DE19635768A1 - Methacryloyl-Gruppen enthaltende polymere Trägersysteme, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in Festphasenreaktionen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein neues polymeres Trägermaterial, das die Methacryloyl-Gruppe in folgender allgemeinen Formel enthält

worin
F ein natürliches, halbsynthetisches oder synthetisches polymeres Trägermaterial bedeutet,
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Halogen bedeuten,
R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Alkyl oder Aryl bedeuten,
S eine Verknüpfungsgruppierung (Spacer) bedeutet, ausgewählt unter Alkylen, -NH-, -NR-, oder -O- (Ester), und
X eine zur Verknüpfung geeignete Gruppe, ausgewählt unter Hydroxyl, Halogen, Sulfonat, Phosphonat, Azido, Amino, Alkoxy, Thioether, Amido oder Acyloxy, wobei Acyl den Rest einer Carbonsäure darstellt,
und die Methacryloyl-Gruppe über die Carbonylgruppe gebunden ist, eignet sich für Reaktionen zur Synthese organischer Verbindungen, insbesondere für eine Synthese von geschützten und ungeschützten Peptiden, Oligosacchariden, Glycopeptiden, Nucleotiden oder Proteinen an löslichen oder unlöslichen Trägermaterialien.

Die Erfindung betrifft Festphasensysteme, die Methacryloyl-Gruppen als Ankergruppierungen enthalten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Synthese organischer Verbindungen, insbesondere von geschützten und ungeschützten Peptiden, Oligosacchariden, Glycopeptiden, Nucleotiden und Proteinen.

Die gezielte Synthese von organischen Verbindungen an polymeren Trägern gewinnt angesichts der zunehmenden Anforderungen an Pharmaka, Lebensmittelzusatzstoffe und andere Wirkstoffe hinsichtlich der Selektivität der Wirkung, der Verträglichkeit und der biologischen Abbaubarkeit stark an Bedeutung (zum Stand der organischen Festphasensynthese vgl. z. B. J. S Früchtel u. G. Jung, Angew. Chem. 108, 4001 (1996); Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35, 17-42 (1996)). Trotz der nunmehr hoch entwickelten gentechnologischen Techniken gilt dies auch für die chemische Synthese z. B. von Peptiden, durch die allein z. B. Peptide mit nicht-natürlichen Bausteinen und Strukturelementen zugänglich sind.

Für den chemischen Aufbau von Peptiden bedeutete die Einführung der Festphasensynthese nach R. B. Merrifield (R. B. Merrifield, J. Chem. Soc. 85, 2149 (1963)) einen großen Fortschritt. Das gilt trotz der inzwischen erkannten Probleme, die bei diesen Festphasen-Peptidsynthesen hinsichtlich der Reinheit der synthetisierten Produkte immer wieder auftreten.

Als Ankergruppierung zur Befestigung der C-terminalen Aminosäure auf dem Träger dienen verschiedenste Systeme, die nach erfolgter Synthese eine Abspaltung des Peptids hydrogenolytisch, photolytisch, unter basischen Bedingungen oder acidolytisch erlauben. Eine selektive Abspaltung vom Träger ohne gleichzeitige Abspaltung der Aminosäureseitenketten-Schutzgruppen ist unter diesen Bedingungen nicht möglich. Es entstehen vielmehr an den Drittfunktionen voll oder teilweise entschützte Peptide, die daher für weitere peptidchemische Aufbaureaktionen nicht mehr benutzt werden können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Trägersystemen zur Synthese organischer Verbindungen, insbesondere zur Festphasensynthese von Peptiden, Glycopeptiden, Oligonucleotiden und Oligosacchariden, bei denen die Produkte selektiv und unter solchen milden Bedingungen vom polymeren Träger abgespalten werden können, daß Schutzgruppen auf den Endprodukten verbleiben und Nebenreaktionen der Ankerverbindung mit den Endprodukten in Lösung weitgehend unterbleiben.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Methacryloyl-Gruppen enthaltendes polymeres Trägersystem gemäß Anspruch 1, in dem die Methacryloyl-Gruppen an ein lösliches oder unlösliches, synthetisches oder natürliches Polymer gebunden sind, mit der allgemeinen Formel (I).

Die Art des Spacers richtet sich dabei vor allem nach dem ausgewählten Trägermaterial. X kann eine Hydroxyl, Halogen, eine Sulfonat-, eine Phosphonat-, eine Azido-, eine Amino-, eine Thioether-, eine Alkoxygruppe sein, worin Alkyl der Rest eines Nucleotids oder Saccharids sein kann, eine Amido- oder eine Acyloxygruppe sein, worin Acyl den Rest einer Carbonsäure oder den Rest RCO-, mit R als einen organischen Rest bezeichnet, und RCO- insbesondere der geschützte oder ungeschützte Rest einer Aminosäure, eines Peptids, Glycopeptids, sein kann. Unter einem Peptidrest kann hierbei auch ganz allgemein der Rest eines Proteins, z. B. ein Enzym verstanden werden.

