen ist zu ersehen, dass die Umwandlung der chlorine thyli er ten makr ore titular en KUgelohen au veresterten KUgelohen bei Durchführung der bisher bekannten Methoden wenigstens so hoch ist wie bei Verwendung von iibliohen Ktigelohen, und zwar trotz des 10- bis 20-faoh grösseren Durohmessers. Ausserdem kann diese Umwandlung bei Einhaltung der in den Beispielen geschilderten Bedingungen mehr als verdoppelt werden, ferner sind die KUgelohen mechanisch stabil. Sie stauben nicht und zerbreohen auch nicht während dts Filtriereins, Eührens oder während anderer Malnahmen, die max DurohfOhrung dor Settrbildung tiBg«h*lt*n wtrdtn

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Es ist gewöhnlich zweokmässig, mit einer viel grösseren Menge an verestert er Aminosäure pro Gramm der Harskügelchen zur Durchführung der anschliessenden Polypeptid-Synthese zu beginnen, und zwar mit einer grösseren Menge im Vergleich au den bisher eingesetzten Mengen. Bei Verwendung des 2 $ DVB-Styrolgelharzes, das von Merrif ield eingesetzt wird, schwankt die Menge von ungefähr 0,2 - 0,5 mMol Aminosäure pro Gramm des Harzes. Bei der Durchführung des erfindungsgemäesen Verfahrens können normalerweiae 1-4 mflfol der Aminosäure pro Gramm dee Harzes zur Herstellung der meisten Polypeptide verwendet werden, und zwar zur Herstellung von Polypeptiden, welche 3-20 Aminosäure-Einheiten aufweisen. Zur Herstellung von Polypeptiden mit einem Molekulargewicht von mehr als 2000 ist ein gross ere r Punktionalitätsgrad aweckraässig. Dies wird am besten durch Begrenzung des Ausmaßes der Chlormethylierung erreicht*

Zur Herstellung des Polypeptide wird die Schutzgruppe zuerst entfernt, worauf ansohlieasend nach den bisher bekannten Methoden Aminosäure-Einheiten angefügt werden» Biese Reaktionen verlaufen erfindungsgemäss genauso gut wie bei Verwendung der bisher bekannten uelharze. Die grossen Kügelchen behalten ihre Integrität bei und lassen sich in einfacher Weise filtrieren und handhaben. Sie nehmen ohne weiteres das Mehrfache ihres eigenen Gewichts und mehr Polypeptid auf, ohne dass dabei sichtbare Veränderungen mit Ausnahme eines Ansteigens des Durchmessers zts. erl nnen sind. Die rössere ursprüngliche Kapazität der Kttgelohen, die durch einen höheren Qhlormethylierungsgrad erreicht wird, lässt sioh in dem fertigen Polypeptid

Da di® tatsächliche Polypeptid-Synthese mai&h der anfänglichen von M«rrifi9ld TollBtindig bcsohrieben worden ist.

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braucht erfindungsgemäes auf diese Synthese nicht näher eingegangen 2Oi werden. Bei Verwendung der erflndungsgemässen chlormethylierten Harzunterlagen können die folgenden Peptld-Systeme hergestellt und von der Harzunterlage in der von Merrifield gezeigten Weise abgespalten werden:

Dipeptide:

L-Alanyl-L-phenylalanin Ietrapeptldeϊ

alanln

Ir-Alaayl-L-phenylalanyl-L-alanyl-L-plienyl alanln

Ii-Iieuoyl-Ii-alanyl-glyoyl-Ii-valin Honapeptide:

(L-Phenylalanyl)₂(L-alanyl)g-L-alanin

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Claims (1)

1. - 24 Patentansprüche

   1 ο Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, bei dessen Durchführung blockierte Aminosäuren an eine feste Polymerenunterlage oder an eine Harzunterlage durch vernetzende Gruppen auf der Unterlage geknüpft werden, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Unterlage ein makroretikulares vernetates Polymeres verwendet wird, das wenigstens 50 Gewichte-^ an alfcenylaromatischen Monomeren »Einheiten enthält*

   w 2. Verfahren nach Anspruch. 1, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete makroretikulare Polymerenunterlage oder die Harzunterlage zur Schaffung der Vernetzungsgruppen für die blockierte Aminosäuren chlörmethyliert wird.

