KR101978446B1 - 고체상 응용을 위한 에틸렌글리콜 유도체 및 코어-쉘형 그라프트 지지체 - Google Patents

고체상 응용을 위한 에틸렌글리콜 유도체 및 코어-쉘형 그라프트 지지체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고상 펩타이드 합성을 위한 에틸렌글리콜 유도체 및 이를 이용한 코어-쉘형 그라프트 지지체에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 고체상 응용에 스페이로서 작용하는 에틸렌글리콜 유도체, 및 이러한 에틸렌글리콜 유도체를 이용하여 제조된 그라프트 지지체를 사용하여 고상 합성 기술에 의한 펩타이드 합성 및 온-비드 바이오어세이(on-bead bioassay) 방법에 유용한 지지체를 제공하는 효과가 있다.

Description

고체상 응용을 위한 에틸렌글리콜 유도체 및 코어-쉘형 그라프트 지지체 {Ethylene glycol derivatives for solid phase application and core-shell type graft support}
본 발명은 고체상 응용을 위한 스페이서로서 에틸렌글리콜 유도체 및 이를 이용한 코어-쉘형 그라프트 지지체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고체상 응용을 위한 스페이서로서 에틸렌글리콜 유도체 및 이러한 에틸렌 글리콜 유도체로 그라프트된 지지체로서 고상 합성 기술에 의한 펩타이드 합성 및 온-비드 바이오어세이(on-bead bioassay) 응용에 유용한 지지체에 관한 것이다.
스페이서(spacer)는 현대 생화학의 많은 영역에서 필수적인 요소이다. 스페이서는 하나의 분자를 다른 분자에 또는 불활성 지지체에 결합하는 분자로서 정의할 수 있다. 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜은 효소를 효소의 활성을 보유하면서 불용성 담체 및 다른 생체 분자에 결합하는데 유리하게 사용되어 왔다(M.Stark 및 K.Holmberg, Biotech.and Bioeng., 34:942~950, 1989). 이러한 개념은 고정된 효소를 사용하는 공업적 프로세스(예를 들면 친화력 컬럼 정제 프로세스) 용도, 그리고 진단 평가(예를 들면 ELISA 평가)에 중요한 결과를 제공한다. 폴리에틸렌 글리콜 스페이서가 사용되는 기타 영역은 펩타이드 합성 및 시퀀싱(sequencing) 분야이다.
고상 핵산, 펩타이드 합성 또는 시퀀스 분석의 유효성은 반응성 사이트(reactive site)를 고정하는 고상 또는 지지체에 의해 영향을 받는다. 폴리스티렌 겔 또는 다공성 유리가 예를 들면 펩타이드 시퀀싱을 위한 고체 지지체로서 이용되어 왔다. 많은 응용에서 이러한 프로세스에 사용되는 용매는 폴리스티렌 입자의 체적을 변화시키고 반응 컬럼의 폐색 및 배압을 일으킬 가능성이 있다.
반응성기가 폴리머 입자에 결합될 수 있도록 유도된 폴리머 입자, 예를 들면 폴리스티렌 입자는 많은 응용에 유용한 것이 증명되었다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 구조체는 넓은 범위의 용매와 혼화성을 가져 화학적으로 불활성 스페이서로서 사용되어 왔다.
하지만 PEG-PS 수지는 고분자량 PEG(예를 들면 분자량 400 초과)에서 반응이 불충분하게 진행되며, 대칭성 이관능 PEG는 가교를 형성하는 경향이 있다. 이러한 문제는 에틸렌 옥사이드가 가교된 폴리스티렌 상의 직접적인 음이온 중합에 의해 경감되지만, 이 방법 또한 PEG 연쇄 길이를 제어하기 어렵고 PEG 폴리머의 균일성이 부정확한 단점이 있다. 이러한 프로세스에 관한 또 다른 문제점은 폴리스티렌이 고도로 독성인 클로로메틸에테르를 사용하여 관능화되고 잔류 클로로메틸기는 펩타이드 합성 도중 부반응을 일으킬 가능성이 있다는데 있다.
이에 폴리에틸렌글리콜 유도체를 대체하면서 넓은 범위의 용매와 함께 사용할 수 있고 비독성으로 효과적인 고상 지지체를 제조하는 재료 및 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 다양한 용매와 함께 사용할 수 있고 비독성이면서 펩타이드 합성 및 온비드 바이오어세이(on-bead bioassay) 등에 효율이 개선된 코어-쉘형 그라프트 고상 지지체를 제공할 수 있는 스페이서로서 에틸렌글리콜 유도체와 코어-쉘형 그라프트 폴리머 지지체, 및 관련 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 고체상 응용을 위한 스페이서로서 하기 식 1으로 나타낸 에틸렌글리콜 유도체가 제공된다.
[식 1]
Figure 112018020673494-pat00001
(여기서 R1은
Figure 112018020673494-pat00002
,
Figure 112018020673494-pat00003
,
Figure 112018020673494-pat00004
,
Figure 112018020673494-pat00005
, -Cl, 또는 -Br 중에서 독립적으로 선택되며, n은 1 내지 4의 정수이다.)