Für das natürliche oder synthetische polymere Trägermaterial geht man vorzugsweise von einem solchen Trägermaterial aus, das funktionelle Gruppen aufweist, die sich gut für die Umsetzung mit der die Methacrylgruppierung tragenden Verbindung eignen, wobei sich die die Spacergruppierung S während dieser Umsetzung ausbilden oder auch bereits teilweise oder auch ganz Bestandteil (Substituent) des Trägers sein kann.

Das Trägermaterial ist vorzugsweise ein organisches oder anorganisches Polymeres, z. B. ein synthetisches, halbsynthetisches oder natürliches Polymeres, wie z. B. Polystyrol, Cellulose, Polyacrylamide, Methacrylate, Dextrane, aber auch feste Basismaterialien, die mit einem für die Verknüpfung mit den Methacryloylgruppen geeigneten Material überzogen sind, wie z. B. mit einem geeigneten Polymeren oder einem vernetzten Protein. Das Basismaterial kann z. B. Glas, Kieselgel oder auch ein Kunstharz sein. Für das Trägermaterial und als Überzug geeignete organische Polymere sind vorzugsweise Polyacrylamide, Polyethylenglycol, und insbesondere Polystyrol.

Zur Ausbildung einer geeigneten Spacergruppierung S kann es zweckmäßig sein, z. B. ein mit Aminomethylgruppen substituiertes Polystyrol einzusetzen; im erfindungsgemäßen Festphasensystem sind die Aminomethylgruppierungen dann vorzugsweise durch die Gruppierung -S-CO-C[=CR¹R²]-CR³R⁴-X substituiert.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren gemäß Anspruch 8 zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin X eine zur Verknüpfung geeignete Gruppe, ausgewählt unter Hydroxyl, Halogen, Sulfonat, Phosphonat, Azido, Amino, Alkoxy, Thioether, Amido oder Acyloxy, wobei Acyl den Rest einer Carbonsäure darstellt, bedeutet, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein polymeres Trägermaterial, das zur Verknüpfung mit der Methacryloyl-Gruppe -CO-C[=CR¹R²]-CR³R⁴-X geeignete funktionelle Gruppe A enthält, mit einer Verbindung B-CO-C[=CR¹R²]-CR³R⁴-X umsetzt, worin A und B Atomgruppierungen bedeuten, die unter Kondensation und/oder Addition und Ausbildung einer Verknüpfung zwischen festem Trägermaterial und Methacryloyl-Gruppierung miteinander reagieren.

Zweckmäßige Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind Gegenstand der Ansprüche 9 und 10.

Bei den Resten A und B handelt es sich um solche Gruppierungen, die unter Kondensation und/oder Addition und Ausbildung einer Verknüpfung zwischen polymerem Trägermaterial und Methacryloyl-Gruppe miteinander reagieren. Solche Gruppen sind vorzugsweise die in Kondensations- und Additionsreaktionen üblicherweise verwendete Gruppen, z. B. Aminogruppen, z. B. in Form einer Aminomethylgruppe, Halogen, Estergruppierungen, Nitrilgruppen usw. Die Kondensations- und/oder Additionsreaktionen können in der Regel auf an sich bekannte Weise, z. B. unter Abspaltung von Wasser, Halogenwasserstoff usw. durchgeführt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird z. B. ein Aminomethylgruppen (Gruppe A) enthaltendes Polystyrol mit einer substituierten Merthacrylsäure oder einer terminal methacryloylisch substituierten Carbonsäure oder einem Carbonsäurederivat unter Bildung einer Amidgruppierung umgesetzt. Eine substituierte Merthacrylsäure ist z. B. 5-Brommethyl-acrylsäure (B = OH, X = Br), eine C-terminal methacryloylisch substituierte Carbonsäure ist z. B. 5-Brommethyl-4-oxo-hex-5-en-säure (B = HOOC-(CH₂)₂-, X = Br).

Weitere allylisch ungesättigte Carbonsäuren sind z. B. 4-Halogenmethyl-, 4-Hydroxymethyl-, 4-Acyloxymethyl- oder 4-Sulfonyloxymethyl-Acrylsäure.

Die Umsetzung mit den geschützten Aminosäuren, Peptiden, Glycopeptiden, Nucleotiden, Sacchariden, Carbonsäuren oder deren Derivate oder Salzen erfolgt wie allgemein in der Merrifield-Fest­ phasen-Technik üblich. Als Schutzgruppen können alle bekannten Schutzgruppen dienen.

Die Abspaltung der Produkte vom Träger erfolgt unter milden, nahezu neutralen Bedingungen wie verdünnt nucleophilen Medien, wozu beispielsweise Piperidin oder Morpholin in verschiedenen Lösungsmitteln zählen, oder durch Edelmetallkatalyse, wie z. B. durch Katalyse mit Verbindungen der Platinmetalle wie Ru, Rh, Pd, Os, Ir, Pt (B. Blankemeyer-Menge u. R. Frank Tetrahedron Lett. 29, 5871 (1988); F. Guib´, O. Dangles, G. Balavoine u. A. Loffet Tetrahedron Lett. 30, 2641 (1989)), die sowohl N-Amino-Schutzgruppen wie auch Seitenkettenschutzgruppen von Peptiden und Oligosacchariden selektiv auf dem Produkt belassen. Ein Anspruch besteht daher auch bezüglich der Synthese geschützter Peptidfragmente unter Verwendung der erfindungsgemäßen Festphasensysteme.

