ES2291245T3 - Conectores segmentales selectivamente basados en un grupo metionina y en un grupo ester. - Google Patents

Abstract

Un soporte en fase sólida acoplado a un conector, en donde dicho soporte es del tipo adecuado para la síntesis en fase sólida y dicho conector comprende un enlace éster segmentable y una metionina, en donde dicha metionina está ligada a un ácido dicarboxílico que está acoplado a dicho soporte sólido, en donde dicho enlace éster es segmentable a pH alto y estable a pH 8,5 o inferior, y en donde dicho enlace éster se proporciona al acoplar un aminoalcohol, serina, homoserina o treonina a través de un enlace amida a un grupo carboxilo del ácido dicarboxílico y un aminoácido al grupo hidroxilo de dichos aminoalcohol, serina, homoserina o treonina.

Description

Conectores segmentables selectivamente basados en un grupo metionina y en un grupo éster.

1. Campo de la invención

La presente invención se dirige a conectores basados en conexiones de enlaces éster, especialmente conexiones de enlaces de éster de ácido iminodiacético, para usar en la síntesis de péptidos en fase sólida. En particular, la invención se dirige a conectores segmentables que pueden liberar péptido del soporte en fase sólida bajo condiciones relativamente suaves mediante la formación de una dicetopiperazina u otra estructura cíclica, tal que la estructura cíclica permanece sobre el soporte en fase sólida, y, en una segunda segmentación, bajo condiciones más restrictivas de pH alto. La invención se dirige además a soportes en fase sólida preparados con conectores segmentables múltiples, incluyendo un conector que se segmenta mediante la formación de un producto cíclico. Uno de tales segundos conectores es un éster de ácido hidroximetilbenzoico, o ésteres formados por grupos carboxi de ácido aspártico o glutámico.

2. Antecedentes de la invención

Están disponibles en la industria muchas resinas y asideros en fase sólida para la síntesis de péptidos, según se describe en Fields y Noble, 1990, Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214. Para ser útiles, los asideros deben ser estables a las condiciones de reacción de la síntesis de péptidos, pero cuando la síntesis es completa, el asidero necesita dejarse para la segmentación del péptido del soporte sólido.

Menos comunes, pero no menos útiles, son los conectores segmentables selectivamente. Estos conectores pueden actuar como asideros; alternativamente, el conector puede acoplarse a otro asidero. El rasgo útil de ciertos de estos conectores es que pueden segmentarse bajo condiciones mucho más suaves de las que están asociadas con los asideros, por ejemplo, bajo condiciones suavemente ácidas o básicas, en vez de las condiciones altamente ácidas asociadas con la segmentación de péptidos, por ejemplo, en fluoruro de hidrógeno (HF) o ácido trifluoroacético (TFA).

Se han usado conectores sensibles a la luz ultravioleta, tales como ONb (véase Barany y Albericio, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4936-4942). Otros conectores segmentables requieren hidrogenólisis o fotólisis. Ejemplos de otros conectores fotosensibles (fotosegmentables) se encuentran en Wang (1976, J. Org. Chem. 41:32-58), Hammer y otros (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31-45), y Kreib-Cordonier y otros (1990, en Peptides - Chemistry, Structure and Biology, Rivier y Marshall, eds., pp. 895-897).

Landen (1977, Methods Enzym. 47:145-149) usó ácido fórmico acuoso para segmentar enlaces Asp-Pro; este sistema se ha usado para caracterizar determinantes de células T junto con el método de síntesis del "pin" de Geysen (Van der Zee y otros, 1989, Eur. J. Immunol. 191:43-47). Sin embargo, el tratamiento de péptidos con ácido fórmico es indeseable, especialmente si los péptidos tratados han de usarse en un ensayo biológico.

Otros grupos conectores potenciales segmentables bajo condiciones básicas incluyen los basados en ácido p-(hidroximetil)benzoico (Atherton y otros, 1981, J. Chem. Soc. Perkin I:538-546) y ácido hidroxiacético (Baleaux y otros, 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28:22-28). Geysen y otros (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33) presentaron la segmentación de péptidos mediante ataque nucleófilo sobre un éster carboxi-terminal de prolina, dando lugar a un derivado de dos anillos de dicetopiperazina. Sin embargo, el método de la "dicetopiperazina" descrito por Geysen produce péptidos que tienen un resto de dicetopiperazina C-terminal (Bray y otros, 1991, J. Org. Chem. 56:6659-6671). Esto es una desventaja, debido a que el resto heterocíclico puede afectar a la actividad de enlace o la actividad biológica del péptido liberado. La Publicación de Patente Internacional WO 90/09395 (Geysen, publicada el 23 de Agosto de 1990) sugiere orientar un conector segmentable dipeptídico de modo que el heterociclo permanezca sobre el soporte sólido.

Por otra parte, recientemente, se han desarrollado técnicas que hacen posible la preparación de bibliotecas de 10^{6} a 10^{7} o más péptidos ligados a soportes en fase sólida, en los que cada partícula de soporte en fase sólida contiene una sola especie de péptido (Publicación de Patente Internacional Nº WO 92/00091, publicada el 9 de Enero de 1992). Estas bibliotecas se usan ventajosamente cuando la especie de péptido puede segmentarse secuencialmente en cantidad sustancialmente equimolar del soporte en fase sólida, de modo que cada especie de péptido puede probarse en más de un ensayo con respecto a su actividad, o los péptidos pueden probarse en mezclas, seguido por la separación de todas las partículas de resina de la mezcla positiva para la prueba adicional. Estas bibliotecas también proporcionan una cantidad equimolar de cada péptido para permanecer sobre el soporte en fase sólida para someter a secuenciación los péptidos que, cuando se liberan del soporte sólido, exhiben la actividad de interés.

Así, hay una necesidad en la industria de un conector liberable que dé un péptido de estructura sustancialmente inalterada y, en particular, que no tenga un resto de dicetopiperazina ligado. Por otra parte, hay una necesidad para la liberación de péptidos a una solución compatible con pruebas biológicas.

Por otra parte, hay una necesidad en la industria de conectores múltiplemente segmentables, en los que la segmentación de cada conector sea independiente de la segmentación de los otros, es decir, ortogonal a la segmentación de los otros, proporcionando así la segmentación secuencial de una especie de péptido igual o diferente de un soporte en relaciones equimolares.

La cita de cualquier referencia en esta solicitud no debe considerarse una admisión de que tal referencia esté disponible como "técnica anterior".

3. Sumario de la invención

La presente invención se dirige a conectores basados en conexiones de enlaces éster, en particular conectores de ácido iminodiacético, para la síntesis de péptidos en fase sólida. Tales conectores proporcionan la segmentación del péptido del soporte en fase sólida. En un aspecto de la invención, el enlace éster se segmenta con la formación de una dicetopiperazina u otra estructura cíclica que permanece sobre el soporte sólido. El péptido liberado mediante segmentación del enlace éster puede incluir un grupo carboxihidroxialquilamida C-terminal. En una realización adicional, el enlace éster se segmenta bajo condiciones básicas relativamente fuertes. Preferiblemente, una disposición en tándem de grupos ácido iminodiacético proporciona ambos tipos de enlaces éster.

En un aspecto preferido de la invención, el conector es ácido iminodiacético (IDA). Los restos de ácido carboxílico del IDA, que pueden formar un enlace éster con un péptido, pueden proporcionar segmentación múltiple. La primera reacción de segmentación puede producirse mediante un ataque nucleófilo interno con formación de dicetopiperazina. Esta reacción se produce a un pH mayor que aproximadamente 6,0, preferiblemente mayor que 7,0, mediante el ataque de una amina libre de un aminoácido acoplado al grupo imino del IDA. La amina libre ataca a uno de los ésteres. Alternativamente, el grupo imino en un éster de aminoácido acoplado a uno de los ácidos carboxílicos puede actuar como un nucleófilo para el éster. Más preferiblemente, el grupo imino de un IDA ataca a un éster formado con el ácido carboxílico de un segundo IDA, segundo IDA que se acopla a través de una conexión de amida con el grupo imino del segundo IDA a un ácido carboxílico del primer IDA.

La segunda reacción de segmentación puede producirse mediante un ataque nucleófilo externo, por ejemplo, hidrólisis bajo condiciones básicas relativamente fuertes.

La invención se dirige además a soportes en fase sólida que comprenden más de un conector segmentable, en los que al menos uno de tales conectores puede segmentarse con la formación de una estructura cíclica, por ejemplo, una dicetopiperazina, ligada al soporte en fase sólida. Los conectores pueden comprender además un conector tal que durante la segmentación, la dicetopiperazina se una al péptido liberado. En una realización adicional, la conexión de enlace éster puede ser a un ácido carboxílico reactivo, tal como ácido hidroximetilbenzoico. Otros conectores segmentables que pueden ligarse al soporte en fase sólida en la realización de los conectores segmentables múltiple de la invención incluyen, pero no se limitan a, conectores fotosegmentables y conectores segmentables por ácido. El soporte en fase sólida puede comprender además un asidero tradicional.

La invención se dirige además a métodos para segmentar conectores múltiples secuencialmente, de modo que en cada etapa de segmentación sólo se segmente un conector, y se libere una fracción del péptido.

El conector segmentable de la invención puede usarse para ensayos biológicos o de unión de péptidos u otros compuestos de prueba. Alternativamente, el compuesto conectado puede ser una molécula de codificación según se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/068.327, presentada el 27 de Mayo de 1993. El uso de conectores de ácido iminodiacético es particularmente ventajoso para este tipo de ensayos ya que el péptido liberado carece de un resto de dicetopiperazina.

El uso de ácido iminodiacético (IDA) como un conector tiene grandes ventajas sobre conectores dipeptídicos que forman dicetopiperazinas. El IDA es un reactivo mucho menos costoso. Por otra parte, según se muestra en un ejemplo específico, posteriormente, los conectores de IDA-IDA sufren ciclación rápida con liberación de péptido, incluso a un pH menor que 7. En un ejemplo específico, la liberación se produce a aproximadamente pH 6,5.

Otra ventaja de la presente invención es que la velocidad de liberación de un conector de dicetopiperazina dipeptídico puede controlarse mediante la selección de combinaciones de aminoácidos apropiadas, proporcionando así liberación rápida o, alternativamente, lenta, dependiendo del ensayo biológico de interés. Una ventaja más de la presente invención es que los péptidos pueden liberarse a una solución compatible con pruebas biológicas.

En otro aspecto, la invención proporciona la liberación in vivo de un agente farmacéutico, tal como un péptido. Una ventaja particular de los conectores segmentable de la invención es que la velocidad de segmentación puede controlarse, dependiendo de la velocidad de liberación deseada del agente terapéutico, y el agente farmacéutico liberado no tendrá un resto de dicetopiperazina ligado a él. Tales agentes farmacéuticos liberables se prefieren para la administración oral, en la que un soporte sólido inerte, al que está ligado después de la segmentación la dicetopiperazina u otro resto cíclico, puede excretarse.

Otra ventaja más de la invención es que se proporcionan conectores segmentables múltiples que pueden segmentarse secuencialmente, es decir, ortogonalmente.

3.1. Abreviaturas

Las abreviaturas usadas siguen las recomendaciones de the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (Eur. J. Biochem. 1984, 138:9). Los símbolos de los aminoácidos indican la configuración L cuando es aplicable. Otras abreviaturas son como sigue:

AA

aminoácido

AcOH

ácido acético

Alloc

aliloxicarbonilo

Boc

butiloxicarbonilo

Bu^{t}

terc-butilo

Bzl

bencilo

Ddz

2-(3,5-dimetoxifenil)propiloxicarbonilo

DIC

N,N'-diisopropilcarbodiimida

DIEA

N,N'-diisopropiletilamina

DCM

diclorometano

DKP

dicetopiperazina

DMAP

4-dimetilaminopiridina

DMF

N,N-dimetilformamida

EDT

1,2-etanoditiol

HOBt

1-hidroxibenzotriazol

IDA

ácido iminodiacético

Npys

2-nitropiridilsulfenilo

PA, PAO

éster de propanilamina (o amida)

PAOH

propanolamina (o amida)

RP-HPLC

cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa

SPPS

síntesis de péptidos en fase sólida

TFA

ácido trifluoroacético

TG

TentaGel (resina)

Z

benciloxicarbonilo

4. Breve descripción de los dibujos

Fig. 1. Cinética de reacción de la liberación del péptido Trp-Gly-propanolamida (PAOH) de un conector de IDA a pH 8,3. Absorbancia a 280 nm (triptófano) frente al tiempo. El conector era IDA-Pro-OPA<-Gly<-Trp<-Fmoc (compuesto 7).

Fig. 2A-B. Cinética de reacción de la liberación del péptido Trp-Gly-PAOH del constructo I de conector-resina. Fig. 2A. La primera liberación a pH 8,3. Fig. 2B. La segunda liberación a pH 13,2 (B).

Fig. 3. La cinética de la liberación del péptido Trp-Gly-PAOH del constructo II de conector a pH 8,3. La liberación se produce mediante el ataque del grupo amino \alpha de Gly, acoplado a través de un enlace amida al grupo imino del primer IDA, sobre el éster peptídico formado con uno de los brazos de IDA.

Fig. 4A-D. La cinética de la liberación del péptido Trp-Gly-PAOH de un conector segmentable doble usando una estrategia de IDA-IDA determinada a pH 4,0 (Fig. 4A), 6,5 (Fig. 4B) y 8,5 (Fig. 4C). Fig. 4D. La cinética de una liberación primera y una segunda a pH 8,5 y a pH 13,2, respectivamente.

Fig. 5A-B. Liberación del péptido Trp-Gly-Gly-propanolamida. El péptido se acopló al soporte en fase sólida usando un conector de dicetopiperazina. La absorbancia en solución (enlaces de triptófano y amida) se verificó como una función del tiempo. Fig. 5A. Perfil de absorbancia frente al tiempo del péptido liberado, que muestra la liberación casi cuantitativa de péptido en 2 horas. Fig. 5B. Espectros de absorbancia resueltos frente al tiempo del péptido liberado. Nótese que los espectros son idénticos, indicando que la absorbancia incrementada a lo largo del tiempo resultaba del péptido liberado, en lugar de un artefacto.

Fig. 6. Prueba de estabilidad de un conector de glutamato a pH 8,46. La gráfica de absorbancia frente al tiempo no muestra sustancialmente liberación de péptido durante 7,5 horas.

Fig. 7A-B. Liberación de péptido acoplado al soporte en fase sólida a través de un conector de glutamato. Esta combinación péptido-conector ya se ha tratado con solución a pH 8,5, lo que no daba como resultado la liberación del péptido. El conjugado de péptido-conector se trató con NaOH, pH 13,2, y la liberación de Gly-Trp-Gly-PAOH se verificó espectrofotométricamente. Fig. 7A. Gráfica de absorbancia frente al tiempo, que muestra absorbancia creciente y liberación casi cuantitativa en una hora. Fig. 7B. Espectros de absorbancia resueltos frente al tiempo del péptido liberado. Nótese que los espectros son idénticos, indicando que la absorbancia incrementada a lo largo del tiempo resultaba del péptido liberado, en lugar de un artefacto.

