DE69435011T2

DE69435011T2 - Selektiv spaltbare Linker, die auf einer Methionin- und einer Estergruppe basieren

Info

Publication number: DE69435011T2
Application number: DE69435011T
Authority: DE
Inventors: Michal Lebl; Viktor Krchnak; Petr Kocis; Kit S. Lam
Original assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-06-21
Filing date: 1994-06-21
Publication date: 2008-10-23
Anticipated expiration: 2014-06-22
Also published as: DE69429542T2; DK1156059T3; JP2003327597A; DE69435011D1; ATE369376T1; DK0751779T3; JP3469579B2; EP1156059A1; EP1156059B1; PT751779E; NZ268292A; DE69429542D1; ES2165880T3; ES2291245T3; US5635598A; AU689116B2; WO1995000165A1; EP0751779A1; ATE210993T1; JPH09500111A

Description

1. GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Linker, die auf Esterbindungs-Verknüpfungen, insbesondere Iminodiessigsäure-Esterbindungs-Verknüpfungen, basieren, für eine Anwendung in der Festphasen-Peptidsynthese gerichtet. Insbesondere ist die Erfindung auf spaltbare Linker gerichtet, die ein Peptid vom Festphasenträger unter relativ milden Bedingungen durch die Bildung eines Diketopiperazins oder einer anderen zyklischen Struktur freisetzen können, sodass die zyklische Struktur auf dem Festphasenträger zurück bleibt, und bei einer zweiten Spaltung unter stringenteren Bedingungen eines hohen pH-Werts. Die Erfindung ist ferner auf Festphasenträger gerichtet, die mit mehrfach spaltbaren Linkern hergestellt werden, was einen Linker einschließt, der durch die Bildung eines zyklischen Produktes abgespalten wird. Ein solcher zweiter Linker ist ein Ester der Hydroxymethylbenzoesäure oder sind Ester, die durch Carboxy-Gruppen der Asparagin- oder der Glutamin-Säure gebildet werden.
2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zahlreiche Festphasen-Harze und -Linker für die Peptidsynthese sind im Fachbereich erhältlich, wie es bei Fields und Noble, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35: 161–214 beschrieben ist. Um verwendbar zu sein, müssen die Linker gegenüber den Reaktionsbedingungen einer Peptidsynthese stabil sein, aber wenn die Synthese vollständig ist, muss der Linker die Spaltung des Peptids vom festen Träger erlauben.
Weniger gebräuchlich, aber nicht weniger nützlich, sind selektiv spaltbare Linker. Diese Linker können als Handlen bzw. Henkel dienen; alternativ kann der Linker an ein anderes Handle gekoppelt werden. Die nützliche Eigenschaft von bestimmten von diesen Linkern ist, dass sie unter viel milderen Bedingungen gespalten werden können, als mit Handlen assoziiert sind, z. B. unter mild basischen oder sauren Bedingungen, an Stelle von stark sauren Bedingungen, die mit der Peptidspaltung z. B. in Fluorwasserstoff (HF) oder Trifluoressigsäure (TFA) verbunden sind.
Es wurden Linker verwendet, die gegen ultraviolettes Licht empfindlich sind, wie ONb (siehe Barany und Albericio, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 4936–4942). Andere spaltbare Linker erfordern eine Hydrogenolyse oder eine Photolyse. Beispiele anderer lichtempfindlicher (photospaltbarer) Linker werden bei Wang (1976, J. Org. Chem. 41: 32–58), Hammer et al. (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36: 31–45) und Kreib-Cordonier et al. (1990, in Peptides-Chemistry, Structure and Biology, Rivier und Marshall, Hrsg., Seiten 895–897) gefunden.
Landen (1977, Methods Enzym. 47: 145–149) verwendete wässrige Ameisensäure, um Asp-Pro-Bindungen zu spalten; dieser Ansatz wurde verwendet, um T-Zell-Determinanten in Verbindung mit der Stift-Synthesemethode von Geysen zu charakterisieren (Van der Zee et al., 1989, Eur. J. Immunol. 191: 43–47). Jedoch ist eine Behandlung von Peptiden mit Ameisensäure nicht wünschenswert, besonders wenn die behandelten Peptide in einem biologischen Assay verwendet werden sollen.
Andere potenzielle Linker-Gruppen, die unter basischen Bedingungen spaltbar sind, schließen jene mit ein, die auf p-(Hydroxymethyl)benzoesäure (Atherton et al., 1981, J. Chem. Soc. Perkin I: 538–546) und auf Hydroxyessigsäure (Baleaux et al., 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28: 22–28) basieren. Geysen et al. (1990, J. Immunol. Methods 134: 23–33) berichtete über eine Peptidspaltung durch einen nukleophilen Angriff an einem Carboxy-terminalen Ester von Prolin, was zu einem Zweiring-Derivat von Diketopiperazin führte. Jedoch erzeugt das von Geysen beschriebene „Diketopiperazin"-Verfahren Peptide, die einen C-terminalen Diketopiperazinrest tragen (Brav et al., 1991, J. Org. Chem. 56: 6659–6671). Dies ist ein Nachteil, da der heterozyklische Rest die Bindungsaktivität oder die biologische Aktivität des freigesetzten Peptids beeinflussen kann. Die Internationale Patent-Veröffentlichung WO 90/09395 (Geysen, veröffentlicht am 23. August 1990) schlägt die Ausrichtung eines spaltbaren Dipeptid-Linkers derartig vor, dass der Heterozyklus auf dem festen Träger zurück bleibt.
Darüber hinaus wurden vor kurzem Techniken entwickelt, welche die Herstellung von Bibliotheken von 10⁶ bis 10⁷ oder mehr an Festphasenträger angehefteten Peptiden möglich machten, in denen jedes Teilchen des Festphasenträgers eine einzelne Peptidart enthält (Internationale Patent-Veröffentlichung Nr. WO92/00091 , veröffentlicht am 9. Januar 1992). Diese Bibliotheken werden in vorteilhafter Weise verwendet, wenn die Peptidarten sequenziell in im Wesentlichen äquimolarer Menge von dem Festphasenträger abgespalten werden können, sodass jede Peptidart in mehr als einem Assay auf ihre Aktivität getestet werden kann, oder Peptide in Mischungen getestet werden können, gefolgt von einer Abtrennung der gesamten Harz-Teilchen aus einer positiven Mischung für ein weiteres Testen. Diese Bibliotheken sehen auch vor, dass eine äquimolare Menge von jedem Peptid auf dem Festphasenträger für das Sequenzieren jener Peptide verbleibt, die, wenn sie vom festen Träger freigesetzt werden, die Aktivität von Interesse aufweisen.
Daher besteht im Fachbereich ein Bedarf für einen freisetzbaren Linker, der ein Peptid von im Wesentlichen unveränderter Struktur ergibt, und der insbesondere keinen angehefteten Diketopiperazin-Rest aufweist. Darüber hinaus gibt es eine Notwendigkeit für eine Freisetzung von Peptiden in eine Lösung, die mit biologischen Tests kompatibel ist.
Darüber hinaus gibt es im Fachbereich einen Bedarf für mehrfach spaltbare Linker, bei denen die Spaltung jedes Linkers von der Spaltung der anderen unabhängig, d. h. orthogonal zu der Spaltung der anderen ist, wodurch eine sequenzielle Spaltung der gleichen oder einer unterschiedlichen Peptidart von einem festen Träger in äquimolaren Verhältnissen bereit gestellt wird.
Ein Zitat eines beliebigen Literaturhinweises in dieser Anmeldung soll nicht als eine Anerkennung angesehen werden, dass so ein Literaturhinweis als „Stand der Technik" zur Verfügung steht.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf Linker auf der Grundlage von Esterbindungs-Verknüpfungen, insbesondere Iminodiessigsäure-Linker, für die Festphasen-Peptidsynthese gerichtet. Solche Linker sehen die Spaltung des Peptids vom Festphasenträger vor. In einem Aspekt der Erfindung, wird die Esterbindung mit der Bildung eines Diketopiperazins oder einer anderen zyklischen Struktur, die auf dem festen Träger verbleibt, gespalten. Das durch die Spaltung der Esterbindung freigesetzte Peptid kann eine C-terminale Carboxyhydroxyalkylamid-Gruppe enthalten. In einer weiteren Ausführungsform wird die Esterbindung unter relativ stark basischen Bedingungen gespalten. Vorzugsweise stellt eine Tandem-Anordnung von Iminodiessigsäure-Gruppen beide Arten von Esterbindungen zur Verfügung.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung, ist der Linker eine Iminodiessigsäure (IDA). Die Carbonsäure-Gruppen der IDA, die eine Esterbindung mit einem Peptid bilden können, können für eine mehrfache Spaltung sorgen. Die erste Spaltungsreaktion kann durch einen internen nukleophilen Angriff mit einer Diketopiperazin-Bildung stattfinden. Diese Reaktion findet bei pH-Werten von größer als etwa 6,0, vorzugsweise größer als 7,0, durch einen Angriff eines freien Amins einer Aminosäure, die an die Imino-Gruppe der IDA gekoppelt ist, statt. Das freie Amin greift einen der Ester an. Alternativ kann die Imino-Gruppe an einem Aminosäureester, der an eine der Carbonsäuren gekoppelt ist, als ein Nukleophil gegenüber dem Ester wirken. Stärker bevorzugt greift die Imino-Gruppe einer IDA einen Ester an, der mit der Carbonsäure einer zweiten IDA gebildet wurde, wobei die zweite IDA über eine Amidbindung mit der Imino-Gruppe der zweiten IDA an eine Carbonsäure der ersten IDA gekoppelt ist.
Die zweite Spaltungsreaktion kann durch einen externen nukleophilen Angriff, z. B. eine Hydrolyse unter relativ stark basischen Bedingungen stattfinden.
Die Erfindung ist ferner auf Festphasenträger gerichtet, die mehr als einen spaltbaren Linker umfassen, wobei mindestens ein solcher Linker durch die Bildung einer zyklischen Struktur, z. B. eines Diketopiperazins gespalten werden kann, angeheftet an den Festphasenträger. Die Linker können ferner einen solchen Linker umfassen, dass nach der Spaltung das Diketopiperazin an das freigesetzte Peptid angeheftet ist. In einer weiteren Ausführungsform kann die Esterbindungs-Verknüpfung an eine reaktive Carbonsäure wie Hydroxymethylbenzoesäure sein. Andere spaltbare Linker, die an den Festphasenträger in der Ausführungsform der Erfindung als mehrfach spaltbarer Linker angeheftet sein können, schließen photospaltbare Linker und säurespaltbare Linker ein, sind aber nicht darauf begrenzt. Der Festphasenträger kann ferner ein herkömmliches Handle umfassen.
Die Erfindung ist ferner auf Verfahren zum sequenziellen Spalten mehrfacher Linker gerichtet, sodass bei jedem Spaltungsschritt nur ein Linker gespalten wird, und ein Teil des Peptids freigesetzt wird.
Der spaltbare Linker der Erfindung kann für biologische oder Bindungs-Assays von Peptiden oder anderen Testverbindungen verwendet werden. Alternativ kann die verknüpfte Verbindung ein codierendes Molekül sein, wie in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 08/068 327, eingereicht am 27. Mai 1993, offenbart wird. Die Verwendung von Iminodiessigsäure-Linkern ist besonders vorteilhaft für diese Art von Assays, da dem freigesetzten Peptid ein Diketopiperazinrest fehlt.
Die Verwendung von Iminodiessigsäure (IDA) als ein Linker hat große Vorteile gegenüber Dipeptid-Linkern, die Diketopiperazine bilden. IDA ist ein viel weniger teures Reagenz. Darüber hinaus, wie in einem bestimmten Beispiel gezeigt, unten, machen IDA-IDA-Linker eine schnelle Zyklisierung bei der Freisetzung eines Peptids durch, selbst bei einem pH-Wert von weniger als 7. In einem bestimmten Beispiel findet die Freisetzung bei einem pH-Wert von ungefähr pH 6,5 statt.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass die Rate der Freisetzung eines Dipeptid-Diketopiperazin-Linkers durch die Wahl geeigneter Aminosäurekombinationen gesteuert werden kann, wodurch eine schnelle oder, alternativ, langsame Freisetzung, in Abhängigkeit vom biologischen Assay von Interesse zur Verfügung gestellt wird. Noch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass die Peptide in eine Lösung freigesetzt werden können, die mit biologischen Tests kompatibel ist.
In einem weiteren Aspekt sieht die Erfindung eine in vivo-Freisetzung eines pharmazeutischen Wirkstoffs, wie ein Peptid, vor. Ein besonderer Vorteil der spaltbaren Linker der Erfindung ist, dass die Rate der Spaltung gesteuert werden kann, in Abhängigkeit von der gewünschten Rate der Freisetzung des pharmazeutischen Wirkstoffs, und der freigesetzte pharmazeutische Wirkstoff wird keinen an ihm angehefteten Diketopiperazin-Rest aufweisen. Solche freisetzbaren pharmazeutischen Wirkstoffe werden für eine orale Verabreichung bevorzugt, bei der ein inerter fester Träger, an dem das Diketopiperazin oder eine andere zyklische Gruppe nach einer Spaltung angeheftet ist, ausgeschieden werden kann.
Noch ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, dass mehrfach spaltbare Linker, die sequentiell, d. h. orthogonal, gespalten werden können, bereit gestellt werden.
3.1 ABKÜRZUNGEN
Die verwendeten Abkürzungen folgen den Empfehlungen der IUPAC-IUB-Kommission für die Biochemische Nomenklatur (Eur. J. Biochem. 1984, 138: 9). Die Aminosäuresymbole bezeichnen, wo anwendbar, die L-Konfiguration. Andere Abkürzungen sind wie folgt:

AA: Aminosäure
Ac: OH Essigsäure
Alloc: Allyloxycarbonyl
Boc: Butyloxycarbonyl
Bu^t: tert-Butyl
Bzl: Benzyl
Ddz: 2-(3,5-Dimethoxyphenyl)propyloxycarbonyl
DIC: N,N'-Diisopropylcarbodiimid
DIEA: N,N'-Diisopropylethylamin
DCM: Dichlormethan
DKP: Diketopiperazin
DMAP: 4-Dimethylaminopyridin
DMF: N,N-Dimethylformamid
EDT: 1,2-Ethandithiol
HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol
IDA: Iminodiessigsäure
Npys: 2-Nitropyridylsulfenyl
PA, PAO: Propanyl-Amin-(oder -Amid-)Ester
PAOH: Propanol-Amin (oder -Amid)
RP-HPLC: Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie
SPPS: Festphasen-Peptidsynthese
TFA: Trifluoressigsäure
TG: TentaGel (Harz)
Z: Benzyloxycarbonyl

4. KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Reaktionskinetiken der Freisetzung des Peptids Trp-Gly-Propanolamid (PAOH) von einem IDA-Linker bei pH 8,3. Optische Dichte bei 280 nm (Tryptophan) gegen die Zeit. Der Linker war IDA-Pro-OPA<-Gly<-Trp<-Fmoc (Verbindung 7).
2A–B. Reaktionskinetiken der Freisetzung des Peptids Trp-Gly-PAOH vom Linker-Harz-Konstrukt I. 2A. Die erste Freisetzung bei pH 8,3. 2B. Die zweite Freisetzung bei pH 13,2 (B).
3. Die Kinetiken der Freisetzung des Peptids Trp-Gly-PAOH vom Linker-Konstrukt II bei pH 8,3. Die Freisetzung findet durch einen Angriff der α-Aminogruppe von Gly, das über eine Amidbindung an die Imino-Gruppe der ersten IDA gekoppelt ist, auf den Peptidester, der mit einem der Arme von IDA gebildet wird, statt.
4A–D. Die Kinetiken der Freisetzung des Peptids Trp-Gly-PAOH von einem doppelt spaltbaren Linker unter Verwendung einer IDA-IDA-Strategie, bestimmt bei pH 4,0 (4A), 6,5 (4B) und 8,5 (4C). 4D.
Die Kinetiken einer ersten und einer zweiten Freisetzung bei pH 8,5 bzw. bei pH 13,2.
5A–B. Freisetzung des Peptids Trp-Gly-Gly-Propanolamid. Das Peptid wurde an den Festphasenträger unter Verwendung eines Diketopiperazin-Linkers gekoppelt. Die optische Dichte in Lösung (Tryptophan und Amidbindungen) wurde als eine Funktion der Zeit verfolgt. 5A. Profil der Optischen Dichte gegen die Zeit des freigesetzten Peptids, das eine nahezu quantitative Freisetzung des Peptids innerhalb von 2 Stunden zeigt. 5B. Zeitaufgelöste Absorbtions-Spektren des freigesetzten Peptids. Man beachte, dass die Spektren identisch sind, was darauf hindeutet, dass die über die Zeit erhöhte optische Dichte aus dem freigesetzten Peptid und nicht aus einem Artefakt resultierte.
6. Stabilitätstest eines Glutamat-Linkers bei einem pH-Wert von 8,46. Die Auftragung der optischen Dichte gegen die Zeit zeigt im Wesentlichen keine Freisetzung von Peptid während 7,5 Stunden.
7A–B. Freisetzung von Peptid, das an den Festphasenträger über einen Glutamat-Linker gekoppelt war. Diese Peptid-Linker-Kombination war bereits mit einer Lösung bei pH 8,5 behandelt worden, was keine Freisetzung des Peptids zur Folge hatte. Das Peptid-Linker-Konjugat wurde mit NaOH, pH 13,2 behandelt, und die Freisetzung von Gly-Trp-Gly-PAOH wurde spektralphotometrisch verfolgt. 7A. Auftragung der optischen Dichte gegen die Zeit, was eine zunehmende optische Dichte und eine nahezu quantitative Freisetzung innerhalb einer Stunde zeigt. 7B. Zeitaufgelöste Absorbtions-Spektren des freigesetzten Peptids. Man beachte, dass die Spektren identisch sind, was darauf hindeutet, dass die über die Zeit erhöhte optische Dichte aus dem freigesetzten Peptid und nicht aus einem Artefakt resultierte.
8. Zweistufige Freisetzung von Peptiden von Linkern, die zwei Esterbindungen aufweisen, sodass das Peptid mit einem freien Carboxyl-Rest freigesetzt wird. Erste Freisetzung bei pH 8,0 und zweite Freisetzung und Esterhydrolyse bei pH 12.
5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft auf Esterbindungs-Verknüpfungen basierende Linker für die Festphasen-Peptidsynthese, und zwar insbesondere Iminodiessigsäure-Linker. Solche Linker sehen eine Spaltung des Peptids vom Festphasenträger vor. In einem Aspekt der Erfindung wird die Esterbindung mit einem nukleophilen Angriff eines internen Nukleophils gespalten, was eine zyklische Verbindung, z. B. ein Diketopiperazin (DKP) bildet, das auf dem festen Träger verbleibt. Das durch die Spaltung der Esterbindung freigesetzte Peptid kann eine C-terminale Hydroxyalkylamid-Gruppe, z. B. ein Methanolamid, Ethanolamid oder Propanolamid einschließen. In einer weiteren Ausführungsform wird die Esterbindung durch ein externes Nukleophil gespalten (basische Bedingungen). In einem bevorzugten Aspekt, wenn der Linker IDA-IDA ist, werden zwei spaltbare Esterbindungs-Verknüpfungen bereit gestellt, wobei eine über eine DKP-Bildung und die zweite über eine Behandlung unter Bedingungen von hohem pH-Wert spaltbar ist.
Die Erfindung ist weiter auf Festphasenträger gerichtet, die mehr als einen spaltbaren Linker umfassen, wobei mindestens ein solcher Linker eine Esterbindungs-Verknüpfung zum Peptid enthält. Vorzugsweise ist solch ein Linker IDA und stärker bevorzugt, IDA-IDA. Ein zusätzlicher Linker kann mit der Bildung einer zyklischen Struktur, z. B. eines Diketopiperazins, angeheftet an den Festphasenträger oder mit dem Diketopiperazin, angeheftet an das freigesetzte Peptid, gespalten werden. Die nukleophilen Gruppen der Linker, die durch die Bildung eines zyklischen Produktes spalten, können orthogonal geschützt werden. Die orthogonalen Schutzgruppen können sequenziell entfernt werden, was sequenzielle Freisetzungen vorsieht. In einer anderen Ausführungsform kann die Esterbindungs-Verknüpfung an eine reaktive Carbonsäure wie Hydroxymethylbenzoesäure sein. Andere spaltbare Linker, die an den Festphasenträger in der Ausführungsform der Erfindung als mehrfach spaltbarer Linker angeheftet werden können, schließen photospaltbare Linker und säurespaltbare Linker ein, ohne darauf begrenzt zu sein. Der Festphasenträger kann ferner ein herkömmliches Handle umfassen.
Die Erfindung ist weiter auf Verfahren gerichtet, die mehrfache Linker sequenziell spalten, sodass bei jedem Spaltungsschritt nur ein Linker gespalten wird, und ein äquimolarer Teil des Peptids freigesetzt wird.
In einer besonderen Ausführungsform, unten, basiert die Freisetzung des Peptids auf der Spaltung einer Esterbindung mit einem internen Nukleophil durch eine schnelle Bildung einer zyklischen Struktur, z. B. von Diketopiperazin, unter schwach basischen Bedingungen. Vorzugsweise ist das interne Nukleophil die Imino-Funktionalität eines IDA-Linkers, die eine Esterbindung angreifen kann, die durch eine beliebige α-Carbonsäure eines Moleküls gebildet wird, welches an eine der verzweigenden Essigsäure-Gruppen von IDA gekoppelt ist. In einem Aspekt ist der Carbonsäure-Ester ein α-Carboxyl einer Aminosäure; vorzugsweise ist er ein Carboyxl von einer IDA. In einer weiteren Ausführungsform kann die freie α-Aminogruppe eines beliebigen Moleküls, das an die Imino-Gruppe von IDA gekoppelt ist, einen Ester angreifen, der mit einer der Carbonyl-Gruppen der IDA gebildet wird. In einem Aspekt kann das α-Amin ein Teil einer Aminosäure sein. In einer besonderen Ausführungsform, unten, ist die Aminosäure Glycin.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Freisetzung durch eine Behandlung mit verdünntem Natriumhydroxid oder Ammoniak in Methanol oder durch das Aussetzen an Ammoniakgas bewirkt.
In noch einer weiteren Ausführungsform, werden beide Verknüpfungen verwendet. In einer anderen Ausführungsform werden beide Verknüpfungen auf einem einzigen Linker bereit gestellt. Vorzugsweise ist solch ein Linker IDA-IDA.
In noch einer anderen Ausführungsform werden unterschiedliche Linker mit fünf Graden der Spaltbarkeit verwendet, was die Esterbindungs-Linker einschließt.
Wie hierin verwendet, schließt der Begriff Alkyl C₁- bis etwa C₁₀-Alkan, -Alken und -Alkin (d. h., gesättigte und ungesättigte Kohlenwasserstoffe) ein, ist aber nicht darauf begrenzt. Zum Beispiel kann eine Alkylgruppe Methyl, Ethyl, Ethenyl, Propyl, Propenyl, Propinyl, usw. sein. Der Begriff Alkyl, wie hierin verwendet, schließt Gruppen verzweigter Ketten sowie linearer Ketten und zyklisches Alkyl mit ein.
Wie hierin verwendet ist der Begriff „spaltbarer Linker" als ein Spacer-Molekül definiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Bindung aufweist, die unter relativ milden Bedingungen gespalten werden kann. Der Linker besitzt eine funktionelle Gruppe, die an einen Festphasenträger bindet, oder an einem Handle auf einem Festphasenträger. Der Linker weist eine zweite funktionelle Gruppe auf, die an eine Aminosäure oder ein Peptid oder eine beliebige organische Verbindung von Interesse konjugiert werden kann, die eine geeignete funktionelle Gruppe für das Ankoppeln an den Linker zur Verfügung stellt. Die Linker der Erfindung können eine dritte funktionelle Gruppe aufweisen, eine nukleophile Gruppe, die die Esterbindung angreifen und sie dadurch spalten kann. Der Linker sieht die Spaltung des Peptids vor, nachdem die Synthese vollständig ist.
Wie hierin verwendet, ist der Begriff „Festphasenträger" nicht auf eine spezielle Art von Träger begrenzt. Es ist vielmehr eine große Zahl von Trägern erhältlich und einem normalen Fachmann im Fachbereich bekannt. Festphasenträger schließen Silika-Gele, Harze, derivatisierte Kunststoff-Folien, Glas-Kügelchen, Baumwolle, Kunststoff-Kügelchen, Aluminiumoxid-Gele, Polysaccharide mit ein. Ein geeigneter Festphasenträger kann auf der Grundlage der gewünschten Endanwendung und einer Eignung für verschiedene Syntheseprotokolle gewählt werden. Zum Beispiel kann sich für die Peptidsynthese der Festphasenträger auf Harze wie p-Methylbenzhydrylamin(pMBHA)-Harz (Peptides International, Louisville, KY), Polystyrol- (z. B., PAM-Harz, erhalten von Bachem Inc., Peninsula Laboratories, usw.), Poly(dimethylacrylamid)-gepfropftes Styrol-codivinylbenzol- (z. B., POLYHIPE^®-Harz, erhalten von Aminotech, Kanada), Polyamidharz (erhalten von den Peninsula Laboratories), mit Polyethylenglykol gepfropftes Polystyrol-Harz (TentaGel^®, Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland) Polydimethylacrylamidharz (erhalten von Milligen/Biosearch, Kalifornien) oder Sepharose (Pharmacia, Schweden) beziehen.
In einer Ausführungsform kann der Festphasenträger für eine in vivo-Anwendung geeignet sein, d. h. er kann als ein Carrier für oder ein Träger für direkte Anwendungen des Peptids oder einer anderen biologisch aktiven Verbindung (z. B., TentaGel, Rapp Polymere, Tübingen, Deutschland) dienen. In einer besonderen Ausführungsform kann der Festphasenträger genießbar und oral verzehrbar sein.
Der Begriff "Peptid" wird hierin in seiner weitesten Bedeutung verwendet, um sich auf eine Verbindung von zwei oder mehr Untereinheits-Aminosäuren, -Aminosäure-Analoga oder -Peptidmimetika zu beziehen. Die Untereinheiten können durch Peptidbindungen verknüpft sein. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Aminosäure" auf entweder natürliche und/oder nicht natürliche oder synthetische Aminosäuren, was Glycin und sowohl die optischen D- als auch L-Isomere und Aminosäuren-Analoga und Peptidmimetikum-Untereinheiten einschließt. Wie hierin verwendet, ist ein Peptidmimetikum ein Molekül, das einem Peptid ähnliche Eigenschaften aufweist, ohne eine chemische Struktur eines Peptids zu besitzen. Die Peptide können D-Aminosäuren, eine Kombination von D- und L-Aminosäuren und verschiedene „Designer"-Aminosäuren (z. B., β-Methyl-Aminosäuren, Cα-Methyl-Aminosäuren und Nα-Methyl-Aminosäuren, usw.) umfassen, um spezielle Eigenschaften auf die Peptide zu übertragen. Darüber hinaus, indem man bestimmte Aminosäuren bei bestimmten Kopplungsschritten festsetzt, können Peptide mit α-Helices, β-Schleifen, β-Faltblättern, γ-Schleifen und zyklische Peptide erzeugt werden.
5.1. LINKER
Die selektiv spaltbaren Linker, die auf einer Esterbindungs-Verknüpfung basieren, sind dadurch gekennzeichnet, dass sie gegen einen nukleophilen Angriff sensitiv sind. Vorzugsweise ist der Linker Iminodiessigsäure.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Strategien für das Erhöhen oder das Verringern der Sensitivität einer bestimmten Esterbindung gegen einen nukleophilen Angriff bereit. Diese Strategien schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf das Beeinflussen der Nukleophilie des Nukleophils; das Beeinflussen der Zugänglichkeit des Ester-Carbonyls; und das Beeinflussen der Neigung zu zyklisieren, in dem Fall, bei dem das Nukleophil das Ester-Carbonyl in einer Zyklisierungsreaktion angreift. Durch Veränderung dieser Parameter stellt die Erfindung eine Steuerung des pH-Werts der Freisetzungsreaktion, eine Steuerung der Rate der Freisetzung und eine Steuerung der Menge des Peptids, das freigesetzt wird, zur Verfügung.
Für die Klarheit der Diskussion, wird die Erfindung in den Unterabschnitten unten durch ein Beispiel für die (i) Diketopiperazin-bildenden Linker (Linker, die ein internes Nukleophil enthalten und zyklische Strukturen bilden, die am Festphasenträger nach der Abspaltung angeheftet bleiben) und (ii) die Linker der Hydroxymethylbenzoe-, Glutamin- oder Asparagin-Säure (Linker, die nur durch einen externen nukleophilen Angriff spaltbar sind) beschrieben. Jedoch können die Prinzipien analog auf andere auf einer Esterbindung basierte Linker angewendet werden.
5.1.1. BEI MODERATEM pH-WERT SPALTBARE ESTER-LINKER
In einer Ausführungsform setzen die Linker der Erfindung einen Peptidalkohol nach der Bildung eines Diketopiperazins frei, welches auf dem Festphasenträger zurück bleibt. Solche Linker werden hierin als „Diketopiperazin(DKP)-Linker" bezeichnet. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Beobachtung, dass ein Peptid, das an ein aliphatisches Alkohol-Amin gekoppelt ist, bei dem die Amino-Gruppe eine Amidbindung mit dem C-terminalen Carboxyl des Peptids bildet und die Alkohol-Gruppe mittels einer Esterbindung an einen zyklisierbaren Linker angeheftet ist, vom Linker unter milden Bedingungen gespalten werden kann. Nach dem Entschützen des Nukleophils auf dem Linker, kann das freie Nukleophil die Esterbindung angreifen, wodurch sich ein zyklisches Produkt bildet, das an dem festen Träger angeheftet ist, z. B. das Diketopiperazin, und das Peptid freisetzt.
Das Feststellen der Iminodiessigsäure als eine in die Diketopiperazin-Bildung involvierte alpha-Aminosäure, ermöglicht das Entwerfen von neuen doppelt spaltbaren Linkern. Die Iminodiessigsäure ist aus mehreren Gründen eine geeignete Schlüsselverbindung für den Entwurf von Doppelspaltungs-Linkern: (i) Die Imino-Gruppe ist in einer α-Position bezogen auf die Carboxyl-Gruppen; (ii) beide Carboxyl-Gruppen sind chemisch gleich (identisch); (iii) als eine N-substituierte Aminosäure ist sie für eine Zyklisierung über eine DKP-Bildung mit so gut wie jeder anderen α-Aminosäure anfällig; (iv) sie ist nicht chiral; (v) ihr Preis ist mehr als konkurrenzfähig. Im Allgemeinen gibt es drei Variationen, um einen IDA-basierten Linker zu konstruieren. Sie können schematisch als Dipeptide dargestellt werden, die Aaa-IDA, IDA-Aaa oder IDA-IDA enthalten, wobei Aaa eine beliebige α-Aminosäure ist, vorzugsweise solch eine, die für eine Zyklisierung über eine DKP-Bildung anfällig ist. Die Position von IDA in solch einem Dipeptid scheint nicht wichtig zu sein. Dies gilt nicht für andere Kombinationen von Aminosäuren, wie Glu-Pro und Pro-Glu, wie unten beschrieben.
Daher ist, in einer besonderen Ausführungsform, unten, der Linker IDA, bei der ein Carboxyl dazu verwendet wird, um an den Festphasenträger zu koppeln und das andere Carboxyl an ein Alkoholderivat eines Peptids gekoppelt wird, und ein Amin einer an die Imino-Gruppe gekoppelten Aminosäure als ein Nukleophil dienen kann. In einer anderen Ausführungsform, unten, ist der Linker IDA, die an einen festen Träger an dem einem Carboxyl und an eine Aminosäure am anderen Carboxyl gekoppelt ist. Das α-Carbonyl der Imino-Säure wird dazu verwendet, einen Ester zu bilden, und die Imino-Gruppe der IDA kann den Ester angreifen. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform stellen verzweigte IDA-Linker (1) eine freie Imino-Gruppe bereit, die an einem nukleophilen Angriff eines Esters zur Bildung von DKP teilnehmen kann; und (2) mindestens eine Esterbindung, die durch eine Zyklisierungsreaktion spaltbar ist, und eine Esterbindung, die durch eine Hydrolyse spaltbar ist.
In einer weiteren Ausführungsform, unten, ist der Linker ein Dipeptid der Sequenz Glutaminsäure-Prolin. In einer weiteren Ausführungsform, unten, ist der Linker ein Dipeptid der Sequenz Prolin-Glutaminsäure. In noch einer weiteren Ausführungsform ist der Linker ein Dipeptid der Sequenz Lysin-Prolin. Die N-terminale Aminogruppe des Dipeptids fungiert als das Nukleophil in der Spaltungsreaktion. Im Allgemeinen kann eine beliebige Art von Dipeptid verwendet werden, mit der Maßgabe, dass das Dipeptid eine funktionelle Seitenketten-Gruppe für die Kopplung an den Festphasenträger enthält. In bestimmten Ausführungsformen, unten, wird die γ-Glutamyl-Gruppe der Glutamin-Säure verwendet, um mit dem Festphasenträger zu koppeln. Andere Seitenketten-Gruppen, die für das Ankoppeln an den Festphasenträger geeignet sind, schließen die Seitenkette der Asparaginsäure, und die mit Bernsteinsäure-Anhydrid derivatisierte ε-Aminogruppe von Lysin ein, ohne darauf begrenzt zu sein.
Die nukleophile Gruppe der Diketopiperazin-Linker ist während der Synthese und vor der Abspaltung des Peptids geschützt. In einer Ausführungsform der Erfindung kann die Spaltungsreaktion auf der Ebene der Entschützung des Nukleophils gesteuert werden. In einer bestimmten Ausführungsform, in der das Nukleophil eine Imino-Gruppe der Iminodiessigsäure oder eine α-Aminogruppe des Linker-Dipeptids ist, kann die Schutzgruppe Boc, Fmoc, Alloc, Npys, Z oder eine modifizierte Z-Gruppe sein. Wie im Fachbereich weithin bekannt ist, sind solche Schutzgruppen unter unterschiedlichen Bedingungen entfernbar und können verwendet werden, wo ein Entfernen unter solchen Bedingungen gewünscht wird. Zum Beispiel wird die Boc-Schutzgruppe mit TFA entfernt; die Fmoc-Schutzgruppe wird unter basischen Bedingungen entfernt; die Alloc-Schutzgruppe wird durch eine Hydrogenolyse entfernt; die Npys-Schutzgruppe wird unter reduzierenden Bedingungen entfernt z. B. durch eine Behandlung mit einer freien -SH-Gruppe; und die Z-Schutzgruppe wird in HBr oder Essigsäure oder durch eine Hydrogenolyse entfernt.
In einer weiteren Ausführungsform, in der mehrfache Linker verwendet werden, werden zwei Linker vom Diketopiperazin-Typ eingesetzt, die unter unterschiedlichen Bedingungen freisetzbar sind. Die unterschiedlichen Linker besitzen unterschiedliche Schutzgruppen, z. B. Boc an einem Linker, Npys oder Alloc an dem anderen Linker, und sind damit nach unterschiedlichen Entschützungs-Prozeduren spaltbar.
Nach dem Entschützen des Nukleophils, kann das Nukleophil mit dem Ester-Carbonyl reagieren, wodurch das Peptid freigesetzt wird. Jedoch hängt die Rate dieses nukleophilen Angriffs vom pH-Wert des Puffers, von der Nukleophilie des Nukleophils und von der Größe und der Art des zu bildenden Rings ab. Zum Beispiel werden bei saurem pH-Wert die Elektronen des Nukleophils mit der Lewis-Säure Wechselwirken. Wenn das Nukleophil ein Amin ist, wird das Amin protoniert werden. Unter diesen Bedingungen wird der nukleophile Angriff nicht stattfinden, oder er wird sehr langsam sein. Daher benötigt der Diketopiperazin-Linker höchstens leicht saure (pH-Wert 6–7), vorzugsweise neutrale (pH-Wert 7) oder leicht basische (größer als pH 7) Bedingungen, um das Peptid innerhalb eines angemessenen Zeitraums freizusetzen. Eine Anpassung des pH-Werts ist ein Mittel, das die Steuerung der Rate der Freisetzung eines Peptids bereit stellt. In einer bestimmten Ausführungsform wird das Peptid beim pH-Wert 8,5 schnell freigesetzt, wenn der Linker IDA-IDA, Gly-IDA und Glu-Pro ist. In einer weiteren Ausführungsform wird das Peptid bei einem pH-Wert größer als pH 8,5 freigesetzt.
Das Vermögen des Linkers, eine zyklische Struktur zu bilden, hängt sehr stark von der Anzahl der Atome im Ring ab. Zyklisierungsreaktionen, die eine fünf- oder eine sechsgliedrige Ringstruktur bilden, wobei sechsgliedrige Ringe stärker bevorzugt sind. Eine Zyklisierung zur Bildung von viergliedrigen Ringen oder weniger, oder siebengliedrigen Ringen oder mehr, ist nicht bevorzugt.
Die Rate der Spaltung hängt auch von der inhärenten Nukleophilie des Nukleophils ab. Diese wiederum wird durch die benachbarten funktionellen Gruppen beeinflusst. Daher wird in dem Beispiel, in dem der Linker ein Dipeptid ist, hauptsächlich die Seitenkette des nukleophilen Peptids die relative Nukleophilie der α-Aminogruppe bestimmen. Zum Beispiel wird S-Methylcystein die Nukleophilie der Amino-Gruppe auf Grund des induktiven Effektes des Schwefels in seiner Seitenkette erhöhen. Auf der anderen Seite wird die oxidierte (Sulfoxid oder Sulfon) Form dieser Aminosäure die Nukleophilie der Aminogruppe wesentlich verringern.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Rate der Spaltung durch die Zugänglichkeit des Ester-Carbonyls bestimmt. Zum Beispiel, wenn sich sperrige Gruppen, wie sekundäre und tertiäre Aryl- oder Alkyl-Gruppen, einschließlich Heteroaryl- oder Heteroalkyl-Gruppen, aber nicht darauf begrenzt, in der Nähe des Ester-Carbonyls befinden, kann das Nukleophil sterisch daran gehindert sein, das Carbonyl anzugreifen. In einer Ausführungsform ist der Zugang zum Ester-Carbonyl durch die Gegenwart einer Methyl-, Ethyl-, Propyl-, usw. Gruppe in der C1-Position neben dem Sauerstoff, der an das Carbonyl gebunden ist, behindert. Die Reaktionsrate kann auf der anderen Seite durch das Entfernen von sperrigen Gruppen in der Nähe des Ester-Carbonyls erhöht werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Reaktionsrate beeinflusst werden, indem die Neigung des Linkers zu zyklisieren verändert wird. Die Einbeziehung eines Prolin-Aminosäurerests in der zweiten (C-terminalen) Position eines Linkers erhöht die Rate der Spaltung. Obwohl es nicht beabsichtigt ist, an irgendeine bestimmte Theorie gehalten zu sein, entspricht diese Zunahme in der Rate der Spaltung einer erhöhten Neigung zu zyklisieren. Auf der anderen Seite verringert die Einbeziehung einer Prolin-Aminosäure in die erste (N-terminale) Position des Linkers die Rate der Spaltung. In einem speziellen Beispiel, unten, spaltet der Linker Glu-Pro bei pH 8,5 schnell, aber der Linker Pro-Glu spaltet bei diesem pH-Wert sehr langsam. In einer weiteren Ausführungsform schließt der Linker D-Aminosäuren mit ein, die dafür bekannt, sind leicht zu zyklisieren. Außerdem ist es bekannt, dass sterische Effekte das Zyklisierungsvermögen ebenso bestimmen. Zum Beispiel werden Peptide mit einem aminoterminalen Glycin sehr schnell zyklisieren im Vergleich zu Peptiden mit einem aminoterminalen Valin, welche jedoch immer noch schneller zyklisieren werden als ein Peptid, das die N-terminal sterisch anspruchsvolle Aminoisobuttersäure enthält.