Die erfindungsgemäßen Festphasensysteme lassen sich neben ihrer Verwendung in der Festphasen-Technik (Merrifield-Technik) zur Peptidsynthese oder Glycopeptidsynthese auch als Festphasen in anderen Festphasen-Techniken einsetzen, z. B. zur Synthese von Oligonucleotiden, die sich gegebenenfalls enzymatisch weiter verlängern lassen, z. B. zur Synthese von bestimmten DNA-Sequenzen, zu Sequenzanalysen, aber auch bei Reaktionen, bei denen Enzyme, katalytisch wirkende Lewissäuren, Redoxsysteme und dergleichen durch Immobilisierung infolge Adsorption, Polymerisation, Pfropfung usw. in eine feste Form gebracht werden, was die Dosierung, Wiederaufarbeitung und Abtrennung von Reaktionsprodukten erleichtert. Daneben ist auch eine Anwendung in Festbettverfahren möglich (vgl. z. B. Römpps-Lexikon, 8. Auflage, Seite 1263 und 2543).

Nachfolgend werden einige bevorzugte Ausführungsformen von erfindungsgemäßen Festphasensystemen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung beschrieben, ohne ihren Umfang darauf einzuschränken.

Synthese der die Methacryloyl-Gruppen enthaltenden polymeren Trägersysteme Synthese der methacryloylischen Ankergruppen (siehe z. B.: K. Ramarajan, K. Ramalingam, D. J. O′Donnell u. K. D. Berlin, Org. Synth. Coll. Vol. 7, 210 (1990)) Synthese von polymeren Trägern mit methacryloylischen Ankergruppen

Zur Synthese von Polymeren der allgemeinen Formel I können verschiedene Wege beschritten werden. Das prinzipielle Vorgehen wird an einem kommerziell erhältlichen (Nova-Biochem. 0,7 mg Cl₂/g) chlormethyliertem Polystyrol gezeigt, das zunächst in bekannter Weise (A. R. Mitchell u. Mitarb., J. Am. Chem. Soc. 98, 7337 (1976)) mit Phtalimid-Kalium über das Phtaloyl-amido-Derivat in das Amino-methyl-polystyrol 1 überführt wird. Alternativ kann das Phtaloyl-amido-Derivat ebenfalls in bekannter Weise (R. B. Merrifield u. Mitarb., Tetrahedron Lett. 42, 3795 (1976)) aus geeignet vernetztem Polystyrol durch Umsetzung mit N-Chlormethyl-phtalimid hergestellt werden.

1 wird aus dem Phtaloyl-amido-Derivat durch Umsetzung mit Hydrazin in Ethanol erhalten (A. R. Mitchell u. Mitarb., J. Am. Chem. Soc. 98, 7337 (1976)).

Das aminomethylierte Polystyrol 1 wird nun, als Beispiel für polymere Träger mit Aminogruppen, in Verbindungen der allgemeinen Formel I umgewandelt, indem es mit Methacroylverbindungen oben beschriebener Ausführung umgesetzt wird. Als Beispiel ist nachfolgend die Umsetzung des Harzes 1 mit α-Brommethyl-acrylsäure 2 (K. Ramarajan, K. Ramalingam, D. J. O′Donnell u. K. D. Berlin, Org. Synth. Coll. Vol. 7, 210 (1990)) beschrieben. Die Verknüpfung erreicht man z. B. mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), mit DCC/Hydroxybenzotriazol (Hobt) in CH₂Cl₂, DMF (vgl. W. König u. R. Geiger, Chem. Ber. 103, 788 (1970)) oder anderen bekannten Reaktionen zur Bildung von Säureamiden (Beispiel 1).

Statt der α-Brommethyl-acrylsäure 2 können in gleicher Weise an der Doppelbindung substituierte Derivate eingesetzt werden, z. B. α-Brommethyl-crotonsäure. Ebenso erhält man in analogen Reaktionen mit hydroxymethylierten Polymeren anstelle von 1 analog die zu 3 entsprechenden Ester.

Die Verbindung 3 ist ein Beispiel für Substanzen der allgemeinen Formel I, worin X = Br ist. Auf analoge Weise lassen sich ausgehend von einer Verbindung 1 Verbindungen der Formel I darstellen, in denen X die Bedeutung Halogen, Hydroxyl, Sulfonat, Phosphonat, Azido, Amino, Alkoxy, Thioether, Amido oder Acyloxy hat, wobei Acyl der Rest einer Carbonsäure oder der Rest RCO mit R als einem organischen Rest ist.