본 발명의 다른 구현예에 따르면,
에틸렌글리콜 백본에 양 말단 아민기를 포함하는 디아민계 화합물을 숙시닐화하는 단계;
상기 숙시닐화 처리된 화합물에 Fmoc 커플링 반응시켜 타측 말단에 위치한 아민기에 Fmoc기를 비롯한 보호기를 결합하는 단계; 및
상기 숙시닐화에 의해 제공되는 카복시기에 활성화기를 결합하는 단계를 포함하는 에틸렌글리콜 유도체의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 에틸렌글리콜 유도체가 아미노폴리스티렌 고체 지지체에 공유결합하고 있는 그라프트 지지체가 제공된다. 상기 그라프트 지지체는 하기 식 2로 나타낸 코어-쉘 타입 양친성(amphiphilic) 중합체 지지체인 것이 반응성 자리가 쉘에 그라프트된 친수성 에틸렌글리콜 유도체에 위치하는 점에서 바람직하다.
[식 2]
Figure 112018020673494-pat00006
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면,
아미노메틸폴리스티렌 수지를 팽윤시키는 단계; 상기 식 1의 에틸렌글리콜 유도체를 사용하여 상기 팽윤된 아미노메틸폴리스티렌 수지의 바깥쪽 부분의 아민기를 보호시켜 쉘을 형성시키는 단계; 상기 쉘을 제외한 수지의 아민기를 아세틸화하여 코어를 형성시키는 단계; 및 상기 쉘의 층에 존재하는 에틸렌글리콜 유도체를 염기로 처리하여 상기 식 2의 그라프트 지지체를 제공하는 단계를 포함하는 코어-쉘형 폴리머 지지체를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 식 2의 그라프트 지지체를 포함하는 펩타이드 합성 방법 또는 온비드 바이오어세이 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면, 고체상 응용을 위한 스페이서로서 효과적인 에틸렌글리콜 유도체 및 이러한 에틸렌 글리콜로 그라프트된 지지체를 제공할 수 있다. 상기 그라프트 지지체는 고상 합성 기술에 의한 펩타이드 합성 및 온-비드 바이오어세이(on-bead bioassay) 방법에 응용하기에 유리한 물성을 부여하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 에틸렌글리콜 그라프트된 폴리스티렌(EG-PS) 지지체의 개략적인 구조를 나타낸다. X는 생체 폴리머 연결사슬의 성장이 시작되는 반응성 자리(reactive site)를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 일련의 스페이서 링커 제조를 유도하는 반응 개략도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 일련의 스페이서 링커를 사용한 아미노관능화된 폴리스티렌 수지로의 커플링 반응 개략도이다.
도 4는 도 3의 반응을 통해 수득된 그라프트 지지체(좌측 a)과 아미노메틸 폴리스티렌 수지(우측 b)를 공초점 형광현미경을 통해 촬영한 형광 사진이다.
도 5는 도 3의 반응을 통해 수득된 그라프트 지지체(상단부 a), 아미노메틸 폴리스티렌 수지(하단부 b)를 사용하여 각각 합성한 Jung-Redmann (J-R) 10-mer 펩타이드를 고성능 액체크로마토그래피로 분석한 결과이다. 도면 중 화살표는 펩타이드를 표시한다.
도 6은 아미노메틸 폴리스티렌 수지(상단부 AMPS resin), 폴리에틸렌글리콜로 그라프트 개질한 지지체(중간부 TentaGel resin), 그리고 도 3의 반응을 통해 수득된 그라프트 지지체(하단부 TEG SURE)를 온비드 바이오어세이(on-bead bioassay)를 통하여 세포결합 GRGDS 펩타이드와 GRGES 펩타이드를 음성 대조군으로 사용하여 세포 처리한 다음 세포 독성을 평가하도록 현미경을 통해 촬영한 사진이다.
이하, 본 발명에 대하여 도면을 참조하여 자세하게 설명한다.
본 발명은 고체 지지체에 공유결합된 관능화된 트리에틸렌 글리콜 유도체를 포함하고 구성되는 수지를 다양한 고체상 응용처에서 고체 지지체로 활용하는 기술에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 에틸렌글리콜 그라프트된 폴리스티렌(EG-PS) 지지체의 개략적인 구조를 나타낸다. X는 생체 폴리머 연결사슬의 성장이 시작되는 반응성 자리(reactive site)를 나타낸다.
상기 에틸렌글리콜 그라프트된 폴리스티렌(EG-PS) 지지체를 구성하며, 고체상 응용을 위한 스페이서로서 작용하는 에틸렌글리콜 유도체는 일례로 하기 식 1으로 나타낼 수 있다.
[식 1]
Figure 112018020673494-pat00007
(여기서 R1은
Figure 112018020673494-pat00008
,
Figure 112018020673494-pat00009
,
Figure 112018020673494-pat00010
,
Figure 112018020673494-pat00011
, -Cl, 또는 -Br 중에서 독립적으로 선택되며, n은 1 내지 4의 정수이다.)
일례로, 상기 n은 2 내지 3의 정수일 수 있고, 특히 3인 것이 지지체의 표면 작용기의 적재 수준(loading level)을 정밀하게 제어할 수 있고, 원하는 소수성/친수성/양친성 효과를 제공할 수 있어 서열 함유 펩타이드 합성, 및 온비드 바이오어세이에 적용하기에 바람직하다.
일례로, 상기 R1은 펩타이드가 결합할 수 있는 작용기일 수 있다.
구체적인 예로, 상기 R1은 6-클로로-1-히드록시벤조티아졸(HOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 3-히드록시-3,4-디히드록-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), p-니트로페놀, SOCl2, SOBr2, DIC 등을 사용하여 제공할 수 있다.
