KR20170109046A - 바이오마커 검출용 불안정성 링커 - Google Patents

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KR20170109046A
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nanopore
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트레버 제이. 모린
윌리엄 비. 던바
대니얼 에이. 헬러
타일러 슈롭셔
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투 포어 가이즈, 인코포레이티드
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Abstract

본 명세서는 포어 시스템을 사용하여 시료 내의 효소 또는 효소 활성을 전자적으로 검출 및/또는 정량하기 위한 방법 및 조성물을 개시한다.

Description

바이오마커 검출용 불안정성 링커
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016 년 2월 2일 출원된 미국 가출원 제 62/111,073호에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원의 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
시료 내에 존재하는 효소 활성은 독소, 이상 또는 생물체의 기타 질환의 존재를 표시할 수 있다. 예를 들어, 인체에서 발견되는 프로테아제는 상처 치유, 세포 신호 전달 및 세포 사멸을 포함한 다양한 정상적인 인체 생리 과정을 조절하는 매우 중요한 분자이다. 인체 내에서 중요한 역할을 하기 때문에 프로테아제의 비정상적인 활성은 많은 질병 상태와 관련이 있으며, 여기에는, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 류마티스 관절염, 알츠하이머병, 심혈관 질환 및 다양한 악성 종양이 포함된다. 전립선 특이 항원(PSA)은 남성의 전립선 암을 진단하고 모니터링하는 데 있어 중요한 기준이 되는 중요한 진단 프로테아제의 일례이다. 프로테아제는 거의 모든 인체 액체 및 조직에서 발견되며, 이의 활성 수준으로부터 질환의 존재를 알 수 있다.
시료 내의 효소의 존재를 측정하기 위한 다수의 전략이 존재하지만, 해당 효소의 활성이 효소 자체의 존재 또는 부재보다 더 중요한 경우가 많다. 시료 내에 존재하는 효소 활성의 수준을 평가하기 위한 전략들이 존재하지만, 이러한 기술은 비용이 많이 들고 상당한 시간 투자와 장치 인프라를 필요로 하고/하거나 사용하기가 어렵거나 휴대하기가 어려운 경우가 많다. 따라서, 신속하고, 활성 효소를 단지 존재하기만 하고 비활성인 효소로부터 식별하고, 표지가 존재하지 않고/않거나(label free), 정제되거나 정제되지 않은 시료에 수행될 수 있는, 용액 내의 효소 활성을 측정하는 방법이 요구된다.
개요
본 명세서에 개시된 다양한 양태는 전술한 필요성 중 하나 이상을 충족시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 시스템 및 방법은 각각 다수의 양태를 가지며, 그 중 하나만이 단독으로 그 바람직한 속성을 담당하지는 않는다. 이하 주요한 특징들을 간략하게 기재할 것이나, 후술되는 청구항에 기재된 바와 같은 본 발명의 범위가 이로 인해 제한되는 것은 아니다. 아래의 기재를 참고함으로써, 특히 "발명의 상세한 설명"(또는 발명의 설명) 부분을 참고함으로써, 본 명세서에 기재된 표본 특징들이 어떠한 방식으로 개선된 시스템 및 방법을 제공하는지가 이해될 것이다.
일부 실시형태에서 본원은, 표적 분자 또는 상태(또는 조건)에 의한 불안정성 링커(labile linker)(예를 들어, 절단 가능한 링커(cleavable linker))의 절단을 나노포어 장치(nanopore device)를 사용하여 검출하여 상기 절단의 생성물을 식별함으로써 시료 내의 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 존재 여부를 검출하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 표적 분자는 효소이고, 본원에 기술된 방법은 상기 시료 내에 활성 표적 효소가 존재하는지 여부를 검출한다.
바람직한 특정 실시형태에서, 상기 폴리머(고분자) 지지체(scaffold)는 dsDNA이다. 바람직한 특정 실시형태에서, 상기 융합 분자는 상기 dsDNA에 직접적으로 및 공유 결합으로 결합되고, 상기 페이로드(payload)는 상기 융합 분자에 직접적으로 및 비공유 결합으로 결합된다.
일부 실시형태에서, 효소에 의한 상기 절단 가능한 링커의 절단 이전에, 상기 지지체/융합 분자/페이로드는 상기 나노포어를 통한 이동시 고유하고 검출 가능한 전류를 제공한다. 일부 실시형태에서, 효소에 의한 상기 절단 가능한 링커의 절단 이후, 상기 지지체(또는 지지체 및 상기 융합 분자의 나머지 성분) 및 페이로드(또는 페이로드 및 상기 융합 분자의 나머지 성분)은 더 이상 결합되어 있지 않으며, 이들 각각은 상기 나노포어를 통한 이동시, 상기 지지체/융합 분자/페이로드 복합체와 구별되는 고유하고 검출 가능한 전류를 제공한다.
특정 실시형태에서, 상기 융합 분자는 상기 DNA 지지체에 결합된 PNA를 포함하고, 상기 절단 가능한 링커는 연결기에 의해 상기 PNA에 공유 테더링된다(tethered covalently). 특정 실시형태에서, 상기 페이로드는 상기 절단 가능한 링커에 결합된 PEG이다. 특정 실시형태에서, 상기 페이로드의 크기, 형상 및/또는 전하는 지지체/융합 분자/페이로드 복합체와 지지체 및 페이로드 간의 식별을 향상시키기 위해, 해상도를 증가시키도록 특정 형상 또는 크기의 포어에서의 전류 임피던스에 기초하여 변형될 수 있다.
특정 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는 하나 이상의 표적 엔도뉴클레아제에 의해 절단 가능한 절단 가능한 도메인을 포함하는 하나 이상의 서열 부위를 갖는 dsDNA이다. 특정 실시형태에서, 절단 이전에, 상기 폴리머 지지체는 선형 dsDNA이다. 특정 실시형태에서, 절단 이전에, 상기 폴리머 지지체는 원형화된(circularized) dsDNA이다.
또한, 본원은 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 존재를 정량하기 위해 나노포어 장치로부터의 데이터를 분석하는 방법을 제공한다. 바람직한 특정 실시형태에서, 검출에 대한 신뢰 수준 수치가 할당된다. 바람직한 특정 실시형태에서, 상기 표적의 농도는 상기 융합 분자, 지지체, 페이로드 및/또는 표적 분자의 농도를 변화시키는 반복 실험에 수학적 도구를 적용함으로써 추정된다.