Ankopplung der C-terminalen Aminosäure an den erfindungsgemäßen Träger

Durch Reaktion von N-geschützten Aminosäuren 4 (z. B. R′′ = Boc) mit Harzen des Typs 3 werden die C-terminalen Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptids oder Glycopeptids an den polymeren Träger angekoppelt. Die dabei gebildeten Kopplungsprodukte, wie z. B. 5, entsprechen der allgemeinen Formel I (Beispiel 2 für Phenylalanin, R′ = CH₂-C₆H₅). Die Ausbeuten liegen je nach Aminosäure-Überschuß bei bis zu 100%.

Von der in 5 als (substituierter) Methacrylester an den polymeren Träger gebundenen Aminosäure kann die N-terminale Schutzgruppe selektiv abgespalten werden. Im Falle der tert-Butyloxycarbonyl(Boc)-Gruppe (z. B. in 5) gelingt dies durch Behandeln mit Trifluoressigsäure (Beispiel 4). Die Ester-Bindung an den Träger bleibt dabei völlig stabil.

Aus den gebundenen Aminosäure-hydrosalzen, wie 6, wird mit tertiären Basen die freie Aminoverbindung erhalten.

Ankopplung von selektiv ungeschützten Monosacchariden an den erfindungsgemäßen Träger

Durch Reaktion der Salze, insbesondere der Natrium-Salze, von selektiv blockierten Nucleotid- oder Saccharid-Bausteinen 7 (z. B. R′ = C(CH₃)₂, R′′ = TBDPSi) mit Harzen des Typs 3 werden die Saccharid-Bausteinen des zu synthetisierenden Oligosaccharids, Oligonucleotids oder Glycopeptids an den polymeren Träger angekoppelt. Die dabei gebildeten Kopplungsprodukte, wie z. B. 8, entsprechen der allgemeinen Formel I (X = Alkoxy, Beispiel 3 für Methyl-2,3-O-isopropyliden-6-O-tert-bu­ tyldiphenylsilyl-α-D-Manp). Die Ausbeuten liegen je nach Saccharid-Überschuß bei bis zu 100%.

Von dem in 8 als (substituierter) Methacrylether an den polymeren Träger gebundenen Saccharid-Bau­ stein können die temporären Schutzgruppen selektiv abgespalten werden. Im Falle der tert-Butyldiphenylsilyl(TBDPSi)-Gruppe (z. B. in 8) gelingt dies durch Behandeln mit Trifluoressigsäure (Beispiel 8). Die Methacrylether-Bindung an den Träger bleibt dabei völlig stabil.

Peptid- und Glycopeptidsynthese am erfindungsgemäßen Träger

An diesen N-deblockierten Substanzen wird nun der Aufbau der Peptidkette nach den in der Festphasensynthese bekannten Methoden (s. M. Mutter u. D. Bellof; Helv. Chim. Acta 67, 2009-2016 (1984) und M. Schnölzer, P. Alewood, A. Jones, D. Alewood u. S. B. H. Kent, Int. J. Peptide Protein Res. 40, 1 (1992)) durchgeführt. So erhält man z. B. aus 6 nach Deprotonierung und Kupplung mit N^α-Boc-Asparginsäure das gebundene Dipeptid 9 (Beispiel 5).

Durch Fixierung von N^α-Boc-Phenylalanin am erfindungsgemäßen polymeren Träger, wie vom Typ 3, und durch neun anschließende Synthesecyclen, bestehend aus N-terminaler Schutzgruppenab­ spaltung, Freilegung der terminalen Aminogruppe und Kettenverlängerung mit den jeweiligen Boc-Aminosäuren wurde das geschützte Decapeptid 10, ein Fragment der HIV-Protease, in festphasen­ gebundener Form synthetisiert (Beispiel 6). Die terminale Boc-Schutzgruppe wurde auf dem Peptid belassen.

Als weiteres veranschaulichendes Beispiel wurde nach dem erfindungsgemäßen Verfahren das folgende Myoglobin-Fragment in festphasengebundener Form 11 aufgebaut (Beispiel 7).

Oligosaccharidsynthese am erfindungsgemäßen Träger

Durch Fixierung von Methyl-2,3-O-isopropyliden-6-O-(tert.-butyl-diphenyl-sily-α-D-Manp am erfindungsgemäßen polymeren Träger, wie vom Typ 3, und durch zwei anschließende Synthesecyclen, bestehend aus Schutzgruppenabspaltung und Kettenverlängerung mit Trichloracetimido-2-deoxy-2-N-phta­ loyl-3,4,6-tri-O-acetyl-β-D-Glcp unter der Wirkung von TMSOTf (Trimethylsilyl­ trifuormethansulfonat) wurde das Disaccharid 12 in festphasengebundener Form synthetisiert (Beispiel 8).