상기 에틸렌글리콜 유도체는 폴리스티렌 지지체에 그라프트되어 스페이서 링커로 작용할 수 있다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 일련의 스페이서 링커 제조를 유도하는 반응 개략도이다. 참고로, 이하 반응식 1은 식 1중 R1이 벤조트리아졸인 경우에 해당한다.
[반응식 1]
Figure 112018020673494-pat00012
상기 반응에서 도식화한 것과 같이, 상기 식 1의 에틸렌글리콜 유도체(Activated Fmoc-Ttds, 이하 Fmoc-Ttds-Act라고도 칭함, 9-fluorenylmethoxycarbonyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecancediamine succinimicacid benzotriazolyl ester)는 다음과 같은 3단계로 합성될 수 있다:
즉, 에틸렌글리콜 백본에 양 말단 아민기를 포함하는 디아민계 화합물을 숙시닐화한다. 구체적으로는, 에틸렌글리콜 백본에 양 말단 아민기를 포함하는 디아민계 화합물을 숙신산 무수물과 테트라하이드로퓨란으로 처리하여 일측 말단에 위치한 아민기에 숙시닐화를 통해 카복시기를 결합시킬 수 있다. 상기 단계에서는 디클로로메탄(DCM), 테트라하이드로퓨란(THF), 클로로포름, 톨루엔 등과 같은 소수성 용매를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 숙신산 무수물은 글루타르산 무수물 또는 아디프산 무수물로 대체할 수 있다.
상기 숙시닐화 처리된 화합물에 Fmoc 커플링 반응시켜 타측 말단에 위치한 아민기에 Fmoc기를 결합한다. 구체적으로, Fmoc-OSu(fluorenylmethyloxycarboyl,
Figure 112018020673494-pat00013
), NaHCO3, H2O, 테트라하이드로퓨란, DCM과 Fmoc 커플링 반응시켜 타측 말단에 위치한 아민기에 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 기를 보호기로서 결합할 수 있다. 상기 단계에서 DCM, THF, 클로로포름, 톨루엔 등과 같은 소수성 용매를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 숙시닐화에 의해 제공되는 카복시기에 활성화기를 결합하게 된다. 구체적으로는, N,N'-디이소프로필 카르보디이미드(DIC)와 펩타이드가 결합할 수 있는 작용기를 제공할 수 있는 작용기를 포함하는 제제를 반응시켜 상기 카복시기에 해당 작용기를 결합하고 활성화시킬 수 있다. 여기서 펩타이드가 결합할 수 있는 작용기는 6-클로로-1-히드록시벤조티아졸(HOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 3-히드록시-3,4-디히드록-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), HOSu(N-hydroxysuccinimide), p-니트로페놀, SOCl2, SOBr2 또는 DIC 등을 사용하여 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 식 1로 나타낸 에틸렌글리콜 유도체가 아미노폴리스티렌 고체 지지체에 공유결합하고 있는 그라프트 지지체가 제공된다. 상기 그라프트 지지체는 하기 식 2로 나타낸 코어-쉘 타입 양친성(amphiphilic) 중합체 지지체인 것이 반응성 자리가 쉘에 그라프트된 친수성 에틸렌글리콜 유도체에 위치함에 따라 쉘 층에서만 펩타이드가 생성되기 때문에 펩타이드의 합성 효율과 수율이 증대되는 점에서 바람직하다. 참고로, 펩타이드 합성을 예로 들면, 지지체의 중심 코어 부분에 아민기가 활성화되어 있으면 지지체의 중심부에서도 펩타이드 합성이 부분적으로 진행되며, 이 경우 중심 코어부분의 입체 장애로 인하여 원하는 펩타이드를 높은 순도로 합성하기 어렵게 된다. 이로 인해 원치않는 펩타이드가 합성될 뿐 아니라 이로 인한 반응물질의 낭비가 발생할 수 있다.
[식 2]
Figure 112018020673494-pat00014
상기 식 2에서, NH-Ttds-NH2는 지지체의 쉘 부분에, 그리고 NH-Ac는 지지체의 코어 부분에 각각 위치하는 것을 형상화한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 코어-쉘 구조의 지지체는 소수성 펩타이드 합성에 매우 유용할 뿐 아니라 친수성 말단이 신경원의 세포막 양표면에, 소수성 말단이 세포막 안쪽으로 향해있는 인지질의 이중막 구조로 되어 있어 양친성이 요구되는 인간 신경 펩타이드의 합성에도 유용하다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 코어-쉘 구조의 그라프트 폴리머 지지체를 제조하는 방법이 제공된다. 도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 일련의 스페이서 링커를 사용한 아미노관능화된 폴리스티렌 수지로의 커플링 반응 개략도이다.
도 3에서 보듯이, 아미노메틸폴리스티렌 수지를 팽윤시키고, 상기 식 1의 에틸렌글리콜 유도체를 사용하여 상기 팽윤된 아미노메틸폴리스티렌 수지의 바깥쪽 부분의 아민기를 보호시켜 쉘을 형성시킨다.
그런 다음 상기 쉘을 제외한 수지의 아민기를 아세틸화하여 코어를 형성시키며, 상기 쉘의 층에 존재하는 에틸렌글리콜 유도체를 염기 처리하여 상기 식 2의 그라프트 지지체를 제공할 수 있다.
구체적인 제조방법으로서, 상기 아미노메틸폴리스티렌 수지를 팽윤시키는 단계에서는, 아미노메틸폴리스티렌 수지를 염산과 테트라하이드로퓨란으로 처리함으로써 해당 수지를 팽윤시킬 수 있다.