일부 실시형태에서, 본원은 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자의 존재 여부를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자와 상기 시료를 접촉시키는 단계로서, 상기 절단 가능한 링커는 상기 표적 분자의 존재시 특이적으로 절단되는 것인 단계; 나노포어를 포함하는 장치에 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계; 상기 나노포어를 통해 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 융합 분자의 제 1 부분이 상기 폴리머 지지체에 결합하고(또는 결합한 것이고), 상기 융합 분자의 제 2 부분이 페이로드 분자에 결합하며(또는 결합한 것이며), 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및 상기 절단 가능한 링커가 절단되었는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 시료 내에 상기 표적 분자가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키는 단계는 상기 시료를 상기 장치에 탑재하기 전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 상기 시료를 상기 장치에 탑재하는 단계는 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키기 전에 수행된다.
일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 폴리머 지지체 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 분자의 존재 여부를 검출하는 상기 방법은 상기 시료를 폴리머 지지체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 분자의 존재 여부를 검출하는 상기 방법은 상기 폴리머 지지체를 상기 폴리머 지지체 결합 도메인에 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용(planar stacking interaction) 또는 금속 결합을 통해 상기 폴리머 지지체 결합 도메인에 결합된다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체 결합 도메인은 아지드기(azide group)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체 결합 도메인은 DNA, RNA, PNA, 폴리펩타이드, 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체 결합 도메인은 잠금 핵산(locked nucleic acid(LNA)), 가교 핵산(bridged nucleic acid, BNA), 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nucleases(TALEN), 주기적으로 간격을 두고 분포하는 짧은 회문 구조 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(크리스퍼, CRISPR), 앱타머(aptamer), DNA 결합 단백질 및 항체 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거(zinc finger) 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 단편은 항원-결합 분절(Fab) 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체 결합 도메인은 화학적 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 페이로드 분자 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 분자의 존재 여부를 검출하는 상기 방법은 상기 시료를 페이로드 분자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적 분자의 존재 여부를 검출하는 상기 방법은 상기 페이로드 분자를 상기 페이로드 분자 결합 도메인에 결합시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 페이로드 분자는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용 또는 금속 결합을 통해 상기 페이로드 분자 결합 도메인에 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 페이로드 분자 결합 도메인은 DBCO를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 폴리머 지지체 결합 도메인 및 페이로드 분자 결합 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자의 상기 제 1 부분은 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용, 또는 금속 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 상기 폴리머 지지체에 결합한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자의 상기 제 2 부분은 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용, 또는 금속 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 상기 페이로드 분자에 결합한 것이다.
일부 실시형태에서, 상기 페이로드 분자 또는 상기 폴리머 지지체는 직접 공유 테더링(direct covalent tethering)을 통해 상기 융합 분자에 결합한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 상기 폴리머 지지체 또는 상기 융합 분자를 상기 절단 가능한 링커에 직접 공유 테더링시키기 위한 연결기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는 상기 융합 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 시료 내에 표적 분자가 존재하는지 여부를 검출하는 단계는 상기 폴리머 지지체가 상기 융합 분자를 통해 상기 페이로드 분자에 결합되어 있는지 여부를 센서로 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 센서는 상기 나노포어 내의 전기 신호를 검출한다. 일부 실시형태에서, 상기 전기 신호는 전류이다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 분자는 가수 분해 효소 또는 리아제(lyase)이다. 일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 아조 화합물, 이황화 결합, 술폰, 에틸렌 글리콜 디숙신산염, 히드라존, 아세탈, 이민, 비닐 에테르, 인접 디올(vicinal diol) 및 피콜리네이트 에스테르로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 표적 분자는 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 탄소-탄소 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 상기 절단 가능한 링커 내의 결합을 특이적으로 절단한다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는 디옥시리보핵산(DNA), 덴드리머, 펩타이드 핵산(PNA), 리보핵산(RNA), 폴리펩타이드, 나노로드(nanorod), 나노튜브(nanotube), 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 페이로드 분자는 덴드리머, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, DNA 앱타머, 형광 발색단, 단백질, 폴리펩타이드, 나노비드(nanobead), 나노로드, 나노튜브, 풀러렌, PEG 분자, 리포솜 및 콜레스테롤-DNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 2개 이상의 절단 가능한 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 센서는 전극 쌍을 포함하며, 상기 전극 쌍은 상기 두 용적 사이에 전압차를 인가하고, 상기 나노포어를 통과하는 전류 흐름을 검출한다. 일부 실시형태에서, 상기 장치는 2개 이상의 나노포어를 연달아(또는 직렬로) 포함하며, 상기 폴리머 지지체는 상기 2개 이상의 나노포어에서 동시에 포집되고 검출된다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체의 이동은 상기 나노포어 각각에 고유한 전압을 인가함으로써 제어된다.
또한, 본원은 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 존재 여부를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자와 상기 시료를 접촉시키는 단계로서, 상기 절단 가능한 링커가 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 존재시 특이적으로 절단되는 단계; 나노포어를 포함하는 장치에 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계; 상기 나노포어를 통해 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 융합 분자의 제 1 부분이 상기 폴리머 지지체에 결합하고(또는 결합한 것이고), 상기 융합 분자의 제 2 부분이 페이로드 분자에 결합하며(또는 결합한 것이며), 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및 상기 절단 가능한 링커가 절단되었는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 시료 내에 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본원은 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 존재 여부를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 시료를 융합 분자, 폴리머 지지체 및 페이로드 분자와 접촉시키는 단계로서, 상기 융합 분자는 절단 가능한 링커를 포함하고 상기 표적 분자는 상기 절단 가능한 링커, 폴리머 지지체 결합 도메인 및 페이로드 분자 결합 도메인을 특이적으로 절단하는 단계; 나노포어를 포함하는 장치에 상기 융합 분자, 상기 폴리머 지지체, 상기 페이로드 분자 및 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계; 상기 나노포어를 통해 상기 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및 상기 절단 가능한 링커가 상기 페이로드 분자에 결합되어 있는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 분자는 가수 분해 효소 또는 리아제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)는 10nm 내지 550nm의 파장을 포함하는 빛에 상기 절단 가능한 링커를 노출시킴으로써 상기 절단 가능한 링커를 광분해로 절단한다. 일부 실시형태에서, 상기 광분해 절단에 민감한 절단 가능한 링커는 오르토-니트로벤질 유도체 및 페나실 에스테르 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)는, 상기 절단 가능한 링커를 친핵성 시약, 염기성 시약, 친전자성 시약, 산성 시약, 환원 시약, 산화 시약 및 유기 금속 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 시약에 노출시킴으로써 상기 절단 가능한 링커를 화학적으로 절단한다.