Es kann leicht durch einen normalen Fachmann in diesem Fachbereich gewürdigt werden, versehen mit den vorangehenden Unterrichtungen, dass die Diketopiperazin-Linker der Erfindung einen beliebigen Linker einschließen können, der durch eine Zyklisierung, ein Nukleophil in die Nähe zum Ester-Carbonyl für eine Reaktion mit dem Carbonyl platzieren kann. Solch eine Strategie ist bevorzugt, da sie keinen Überschuss an freiem Nukleophil erfordert, da jeder Linker ein Nukleophil einschließt. IDA-Linker sind besonders bevorzugt.
In einer Ausführungsform wird der Linker synthetisiert, indem ein Ester von der Carboxyl-Gruppe (z. B., einer Aminosäure oder einer beliebigen Carbonsäure) mit einem kurzkettigen (C1 bis C6) Aminoalkohol gebildet wird. Die Amino-Gruppe kann dann an die Carboxyl-Gruppe der ersten Aminosäure der Peptidkette unter Verwendung von Standard-Verfahren der Peptidsynthese gekoppelt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann die Seitenkette von Serin oder Threonin als der Alkohol fungieren, was die Erfordernis für ein Aminoalkohol-Derivat unnötig macht.
5.1.2. BEI HÖHEREM pH-WERT SPALTBARE ESTER-LINKER
In noch einer anderen Ausführungsform kann der Linker der Erfindung eine Esterbindung enthalten, die für eine Spaltung durch ein freies Nukleophil, z. B. ein Hydroxy-Ion oder Ammoniak anfällig ist. In einem besonderen Beispiel kann der Linker eine IDA sein, bei der die Imino-Gruppe an ein Carboxyl gekoppelt ist, und damit nicht für einen nukleophilen Angriff frei ist. In einem weiteren Beispiel kann der Linker Glutaminsäure-Propanolamin sein (bei dem die Aminogruppe des Propanolamins an das C-terminale Carboxyl des Peptids gekoppelt ist). Andere geeignete Säuregruppen für Linker schließen p-(Hydroxymethyl)benzoesäure, Asparaginsäure und Hydroxyessigsäure ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Anstelle von Aminoalkoholen können Derivate von Serin, Homoserin und Threonin, die an ihren OH-Gruppen substituiert sind (durch die Bildung der Esterbindung) verwendet werden.
Die Esterbindung kann durch die Behandlung mit einer starken Base gespalten werden. Zum Beispiel kann die Bindung durch eine Behandlung mit 0,1% Natriumhydroxid (NaOH) gespalten werden. In einer weiteren Ausführungsform kann die Bindung durch eine Behandlung mit Ammoniak in Alkohol, vorzugsweise Methanol, oder durch ein Aussetzen an gasförmigen Ammoniak gespalten werden. Ein besonderer Vorteil des letzteren Systems ist, dass nach der Spaltung der Ammoniak und der Alkohol verdampft werden können, was das abgespaltene Peptid bei einem neutralen pH-Wert zurück lässt.
5.1.3. FREISETZUNG VON VERBINDUNGEN MIT EINER FREIEN CARBOXY-GRUPPE
In den vorherigen Ausführungsformen sieht die Freisetzung der Verbindung von dem doppelt freisetzbaren Linker, der auf IDA basiert, Verbindungen vor, die das Gly-HOPA daran angeheftet enthalten. Da es in einigen Fällen wünschenswert sein kann, eine Verbindung ohne das Hydroxypropylamid des Glycins freizusetzen, d. h. mit einer freien Carboxy-Gruppe, wird ein modifizierter IDA-IDA-Linker bereit gestellt, der eine zweite Esterverknüpfung enthält. Die Esterbindung wird in den Linker durch das Anheften einer Hydroxy-Säure, z. B. einer p-Hydroxymethylbenzoesäure, eines Serins oder eines 3-Hydroxypropylamids der Bernsteinsäure an beide Arme eines IDA-IDA-Linkers eingeführt. Während der ersten Freisetzung bei einem pH-Wert von 8 wird das DKP gebildet, und die Verbindung wird mit dem Hydroxysäure-Linker in die Lösung freigesetzt. Anschließend werden die Kügelchen von der Lösung durch eine Filtration getrennt, der pH-Wert wird auf etwa 13 durch die Zugabe einer starken Base, wie NaOH, gebracht. Nach einer Inkubation während eines Zeitraums, der ausreichend ist, den Ester zu hydrolysieren, normalerweise etwa 30 min, wird die Base neutralisiert, sodass der pH-Wert für einen biologischen Screening-Assay geeignet ist. Daher wird die zweite Freisetzung durch die Verwendung von NaOH wie zuvor beschrieben durchgeführt, und sieht auf Grund des Vorhandenseins der zweiten Esterbindung direkt die gewünschte Verbindung mit einer freien Carboxy-Gruppe vor.
Die allgemeine Struktur eines Linkers dieser Ausführungsform, der Verbindungen mit freien Carboxy-Gruppen ergibt, ist:
worin das freie Carboxy dafür gedacht ist, an den Festphasenträger angeheftet zu werden und R ein Kohlenstoff- oder ein Hetero-Kohlenstoff-Skelett ist, das zwei Hydroxyl-Gruppen verbindet (z. B., R = -(CH₂)₃-O-CO(CH₂)₂-CO-Gly-NH-(CH₂)₃-). Die wesentliche Esterbindung für den Zweck der Erfindung ist die Esterbindung, die dem Peptid oder einer anderen freizusetzenden Testverbindung am nächsten ist.
Die Chemie der beiden Freisetzungen an einem Modell-Linker ist schematisch in 8 veranschaulicht.
5.2. MEHRFACH SPALTBARE LINKER
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung, werden die auf einer Esterbindung basierten Linker mit anderen bekannten spaltbaren Linkern kombiniert, um eine sequenzielle Freisetzung des Peptids vom Festphasenträger zur Verfügung zu stellen. Solche mehrfach spaltbaren Linker sind vorher beschrieben worden (Internationale Patent-Veröffentlichung Nr. WO92/00091 ). Die auf einer Esterbindung basierten spaltbaren Linker sehen einen bevorzugten Linker in Kombination mit anderen selektiv spaltbaren Linkern vor. In einer besonderen Ausführungsform werden sowohl der Diketopiperazin-Linker als auch ein Esterbindungs- Linker, der bei hohem pH-Wert spaltbar ist, auf einem Festphasenträger kombiniert.
Wie durch einen normalen Fachmann im Fachbereich leicht anerkannt werden kann, gibt es zahlreiche Strategien für das Anheften mehrerer unterschiedlicher spaltbarer Linker an einen Festphasenträger. Vorzugsweise wird der Linker an den Festphasenträger unter Verwendung von Standardtechniken einer chemischen Kondensationsreaktion angeheftet, z. B. der Reaktion eines aktivierten Carbonyls auf dem Linker mit einem freien Amin oder einem anderen Nukleophil auf dem festen Träger. Um mehr als einen Linker anzuheften, wird vorzugsweise der feste Träger oder das an den festen Träger angeheftete Handle weiter mit verzweigenden Lysin-Gruppen derivatisiert. Jede der beiden Aminogruppen am Lysin kann selektiv entschützt und mit einem speziellen Linker oder mit einem anderen Lysin gekoppelt werden, um das Verzweigen und das Anheften zusätzlicher Linker fortzuführen. In einer weiteren Ausführungsform kann der Linker so umgesetzt werden, dass die Konzentration des Linkers einen Bruchteil der Konzentration des Nukleophils beträgt. Auf diese Weise kann jeder Linker in nicht quantitativer Weise an den festen Träger gekoppelt werden, was freie nukleophile Gruppen für das Ankoppeln an den nächsten Linker übrig lässt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine Anzahl von unterschiedlichen Linkern auf einem einzelnen Festphasenträger zusätzlich zu den auf einer Esterbindungsverknüpfung basierten Linkern kombiniert werden. Diese schließen Linker ein, sind aber nicht darauf beschränkt, die säuresensitiv, basensensitiv, Nukleophil-sensitiv, Elektrophil-sensitiv, lichtempfindlich, oxidationsempfindlich oder reduktionsempfindlich sind. Beispiele von lichtempfindlichen (photospaltbaren) Linkern werden bei Barany und Albericio (1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 4936 –4942), Wang (1976, J. Org. Chem. 41: 32–58), Hammer et al. (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36: 31–45) und Kreib-Cordonier et al. (1990, in Peptides-Chemistry, Structure and Biology, Rivier und Marshall, Hrsg., Seiten 895–897) gefunden. Landen (1977, Methods Enzym. 47: 145–149) beschreibt die Verwendung von wässriger Ameisensäure, um Asp-Pro-Bindungen zu spalten. Andere mögliche Linker-Gruppen, die unter basischen Bedingungen spaltbar sind, schließen jene ein, die auf p-(Hydroxymethyl)benzoesäure (Atherton et al., 1981, J. Chem. Soc. Perkin I: 538–546) und Hydroxyessigsäure (Baleaux et al., 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28: 22–28) basieren. Geysen et al. (1990, J. Immunol. Methods 134: 23–33) berichteten über eine Peptidspaltung durch einen Diketopiperazin-Mechanismus. Somit stellt die vorliegende Erfindung „reverse" Diketopiperazin-Linker zur Verfügung, die in Verbindung mit dem durch Geysen et al. beschriebenen Freisetzungsmechanismus von Diketopiperazin verwendet werden. Vorzugsweise werden unterschiedliche blockierende Gruppen verwendet, um die Nukleophile der unterschiedlichen Diketopiperazin-Linker zu blockieren. Ein Enzym kann einen Linker spezifisch spalten, der eine Sequenz, die empfindlich ist, oder ein Substrat für eine Enzymspaltung umfasst, z. B. eine Protease-Spaltung eines Peptids; eine Endonuklease-Spaltung eines Oligonukleotids. In bestimmten Fällen kann man 10–50% des Harzes durch eine Substitution mit dem spaltbaren Linker derivatisieren, und die restlichen 50–90%, die mit einem nicht spaltbaren Linker substituiert sind, um sicherzustellen, dass genügend Peptid nach der Spaltung des Linkers für eine Sequenzierung übrig bleiben wird. Zusätzlich zu den spaltbaren Linkern können verschiedene Standard-Linker, d. h. die unter Standardabspaltbedingungen, z. B. 50% TFA oder HF, gespalten werden können, verwendet werden, um das Oligomer an den Festphasenträger anzuheften. Beispiele von Linkern schließen Aminobuttersäure, Aminocapronsäure, 7-Aminoheptansäure und 8-Amino caprylsäure mit ein. Fmoc-Aminocapronsäure ist von Bachem Kalifornien kommerziell erhältlich. In einer weiteren Ausführungsform können Linker zusätzlich ein oder mehrere β-Alanine als Spacer umfassen. Solche Standard-Linker in der Mehrfachlinker-Ausführungsform der Erfindung sehen ein Zurückhalten von Peptid auf dem Festphasenträger für ein nachfolgendes Sequenzieren vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Sicherheits-Fang-Handle (Safety-Catch-Handle) verwendet werden (siehe Patek und Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32: 3891–4). Solch ein Handle ist ein substituiertes Benzhydrylamin der allgemeinen Formel (I):
in welcher a = 1 bis 3, X¹ [S]R¹ ist oder X¹ Z ist, die X¹-Gruppen sich in den ortho- oder para-Positionen des ersten Benzolrings befinden und R¹ eine Alkyl-Gruppe ist und
in welcher b = O bis 3, X² [S]R² ist, die X²-Gruppen sich in den ortho- oder para-Positionen des zweiten Benzolringes befinden und R² eine Alkylgruppe ist; und
in welcher Z R³, OR³ oder [S]R³ in einer beliebigen Position ist, die nicht durch X¹ besetzt ist, es sei denn X¹ ist Z, und R³ eine Alkylgruppe ist, die eine reaktive funktionelle Gruppe für das Ankoppeln an einen Festphasenträger umfasst, und in welcher, wenn X¹ Z ist, Z [S]R³ in einer ortho- oder para-Position ist; und
in welcher c = 0 oder 1 und d = 0 oder 1, Y OR⁴ ist und R⁴ eine Alkylgruppe ist; und
in welcher [S] -S-, -SO- oder -SO₂- ist; und
in welcher D H, eine Schutzgruppe oder ein N^α-geschütztes Acyl ist. Wie hierin verwendet, kann „Alkyl" ein C₁ bis C₁₀ sein. Die Sicherheits-Fang-Handles können wie beschrieben (Patek und Lebl, oben) synthetisiert werden. Zum Beispiel können Hydroxy- oder Mercapto-Benzophenone mit ω-Haloestern von Alkancarbonsäuren in der Gegenwart von Fluoridionen umgesetzt werden. Das Benzophenon-Carbonyl wird nachfolgend in ein Amin durch routinemäßige Syntheseverfahren umgewandelt, z. B. eine Reaktion mit Hydroxylamin, um ein Oxim zu erhalten, gefolgt von einer Reduktion, z. B. mit Zink, um ein Benzhydrylamin zu erhalten oder durch eine reduktive Aminierung, z. B. durch eine Reaktion mit Ammonium-Formiat. Alternativ kann das Benzophenon zum Alkohol reduziert und mit einem N^α-geschützten Aminosäureamid amidiert werden.
5.2.1. UNTER VERWENDUNG EINER ESTERBINDUNGS- UND EINER METHIONINBINDUNGS-SPALTUNG DOPPELT SPALTBARE LINKER
Ein Screening kombinatorischer Bibliotheken unter Verwendung der Selectid-Technologie kann entweder unter Verwendung eines Eindungs-Assays auf Kügelchen oder eines Assays mit Freisetzung durchgeführt werden. Es kann wünschenswert sein, beide Verfahren des Screenens zu kombinieren, d. h. die Bibliothek nach einem Liganden mit einem Eindungs-Assay auf Kügelchen zu screenen und dann die Bindung des möglichen Liganden in Lösung zu bestätigen. Um eine unbeabsichtigte Freisetzung während des Eindungs-Assays auf Kügelchen zu vermeiden, wird ein Linker bereit gestellt, der eine Esterverknüpfung, die für eine Freisetzung bei einem hohem pH-Wert geeignet und bei pH 8,5 oder darunter stabil ist, wie im Abschnitt 5.1.2 beschrieben, zusammen mit einem Linker kombiniert, der eine Methionin-Aminosäure enthält. Die Peptidbindung zwischen dem Carboxy-Ende des Methionins und einer zweiten Aminosäure kann durch Cyanbromid selektiv gespalten werden, begleitet von der Bildung eines Homoserin-Lactons.
Eine weitere Anwendung der Methionin enthaltenden Linker ist die Analyse der Verbindung von Interesse durch Massenspektroskopie, da eine solche Analyse die Spaltung der Verbindung vom Kügelchen erfordert.
Ein Beispiel dieser Art von Linker wird veranschaulicht, indem ein Methionin an eine Dicarbonsäure, z. B. eine Glutaminsäure angeheftet wird, die an den Festphasenträger gebunden ist. Die den Ester enthaltende Verknüpfung wird durch eine Reaktion der zweiten Carboxyl-Gruppe der Glutaminsäure mit Hydroxypropylamin bereit gestellt, um eine Amidbindung zu erhalten. Besonders bevorzugt als die an die Hydroxylgruppe des Hydroxypropylamins zu koppelnde erste Aminosäure ist β-Ala, deren Anwesenheit die Bildung von DKP während der Stufe der Synthese, wenn eine freie Aminoeinheit eines Dipeptids vorliegt, verhindert. Die Konstruktion eines Linkers, der Methionin enthält, ist in Beispiel 7 veranschaulicht.
5.3. VERWENDUNG DES LINKERS FÜR EINE PEPTIDSYNTHESE
Die Linker dieser Erfindung sind für das Anheften einer Peptidkette an einen Festphasenträger für eine Peptidsynthese gut geeignet. Die Linker können an beliebige Amino-Harze über eine geeignete funktionelle Gruppe, z. B. eine Carbonsäure, an die Alkylgruppe angeheftet werden. Das Anheften einer Carbonsäurefunktionellen Gruppe an ein Amin auf dem Harz kann entsprechend einer beliebigen der üblicherweise für die Peptidsynthese verwendeten Techniken, z. B. eine Herstellung eines OPfp-, HOBt- oder eines anderen aktivierten Esters, eine Kondensation in der Gegenwart eines Carbodiimids, usw. ablaufen. Geeignete feste Träger für einen Gebrauch in der Erfindung werden diskutiert, oben.
Methoden der Festphasenpeptidsynthese sind im Fachbereich gut bekannt. Einfach ausgedrückt wird eine N^α-geschützte Aminosäure am α-Carboxyl aktiviert und mit dem entschützten N^α des werdenden Peptid-Linker-Festphasenträgers gekoppelt. Die Kopplungsreaktionen können durch Techniken bewerkstelligt werden, die jenen im Fachbereich geläufig sind (siehe, z. B. Stewart und Young, 1984, Solid Phase Synthesis, zweite Ausgabe, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Fields und Noble, 1990, „Solid Phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethyloxycarbonyl amino acids," Int. J. Pept. Protein Res. 35: 161–214; Geysen et al., 1987, J. Immunol. Methods 102: 259–274). Die Chemie des Koppelns, Entschützens und schließlich der Spaltung des Peptids vom Festphasenträger hängt von der Wahl der αN-Schutzgruppe ab, die im Allgemeinen tert-Butoxycarbonyl (Boc) oder 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Peptidsynthese unter Verwendung von Linkern der Erfindung sollte die Vollständigkeit der Kopplung bestimmt werden. Verfahren zur Bestimmung der Vollständigkeit der Kopplung sind im Fachbereich gut bekannt. Wenn die Kopplung nicht vollständig wäre, sollte die Reaktion durch eine zweite Kopplung zur Vervollständigung getrieben werden, z. B. (a) durch die Verwendung einer höheren Konzentration der aktivierten Aminosäure oder eines anderen Aktivierungsmechanismus; (b) an Hand des Hinzufügens von anderen oder zusätzlichen Lösungsmitteln; oder (c) an Hand des Hinzufügens von chaotropen Salzen (siehe Klis und Stewart, 1990, in Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier und Marshall (Hrsg.), ESCOM Verlag, Seiten 904–906).
5.4. BIOAKTIVITÄTS-ASSAYS MIT DEN FREISETZBAREN LINKERN
Die spaltbaren Linker der Erfindung, die auf einer Esterbindungs-Verknüpfung basieren, sind für Bindungs-Assays und biologische Assays verwendbar. Ein Teil des Peptids kann vom Linker freigesetzt und seine Aktivität in situ ermittelt werden. Die Festphasenträger, von denen das Peptid von Interesse freigesetzt wurde, können dann erhalten und die Sequenz des auf dem Träger verbleibenden Peptids bestimmt werden, wie in der Internationalen Patent-Veröffentlichung Nr. WO92/00091 beschrieben. Alternativ können die Diketopiperazin-Linker der Erfindung in den herkömmlichen Verfahren angewendet werden, wie jene, die von Geysen et al. (1990, J. Immunol. Methods 134: 23–33) beschrieben werden, mit dem Vorteil, dass die Rate der Spaltungsreaktion gesteuert werden kann und das freigesetzte Peptid nicht den Diketopiperazinrest daran angeheftet aufweisen wird.
Die Fähigkeit, die Freisetzungsrate zu steuern, kann für biologische Assays verwendet werden, bei denen der Effekt einer langsamen Langzeit-Freisetzung des Peptids untersucht wird.
5.4.1. PEPTID-ZUFALLSBIBLIOTHEKEN
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung werden die auf einer Esterbindungsverknüpfung basierten spaltbaren Linker mit einer Peptid-Zufallsbibliothek verwendet, wie in der Internationalen Patent-Veröffentlichung Nr. WO92/00091 , veröffentlicht am 9. Januar 1992, beschrieben.
Die vorliegende Erfindung erlaubt eine Identifizierung von Peptidliganden, die Akzeptormoleküle binden. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Akzeptormolekül" auf eine beliebige Substanz, die an einen Peptidliganden bindet. Akzeptormoleküle können ein biologisches Makromolekül, wie Antikörper, Rezeptoren oder Viren sein, ohne darauf beschränkt zu sein. Darüber hinaus können Akzeptormoleküle eine chemische Verbindung, wie Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, Lipide, Arzneimittel, Metalle oder kleine Moleküle sein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die Peptidbibliothek der Erfindung kann potenziell mit vielen verschiedenen Akzeptormolekülen Wechselwirken. Indem man die spezielle Peptidart identifiziert, an die ein bestimmtes Akzeptormolekül bindet, ist es möglich, die Peptidart von Interesse physikalisch zu isolieren.
Eine Wechselwirkung mit Akzeptormolekülen kann durch kompetitive Eindungs-Assays ermittelt werden, bei denen der native Ligand eines Rezeptors markiert ist. Alternativ können die Peptide z. B. durch das Einbringen eines radioaktiven Tracer-Elements markiert und das Binden eines markierten Peptids an das Akzeptormolekül direkt detektiert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Assays für die biologische Aktivität eines Peptids aus einer Bibliothek zur Verfügung, die so behandelt wird, dass alle giftigen Moleküle, die von der Synthese zurück bleiben, z. B. durch Neutralisation und extensives Waschen mit einem Lösungsmittel, sterilem Wasser und Kulturmedium entfernt werden. Die biologischen Aktivitäten, die getestet werden können, schließen die Toxizität und Tötung, Stimulation und Wachstumsförderung und physiologische Veränderung ein.
Gemäß der vorliegenden Erfindung sind die Peptide der Bibliothek unter Verwendung des Diketopiperazin-Linkers der Erfindung vom Festphasenträger, hierin auch als „Kügelchen" bezeichnet, selektiv spaltbar. In einer Ausführungsform werden Kügelchen so präpariert, dass nur ein Bruchteil der Peptide selektiv spaltbar ist. Das Nukleophil des Diketopiperazin-Linkers wird entschützt, und die Bibliothek wird mild basischen Bedingungen ausgesetzt, z. B. größer als pH 7, sodass eine Spaltung einer Fraktion von Peptiden stattfindet. In einer Ausführungsform wird die Bibliothek so behandelt, dass 10–90% der Peptide freigesetzt werden. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform werden 25–50% der Peptide freigesetzt. Wo alle Peptide spaltbar sind, kann eine nicht-quantitative Spaltung bewirkt werden, indem die Rate der Spaltungsreaktion, wie oben beschrieben, beeinflusst wird und indem die Konzentration und die Zeit der Behandlung mit der Base reguliert werden. Nach der Behandlung, um eine Spaltung zu bewirken, kann die Bibliothek weiter, z. B. durch eine Neutralisation oder Hinzufügung eines Puffers, behandelt werden, um sie mit dem gewünschten Assay biologisch verträglich zu machen. In der Praxis würde ein normaler Fachmann in der Lage sein, geeignete Spaltungsbedingungen für eine partielle Spaltung leicht zu bestimmen, wenn alle Peptide der Bibliothek durch spaltbare Linker oder Bindungen an die feste Phase angeheftet sind. Ein gewöhnlicher Fachmann würde ferner verstehen, dass die relative Konzentration des freigesetzten Peptids beeinflusst werden kann, indem man die Spaltungsbedingungen variiert.
Da die Kügelchen der Bibliothek immobilisiert sind, wird sich ein Konzentrations-Gradient eines bestimmten Peptids bilden. Hohe Konzentrationen des Peptids werden in der Nähe des Kügelchens gefunden werden, von dem es freigesetzt wurde. Damit wird der Nachweis einer biologischen Aktivität von Interesse, in der Nähe zu einem Kügelchen, eine Identifizierung und Isolierung des Kügelchens und eine Sequenzierung oder eine andere Charakterisierung des Peptids ermöglichen. Eine Identifizierung des Peptids ist möglich, weil auf dem Kügelchen nach einer partiellen Spaltung genug für eine Sequenzierung oder eine andere Charakterisierung übrig gelassen werden wird. In einer anderen Ausführungsform können die Kügelchen in Mikrotitermulden (z. B., 10 Kügelchen/Mulde) aufgeteilt und ein Prozentanteil des Peptids freigesetzt und auf eine biologische Aktivität getestet werden, wodurch das mögliche Problem der Diffusion beseitigt wird. Wie unten beschrieben, können unterschiedliche Fraktionen des Peptids an einen Festphasenträger oder ein Kügelchen über verschiedene spaltbare Linker für aufeinander folgende Assays angeheftet werden. Innerhalb dieser Beispiele bezieht sich der Begriff „Kügelchen" auf einen Festphasenträger.
Die folgenden Beispiele werden bereit gestellt, um zu veranschaulichen, wie die biologischen Assays durchgeführt werden können, nicht als Einschränkungen.