그런 다음 상기 식 1의 에틸렌글리콜 유도체를 사용하여 상기 팽윤된 아미노메틸 폴리스티렌 수지의 바깥쪽 부분의 아민기를 보호시켜 쉘을 형성하게 된다. 일례로 수지의 바깥쪽 부분의 아민기에 Fmoc(fluorebylmethyloxycarbonyl)기를 결합시켜 상기 아민기를 보호할 수 있다. 구체적으로는, 팽윤된 아미노폴리스티렌 수지와 상기 식 1의 에틸렌글리콜 유도체(예를 들면, Fmoc-Ttds-Act, 9-fluorenylmethoxycarbonyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecancediamine succinimicacidbenzotriazolyl ester) 및 DIPEA(N,N'-디이소프로필에틸아민)을 반응시켜 상기 아민기에 Fmoc 포함 보호기로서 식 1의 에틸렌글리콜 유도체(예를 들어 Fmoc-Ttds-Act)를 결합시킬 수 있다.
상기 단계에서는 DCM, THF, 클로로포름, 톨루엔을 비롯한 소수성 유기용매를 사용하는 것이 바람직한 것으로, 상기 반응은 용매와 수지의 극성 차이로 인하여 용매와 수지의 계면에서 반응이 진행된다. 또한 상기 아미노폴리스티렌 수지의 바깥쪽 아민기가 Fmoc 포함 보호기로서 식 1의 에틸렌 글리콜 유도체(예를 들어, Fmoc-Ttds-Act)로 보호되면서 온화한 조건에서 간단하게 코어/셀 구조가 형성되는 이점이 있다.
특히 상기 Fmoc 포함 보호기로서 식 1의 에틸렌 글리콜 유도체와 DIPEA의 양을 달리함에 따라 생성되는 지지체의 쉘 두께가 변화하게 되며, 따라서 다양한 두께의 쉘을 갖는 지지체를 제조할 수 있다.
그런 다음 상기 쉘을 제외한 수지의 아민기를 아세틸화하여 코어를 형성시키게 된다. 구체적으로는 아세트산 무수물과 DIPEA를, DMF 또는 NMP(1-메틸-2-피롤리돈)과 반응시켜 상기 수지의 중심부에 존재하는 아민기를 아세틸화시킬 수 있다.
마지막으로, DMF 또는 NMP 용매 내에서 수득된 수지를 염기로 처리하면 Fmoc기를 제거하고 식 2로 나타낸 코어-쉘 구조의 그라프트 지지체를 얻을 수 있다. 여기서 사용하는 염기는 일례로 4-아미노에틸-피페리딘, 피페리딘, 트리스(2-아미노에틸)아민 등일 수 있다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 일련의 스페이서 링커를 사용한 아미노관능화된 폴리스티렌 수지로의 커플링 반응 개략도이다.
[반응식 2]
Figure 112018020673494-pat00015
상기 반응식 2에서 보듯이, 본 발명에 따른 코어-쉘 구조의 그라프트 지지체는 온화한 조건하에 반응이 진행될 수 있다.
결과 수득된 상기 식 2의 그라프트 지지체는 양친성(amphiphilic) 중합체 지지체로서, 반응성 자리가 쉘에 그라프트된 친수성 에틸렌글리콜 유도체에 위치함에 따라 쉘 층에서만 펩타이드가 생성되기 때문에 펩타이드의 합성 효율과 수율이 증대되는 점에서 펩타이드 합성에 적용하기 바람직하다.
구체적으로, 본 발명에서 제작된 그라프트 지지체는 고상 응용에 바람직한 특징을 갖는 것으로, 다양한 용매 중에서 팽윤하고 대부분의 고상 합성에 사용되는 조건하에 안정적이며 고상 응용, 특히 고상 펩타이드 합성에 사용되는 배치 및 컬럼 반응기의 양쪽 모두에서 잘 동작할 수 있다.
상기 고상 펩타이드 합성은 전형적으로는 제1 아미노산의 고체 지지체로의 카르복실 말단의 공유결합으로 시작된다. Nα 보호된 아미노산의 카르복실기는 스페이서의 유리 말단(고체 지지체에 결합하고 있지 않는 말단) 상의 아미노기에 결합되어 있는 부분에 공유결합할 수 있다(도 1 참조). 일단 결합되면, 일반적인 합성 사이클을 진행한다. 상기 합성 사이클은 일반적으로 수지상 아미노산 또는 펩타이드의 Nα-아미노기의 탈보호, 세척 및 만약 필요하면 중화 단계 및 그에 계속되는 다음 Nα 보호된 아미노산의 카르복실 활성화된 형태와의 반응으로 구성된다. 이 사이클을 반복하여 흥미가 있는 펩타이드 또는 단백질을 생성시킨다. 관능화된 불용성 지지체를 사용하는 고상 펩타이드 합성 방법은 잘 알려져 있다. 상기 펩타이드는 소수성 펩타이드, 친수성 펩타이드, 양쪽성 펩타이드일 수 있고, 특히 본 발명의 지지체는 인간 신경 펩타이드에도 유용하다. 참고로 신경 펩타이드는 신경계에서 발견되는 모든 펩타이드를 총칭하며, 현재 백여종의 물질들이 밝혀져 있다. 3개의 아미노산으로 구성된 갑상선 분비 호르몬으로부터 200여개의 아미노산으로 구성된 황체 자극 호르몬, 성장 호르몬, 프로락틴까지 크기가 다양하다. 이들은 하나의 신경세포 말단에서 다른 신경전달물질들과 공존하여 다른 신경전달 물질들의 분비를 조절하기도 하고 독자적인 수용체를 갖고 고유의 기능을 나타내기도 한다. 즉 일부는 신경조절물질로 그리고 일부는 신경전달물질로 작용한다. 이러한 신경 펩타이드는 소수성 및 친수성을 모두 필요로 할 수 있으며, 따라서 양친성 그라프트 지지체는 고상 합성 기술에 의한 펩타이드 합성에 유용하다(도 5 참조).