일부 실시형태에서, 상기 장치 내의 2개의 용적 중 적어도 하나는 상기 융합 분자와 상기 폴리머 지지체의 결합 및 상기 융합 분자와 상기 페이로드 분자의 결합을 허용하는 상태(또는 조건)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키기 전에 상기 폴리머 지지체 및 상기 페이로드 분자에 결합된다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 상기 융합 분자를 상기 장치에 탑재하기 전에 상기 폴리머 지지체 및 상기 페이로드 분자에 결합된다.
일부 실시형태에서, 상기 장치 내의 하나 이상의 용적은 상기 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)가 상기 절단 가능한 링커를 절단할 수 있게 하는 상태(또는 조건)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키는 단계는 상기 시료를 상기 장치에 탑재하기 전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 상기 시료를 상기 장치에 탑재하는 단계는 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키기 전에 수행된다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는 디옥시리보핵산(DNA), 덴드리머, 펩타이드 핵산(PNA), 리보핵산(RNA), 폴리펩타이드, 나노로드, 나노튜브, 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 아조 화합물, 이황화 결합, 술폰, 에틸렌 글리콜 디숙신산염, 히드라존, 아세탈, 이민, 비닐 에테르, 인접 디올 및 피콜리네이트 에스테르로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)는 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 탄소-탄소 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 상기 절단 가능한 링커 내의 결합을 특이적으로 절단한다.
일부 실시형태에서, 상기 페이로드 분자는 덴드리머, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, DNA 앱타머, 형광 발색단, 단백질, 폴리펩타이드, 나노비드, 나노로드, 나노튜브, 풀러렌, PEG 분자, 리포솜 및 콜레스테롤-DNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체 및 상기 융합 분자는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용 또는 금속 결합을 통해 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 지지체 및 상기 융합 분자는 직접 공유 테더링을 통해 결합한 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 상기 폴리머 지지체에 직접 공유 테더링하기 위한 연결기를 포함하며, 상기 연결기는 상기 절단 가능한 링커와 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 연결기는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 DNA, RNA, PNA, 폴리펩타이드, 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 폴리머 지지체 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 잠금 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 주기적으로 간격을 두고 분포하는 짧은 회문 구조 반복서열(CRISPR), 앱타머(aptamer), DNA 결합 단백질 및 항체 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 단편은 항원-결합 분절(Fab) 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 화학적 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커 및 상기 페이로드 분자는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용 또는 금속 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 결합되는 것이다. 일부 실시 형태에서, 상기 융합 분자는 2개 이상의 절단 가능한 링커를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 센서는 전극 쌍을 포함하며, 상기 전극 쌍은 상기 두 용적 사이에 전압차를 인가하고, 상기 나노포어를 통과하는 전류 흐름을 검출한다.
또한, 본원은 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태(또는 조건)를 검출하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 시료를 폴리머 지지체와 접촉시키는 단계로서, 상기 폴리머 지지체는 절단 가능한 도메인을 포함하고 상기 절단 가능한 도메인은 상기 표적 분자의 존재시 특이적으로 절단되는 것인 단계; 나노포어를 포함하는 장치에 상기 폴리머 지지체를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계; 상기 나노포어를 통해 상기 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및 상기 절단 가능한 도메인이 절단되었는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 시료 내에 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는 디옥시리보핵산(DNA), 덴드리머, 펩타이드 핵산(PNA), 리보핵산(RNA), 폴리펩타이드, 나노로드, 나노튜브, 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 도메인은 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)는 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 탄소-탄소 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 상기 절단 가능한 도메인 내의 결합을 특이적으로 절단한다.
일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 도메인은 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 존재시 광분해로 절단되며, 상기 절단 가능한 도메인은 오르토-니트로벤질 유도체 및 페나실 에스테르 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 도메인은 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 존재시 화학적으로 절단되며, 상기 절단 가능한 도메인은 아조 화합물, 이황화 결합, 술폰, 에틸렌 글리콜 디숙신산염, 히드라존, 아세탈, 이민, 비닐 에테르, 인접 디올 및 피콜리네이트 에스테르로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 장치는 2개 이상의 나노포어를 직렬로(또는 연달아) 포함하며, 상기 폴리머 지지체는 이동 중에 상기 2개 이상의 나노포어 내에 동시에 존재한다.
일부 실시형태에서, 본원은 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태(또는 조건)를 정량하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 시료를 융합 분자, 폴리머 지지체 및 페이로드 분자와 접촉시키는 단계로서, 상기 융합 분자는 절단 가능한 링커를 포함하고, 상기 절단 가능한 링커는 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건), 폴리머 지지체 결합 도메인 및 페이로드 분자 결합 도메인 존재시 특이적으로 절단되는 것인 단계; 나노포어를 포함하는 장치에 상기 융합 분자, 상기 폴리머 지지체, 상기 페이로드 분자 및 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계; 상기 나노포어를 통해 상기 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및 상기 폴리머 지지체가 상기 페이로드 분자에 결합되어 있는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 표적 분자가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및 상기 센서로부터의 측정치를 사용하여 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 농도 또는 활성을 추정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 농도 또는 활성의 측정은 상기 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 검출에 신뢰 수준 수치를 할당하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키는 단계, 상기 융합 분자, 상기 폴리머 지지체, 상기 페이로드 분자 및 상기 시료를 상기 장치에 탑재하는 단계, 상기 장치를 설정하는 단계 및 상기 폴리머 지지체가 상기 페이로드 분자에 결합되어 있는지 여부를 측정하는 단계는 상기 폴리머 지지체, 상기 융합 분자, 상기 페이로드 분자 또는 상기 시료 내의 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건) 중 하나 이상의 농도 또는 활성을 변화시키면서 반복된다.