Fig. 8. Liberación en dos fases de péptidos de conectores que tienen dos enlaces éster de modo que el péptido se libera teniendo un resto carboxi libre. Primera liberación a pH 8,0 y segunda liberación e hidrólisis del éster a pH 12.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a conectores basados en conexiones de enlaces éster para síntesis de péptidos en fase sólida, en particular, conectores de ácido iminodiacético. Tales conectores proporcionan la segmentación del péptido del soporte en fase sólida. En un aspecto de la invención, el enlace éster se segmenta con ataque nucleófilo de un nucleófilo interno que forma un compuesto cíclico, por ejemplo, una dicetopiperazina (DKP), que permanece sobre el soporte sólido. El péptido liberado mediante segmentación del enlace éster puede incluir un grupo hidroxialquilamida C-terminal, por ejemplo, metanolamida, etanolamida o propanolamida. En una realización adicional, el enlace éster se segmenta mediante un nucleófilo externo (condiciones básicas). En un aspecto preferido, cuando el conector es IDA-IDA, se proporcionan dos conexiones segmentables de enlace éster, una segmentable a través de la formación de DKP y la segunda a través de tratamiento bajo condiciones de pH alto.

La invención se dirige además a soportes en fase sólida que comprenden más de un conector segmentable, en los que al menos uno de tales conectores contiene una conexión de enlace éster con el péptido. Preferiblemente, tal conector es IDA y, más preferiblemente, IDA-IDA. Un conector adicional puede segmentarse con formación de una estructura cíclica, por ejemplo, una dicetopiperazina, ligada al soporte en fase sólida, o con la dicetopiperazina ligada al péptido liberado. Los grupos nucleófilos de conectores que se segmentan mediante la formación de un producto cíclico pueden estar protegidos ortogonalmente. Los grupos protectores ortogonales pueden retirarse secuencialmente, proporcionando liberaciones secuenciales. En otra realización, la conexión de enlace éster puede ser con un ácido carboxílico reactivo, tal como ácido hidroximetilbenzoico. Otros conectores segmentables que pueden ligarse al soporte en fase sólida en la realización de múltiples conectores segmentables de la invención incluyen, pero no se limitan a, conectores fotosegmentables y conectores segmentables por ácido. El soporte en fase sólida puede comprender además un asidero tradicional.

La invención se dirige además a métodos para segmentar múltiples conectores secuencialmente, de modo que en cada etapa de segmentación sólo se segmenta un conector, y se libera una fracción equimolar del péptido.

En una realización específica, posteriormente, la liberación de péptido se basa en la segmentación de un enlace éster con un nucleófilo interno mediante la formación rápida de una estructura cíclica, por ejemplo, dicetopiperazina, bajo condiciones débilmente básicas. Preferiblemente, el nucleófilo interno es la funcionalidad imino de un conector de IDA, que puede atacar a un enlace éster formado por cualquier ácido carboxílico \alpha de una molécula acoplada a uno de los grupos ácido acético de ramificación del IDA. En un aspecto, el éster de ácido carboxílico es un carboxilo \alpha de un aminoácido; preferiblemente, es un carboxilo de un IDA. En otra realización, el grupo amino \alpha libre de cualquier molécula acoplada al grupo imino del IDA puede atacar a un éster formado con uno de los grupos carbonilo del IDA. En un aspecto, la amina \alpha puede ser parte de un aminoácido. En una realización específica, posteriormente, el aminoácido es glicina.

En una realización adicional, la liberación se efectúa mediante tratamiento con hidróxido sódico o amoníaco diluido en metanol o mediante la exposición a amoníaco gaseoso.

En otra realización más, se usan ambas conexiones. En otra realización, ambas conexiones se proporcionan en un solo conector. Preferiblemente, tal conector es IDA-IDA.

En otra realización más, se usan diferentes conectores con cinco niveles de capacidad de segmentación, incluyendo los conectores de conexión de éster.

\newpage

Según se usa aquí, el término alquilo incluye, pero no se limita a, alcano, alqueno y alquino (es decir, hidrocarburos saturados e insaturados) C_{1} a aproximadamente C_{10}. Por ejemplo, un grupo alquilo puede ser metilo, etilo, etenilo, propilo, propenilo, propinilo, etc. El término alquilo, según se usa aquí, incluye grupos de cadena ramificada así como de cadena lineal, y alquilo cíclico.

Según se usa aquí, el término "conector segmentable" se define como una molécula espaciadora caracterizada por tener un enlace que puede segmentarse bajo condiciones relativamente suaves. El conector tiene un grupo funcional que se enlaza a un soporte en fase sólida, o a un asidero sobre un soporte en fase sólida. El conector tiene un segundo grupo funcional que puede conjugarse con un aminoácido o un péptido o cualquier compuesto orgánico de interés que proporcione un grupo funcional adecuado para el acoplamiento al conector. Los conectores de la invención pueden tener un tercer grupo funcional, un grupo nucleófilo, que puede atacar al enlace éster y segmentarlo de ese modo. El conector proporciona la segmentación del péptido después de que la síntesis sea completa.

Según se usa aquí, el término "soporte en fase sólida" no se limita a un tipo específico de soporte. En cambio, un gran número de soportes está disponible y es conocido por un experto normal en la industria. Soportes en fase sólida incluyen geles de sílice, resinas, películas plásticas derivadas, cuentas de vidrio, algodón, cuentas de plástico, geles de alúmina, polisacáridos. Un soporte en fase sólida adecuado puede seleccionarse sobre la base del uso final deseado y la idoneidad para diversos procedimientos sintéticos. Por ejemplo, para la síntesis de péptidos, soporte en fase sólida puede referirse a resinas tales como resina de p-metilbenzhidrilamina (pMBHA) (Peptides International, Louisville, KY), poliestireno (por ejemplo, PAM-resin obtenida de Bachem Inc., Peninsula Laboratories, etc.), estireno-co-divinilbenceno injertado con poli(dimetilacrilamida) (por ejemplo, resina POLYHIPE®, obtenida de Aminotech, Canadá), resina de poliamida (obtenida de Peninsula Laboratories), resina de poliestireno injertada con polietilenglicol (TentaGel®, Rapp Polymere, Tubingen, Alemania), resina de polidimetilacrilamida (obtenida de Milligen/Biosearch, California) o Sepharose (Pharmacia, Suecia).

En una realización, el soporte en fase sólida puede ser adecuado para uso 0in vivo, es decir, puede servir como un portador o soporte para aplicaciones directas del péptido u otro compuesto biológicamente activo (por ejemplo, TentaGel, Rapp Polymere, Tubingen, Alemania). En una realización particular, el soporte en fase sólida puede ser apetitoso y consumible oralmente.

El término "péptido" se usa aquí en su sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más aminoácidos, análogos de aminoácidos o peptidomiméticos subunitarios. Las subunidades pueden estar conectadas mediante enlaces peptídicos. Según se usa aquí, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y los isómeros ópticos tanto D como L, y análogos de aminoácidos, y subunidades peptidomiméticas. Según se usa aquí, un peptidomimético es una molécula que exhibe propiedades similares a un péptido sin tener una estructura química peptídica. Los péptidos pueden comprender D-aminoácidos, una combinación de D- y L-aminoácidos, y diversos aminoácidos "de diseño" (por ejemplo, \beta-metil-aminoácidos, C\alpha-metil-aminoácidos y N\alpha-metil-aminoácidos, etc.) para transmitir propiedades especiales a los péptidos. Adicionalmente, asignando aminoácidos específicos a etapas de acoplamiento específicas, pueden generarse péptidos con hélices \alpha, vueltas \beta, láminas \beta, vueltas \gamma y péptidos cíclicos.

5.1. Conectores

Los conectores segmentables selectivamente basados en una conexión de enlace éster se caracterizan por ser sensibles al ataque nucleófilo. Preferiblemente, el conector es ácido iminodiacético.

La presente invención proporciona además estrategias para incrementar o disminuir la sensibilidad de un enlace éster específico al ataque nucleófilo. Estas estrategias incluyen, pero no se limitan a, afectar a la nucleofilia del nucleófilo; afectar a la accesibilidad del carbonilo del éster; y afectar a la tendencia a ciclarse, en el caso en el que el nucleófilo ataque al carbonilo del éster en una reacción de ciclación. Al alterar estos parámetros, la invención proporciona control sobre el pH de la reacción de liberación, control sobre la velocidad de liberación y control sobre la cantidad de péptido liberada.

Para la claridad del análisis, la invención se describe en las subsecciones posteriores a modo de ejemplo para los (i) conectores que forman dicetopiperazina (conectores que contienen un nucleófilo interno y que forman estructuras cíclicas que permanecen ligadas al soporte en fase sólida después de la segmentación) y (ii) un conector de ácido hidroximetilbenzoico, glutámico o aspártico (conector segmentable sólo mediante ataque nucleófilo externo). Sin embargo, los principios pueden aplicarse análogamente a otros conectores basados en conexiones de éster.

5.1.1. Conectores de éster segmentables a pH moderado

En una realización, los conectores de la invención liberan un alcohol peptídico durante la formación de una dicetopiperazina, que permanece sobre el soporte en fase sólida. Tales conectores se denominan aquí "conectores de dicetopiperazina (DKP)". La presente invención se basa en parte en la observación de que el péptido acoplado a una alcohol-amina alifática, en la que el grupo amina forma un enlace amida con el carboxilo C-terminal del péptido y el grupo alcohol está ligado a través de un enlace éster a un conector ciclable, puede segmentarse del conector bajo condiciones suaves. Durante la desprotección del nucleófilo sobre el conector, el nucleófilo libre puede atacar al enlace éster, formando un producto cíclico ligado al soporte sólido, por ejemplo, la dicetopiperazina, y liberando el péptido.

El reconocimiento del ácido iminodiacético como un alfa-aminoácido implicado en la formación de dicetopiperazina permite el diseño de nuevos conectores segmentables dobles. El ácido iminodiacético es un compuesto clave adecuado para el diseño de conectores de doble segmentación por varias razones: (i) El grupo imino está en una posición \alpha relativa a los grupos carboxilo; (ii) ambos grupos carboxilo son químicamente iguales (idénticos); (iii) como un aminoácido sustituido en N es propenso a la ciclación a través de la formación de DKP con prácticamente cualquier otro \alpha-aminoácido; (iv) no es quiral; (v) su precio es más que competitivo. En general, hay tres variaciones para construir un conector basado en IDA. Pueden representarse esquemáticamente como dipéptidos que contienen Aaa-IDA, IDA-Aaa o IDA-IDA, en donde Aaa es cualquier alfa-aminoácido, preferiblemente tal que es propenso a la ciclación a través de la formación de DKP. La posición del IDA en tal dipéptido parece no ser importante. Esto no es cierto para otras combinaciones de aminoácidos, tales como Glu-Pro y Pro-Glu, según se describe posteriormente.

Así, en una realización específica, posteriormente, el conector es IDA, en el que se usa un carboxilo para acoplarse al soporte en fase sólida, y el otro carboxilo se acopla a un derivado alcohólico de un péptido, y una amina de un aminoácido acoplado al grupo imino puede actuar como un nucleófilo. En otra realización, posteriormente, el conector es IDA acoplado a un soporte sólido sobre un carboxilo y a un aminoácido sobre el otro carboxilo. El carbonilo \alpha del iminoácido se usa para formar un éster, y el grupo imino del IDA puede atacar al éster. En una realización más preferida, conectores de IDA que se ramifican proporcionan (1) un grupo imino libre que puede participar en el ataque nucleófilo de un éster para formar DKP; y (2) en al menos un enlace éster segmentable mediante una reacción de ciclación y un enlace éster segmentable mediante hidrólisis.

En otra realización, posteriormente, el conector es un dipéptido de la secuencia ácido glutámico-prolina. En otra realización, posteriormente, el conector es un dipéptido de la secuencia prolina-ácido glutámico. En otra realización más, el conector es un dipéptido de la secuencia lisina-prolina. El grupo amino N-terminal del dipéptdo actúa como el nucleófilo en la reacción de segmentación. Generalmente, puede usarse cualquier especie de dipéptido con la condición de que el dipéptido contenga un grupo funcional de cadena lateral para acoplarse al soporte en fase sólida. En realizaciones específicas, posteriormente, el grupo glutamilo \gamma del ácido glutámico se usa para acoplarse con el soporte en fase sólida. Otros grupos de cadena lateral adecuados para acoplarse al soporte en fase sólida incluyen, pero no se limitan a, la cadena lateral de ácido aspártico y el grupo amino \varepsilon derivado de anhídrido de succinilo de la
lisina.

El grupo nucleófilo de los conectores de dicetopiperazina se protege durante la síntesis y antes de la segmentación del péptido. En una realización de la invención, la reacción de segmentación puede controlarse en el nivel de la desprotección del nucleófilo. En una realización específica, en la que el nucleófilo es un grupo imino de ácido iminodiacético o un grupo amino \alpha del dipéptido conector, el grupo protector puede ser Boc, Fmoc, Alloc, Npys, Z o un grupo Z modificado. Como es bien conocido en la industria, tales grupos protectores pueden retirarse bajo condiciones diferentes, y pueden usarse cuando se desea la retirada bajo tales condiciones. Por ejemplo, el grupo protector Boc se retira con TFA; el grupo protector Fmoc se retira bajo condiciones básicas; el grupo protector Alloc se retira mediante hidrogenólisis; el grupo protector Npys se retira bajo condiciones reductoras, por ejemplo, mediante el tratamiento con un grupo -SH libre; y el grupo protector Z se retira en HBr o ácido acético, o mediante hidrogenólisis.

En una realización más, en la que se usan múltiples conectores, se emplean dos conectores de tipo de dicetopiperazina liberables bajo condiciones diferentes. Los diferentes conectores tienen diferentes grupos protectores, por ejemplo, Boc sobre un conector, Npys o Alloc sobre el otro conector, y así son segmentables después de procedimientos de desprotección diferentes.

Después de la desprotección del nucleófilo, el nucleófilo puede reaccionar con el carbonilo del éster, liberando el péptido. Sin embargo, la velocidad de este ataque nucleófilo depende del pH del tampón, de la nucleofilia del nucleófilo y del tamaño y del tipo del anillo que ha de formarse. Por ejemplo, a pH ácido, los electrones del nucleófilo interactuarán con el ácido de Lewis. Si el nucleófilo es una amina, la amina se protonará. Bajo estas condiciones, el ataque nucleófilo no se producirá o será muy lento. Así, el conector de dicetopiperazina requiere como mucho condiciones ligeramente ácidas (pH 6-7), preferiblemente neutras (pH 7) o ligeramente básicas (mayores que pH 7) para liberar el péptido dentro de un período de tiempo razonable. El ajuste del pH es un medio proporcionado para controlar la velocidad de liberación de un péptido. En una realización específica, el péptido se libera rápidamente a pH 8,5 cuando el conector es IDA-IDA, Gly-IDA y Glu-Pro. En otra realización, el péptido se libera a un pH mayor que pH 8,5.

El potencial del conector para formar una estructura cíclica depende mucho del número de átomos del anillo. Las reacciones de ciclación que forman una estructura de anillo de cinco o seis miembros están favorecidas, con anillos de seis miembros más favorecidos. La ciclación para formar anillos de cuatro miembros o menos, o anillos de siete miembros o más, no está favorecida.