(i) Eine Population von Zellen in einer Einzelzell-Suspension wird über ein flüssiges Medium oder eine halbfeste Matrix, die eine Peptid-Zufallsbibliothek enthalten, geschichtet. In einer Ausführungsform wird diese Prozedur in Mikromulden-Gewebekulturplatten mit 96 Mulden mit einem oder mehreren Kügelchen pro Mulde zuzüglich der Zell-Suspension durchgeführt. In einer weiteren Ausführungsform wird eine Sperrmatrix oder eine „Ausstechform" auf die Suspension von Zellen und die Kügelchen der Bibliothek angewendet, um einzelne Kammern zu erzeugen. Ein Teil des Peptids auf jedem Kügelchen ist mit einem spaltbaren Linker verbunden. Ausreichend Peptid kann freigesetzt werden, um einen biologischen Effekt auszuüben, während noch genügend Peptid am Kügelchen für eine Sequenzierung gebunden bleibt. Die Zell-Suspension kann in Lösung sein oder kann selbst in einer halbfesten Matrix sein. Nach einem geeigneten Inkubationszeitraum wird die Zellpopulation auf Wachstum oder Proliferation untersucht, z. B. durch eine Identifizierung von Kolonien. In einer weiteren Ausführungsform kann das Tetrazolium-Salz MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid) zugegeben werden (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55–63; Niks und Otto, 1990, J. Immunol. Methods 130: 140–151). Succinat-Dehydrogenase, die in Mitochondrien von lebensfähigen Zellen gefunden wird, wandelt das MTT in Formazan-Blau um. Somit würde eine konzentrierte blaue Farbe auf metabolisch aktive Zellen hinweisen. In noch einer weiteren Ausführungsform kann die Aufnahme einer radioaktiven Markierung, z. B. eines tritiierten Thymidins, getestet werden, um eine Proliferation von Zellen anzuzeigen. In ähnlicher Weise kann eine Proteinsynthese durch den Einbau von ³⁵S-Methionin gezeigt werden. Die Kügelchen, die ein Peptid freisetzen, welches das Zellwachstum entweder stimulierte oder hemmte, würden dann zurückgewonnen und sequenziert werden, wobei die identifizierten Peptid-Sequenzen anschließend in Lösung in bestätigenden Kulturen gegen den Indikatorzelltyp erneut getestet würden.
(ii) In einer weiteren Ausführungsform von (i) oben, werden die Kügelchen einer Bibliothek so in Mikrotitermulden verteilt, dass jede Mulde ungefähr zehn Kügelchen enthält. Die Kügelchen werden in einer Lösungsphase suspendiert. Ausreichend Peptid wird von jedem Kügelchen freigesetzt, um einen biologischen Effekt auszuüben, während genügend Peptid auf dem Kügelchen für eine Sequenzierung verbleibt. Der Überstand, der das freigesetzte Peptid enthält, kann zu einer Replikations-Platte übertragen oder in den Mulden mit den Kügelchen gelassen werden. Die biologische Aktivität, z. B. das Wachstum oder die Proliferation einer Zell-Linie wird bestimmt. Kügelchen aus Mulden mit einer biologischen Aktivität werden sequenziert, und jede Sequenz wird hergestellt und getestet, um zu bestimmen, welche der Sequenzen eine biologische Aktivität zeigte.
(iii) In noch einer weiteren Ausführungsform von (ii), oben, werden die Peptide so an Kügelchen angeheftet, dass etwa 1/3 des Peptids in einem ersten Schritt freigesetzt werden kann, etwa 1/3 in einem zweiten Schritt und das übrige 1/3 auf dem Kügelchen bleibt. Eine aufeinander folgende Freisetzung kann aus der Verwendung von zwei verschiedenen spaltbaren Linkern resultieren oder durch eine Beschränkung des Spaltmittels, um nur einen Teil des Peptids bei jedem Schritt freizusetzen. Für das letztere kann eine kontrollierte Bestrahlung eines photospaltbaren Linkers bevorzugt sein, obwohl ein zeitlich sorgfältig abgestimmtes Aussetzen an ein chemisches oder enzymatisches Spaltmittel eine partielle Spaltung bewirken kann. Eine Bibliothek von sequenziell spaltbaren Peptiden wird hergestellt und so in Mulden von Mikrotiterplatten verteilt, dass jede Mulde mehr als etwa 50, und stärker bevorzugt von etwa 50 bis etwa 1000 Kügelchen pro Mulde enthält. Die Kügelchen werden so behandelt, dass etwa 1/3 der Peptide gespalten wird. Der Überstand wird auf eine biologische Aktivität in einem Mehrfach-Assay getestet. Die Kügelchen aus den Mulden, die eine biologische Aktivität zeigen, werden dann suspendiert und so in Mulden einer Mikrotiterplatte verteilt, dass jede Mulde etwa 1 bis 10 Kügelchen enthält. Die Kügelchen werden behandelt, um ein weiteres 1/3 des Peptids freizusetzen, und der Überstand wird auf eine biologische Aktivität untersucht. Kügelchen aus den Mulden, die eine biologische Aktivität zeigen, werden isoliert und das angeheftete Peptid wird sequenziert. Wo mehr als ein Kügelchen gefunden wird, werden alle identifizierten Sequenzen hergestellt und einzeln auf eine biologische Aktivität getestet. Dieser zweistufige sequenzielle biologische Assay stellt ein effizientes, leistungsfähiges Verfahren zur Verfügung, um eine sehr große Bibliothek nach Peptiden mit einer bestimmten biologischen Aktivität zu screenen.
(iv) Die Stimulierung einer Cytokin-Freisetzung kann untersucht werden, indem eine Einzelzell-Suspension, die in einer halbfesten Matrix, z. B. einem Agarosegel, immobilisiert ist, hinzugefügt wird. Wo ein Peptid der Erfindung die Freisetzung eines Cytokins, z. B. eines Lymphokins, eines Wachstumsfaktors, eines Hormons, usw. induziert, kann das Vorhandensein des Cytokins durch die Aktivität einer Indikatorzell-Linie nachgewiesen werden. Spezifische Assays mit einer Indikatorzell-Linie können, wie in (i), oben, beschrieben durchgeführt werden. In einer weiteren Ausführungsform kann das durch die stimulierten Zellen freigesetzte Cytokin auf eine Membran, z. B. Nitrocellulose, geblottet und das Cytokin durch einen Immunoassay oder einen Rezeptor-Eindungs-Assay nachgewiesen werden.
(V) In einer weiteren Ausführungsform kann die Toxizität eines Peptids beobachtet werden. Bereiche oder Plaques von Nicht-Wachstum, z. B. von einer transformierten oder Krebs-Zelllinie, die über eine Peptidbibliothek geschichtet wurden, würden auf eine zytotoxische Aktivität hinweisen. In einem besonderen Aspekt können zwei Zellpopulationen in einer halbfesten Matrix geschichtet werden, eine über die andere. Auf diese Weise könnte ein zytotoxisches Peptid, das für die Zielzelle spezifisch, aber nicht zytotoxisch für eine Umgebungszelle ist, identifiziert werden. Solch ein Assay würde schnell Peptide für eine Anwendung als chemotherapeutische Mittel identifizieren.
(vi) Eine physiologische Veränderung kann ebenfalls untersucht werden. In einer Ausführungsform wird eine Myokardzell-Suspension über eine Bibliothek geschichtet. Ein „Schlagen" der Zellen, stimuliert durch ein Peptid, kann beobachtet werden. In einer weiteren Ausführungsform kann eine Hochregulierung eines bestimmten Enzyms untersucht werden, indem eine Zunahme bei einer bestimmten Enzymaktivität detektiert wird, wenn ein geeignetes Substrat, wie ein Chromogen (z. B., MTT, (i), oben), ein Fluorophor oder ein chemilumineszenter Stoff vorhanden ist. Alternativ kann die Hochregulierung eines Enzyms durch einen immunologischen Assay nachgewiesen werden. In noch einer weiteren Ausführungsform können histologische Techniken auf physiologische oder morphologische Veränderungen hinweisen, die durch ein Peptid der Bibliothek bewirkt werden.
(vii) Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Verfügung, um die Aktivität eines Peptids in einer Bibliothek auf polarisierte Zellen, z. B. Zellen mit einer basolateralen und einer luminalen Oberfläche zu untersuchen. Polare Zellkulturen können auf einer semipermeablen Membran, entsprechend dem Lumen, präpariert werden. Eine Bibliothek wird in einer halbfesten Matrix zu der luminalen Oberfläche oder der basolateralen Oberfläche hinzu gegeben. Es können verschiedene Effekte eines Peptids der Erfindung, wie polarer Transport, Proliferation, interzelluläre Kommunikation, usw. untersucht werden. Insbesondere können durch ein Markieren des Peptids, z. B. mit einer radioaktiven Markierung oder einem Fluorophor, transportierbare Peptide identifiziert werden. Es gibt eine seit langem bestehende Notwendigkeit im Fachbereich für spezifisch absorbierbare Moleküle. Insbesondere würden solche Moleküle für eine orale oder nasale Verabreichung von pharmazeutischen Produkten nützlich sein, wo ein Transport von der luminalen Oberfläche zur basolateralen Oberfläche des Epithels gewünscht wird.