또한, 본원은 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자를 정량하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자와 상기 시료를 접촉시키는 단계로서, 상기 절단 가능한 링커는 상기 표적 분자의 존재시 특이적으로 절단되는 것인 단계; 나노포어를 포함하는 장치에 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계; 상기 나노포어를 통해 상기 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 융합 분자의 제 1 부분이 상기 폴리머 지지체에 결합하고(또는 결합한 것이고), 상기 융합 분자의 제 2 부분이 페이로드 분자에 결합하며(또는 결합한 것이며), 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 상기 절단 가능한 링커가 절단되었는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 시료 내에 상기 표적 분자가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및 상기 센서로부터의 측정치를 사용하여 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 농도를 추정하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 농도 측정은 상기 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 검출에 신뢰 수준 수치를 할당하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키는 단계, 상기 시료를 상기 장치에 탑재하는 단계, 상기 장치를 설정하는 단계 및 상기 절단 가능한 링커가 절단되었는지 여부를 측정하는 단계는 상기 폴리머 지지체, 상기 융합 분자, 상기 페이로드 분자 또는 상기 시료 내의 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건) 중 하나 이상의 농도를 변화시키면서 반복된다.
또한, 본원은 나노포어를 포함하는 장치로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하고, 상기 장치는 하나 이상의 포어를 통해 상기 핵산을 통과시키도록 설정되고, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 각 포어에 대해 포함하는 것인 장치; 절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자로서, 상기 절단 가능한 링커는 표적 분자 존재시 특이적으로 절단되는 융합 분자; 페이로드 분자; 폴리머 지지체; 및 시료 내에 상기 표적 분자가 존재하는지 여부를 검출하기 위한 사용 설명서를 포함하는 키트(kit)를 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 상기 페이로드 분자에 결합한다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자는 상기 폴리머 지지체에 결합한다.
전술한 그리고 기타의 목적, 특징 및 장점들은 첨부 도면들에 도시되어 있는 바와 같은 본 발명의 특정 실시형태에 관한 이하의 설명으로부터 더욱 명확해질 것이다. 상이한 도면들 전반에 걸쳐 동일한 도면 부호는 동일한 부분을 나타낸다. 도면들은 반드시 일정한 비율로 도시된 것은 아니며, 본 발명의 다양한 실시형태의 원리를 나타낼 때 강조한다. 본 발명의 실시형태로서 본 발명의 특징들을 예시하는 데이터 수치들이 또한 제공되나, 이는 단지 예시적인 것일 뿐 제한적인 것이 아니다.
도 1은 절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자, 페이로드에 결합된 융합 분자 및 나노포어에 포집된 지지체에 결합된 융합 분자의 실시형태를 도시한다.
도 2는 지지체/융합 분자/페이로드 분자를 사용하여 나노포어 시스템으로 효소 활성을 검출하는 한 방법을 도시한다.
도 3은 선형 지지체 분자를 사용하여 나노포어로 엔도뉴클레아제 활성을 검출하는 방법을 도시한다.
도 4는 원형화된(circularized) 지지체 분자를 사용하여 나노포어로 엔도뉴클레아제 활성을 검출하는 방법을 도시한다.
도 5는 다수의 표적 부위를 갖는 표적 분자를 사용하여 나노포어로 엔도뉴클레아제 활성을 다중 검출(multiplexed detection)하는 방법을 도시한다.
도 6a, 도 6b 및 도 6c는 매트릭스 메탈로프로티나아제 9(matrix-metalloproteinase 9)(MMP9)에 의한 단백질 분해에 민감한, 융합 분자 내에 포함된 절단 가능한 링커의 특정 예를 도시한다. 상기 융합 분자의 링커 성분은 PEG-비오틴 페이로드(도 6a) 또는 크기가 보다 큰 PEG-비오틴-모노스트렙타비딘 페이로드(도 6b)에 연결된다. 상기 융합 분자는 "클릭" 화학 반응("click" chemistry)을 통해 상기 DNA 지지체 분자에 화학적으로 결합할 수 있는 아지드 화학기(N3)를 함유한다(도 6c).
도 7은 MMP9에 의한 절단 가능한 링커의 단백질 분해의 예를 도시한다. MMP9를 함유하는 시료와 배양시, 상기 프로테아제 민감성 구조물은 두 개의 분리된 단편으로 절단된다.
도 8은 임피던스 값으로부터 상기 절단 가능한 링커가 단백질 분해적으로 분해되었는지 여부를 알 수 있는 3가지 예시적인 분자가 나노포어를 통과할 때의 이상적인 전류 프로파일을 도시한다. 패널 A에 표시된 손상되지 않은 DNA 지지체/융합 분자/페이로드의 깊고 오래 지속되는 전류 임피던스 프로파일은 상기 절단 가능한 링커가 MMP9에 의해 분해되지 않았음을 나타낸다. MMP9에 의해 상기 절단 가능한 링커가 절단된 후의 2개의 단편에 대한 패널 B 및 패널 C에는 짧고/짧거나 얕은 전류 임피던스 프로파일이 표시되어 있으며, 상기 단편은 상기 완전한 지지체/융합 분자/페이로드 복합체보다 작기 때문에 그 각각이 나노포어를 통과할 때 전류를 방해하는 정도가 적다.
도 9a는 상기 지지체 분자 및 관심 엔도뉴클레아제에 의해 절단되기 쉬운 특정 DNA 서열을 함유하는 상기 융합 분자의 일부를 포함하는 이중 가닥 DNA의 특정 예를 나타낸다. 상기 융합 분자는 또한, 구리가 존재하지 않는 "클릭" 화학 반응을 통해 페이로드 분자에 다운스트림 접합(downstream conjugation)하기 위한 디벤조시클로옥틴(DBCO) 화학 손잡이(chemical handle)를 함유한다. 도 9b에서, 상기 DBCO 손잡이는 PEG-비오틴 페이로드에 접합된다.
도 10은 엔도뉴클레아제 Eco81I에 의해 상기 DNA의 링커 영역에 포함되는 상기 절단 가능한 도메인 서열이 분해되는 특정 예를 도시한다. Eco81I를 함유하는 시료와 함께 상기 완전한 지지체/융합 분자/페이로드 구조물을 배양하면, 상기 절단 가능한 도메인에서 상기 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 특정 서열이 절단되어 두 개의 분리된 단편이 생성된다.