La velocidad de segmentación también depende de la nucleofilia inherente del nucleófilo. Esto a su vez está afectado por los grupos funcionales vecinos. Así, en el ejemplo en el que el conector es un dipéptido, la cadena lateral del péptido nucleófilo determinará principalmente la nucleofilia relativa del grupo amino \alpha. Por ejemplo, la S-metilcisteína incrementará la nucleofilia del grupo amino debido al efecto inductivo del azufre en su cadena lateral. Por otra parte, la forma oxidada (sulfóxido o sulfona) de este aminoácido disminuirá significativamente la nucleofilia del grupo amino.

En una modalidad más, la velocidad de segmentación se determina por la accesibilidad del carbonilo del éster. Por ejemplo, si están situados grupos voluminosos, tales como, pero no limitados a, grupos arilo o alquilo secundarios y terciarios, incluyendo grupos heteroarilo o heteroalquilo, en la proximidad del carbonilo del éster, el nucleófilo puede estar estéricamente impedido para atacar el carbonilo. En una realización, el acceso al carbonilo del éster está impedido por la presencia de un grupo metilo, etilo, propilo, etc. en la posición C1 próxima al oxígeno unido al carbonilo. La velocidad de reacción puede incrementarse, por otra parte, retirando grupos voluminosos próximos al carbonilo del éster.

En una realización adicional más, la velocidad de reacción puede afectarse al alterar la propensión del conector a ciclarse. La inclusión de un residuo del aminoácido prolina en la segunda posición (C-terminal) de un conector incrementa la velocidad de segmentación. Aunque sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, este incremento en la velocidad de segmentación corresponde a una propensión incrementada a ciclarse. Por otra parte, la inclusión de un aminoácido prolina en la primera posición (N-terminal) del conector disminuye la velocidad de segmentación. En un ejemplo específico, posteriormente, el conector Glu-Pro se segmenta rápidamente a pH 8,5, pero el conector Pro-Glu se segmenta muy lentamente a este pH. En otra realización, el conector incluye D-aminoácidos, que se sabe que se ciclan fácilmente. Por otra parte, se sabe que los efectos estéricos también determinan el potencial de ciclación. Por ejemplo, los péptidos con glicina aminoterminal se ciclarán muy rápidamente en comparación con péptidos con valina aminoterminal, que, sin embargo, se ciclarán aún más rápidamente que un péptido que contiene el ácido aminoisobutírico estéricamente demandante N-terminal.

Puede apreciarse fácilmente por un experto normal en la industria, provistos de las enseñanzas precedentes, que los conectores de dicetopiperazina de la invención pueden incluir cualquier conector que, mediante ciclación, pueda poner un nucleófilo en proximidad con el carbonilo del éster para la reacción con el carbonilo. Tal estrategia se prefiere debido a que no requiere un exceso de nucleófilo libre, ya que cada conector incluye un nucleófilo. Los conectores de IDA se prefieren especialmente.

En una realización, el conector se sintetiza al formar un éster del grupo carboxilo (por ejemplo, de un aminoácido o cualquier ácido carboxílico) con un aminoalcohol de cadena corta (C1 a C6). El grupo amino puede acoplarse a continuación al grupo carboxilo del primer aminoácido de la cadena peptídica, usando métodos sintéticos de péptidos estándar. En otra realización, la cadena lateral de serina o treonina puede actuar como el alcohol, obviando la necesidad de un derivado de aminoalcohol.

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5.1.2. Conectores de éster segmentables a pH superior

En otra realización más, el conector de la invención puede contener un enlace éster que es susceptible a la segmentación por un nucleófilo libre, por ejemplo, hidroxi o amoníaco. En un ejemplo específico, el conector puede ser IDA en el que el grupo imino está acoplado a un carboxilo, y así no está libre para el ataque nucleófilo. En otro ejemplo, el conector puede ser propanolamina de ácido glutámico (en la que el grupo amino de la propanolamina está acoplado al carboxilo C-terminal del péptido). Otros grupos ácidos adecuados para conectores incluyen, pero no se limitan a, ácido p-(hidroximetil)benzoico, ácido aspártico y ácido hidroxiacético. En lugar de aminoalcoholes, pueden usarse derivados de serina, homoserina y treonina sustituidos en sus grupos OH (mediante la formación del enlace
éster).

El enlace éster puede segmentarse mediante el tratamiento con una base fuerte. Por ejemplo, el enlace puede segmentarse mediante el tratamiento con hidróxido sódico (NaOH) al 0,1%. En otra realización, el enlace puede segmentarse mediante el tratamiento con amoníaco en alcohol, preferiblemente metanol, o mediante la exposición a amoníaco gaseoso. Una ventaja particular del último sistema es que, después de la segmentación, el amoníaco y el alcohol pueden evaporarse, dejando el péptido segmentado a pH neutro.

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5.1.3. Liberación de compuestos con grupo carboxi libre

En las realizaciones previas la liberación de compuesto del conector liberable doble basado en IDA proporciona compuestos que contienen la Gly-HOPA ligada a él. Puesto que puede ser deseable en algunos casos liberar un compuesto sin la hidroxipropilamida de glicina, es decir, que tiene un grupo carboxi libre, se proporciona un conector IDA-IDA modificado que incorpora una segunda conexión de éster. El enlace éster se introduce en el conector al ligar un hidroxiácido, por ejemplo ácido p-hidroximetilbenzoico, serina o 3-hidroxipropilamida de ácido succínico, a ambos brazos de un conector IDA-IDA. Durante la primera liberación a pH 8, se forma la DKP y compuesto con el conector de hidroxiácido se libera a la solución. A continuación, las cuentas se separan de la solución mediante filtración, el pH se lleva hasta aproximadamente 13 mediante la adición de una base fuerte, tal como NaOH. Después de la incubación durante un período suficiente para hidrolizar el éster, típicamente aproximadamente 30 minutos, la base se neutraliza de modo que el pH sea adecuado para un ensayo de rastreo biológico. Así, la segunda liberación se realiza mediante el uso de NaOH según se describe anteriormente y, debido a la presencia del segundo enlace éster, proporciona directamente el compuesto deseado con grupo carboxi libre.

\newpage

La estructura general de un conector de esta realización que da compuestos con grupos carboxi libres es:

1

en donde se pretende que el carboxi libre esté ligado al soporte en fase sólida y R es carbono o un esqueleto hidrocarbúrico que conecta dos grupos hidroxilo (por ejemplo, R = -(CH_{2})_{3}-O-CO(CH_{2})_{2}-CO-Gly-NH-(CH_{2})_{3}-). El enlace éster esencial, para el propósito de la invención, es el enlace éster más cercano al péptido u otro compuesto de prueba que ha de liberarse.

La química de ambas liberaciones sobre un conector modélico se ilustra esquemáticamente en la Figura 8.

5.2. Conectores segmentables múltiples

En un aspecto preferido de la invención, los conectores basados en enlaces éster se combinan con otros conectores segmentables conocidos para proporcionar la liberación secuencial de péptido del soporte en fase sólida. Tales conectores segmentables múltiples se han descrito previamente (Publicación de Patente Internacional Nº WO92/00091). Los conectores segmentables basados en enlaces éster proporcionan un conector preferido en combinación con otros conectores segmentables selectivamente. En una realización específica, tanto el conector de dicetopiperazina como un conector de enlace éster segmentable a pH alto se combinan sobre un soporte en fase sólida.

Como puede apreciarse fácilmente por alguien de experiencia normal en la industria, hay numerosas estrategias para ligar varios conectores segmentables diferentes a un soporte en fase sólida. Preferiblemente, el conector se une al soporte en fase sólida usando técnicas de reacción de condensación química estándar, por ejemplo, la reacción de un carbonilo activado sobre el conector con una amina libre u otro nucleófilo sobre el soporte sólido. Para ligar más de un conector, preferiblemente, el soporte sólido o el asidero ligado al soporte sólido se deriva adicionalmente con grupos lisina de ramificación. Cada uno de los dos grupos amina sobre la lisina puede desprotegerse selectivamente y acoplarse con un conector específico o con otra lisina, para continuar ramificando y ligando conectores adicionales. En otra realización, el conector puede hacerse reaccionar de modo que la concentración de conector sea una fracción de la concentración de nucleófilo. Así, cada conector puede acoplarse no cuantitativamente al soporte sólido, dejando grupos nucleófilos libres para el acoplamiento al siguiente conector.

De acuerdo con la presente invención, un número de conectores diferentes puede combinarse sobre un sólo soporte en fase sólida además de los conectores basados en conexiones de enlace éster. Estos incluyen, pero no se limitan a, conectores que son sensibles a los ácidos, sensibles a las bases, sensibles a los nucleófilos, sensibles a los electrófilos, fotosensibles, sensibles a la oxidación o sensibles a la reducción. Ejemplos de conectores fotosensibles (fotosegmentables) se encuentran en Barany y Albericio (1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4936-4942), Wang (1976, J. Org. Chem. 41:32-58), Hammer y otros (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31-45) y Kreib-Cordonier y otros (1990, en Peptides - Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshall, eds., pp. 895-897). Landen (1977, Methods Enzym. 47:145-149) describe usar ácido fórmico acuoso para segmentar enlaces Asp-Pro. Otros grupos conectores potenciales segmentables bajo condiciones básicas incluyen los basados en ácido p-(hidroximetil)benzoico (Atherton y otros, 1981, J. Chem. Soc. Perkin I:538-546) y ácido hidroxiacético (Baleaux y otros, 1986, Int. J. Pept. Protein Res. 28:22-28). Geysen y otros (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33) presentaron la segmentación de péptidos mediante un mecanismo de dicetopiperazina. Así, la presente invención proporciona conectores de dicetopiperazina "inversos" usados junto con el mecanismo de liberación de dicetopiperazina descrito por Geysen y otros. Preferiblemente, se usan diferentes grupos de bloqueo para bloquear los nucleófilos de los diferentes conectores de dicetopiperazina. Una enzima puede segmentar específicamente un conector que comprende una secuencia que es sensible o un sustrato para la segmentación enzimática, por ejemplo, segmentación con proteasa de un péptido; segmentación con endonucleasa de un oligonucleótido. En ciertos casos, se puede derivar 10-50% de la resina mediante sustitución con el conector segmentable, y el restante 50-90% sustituirse con un conector no segmentable para asegurar que permanecerá suficiente péptido después de la segmentación del conector para la secuenciación. Además de los conectores segmentables, pueden usarse diversos conectores estándar, es decir, que pueden segmentarse usando condiciones de segmentación estándar, por ejemplo, TFA o HF al 50%, para ligar el oligómero al soporte en fase sólida. Ejemplos de conectores incluyen ácido aminobutírico, ácido aminocaproico, ácido aminoheptanoico y ácido 8-aminocaprílico. Fmoc-ácido aminocaproico está disponible comercialmente de Bachem California. En una realización adicional, los conectores pueden comprender adicionalmente una o más \beta-alaninas como espaciadores. Tales conectores estándar en la modalidad de conectores múltiples de la invención proporcionan la retención de péptido sobre el soporte en fase sólida para la secuenciación posterior.

En una realización preferida, puede usarse un asidero de cierre de seguridad (véase Patek y Lebl, 1991, Tetrahedron Lett. 32:3891-4). Tal asidero es una benzhidrilamina sustituida de la fórmula general (I):

2

en la que a = 1 a 3, X^{1} es [S]R^{1} o X^{1} es Z, los grupos X^{1} están en las posiciones orto o para del primer anillo bencénico, y R^{1} es un grupo alquilo y

en la que b = 0 a 3, X^{2} es [S]R^{2}, los grupos X^{2} están en las posiciones orto o para del segundo anillo bencénico, y R^{2} es un grupo alquilo; y

en la que Z es R^{3}, OR^{3} o [S]R^{3} en cualquier posición no ocupada por X^{1} a no ser que X^{1} sea Z, y R^{3} es un grupo alquilo que comprende un grupo funcional reactivo para acoplar a un soporte en fase sólida, y en la que si X^{1} es Z, Z es [S]R^{3} en una posición orto o para; y

en la que c = 0 ó 1 y d = 0 ó 1, Y es OR^{4} y R^{4} es un grupo alquilo; y

en la que [S] es -S-, -SO- o -SO_{2}-; y

en la que D es H, un grupo protector o un acilo protegido en N^{\alpha}. Según se usa aquí, "alquilo " puede ser un C_{1} a C_{10}. Los asideros de cierre de seguridad pueden sintetizarse según se describe (Patek y Lebl, anteriormente). Por ejemplo, pueden hacerse reaccionar hidroxi- o mercapto-benzofenonas con \omega-haloésteres de ácidos alcanocarboxílicos en presencia de iones fluoruro. El carbonilo de la benzofenona se convierte posteriormente en una amina mediante métodos sintéticos habituales, por ejemplo, reacción con hidroxilamina para dar una oxima, seguido por reducción, por ejemplo, con zinc, para dar benzhidrilamina, o mediante aminación reductiva, por ejemplo, mediante reacción con formiato amónico. Alternativamente, la benzofenona puede reducirse hasta el alcohol y amidarse con una amida de aminoácido protegida en N^{\alpha}.

5.2.1. Conector segmentable doble que utiliza segmentación de enlaces éster y enlaces metionina

El rastreo de bibliotecas combinatorias usando tecnología Selectide puede realizarse usando un ensayo de unión sobre cuentas o un ensayo liberable. Puede ser deseable combinar ambos métodos de rastreo, es decir, rastrear la biblioteca con respecto al ligando usando un ensayo de unión sobre cuentas y a continuación confirmar la unión de ligando potencial en solución. Para evitar la liberación accidental durante el ensayo de unión sobre cuentas se proporciona un conector que combina una conexión de éster adecuada para liberación a pH alto y estable a pH 8,5 o inferior, según se describe en la sección 5.1.2, junto con un conector que contiene el aminoácido metionina. El enlace peptídico entre el extremo carboxi de la metionina y un segundo aminoácido puede segmentarse selectivamente mediante bromuro de cianógeno acompañado por la formación de una homoserinalactona.

Una aplicación adicional de los conectores que contienen metionina es el análisis del compuesto de interés mediante espectroscopía de masas ya que tal análisis requiere la segmentación del compuesto de la cuenta.

Un ejemplo de este tipo de conector se ilustra al ligar una metionina a un ácido dicarboxílico, por ejemplo, ácido glutámico, que está conectado al soporte en fase sólida. La conexión que contiene éster se proporciona mediante la reacción del segundo grupo carboxilo del ácido glutámico con hidroxipropilamina para dar un enlace amida. Particularmente preferida como el primer aminoácido que ha de acoplarse al grupo hidroxilo de la hidroxipropilamina es la \beta-Ala, cuya presencia evita la formación de DKP durante la fase de síntesis cuando hay un resto amino libre de un dipéptido. La construcción de un conector que contiene metionina se ilustra en el Ejemplo 7.

5.3. Uso del conector para síntesis de péptidos

Los conectores de esta invención son muy adecuados para ligar una cadena peptídica a un soporte en fase sólida para la síntesis de péptidos. Los conectores pueden ligarse a cualesquiera aminoresinas a través de un grupo funcional adecuado, por ejemplo, ácido carboxílico, sobre el grupo alquilo. La ligación de un grupo funcional ácido carboxílico a una amina sobre la resina puede proceder de acuerdo con cualquiera de las técnicas usadas comúnmente para la síntesis de péptidos, por ejemplo, la preparación de un OPfp, HOBt u otro éster activado, la condensación en presencia de una carbodiimida, etc. Soportes sólidos adecuados para usar en la invención se analizan anteriormente.