Die Abspaltung der Peptide, Glycopeptide und Saccharide vom erfindungsgemäßen Träger

Das besondere Merkmal der erfindungsgemäßen polymeren Träger und der damit durchgeführten Festphasenpeptidsynthesen ist die Anbindung der Aminosäuren, Peptide, Monosaccharide, Oligosaccharide, Glycopeptide und Nucleotide als methacrylische Ester bzw. Ether (z. B. in 5, 6, 8, 9, 10, 11, 13). Daraus ergibt sich als entscheidender Vorteil, daß die synthetisierten Peptide, Glycopeptide, Oligosaccharide und Oligonucleotide unter sehr milden, praktisch neutralen Bedingungen vom Träger abgespalten werden können. Man erreicht diese Abspaltung z. B. durch Behandeln der polymergebundenen Derivate mit verdünnt nucleophilen Medien, wozu beispielsweise Morpholin oder Piperidin gehört, oder katalytischen Mengen eines Palladium(0)-Katalysators unter Sauerstoffausschluß in Tetrahydrofuran oder anderen Lösungsmittelsystemen in Gegenwart eines geeigneten Nucleophils, wie Dimedon oder einer anderen leicht deprotonierbaren CH-aziden Verbindung. Die Reaktion ist bei Raumtemperatur in der Regel in wenigen Minuten bis Stunden vollständig abgelaufen. Durch die außerordentlich milden Abspaltbedingungen bleiben selbst empfindliche Strukturen (z. B. glycosidische Bindungen) und Schutzgruppen, wie z. B. die Boc- und Z-Schutzgruppen im abgelösten Peptid (z. B. 9, 10, 11), oder die Acetyl- und Phtaloyl-Schutzgruppe im Oligosaccharid (z. B. 13) zuverlässig erhalten.

Die abgelösten Produkte, wie z. B. 14 (Beispiel 9), 15 (Beispiel 10), 16 (Beispiel 11) und 17 (Beispiel 12), können dadurch selektiv und partiell geschützt in guten Ausbeuten isoliert werden. Sie sind deshalb sofort zu weiteren Synthesen, wie gezielten Fragmentkondensationen, einsetzbar. Sie können natürlich auch von den restlichen Schutzgruppen befreit werden.

Die erfindungsgemäßen Träger, wie z. B. 3, die die Festphasensynthese von Peptiden, Glycopeptiden und Oligosacchariden über Ester- und Etherbindungen an den Träger gebundene Bausteine ermöglichen, haben damit entscheidende Vorteile:
Die Produkte sind einfach davon abzuspalten und sie erlauben eine effektive, racemisierungsfreie Ankupplung des C-terminalen Bausteins. Die Festphasenpeptid- und Oligosaccharidsynthese kann mit säurelabilen Aminoschutzgruppen bzw. allgemein temporären Schutzgruppen durchgeführt werden. Die Abspaltung der synthetisierten Peptiden, Glycopeptiden und Oligosacchariden ist unter nahezu neutralen Bedingungen sehr effektiv möglich; dabei werden empfindliche Strukturelemente, wie z. B. Glycosidbindungen und Säure- (z. B. Trt) und die meisten basenlabilen (z. B. OAc) Schutzgruppen, nicht angegriffen.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne ihren Umfang darauf einzuschränken.

Beispiel 1 Synthese eines aktivierten bzw. aktivierbaren polymeren Trägers mit methacrylischen Ankergruppen der allgemeinen Formel I (α-Brommethyl-acryloyl)-aminomethyl-polystyrol 3

2 g Aminomethyl-polystyrol 1 (1,3 mmol NH₂/g Harz; 2,6 mmol) werden in 15 ml absolutem Dichlormethan zusammen mit 702 mg (5,2 mmol) HOBt gequollen. Dazu wird eine Lösung von 2,45 g (7,8 mmol) α-Brommethyl-acrylsäure-anhydrid in 15 ml abs. Dichlormethan gegeben, in-situ dargestellt aus 2,57 g (15,6 mmol) α-Brommethyl-acrylsäure und 1,61 g (7,8 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dichlormethan durch Reaktion bei 20° für 30 min. Nach 1 h Schwenken bei Raumtemperatur bestätigt der Kaiser-Test die vollständige Reaktion. Schließlich wird das Harz mehrmals mit DMF, DCM und Diethylether gewaschen, bevor es im Vakuum getrocknet wird.

Beispiel 2 Kupplung einer C-terminalen Aminosäure an den polymeren Träger N^α-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-(α-oxymethylen-acryloyl-aminomethyl)-polystyrol 5

Zu 5 g (5,46 mmol Bromid) Brommethacroyl-funktionalisiertem Polystyrol, gequollen in 20 ml abs. Dichlormethan, werden 27,29 mmol DIEA und 7,24 g (27,29 mmol) N^α-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phe­ nylalanin gegeben. Nach 1 h Schwenken bei Raumtemperatur schüttet man die Mischung in eine Lösung von 5 ml DIEA in 30 ml Methanol. Nach 30 min wird filtriert und mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen kann das Harz zur Synthese eingesetzt werden; Beladung 0,92 mmol/g Boc-Phe.