Er wird ferner von einem normalen Fachmann im Fachbereich verstanden werden, dass eine beliebige Zelle, die in einer Gewebekultur gehalten werden kann, entweder für eine kurze oder eine lange Dauer, in einem biologischen Assay verwendet werden kann. Der Begriff "Zelle", wie hier verwendet, soll prokaryotische (z. B., bakterielle) und eukaryotische Zellen, Hefe, Schimmel und Pilze mit einschließen. Primärzellen oder -Linien, die in Kultur gehalten werden, können verwendet werden. Darüber hinaus vergegenwärtigen sich die Anmelder, dass biologische Assays an Viren durchgeführt werden können, indem Zellen mit einem Virus infiziert oder transformiert werden. Als ein Beispiel und nicht als Einschränkung, kann die Fähigkeit eines Peptids, die lysogene Aktivität eines Lambda-Bakteriophagen zu hemmen, untersucht werden, indem transfizierte E. coli-Kolonien identifiziert werden, die keine klaren Plaques bilden, wenn sie infiziert werden.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung für das Untersuchen der Aktivität eines Peptids einer Zufallsbibliothek von Peptiden oder eines einzelnen Peptids sind nicht auf die vorhergehenden Beispiele beschränkt; die Anmelder vergegenwärtigen sich, dass ein beliebiges Assay-System modifiziert werden kann, um die vorliegend offenbarte Erfindung einzuarbeiten. Die Anmelder vergegenwärtigen sich, dass sich Derartiges innerhalb des Umfangs ihrer Erfindung befindet.
5.5. PHARMAZEUTISCHE ANWENDUNGEN DER SPALTBAREN LINKER
Die selektiv spaltbaren Linker, die auf einer Esterbindungsverknüpfung basieren, können für die Freisetzung von pharmazeutischen Wirkstoffen in vivo verwendet werden. In einer Ausführungsform ist der freigesetzte pharmazeutische Wirkstoff ein Peptid. Jedoch kann eine beliebige pharmazeutisch aktive Substanz, die über eine Esterbindung an den Linker gebunden werden kann, an den Linker für eine Freisetzung in vivo gekoppelt werden. Darüber hinaus, da die Erfindung eine Steuerung der Rate der Freisetzung der Diketopiperazin-Linker der Erfindung vorsieht, ermöglicht die vorliegende Erfindung das Verändern der Freisetzungsrate, und zwar in Abhängigkeit von der gewünschten Freisetzungsrate für ein Molekül von Interesse.
Darüber hinaus, da die vorliegende Erfindung die Freisetzung einer freien Alkoholform der freigesetzten Einheit vorsieht, und ein Zurückhalten des Diketopiperazins auf einem Festphasenträger, der ausgeschieden werden kann, z. B. nach einer oralen Verabreichung, stellt die Erfindung die Freisetzung eines geeigneten pharmazeutischen Wirkstoffs zur Verfügung, der unbeeinträchtigt durch einen Diketopiperazin-Rest, angeheftet an den pharmazeutischen Wirkstoff, ist.
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezug auf die folgenden Beispiele veranschaulicht, die zur Erläuterung und nicht zur Einschränkung sind.
6. BEISPIEL: AUF IMINODIESSIGSÄURE BASIERENDE LINKER FÜR EINE ZWEISTUFIGE FREISETZUNG VON PEPTIDEN VON EINEM FESTEN TRÄGER
Die Peptide wurden auf einem polymeren Träger über einen spaltbaren, Iminodiesssigsäure (IDA) enthaltenden Linker synthetisiert, der eine zweistufige unabhängige Freisetzung von definierten Teilen des Peptids in eine Lösung erlaubte. Die Peptide wurden an den Linker über eine Esterbindung von Fmoc-Gly-Propanolamid (PAOH) angeheftet. Die Esterbindung war durch zwei einzigartige Mechanismen spaltbar, nämlich (1) durch einen nukleophilen Angriff eines internen Nukleophils, was zu einer DKP-Bildung führte, und (2) eine alkalische Hydrolyse. Die von beiden Linkern freigesetzten Peptide enthielten identische Carboxy-Enden (Hydroxypropylamide, -PAOH, in diesem Beispiel). Der am meisten geeignete Linker enthielt ein IDA-IDA-Dipeptidmotiv, und die Peptide wurden entweder an einer Carboxy-terminalen IDA synthetisiert, oder jede IDA wies ein Peptid auf.
Die Synthese und die Freisetzung des Modell-Peptids Leu-Enkephalin wird beschrieben. Der IDA-Linker dieses Beispiels sieht eine zweistufige Freisetzung vor und war dafür entwickelt und ist besonders nützlich beim Testen von „Peptidbibliotheken", die aus Millionen von Peptiden bestehen, da er es ermöglicht, Peptide nach einer Wechselwirkung mit einem gegebenen Akzeptor in Lösung zu screenen.
Da Peptide gewöhnlich in der Richtung N-terminal nach C-terminal aufgeschrieben werden, zeigen in den hierin dargestellten Schemata und Formeln Pfeile (<-) eine entgegengesetzte (C-terminal nach N-terminal) Orientierung an.
6.1. MATERIALIEN UND METHODEN
Aminosäurederivate wurden von Advanced ChemTech, Kentucky, bezogen und ohne Reinigung verwendet. DCC, DIEA, wurden von Aldrich (Milwaukee) erhalten; HOBT und BOP wurden von Propeptide erhalten (SNPE Vert-le-Petit, Frankreich). TLC wurden auf vorbeschichteten Whatman (Kent, England) Silica Gel UV₂₅₄ Silikagel G-Platten unter Verwendung der beschriebenen Lösungsmittelsysteme durchgeführt. Die Schmelzpunkte wurden auf einem Kofler-Block bestimmt und sind unkorrigiert. ¹H-NMR-Spektren wurden an einem General Electric QE 300 Instrument aufgenommen. Alle Spektren werden in ppm, bezogen auf Tetramethylsilan (δ) unter Verwendung von entweder CDCl₃ oder CD₃SOCD₃ als Lösungsmittel, ausgewiesen. UV/VIS-Absorptionsspektren wurden an einem Hewlett-Packard HP8452A Diodenarray-Spektrophotometer unter Verwendung einer 1 cm-Quarz-Küvette aufgenommen. Sowohl analytische als auch präparative HPLC wurden an einem modularen System von Spectra Physics unter Verwendung von Vydac (0,46 × 250 mm, 5 μm, Fluss 1 ml/min) bzw. Vydac (10 × 250 mm, 10 μm, Fluss 3 ml/min) C-18-Säulen durchgeführt.
6.1.1. HERSTELLUNG VON IDA-LINKERN
tert.-Butyloxycarbonyliminodiessigsäure (Boc-IDA); (1) Eine Lösung von Iminodiessigsäure 30,0 g (225 mMol) in 1 N NaOH (225 ml) und Dioxan (200 ml) wurde gerührt und in einem Eis-Wasser-Bad gekühlt. Di-tert-butylpyrocarbonat (53,9 g, 247 mMol) wurde in mehreren Portionen hinzugesetzt, und ein Rühren wurde bei Raumtemperatur 1 h lang fortgesetzt. Dioxan wurde im Vakuum abgedampft, mit einer Schicht von Ethylacetat (100 ml) bedeckt und mit einer gesättigten Lösung von KHSO₄ auf einen pH-Wert von 2–3 angesäuert. Die wässrige Phase wurde mit Ethylacetat (3 × 150 ml) extrahiert. Vereinigte Acetatextrakte wurden mit Wasser (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet und im Vakuum abgedampft. Das Produkt wurde aus einer Lösemittelmischung von Ethylacetat und Petroleumether kristallisiert. Ausbeute: 47,0 g (90%).
tert.-Butyloxycarbonyliminodiessigsäureanhydrid; (2)
Zu einer Lösung von Boc-IDA (10,0 g, 43 mMol) in einer Mischung von Dichlormethan (280 ml) und DMF (5 ml) wurde Dicyclohexylcarbodiimid (9,76 g, 47,3 mMol) gegeben. Nach dem Rühren während 2 Stunden ließ man Dicyclohexylharnstoff bei 4°C (in einem Kühlschrank) kristallisieren. Das Nebenprodukt wurde abfiltriert, und nach der Konzentrierung im Vakuum wurde eine Kristallisierung von restlichem Dicyclohexylharnstoff wiederholt. Das Filtrat wurde bis zur Trockne abgedampft und aus der Lösemittelmischung von Ethylacetat und Petroleumether kristallisiert. Ausbeute: 5,7 g (62%); ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25°C). δ: 1,42 (s, 9H, BOC), 4,38 (s, 4H, CH₂).
Boc-N(CH₂COOH)-CH₂-CO-Pro-O-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc (3)
Zu einer Lösung von tert-Butyloxycarbonyl-iminodiessigsäureanhydrid (0,62 g, 2,8 mMol) in DMF (3 ml) wurde Pro-O(CH₂)₃NH<-Gly<-Fmoc (0,76 g, 1,7 mMol) in DMF (10 ml) hinzugesetzt. Die Aminokomponente wurde aus dem entsprechenden Trifluoracetat wie folgt hergestellt: TFA, Pro-O(CH₂)₃NH<-Gly<-Fmoc wurde in Ethylacetat gelöst und in wässriger 1 M Chlorwasserstoffsäure extrahiert. Die wässrige Phase wurde dann auf einen pH-Wert von 9 durch Zugabe einer gesättigten Lösung von Na₂CO₃ eingestellt und sofort mit Chloroform bei 5°C extrahiert. Nach dem Trocknen über MgSO₄ wurde Lösemittel bis zur Trockne abgedampft. Die Reaktionsmischung wurde 6 h lang gerührt und dann bis zur Trockne abgedampft. Der Rückstand wurde in Methanol gelöst und durch Zugabe von Diethylether präzipitiert, um restliches Boc-IDA-Anhydrid zu entfernen. Das rohe Produkt, welches erhalten wurde, wurde aus einer Lösemittelmischung von Ethylacetat und Petroleumether kristallisiert. Ausbeute: 0,63 g (57%); ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆; 25°C) δ: 1,35 (s, 9H, BOC), 1,71 (m, 2H, PA C^δH₂), 1,85, 2,14 (m, 2H, Pro C^βH₂), 1,91 (m, 2H, Pro C^γH₂), 3,13 (m, 2H, PA C^γH₂), 3,58 (d, 2H, Gly C^αH₂), 3,75-4,16 (m, 4H, IDA), 4,05 (m, 2H, PA C^αH₂), 4,32 (m, 1H, Pro C^αH), 4,18-4,32 (m, 3H, Fmoc, OCH₂-CH-), 7,47 (t, 1H, Gly NH), 7,33-7,84 (m, 8H, Fmoc), 7,85 (t, 1H, PA NH).
Boc-N(CH₂-COOH)-CH₂COO(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc; (4)
Boc-IDA (4,66 g, 20 mMol) wurde in 50 ml DCM:DMF (10:1)-Mischung gelöst, DIC (3,14 ml, 20 mMol) wurde hinzugesetzt, die Reaktionsmischung wurde 30 min lang gerührt, die Lösung von Fmoc-Gly-OPA (7,08 g, 20 mMol) und Dimethylaminopyridin (0,48 g, 2 mMol) wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. DMF und DCM wurden unter reduziertem Druck abgedampft, der ölige Rückstand wurde in 100 ml AcOEt gelöst, 3 mal mit Wasser, wässriger 5%iger HCl, Wasser und gesättigter NaHCO₃-Lösung extrahiert. NaHCO₃-Extrakte wurden vereinigt, mit wässriger HCl angesäuert, das Produkt wurde dreimal in AcOEt extrahiert, vereinigte AcOEt-Extrakte wurden mit einer gesättigten Lösung von NaCl gewaschen, mit wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, und AcOEt wurde unter reduziertem Druck abgedampft. Ausbeute: 6,2 g (55%), einzelner Fleck auf TLC, Rf 0,37. Das NMR zeigte die erwarteten Signale.
HN(CH₂-CO-O-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc)₂, HCl; (5)
Eine Lösung von Fmoc-Gly-PAOH (7,08 g, 20 mMol) in 30 ml DMF wurde zu einer Lösung von Boc-IDA (2,33 g, 10 mMol) gegeben; HOBt (2,7 g, 20 mMol) und DIC (3,14 ml, 20 mMol) in 30 ml DMF und Dimethylaminopyridin (0,48 g, 4 mMol) wurden hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde bei RT 5 h lang gerührt. DMF wurde unter reduziertem Druck abgedampft, der ölige Rückstand wurde in 100 ml AcOEt gelöst, filtriert, 3 mal mit Wasser, wässriger 5%iger HCl, Wasser, gesättigter NaHCO₃-Lösung, Wasser und gesättigter NaCl-Lösung in Wasser extrahiert. Die organische Schicht wurde mit wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, und AcOEt wurde unter reduziertem Druck abgedampft. Ausbeute: 7,2 g (80%) an bröckeligem Schaum, Rf 0,55 (enthält zwei Verunreinigungen mit einer Rf von 0,37 und 0,62). Das Produkt wurde in 30 ml DCM gelöst, 30 ml TFA wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde 30 min bei RT gehalten. DCM und TFA wurden unter reduziertem Druck abgedampft, der ölige Rückstand wurde in AcOEt gelöst und 3 mal mit Wasser und gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen. Nach der Extraktion mit einer Lösung von Na₂CO₃ wurden drei Schichten gebildet. Die Bodenschicht, welche das Produkt enthielt, wurde abgetrennt, angesäuert durch Schütteln mit 5%iger HCl, in Chloroform gelöst, durch wasserfreies MgSO₄ getrocknet, auf ein kleines Volumen konzentriert und in einen großen Überschuss an Ether gegossen. Das Präzipitat wurde gesammelt, mit Ether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 5,4 g, (64%) von einem bröckeligen Schaum, ein einzelner Fleck auf der TLC, Rf 0,28 in CHCl₃:MeOH:AcOH (90:9:1); ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 27°C) δ: 1,78 (m, 2H, PA C^βH₂), 3,17 (m, 2H, PA C^γH₂), 3,60 (d, 2H, Gly CH₂), 4,01 (m, 4H, IDA CH₂) 4,18 (m, 2H, PA C^αH₂), 4,19-4,34 (m, 3H, Fmoc, OCH₂CH), 7,52 (t, 1H, Gly NH), 7,33, 7,43, 7,72 og 7,90 (m, 8H, Fmoc aromatisches H), 7,96 (t, 1H, PA, NH).
Boc-N(CH₂-COOH)-CH₂-CON(CH₂-COO-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc)₂; (6)
Boc-IDA (2,33 g, 10 mMol) wurde in 50 ml DCM:DMF (10:1) gelöst, DIC (1,57 ml, 10 mMol) wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde 30 min lang gerührt. Dann wurde die Lösung von HN(CH₂-CO-O-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc)₂·HCl (5) (8,4 g, 10 mMol) in 50 ml DMF hinzugesetzt, der pH-Wert wurde auf etwa 8 durch die DIEA gebracht, und die Reaktionsmischung wurde bei RT 1 h lang gerührt. DMF und DCM wurden unter reduziertem Druck abgedampft, der ölige Rückstand wurde in 100 ml AcOEt gelöst und 3 mal mit Wasser, wässriger 5%iger HCl, Wasser und einer gesättigten NaHCO₃-Lösung extrahiert. NaHCO₃-Extrate wurden vereinigt und mit wässriger HCl angesäuert. Das Produkt wurde dreimal in AcOEt extrahiert, mit wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, und AcOEt wurde unter reduziertem Druck abgedampft. Der ölige Rückstand wurde mit Ether trituriert, und das Produkt wurde kristallisiert. Ausbeute: 6,8 g (67%); einzelner Fleck auf der TLC, Rf 0,28 in CHCl₃:MeOH:AcOH (90:9:1); ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 27°C) δ: 1,36 (s, 9H, Boc), 1,75 (m, 2H, PA C^βH₂), 3,16 (m, 2H, PA C^γH₂), 3,60 (d, 2H, Gly CH₂), 3,76-4,23 (m, 8H, IDA CH₂), 4,11 (m, 2H, PA C^αH₂), 4,19-4-34 (m, 3H, Fmoc, OCH₂CH), 7,49 (t, 1H, Gly NH), 7,34, 7,42, 7,72, og 7,89 (m, 8H, Fmoc aromatisches H).
6.1.2. ALLGEMEINES PROTOKOLL ZUR FESTPHASENSYSTHESE