Las técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida son bien conocidas en la industria. Expresado simplemente, un aminoácido protegido en N^{\alpha} se activa en el carboxilo \alpha y se acopla con el N^{\alpha} desprotegido del péptido-conector-soporte en fase sólida naciente. Las reacciones de acoplamiento pueden efectuarse mediante técnicas familiares para los expertos en la industria (véanse, por ejemplo, Stewart y Young, 1984, Solid Phase Synthesis, Segunda Edición, Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Fields y Noble, 1990 "Solid phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethyloxycarbonyl amino acids", Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214; Geysen y otros, 1987, J. Immunol. Methods 102:259-274). La química del acoplamiento, la desprotección y finalmente la segmentación del péptido del soporte en fase sólida depende de la elección del grupo protector de \alphaN, que es generalmente terc-butoxicarbonilo (Boc) o 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc).

En una realización preferida de síntesis de péptidos usando conectores de la invención, debe determinarse la terminación del acoplamiento. Métodos para determinar la terminación del acoplamiento son bien conocidos en la industria. Si el acoplamiento no fuera completo, la reacción debería forzarse a la terminación mediante un segundo acoplamiento, por ejemplo, (a) al usar una concentración superior del aminoácido activado o un mecanismo de activación diferente; (b) con la adición de disolventes diferentes o adicionales; o (c) con la adición de sales caotrópicas (véase Klisy Stewart, 1990, en Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier y Marshall (eds.), ESCOM Publishers, pp.
904-906).

5.4. Ensayos de bioactividad con los conectores liberables

Los conectores segmentables de la invención basados en una conexión de enlace éster son útiles para ensayos de unión y ensayos biológicos. Una porción de péptido del conector puede liberarse, y su actividad detectarse in situ. Los soportes en fase sólida de los que se liberaba el péptido de interés pueden obtenerse a continuación y determinarse la secuencia del péptido que permanece sobre el soporte, según se describe en la Publicación de Patente Internacional Nº WO92/00091. Alternativamente, los conectores de dicetopiperazina de la invención pueden usarse en los métodos tradicionales, tales como los descritos por Geysen y otros (1990, J. Immunol. Methods 134:12-33), con la ventaja de que la velocidad de la reacción de segmentación puede controlarse y el péptido liberado no tendrá el resto de dicetopiperazina ligado.

La capacidad para controlar la velocidad de liberación puede usarse para ensayos biológicos en los que se ensaya el efecto de la liberación lenta a largo plazo de péptido.

5.4.1. Bibliotecas de péptidos aleatorias

En un aspecto preferido de la invención, los conectores segmentables basados en conexiones de enlace éster se usan con una biblioteca de péptidos aleatoria como la descrita en la Publicación de Patente Internacional Nº WO92/00091, publicada el 9 de Enero de 1992.

La presente invención permite la identificación de ligandos de péptidos que se unen a moléculas aceptoras. Según se usa aquí, el término "molécula aceptora" se refiere a cualquier sustancia que se una a un ligando de péptidos. Las moléculas aceptoras pueden ser una macromolécula biológica tal como, pero no limitada a, anticuerpos, receptores o virus. Además, las moléculas aceptoras pueden ser un compuesto químico tal como, pero no limitado a, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, lípidos, fármacos, metales o moléculas pequeñas.

La biblioteca de péptidos de la invención puede interactuar potencialmente con muchas moléculas aceptoras diferentes. Al identificar la especie de péptido particular a la que se une una molécula aceptora específica, es posible aislar físicamente la especie de péptido de interés.

La interacción con moléculas aceptoras puede detectarse mediante ensayos de unión competitiva, en los que se marca el ligando natural de un receptor. Alternativamente, los péptidos pueden marcarse, por ejemplo, mediante la incorporación de un elemento trazador radiactivo, y la unión de un péptido marcado a una molécula aceptora puede detectarse directamente.

La presente invención proporciona además ensayos para la actividad biológica de un péptido de una biblioteca tratada a fin de retirar cualesquiera moléculas tóxicas que permanezcan de la síntesis, por ejemplo, mediante neutralización y lavado intensivo con disolvente, agua estéril y medio de cultivo. Las actividades biológicas que pueden ensayarse incluyen toxicidad y destrucción, estimulación y promoción del crecimiento y cambio fisiológico.

De acuerdo con la presente invención, los péptidos de la biblioteca son segmentables selectivamente del soporte en fase sólida que usa el conector de dicetopiperazina de la invención, también denominado aquí "cuenta". En una realización, se preparan cuentas tales que sólo una fracción de péptidos es segmentable selectivamente. El nucleófilo del conector de dicetopiperazina se desprotege y la biblioteca se expone a condiciones suavemente básicas, por ejemplo, mayores que pH 7, de modo que se produce la segmentación de una fracción de péptidos. En una realización, la biblioteca se trata de modo que se libera 10-90% de los péptidos. En una realización más preferida, se libera 25-50% de los péptidos. Cuando todos los péptidos son segmentables, puede efectuarse la segmentación no cuantitativa al afectar a la velocidad de la reacción de segmentación, según se describe anteriormente, y controlar la concentración y el tiempo de tratamiento con la base. Después del tratamiento para efectuar la segmentación, la biblioteca puede tratarse adicionalmente, por ejemplo mediante neutralización o adición de un tampón, para hacerla biológicamente compatible con el ensayo deseado. En la práctica, alguien de experiencia normal sería capaz de determinar fácilmente condiciones de segmentación apropiadas para la segmentación parcial cuando todos los péptidos de la biblioteca están ligados a la fase sólida mediante conectores o enlaces segmentables. Alguien de experiencia normal entenderá además que la concentración relativa de péptido liberado puede afectarse al variar las condiciones de segmentación.

Puesto que las cuentas de la biblioteca están inmovilizadas, se formará un gradiente de concentración de un péptido particular. Se encontrarán altas concentraciones de péptido en la proximidad de la cuenta desde la que se libere. Así, la evidencia de la actividad biológica de interés, en proximidad con una cuenta, permitirá la identificación y el aislamiento de la cuenta, y la secuenciación u otra caracterización del péptido. La identificación del péptido es posible debido a que se dejará suficiente sobre la cuenta después de la segmentación parcial para la secuenciación u otra caracterización. En otra realización, las cuentas pueden someterse a reparto en pocillos de microvaloración (por ejemplo, 10 cuentas/pocillo) y un porcentaje de péptido puede liberarse y probarse con respecto a la actividad biológica, eliminando así el problema potencial de la difusión. Según se describe posteriormente, diferentes fracciones de péptido pueden ligarse a un soporte en fase sólida o cuenta a través de diferentes conectores segmentables para ensayos secuenciales. Dentro de estos ejemplos, el término "cuenta" se refiere a un soporte en fase
sólida.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar cómo pueden realizarse los ensayos biológicos, no como limitaciones.

(i)

Una suspensión de células en suspensión de células simples se dispone en forma de capa sobre medio líquido o una matriz semisólida que contiene una biblioteca de péptidos aleatoria. En una realización, este procedimiento se lleva a cabo en placas de cultivo tisular con micropocillos de 96 pocillos con una o más cuentas por pocillo más la suspensión de células. En otra realización, se aplica una matriz de barrera o "cortador de bizcochos" a la suspensión de células y las cuentas de una biblioteca para crear cámaras individuales. Una proporción de péptido en cada cuenta se conecta con un conector segmentable. Puede liberarse suficiente péptido para ejercer un efecto biológico mientras que todavía permanece suficiente péptido conectado a la cuenta para la secuenciación. La suspensión de células puede estar en solución o puede estar ella misma en una matriz semisólida. Después de un período de incubación adecuado, la población de células se examina con respecto al crecimiento o la proliferación, por ejemplo, mediante identificación de colonias. En otra realización, puede añadirse la sal de tetrazolio MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilterazolio) (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63; Niks y Otto, 1990, J. Immunol. Methods 130:140-151). La succinato deshidrogenasa, encontrada en mitocondrias de células viables, convierte el MTT en azul de formazano. Así, el color azul concentrado indicaría células metabólicamente activas. En otra realización más, puede ensayarse la incorporación de un radiomarcador, por ejemplo timidina tritiada, para indicar la proliferación de células. De forma similar, puede mostrarse la síntesis de proteínas mediante incorporación de ^{35}S-metionina. Las cuentas que liberan péptido que estimulaba o inhibía el crecimiento celular se recuperarían entonces y se someterían a secuenciación, con las secuencias peptídicas identificadas probadas de nuevo a continuación en solución en cultivos confirmadores contra el tipo de célula indicadora.

(ii)

En una realización adicional de (i) anterior, las cuentas de una biblioteca se distribuyen en pocillos de microvaloración tal que cada pocillo contiene aproximadamente diez cuentas. Las cuentas se suspenden en fase de solución. Se libera suficiente péptido de cada cuenta para ejercer un efecto biológico mientras que permanece suficiente péptido sobre la cuenta para la secuenciación. El sobrenadante que contiene péptido liberado puede transferirse a una placa duplicada o dejarse en los pocillos con las cuentas. Se determina la actividad biológica, por ejemplo, el crecimiento o la proliferación de una línea celular. Las cuentas de los pocillos con actividad biológica se someten a secuenciación y cada secuencia se prepara y se prueba para determinar cuál de las secuencias demostraba actividad biológica.

(iii)

En una realización adicional más de (ii) anterior, los péptidos se ligan a cuentas de modo que aproximadamente 1/3 del péptido puede liberarse en una primera etapa, aproximadamente 1/3 en una segunda etapa y el 1/3 restante permanecer sobre la cuenta. La liberación secuencial puede resultar del uso de dos conectores segmentables diferentes, o al limitar el agente de segmentación para liberar sólo una porción del péptido en cada etapa. Para lo último, puede preferirse la irradiación controlada de un conector fotosegmentable, aunque la exposición cuidadosamente cronometrada a un agente de segmentación químico o enzimático puede efectuar la segmentación parcial. Una biblioteca de péptidos segmentables secuencialmente se prepara y se distribuye en pocillos de placas de microvaloración de modo que cada pocillo contiene más de aproximadamente 50, y más preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 1000, cuentas por pocillo. Las cuentas se tratan a fin de segmentar aproximadamente 1/3 de los péptidos. El sobrenadante se ensaya con respecto a la actividad biológica en un ensayo duplicado. A continuación, las cuentas de pocillos que demuestran actividad biológica se suspenden y se distribuyen en pocillos de una placa de microvaloración de modo que cada pocillo contiene aproximadamente 1 a 10 cuentas. Las cuentas se tratan para liberar 1/3 de péptido, y el sobrenadante se ensaya con respecto a la actividad biológica. Las cuentas de pocillos que demuestran actividad biológica se aíslan y el péptido ligado se somete a secuenciación. Cuando se encuentra más de una cuenta, todas las secuencias identificadas se preparan y se prueban individualmente con respecto a la actividad biológica. Este ensayo biológico secuencial en dos etapas proporciona un método poderoso y eficaz para rastrear una biblioteca muy grande con respecto a péptidos con actividad biológica específica.

(iv)

La estimulación de la liberación de citoquina puede ensayarse al añadir una sola suspensión de células inmovilizada en una matriz semisólida, por ejemplo, gel de agarosa. Cuando un péptido de la invención induce la liberación de citoquina, por ejemplo, linfoquina, factor de crecimiento, hormona, etc., la presencia de la citoquina puede detectase mediante la actividad de una línea celular indicadora. Ensayos específicos con una línea celular indicadora pueden realizarse como se describe en (i), anteriormente. En otra realización, citoquina liberada por células estimuladas puede transferirse sobre una membrana, por ejemplo nitrocelulosa, y la citoquina puede detectarse mediante un inmunoensayo o un ensayo de unión a receptores.

(v)

En otra realización, puede observarse la toxicidad de un péptido. Las zonas o calvas de ausencia de crecimiento, por ejemplo, de una línea celular transformada o cancerígena dispuesta en forma de capa sobre una biblioteca de péptidos, indicarían actividad citotóxica. En un aspecto particular, dos poblaciones de células en una matriz semisólida pueden disponerse en forma de capas, una sobre la otra. De este modo, podría identificarse un péptido citotóxico específico para la célula diana, pero no citotóxico para una célula espectadora. Tal ensayo identificaría rápidamente péptidos para usar como agentes quimiotera- péuticos.

(vi)

También puede ensayarse el cambio fisiológico. En una realización, una suspensión de células de miocardio se dispone en forma de capa sobre una biblioteca. Puede observarse el "latido" de células estimuladas por un péptido. En otra realización, la regulación al alza de una enzima particular puede ensayarse al detectar el incremento en una actividad enzimática específica si está disponible un sustrato adecuado, tal como un cromógeno (por ejemplo, MTT, (i), anteriormente), un fluoróforo o un material quimioluminiscente. Alternativamente, la regulación al alza de una enzima puede detectarse mediante un ensayo inmunológico. En una realización adicional más, las técnicas histológicas pueden indicar cambios fisiológicos o morfológicos efectuados por un péptido de la biblioteca.

(vii)

La presente invención proporciona un método para ensayar la actividad de un péptido en una biblioteca sobre células polarizadas, por ejemplo, células con una cara basolateral y una luminal. Pueden prepararse cultivos celulares polares sobre una membrana semipermeable, correspondiente al lumen. Se añade una biblioteca en una matriz semisólida a la cara luminal o la cara basolateral. Pueden ensayarse diversos efectos de un péptido de la invención, tales como transporte polar, proliferación, comunicación intercelular, etc. En particular, al marcar el péptido, por ejemplo, con un radiomarcador o un fluoróforo, pueden identificarse péptidos transportables. Hay una necesidad existente desde hace mucho tiempo en la industria de moléculas absorbibles específicamente. En particular, tales moléculas serían útiles para la administración oral o nasal de productos farmacéuticos, donde se desea el transporte desde la superficie luminal hasta la superficie basolateral del epitelio.

Será entendido además por un experto normal en la industria que puede usarse cualquier célula que pueda mantenerse en cultivo tisular, durante un espacio corto o largo, en un ensayo biológico. El término "célula", según se usa aquí, pretende incluir células procarióticas (por ejemplo, bacterianas) y eucarióticas, levaduras, mohos y hongos. Pueden usarse células primarias o líneas mantenidas en cultivo. Por otra parte, los solicitantes prevén que puedan realizarse ensayos biológicos sobre virus al infectar o transformar células con virus. Por ejemplo, y no a modo de limitación, la capacidad de un péptido para inhibir la actividad lisogénica del bacteriófago lambda puede ensayarse al identificar colonias de E. coli transfectadas que no forman calvas claras cuando se infectan.

Los métodos de la presente invención para ensayar la actividad de un péptido de una biblioteca aleatoria de péptidos o un péptido simple no están limitados a los ejemplos posteriores; los solicitantes prevén que cualquier sistema de ensayo puede modificarse para incorporar la invención descrita actualmente. Los solicitantes prevén que éstos están dentro del alcance de su invención.