도 11은 임피던스 값으로부터 DNA의 융합 분자 성분에 코딩된 서열(즉, 상기 절단 가능한 도메인)이 엔도뉴클레아제에 의해 분해되었는지 여부를 알 수 있는 3 가지 예시적인 분자의 이상적인 전류 프로파일을 도시한다. 패널 A는 손상되지 않은 지지체/융합 분자/페이로드가 나노포어를 통과할 때의 이상적인 전류 프로파일을 도시하며, 상기 전체 분자 구조물의 높은 임피던스는 상기 엔도뉴클레아제가 상기 절단 가능한 도메인 서열을 절단하지 않았음을 나타낸다. 패널 B는 배양 및 Eco81I에 의한 절단 이후 상기 DNA의 나머지 지지체 부분의 이상적인 전류 프로파일을 나타내며, 나노포어 통과시 보다 얕고/얕거나 보다 빠른 이벤트 프로파일(event profile)을 생성한다. 패널 C는 상기 지지체에 결합되어 있지 않으면서 나노포어를 통과하는 나머지 단편과 일치하는 이상적인 전류 프로파일을 도시한다.
도 12a는 예시적인 구조물을 도시하며, 여기에서 단일 융합 분자는 효소 활성을 검출하기 위한 2개의 상이한 효소 절단 가능한 링커, 즉 MMP9에 의한 단백질 분해에 민감한 절단 가능한 링커; 및 상기 엔도뉴클레아제 Eco81I에 의해 인식되고 절단되는 특정 서열을 포함한다. 도 12b는 활성 엔도뉴클레아제 Eco81I의 존재에 의한 DNA 서열 링커의 절단 과정을 도시하며, 상기 절단 가능한 링커는 활성 MMP9의 부재시 손상되지 않은 채로 유지된다. Eco81I를 함유하지만 MMP9는 함유하지 않는 시료와 함께 상기 완전한 지지체/융합 분자/페이로드 구조물을 배양하면, 상기 엔도뉴클레아제에 의해 인식되는 특정 서열이 절단되어 두 개의 분리된 단편이 생성된다. 도 12c는 (i) 상기 전체 분자 구조물을 (ii, iii) Eco81I에 의한 상기 절단 가능한 링커 절단 이후의 단편과 비교하는 이상적인 나노포어 이벤트 신호를 도시한다.
도 13은 전기 영동 이동성 변화 분석(electrophoretic mobility shift assay)(EMSA)을 통한 프로테아제 민감성 분자 구조물의 접합을 도시한다. 500 bp 이중 가닥 DNA 지지체(레인 1)는 MMP9 민감성인 절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자에 테더링(tethering)되고, 이는 페이로드 분자(레인 2, 상부 밴드)에 테더링된다. 추가 페이로드 벌크(bulk)의 경우, 상기 단백질 모노스트렙타비딘이 상기 복합체의 페이로드 부분에 결합된다(레인 3, 상부 밴드).
도 14는 프로테아제 MMP9와 함께 배양하기 이전 및 이후의 상기 프로테아제 민감성 구조물의 전기 영동 이동성을 비교하는 겔을 도시한다. 500 bp DNA 지지체가 상기 MMP9 절단 가능한 링커를 함유하는 융합 분자에 접합되며, 이는 페이로드에 테더링된다(레인 1 및 레인 3). MMP9와 함께 배양한 후, 상기 구조물은 전기 영동 이동성의 증가를 나타내며, 이는 DNA 밴딩의 하향 이동으로 나타난다. 이는 상기 절단 가능한 링커의 완전 분해를 의미한다(레인 2).
도 15는 SauI 동일전달제한효소(isoschizomer) Eco81I에 의한 분해 이전 및 이후의 엔도뉴클레아제 민감성 구조물의 단편을 도시한다. 페이로드에 공유 결합된 500 bp DNA 지지체 내의 부위에 대한 Eco81I의 분해로 인해 코딩된 서열 CC/T(N)AGG(상기 500 bp DNA의 융합 분자 부분에 포함됨)에서 완전한 가수 분해가 일어난다. 가수 분해로 인해 두 개의 단편, 즉 306bp 지지체 및 페이로드에 테더링된 194bp DNA를 포함하는 융합 분자:페이로드(레인 3)가 생성된다.
도 16은 인간 소변의 적정(titration)에서 MMP9 민감성 구조물의 절단을 입증한다. MMP9 민감성 구조물을 포함하며 페이로드와 결합된 융합 분자에 테더링된 300bp 지지체(레인 5)를 0 내지 30 % 범위에서 소변 농도를 증가시키면서 MMP9와 함께 배양하였다. 손상되지 않은 DNA 지지체:융합 분자:페이로드를 나타내는 상위 밴드에 변화가 없는 것으로부터 알 수 있듯이 용액 내 소변이 15%를 초과할 때 상기 효소가 완전히 저해되는 것이 명백한 반면(레인 3 및 레인 4), 최대 5% 소변까지는 효율적으로 절단되었다(레인 2).
도 17a 및 도 17b는 나노포어 장치를 사용한 단일 분자 감지를 도시한다. (a) 전압 V = 100 mV(1M LiCl)에서 27 nm 직경의 나노포어를 통과하는 3.2 kb dsDNA에 의해 야기된 대표적인 전류 시프트 이벤트. 이벤트는 컨덕턴스 시프트 깊이 (δG = δI/V) 및 지속 시간에 의해 정량된다. (b) 10분 동안 기록된 744건의 이벤트에 대한 δG 대비 지속 시간의 산점도.
도 18a 및 도 18b는 DNA 단독(500 bp), DNA-페이로드 및 DNA-페이로드-모노스트렙타비딘(DNA-페이로드-MS)에 대한 나노포어 이벤트 특성을 비교한 것이다. DNA-페이로드는 DNA 단독에 비해 δG > 1 nS인 이벤트의 갯수를 증가시킨다. 상기 DNA-페이로드에 MS를 첨가하면, (a) δG 대비 지속 시간의 산점도와 (b) ΔG > 1 nS인 이벤트의 비율에서 관찰되는 바와 같이 이벤트 신호의 깊이와 지속 기간을 더 증가시킬 수 있다.