Tentagel (Substitution 0,23 mäquiv. NH₂/g) wurde einer Festphasensynthese unter Verwendung des nachfolgenden allgemeinen Protokolls unterzogen.

Schritt	Reagens	Zeit
1	5% DIEA/DMF	2 × 5 min
2	DMF-Waschung	10 × 2 min
3	Kopplungslinker (oder Boc-AA oder Fmoc-AA) unter Verwendung der BOP-Chemie	bis der Kaiser-Test negativ ist
4	wiederhole Schritt 2
Boc-Gruppen-Entschützung:
5	DCM	2 × 5 min
6	TFA/DCM/Anisol (10/10/1)	1 × 30 min
7	wiederhole Schritt 5
8	5% DIEA/DCM	bis pH-8
Fmoc-Gruppen-Entschützung:
10	DMF-Waschung
11	50% Piperidin/DMF	10 min
12	wiederhole Schritt 2

Die Fmoc-Freisetzung wurde quantifiziert, indem die Extinktion (302 nm) von Piperidinlösung und vereinigten Waschungen gemessen wurde.
Boc-IDA(Fmoc-Trp-Gly-PAO<-Pro)-TG (7)
TentaGel (0,2 g, Substitution 0,23 mäquiv. NH₂/g) wurde in DCM, DMF vorgequollen (5 ml große Kunststoffspritze, die mit einer Polypropylen-Fritte ausgestattet war). Der Linker Boc-IDA (Fmoc-Gly-PAO<-Pro)OH (0,1 g, 0,15 mMol) in DMF (2 ml), BOP (0,066 g, 0,15 mMol), HOBT (0,025 g, 0,15 mMol) und DIEA (0,026 ml, 0,15 mMol) wurde an das TentaGel gemäß dem allgemeinen Protokoll gekoppelt. Nach einer Fmoc-Entschützung wurde Fmoc-Trp (0,059 g, 0,138 mMol) in DMF (2 ml), aktiviert durch BOP (0,061 g, 0,138 mMol), HOBT (0,019 g, 0,138 mMol) und DIEA (0,024 ml, 0,138 mMol) an das Glycincarboxylat gekoppelt.
Boc-Gly-IDA(Fmoc-Trp-Gly<-PAO)-TG (8)
Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO)OH (0,019 g, 0,035 mMol) in DMF (1 ml), aktiviert durch BOP (0,015 g, 0,035 mMol), HOBT (0,05 g, 0,035 mMol) und DIEA (0,006 ml, 0,035 mMol) wurde an TentaGel (0,05 g, Substitution 0,23 mäquiv. NH₂/g) in gleicher Weise wie oben für (7) beschrieben, gebunden. Nach der Boc-Gruppen-Entfernung und Anheftung von Boc-Gly (0,006 g, 0,035 mMol), aktiviert durch BOP (0,015 g, 0,035 mMol), HOBT (0,005 g, 0,035 mMol) und DIEA (0,006 ml, 0,035 mMol) in DMF (1 ml), wurde die Fmoc-Gruppe entfernt, und Fmoc-Trp (0,015 g, 0,035 mMol) in DMF (1 ml), aktiviert durch BOP (0,015 g, 0,035 mMol), HOBT (0,005 g, 0,0335 mMol) und DIEA (0,006 ml, 0,035 mMol), wurde an Boc-Gly-IDA-(H-Gly-PAO)-TG gekoppelt. Synthese eines doppelt spaltbaren Linkerharzkonstruktes I mit unterschiedlichen Peptiden auf jedem spaltbaren Arm (9)
Boc-Lys (Fmoc) (0,023 g, 0,045 mMol), aktiviert durch BOP (0,021 g, 0,045 mMol), HOBT (0,006 g, 0,045 mMol) und DIEA (0,009 ml, 0,045 mMol) wurde an Tentagel gekoppelt (20 mg, Substitution 0,23 mäquiv. NH₂/g). Nach der Boc-Gruppen-Entfernung wurde Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO)OH (4) (0,025 g, 0,045 mMol) aktiviert, in gleicher Weise wie Boc-Lys (Fmoc) an Lys (Fmoc)-TG gekoppelt wurde. Die Fmoc-Gruppen-Entfernung ermöglichte das Koppeln von Fmoc-Val (0,031 g, 0,090 mMol) in Gegenwart von BOP (0,040 g, 0,090 mMol), HOBT (0,012 g, 0,090 mMol) und DIEA (0,016 ml, 0,090 mMol). Die Boc-Gruppe von Iminodiessigsäure wurde entfernt, und nach der Neutralisation, wie im allgemeinen Protokoll beschrieben, wurde Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO-Pro)OH (3) (0,030 g, 0,45 mMol), aktiviert in gleicher Weise wie Boc-Lys(Fmoc), gekoppelt. Der finalen Fmoc-Entschützung folgte eine Fmoc-Trp (0,019 g, 0,045 mMol) (BOP-Aktivierung, wie oben beschrieben)-Kopplung. Synthese eines doppelspaltbaren Linkerharzkonstruktes II mit unterschiedlichen Peptiden auf jedem spaltbaren Arm (10)
Tentagel (0,060 g, Substitution 0,23 mäquiv. NH₂/g) wurde einer Festphasensynthese unter Anwendung des gleichen Protokolls, wie für den Linker I beschrieben, unterzogen, mit der Ausnahme, dass Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO)OH (4) (0,023 g, 0,042 mMol), BOP (0,019 g, 0,042 mMol), HOBT (0,006 g, 0,042 mMol) und DIEA (0,007 ml, 0,042 mMol) anstelle von Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO-Pro)OH bei der Kopplung des zweiten Armes zur Anwendung kamen. Danach folgte eine Boc-Entschützung und eine anschließende Boc-Trp-Kopplung.
Boc-N[CH₂-CON(CH₂-CO-Lys(Fmoc)-TG)-CH₂-COO(CH₂)<-Gly<-Fmoc]-CH₂-COO-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc (11)
Boc-N(CH₂-COOH)-CH₂-COO-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc (4) (0,57 g, 1 mMol) wurde unter Verwendung von BOP (0,44 g, 1 mMol), HOBt (0,135 g, 1 mMol) und DIEA (0,175 ml, 1 mMol), an Lys (Fmoc)-TG (2 g, 0,2 mMol NH₂/g, siehe Peptidharz (9) gemäß dem allgemeinen Protokoll gebunden. Die Boc-Gruppe wurde entschützt, und der zweite Arm (erneut Verbindung (4)) wurde mittels der gleichen Prozedur gekoppelt.
Boc-N(CH₂-CO-Lys(Fmoc)-TG)-CH₂-CON(CH₂-COO-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc)₂ (12)
Boc-N (CH₂-COOH)-CH₂-CON(CH₂-COO-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc) 2 (6) (1,2 g, 1 mMol), BOP (0,44 g, 1 mMol) HOBt (0,135 g, 1 mMol) und DIEA (0,175 ml, 1 mMol) wurde an Lys (Fmoc)-TG (2 g, 0,2 mMol NH₂/g, siehe Protokoll für die Peptidharzverbindung (9)) gemäß dem allgemeinen Protokoll gebunden.
Boc-N(CH₂-CO-TG)-CH₂-CON(CH₂-COO-(CH₂)₃-NH←Gly←CO-(CH₂)₃-CO-NH-(CH₂)₃-O-Gly←Trp←Fmoc)₂ (13)
Der Linker wurde wie folgt konstruiert: Boc-N(CH₂-COOH)-CH₂-CON(CH₂-COO-(CH₂)₃-NH-Gly-Fmoc)₂ (Linker 6) wurde an Tg gekoppelt, Fmoc-Gruppen wurden entfernt, und das Harz wurde mit Bernsteinsäureanhydrid in DMF (5 molarer Überschuss) 2 h lang umgesetzt. Nach dem Waschen des Harzes für 5 mal mit DMF wurde die Carboxylgruppe auf dem Harz durch HBTU/DIEA aktiviert, und 3 molarer Überschuss an HOPA wurde hinzugegeben. Man ließ die Reaktion über Nacht weiterlaufen, das Harz wurde 5 mal mit DMF gewaschen, und das Koppeln wurde unter den gleichen Bedingungen wiederholt, und das Harz wurde 5 mal mit DMF gewaschen.
Die Modellverbindung wurde wie folgt konstruiert: Fmoc-Gly wurde durch DIC/HOBT voraktiviert und in 5 molarem Überschuss dem Harz mit Linker hinzugesetzt, die Veresterung wurde mittels DMAP katalysiert. Nach einer Reaktion über Nacht wurde das Harz 5 mal mit DMF gewaschen, die Fmoc-Gruppe wurde entfernt, und Fmoc-Trp, aktiviert mittels DIC/HOBT, wurde in 3 molarem Überschuss gekoppelt. Das Harz wurde 5 mal mit DMF, die Fmoc-Gruppe wurde abgespalten, Harz wurde mittels DMF und DCM gewaschen, und die Boc-Gruppe vom Linker wurde mittels der Mischung K gespalten. Das Harz wurde mittels TFA, DCM, MeOH gewaschen und getrocknet.
Kontrollfreisetzung vom Linker V: Die Prozedur für die erste Freisetzung war im wesentlichen die gleiche, wie es für die Kontrollfreisetzung vom Linker IV beschrieben ist, siehe untenstehender Abschnitt 6.2. Die Struktur vom Produkt vom zuerst freigesetzten Trp-Gly-O-(CH₂)₃-NH-CO-(CH₂)₃CO-NH-(CH₂)₃-OH wurde mittels MS bestätigt. Die Lösung wurde dann mittels 2 N NaOH alkalisch gemacht, nach 30 min wurde der pH-Wert ca. auf 5 mittels 1 N HCl gebracht, und die Struktur vom Produkt, Trp-Gly-OH, wurde erneut mittels MS bestätigt. Die zweite Freisetzung wurde mittels des gleichen Weges, wie er beschrieben ist, durchgeführt, und das Produkt wurde quantifiziert, und seine Struktur wurde mittels MS bestätigt.
6.1.3. SYNTHESE VON DOPPELT SPALTBAREM LEU-ENKEPHALIN
Leu-Enkephalin-Peptid (YGGFL) wurde auf den Armen vom doppelt spaltbaren Linker IV unter Verwendung des standardmäßigen Fmoc-tBu-Protokolls synthetisiert.
6.1.4. Trp-Gly-PAOH-KONTROLLFREISETZUNG
Die Fmoc-Gruppe wurde aus dem doppelt spaltbaren Linkerharzkonstrukt gemäß dem allgemeinen Protokoll entfernt, und Fmoc-Trp, aktiviert mittels der BOP-Chemie, wurde an alle drei Arme gekoppelt. Nach der DMF-Waschung wurden die Fmoc-Gruppe und Boc-Gruppe der Reihe nach gemäß dem allgemeinen Protokoll entfernt. Das entschützte Peptidharz wurde mit DCM (10 mal), MeOH (5 mal) gewaschen und über Nacht getrocknet/lyophilisiert. Getrocknetes Peptidharz (etwa 5 mg) wurde mit Bicarbonatpuffer bei einem pH-Wert von 8,3 3 h lang behandelt. Die Trp-Gly-PAOH-Freisetzung wurde quantifiziert, indem die Extinktion von Trp (280 nm) gemessen wurde. Das Harz wurde gründlich mit Wasser gewaschen und mit 0,5%iger NaOH 2 h lang inkubiert. Die Extinktion von freigesetztem Trp-Gly-PAOH in der Lösung wurde bei 280 nm abgelesen.
6.1.5. PEPTIDFREISETZUNGSKINETIK
Peptidharz (5 mg) wurde einer gerührten Pufferlösung bei einem pH-Wert von 8,3 (100 mM Bicarbonatpuffer) in einer Kuvette eines Abtast-UV-Spektrometers (Hewlett-Packard, HP 1050 HPUV) hinzugesetzt. Unter Verwendung eines 4 s-Intervalls wurden mehrere Scans des UV-Spektrums von 200–500 nm erhalten, und die Kinetik der Trp-Gly-PAOH-Freisetzung wurde verfolgt.
6.2. ERGEBNISSE
Ausgehend von tert-Butyloxcarbonyliminodiessigsäure (Boc-IDA) wurde Boc-IDA-Pro-OPA<-Gly<-Fmoc mittels der Öffnung des Boc-IDA-Anhydrids durch nukleophilen Angriff von Pro-OPA<-Gly<-Fmoc hergestellt. Boc-IDA-OPA<-Gly<-Fmoc wurde hergestellt mittels der Öffnung vom Boc-IDA-Anhydrid durch nukleophilen Angriff vom HOPA<-Gly<-Fmoc. Diese Reaktion ist im Schema 1 gezeigt:
Ein Modell-Peptidharz-Konstrukt (7) wurde zusammengebaut, und nach der Entschützung wurde das Modelldipeptid freigesetzt und wurde die Kinetik verfolgt. Die Reaktionskinetik von der Freisetzung des Peptids Trp-Gly-PAOH ist in der 1 gezeigt.
Das doppelt spaltbare Linkerharzkonstrukt I ist unten gezeigt:
Doppelt spaltbares Linkerharzkonstrukt I
Dieser Linker wurde unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Armen zusammengebaut, welche sich darin unterschieden, dass sie unterschiedliche Modellpeptide aufwiesen, die auf diesen synthetisiert wurden. Die Reaktionskinetik der Freisetzung bei einem pH-Wert von 8,3 ist in der 2 gezeigt. Die erste Freisetzung tritt bei einem pH-Wert von 8,5 auf (2A); die zweite Freisetzung tritt bei einem pH-Wert von 13,2 auf (2B).

a: 50% Piperidin/DMF; b: TFA/DCM/TA, c: Puffer pH 8,5

Der Mechanismus der Reaktion, wobei die Freisetzung durch die Erzeugung von Hexahydropyrrolo(1,2-a)pyrazin-1,4-dion (HHPPD) begleitet wird, ist unten im Schema 2 gezeigt. Die HPLC-Analyse der freigesetzten Peptide enthüllte, dass zusätzlich zu dem obigen Mechanismus unerwarteterweise ein zweiter Mechanismus der Heterozyklusbildung auftrat. Die Bildung von zyklischem IDA-IDA-Diketopiperazin war, wie gezeigt wurde, schneller als die zyklische HHPPD-Bildung. Somit wurde während der ersten Freisetzung (durch Heterozyklusbildung) das Peptid von dem IDA-Arm, von dem erwartet wurde, dass es durch alkalische Hydrolyse freigesetzt wird, stattdessen bei einem pH-Wert von 8,3 freigesetzt. Das Peptid von dem Prolinarm konnte bei einem pH-Wert von 13,2 freigesetzt werden.
Aus den Ergebnissen mit I wurde ein zweiter auf IDA basierender Linker, II, entworfen und synthetisiert. Dieser Linker ist unten gezeigt: Doppelt spaltbares Linkerharzkonstrukt II (8)
Ein Vorteil dieses Linkers ist der, dass jeder Zweig in der Struktur identisch ist, jedoch jeder Peptid durch einen einzigartigen Mechanismus freisetzt. Der Reaktionsmechanismus ist im Schema 3 gezeigt:

a: 50% Piperidin/DMF; b: TFA/DCM/TA, c: Puffer pH 8,5

Eine weitere Vereinfachung der Linkerstruktur durch Weglassen von Boc-Gly führt zu einer weiteren Version vom doppelt spaltbaren Linker (III) wie unten gezeigt: Doppelt spaltbares Linkerharzkonstrukt III
Die Variation bezüglich dieses strukturellen Themas führt zu einem Design von einem noch weiteren doppelt spaltbaren Linker (IV), wie unten gezeigt: Doppelt spaltbares Linkerharzkonstrukt IV

Tabelle 1 fasst die Peptidfreisetzung von verschiedenen Linkern zusammen. TABELLE 1

Linker-TG	Fmoc-Freisetzung (mMol/g)	1. Peptidfreisetzung (mMol/g)	2. Peptidfreisetzung (mMol/g)
(7)	0,20	0,20
(8)	0,13	0,13
(9)	0,153	0,055	0,073
(10)	0,142	0,053	0,083
(11)	0,230	0,083	0,092
(12)	0,220	0,088	0,081

Anmerkung: Die Fmoc-Freisetzung von Boc-Lys (Fmoc)-TG betrug 0,2 mMol/g, und dieser Wert wurde von der Fmoc-Ablesung des gesamten Linkerharzkonstruktes abgezogen, um eine Schätzung der Menge von freisetzbarem Peptid zu erhalten.

Boc-IDA(H-Trp-Gly-PAO)-TG (6 mg) wurde mit 20% Piperidin in DMF behandelt, um dessen Stabilität in Gegenwart dieser schwachen Base zu testen. Die Fmoc-Trp-Gly-PAOH-Freisetzung wurde quantifiziert, indem die Extinktion (302 nm) der Piperidin-Freisetzungslösung gemessen wurde. Die Stabilität der Esterbindungsverknüpfung wird in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2

Zeit (Stunden) freigesetztes Peptid (%)