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5.5. Usos farmacéuticos de los conectores segmentables

Los conectores segmentables selectivamente basados en una conexión de enlace éster pueden usarse para la liberación de agentes farmacéuticos in vivo. En una realización, el agente farmacéutico liberado es un péptido. Sin embargo, cualquier sustancia farmacéuticamente activa que pueda unirse a través de un enlace éster al conector puede acoplarse al conector para la liberación in vivo. Además, puesto que la invención proporciona el control de la velocidad de liberación de los conectores de dicetopiperazina de la invención, la presente invención permite variar la velocidad de liberación, dependiendo de la velocidad de liberación deseada para una molécula de interés.

Además, puesto que la presente invención proporciona la liberación de una forma de alcohol libre de la entidad liberada, y la retención de la dicetopiperazina sobre un soporte en fase sólida que puede excretarse, por ejemplo, después de la administración oral, la invención proporciona la liberación de un agente farmacéutico apropiado, no comprometida por un resto de dicetopiperazina ligado al agente farmacéutico.

La presente invención se ilustrará mediante referencia a los siguientes ejemplos, que están a modo de ejemplificación y no de limitación.

6. Ejemplo Conectores basados en ácido iminodiacético para la liberación en dos fases de péptidos de un soporte sólido

Se sintetizaron péptidos sobre un soporte polímero a través de un conector que contiene ácido iminodiacético (IDA) segmentable que permitía la liberación independiente en dos fases de porciones definidas de péptido a una solución. Los péptidos se ligaban al conector a través de un enlace éster de Fmoc-Gly-propanolamida (PAOH). El enlace éster era segmentable mediante dos mecanismos únicos, a saber (1) mediante el ataque nucleófilo de un nucleófilo interno dando como resultado la formación de DKP y (2) hidrólisis alcalina. Los péptidos liberados de ambos conectores contenían extremos carboxi idénticos (hidroxipropilamidas, -PAOH, en este ejemplo). El conector más adecuado contenía un motivo dipeptídico IDA-IDA y los péptidos se sintetizaron sobre IDA carboxi-terminal o cada IDA soportaba un péptido.

Se describe la síntesis y la liberación del péptido modélico Leu-encefalina. Se diseño el conector de IDA de este ejemplo que proporciona liberación en dos fases, y es particularmente útil para probar "bibliotecas peptídicas" que consisten en millones de péptidos, ya que permite rastrear péptidos con respecto a la interacción con un aceptor dado en solución.

Puesto que los péptidos normalmente se transcriben en la dirección N-terminal a C-terminal, en los esquemas y las fórmulas presentadas aquí, las flechas (\leftarrow) indican una orientación inversa (C-terminal a N-terminal).

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6.1. Materiales y métodos

Los derivados de aminoácidos se adquirieron de Advanced ChemTech, Kentucky, y se usaron sin purificación. DCC, DIEA se obtuvieron de Aldrich (Milwaukee); HOBT y BOP se obtuvieron de Propeptide (SNPE Vert-le-Petit, Francia). Las TLC se realizaron sobre placas de gel de sílice G prerrevestidas Whatman (Kent, Inglaterra) Silica Gel UV_{254} usando los sistemas de disolventes descritos. Los puntos de fusión se determinaron sobre un bloque de Kofler y están sin corregir. Los espectros de ^{1}H NMR se registraron en un General Electric QE 300 Instrument. Todos los espectros se presentan en ppm relativas al tetrametilsilano (\delta) usando CDCl_{3} o CD_{3}SOCD_{3} como disolventes. Los espectros de absorción UV/VIS se registraron en un espectrofotómetro Hewlett-Packard HP8452A Diode-Array usando una cubeta de cuarzo de 1 cm. Las HPLC tanto analíticas como preparativas se llevaron a cabo sobre un sistema Spectra Physics modular usando columnas Vydac (0,46 x 250 mm, 5 \mum, flujo 1 ml/min) y Vydac (10 x 250 mm, 10 \mum, flujo 3 ml/min) C-18, respectivamente.

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6.1.1. Preparación de conectores de ida Ácido terc-butiloxicarboniliminodiacético (Boc-IDA); (1)

Una solución de 30,0 g (225 milimoles) de ácido iminodiacético en NaOH 1 N (225 ml) y dioxano (200 ml) se agitó y se enfrió en un baño de agua de hielo. Se añadió pirocarbonato de di-terc-butilo (53,9 g, 247 milimoles) en varias porciones y la agitación se continuó a temperatura ambiente durante 1 h. El dioxano se evaporó a vacío, se cubrió con una capa de acetato de etilo (100 ml) y se acidificó con solución saturada de KHSO_{4} hasta pH 2-3. La fase acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 150 ml). Los extractos de acetato combinados se lavaron con agua (100 ml), se secaron sobre MgSO_{4} anhidro y se evaporaron a vacío. El producto se cristalizó en una mezcla de disolventes de acetato de etilo y éter de petróleo, rendimiento 47,0 g (90%).

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Anhídrido de ácido terc-butiloxicarboniliminodiacético; (2)

Se añadió diciclohexilcarbodiimida (9,76 g, 47,3 milimoles) a una solución de Boc-IDA (10,0 g, 43 milimoles) en una mezcla de diclorometano (280 ml) y DMF (5 ml). Después de agitar 2 horas, se dejó que cristalizara diciclohexilurea a 4ºC (en un refrigerador). El subproducto se separó por filtración y, después de la concentración a vacío, se repitió la cristalización de la diciclohexilurea residual. El filtrado se evaporó hasta sequedad y se cristalizó en una mezcla de disolventes de acetato de etilo y éter de petróleo. Rendimiento 5,7 g (62%); ^{1}H-NMR (300 MHz, DMSO-d_{6}, 25ºC) \delta: 1,42 (s, 9H, BOC), 4,38 (s, 4H, CH_{2}).

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Boc-N(CH_{2}COOH)-CH_{2}-CO-Pro-O-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc (3)

Se añadió Pro-O(CH_{2})_{3}NH<-Gly<-Fmoc (0,76 g, 1,7 milimoles en DMF (10 ml) a una solución de anhídrido de ácido terc-butiloxicarboniliminodiacético (0,62 g, 2,8 milimoles) en DMF (3 ml). El componente de amino se preparó a partir del trifluoroacetato correspondiente como sigue: TFA, Pro-O(CH_{2})_{3}NH<-Gly-Fmoc se disolvió en acetato de etilo y se extrajo en ácido clorhídrico acuoso 1M. La fase acuosa se ajustó a continuación hasta pH 9 añadiendo una solución saturada de Na_{2}CO_{3} y se extrajo inmediatamente con cloroformo a 5ºC. Después de secar sobre MgSO_{4}, el disolvente se evaporó hasta sequedad. La mezcla de reacción se agitó durante 6 horas y a continuación se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en metanol y se precipitó al añadir éter dietílico para retirar Boc-anhídrido de IDA restante. El producto en bruto que se obtenía se cristalizó en una mezcla de disolventes de acetato de etilo y éter de petróleo. Rendimiento: 0,63 g (57%); ^{1}H-NMR (300 MHz, DMSO-d_{6}, 25ºC) \delta: 1,35 (s, 9H, BOC), 1,71 (m, 2H, PA C^{\beta}H_{2}), 1,85, 2,14 (m, 2H, Pro C^{\beta}H_{2}), 1,91 (m, 2H, Pro C^{\gamma}H_{2}), 3,13 (m, 2H, PA C^{\gamma}H_{2}), 3,58 (d, 2H, Gly C^{\alpha}H_{2}), 3,75-4,16 (m, 4H, IDA), 4,05 (m, 2H, C^{\alpha}H_{2}), 4,32 (m, 1H, Pro C^{\alpha}H), 4,18-4,32 (m, 3H, Fmoc OCH_{2}-CH-), 7,47 (t, 1H, Gly NH), 7,33-7,84 (m, 8H, Fmoc), 7,85 (t, 1H, PA NH).

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Boc-N(CH_{2}-COOH)-CH_{2}COO(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc; (4)

Se disolvió Boc-IDA (4,66 g, 20 milimoles) en 50 ml de mezcla de DCM:DMF (10:1), se añadió DIC (3,14 ml, 20 milimoles), la mezcla de reacción se agitó durante 30 min, se añadió la solución de Fmoc-Gly-OPA (7,08 g, 20 milimoles) y dimetilaminopiridina (0,48 g, 2 milimoles) y la mezcla de reacción de agitó durante la noche. La DMF y el DCM se evaporaron bajo presión reducida, el residuo aceitoso se disolvió en 100 ml de AcOEt, se extrajo 3 veces con agua, HCl acuoso al 5%, agua y solución saturada de NaHCO_{3}. Los extractos de NaHCO_{3} se combinaron, se acidificaron con HCl acuoso, el producto se extrajo tres veces en AcOEt, los extractos de AcOEt combinados se lavaron con solución saturada de NaCl, se secaron con MgSO_{4} anhidro y el AcOEt se evaporó bajo presión reducida. Rendimiento 6,2 g (55%), mancha simple de tlc, Rf 0,37. La NMR mostraba las señales esperadas.

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HN(CH_{2}-CO-O-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly-Fmoc)_{2}, HCl; (5)

Una solución de Fmoc-Gly-PAOH (7,08 g, 20 milimoles) en 30 ml de DMF se añadió a una solución de Boc-IDA (2,33 g, 10 milimoles), se añadieron HOBt (2,7 g, 20 milimoles) y DIC (3,14 ml, 20 milimoles) en 30 ml de DMF y dimetilaminopiridina (0,48 g, 4 milimoles), y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 5 h. La DMF se evaporó bajo presión reducida, el residuo aceitoso se disolvió en 100 ml de AcOEt, se filtró, se extrajo 3 veces con agua, HCl acuoso al 5%, agua, NaHCO_{3} en solución saturada, agua y NaCl en solución saturada en agua. La capa orgánica se secó mediante MgSO_{4} anhidro y el AcOEt se evaporó bajo presión reducida. Rendimiento 7,2 g (80%) de espuma crujiente, Rf 0,55 (contiene dos impurezas con Rf 0,37 y 0,62). El producto se disolvió en 30 ml de DCM, se añadieron 30 ml de TFA y la mezcla de reacción se mantuvo 30 min a TA. El DCM y el TFA se evaporaron bajo presión reducida, el residuo aceitoso se disolvió en AcOEt y se lavó 3 veces con agua y solución saturada de NaHCO_{3}. Después de la extracción con solución de Na_{2}CO_{3}, se formaron tres capas. La capa del fondo que contenía el producto se separó, se acidificó removiendo con HCl al 5%, se disolvió en cloroformo, se secó mediante MgSO_{4} anhidro, se concentró hasta un volumen pequeño y se vertió en un gran exceso de éter. El precipitado se recogió, se lavó con éter y se secó. Rendimiento 5,4 g (64%) de espuma crujiente, mancha simple en tlc, Rf 0,28 en CHCl_{3}:MeOH:AcOH (90:9:1); ^{1}NMR (300 MHz, DMSO-d_{6}, 27ºC) \delta: 1,78 (m, 2H, PA C^{\beta}H_{2}), 3,17 (m, 2H, PA C^{\gamma}H_{2}), 3,60 (d, 2H, Gly CH_{2}), 4,01 (m, 4H, IDA CH_{2}), 4,18 (m, 2H, PA C^{\alpha}H_{2}), 4,19-4,34 (m, 3H, Fmoc OCH_{2}CH), 7,52 (t, 1H, Gly NH), 7,33, 7,43, 7,72 y 7,90 (m, 8H, H aromático de Fmoc), 7,96 (t, 1H, PA, NH).

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Boc-N(CH_{2}-COOH)-CH_{2}-CON(CH_{2}-COO-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc)_{2}; (6)

Se disolvió Boc-IDA (2,33 g, 10 milimoles) en 50 ml de DCM:DMF (10:1), se añadió DIC (1,57 ml, 10 milimoles) y la mezcla de reacción se agitó durante 30 min. A continuación, se añadió la solución de HN(CH_{2}-CO-O-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc)_{2}.HCl (5) (8,4 g, 10 milimoles) en 50 ml de DMF, el pH se llevó hasta aproximadamente 8 mediante DIEA y la mezcla de reacción se agitó a TA durante 1 h. La DMF y el DCM se evaporaron bajo presión reducida, el residuo aceitoso se disolvió en 100 ml de AcOEt y se extrajo 3 veces con agua, HCl acuoso al 5%, agua y una solución saturada de NaHCO_{3}. Los extractos de NaHCO_{3} se combinaron y se acidificaron con HCl acuoso. El producto se extrajo 3 veces en AcOEt, se secó con MgSO_{4} anhidro y el AcOEt se evaporó bajo presión reducida. El residuo aceitoso se trituró con éter y el producto cristalizó. Rendimiento 6,8 g (67%); mancha simple en tlc, Rf 0,28 en CHCl_{3}:MeOH:AcOH (90:9:1); ^{1}NMR (300 MHz, DMSO-d_{6}, 27ºC) \delta: 1,36 (s, 9H, Boc), 1,75 (m, 2H, PA C^{\beta}H_{2}), 3,16 (m, 2H, PA C^{\gamma}H_{2}), 3,60 (d, 2H, Gly CH_{2}), 3,76-4,23 (m, 8H, IDA CH_{2}), 4,11 (m, 2H, PA C^{\alpha}H_{2}), 4,19-4,34 (m, 3H, Fmoc OCH_{2}CH), 7,49 (t, 1H, Gly NH), 7,34, 7,42, 7,72 y 7,89 (m, 8H, H aromático de Fmoc).

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6.1.2. Procedimiento general para la síntesis en fase sólida

Se sometió Tentagel (sustitución 0,23 miliequivalentes de NH_{2}/g) a síntesis en fase sólida usando el siguiente procedimiento general

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3

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La liberación de Fmoc se cuantificó al medir la absorbancia (302 mm) de la solución de piperidina en los lavados combinados.

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Boc-IDA(Fmoc-Trp-Gly-PAO<-Pro)-TG (7)

Se prehinchó TentaGel (0,2 g, sustitución 0,23 miliequivalentes de NH_{2}/g) en DCM, DMF (jeringa de plástico de 5 ml equipada con frita de polipropileno). El conector Boc-IDA(Fmoc-Gly-PAO<-Pro)OH (0,1 g, 0,15 milimoles) en DMF (2 ml), BOP (0,066 g, 0,15 milimoles), HOBT (0,025 g, 0,15 milimoles) y DIEA (0,026 ml, 0,15 milimoles) se acopló al TentaGel de acuerdo con el procedimiento general. Después de la desprotección de Fmoc, Fmoc-Trp (0,059 g, 0,138 milimoles) en DMF (2 ml) activado por BOP (0,061 g, 0,138 milimoles), HOBT (0,019 g, 0,138 milimoles) y DIEA (0,024 ml, 0,138 milimoles) se acopló al carboxilato de la glicina.

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Boc-Gly-IDA(Fmoc-Trp-Gly<-PAO)-TG (8)

Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO)OH (0,019 g, 0,035 milimoles) en DMF (1 ml) activado por BOP (0,015 g, 0,035 milimoles), HOBT (0,05 g, 0,035 milimoles) y DIEA (0,006 ml, 0,035 milimoles) se ligó a TentaGel (0,05 g, sustitución 0,23 miliequivalentes de NH_{2}/g)de la misma manera que se describe para (7), anteriormente. Después de la retirada del grupo Boc y ligar Boc-Gly (0,006, 0,035 milimoles) activado por BOP (0,015 g, 0,035 milimoles), HOBT (0,005 g, 0,035 milimoles) y DIEA (0,006 ml, 0,035 milimoles) en DMF (1 ml), el grupo Fmoc se retiró y Fmoc-Trp (0,015 g, 0,035 milimoles) en DMF (1 ml) activado por BOP (0,015 g, 0,035 milimoles), HOBT (0,005 g, 0,0335) milimoles y DIEA (0,006 ml, 0,035 milimoles) se acopló a Boc-Gly-IDA-(H-Gly-PAO)-TG.