도 19a, 도 19b 및 도 19c는 DNA 지지체 단독(300 bp), DNA:융합 분자:페이로드 및 MMP9 프로테아제 활성 이후의 DNA:융합 분자:페이로드에 대해 나노포어 이벤트를 비교한 것이며, 상기 융합 분자에는 MMP9 절단 가능한 링커가 포함되어 있다. 0.1 ms보다 긴 이벤트의 비율은 상기 MMP9 효소의 활성을 99% 신뢰 수준에서 검출할 수 있는 신호를 제공한다.
도 20a, 도 20b 및 도 20c는 DNA 단독(500 bp), 지지체:융합 분자:페이로드 및 Eco81I 엔도뉴클레아제와 배양한 이후의 지지체:융합 분자:페이로드에 대한 나노포어 이벤트를 비교하며, Eco81I에 대한 DNA 절단 가능한 링커가 상기 DNA의 융합 분자 부분에 포함되어 있다. 0.06 ms보다 긴 이벤트의 비율은 상기 Eco81I 효소의 활성을 99% 신뢰 수준에서 검출할 수 있는 신호를 제공한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 본 발명의 장치, 조성물, 시스템 및 방법의 다양한 실시형태가 참조된다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태는 다양한 예시적인 실시예를 제공하기 위한 것이며, 이는 대안적인 종류를 설명하는 것으로 해석되어서는 안된다. 오히려, 본 명세서에 제공된 다양한 실시형태의 설명은 그 범위가 중복될 수 있음을 유념해야 한다. 본 명세서에 기재된 실시형태는 단지 예시적인 것이며 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐, 다양한 출판물, 특허 및 공개된 특허 명세서가 인용에 의해 참조된다. 이들 출판물, 특허 및 공개된 특허 명세서의 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "포함하는(comprising)"은 상기 시스템, 장치 및 방법이 기재된 구성 요소 또는 단계를 포함하며, 다른 것들을 배제하지는 않음을 의미한다. "본질적으로 구성된(consisting essentially of)"이 시스템, 장치 및 방법을 정의하기 위해 사용되는 경우, 이는 해당 조합에 본질적으로 중요한 다른 구성 요소나 단계를 배제함을 의미한다. "구성된(consisting of)"은 다른 구성 요소 또는 단계를 배제함을 의미한다. 이들 연결 어구 각각에 의해 정의된 실시형태들은 본 발명의 범위 내에 속한다.
범위를 포함하는 모든 수치적 한정, 예를 들어 거리, 크기, 온도, 시간, 전압 및 농도는 0.1의 증분만큼 (+) 또는 (-)로 변화되는 근사치이다. 항상 분명하게 진술되는 것은 아니지만, 모든 수치적 표기는 용어 "약"이 선행하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 항상 분명하게 진술되는 것은 아니지만, 본 명세서에서 기술된 구성요소들은 단지 예시일 뿐이며, 이들의 등가물이 업계에 공지되어 있다고 이해되어야 한다
본 명세서에서 사용된 "내부 공간을 분리하는 나노포어를 포함하는 장치(a device comprising a nanopore that separates an interior)"는 개구를 포함하는 포어를 구조 내에 갖는 장치로서, 그 구조가 내부 공간을 2개의 용적 또는 챔버로 분리하는 장치를 의미한다. 상기 장치는 또한 2개 이상의 나노포어를 가질 수 있으며 이때 모든 포어 쌍 사이에 하나의 공통 챔버를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "융합 분자(fusion molecule)"는 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 표적 상태(또는 조건)에 의한 효소적, 광분해적 또는 화학적 분해에 민감한 절단 가능한 링커를 포함하는 분자 또는 화합물을 의미한다. 상기 융합 분자는 또한 폴리머 지지체와 페이로드 분자에 결합한다. 상기 나노포어를 통한 이동시, 전류 신호는 상기 페이로드 분자가 상기 폴리머 지지체에 결합되어 있는지 여부를 측정한다. 이러한 방식으로, 상기 융합 분자 내의 상기 절단 가능한 링커의 절단이 검출 및/또는 정량될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "절단(cleavage)"은 화학적 결합을 파괴하여 분자 또는 화합물을 더 간단한 구조로 나누는 공정 또는 상태(또는 조건)를 의미한다. 본 명세서에 기술된 절단 가능한 링커와 접촉시, 분자(예를 들어, 효소) 또는 상태(또는 조건)(예를 들어, 광분해)의 세트는 상기 링커를 절단하여 절단된 링커를 생성할 수 있다. 본 명세서에서, 특정 절단(specific cleavage)은 상기 링커와 표적 효소 또는 상태(또는 조건) 사이의 공지된 관계로서, 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)는 상기 절단 가능한 링커를 절단하는 것으로 알려져 있는 관계를 의미한다. 따라서, 상기 링커의 절단이 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)의 존재를 유추하는 데 사용될 수 있는 경우, 상기 분자 또는 표적은 상기 링커를 특이적으로 절단한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "절단 가능한 링커(cleavable linker)"또는 "불안정성 링커(labile linker)"는 표적 분자 또는 상태(또는 조건)에 의한 효소적, 광분해적 또는 화학적 절단에 민감한 기질 링커를 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커는 디옥시리보핵산(DNA), 폴리펩타이드, 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 또는 탄소-탄소 결합일 수 있다. 일부 실시형태에서, 광분해 절단에 민감한 절단 가능한 링커는 오르토-니트로벤질 유도체 또는 페나실 에스테르 유도체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 화학적 절단에 민감한 절단 가능한 링커는 아조 화합물, 이황화 결합, 술폰, 에틸렌 글리콜 디숙신산염, 히드라존, 아세탈, 이민, 비닐 에테르, 인접 디올 또는 피콜리네이트 에스테르일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에서 사용된 용어 "절단 가능한 도메인(cleavable domain)"은 표적 분자 또는 상태(또는 조건)에 의한 효소적, 광분해적 또는 화학적 절단에 민감한 분자 도메인을 의미한다. 상기 절단 가능한 도메인이 상기 폴리머 지지체 또는 페이로드 분자와 동일한 유형의 분자의 성분인 경우, 상기 절단 가능한 도메인은 절단 가능한 링커와 호환적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 절단 가능한 도메인이 상기 폴리머 지지체 상에 존재하는 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는 폴리머 지지체 및 절단 가능한 링커(즉, 절단 가능한 도메인)를 포함하는 융합 분자를 포함하는 것으로 이해될 수 있으며, 상기 융합 분자와 상기 폴리머 지지체가 동일한 종류의 분자(예를 들어, dsDNA)라 하더라도 상기 융합 분자가 상기 폴리머 지지체에 결합될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "표적 분자(target molecule)"는 시료 내의 검출 대상인 관심 분자이고, 절단 가능한 링커 영역 또는 도메인을 절단(예를 들어, 효소적 절단을 통해)할 수 있는 분자(예를 들어, 가수 분해 효소 또는 리아제)를 의미한다. 