Beispiel 3 Fixierung von Methyl-2,3-O-isopropyliden-6-O-tert.-butyl-diphenyl-si­ lyl)-α-D-Manp am erfindungsgemäßen polymeren Träger

1,89 g (4 mmol) Methyl-2,3-O-isopropyliden-6-O-(tert.-butyl-diphenyl-silyl)-α-D-Mannopyranose werden in 10 ml abs. Tetrahydrofuran gelöst und mit 93,6 mg (3,9 mmol) Natriumhydrid versetzt. Nach 6 h bei Raumtemperatur gibt man 1 g (1,09 mmol) Brommethacroyl-funktionalisierte Polystyrol, vorgequollen in 10 ml DCM, dazu. Nach 1 h Schwenken bei Raumtemperatur schüttet man die Mischung in eine Lösung von 1 ml DIEA in 6 ml Methanol. Nach 30 min wird filtriert und mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen kann das Harz zur Synthese eingesetzt werden; Beladung 0,70 mmol/g Methyl-2,3-O-isopropyliden-6-O-(tert.-butyl-diphenyl-silyl)-α-D-Mannopyranose.

Die folgenden beiden Beispiele zeigen den typischen Reaktionscyclus, der bei Peptid-, Glycopeptid- und Oligosaccharidsynthesen an erfindungsgemäßen Trägersystemen mit methacryloylischen Ankergruppen bei jeder Kettenverlängerung durchgeführt wird.

Beispiel 4 Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe; Abspalten der tert.-Butyloxy­ carbonylgruppe vom N^α-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-(α-oxymethylen­ acryloyl-aminomethyl)-polystyrol 5

Das nach Beispiel 4 synthetisierte N^α-Boc-Phe-(α-oxymethylen-acryloyl-aminomethyl)-polystyrol 5 (500 mg; 0,42 mmol Boc-Gruppen) wird mit 5 ml 55%iger (v/v) Trifluoressigsäure in abs. Dichlormethan bei Raumtemperatur 1 h geschüttelt. Nach Filtration wird 5mal mit abs. Dichlormethan gewaschen. Das nun vorliegende Hydro-trifluoracetat des polymergebundenen Phenylalanins 6 kann direkt zur Kupplung mit der nächsten Aminosäure eingesetzt werden.

Beispiel 5 Kettenverlängerung eines über eine methacrylische Ankergruppe an den polymeren Träger gebundenen Aminoacyl- oder Peptid-Bausteins N^α-Boc-Asparaginyl(Xanthenyl)-phenylalanyl-(α-oxymethyl-acryloyl-aminomethyl)-polystyrol 9

129 mg des nach Beispiel 4 hergestellten polymergebundenen Phenylalanins 6 werden in 3 ml abs. Dichlormethan mit einer Lösung voraktiviertem N^a-Boc-Asparagin(Xanthenyl) behandelt. Diese Lösung wird erhalten, indem man 1 mmol N^α-Boc-Asparagin(Xanthenyl) mit 1 mmol Dicyclohexylcarbodiimid und 1 mmol 1-Hydroxybenzotriazol 30 min bei Raumtemperatur in 5 ml Dimethylformamid stehen läßt.

Nachdem diese Lösung voraktivierter Aminosäure zu 6 gegeben wurde, werden 2 mmol Diisopropyl-ethylamin dazugegeben und es wird 15 min bei RT geschüttelt. Das polymergebundene Dipeptid 9 wird abfiltriert, mit Dichlormethan, Dimethylformamid und wiederum Dichlormethan gewaschen und getrocknet.

Beispiel 6 Synthese eines vollgeschützten Decapeptids (Fragment der HIV-Protease) am polymeren Träger: N^a-Boc-Leu-Thr(Bzl)-Glu-Ile-Cys(Acm)-Thr(Bzl)-Leu-Asn-Phe-(α-oxy­ methylen-acryloyl-aminomethyl)-polystyrol 10

Analog Beispiel 4 und 5 wird das Decapeptid 10 erhalten, indem diese Synthesecyclen 9mal mit den entsprechenden N^α-geschützten Aminosäuren wiederholt werden.

Beispiel 7 Synthese eines vollgeschützten Decapeptids (Fragment des Myoglobin) am polymeren Träger: N^α-Boc-Pro-Glu-Thr(Bzl)-Leu-Glu-Lys(Cl-Z)-Phe-Asp(OTos)- Arg(cHx)-Phe-(α-oxymethylen-acryloyl-aminomethyl)-polylystyrol 11

Analog Beispiel 4 und 5 wird das Decapeptid 11 erhalten, indem diese Synthesecyclen 9mal mit den entsprechenden N^a-geschützten Aminosäuren wiederholt werden.