Síntesis del constructo I de conector segmentable doble-resina con diferentes péptidos sobre cada brazo segmentable (9)

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4

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Boc-Lys (Fmoc) (0,023 g, 0,045 milimoles) activado por BOP (0,021 g, 0,045 milimoles), HOBT (0,006 g, 0,045 milimoles) y DIEA (0,009 ml, 0,045 milimoles) se acopló a Tentagel (20 mg, sustitución 0,23 miliequivalentes de NH_{2}/g). Después de la retirada del grupo Boc, Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO)OH (4) (0,025 g, 0,045 milimoles) activado del mismo modo que Boc-Lys (Fmoc) se acopló a Lys (Fmoc)-TG. La retirada del grupo Fmoc permitía el acoplamiento de Fmoc-Val (0,031 g, 0,090 milimoles), en presencia de BOP (0,040 g, 0,090 milimoles), HOBT (0,012 g, 0,090 milimoles) y DIEA (0,016 ml, 0,090 milimoles). El grupo Boc del ácido iminodiacético se retiró y, después de la neutralización como se describe en el procedimiento general, se acopló Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO-Pro)OH (3) (0,030 g, 0,45 milimoles), activado del mismo modo que Boc-Lys(Fmoc). La desprotección de Fmoc final fue seguida por acoplamiento a Fmoc-Trp (0,019 g, 0,045 milimoles) (activación con BOP como se describe anteriormente).

Síntesis del constructo II de conector segmentable doble-resina con diferentes péptidos sobre cada brazo segmentable (10)

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5

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Se sometió Tentagel (0,060 g, sustitución 0,23 miliequivalentes de NH_{2}/g) a síntesis en fase sólida usando el mismo procedimiento que se describe para el conector I con la excepción de emplear Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO)OH (4) (0,023 g, 0,042 milimoles), BOP (0,019 g, 0,042 milimoles), HOBT (0,006 g, 0,042 milimoles) y DIEA (0,007 ml, 0,042 milimoles) en lugar de Boc-IDA-(Fmoc-Gly-PAO-Pro)OH en el acoplamiento del segundo brazo. Esto fue seguido por desprotección de Boc y posterior acoplamiento a Boc-Trp.

Boc-N[CH_{2}-CON(CH_{2}-CO-Lys(Fmoc)-TG)-CH_{2}-COO-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc]-CH_{2}-COO-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly <-Fmoc (11)

Boc-N(CH_{2}-COOH)-CH_{2}-COO-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc (4) (0,57 g, 1 milimoles), usando BOP (0,44 g, 1 milimol), HOBt (0,135 g, 1 milimol) y DIEA (0,175 g, 1 milimol), se ligó a Lys (Fmoc)-TG (2 g, 0,2 milimoles de NH_{2}/g), véase la péptido-resina (9) de acuerdo con el procedimiento general. El grupo Boc se desprotegió y el segundo brazo (de nuevo el compuesto (4)) se acopló mediante el mismo procedimiento.

Boc-N(CH_{2}-CO-Lys(Fmoc)-TG)-CH_{2}-CON(CH_{2}-COO-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly-Fmoc)_{2} (12)

Boc-N(CH_{2}-COOH)-CH_{2}-CON(CH_{2}-COO-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc)_{2} (6) (1,2 g, 1 milimol), BOP (0,44 g, 1 milimol), HOBt (0,135 g, 1 milimol) y DIEA (0,175 ml, 1 milimol), se ligó a Lys (Fmoc)-TG (2 g, 0,2 milimoles de NH_{2}/g, véase el procedimiento para el compuesto de péptido-resina (9)) de acuerdo con el procedimiento general.

Boc-N(CH_{2}-CO-TG)-CH_{2}-CON(CH_{2}-COO-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowCO-(CH_{2})_{2}-CO-NH-(CH_{2})_{3}-O\leftarrowGly\leftarrowTrp\leftarrow Fmoc)_{2} (13)

El conector se construyó como sigue: Boc-N(CH_{2}-COOH)-CH_{2}-CON(CH_{2}-COO-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc)_{2} (Conector 6) se acopló a TG, los grupos Fmoc se retiraron y la resina se hizo reaccionar con anhídrido succínico en DMF (exceso molar de 5) durante 2 h. Después de lavar la resina 5 veces con DMF, el grupo carboxilo sobre la resina se activó mediante HBTU/DIEA y se añadió un exceso molar de 3 de HOPA. Se dejó que la reacción avanzara durante la noche. La resina se lavó 5 veces con DMF y el acoplamiento se repitió bajo las mismas condiciones y la resina se lavó 5 veces con DMF.

El compuesto modélico se construyó como sigue: Fmoc-Gly se preactivó mediante DIC/HOBT y se añadió en un exceso molar de 5 a la resina con conector, la esterificación se catalizó mediante DMAP. Después de la reacción durante la noche, la resina se lavó 5 veces con DMF, el grupo Fmoc se retiró y Fmoc-Trp, activado a través de DIC/HOBT, se acopló en un exceso molar de 3. La resina se lavó 5 veces con DMF, el grupo Fmoc se segmentó, la resina se lavó mediante DMF y DCM, y el grupo Boc del conector se segmentó mediante la mezcla K. La resina se lavó mediante TFA, DCM, MeOH y se secó.

Liberación de control del conector V: El procedimiento para la primera liberación era esencialmente el mismo que se describe para la liberación de control del conector IV, véase la sección 6.2 posteriormente. La estructura del producto del Trp-Gly-O-(CH_{2})_{3}-NH-CO-(CH_{2})_{3}CO-NH-(CH_{2})_{3}-OH liberado en primer lugar se confirmó mediante MS. La solución se alcalinizó a continuación mediante NaOH 2N, después de 30 min el pH se llevó hasta alrededor de 5 mediante HCl 1N y la estructura del producto, Trp-Gly-OH, se confirmó de nuevo mediante MS. La segunda liberación se realizó del mismo modo que se describe y el producto se cuantificó y su estructura se confirmó mediante MS.

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6.1.3. Síntesis de Leu-encefalina doblemente segmentable

El péptido Leu-encefalina (YGGFL) se sintetizó sobre los brazos del conector segmentable doble IV usando el procedimiento de Fmoc-tBu estándar.

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6.1.4. Liberación de control de Trp-Gly-PAOH

El grupo Fmoc se retiró del constructo de conector segmentable doble-resina de acuerdo con el procedimiento general, y Fmoc-Trp activado mediante química de BOP se acopló a los tres brazos. Después del lavado con DMF, el grupo Fmoc y el grupo Boc se retiraron secuencialmente de acuerdo con el procedimiento general. La péptido-resina desprotegida se lavó con DCM (10 veces), MeOH (5 veces) y se secó/liofilizó durante la noche. La péptido-resina secada (aproximadamente 5 mg) se trató con tampón de bicarbonato a pH 8,3 durante 3 h. La liberación de Trp-Gly-PAOH se cuantificó al medir la absorbancia de Trp (280 nm). La resina se lavó a fondo con agua y se incubó con NaOH al 0,5% durante 2 h. La absorbancia del Trp-Gly-PAOH liberado en la solución se leyó a 280 nm.

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6.1.5. Cinética de liberación de péptidos

Se añadió péptido-resina (5 mg) a solución tamponadora agitada a pH 8,3 (tampón de bicarbonato 100 mM) en una cubeta de un espectrómetro UV de exploración (Hewlett-Packard, HP 1050 HPUV). Usando un intervalo de 4 segundos, se obtuvieron exploraciones múltiples del espectro UV desde 200-500 nm y se siguió la cinética de liberación de Trp-Gly-PAOH.

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6.2. Resultados

Partiendo de ácido terc-butiloxicarboniliminodiacético (Boc-IDA), se preparó Boc-IDA-Pro-OPA<-Gly<-Fmoc a través de la apertura del Boc-anhídrido de IDA mediante ataque nucleófilo de Pro-OPA<-Gly<-Fmoc. Se preparó Boc-IDA-OPA\leftarrowGly\leftarrowFmoc a través de la apertura del Boc-anhídrido de IDA mediante ataque nucleófilo de HOPA\leftarrowGly\leftarrowFmoc. Esta reacción se muestra en el Esquema 1:

Un constructo de péptido-resina modélico (7) se montó y, después de la desprotección, el dipéptido modélico se liberó y la cinética se siguió. La cinética de reacción de liberación del péptido Trp-Gly-PAOH se muestra en la
Fig. 1.

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El constructo I de conector segmentable doble-resina se muestra posteriormente:

6

Constructo de conector segmentable doble-resina

7

Este conector se construyó usando dos brazos diferentes que se diferenciaban por tener péptidos modélicos diferentes sintetizados sobre ellos. La cinética de reacción de la liberación a pH 8,3 se muestra en la Fig. 2. La primera liberación se produce a pH 8,5 (Fig. 2A); la segunda liberación se produce a pH 13,2 (Fig. 2B).

8

a: piperidina al 50%/DMF; b: TFA/DCM/TA, c: tampón pH 8,5

El mecanismo de la reacción por la que la liberación estaba compañada por la generación de hexahidropirrolo(1,2-a)pirazin-1,4-diona (HHPPD) se muestra en el Esquema 2, anteriormente. El análisis por HPLC de los péptidos liberados revelaba que además del mecanismo anterior había inesperadamente un segundo mecanismo de formación de heterociclo. Se observó que la formación de dicetopiperazina de IDA-IDA cíclica era más rápida que la formación de HHPPD cíclica. Así, durante la primera liberación (mediante la formación de heterociclo), el péptido del brazo de IDA, que se esperaba que se liberara mediante hidrólisis alcalina, se liberaba en cambio a pH 8,3. El péptido del brazo de prolina podía liberarse a pH 13,2.

A partir de los resultados con I, se diseñó y se sintetizó un segundo conector basado en IDA, II. Este conector se muestra posteriormente:

Constructo II de conector segmentable doble-resina (8)

9

Una ventaja de este conector es que cada rama es idéntica en estructura pero cada una libera péptido a través de un mecanismo único. El mecanismo de reacción se muestra en el Esquema 3:

10

a: piperidina al 50%/DMF; b: TFA/DCM/TA, c: tampón pH 8,5

Una simplificación adicional de la estructura del conector al omitir Boc-Gly conducía a otra versión de conector segmentable doble (III) mostrada posteriormente:

Constructo III de conector segmentable doble-resina

11

La variación para este tema estructural da como resultado el diseño de otro conector segmentable doble más (IV), mostrado posteriormente:

Constructo IV de conector segmentable doble-resina

12

La Tabla 1 resume la liberación de péptido de diversos conectores.

TABLA 1

13

Se trató Boc-IDA(H-Trp-Gly-PAO)-TG (6 mg) con piperidina al 20% en DMF para probar su estabilidad en presencia de esta base débil. La liberación de Fmoc-Trp-Gly-PAOH se cuantificó al medir la absorbancia (302 nm) de la solución de liberado de piperidina. La estabilidad de la conexión de enlace éster se demuestra en la Tabla 2.

TABLA 2

14

Se liberó Leu-encefalina del constructo IV de conexión segmentable doble en dos etapas. La primera liberación a pH 8,3 daba 65 milimoles de péptido por gramo de resina. La segunda liberación a pH 13,2 daba 62 milimoles/g. La HPLC analítica mostraba el mismo pico para ambos péptidos liberados. La pureza de ambos péptidos liberados era mayor que 98%.

6.3. Análisis: conectores basados en un motivo ida-ida

El motivo dipeptídico IDA-IDA se encontró particularmente adecuado para alinear conectores segmentables dobles. El dipéptido IDA-IDA es propenso a la formación de DKP, ya que proporciona tres grupos carboxilo, uno sobre el IDA amino-terminal y dos sobre el carboxi-terminal. Para construir un conector segmentable doble, son necesarios dos grupos carboxilo para la derivación y la construcción del péptido posterior. Hay dos modos posibles de ligar dos Fmoc-Gly-PAOH's a grupos carboxilo. Los Fmoc-Gly-PAOH's están acoplados a ambos carboxilos del IDA carboxi-terminal (conector IV) o cada IDA tiene un Fmoc-Gly-PA (conector III). En cualquier caso, hay un grupo carboxilo libre que sirve para empalmar el conector al soporte sólido (por ejemplo, a través de Lys, que proporciona ella misma un grupo amino extra para la síntesis de una tercera copia de péptido, no liberable, péptido no liberable que puede usarse para secuenciación mediante degradación de Edman).

El conector IV entero se sintetizó en solución. Ambos grupos carboxilo de Boc-IDA se activaron mediante DIC o HOBt y se dejaron reaccionar con Fmoc-Gly-PA en presencia del catalizador dimetilaminopiridina. Después de retirar el grupo protector Boc mediante TFA, la base libre se usó para abrir el anhídrido cíclico preformado de Boc-IDA. En este caso, ambos Fmoc-Gly-PA's son químicamente indistinguibles y el primer péptido se segmenta a través de la ciclación y la formación de DKP a partir de cualquiera de los dos brazos. La DKP formada tiene sobre un nitrógeno la segunda copia de péptido.

Puede considerarse que el conector III está compuesto de dos bloques de construcción idénticos. Se preparó Boc-anhídrido de IDA y se abrió mediante Fmoc-Gly-PA dando como resultado Boc-IDA monosustituido. El acoplamiento de este producto a un soporte sólido, la retirada del grupo Boc y el acoplamiento repetido del mismo derivado de Boc-IDA daba como resultado la síntesis del conector III deseado. Cuando se ensamblan entre sí esos dos bloques de construcción idénticos proporcionan reactividades totalmente diferentes de sus ésteres. Después de retirar el grupo protector Boc y ajustar el pH, el dipéptido IDA-IDA forma DKP casi instantáneamente, liberando el péptido del brazo que ha reaccionado en la reacción de ciclación. La cinética de reacción para la liberación de este péptido se midió a pH 4,0 (Fig. 4A), pH 6,5 (Fig. 4B), pH 8,3 (Fig. 4C). La liberación en dos etapas (a pH 8,5, a continuación pH 13,2) se muestra en la Fig. 4D. El segundo brazo retenía un péptido para la liberación con hidrólisis alcalina.

Este tipo de conector también proporciona la posibilidad de liberar diferentes péptidos en cada una de dos etapas de liberación. Al desproteger separadamente la porción de extensión de la cadena peptídica de los brazos respectivos del conector, pueden realizarse diferentes síntesis de péptidos. Después de acoplar el primer brazo, el grupo Fmoc se retira y el péptido que está destinado a liberarse en la primera etapa (formación de DKP) se sintetiza (protegiéndose su extremo amino mediante la estrategia de protección con Boc). Sin embargo, el grupo imino de IDA tiene que ser protegido por un grupo lábil más ácido, tal como Ddz o Bpoc, que permite su segmentación suave sin afectar a la protección de la cadena lateral en el primer péptido. Después de retirar el grupo Ddz/Bpoc del IDA, el segundo brazo se acopla, el grupo Fmoc se retira y el segundo péptido se monta sobre el grupo amino libre de Gly.