상기 표적 분자는, 나노포어를 통해 이동하며 소정의 전류 임피던스 또는 전류 신호를 제공하는 폴리머 지지체에 결합된 융합 분자 내의 절단 가능한 링커의 절단을 통해 본 명세서에 기술된 방법에 의해 검출될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "표적 상태(또는 조건)(target condition)"는 10 nm 내지 550 nm의 파장 범위 내의 빛에 대한 노출을 통해 상기 절단 가능한 링커를 광분해로 변형시킬 수 있는 상태(또는 조건)를 의미한다. 다르게는, 상기 표적 상태(또는 조건)는 친핵성 또는 염기성 시약, 친전자성 또는 산성 시약, 환원 시약, 산화 시약 또는 유기 금속 화합물에 대한 노출을 통해 상기 절단 가능한 링커를 화학적으로 변형시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "지지체(scaffold)" 또는 "폴리머 지지체(polymer scaffold)"는 전압 인가시 나노포어를 통해 이동하는 음으로 또는 양으로 하전된 폴리머를 의미한다. 일부 실시형태에서, 폴리머 지지체는 절단 가능한 도메인 또는 절단 가능한 링커를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리머 지지체는 절단 가능한 링커를 포함하며 전압 인가시 포어를 통과하여 이동하는 융합 분자에 결합할 수 있거나 결합한다. 일부 양태에서, 상기 폴리머 지지체는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 펩타이드 핵산(PNA), DNA/RNA 혼성체 또는 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 지지체는 자연 발생 분자 또는 생물학적 분자가 아닌, 화학적으로 합성된 폴리머일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는, 상기 나노포어를 통한 이동 시의 신호 예측을 향상시킬 수 있고 ssDNA 또는 RNA에 존재하는 2차 구조를 감소시키는 dsDNA이다. 일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는 상기 지지체의 일 단부 또는 상기 지지체의 양 단부에 존재할 수 있는 융합 분자 결합 부위를 포함한다. 상기 지지체 및 융합 분자는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용 또는 금속 결합을 통해 연결될 수 있다. 대안적으로, 상기 절단 가능한 링커 성분이 상기 지지체에 직접 공유 테더링(direct covalent tethering)되어 상기 지지체와 상기 융합 분자를 연결할 수 있다. 대안적으로, 상기 융합 분자의 연결기 성분이 상기 절단 가능한 링커를 상기 지지체에 직접 공유 테더링을 통해 결합시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 융합 분자는 지지체-결합 도메인을 포함하며, 이는 DNA, RNA, PNA, 폴리펩타이드, 콜레스테롤/DNA 혼성체 또는 DNA/RNA 혼성체일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "페이로드(payload)"는 나노포어에서의 검출의 선택성 및/또는 감도를 향상시키기 위해 상기 융합 분자에 결합되는 분자 또는 화합물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 페이로드 분자는 덴드리머, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, DNA 앱타머, 형광 발색단, 단백질, 폴리펩타이드, 나노로드, 나노튜브, 풀러렌, PEG 분자, 리포솜 또는 콜레스테롤-DNA 혼성체일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커 및 상기 페이로드는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용, 또는 금속 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 연결된 것이다. 상기 페이로드는 상기 지지체:융합 분자에 크기를 부가하며, 상기 지지체:융합 분자:페이로드가 상기 나노포어를 통과할 때, 상기 절단 가능한 링커의 절단(예를 들어, 가수 분해 효소에 의한 상기 절단 가능한 링커의 절단) 이후 남은 지지체:융합 분자 및 융합 분자:페이로드 성분에 비해 현저하게 상이한 전류 신호를 가지므로, 상기 페이로드는 상기 절단 가능한 링커의 절단에 대한 검출을 향상시킨다.
본 명세서에서 사용된 용어 "결합 도메인(binding domain)"은 일정 분자의 존재시 그 분자에 특이적으로 결합하는 분자 도메인을 의미한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서는 폴리머 지지체에 특이적으로 결합하는 폴리머 지지체 결합 도메인 및 페이로드 분자에 특이적으로 결합하는 페이로드 분자 결합 도메인을 개시한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "연결기(connector)"는 공간적으로 서로 떨어져있는 2개의 분자를 연결하여 상기 연결기를 통해 결합되도록 하는 분자를 의미한다. 일부 실시형태에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이, 예를 들어 융합 분자와 폴리머 지지체 또는 페이로드 분자 사이의 연결기로서 작용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "나노포어(nanopore)"는 특정 크기의 폴리머를 통과시키기에 충분한 크기의 개구(홀 또는 채널(hole or channel))를 의미한다. 증폭기를 사용하면 전압이 인가되어 음으로 하전된 폴리머가 상기 나노포어를 통과하도록 유도하며, 상기 포어를 통과하는 전류를 통해 분자가 상기 포어를 통과하는지 여부를 검출한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "센서(sensor)"는 나노포어 장치로부터의 신호를 수집하는 장치를 의미한다. 많은 실시형태에서, 상기 센서는 포어 양측에 배치된 한 쌍의 전극을 포함하여, 분자 또는 다른 개체, 특히 폴리머 지지체가 상기 포어를 통해 이동할 때 상기 포어를 통과하는 이온 전류를 측정한다. 상기 전극 이외에, 상기 나노포어 장치에서 광 신호(optical signal)를 검출하기 위해 추가 센서, 예를 들어 광학 센서가 사용될 수 있다. 전류 차단, 전자 터널링 전류(electron tunneling current), 전하-유도 전계 효과(charge-induced field effect), 나노포어 통과 시간, 광 신호, 광 산란 및 플라즈몬 공명(plasmon resonance)과 같은 특성을 검출하기 위해 기타 센서가 사용될 수도 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전류 측정치(current measurement)"는 인가 전압에서의 시간에 따른 상기 나노포어를 통과하는 전류 흐름의 일련의 측정치들을 의미한다. 상기 전류는 이벤트를 정량하기 위한 측정치로 표시되며, 전압(컨덕턴스)에 의해 표준화된 전류 또한 이벤트를 정량하는 데 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "개방 채널(open channel)"은 전류가 분석 소프트웨어에 의해 정의된 임계값으로부터 벗어나지 않는 노이즈(noise) 범위 내의 나노포어 채널을 통과하는 전류의 기준선 레벨을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "이벤트(event)"는 전류 측정치가 상기 개방 채널 값으로부터 소정의 임계값만큼 벗어날 때부터 전류가 상기 개방 채널의 임계값 내로 복귀할 때까지의 전류 임피던스 측정치 세트를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전류 임피던스 신호(current impedance signature)"는 검출된 이벤트 내에서 식별된 전류 측정치 및/또는 패턴의 집합을 의미한다. 한 이벤트 내에 다수의 신호가 존재할 수 있어 분자 유형 간의 식별력을 높일 수 있다.