이뿐 아니라 수득된 상기 식 2의 그라프트 지지체는 양친성(amphiphilic) 중합체 지지체로서, 반응성 자리가 쉘에 그라프트된 친수성 에틸렌글리콜 유도체에 위치함에 따라 온비드 바이오어세이에서 요구되는 세포와 지지체 사이의 소수성 상호작용을 억제하기에 충분한 것을 확인하였으며, 그 결과 온비드 바이오어세이에 유용하다(도 6 참조).
이하 다음 실시예 또는 도면을 들어 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나 첨부된 실시예 또는 도면은 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 이에 한정하는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1: Fmoc 포함 보호기로서 식 1의 에틸렌글리콜 유도체 제조
<Fmoc-Ttd 합성>
500mL 둥근 바닥 플라스크에 4,7,10-트리옥사-1,13-트리데칸디아민 (11.015g, 50mmol, 1.0 당량)을 THF (20mL)에 용해시켰다. 상기 반응 혼합물을 얼음 배쓰에서 교반하고 THF (140 mL) 중의 숙신산 무수물(5.504g, 55mmol, 1.1 당량)을 점적 첨가하였다. 적하 종료 후, 얼음 배쓰를 제거하고 실온에서 3hr 반응시켰다. 백색 점착성 화합물을 확인한 다음 THF로 3 회 세척하였다.
상기 둥근 바닥 플라스크에 H2O (140mL)과 THF (15mL) 중의 중탄산나트륨 (6.452g, 76.8mmol, 1.54 당량)을 붓고, 얼음 배쓰에서 교반하면서 DCM (100mL) 중의 Fmoc-OSu (12.952g, 38.4mmol, 0.77 당량)을 점적 첨가하였다. 그런 다음 얼음 배쓰를 제거하고 실온에서 밤새 반응시켰다. 이후 유기 용제를 증발시켰다.
원하는 화합물을 추출하도록, EtOAc (약 200mL)과 물 (약 200mL)을 첨가하고 전체 혼합물을 분별 깔때기로 옮겼으며, 수층을 EtOAc로 3회 이상 세척하고 잔여 출발 물질을 제거하였다. 수층의 pH가 약 2에 도달할 때까지 수층을 3N HCl을 사용하여 산성 처리하였으며, 생성물을 EtOAc (500mL)로 추출하고 3회 수세하고 유기층을 MgSO4로 건조시켜 감압 증발시키고 Fmoc-Ttd를 수득하였다 (5.782g, 10.66mmol, 수율 21.3 %).
< Fmoc-Ttds-Act의 제조>
앞서 수득된 Fmoc-Ttd (1.02g, 1.88mmol, 1.0 당량)을 DCM (30mL)에 용해시킨 다음 HOBt (761mg, 5.64mmol, 3.0 당량) 및 DIC (887μL, 5.64mmol, 3.0 당량)을 첨가하고 혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 더 이상 정제하지 않은 상태로 반응한 다음 증발시켰다.
결과 수득된 Fmoc-Ttds-Act는 하기 식으로 나타내는 물질인 9-fluorenylmethoxy-carbonyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine succinimic acid benzotriazolyl ester이었다.
[식 3]
Figure 112018020673494-pat00016
실시예 2: Fmoc 포함 보호기를 이용한 코어-셀 수지의 제조
1N HCl/THF (1:1, v/v, 12mL)에 AMPS 수지 (1g, 충전 레벨 : 0.94 mmol/g)를 24hr 팽윤시키고, 1N HCl/THF로 3회 세척하였다. Fmoc-Ttds-Act (2.0 당량) 및 DIPEA (2.0 당량)을 DCM (14mL)에 용해시킨 다음 산-처리된 수지에 첨가하고 밤새 교반하였다.
반응 후 수지를 DMF, DCM 및 MeOH로 각각 2회 세척하였다. 수지의 잔류 아민기를 아세틸화하기 위해, 수지를 DMF (13.5mL) 중 아세트산 무수물 (750μL)과 DIPEA (750μL)의 혼합물로 2hr 처리하였다. 상기 수지를 DMF, DCM 및 MeOH로 각각 2회 세척하여 아세틸화의 반응 종결을 카이저 닌히드린 테스트로 확인하였다.
상기 수지를 20 % 피페리딘/DMF (v/v) 용액 (15mL)에서 1hr 처리하여 Fmoc 기를 제거하고, DMF, DCM 및 MeOH로 각각 2 회 세척하였다. 수득된 수지(TEG SURE)를 사용하기에 앞서 감압 건조시켰다. 상기 TEG SURE의 적재(loading) 수준은 0.61 mmol/g이었다.
참고예 1: 종래의 AMPS 수지와 본 발명의 코어-쉘 수지의 공초점 형광사진 대비
코어-쉘 구조를 확인하도록, AMPS 수지와 본 발명의 코어-쉘 수지 각 10mg에 형광물질로 사용되는 FITC(5-fluorescein isothiocyanate, 시그마사 구입) 2당량과 DIPEA 4 당량을 18시간 동안 처리하였다. 반응 후 수지를 DMF, DCM 및 메탄올로 완전히 세척하고 진공 건조한 다음 공초점 형광현미경(CLSM)을 이용하여 수지의 형광사진을 촬영하였다(도 4).