7. Ejemplo Conectores que contienen metionina Ácido \gamma-(3-hidroxipropilamino)metionilglutámico-TG (14)

La estructura de un conector que contiene metionina se da posteriormente:

15

Montaje del conector sobre TentaGel:

Se activó Fmoc-Glu(OtBu) mediante DIC/HOBt y se acopló a TG (0,2 mmol de grupos amino por g de resina) en un exceso molar de 3. El grupo Fmoc se segmentó, la resina se lavó 5 veces con DMF y se acopló Fmoc-Met. El tBu se retiró mediante exposición a TFA. Después de lavar la resina 5 veces con DMF, el grupo carboxilo de la resina se activó mediante HBTU/DIEA y se añadio un exceso molar de 3 de HOPA. Posteriormente, el grupo Fmoc se retiró y se acopló Fmoc-\beta-Ala a los grupos tanto amino como hidroxilo sobre la resina a través de activación con DIC/HOBT y catálisis mediante DMAP durante la noche y se reacopló a través de anhídrido simétrico. Después de lavar la resino con DMF, el grupo Fmoc se retiró y se midió la absorbancia de la solución después de la desprotección y se cuantificó la liberación de Fmoc - Cuantificación de la liberación de Fmoc, 0,38 mmol/g mostraba acoplamiento casi cuantitativo de \beta-Ala.

Este conector se usó en la síntesis en fase sólida de un pentapéptido como el descrito anteriormente. El producto se segmentó de ambos brazos y su pureza se determinó mediante HPLC analítica, la estructura se confirmó mediante MS.

8. Ejemplo Conectores más segmentables con enlaces éster Instrumentación

Los puntos de fusión se determinaron en un bloque de Kofler y están sin corregir. Los espectros de ^{1}H NMR se registraron en un General Electric QE 300 Instrument. Todos los espectros se presentan en ppm relativas al tetrametilsilano (\delta) usando CDCl_{3} o CD_{3}SOCD_{3} como disolventes. Los espectros de absorción UV/VIS se registraron en un espectrofotómetro Hewlett-Packard HP8452A Diode-Array usando una cubeta de cuarzo de 1 cm. Los análisis de aminoácidos se llevaron a cabo en un sistema D-500 (Durrum Corp., EE.UU. de A.). Las HPLC tanto analíticas como preparativas se llevaron a cabo en un sistema Spectra Physics modular usando columnas Vydac (0,46 x 250 mm, 5 \mum, caudal 1 ml/min) y Vydac (10 x 250 mm, 10 \mum, caudal 3 ml/min) C-18, respectivamente.

Procedimientos Generales

La cromatografía de desarrollo rápido se realizó con gel de sílice Merck 60 (40-63 \mum). La cromatografía en capa fina se realizó sobre Silufol UV 254 (Kavalier, Checoslovaquia) o sobre Merck DC-Alufolien Kieselgel 60. La cromatografía en capa fina preparativa se realizó sobre placas de Whatman Silica gel 60A (1 mm de grosor). Las manchas se detectaron mediante extinción de fluorescencia o al pulverizar con una solución diluida de ninhidrina etanólica. Las soluciones de reacción se concentraron usando un evaporador giratorio (a 2,0-2,6 kPa).

Materiales

A no ser que se indique otra cosa, se usaron disolventes de calidad comercial sin purificación adicional. La resina TentaGel (TG) (0,21 milimoles/g) se recibió de Rapp-Polymere (Tübingen). Los aminoácidos protegidos se obtuvieron de Bachem (Torrance, California), Advanced ChemTech (Louisville, Kentucky) o Propeptide (Vert-le-Petit, Francia).

Ddz-Gly-NH-(CH_{2})_{3}-OH (15)

Se añadieron DIC (6,49 ml, 41,6 milimoles), HOBT (5,11 g, 37,8 milimoles) y 1-amino-3-propanol (2,89 ml, 37,8 milimoles) a una solución de Ddz-Gly (liberado de su sal de ciclohexilamonio (15 g, 37,8 milimoles) al disolverla en una mezcla de KHSO_{4} 0,5 N y EtOAc hasta que la capa acuosa es ácida a rojo Congo, pH = 3, y extracción) en DMF (120 ml). Después de agitar durante la noche a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad. El residuo se disolvió en EtOAc y se extrajo con KHSO_{4} 0,5 N a 0ºC, a continuación con solución acuosa saturada de NaHCO_{3} y salmuera, se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó. El producto se disolvió en EtOAc y se precipitó con éter de petróleo. Rendimiento: 9,8 g (73%), homogéneo en TLC: R_{f} = 0,34 (sistema de disolvente 1; DCM:MeOH:AcOH 90:4:1). ^{1}H-NMR (300 MHz, CDCl_{3}, 25ºC) \delta: 1,64 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-OH C^{\beta}H_{2}), 1,73 (s, 6H, Ddz CH_{3}),, 3,37, 3,61 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-OH C^{\alpha}H_{2}, NH-(CH_{2})_{3}-OH C^{\gamma}H_{2}), 3,75 (d, 2H, Gly C^{\alpha}H_{2}), 3,79 (s, 6H, Ddz OCH_{3}), 5,38 (t, 1H, NH-(CH_{2})_{3}-OH NH), 6,35-6,50 (m, 3H, Ddz), 6,61 (t, 1H, Gly NH).

Z-Pro-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowDdz (16)

Se añadieron DIC (0,77 ml, 4,94 milimoles), DMAP (0,092 g, 0,75 milimoles) y Ddz-Gly-NH-(CH_{2})_{3}-OH (1,59 g, 4,5 milimoles) a una solución de Z-Pro (1,13 g, 4,5 milimoles) en DCM (50 ml). Después de agitar durante la noche, la solución se trató posteriormente de la misma manera que el compuesto 15. Rendimiento: 2,42 g (92%); homogéneo en TLC (sistema de disolventes 1).

Boc-Glu(OBz1)-Pro-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowDdz (17)

El compuesto 2 (15,1 g, 25,8 milimoles) se disolvió en DMF (150 ml), se añadió Na_{2}CO_{3} anhidro (0,05 g) y el compuesto se hidrogenó sobre catalizador de Pd al 5%/C (2,8 g) bajo presión normal con agitación vigorosa durante 6 horas (controlado por TLC). La solución se filtró a través de un taco de Celite. El filtrado se usó inmediatamente para acoplar con éster activo preparado in situ Boc-Glu(OBzl)OBt [Boc-Glu(OBzl)-OH (8,7 g, 25,8 milimoles), HOBt (3,49 g, 25,8 milimoles), DIC (4,43 ml, 28,4 milimoles) en DMF (40 ml)]. La mezcla de reacción se agitó durante la noche y a continuación se trató de la misma manera que el compuesto 15. El producto se precipitó en una mezcla de disolventes de EtOAc-PE (acetato de etilo-éter de petróleo) y se obtuvieron 16 g (80%) del producto del epígrafe. R_{f} = 0,81 (sistema de disolventes 1).

Boc-Glu-Pro-O-(CH_{2})_{3}-NH<Gly\leftarrowDdz (18)

El compuesto 3 (16 g, 20,8 milimoles) se disolvió en DMF (210 ml) y se hidrogenolizó sobre catalizador de Pd al 5%/C y se trató de la misma manera que el compuesto 17. El residuo después de la evaporación de DMF se precipitó en una mezcla de EtOAc-PE. Rendimiento: 13,3 g (94%); R_{f} = 0,37. ^{1}H-NMR (300 MHz, DMSO-d_{6}, 25ºC) \delta: 1,36 (s, 9H, BOC), 1,64 (s, 6H, Ddz, CH_{3}), 1,68 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\beta}H_{2}), 1,8-2,0 (m, 6H, Glu C^{\beta}H_{2}, Pro C^{\beta}H_{2} C^{\gamma}H_{2}), 2,16 (m, 2H, Glu C^{\gamma}H_{2}), 3,09 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\alpha}H_{2}), 3,50 (m, 2H, Gly C^{\alpha}H_{2}), 3,65 (m, 2H, Pro C^{\delta}H_{2}), 3,73 (s, 6H, Ddz OCH_{3}), 4,01 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\gamma}H_{2}), 4,22 (m, 1H, Glu C^{\alpha}H), 4,31 (m, 1H, Pro C^{\alpha}H), 6,35-6,49 (m, 3H, Ddz), 7,09 (d, 1H, Glu NH), 7,38 (t, 1H, Gly NH), 8,05 (t, 1H, NH-(CH_{2})_{3}-O NH).

Fmoc-Gly-NH-(CH_{2})_{3}-OH (19)

Se añadieron DIC (31,2 ml, 200 milimoles) y HOBT (27,0 g, 200 milimoles) a una solución de Fmoc-Gly (59,4 g, 200 milimoles) en DMF (900 ml). Después de agitar durante 30 min, se añadió 1-amino-3-propanol (16,1 ml, 210 milimoles) y la mezcla de reacción se agitó durante 4 horas. La mezcla se evaporó hasta sequedad y el residuo se disolvió en EtOAc a ebullición y se dejó cristalizar durante la noche. Después de la recristalización el producto se lavó con EtOAc frío, PE. Rendimiento: 62 g (91%).

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Fmoc-Glu(OBu^{t})-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc (20)

Se añadieron DIC (4,28 ml, 27,4 milimoles), Fmoc-Gly-NH-(CH_{2})_{3}-OH (8,5 g, 24,9 milimoles) y DMAP (0,31 g, 2,49 milimoles) a una solución de Fmoc-Glu(OBu^{t})-OH (10,6 g, 24,9 milimoles) en una mezcla de disolventes de DMF:DCM (1:1, 100 ml). Después de agitar durante la noche, los disolventes se evaporaron y el residuo se disolvió en EtOAc y se extrajo con HCl 1M, NaHCO_{3} al 10%, salmuera, se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó. El producto se cristalizó en EtOAc-PE (17,5 g, 94%), R_{f} = 0,64 (sistema de disolventes 1). ^{1}H-NMR (300 MHz, CDCl_{3}, 25ºC) \delta: 1,44 (s, 9H, tBu), 1,88 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\beta}H_{2}), 1,95-2,10 (m, 2H, Glu C^{\beta}H_{2}), 2,33 (m, 2H, Glu C^{\gamma}H_{2}), 3,38 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\alpha}H_{2}), 3,84 (d, 2H, Gly C^{\alpha}H_{2}), 4,17-4,27 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\gamma}H_{2}), 4,31 (m, 1H, Glu C^{\alpha}H_{2}), 4,30-4,40 (m, 3H, Fmoc OCH_{2}CH-), 5,62 (t, 1H, Gly NH), 5,66 (d, 1H, Glu NH), 6,48 (t, 1H, NH-(CH_{2})_{3}-O NH), 7,29-7,75 (m, 8H, Fmoc).

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Fmoc-Glu-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc (21)

El compuesto 6 (2,0 g, 2,67 milimoles) se disolvió en TFA-H_{2}O (95:5) y la mezcla de reacción se agitó durante 1 h. Después de la evaporación de la mezcla de reacción hasta sequedad, se coevaporó con tolueno cuatro veces. El producto en bruto se cristalizó en EtOAc-PE dos veces para obtener 1,6 g (87%) de producto puro. R_{f} = 0,38 (sistema de disolventes 1). ^{1}H-NMR (300 MHz, DMSO-d_{6}, 25ºC) \delta: 1,71 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\beta}H_{2}), 1,81-1,98 (m, 2H, Glu C^{\beta}H_{2}), 2,32 (m, 2H, Glu C^{\gamma}H_{2}), 3,12 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\alpha}H_{2}), 3,58 (d, 2H, Gly C^{\alpha}H_{2}), 4,06 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\gamma}H_{2}), 4,20-4,30 (m, 3H, Fmoc OCH_{2}CH-), 7,76 (d, 1H, Glu NH), 7,47 (t, 1H, Gly NH), 7,32-7,89 (m, 8H, Fmoc), 7,86 (t, 1H, NH-(CH_{2})_{3}-O NH).

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Fmoc-Glu(O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc)-OBu^{t} (22)

Fmoc-Glu-OBu^{t} (25,0 g, 58,7 milimoles) disuelto en mezcla de DMF-DCM (1:1, 1200 ml) se acopló con Fmoc-Gly-NH-(CH_{2})_{3}-OH (22,0 g, 64,6 milimoles) en presencia de DIC (10,1 ml, 64,6 milimoles) y DMAP (0,71 g, 5,8 milimoles) durante la noche y la mezcla de reacción se trató de la misma manera que se describe para el compuesto 20. La cristalización en EtOAc-PE proporcionaba 34,2 g (78%) del producto. R_{f} = 0,70 (sistema de disolventes 1). ^{1}H-NMR (300 MHz, DMSO-d_{6}, 25ºC) \delta: 1,38 (s, 9H, tBu), 1,71 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\beta}H_{2}), 1,80-1,96 (m, 2H, Glu C^{\beta}H_{2}), 2,37 (m, 2H, Glu C^{\gamma}H_{2}), 3,13 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\alpha}H_{2}), 3,58 (d, 2H, Gly C^{\alpha}H_{2}), 3,93 (m, 1H, Glu C^{\alpha}H), 4,01 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\gamma}H_{2}), 4,20-4,30 (m, 3H, Fmoc OCH_{2}CH-), 7,32-7,89 (m, 8H, Fmoc), 7,47 (t, 1H, Gly NH), 7,67 (d, 1H, Glu NH), 7,85 (t, 1H, NH-(CH_{2})_{3}-O NH).

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Fmoc-Glu(O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc)-OH (23)

El grupo protector terc-butilo del compuesto 22 (33,0 g, 44,1 milimoles) se segmentó de la misma manera que se describe para el compuesto 21. El mismo tratamiento proporcionaba un rendimiento de 26,3 g (86%). ^{1}H-NMR (300 MHz, DMSO-d_{6}, 25ºC) \delta: 1,72 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\beta}H_{2}), 1,83-1,98 (m, 2H, Glu C^{\beta}H_{2}), 2,38 (m, 2H, Glu C^{\gamma}H_{2}), 3,13 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\alpha}H_{2}), 3,58 (d, 2H, Gly C^{\alpha}H_{2}), 4,018 (m, 2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\gamma}H_{2}), 4,02 (m, 1H, Glu C^{\alpha}H), 4,20-4,30 (m, 3H, Fmoc OCH_{2}CH-), 7,32-7,89 (m, 8H, Fmoc), 7,48 (t, 1H, Gly NH), 7,64 (d, 1H, Glu NH), 7,86 (t, 1H, NH-(CH_{2})_{3}-O NH).

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Boc-Glu(Fmoc-Lys-TentaGel)-Pro-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowDdz (constructo de conector-resina liberable mediante la formación de dicetopiperazina)

TentaGel (0,1 g, sustitución 0,23 miliequivalentes de NH_{2}/g) se sometió a síntesis en fase sólida usando el siguiente procedimiento.