Beispiel 8 Synthese eines partiell geschützten Disaccharids am polymeren Träger: 2-Desoxy-2-N-phtaloyl-3,4,6-tri-O-acetyl-D-Glcp-β-(1→6)-methyl-4-O-(α-oxymethyl­ acryloyl-aminomethyl)-polystyrol-α-D-Manp 13

Zu 500 mg (0,35 mmol) 8 in 6 ml Dioxan gibt man 3 ml 40%ige TFAaq. Nach 8 h Schütteln bei 25° wird das Harz filtriert und abwechselnd mit Wasser, MeOH, DMF, DCM und Et₂O gewaschen. Anschließend wird das nun vorliegende Harz in 7,5 ml abs. Dichlormethan gequollen und unter Argon 1,02 g (1,75 mmol) Trichloracetimido-2-deoxy-2-O-phtaloyl-3,4,6-O-tri-O-acetyl-α-D-Glcp 12 dazugegeben. Nachdem auf 0° abgekühlt wurde, werden 161 µl (0,875 mmol) Trimethylsilyl­ trifluormethansulfonat dazugegeben, und 6 h bei 25° geschüttelt. Anschließend wird das Harz abgesaugt und abwechselnd mit MeOH, DMF, DCM und Et₂O gewaschen, bevor i. Vak. getrocknet wird.

Beispiel 9 Abspaltung des Peptids vom erfindungsgemäßen polymeren Träger: N^α-tert-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl(xanthenyl)-L-phenylalanin 14

Das nach Beispiel 5 hergestellte Festphasensystem wird 60 min mit einer Mischung aus 1 ml Acetonitril und 10 µl Piperidin behandelt. Anschließend werden 10 µl Eisessig dazugegeben und vom Träger abfiltriert. Nach Filtration durch Kieselgel und Einengen i. Vak. erhält man das Dipeptid 14 in einer Ausbeute von 93%. Das Produkt besitzt nach HPLC und Ionspray-MS mehr als 97%ige Reinheit.

Beispiel 10 Abspaltung des Peptids vom erfindungsgemäßen polymeren Träger: N^α-Boc-Leu-Thr(Bzl)-Glu-Ile-Cys(Acm)-Thr(Bzl)-Leu-Asn-Phe-OH 15

Das nach Beispiel 6 hergestellte Festphasensystem wird 60 min mit einer Mischung aus 1 ml Dichlormethan/Dimethylformamid/Trifluorethanol (1 : 1 : 1 v/v) und 10 µl Morpholin behandelt. Anschließend werden 10 µl Eisessig dazugegeben und vom Träger abfiltriert. Nach Filtration durch Kieselgel und Einengen i. Vak. erhält man das Decapeptid 15 in einer Ausbeute von 85%. Das Produkt besitzt nach HPLC und Ionspray-MS mehr als 95%ige Reinheit.

Beispiel 11 Abspaltung eines vollgeschützten Decapeptids (Fragment des Myoglobin) vom polymeren Träger: N^α-Boc-Pro-Glu-Thr(Bzl)-Leu-Glu-Lys(Cl-Z)-Phe- Asp(OTos)-Arg(cHx)-Phe-OH 16

Das nach Beispiel 7 hergestellte Festphasensystem wird 60 min mit einer Mischung aus 1 ml Dichlormethan/Dimethylformamid/Trifluorethanol (1 : 1 : 1 v/v) und 10 µl Diethylamin behandelt. Anschließend werden 10 µl Eisessig dazugegeben und vom Träger abfiltriert. Nach Filtration durch Kieselgel und Einengen i. Vak. erhält man das Decapeptid 16 in einer Ausbeute von 89%. Das Produkt besitzt nach HPLC und Ionspray-MS mehr als 95%ige Reinheit.

Beispiel 12 Abspaltung des Disaccharids vom erfindungsgemäßen polymeren Träger: 2-Deoxy-2-N-phtaloyl-3,4,6-tri-O-acetyl-D-Glcp-β-(1→6)-methyl-α-D-Manp 17

Das nach Beispiel 8 hergestellte Festphasensystem wird 6 h mit einer Mischung aus 1 ml Dichlormethan/Dimethylformamid/Trifluorethanol (1 : 1 : 1 v/v) und 10 µl Morpholin behandelt. Anschließend werden 10 µl Eisessig dazugegeben und vom Träger abfiltriert. Nach Filtration durch Kieselgel und Einengen i. Vak. erhält man das Disaccharid 17 in einer Ausbeute von 84%. Das Produkt besitzt nach HPLC und Ionspray-MS mehr als 95%ige Reinheit.

Claims (14)

1. Methacryloyl-Gruppen enthaltende polymere Trägersysteme, in dem die Methacryloyl-Gruppen an ein Trägermaterial gebunden sind, mit der allgemeinen Formel worin
F ein natürliches, halbsynthetisches oder synthetisches polymeres Trägermaterial bedeutet,
R¹ und R² gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Alkyl, Aryl oder Halogen bedeuten,
R³ und R⁴ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Alkyl oder Aryl bedeuten,
S eine Verknüpfungsgruppierung (Spacer) bedeutet, ausgewählt unter Alkylen, -NH-, -NR-, oder -O- (Ester), und
X eine zur Verknüpfung geeignete Gruppe, ausgewählt unter Hydroxyl, Halogen, Sulfonat, Phosphonat, Azido, Amino, Alkoxy, Thioether, Amido oder Acyloxy, wobei Acyl den Rest einer Carbonsäure darstellt.

2. Festphasensystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Acylrest RCO- der geschützte oder ungeschützte Rest einer Aminosäure, eines Peptids, Glycopeptids, Nucleotids, Saccharids, einer Hydroxycarbonsäure, einer Dicarbonsäure oder einer Tricarbonsäure ist.

3. Festphasensystem nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Trägermaterial ein natürliches oder unnatürliches organisches oder anorganisches Polymeres ist.

4. Festphasensystem nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das feste Trägermaterial ein festes Basismaterial ist, das mit einem für die Verknüpfung mit den Methacryloyl-Seitenketten geeigneten Material überzogen ist.

5. Festphasensystem nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymere oder das für die Verknüpfung mit den Methacryloyl-Seitenketten geeignete Material ein vernetztes Polystyrol ist.

6. Festphasensystem nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polystyrol eine Aminomethylgruppe trägt.

7. Festphasensystem nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es an den Aminomethylgruppen die Gruppierung -CO-C[=CR¹R²]-CR³R⁴-X trägt, worin X und R¹, R², R³ und R⁴ die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt.

8. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I nach einer der Ansprüche 1 bis 7, worin X Hydroxyl, Halogen, eine Azido-, eine Sulfonatgruppe, eine Phosphonatgruppe, eine Aminogruppe, eine Alkoxygruppe, eine Thioethergruppe, eine Amidogruppe oder eine Acyloxygruppe in der Bedeutung eines Säurerestes einer aliphatischen Carbonsäure ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein polymeres Trägermaterial, das zur Verknüpfung mit der Methacryloylgruppierung -CO-C[=CR¹R²]-CR³R⁴-X geeignete funktionelle Gruppen A enthält, mit einer Verbindung B-CO-C[=CR¹R²]-CR³R⁴-X umsetzt, worin A und B Atomgruppierungen bedeuten, die unter Kondensation und/der Addition und Ausbildung einer Verknüpfung zwischen polymeren Trägermaterial und Methacryloylgruppierung miteinander reagieren.

9. Verfahren zur Herstellung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das polymere, funktionelle Gruppen A enthaltende Trägermaterial ein aminomethyliertes Polystyrol ist, das mit einer substituierten Merthacrylsäure oder einer terminal methacryloylisch substituierten Carbonsäure oder einem Carbonsäurederivat unter Bildung einer Amidgruppierung umgesetzt wird.

10. Verfahren zur Herstellung nach Anspruch 8 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Methacryloyl-Gruppe α-Halogenmethyl-, α-Hydroxymethyl-, α-Azidomethyl-, α-Acyloxymethyl-, α-Sufonyloxymethyl-, α-Alkoxymethyl- oder α-Phosphonmethyl-Acrylsäure ist.

11. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin X eine Acyloxygruppe bedeutet, in der Acyl den Rest einer Carbonsäure oder den Rest RCO-, mit R als einen organischen Rest bezeichnet, und RCO- insbesondere der geschützte oder ungeschützte Rest einer Aminosäure, eines Peptids oder Glycopeptids sein kann, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Festphasensystem der allgemeinen Formel I, worin X Hydroxyl, Halogen, Sulfonat, Phosphonat, Azido, Amino, eine Thioether-, eine Alkoxygruppe sein, worin Alkyl der Rest eines Nucleotids oder Saccharids sein kann, Amido oder Acyloxy, wobei Acyl den Rest einer Carbonsäure darstellt, bedeutet, mit geschützten Aminosäuren, Peptiden, Glykopeptiden, Sacchariden, Nukleotiden oder Derivaten oder Salzen davon, umsetzt und gegebenenfalls die Schutzgruppen abspaltet.

12. Verfahren zur Synthese von ungeschützten und geschützten Peptiden, Oligosacchariden, Glycopeptiden, Nucleotiden oder Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der Verbindung der allgemeinen Formel I, worin X eine Acyloxy- oder Alkoxygruppe bedeutet, in der Acyl den Rest einer Carbonsäure oder den Rest RCO-, mit R als einen organischen Rest bezeichnet, und RCO- ins­ besondere der geschützte oder ungeschützte Rest einer Aminosäure, eines Peptids, Glycopeptids und Alkoxy der Rest eines Alkohols und insbesondere der geschützte oder ungeschützte Rest eines Nucleotids oder Saccharids bedeutet, den Acyl- oder Alkoxyrest in Gegenwart von Nucleophilen oder, insbesondere wenn X eine Acyloxygruppe bedeutet, mit katalytischen Mengen einer Palladiumverbindung in verschiedenen Lösungsmitteln abspaltet.

13. Verwendung eines Festphasensystems der allgemeinen Formel I nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin X Hydroxyl, Halogen, Sulfonat, Phosphonat, Azido, Amino, Alkoxy, Thioether, Amido oder Acyloxy, wobei Acyl den Rest einer Carbonsäure darstellt, für Festphasenreaktionen.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphasenreaktion eine Festphasensynthese von Peptiden, Glycopeptiden, Proteinen, Oligosacchariden oder Oligonucleotiden ist.