도 4의 (a)는 본 발명의 코어-쉘 수지의 사진이고, (b)는 AMPS 수지 사진이다. 도 4에서 보듯이, 본 발명의 수지는 명백한 코어-쉘 구조를 갖는 것은 확인할 수 있었다.
참고예 2: 쉘 두께 조절이 가능한 코어-쉘 수지의 제조
Fmoc-Ttds-Act와 DIPE의 농도를 조절하여 실시예 2에서와 같은 방식으로 여러가지 코어-쉘 수지를 제조하였다. 제조된 코어-쉘 수지의 Fmoc-Ttds-Act의 함량 대비 적재량을 Fmoc 적정법으로 측정하고 하기표 1에 나타내었다.
Fmoc-Ttds-Act 함량(당량) 0.5 equiv. 1.0 equiv. 1.5 equiv. 2.0 equiv.
수지 표면의 적재 수준(mmol/g) 0.12 0.32 0.45 0.61
상기 표 1에서 보듯이, 약 40%의 Fmoc-Ttds-Act가 수지상에 커플링된 것으로 확인되었으며, 이로부터 Fmoc-Ttds-Act 함량과 수지 표면의 적재 수준간 높은 비례특성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로, Tmoc-Ttds-Act 함량 제어에 따라 다양한 적재 수준의 TEG SURE 지지체를 제작할 수 있음을 확인하였다.
참고예 3: 종래의 AMPS 수지와 본 발명의 코어-쉘 수지의 다양한 용제에 대한 부피팽창률 대비
용제에 대한부피팽창률을 확인하도록, AMPS 수지와 본 발명의 코어-쉘 수지 에 용제로서 물, 메탄올, DMF, NMP, DCP에 투입하고 부피 팽창률을 측정하였다.
측정 결과를 하기표 2에 정리하였다.
팽윤 부피(ml/g)
용제 물 메탄올 DMF NMP DCM
TEG SURE 2.0 2.8 6.8 6.5 8.0
AMPS 수지 1.4 2.6 5.5 6.0 4.5
상기 표 2에서 보듯이, 본 발명에 따른 코어-쉘 수지 TEG SURE는 DMF, NMP에 대하여는 AMPS 수지와 유사한 정도의 팽창률을 보였다.
본 발명에 따른 코어-쉘 수지 TEG SURE 또한 물에 잘 팽윤되지 않았으나 물에 잘 분산된 반면 AMPS 수지는 물에 혼화되지 않는 결과를 보였고, 이로부터 TEG SURE의 표면 친수성은 표면 그래프트된 TEG 스페이서로 인해 AMPS 수지 대비 증가하였음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명에 따라 제작된 TEG SURE 코어-쉘 수지는 물에서의 생물학적 분석을 필요로 하는 수성 환경과 충분히 호환되는 것으로 확인되었다.
실시예 3. 종래의 AMPS 수지와 본 발명의 코어-쉘 수지의 펩타이드 합성 대비
실시예 2에서 제조된 코어-쉘 수지 TEG-SURE 수지(200mg, 적재 수준: 0.61 mmol/g)를 이용하여 링커를 도입한 후 10-머(mer) 펩타이드인 Jung-Redmann 10-머(JP 10-mer, H0WFTTLISTIM-NH2)를 합성하였다.
상기 코어-쉘 수지 200mg와 AMPS 수지 200mg에, Fmoc기로 아민기가 ㅂ호되어 있는 링크아미드 링커(Rink amide linker, 4-[(2,4-dimethoxyphenyl)(Fmoc-amino)methyl]phenoxyacetic acid)을 HBTU (o-(benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyl uronium hexafluorophosphate), HOBt(1-hydroxybenzotriazole), DIPEA를 이용하여 NMP 용매 하에 도입하였다.
각 수지들을 NMP 용매에서 미리 팽윤시켜 준 다음 링크 아미드 링커(3 당량), BOP(3당량), HOBt(3 당량), DIPEA(6당량)를 NMP에 가하여 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응 종결을 카이저 테스트로 확인한 후 DMF, DCM, 메탄올 순서로 3회 세척한 다음 진공 오븐에서 건조하였다.
아민기를 보호하고 있는 Fmoc기를 제거하기 위하여, 20% 피페리딘/NMP 용액으로 1시간 동안 처리하였다.
이하의 커플링/탈보호 단계를 반복하여 펩타이드 서열을 링크 아미드 링커(Rink amide linker)가 결합된 수지상에 합성하였다:
i) 커플링 단계; 상기 수지들을 DMF (3mL) 중 Fmoc-아미노산 (3 당량), BOP (3 당량), HOBt (3 당량) 및 DIPEA (6 당량)의 용액에서 1 시간 동안 처리하였다.
ii) 탈보호 단계; 각 수지를 20% 피페리딘/DMF (v/v) 용액 (3mL)에서 30 분간 처리하였다. 각 커플링/탈보호 단계 이후 상기 수지를 DMF, DCM 및 MeOH로 3 회 세척하였다.
전체 펩타이드 서열을 합성한 다음 각 수지를 TFA : 페놀 : TIPS : 물 (88 : 5 : 5 : 2, v/v, 3mL) 용액으로 2시간 동안 처리하여 펩타이드를 수지에서 분리하고 보호기를 측쇄에서 제거하였다.