0,5 0,26

1 0,65

3 1,01

5 1,10

36 3,7
Leu-Enkephalin wurde von dem doppelt spaltbaren Linkerkonstrukt IV in zwei Schritten freigesetzt. Die erste Freisetzung bei einem pH-Wert von 8,3 ergab 65 mMol an Peptid pro Gramm Harz. Die zweite Freisetzung bei einem pH-Wert von 13,2 ergab 62 mMol/g. Die analytische HPLC zeigte den gleichen Peak für beide freigesetzten Peptide. Die Reinheit von beiden freigesetzten Peptiden war größer als 98%.
6.3. DISKUSSION: AUF EINEM IDA-IDA-MOTIV BASIERENDE LINKER
Man fand, dass das Dipeptidmotiv IDA-IDA besonders geeignet ist, um doppelt spaltbare Linker zu entwerfen. Das IDA-IDA-Dipeptid neigt zu einer DKP-Bildung, da es drei Carboxylgruppen bereitstellt, eine auf dem aminoterminalen IDA und zwei auf dem Carboxyterminus. Um einen doppelt spaltbaren Linker zu konstruieren, sind zwei Carboxylgruppen für die Derivatisierung und anschließende Peptidgestaltung erforderlich. Es gibt zwei mögliche Wege, zwei Fmoc-Gly-PAOHs an Carboxylgruppen zu binden. Fmoc-Gly-PAOHs werden entweder an beide Carboxyle von carboxyterminalem IDA (Linker IV) gekoppelt, oder jedes IDA trägt ein Fmoc-Gly-PA (Linker III). In jedem Fall gibt es eine freie Carboxylgruppe, welche zum Verknüpfen des Linkers an den festen Träger dient (zum Beispiel mittels Lys, welches selbst eine Extraaminogruppe zur Synthese einer dritten Kopie vom Peptid bereitstellt, und zwar nicht freisetzbar, wobei das nicht-freisetzbare Peptid für eine Sequenzierung durch den Edman-Abbau verwendet werden kann).
Der ganze Linker IV wurde in Lösung synthetisiert. Beide Carboxylgruppen von Boc-IDA wurden durch DIC und HOBt aktiviert, und man ließ sie mit Fmoc-Gly-PA in Gegenwart vom Katalysator Dimethylaminopyridin reagieren. Nach der Entfernung der Boc-Schutzgruppe durch TFA wurde die freie Base verwendet, um vorgebildetes zyklisches Anhydrid von Boc-IDA zu öffnen. In diesem Fall sind beide Fmoc-Gly-PAs chemisch ununterscheidbar, und das erste Peptid wird mittels Zyklisierung und DKP-Bildung von einem beliebigen der zwei Arme abgespalten. Das gebildete DKP trägt auf einem Stickstoff die zweite Kopie des Peptids.
Der Linker III kann so angesehen werden, dass er aus zwei identischen Aufbaublöcken besteht. Boc-IDA-Anhydrid wurde hergestellt und durch Fmoc-Gly-PA geöffnet, was zu monosubstituiertem Boc-IDA führte. Das Koppeln dieses Produktes an einem festen Träger, die Entfernung der Boc-Gruppe und das wiederholte Koppeln des gleichen Boc-IDA-Derivats führte zur Synthese des gewünschten Linkers III. Wenn sie zusammengebaut wurden, versahen diese zwei identischen Aufbaublöcke uns mit gänzlich unterschiedlichen Reaktivitäten von ihren Estern. Nach der Entfernung der Boc-Schutzgruppe und der Einstellung des pH-Wertes bildet das IDA-IDA-Dipeptid DKP fast sofort, wodurch das Peptid von dem Arm freigesetzt wurde, welche sich in der Zyklisierungsreaktion umgesetzt hatte. Die Reaktionskinetik zur Freisetzung dieses Peptids wurde bei einem pH-Wert von 4,0 (4A), bei einem pH-Wert von 6,5 (4B), bei einem pH-Wert von 8,3 (4C) gemessen. Die Zwei-Schritt-Freisetzung (bei einem pH-Wert von 8,5, dann bei einem pH-Wert von 13,2) ist in der 4D gezeigt. Der zweite Arm hielt ein Peptid zur Freisetzung mittels alkalischer Hydrolyse.
Dieser Typ an Linker sieht ebenfalls die Möglichkeit zur Freisetzung von unterschiedlichen Peptiden in jedem der zwei Schritte zur Freisetzung vor. Durch getrenntes Entschützen des Peptidketten-Verlängerungsteils der jeweiligen Arme des Linkers können unterschiedliche Peptidsynthesen durchgeführt werden. Nach der Kopplung des ersten Arms wird die Fmoc-Gruppe entfernt, und das Peptid, welches dazu gedacht ist, in dem ersten Schritt freigesetzt zu werden (DKP-Bildung) wird synthetisiert (wobei dessen Aminoterminus durch die Boa-Schutzstrategie geschützt wird). Gleichwohl muss die Iminogruppe vom IDA durch eine stärker säurelabile Gruppe, wie Ddz oder Bpoc, geschützt werden, was dessen sanfte Spaltung ohne Beeinflussung der Seitenkettenschützung in dem ersten Peptid ermöglicht. Nach der Entfernung der Ddz/Bpoc-Gruppe vom IDA wird der zweite Arm gekoppelt, die Fmoc-Gruppe wird entfernt, und das zweite Peptid wird auf der freien Aminogruppe von Gly zusammengebaut.
7. BEISPIEL: METHIONIN ENTHALTENDE LINKER
γ-(3-Hydroxypropylamino)glutaminsäure-TG (14)
Die Struktur eines Methionin enthaltenden Linkers ist unten angeführt.
Zusammenbau des Linkers auf TentaGel:
Fmoc-Glu(OtBu) wurde durch DIC/HOBt aktiviert und an Tg (0,2 mMol an Aminogruppen pro Gramm Harz) in 3 molarem Überschuss gekoppelt. Die Fmoc-Gruppe wurde abgespalten, Harz wurde 5 mal mit DMF gewaschen, und Fmoc-Met wurde gekoppelt. Das tBu wurde entfernt, und zwar indem es an TFA ausgesetzt wurde. Nach dem 5-maligen Waschen des Harzes mit DMF, wurde die Carboxylgruppe auf dem Harz mit HBTU/DIEA aktiviert, und 3 molarer Überschuss an HOPA wurde hinzugesetzt. Danach wurde die Fmoc-Gruppe entfernt, und Fmoc-β-Ala wurde sowohl an die Amino- als auch an die Hydroxylgruppen auf dem Harz über eine DIC/HOBT-Aktivierung und Katalyse mittels DMAP über Nacht gekoppelt und via symmetrischem Anhydrid erneut gekoppelt. Nach dem Waschen des Harzes mit DMF wurde die Fmoc-Gruppe entfernt, und die Extinktion der Lösung nach der Entschützung gemessen, und die Fmoc-Freisetzung quantifiziert – Quantifizierung der Fmoc-Freisetzung, 0,38 mMol/g, zeigte eine fast quantitative Kopplung von β-Ala.
Dieser Linker wurde in der Festphasensynthese eines Pentapeptids verwendet, wie oben beschrieben. Das Produkt wurde von beiden Armen abgespalten, und dessen Reinheit wurde durch analytische HPLC bestimmt, wobei die Struktur durch MS bestätigt wurde.
B. BEISPIEL: MEHR SPALTBARE LINKER MIT ESTERBINDUNGEN
Instrumentierung. Schmelzpunkte wurden auf einem Kofler-Block bestimmt und sind nicht korrigiert. ¹H-NMR-Spektren wurden auf einem General Electric QE 300-Instrument aufgezeichnet. Alle Spektren werden in ppm in bezug auf Tetramethylsilan (δ) unter Verwendung entweder von CDCl₃ oder CD₃SOCD₃ als Lösemittel angegeben. UV/VIS-Absorptionsspektren wurden auf einem Hewlett-Packard HP8452A-Dioden-Array-Spektrophotometer unter Verwendung einer 1 cm-Quarzkuvette aufgezeichnet. Aminosäureanalysen wurden auf einem D-500 (Durrum Corp., USA)-System durchgeführt. Sowohl analytische als auch präparative HPLC wurde auf einem modularen Spektra Physics-System unter Verwendung von Vydac (0,46 × 250 mm, 5 μm, Fluss: 1 ml/min)- bzw. Vydac (10 × 250 mm, 10 μm, Fluss: 3 ml/min) C-18-Säulen durchgeführt.
Allgemeine Prozeduren. Eine Flash-Chromatographie wurde mit Silicagel 60 von Merck (40–63 μm) durchgeführt. Eine Dünnschichtchromatographie wurde entweder auf Silufol UV 254 (Kavalier, Tschechoslowakei) oder auf DC-Alufolien Kieselgel 60 von Merck durchgeführt. Eine präparative Dünnschichtchromatographie wurde auf Whatman-Silicagel 60A-Platten (1 mm Dicke) durchgeführt. Die Flecken wurden mittels Fluoreszenz-Quenching oder durch Besprühen mit einer verdünnten ethanolischen Ninhydrinlösung nachgewiesen. Reaktionslösungen wurden unter Verwendung eines Rotationsverdampfers (bei 2,0–2,6 kPa) konzentriert.
Materialien. Wenn nicht anders angegeben, wurden Lösemittel der kommerziellen Güteklasse ohne weitere Reinigung verwendet. TentaGel (TG)-Harz (0,21 mMol/g) wurde von Rapp-Polymere (Tübingen) erhalten. Geschützte Aminosäuren wurden von Bachem (Torrance, Kalifornien), Advanced ChemTech (Lousville, Kentucky) oder Propeptide (Vert-le-Petit, Frankreich) erhalten.
Ddz-Gly-NH-(CH₂)₃-OH (15).
Zu einer Lösung von Ddz-Gly (freigesetzt von seinem Cyclohexylammoniumsalz (15 g, 37,8 mMol), in dem es in einer Mischung von 0,5 N KHSO₄ und EtOAc aufgelöst wird, bis die wässrige Schicht sauer ist (gegenüber Congo pH = 3 und Extraktion) in DMF (120 ml), werden DIC (6,49 ml, 41,6 mMol), HOBt (5,11 g, 37,8 mMol) und 1-Amino-3-propanol (2,89 ml, 37,8 mMol) gegeben. Nach dem Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Reaktionsmischung bis zur Trockne abgedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und mit 0,5 N KHSO₄ bei 0°C extrahiert, dann mit gesättigter wässriger Lösung von NaHCO₃ und Salzlösung, über MgSO₄ getrocknet und abgedampft. Das Produkt wurde in EtOAC gelöst und mit Petroleumether präzipitiert. Ausbeute: 9,8 g (73%), homogen auf TLC: R_f = 0,34 (Lösemittelsystem 1; DCM:MeOH:AcOH 90:4:1). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃, 25°C) δ; 1,64 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-OH C^βH₂), 1,73 (s, 6H, Ddz CH₃), 3,37, 3,61 (m, 2H, (CH₂)₃-OH C^αH₂, NH-(CH₂)₃-OH C^γH₂), 3,75 (d, 2H, Gly C^αH₂), 3,79 (s, 6H, Ddz OCH₃), 5,38 (t, 1H, NH-(CH₂)₃-OH, NH), 6,35-6,50 (s, 3H, Ddz), 6,61 (t, 1H, Gly NH).
Z-Pro-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Ddz (16).
Zu einer Lösung von Z-Pro (1,13 g, 4,5 mMol) in DCM (50 ml) wurden DIC (0,77 ml, 4,94 mMol), DMAP (0,092 g, 0,75 mMol) und Ddz-Gly-NH-(CH₂)₃-OH (1,59 g, 4,5 mMol) gegeben. Nach dem Rühren über Nacht wurde die Lösung anschließend in gleicher Weise wie Verbindung 15 aufgearbeitet. Ausbeute: 2,42 g (92%); homogen auf TLC (Lösemittelsystem 1).
Boc-Glu(OBz1)-Pro-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Ddz (17).
Verbindung 2 (15,1 g, 25,8 mMol) wurde in DMF (150 ml) gelöst, wasserfreies Na₂CO₃ (0,05 g) wurde hinzugesetzt, und die Verbindung wurde über 5% Pd/C-Katalysator (2,8 g) unter normalem Druck mit kräftigem Rühren 6 Stunden lang hydriert (mittels TLC überwacht). Die Lösung wurde durch ein Celite-Kissen filtriert. Das Filtrat wurde sofort zum Koppeln mit in situ hergestelltem aktiven Ester (Boc-Glu(OBz1)OBt [Boc-Glu(OBz1)-OH (8,7 g, 25,8 mMol), HOBt (3,49 g, 25,8 mMol), DIC (4,43 ml), 28,4 mMol) in DMF (40 ml)] hergestellt. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt und dann in gleicher Weise wie Verbindung 15 aufgearbeitet. Das Produkt wurde aus einer Lösemittelmischung von EtOAc-PE (Ethylacetat-Petroleumether) präzipitiert, und 16 g (80%) der Titelverbindung wurde erhalten. R_f = 0,81 (Lösemittelsystem 1).
Boc-Glu-Pro-O-(CH₂)₃-NH<Gly←Ddz (18).
Verbindung 3 (16 g, 20,8 mMol) wurde in DMF (210 ml) gelöst und über 5% Pd/C-Katalysator hydriert und in gleicher Weise wie Verbindung 17 aufgearbeitet. Der Rückstand nach der DMF-Verdampfung wurde in einer Mischung von EtOAc-PE präzipitiert.
Ausbeute: 13,3 g (94%); R_f = 0,37. ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25 °C) δ: 1,36 (s, 9H, BOC), 1,64 (s, 6H, Ddz CH₃), 1,68 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^βH₂), 1,8-2,0 (m, 6H, Glu C^βH₂, Pro C^βH₂ C^γH₂), 2,16 (m, 2H, Glu C^γH₂), 3,09 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^αH₂), 3,50 (m, 2H, Gly), 3,65 (m, 2H, Pro C^δH₂), 3,73 (s, 6H, Ddz OCH₃), 4,01 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^γH₂), 4,22 (m, 1H, Glu C^αH), 4,31 (m, 1H, Pro C^αH), 6,35-6,49 (M, 3H, Ddz), 7,09 (d, 1H, Glu NH), 7,38 (t, 1H, Gly NH), 8,05 (t, 1H, HH-(CH₂)₃-O, NH).
Fmoc-Gly-NH-(CH₂)₃-OH (19).
Zu einer Lösung von Fmoc-Gly (59,4 g, 200 mMol) in DMF (900 ml) wurden DIC (31,2 ml, 200 mMol) und HOBt (27,0 g, 200 mMol) hinzugesetzt. Nach dem Rühren für 30 min wurde 1-Amino-3-Propanol (16,1 ml, 210 mMol) hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde 4 Stunden lang gerührt. Die Mischung wurde bis zur Trockne abgedampft, und der Rückstand wurde in siedendem EtOAc gelöst und über Nacht kristallisieren gelassen. Nach der Umkristallisation wurde das Produkt mit kaltem EtOAc, PE gewaschen. Ausbeute: 62 g (91%).
Fmoc-Glu(OBu¹)-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Fmoc (20).
Zu einer Lösung von Fmoc-Glu(OBu¹)-OH (10,6 g, 24,9 mMol) in einer Lösemittelmischung von DMF:DCM (1:1, 100 ml) wurden DIC (4,28 ml, 27,4 mMol), Fmoc-Gly-NH-(CH₂)₃-OH (8,5 g, 24,9 mMol) und DMAP (0,31 g, 2,49 mMol) hinzugesetzt. Nach dem Rühren über Nacht wurden Lösemittel abgedampft, und der Rückstand wurde in EtOAc gelöst und mit 1M HCl, 10% NaHCO₃, Salzlösung extrahiert, über MgSO₄ getrocknet und abgedampft. Das Produkt wurde aus EtOAc-PE (17,5 g, 94%) kristallisiert R_f = 0,64 (Lösesmittelsystem 1)). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃, 25°C) δ: 1,44 (s, 9H, tBu), 1,88 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^βH₂), 1,95-2,10 (m, 2H, Glu C^βH₂), 2,33 (m, 2H, Glu C^γH₂), 3,38 (m, 2H, N,N-(CH₂)₃-O, C^αH₂), 3,84 (d, 2H, Gly C^αH₂), 4,17-4,27 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^γH₂), 4,31 (m, 1H, Glu C^αH), 4,30-4,40 (s, 3H, Fmoc OCH₂-CH-), 5,62 (t, 1H, Gly NH), 5,66 (d, 1H, Glu NH), 6,48 (t, 1H, NH-(CH₂)₃-O, NH), 7,29-7,75 (s, 8H, Fmoc).
Fmoc-Glu-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Fmoc (21).
Verbindung 6 (2,0 g, 2,67 mMol) wurde in TFA-H₂O (95:5) gelöst, und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang gerührt. Nach der Verdampfung der Reaktionsmischung bis zur Trockne wurde sie gleichzeitig mit Toluol viermal abgedampft. Das rohe Produkt wurde aus EtOAc-PE zweimal kristallisiert, wodurch man 1,6 g (87%) an reinem Produkt erhielt. R_f = 0,38 (Lösemittelsystem 1). ¹H--NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25 °C) δ: 1,71 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^βH₂), 1,81-1,98 (s, 2H, Glu C^βH₂), 2,32 (m, 2H, Glu C^γH₂), 3,12, (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^αH₂), 3,58 (d, 2H, Gly C^αH₂), 4,06 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^γH₂), 4,20-4,30 (m, 3H, Fmoc, OCH₂CH-), 7,76 (d, 1H, Glu NH), 7,47 (t, 1H, Gly NH), 7,32-7,89 (m, 8H, Fmoc), 7,86 (m, 1H, NH-(CH₂)₃-O, NH).
Fmoc-Glu(O-(CH₂)₃-NH←Gly←Fmoc)-OBu¹ (22).
Fmoc-Glu-OBu¹ (25,0 g, 58,7 mMol), gelöst in einer DMF-DCM-Mischung (1:1, 1 200 ml), wurde mit Fmoc-Gly-NH-(CH₂)₃-OH (22,0 g, 64,6 mMol) in Gegenwart von DIC (10,1 ml, 64,6 mMol) und DMAP (0,71 g, 5,8 mMol) über Nacht gekoppelt, und die Reaktionsmischung wurde in gleicher Weise, wie es für die Verbindung 20 beschrieben worden ist, aufgearbeitet. Die Kristallisation aus EtOAc-PE ergab 34,2 g (78%) des Produktes. R_f = 0,70 (Lösemittelsystem 1) ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25°C) δ: 1,39 (s, 9H, tBu), 1,71 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^βH₂), 1,80-1,96 (m, 2H, Glu C^βH₂), 2,37 (m, 2H, Glu C^γH₂), 3,13 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^αH₂), 3,58 (d, 2H, Gly C^αH₂), 3,93 (m, 1H, Glu C^αH), 4,01 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^γH₂), 4,20-4,30 (m, 3H, Fmoc, OCH₂CH-), 7,32-7,89 (m, 8H, Fmoc), 7,47 (t, 1H, Gly NH), 7,67 (d, 1H, Glu NH), 7,85 (t, 1H, NH-(CH₂)₃-O, NH) .
Fmoc-Glu(O(CH₂)₃-NH←Gly←Fmoc)-OH (23).
Die tert-Butyl-Schutzgruppe der Verbindung 22 (33,0 g, 44,1 mMol) wurde in gleicher Weise, wie es für die Verbindung 21 beschrieben worden ist, abgespalten. Die gleiche Aufarbeitung ergab eine Ausbeute von 26,3 g (86%). ¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆, 25°C) δ: 1,72 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^βH₂), 1,83-1,98 (m, 2H, Glu C^βH₂), 2,38 (m, 2H, Glu C^γH₂), 3,13 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^αH₂), 3,58 (d, 2H, Gly C^αH₂), 4,018 (m, 2H, NH-(CH₂)₃-O, C^γH₂), 4,02 (m, 1H, Glu C^αH), 4,30 (m, 3H, Fmoc, OCH₂CH-), 7,12-7,89 (m, 8H, Fmoc), 7,48 (t, 1H, Gly NH), 7,64 (d, 1H, Glu NH), 7,86 (t, 1H, NH-(CH₂)₃-O, NH).
Boc-Glu(Fmoc-Lys-TentaGel)-PrO-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Ddz (Linker-Harzkonstrukt, freisetzbar durch Diketopiperazin-Bildung).

TentaGel (0,1 g, Substitution 0,23 mäquiv. NH₂/g) wurde einer Festphasensynthese unter Verwendung des nachfolgenden Protokolls unterzogen.

Schritt	Reagens	Zeit
1	5% DIEA/DMF	2 × 5 min
2	DMF-Waschung	10 × 2 min
3	Fmoc-Lys(Boc)/BOP	bis der Kaiser-Test negativ ist
4	wiederhole Schritt 2
5	DCM	10 × 2 min
6	TFA/DCM/Anisol (10/10/1)	1 × 30 min
7	wiederhole Schritt 5
8	5% DIEA/DCM	wiederhole bis pH = 8
9	wiederhole Schritt 2
10	Linker/BOP	bis der Kaiser-Test negativ ist
11	wiederhole Schritt 2

Modelldipeptidsynthese und Kontrollfreisetzung aus dem Peptidharzkonstrukt: Glu (H-Trp-Gly-Lys-TentaGel)-Pro-C-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Trp·2HCl.