16

Síntesis de dipéptido modélico y liberación de control del constructo de péptido-resina: Glu(H-Trp-Gly-Lys-TentaGel)-Pro-O-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Gly<-Trp.2HCl

La síntesis del dipéptido usaba el siguiente procedimiento:

17

La péptido-resina (4 mg) se añadió a solución tamponadora agitada, pH 8,5 (100 milimoles de tampón de bicarbonato) en una cubeta de un espectrómetro UV de exploración (Hewlett-Packard, HP1050 (HPUV). Usando un intervalo de 3 s, se obtuvieron exploraciones múltiples del espectro UV desde 200-500 mm y se siguió la cinética de liberación de Trp-Gly-Gly-NH-(CH_{2})_{3}-OH (Fig. 5). Se alcanzó una liberación máxima de 0,17 milimoles/g (teoría 0,19 milimoles/g).

Fmoc-Glu(Fmoc-Lys-TentaGel)-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc (constructo de conector-resina liberable hidrolíticamente)

Un segundo brazo del conector doblemente segmentable (compuesto 21) se acopló a Fmoc-Lys-TG usando un procedimiento análogo para la síntesis en fase sólida al descrito anteriormente. El dipéptido modélico (Gly-Trp-Glu(Gly-Trp-Lys-TentaGel)-O-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Trp<-Gly) se sintetizó usando también el mismo procedimiento. Para verificar la estabilidad del segundo brazo del conector de EDC, la estabilidad de este brazo se probó bajo las condiciones de la primera liberación. Se añadió péptido-resina (3 mg) a solución tamponadora agitada de pH 8,5 en la cubeta del espectrofotómetro UV y mediante exploraciones de 3 s se midió la estabilidad de este enlace éster (Fig. 6). No se observó liberación significativa del péptido. Esta prueba demostraba la estabilidad del segundo brazo a pH 8,5.

La liberación de control se realizó de la misma manera (siguiendo la cinética mediante espectroscopía UV) que se describe para la primera liberación usando una solución de NaOH al 0,3% (Fig. 7). Se alcanzaba una liberación de 0,18 milimoles/g (teoría 0,19 milimoles/g).

18

TentaGel (20,0 g, sustitución 0,23 miliequivalentes de NH_{2}/g) se sometió a síntesis en fase sólida usando el siguiente procedimiento:

19

20

TentaGel (20,0 g, sustitución 0,23 miliequivalentes de NH_{2}/g) se sometió a síntesis en fase sólida usando el siguiente procedimiento:

21

H-Glu(OBzl)-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc (24)

Boc-Glu(OBzl) (10 milimoles, 3,37 g) se disolvió en 50 ml de DMF y se activó con DIC (10 milimoles, 1,58 ml) en presencia de HOBt (10 milimoles, 1,53 g) y 4-dimetilaminopiridina (3 milimoles, 0,36 g). Se añadió Fmoc-Gly-NH-(CH_{2})_{3}-OH (10 milimoles, 3,54 g) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. La DMF se evaporó bajo presión reducida. La mezcla de reacción se extrajo con éter y el residuo aceitoso se evaporó. Se añadió TFA (50 ml), la solución se agitó durante 60 minutos, el TFA se evaporó y el residuo aceitoso se trituró con éter y se evaporó hasta sequedad. El producto en bruto se disolvió en AcOEt, se extrajo con HCl acuoso al 3% (3 veces) y los extractos acuosos se lavaron con AcOEt, se neutralizaron mediante una solución saturada de NaHCO_{3}. El producto se extrajo 3 veces con AcOEt, los extractos se secaron mediante MgSO_{4} anhidro y el AcOEt se evaporó. Rendimiento 5,5 g (93%). La Tlc sobre una placa de gel de sílice mostraba una mancha absorbente de radiación UV, R_{f} 0,40 en CHCl_{3}: MeOH: ACOH (90:9:1).

Conector I: Boc-Pro-Glu-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc (25)

H-Glu(OBzl)-O-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc (9,3 milimoles, 5,5 g) se trató durante la noche con TFA (50 ml) que contenía 10% de DMS. El TFA se evaporó y la mezcla de reacción se trituró con PE (3 veces) y éter (3 veces) y se evaporó hasta sequedad. Se disolvió Boc-Pro (3,3 milimoles, 0,71 g) en DMF (20 ml), se activó con DIC (3,3 milimoles, 0,52 ml) en presencia de HOBt (3,3 milimoles, 0,49 g) y se añadió H-Glu-O-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc (3,3 milimoles, 1,6 g). El pH se ajustó hasta 8 con DIEA (papel húmedo) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. La DMF se evaporó bajo presión reducida, el producto aceitoso se disolvió en AcOEt y se extrajo con una solución de NaHCO_{3} (5 veces). Los extractos combinados se extrajeron con AcOEt, se acidificaron mediante HCl acuoso al 10%, el producto se extrajo en AcOEt (3 veces), se lavó con agua (3 veces), se secó mediante MgSO_{4} y el AcOEt se evaporó. Rendimiento 1,0 g (16%) de producto espumoso. La Tlc sobre placa de gel de sílice mostraba una mancha absorbente de radiación UV, R_{f} 0,60 en CHCl_{3}: MeOH: ACOH (90:9:1). ^{1}H-NMR (300 MHz, DMSO-d_{6}, 27ºC) \delta: 1,33 (9H, Boc CH_{3}), 1,72 (2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\beta}H_{2}), 1,8 (4H, Pro C^{\beta}H_{2} y C^{\gamma}H_{2}), 1,9 (2H, Glu, C^{\beta}H_{2}), 2,31 (2H, Glu C^{\gamma}H_{2}), 3,13 (2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\alpha}H_{2}), 3,27 y 3,35 (2H, Pro C^{\delta}H_{2}), 3,59 (2H, Gly CH_{2}), 4,04 (2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\gamma}H_{2}), 4,11 (1H, Pro C^{\alpha}H), 4,27 (1H, Glu C^{\alpha}H), 4,2-4,3 (3H, Fmoc CH_{2} y CH), 7,47 (1H, Gly NH), 7,33, 7,42, 7,72 y 7,89 (8H, Fmoc aromático 1H), 7,86 (1H, NH-(CH_{2})_{3}-O NH), 8,23 (1H, Glu NH).

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H-Pro-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc (26)

Boc-Pro (10 milimoles, 2,15 g) se disolvió en DMF (50 ml), se activó con DIC (10 milimoles, 1,58 ml) en presencia de HOBt (10 milimoles, 1,53 g) y 4-dimetilaminopiridina (3 milimoles, 0,36 g). Se añadió Fmoc-Gly-NH-(CH_{2})_{3}-OH (10 milimoles, 3,54 g) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. La DMF se evaporó bajo presión reducida, el residuo aceitoso se disolvió en AcOEt y el precipitado se filtró. La solución de AcOEt se extrajo con HCl acuoso al 3% (3 veces), agua, solución saturada de NaHCO_{3} y agua. La solución se secó sobre MgSO_{4} y el AcOEt se evaporó hasta sequedad (4,2 g). Se añadió TFA (50 ml), la solución se agitó durante 60 min y el TFA se evaporó. El residuo aceitoso se evaporó con tolueno (3 veces), el producto se disolvió en AcOEt y se precipitó con éter. Rendimiento 1,4 g (31%). La Tlc sobre placa de gel de sílice mostraba una mancha absorbente de radiación UV, R_{f} 0,10 en CHCl_{3}:MeOH:ACOH (90:9:1).

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Conector II: Z-Glu-Pro-O-(CH_{2})_{3}-NH\leftarrowGly\leftarrowFmoc (27)

Z-Glu(OtBu) (20 milimoles, 6,74 g) se disolvió en DMF (50 ml), se activó con DIC (20 milimoles, 3,12 ml) en presencia de HOBt (20 milimoles, 3,06 g) y se añadió H-Pro-O-(CH_{2})_{3}-NH<-Gly<-Fmoc (26 milimoles, 12 g). El pH se ajustó hasta 8 con DIEA (papel húmedo) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. La DMF se evaporó bajo presión reducida, y el producto aceitoso se disolvió en AcOEt, se extrajo con una solución de NaHCO_{3} (3 veces), agua, HCl acuoso al 3% (3 veces) y agua. La capa orgánica se secó mediante MgSO_{4} y el AcOEt se evaporó. El residuo aceitoso (8,1 g) se disolvió en DCM (20 ml) y se añadió TFA (100 ml). Después de 60 minutos la mezcla de reacción se evaporó, el residuo aceitoso se evaporó con tolueno (3 veces) y se disolvió en AcOEt. El producto se extrajo en una solución saturada de NaHCO_{3} (5 veces) y los extractos combinados se lavaron con AcOEt, se acidificaron con solución de KHSO_{4}. El producto se extrajo en AcOEt (3 veces), se lavó con agua, se secó sobre MgSO_{4} y el AcOEt se evaporó. Rendimiento 4,3 g (30%) de producto espumoso. La Tlc sobre placa de gel de sílice mostraba una mancha que absorbía radiación UV, R_{f} 0,50 en CHCl_{3}:MeOH:ACOH (90:9:1). ^{1}H-NMR (300 MHz, DMSO, 27ºC) \delta: 1,72 (2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\beta}H_{2}), 1,8 (6H, Pro C^{\beta}H_{2} y C^{\gamma}H_{2}, Glu C^{\beta}H_{2}), 2,34 (2H, Glu C^{\gamma}H_{2}), 3,13 (2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\alpha}H_{2}), 3,58 (2H, Gly CH_{2}), 3,68 (2H, Pro C^{\delta}H_{2}), 4,04 (2H, NH-(CH_{2})_{3}-O C^{\gamma}H_{2}), 4,2-4,3 (3H, Fmoc CH_{2} y CH), 4,3 (1H, Pro C^{\alpha}H), 5,01 (2H, Z CH_{2}), 7,35 (5H, Z aromático), 7,33, 7,42, 7,72 y 7,89 (8H, H aromático de Fmoc), 7,84 (1H, NH-(CH_{2})_{3}-O NH).

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Ligación de los conectores I y II a TentaGel

TengaGel (1 g, sustitución 0,23 miliequivalentes de NH_{2}/g) se prehinchó en DMF (jeringa de plástico de 10 ml equipada con frita de polipropileno). Se añadieron HOBt (0,5 milimoles, 75 mg) y DIC (0,5 milimoles, 80 \mul) a una solución de conector (0,5 milimoles) en DMF (2 ml) y la solución se transfirió a la jeringa que contenía el TG. Después de acoplar durante la noche la resina se lavó con DMF (5 veces) y el grupo Fmoc se retiró mediante tratamiento de 10 minutos con piperidina al 50% en DMF. La liberación de Fmoc se cuantificó midiendo la absorbancia (302 nm) de la solución de piperidina y los lavados combinados.

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Reacciones de Liberación de Control

Fmoc-Trp en solución de DMF se activó mediante DIC en presencia de HOBt y se acopló con un exceso molar de 3 a un conector sobre TG. Después de lavar con DMF, el grupo Fmoc se retiró mediante piperidina al 50% en DMF durante 10 min, y la resina se lavó con DMF. La absorbancia de la solución de piperidina con los lavados combinados se leyó a 302 nm y se cuantificó la liberación de Fmoc. La resina se lavó con DCM (5 veces) y se trató con TFA que contenía diferentes eliminadores (véase la Tabla 1), se lavó con DCM, MeOH y se secó. Una muestra (alrededor de 10 mg) se trató durante la noche con solución tamponadora acuosa, pH 8,5, la absorbancia de la solución se leyó a 280 nm, la resina se lavó con agua y se añadió NaOH acuoso (0,5%). Después de 4 h la absorbancia se leyó a 280 nm y la cantidad de péptido que contenía Trp se calculó.

TABLA 3 Liberaciones (en milimoles/g) de Péptidos que Contienen Trp de los Conectores

22

La Tabla 3 muestra que un conector de dicetopiperazina protegido con un grupo protector Boc se desprotege durante el tratamiento con reactivo K, que contiene 95% de TFA. Sin embargo, puesto que el conector era la combinación de Pro-Glu que se segmentaba más lentamente, sólo se liberaba aproximadamente 28% del marcador de triptófano. En contraste, el conector protegido con el grupo protector Z (benciloxicarbonilo) no era tan susceptible a la segmentación a pH, aunque se usara el conector Glu-Pro más rápidamente segmentado. Sin embargo, había alguna "pérdida", ya que el grupo de bloqueo Z, aunque era utilizable, no era ideal en combinación con el grupo protector Boc para conectores segmentables ortogonales. Otro grupo, tal como Alloc, que se retira mediante hidrogenólisis, puede ser una mejor elección en combinación con Boc. También pueden ser útiles ciertos derivados de Z.

La presente invención no ha de limitarse en el alcance por las realizaciones específicas descritas aquí ya que tales realizaciones pretenden ser sólo simples ilustraciones de un aspecto de la invención y cualesquiera microorganismos que sean funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de esta invención. En efecto, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas aquí serán evidentes para los expertos en la industria a partir de la descripción precedente y los dibujos adjuntos. Tales modificaciones pretenden estar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (11)

1. Un soporte en fase sólida acoplado a un conector, en donde dicho soporte es del tipo adecuado para la síntesis en fase sólida y dicho conector comprende un enlace éster segmentable y una metionina, en donde dicha metionina está ligada a un ácido dicarboxílico que está acoplado a dicho soporte sólido, en donde dicho enlace éster es segmentable a pH alto y estable a pH 8,5 o inferior, y en donde dicho enlace éster se proporciona al acoplar un aminoalcohol, serina, homoserina o treonina a través de un enlace amida a un grupo carboxilo del ácido dicarboxílico y un aminoácido al grupo hidroxilo de dichos aminoalcohol, serina, homoserina o treonina.

2. El soporte en fase sólida de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el ácido dicarboxílico es ácido glutámico o ácido aspártico.

3. El soporte en fase sólida de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el aminoalcohol es hidroxipropilamina.

4. El soporte en fase sólida de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la hidroxipropilamina está unida a través del enlace éster a un aminoácido.

5. El soporte en fase sólida de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el aminoalcohol, la serina, la homoserina o la treonina está unido a través del enlace éster a un aminoácido.

6. El soporte en fase sólida de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en el que el aminoácido es beta-alanina.

7. Un soporte en fase sólida acoplado a un conector, en donde dicho soporte es del tipo adecuado para la síntesis en fase sólida y dicho conector comprende un enlace éster segmentable y una metionina, en donde un grupo carboxilo de dicha metionina está unido a un grupo amino de una amina de un ácido aminodicarboxílico que está acoplada mediante un carbonilo C-terminal a dicho soporte sólido, en donde dicho enlace éster es segmentable a pH alto y estable a pH 8,5 o inferior, y en donde dicho enlace éster se proporciona al acoplar una hidroxipropilamina a través de un enlace amida a otro grupo carboxilo del ácido aminodicarboxílico y beta-alanina al grupo hidroxilo de dicha hidroxipropilamina.

8. El soporte en fase sólida de acuerdo con cualquier reivindicación 1 a 7, en el que un grupo amino de dicha metionina está unido a otro péptido mediante un enlace amida.

9. El soporte en fase sólida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho soporte sólido se selecciona del grupo que consiste en resina de poliestireno, resina de estireno-co-divinilbenceno injertada con poli(dimetilacrilamida), resina de poliamida, poliestireno injertado con polietilenglicol, resina de polidimetilacrilamida y polisacáridos.

10. El soporte en fase sólida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho soporte está caracterizado por un asidero.

11. El soporte en fase sólida de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho asidero es benzhidrilamina.