상기 반응 용액을 증발시켜 얻어진 펩타이드에 디에틸에테르를 가하여 침전시켰다. 상청액을 원심분리 후 가만히 따라내고, 잔여 펩타이드를 디에틸에테르로 3 회 원심 분리하여 세척하고 감압 건조시켰다.
합성한 펩타이드를 고성능 액체크로마토그래피(용매A: 0.1% 트리플루오로아세트산 함유 증류수; 용매B: 0.1% 플루오로아세트산 함유 아세토니트릴; 유속 1.0 ml/min으로 30분 동안 그래디언트 조건, 용매 B의 농도는 10~60%이고, 용매 B로 10분간 일정하게 흘림; 컬럼은 SPIRIT PEPTIDE 120 C18 zjffja(5mm, 250mm x 4.6mm); 흡수파장 230nm과 260nm으로 측정)와 MALDI-TOF 질량분석기로 분석하였다.
각각의 코어-쉘 수지와 AMPS 수지에서 합성된 펩타이드의 순도를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보듯이, 본 발명에 따른 코어-쉘 수지 TEG-SURE의 경우 AMPS 수지대비 약 2배 높은 순도를 확인하였으며(도 5의 상부 40%와 하부 22% 참조), 따라서 본 발명에 따라 제작된 코어-쉘형 TEG-SURE는 AMPS 수지와 같은 겔 타입 수지 대비 순도가 높은 서열 함유 펩타이드 합성에 우수한 성능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 인간 신경 펩타이드 합성 실험
추가로, 상기 실시예 3과 동일한 동일한 반응 조건하에 상이한 적재 수준(0.61 mmol/g, 0.48 mmol/g)의 코어-쉘형 TEG-SURE를 사용하여 신경 펩타이드로서 NPY6-20 아미드 (HDNPGEDAPAEDMARY-NH2)와 NPY21-36 아미드 (HYSALRHYINLITRQRY-NH2)를 각각 합성하고 수율과 순도를 확인하였다.
그 결과, NPY 6-20 아미드에 대한 수율은 각각 82 %, 81 %로 유사하였고, 순도 또한 각각 62 %, 61 %로 유사한 것을 확인하였다. 또한 NPY 21-36 아미드에 대한 수율은 각각 78 %, 75 %로 유사하였으며 다만 순도는 71 %, 59 %로서 약간 차이가 있음을 확인하였다.
이러한 결과로부터, 본 발명의 수지 상에 펩타이드와의 결합 효율은 수지의 적재 수준보다는 수지 표면의 에틸렌 글리콜 유도체의 함량에 더욱 의존하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5.온비드 바이오어세이 실험
GRGDS 펩타이드(Gly-Arg-Gly-Asp-Ser 5-mer 펩타이드)와 GRGES 펩타이드(Gly-Arg-Gly-Glu-Ser 5-mer)를 AMPS 수지 (20 mg, 0.94 mmol/g), TentaGel 수지 (20 mg, 0.29 mmol/g) 및 TEG SURE (20 mg, 0.37 mmol/g) 상에서 Fmoc 케미스트리로 합성하였다.
전체 서열을 합성한 다음, 각각의 수지를 TFA : 물 (95 : 5, v/v, 3mL) 용액으로 2 시간 동안 처리하였다. 상기 수지에서 5-mer 펩타이드를 합성한 다음, 상기 NIH 3T3 세포 (100,000 cells/mL)를 트립신 처리하여 펩타이드 결합된 비드(약 5mg)과 함께 96 웰 플레이트의 배지에서 2 일간 배양하였다.
상기 비드 표면을 광학 현미경을 사용하여 펩타이드 매개 세포 확산을 관찰하였으며, 촬영된 사진을 도 6에 나타내었다. 도 6의 상단부 도면에서 보듯이, 펩티드 서열에 관계없이 세포는 GRGDS 및 GRGES 상에 부착되었으며, AMPS 수지는 세포와 AMPS 수지 사이의 소수성 상호 작용으로 인해 비특이적으로 혼입되었다. 상기 AMPS 수지와 달리 GRGES가 TEG SURE(하단부 도면)와 TentaGel 수지(중단부 도면)에 붙어있는 세포를 최소한으로 부착하는 것이 관찰되었다.
이러한 결과로부터, 쉘층의 에틸렌글리콜 유도체 단위가 세포와 지지체 사이의 소수성 상호 작용을 억제하기에 충분하다는 것을 확인할 수 있었다.
결과적으로, 본 발명의 그라프트 지지체에 따르면 에틸렌글리콜 유도체(예를 들어 Fmoc-Ttds-Act)의 양을 조절하여 표면 작용기의 적재 수준을 정밀하게 조정할 수 있고, 서열-함유 펩타이드의 합성에서 우수한 성능을 나타낼 뿐 아니라 더 긴 펩타이드인 펜타 데카 (pentadeca-) 및 헥사데카 (hexadeca-) 펩타이드에 대해서도 양호한 수율 및 순도로 합성되는 것을 확인하였다. 본 발명의 그라프트 지지체는 온비드 바이오어세이에도 유용하다.

Claims (13)

  1. 고체상 응용을 위한 스페이서로서, 하기 식 1로 나타낸 에틸렌글리콜 유도체:
    [식 1]
    Figure 112018020673494-pat00017

    (여기서 R1은
    Figure 112018020673494-pat00018
    ,
    Figure 112018020673494-pat00019
    ,
    Figure 112018020673494-pat00020
    ,
    Figure 112018020673494-pat00021
    , -Cl, 또는 -Br 중에서 독립적으로 선택되며, n은 1 내지 4의 정수이다.)