Die Synthese vom Dipeptid verwendete das folgende Protokoll:

Schritt	Reagens	Zeit
1	2% TFA/DCM	30 min
2	DCM-Waschung	10 × 2 min
3	DMF-Waschung	10 × 2 min
4	50% Piperidin/DMF	10 min
5	wiederhole Schritt 3
6	Fmoc-Gly/BOP	bis der Kaiser-Test negativ ist
7	wiederhole Schritt 3
8	wiederhole Schritt 4
9	wiederhole Schritt 3
10	Fmoc-Trp/BOP
11	wiederhole Schritt 3
12	wiederhole Schritt 4
13	wiederhole Schritt 5
14	TFA/DCM/Anisol (10/10/1)	30 min
15	wiederhole Schritt 2
16	MeOH	10 × 2 min
17	0,01% HCl

Das Peptidharz (4 mg) wurde zu gerührter Pufferlösung pH 8,5 (100 mMol Bicarbonatpuffer) in einer Kuvette eines Abtast-UV-Spektrometers (Hewlett-Packard, HP1050 (HPUV)) hinzugesetzt. Unter Anwendung eines Intervalls von 3 s wurden mehrere Scans des UV-Spektrums von 200–500 nm erhalten, und die Kinetik der Freisetzung von freiem Trp-Gly-Gly-NH-(CH₂)₃-OH wurde verfolgt (5). Eine maximale Freisetzung von 0,17 mMol/g (Theorie: 0,19 mMol/g) wurde erreicht.
Fmoc-Glu(Fmoc-Lys-TentaGel)-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Fmoc (hydrolytisch freisetzbares Linker-Harz-Konstrukt).
Ein zweiter Arm des doppelt spaltbaren Linkers (Verbindung 21) wurde an Fmoc-Lys-TG unter Verwendung eines analogen Protokolls für die Festphasensynthese, wie oben beschrieben, gekoppelt. Modelldipeptid (Gly-Trp-Glu(Gly-Trp-Lys-TentaGel)-O-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Trp<-Gly) wurde unter Verwendung ebenfalls des gleichen Protokolls synthetisiert. Um die Stabilität des zweiten Arms vom EDC-Linker zu überprüfen, wurde die Stabilität dieses Arms unter den Bedingungen der ersten Freisetzung getestet. Peptid-Harz (3 mg) wurde einer gerührten Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,5 in einer Kuvette des UV-Spektrophotometers hinzugesetzt, und durch 3-s-Scans wurde die Stabilität dieser Esterbindung gemessen (6). Es wurde keine signifikante Freisetzung des Peptids festgestellt. Dieser Test bewies die Stabilität des zweiten Arms bei einem pH-Wert von 8,5.
Eine Kontrollfreisetzung wurde in gleicher Weise (wobei die Kinetik durch UV-Spektroskopie erfolgt wurde), wie es für die erste Freisetzung beschrieben worden ist, unter Verwendung einer 0,3%igen NaOH-Lösung einer 0,3%igen NaOH-Lösung durchgeführt (7). Eine Freisetzung von 0,18 mMol/g (Theorie 0,19 mMol/g) wurde erreicht. Mehrfach spaltbarer Linker:

TentaGel (20,0 g, Substitution 0,23 mäqui. NH₂/g) wurde einer Festphasensynthese unter Verwendung des folgenden Protokolls unterzogen:

Schritt	Reagens	Zeit
1	5% DIEA/DMF	2 × 5 min
2	DMF-Waschung	10 × 2 min
3	Fmoc-Lys(Boc)/BOP	bis der Kaiser-Test negativ ist
4	wiederhole Schritt 2
5	DCM	10 × 2 min
6	TFA/DCM/Anisol (10/10/1)	1 × 0 min 3
7	wiederhole Schritt 5
8	5% DIEA/DCM	bis pH = 8
9	wiederhole Schritt 2
10	ister Arm/BOP (Verbindung 4)	bis der Kaiser-Test negativ ist
11	wiederhole Schritt 2
12	50% Piperidin/DMF	10 min
13	wiederhole Schritt 2
14	2ter Arm/BOP (Verbindung 7)	bis der Kaiser-Test negativ ist
15	wiederhole Schritt 2
16	DMAA	10 × 2 min

Ein zweites Format an mehrfach spaltbaren Linker:

Tentagel (20,0 g, Substitution 0,23 mäquiv. NH₂/g) wurde einer Festphasensynthese unter Verwendung des folgenden Protokolls unterzogen.

Schritt	Reagens	Zeit
1	5% DIEA/DMF	2 × 5 min
2	DMF-Waschung	10 × 2 min
3	Fmoc-Lys(Boc)/BOP	bis der Kaiser-Test negativ ist
4	wiederhole Schritt 2
5	DCM	10 × 2 min
6	TFA/DCM/Ansisol (10/10/1)	1 × 30 min
7	wiederhole Schritt 5
8	5% DIEA/DCM	bis pH = 8
9	wiederhole Schritt 2
10	1ster Arm/BOP (Verbindung 4)	bis der Kaiser-Test negativ ist
11	wiederhole Schritt 2
12	50% Piperidin/DMF	10 min
13	wiederhole Schritt 2
14	2ter Arm/BOP (Verbindung 9)	bis der Kaiser-Test negativ ist
15	wiederhole Schritt 2
16	DMAA	10 × 2 min

H-Glu(OBz1)-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Fmoc (24).
Boc-Glu(OBz1) (10 mMol, 3,37 g) wurde in 50 ml DMF gelöst und mit DIC (10 mMol), 1,58 ml) in Gegenwart von HOBt (10 mMol, 1,53 g) und 4-Dimethylaminopyridin (3 mMol, 0,36 g) aktiviert. Fmoc-Gly-NH-(CH₂)₃-OH (10 mMol, 3,54 g) wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. Das DMF wurde unter reduziertem Druck abgedampft, die Reaktionsmischung wurde mit Ether extrahiert, und der ölige Rückstand wurde abgedampft. TFA (50 ml) wurde hinzugesetzt, die Lösung wurde 60 min lang gerührt, das TFA wurde abgedampft, der ölige Rückstand wurde mit Ether trituriert und bis zur Trockne abgedampft. Rohes Produkt wurde in AcOEt gelöst, mit 3%iger wässriger HCl (3 mal) extrahiert, und die wässrigen Extrakte wurden mit AcOEt gewaschen, mit gesättigter Lösung von NaHCO₃ neutralisiert. Das Produkt wurde 3 mal mit AcOEt extrahiert, Extrakte wurden durch wasserfreies MgSO₄ getrocknet, und das AcOEt wurde abgedampft. Ausbeute: 5,5 g (93%). Tlc auf einer Silicagelplatte zeigte einen UV-absorbierenden Fleck, R_f = 0,40 in CHCl₃: MeOH: ACOH (90:9:1).
Linker I: Boc-Pro-Glu-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Fmoc (25).
H-Glu(OBz1)-O-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc (9,3 mMol, 5,5 g) wurde über Nacht mit TFA (50 ml), das 10% DMS enthielt, behandelt. Das TFA wurde abgedampft, und die Reaktionsmischung wurde mit PE (3 mal) und Ether (3 mal) trituriert und bis zur Trockne abgedampft. Boc-Pro (3,3 mMol, 0,71 g) wurde in DMF (20 ml) gelöst, mit DIC (3,3 mMol, 0,52 ml) in Gegenwart von HOBt (3,3 mMol, 0,49 g) aktiviert, und H-Glu-O-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc (3,3 mMol, 1,6 g) wurde hinzugesetzt. Der pH-Wert wurde auf 8 mit DIEA (angefeuchtetes Papier) eingestellt, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. DMF wurde unter reduziertem Druck abgedampft, das ölige Produkt wurde in AcOEt gelöst und mit einer Lösung von NaHCO₃ (5 mal) extrahiert. Die vereinigten Extrakten wurden mit AcOEt extrahiert, durch 10%ige wässrige HCl angesäuert, das Produkt wurde mit AcOEt extrahiert (3 mal), mit Wasser gewaschen (3 mal), durch MgSO4 getrocknet, und AcOEt wurde abgedampft. Ausbeute: 1,0 g (16%) an schaumigem Produkt. Die Tlc auf einer Silicagelplatte zeigte einen UV-absorbierenden Fleck, R_f = 0,60 in CHCl₃: MeOH: ACOH. ¹H-NMR (300 MHz, DMSO, 27°C) δ: 1,33 (9H, Boc, CH₃), 1,72 (2H, NH-(CH₂)₃-O, C^βH₂), 1,8 (4H, Pro C^βH₂ og C^γH₂), 1,9 (2H, Glu C^βH₂), 2,31 (2H, Glu C^γH₂), 3,13 (2H, NH-(CH₂)₃-O, C^αH₂), 3,27 og 3,35 (2H, Pro C^δH₂), 3,59 (2H, Gly CH₂), 4,04 (2H, NH-(CH₂)₃-Ο, C^γH₂), 4,11 (2H, Pro C^αH), 4,27 (1H, Glu C^αH), 4,2-4,3 (3H, Fmoc, CH₂ und CH), 7,47 (1H, Gly NH), 7,33, 7,42, 7,72 og 7,89 (8H, Fmoc aromatische H), 7,86 (1H, NH-(CH₂)₃-O, NH), 8,23 (3H, Glu NH).
H-Pro-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Fmoc (26).
Boc-Pro (10 mMol, 2,15 g) wurde in DMF (50 ml) gelöst, mit DIC (10 mMol, 1,58 ml) in Gegenwart von HOBt (10 mMol, 1,53 g) und 4-Dimethylaminopyridin (3 mMol, 0,36 g) aktiviert. Fmoc-Gly-NH-(CH₂)₃-OH (10 mMol, 3,54 g) wurde hinzugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. DMF wurde unter reduziertem Druck abgedampft, der ölige Rückstand wurde in AcOEt gelöst, und das Präzipitat wurde filtriert. Die AcOEt-Lösung wurde mit 3%iger wässriger HCl (3 mal), Wasser, gesättigter Lösung von NaHCO₃ und Wasser extrahiert. Die Lösung wurde über MgSO₄ getrocknet, und das AcOEt wurde bis zur Trockne abgedampft (4,2 g). TFA (50 ml) wurde hinzugesetzt, die Lösung wurde 60 min lang gerührt, und TFA wurde abgedampft. Der ölige Rückstand wurde mit Toluol abgedampft (3 mal), das Produkt wurde in AcOEt gelöst und mit Ether präzipitiert. Ausbeute: 1,4 g (31%). Die Tlc auf einer Silicagelplatte zeigte einen UV-absorbierenden Fleck, R_f = 0,10 in CHCl₃: MeOH: ACOH (90:9:1).
Linker II : Z-Glu-Pro-O-(CH₂)₃-NH←Gly←Fmoc (27).
Z-Glu(OtBu) (20 mMol, 6,74 g) wurde in DMF (50 ml) gelöst, mit DIC (20 mMol, 3,12 ml) in Gegenwart von HOBt (20 mMol, 3,06 g) aktiviert, und H-Pro-O-(CH₂)₃-NH<-Gly<-Fmoc (26 mMol, 12 g) wurde hinzugesetzt. Der pH-Wert wurde auf 8 mit DIEA (genässtes Papier) eingestellt, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht gerührt. DMF wurde unter reduziertem Druck abgedampft, und das ölige Produkt wurde in AcOEt gelöst, mit einer Lösung von NaHCO₃ (3 mal), Wasser, 3%iger wässriger HCl (3 mal) und Wasser extrahiert. Die organische Schicht wurde mittels MgSO₄ getrocknet, und AcOEt wurde abgedampft. Der ölige Rückstand (8,1 g) wurde in DCM (20 ml) gelöst, und TFA (100 ml) wurde hinzugesetzt. Nach 60 min wurde die Reaktionsmischung abgedampft, der ölige Rückstand wurde mit Toluol (3 mal) abgedampft und in AcOEt gelöst. Das Produkt wurde zu einer gesättigten Lösung von NaHCO₃ extrahiert (5 mal), und vereinigte Extrakte wurden mit AcOEt gewaschen, mit einer Lösung von KHSO₄ angesäuert. Das Produkt wurde zu AcOEt extrahiert (3 mal), mit Wasser gewaschen, über MgSO4 getrocknet, und AcOEt wurde abgedampft. Ausbeute: 4,3 g (30%) an schaumförmigem Produkt. Die Tlc auf einer Silicagelplatte zeigte einen UV-absorbierenden Fleck, R_f = 0,50 in CHCl₃: MeOH: ACOH
Anheftung der Linker I und II an TentaGel.
TentaGel (1 g, Substitution 0,23 in mäquiv. NH₂/g) wurde in DMF vorgequollen (10 ml große Kunststoffspritze, die mit einer Polypropylenfritte ausgestattet war). Zu einer Lösung vom Linker (0,5 mMol) in DMF (2 ml) wurden HOBt (0,5 mMol, 75 mg) und DIC (0,5 mMol, 80 μl) hinzugesetzt, und die Lösung wurde zu der Spritze, die Tg enthielt, überführt. Nach dem Koppeln über Nacht wurde das Harz mit DMF gewaschen (5 mal), und die Fmoc-Gruppe wurde entfernt, und zwar durch 10-minütige Behandlung mit 50%igem Piperidin in DMF. Die Fmoc-Freisetzung wurde quantifiziert, indem die Extinktion (302 nm) der Piperidinlösung und der vereinigten Waschungen gemessen wurde.
Kontrollfreisetzungsreaktionen. Fmoc-Trp in DMF-Lösung wurde durch DIC in Gegenwart von HOBt aktiviert und in 3 molarem Überschuss an einen Linker auf TG gekoppelt.

Nach der Waschung mit DMF wurde die Fmoc-Gruppe durch 50%iges Piperidin in DMF 10 min lang entfernt, und das Harz wurde mit DMF gewaschen. Die Extinktion der Piperidinlösung mit vereinigten Waschungen wurde bei 302 nm abgelesen, und die Fmoc-Freisetzung wurde quantifiziert. Das Harz wurde mit DCM (5 mal) gewaschen und mit TFA behandelt, das unterschiedliche Abfänger enthielt (siehe Tabelle 1), mit DCM, MeOH gewaschen und getrocknet. Eine Probe (ca. 10 mg) wurde über Nacht mit wässriger Pufferlösung pH 8,5 behandelt, die Extinktion der Lösung wurde bei 280 nm abgelesen, das Harz wurde mit Wasser gewaschen und wässriges NaOH (0,5%) wurde hinzugesetzt. Nach 4 h wurde die Extinktion bei 280 nm abgelesen, und die Menge an Trp enthaltendem Peptid wurde berechnet. TABELLE 3 Freisetzungen (in mMol/g) an Trp enthaltenden Peptiden von Linkern

Linker	Fmoc-Freisetzung	TFA-Behandlung	pH 8,5	pH 13
(I)	0,195	Reag. K, 2 h	0,070	0,106
(II)	0,089	keine	0,004	0,080
(II)	0,089	Reag. K, 2 h	0,012	0,067
(II)	0,089	DMS/TFA, 2 h	0,049	0,033
(II)	0,089	TA/TFA, 2 h	0,045	0,039
(II)	0,089	DMS/TFA, 18 h	0,072

TFA, Trifluoressigsäure; Reagens K, 82,5% TFA, 5% Thioanisol, 5% Cresol, 5% Wasser, 2,5% Ethandithiol; DMS, Dimethylsulfid; TA, Thioanisol.

Die Tabelle 3 zeigt, dass ein Diketopiperazin-Linker, der mit einer Boc-Schutzgruppe geschützt ist, durch die Behandlung mit dem Reagens K, welches 95%iges TFA enthält, entschützt wird. Da jedoch der Linker die langsamere Abspalt-Pro-Glu-Kombination war, wurden nur etwa 28% der Tryptophanmarkierung freigesetzt. Dagegen war der Linker, der mit der Z (Benzyloxycarbonyl)-Schutzgruppe geschützt war, keiner Spaltung beim pH zugänglich, obgleich der schnelle abgespaltene Glu-Pro-Linker verwendet wurde. Gleichwohl gab es eine gewisse "Leckung", so dass die Z-Blockiergruppe, obgleich sie brauchbar war, nicht ideal war in Kombination mit der Boc-Schutzgruppe für orthogonal spaltbare Linker. Eine andere Gruppe, wie Alloc, welche durch Hydrogenolyse entfernt wird, kann eine bessere Wahl in Kombination mit Boc sein. Bestimmte Z-Derivate können ebenfalls brauchbar sein.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf den Umfang durch die spezifischen hierin beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, da solche Ausführungsformen nur einzelne Illustrationen von einem Aspekt der Erfindung sein sollen, und jegliche Mikroorganismen, welche funktionell äquivalent sind, liegen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen hierin gezeigten und beschriebenen jenen im Fachbereich Erfahrenen aus der vorstehenden Beschreibung und den anhängigen Zeichnungen ersichtlich werden. Solche Modifikationen liegen innerhalb des Umfangs der anhängigen Ansprüche.

Claims

Festphasenträger, gekoppelt an einen Linker, wobei der Träger von dem Typ ist, welcher für eine Festphasensynthese geeignet ist, und wobei der Linker eine spaltbare Esterbindung und ein Methionin umfasst, wobei das Methionin an einer Dicarbonsäure angeheftet ist, welche an den festen Träger gekoppelt ist, wobei die Esterbindung bei einem hohen pH-Wert spaltbar ist und bei einem pH-Wert von 8,5 oder darunter stabil ist, und wobei die Esterbindung durch Ankoppeln eines Aminoalkohols, Serins, Homoserins oder Threonins mittels einer Amidbindung an eine Carboxylgruppe der Dicarbonsäure und eine Aminosäure an die Hydroxylgruppe des Aminoalkohols, Serins, Homoserins oder Threonins vorgesehen wird.
Festphasenträger gemäß Anspruch 1, wobei die Dicarbonsäure Glutaminsäure oder Asparaginsäure ist.
Festphasenträger gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Aminoalkohol Hydroxylpropylamin ist.
Festphasenträger gemäß Anspruch 3, wobei das Hydroxylpropylamin durch die Esterbindung an eine Aminosäure gebunden ist.
Festphasenträger gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Aminoalkohol, Serin, Homoserin oder Threonin durch die Esterbindung an eine Aminosäure gebunden ist.
Festphasenträger gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei die Aminosäure beta-Alanin ist.
Festphasenträger, gekoppelt an einen Linker, wobei der Träger von dem Typ ist, welcher für die Festphasensynthese geeignet ist, und wobei der Linker eine spaltbare Esterbindung und ein Methionin umfasst, wobei eine Carboxylgruppe des Methionins an eine Amingruppe eines Amins einer Aminodicarbonsäure bindet, welche durch ein C-terminales Carbonyl an den festen Träger gekoppelt ist, wobei die Esterbindung bei einem hohen pH-Wert spaltbar ist und bei einem pH-Wert von 8,5 oder darunter stabil ist, und wobei die Esterbindung durch Ankoppeln eines Hydroxylropylamins mittels einer Amidbindung an einer weiteren Carboxylgruppe der Aminodicarbonsäure und von beta-Alanin an der Hydroxylgruppe des Hydroxylpropylamins vorgesehen wird.
Festphasenträger gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei eine Aminogruppe des Methionins an ein anderes Peptid durch eine Amidbindung gebunden ist.
Festphasenträger gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der feste Träger gewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Polystyrolharz, Poly(dimethylacrylamid)-gepfropftem Styrol-codivinylbenzolharz, Polyamidharz, mit Polyethylenglykol gepfropftem Polystyrol, Polydimethylacrylamidharz und Polysacchariden.
Festphasenträger gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei der Träger durch ein Handle gekennzeichnet ist.
Festphasenträger gemäß Anspruch 10, wobei das Handle Benzhydrylamin ist.