   .3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet» dass das verwendete makroretikulare vernetzte Polymere eine

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   Oberfläche von mehr als 5 m pro Gramm besitzt, wobei die Hauptmenge der Poren einen Durchmesser von wenigstens 30 £ besitzt.

   4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ι das verwendete makroretikulare vernetzte Polymere aus einem Styrol/Pivinylbenzol-Oopolyaieren bes teht „

   5« Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Chlormethylierung 1-6 mäq Chlor pro Gramm des Harzes zur Verfügung gestellt werden. .

   6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete makroretikulare Polymere eine GrÖsse zwischen ungefähr 18 und ungefähr 60 mesh besitzt.

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   7· Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden, bei dessen !Durchführung eine anfänglich blockierte Aminosäure auf eine chlorine thy Ii er te Polymerenunterlage oder Harzunterlage verestert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Veresterung in Gegenwart eines inerten polaren Lösungsmittels mit einer Dielektrizitätskonstante von wenigstens 35 bei 2O°C durchgeführt wird.

   8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete inerte Lösungsmittel aus Acetonitril, Acetamid, Dimethylformamid, Dime thy lace tamid, Nitromethan oder Mieohimgen davon besteht»

   9. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete inerte Lösungsmittel aus Acetonitril besteht.

   10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete blockierte Aminosäure durch eine tertiäre Butoxyoarbonylgruppe geschützt wird, welche mit der Aminosäuregruppe durch die a-Amlnogruppe verknüpft ist.

   11. Verfahren nach Anspruch 7» dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Polymerenunterlage aus einem festen makroretikularen Polymeren mit einer Oberfläche von wenigstens 5 Ea /g und einem durchschnittlichen Porendurohmesser von wenigstens ungefähr 30 Ä besteht,

   12. Verfahren zur Aufbringung von Aminosäuren auf einen festen Träger, der zur Herstellung von Polypeptiden eingesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass ein makroretikulares vernetztee Styrol/Divinylbenzol-Gopolymeres mit einer (trosse von ungefähr 18 - 100 mesh chlorinethyliert wird, die

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   Aminofunktionen einer Aminosäure durch Umsetzung mit einer Blockierungegruppe geschützt werden, die geschützte Aminosäure auf das ohlormethylierte Copolymere -verestert wird und die Blookierungsgruppe von der Aminosäure abgespalten wird,

   13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Veresterung in Gegenwart eines polaren Lösungsmittels mit einer Dielektrizitätskonstante von wenigstens 35 bei 20°0 durchgeführt wird.

   14. Verfahren nach Anspruch 13* dadurch gekennzeichnet, dass als !lösungsmittel Acetonitril» Acetamid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Nitromethan oder eine Mischung aus diesen lösungsmitteln verwendet wird.

   15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Lösungsmittel aus Acetonitril besteht.

   16« Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete makroretikulare Copolymere eine Oberfläche von wenigstens ungefähr 5 m /g besitzt und eine durchschnittliche Forengrösse von mehr als 30 £ aufweist.

   17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete makroretikulare Polymere eine Oberfläche von wenigstens ungefähr 50 m /g oesitet und eine durchschnittliche Porengrösse von wer gstens ungefäh 90 £ aufweist.

   18. Pestes vernetztes makroretikulares Harz oder Polymeres, dadurch gekennzeichnet, dass es wenigstens 50 Gswlohte-^ an alkenylaromatisohen Monomereneinheitsn aufweist» mit denen eine Aminosäure verknüpft 1st, wobei das Bars in einer überwiegenden Menge Poren mit einem Durchmesser von wenige tens

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   50 % I)OsItSt und eine Oberfläche in getrocknetem Zustand von wenigstens 5 m /g aufweist» und wobei die Aminosäure mit dem Harz Über eine Hethylengruppe mit der CarboxyIfunktion der Aminosäure genäss der Formel

   OR

   verknüpft ist, worin Res für die makroretikulare Harzunterlage oder die Polyaerenunterlage steht und R den Rest der Aminosäure bedeutet·

   19» Produkt nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das alkeny!aromatische Monomere aus Styrol, Ithylstyrol, Vinyl toluol, JQäLvinylbensol oder aus einer Mischung aus diesen Bestandteilen besteht.

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