  2. 에틸렌글리콜 백본에 양 말단 아민기를 포함하는 디아민계 화합물을 숙시닐화하는 단계;
    상기 숙시닐화 처리된 화합물에 Fmoc 커플링 반응시켜 타측 말단에 위치한 아민기에 Fmoc기를 비롯한 보호기를 결합하는 단계; 및
    상기 숙시닐화에 의해 제공되는 카복시기에 활성화기를 결합하는 단계를 포함하는 에틸렌글리콜 유도체의 제조방법.
  3. 제2 항에 있어서,
    상기 숙시닐화 단계는 에틸렌글리콜 백본에 양 말단 아민기를 포함하는 디아민계 화합물을 숙신산 무수물과 소수성 용매로 처리하여 일측 말단에 위치한 아민기에 숙시닐화를 통해 카복시기를 결합시키는 것인 에틸렌글리콜 유도체의 제조방법.
  4. 제2 항에 있어서,
    상기 Fmoc 함유 보호기 결합 단계는 Fmoc-OSu(fluorenylmethyloxycarboyl), NaHCO3, H2O, 소수성 용매와 Fmoc 커플링 반응시켜 아민기에 Fmoc 기를 결합하는 것인 에틸렌글리콜 유도체의 제조방법.
  5. 제2 항에 있어서, 상기 활성화기는 상기 숙시닐화 처리에 의해 제공되는 카복시기에 6-클로로-1-히드록시벤조티아졸(HOBt), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 3-히드록시-3,4-디히드록-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt), HOSu(N-hydroxysuccinimide), p-nitrophenol 및 Cl, -Br 로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상을 결합하고 활성화하는 것인 에틸렌글리콜 유도체의 제조방법.
  6. 에틸렌글리콜 유도체가 아미노폴리스티렌 고체 지지체에 공유결합하고 있는 그라프트 지지체로서,
    상기 에틸렌글리콜 유도체는 하기 식 1로 나타낸 화합물이고, 상기 그라프트 지지체는 하기 식 2로 나타낸 것인 코어-쉘형 그라프트 지지체.
    [식 1]
    Figure 112018020673494-pat00022

    (여기서 R1은
    Figure 112018020673494-pat00023
    ,
    Figure 112018020673494-pat00024
    ,
    Figure 112018020673494-pat00025
    ,
    Figure 112018020673494-pat00026
    , -Cl, 또는 -Br 중에서 독립적으로 선택되며, n은 1 내지 4의 정수이다.)
    [식 2]
    Figure 112018020673494-pat00027
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 그라프트 지지체는 고체상 합성에 의한 펩타이드 합성 혹은 온비드 바이오어세이에 적용되는 것인 코어-쉘형 그라프트 지지체.
  8. 제7 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 소수성 펩타이드 또는 신경 펩타이드인 것인 코어-쉘형 그라프트 지지체.
  9. 아미노메틸폴리스티렌 수지를 팽윤시키는 단계;
    하기 식 1의 에틸렌글리콜 유도체를 사용하여 상기 팽윤된 아미노메틸폴리스티렌 수지의 바깥쪽 부분의 아민기를 보호시켜 쉘을 형성시키는 단계;
    상기 쉘을 제외한 수지의 아민기를 아세틸화하여 코어를 형성시키는 단계; 및 상기 쉘의 층에 존재하는 에틸렌글리콜 유도체를 염기로 처리하여 Fmoc 부분을 제거하고 하기 식 2의 그라프트 지지체를 제공하는 단계를 포함하는 코어-쉘형 그라프트 지지체 제조방법:
    [식 1]
    Figure 112019018381218-pat00028

    (여기서 R1은
    Figure 112019018381218-pat00029
    ,
    Figure 112019018381218-pat00030
    ,
    Figure 112019018381218-pat00031
    ,
    Figure 112019018381218-pat00032
    , -Cl, 또는 -Br 중에서 독립적으로 선택되며, n은 1 내지 4의 정수이다.)
    [식 2]
    Figure 112019018381218-pat00033
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 팽윤은 상기 아미노메틸폴리스티렌 수지를 염산과 테트라하이드로퓨란으로 처리하는 것인 코어-쉘형 그라프트 지지체의 제조방법.
  11. 제9 항에 있어서,
    상기 팽윤된 아미노메틸폴리스티렌 수지의 바깥쪽 부분의 아민기를 보호시켜 쉘을 형성하는 것은 팽윤된 아미노메틸폴리스티렌 수지와 에틸렌글리콜 유도체 및 N,N’-디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 반응시켜 수행되며, 여기서 에틸렌글리콜 유도체의 함량에 따라 다양한 적재 수준의 그라프트 지지체를 제작하는 것인 코어-쉘형 그라프트 지지체의 제조방법.
  12. 제9 항에 있어서,
    상기 아세틸화는 아세트산 무수물과 DIPE; 그리고 NMP 또는 DMF를 사용하는 것인 코어-쉘형 그라프트 지지체의 제조방법.
  13. 제9 항에 있어서,
    상기 염기는 4-아미노에틸-피페리딘, 피페리딘 및 트리스(2-아미노에틸)아민으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상을 사용하여 Fmoc 부분을 제거하는 것인 코어-쉘형 그라프트 지지체의 제조방법.
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