효소 활성 검출
본 명세서는 변형된 절단 가능한 링커를 사용하여 효소 활성을 검출하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 효소 활성의 존재를 검출하기 위해 고안된 분자는 지지체, 페이로드 및 분해되기 쉬운 링커를 포함하는 융합 분자를 포함한다. 이 지지체:융합 분자(링커):페이로드 분자를 나노포어 시스템에서 사용하여, 시료 내의 효소 활성의 존재를 검출할 수 있다. 특히, 도 2는 상기 분자(도 1)를 나노포어와 함께 사용하여 효소 활성의 존재를 검출하는 방법을 보여주는 개념적 예를 제공한다. 도 2에서, 상기 절단 가능한 링커는 프로테아제의 기질인 폴리펩타이드 서열이다. 프로테아제가 상기 시료에 존재하지 않는다면, 상기 지지체/융합 분자(링커)/페이로드 분자는 손상되지 않은 상태로 유지되고 전압 인가 하에 상기 나노포어를 통한 이동시 길고 깊은 신호를 생성할 것이다. 그러나, 관심 프로테아제가 상기 시료 내에 존재하고 활성인 경우, 상기 절단 가능한 링커 폴리펩타이드 서열을 분해하여 분리된 페이로드 및 지지체 분자를 생성할 것이며, 이들 각각은 전압 인가 하에서 상기 나노포어를 통과할 때 고유한 전류 차단 신호를 생성할 것이다. 인가된 전압 및 기타 조건(염 농도, pH, 온도, 나노포어의 기하학적 구조, 나노포어 재료 등)을 변화시킴으로써 전류 차단 및 분해능을 조절할 수 있다. 또한 상기 나노포어와 접촉하는 용액 중의 상기 표적 분자의 농도를 조절함으로써 효소 활성의 분해능을 조절할 수 있다.
절단 가능한 링커는 다양한 형태로 존재할 수 있다. 나노포어 활성 분석에 특이성을 부여하는 것은 기질에 대한 표적 효소의 특이성이다. 즉, 상기 시료로부터의 배경 분자는 상기 절단 가능한 링커를 인지할 수 있을 만큼 변형시키거나 절단하지 않을 것이지만, 상기 표적 분자 또는 상태(또는 조건)는 나노포어 측정치가 상기 절단 및/또는 변형을 분석하고 검출할 수 있는 정도까지 상기 기질을 절단 및/또는 변형시키는 높은 친화성을 갖는다.
본 명세서에 기술된 페이로드 분자는 상기 절단 가능한 링커 분자의 변형(예를 들어, 절단)이 상기 나노포어 내에서 검출되도록 도와주는 임의의 분자일 수 있다. 이는 예를 들어, 덴드리머, DNA 앱타머, 형광 발색단, 단백질 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 폴리머를 포함할 수 있다.
상기 지지체:융합 분자:페이로드 구조물의 상기 융합 분자 성분 내의 상기 절단 가능한 링커는 관심 표적 효소의 활성의 기질인 임의의 기질을 포함 할 수 있다. 이는 예를 들어, 폴리펩타이드 서열, 뉴클레오티드 서열, 또는 임의의 다른 효소 기질을 포함할 수 있다. 이 링커는 또한 환경 조건(예를 들어, pH, UV 및/또는 빛)에 의해 절단되기 쉽다.
또 다른 실시형태에서, 특히 상기 절단 가능한 링커가 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 경우, 상기 지지체:융합 분자:페이로드는 지지체 구조물만으로 축소될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 상기 지지체는 이중 가닥 DNA를 포함한다. 이는 예를 들어, 도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이 엔도뉴클레아제 활성의 검출에 의해 세균 오염을 검출하는 것과 관련이 있다. DNA 지지체 내의 DNA 서열을 포함하는 엔도뉴클레아제 표적은 상기 나노포어와 접촉하는 용액 내에 포함되어 제공된다. 상기 엔도뉴클레아제가 존재하지 않는 경우, 각 표적 분자가 이동하는 동안 긴 전류 신호가 생성된다. 상기 관심 엔도뉴클레아제를 포함하는 시료를 첨가하면, 상기 표적 분자가 분해되어, 상기 분해된 DNA 단편이 전압 인가와 함께 상기 나노포어를 통해 이동할 때 짧은 전류 신호가 발생되고, 전장 표적 서열보다 전류 신호 지속 기간이 감소한다. 엔도뉴클레아제 활성을 검출하기 위해 선형(도 3) 또는 원형(도 4) 지지체 분자가 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 지지체 구조물은 엔도뉴클레아제 활성에 의한 세균 오염의 다중 검출을 수행하는 데 사용될 수 있다. 도 5는 이러한 방법의 일례를 도시한다. 이 예에서, 상기 절단 가능한 도메인-포함 지지체는 하나 이상의 관심 표적 엔도뉴클레아제에 의한 분해를 위한 다수의 고유한 절단 가능한 도메인을 포함한다. 이어서, 생성된 단편이 상기 나노포어 시스템에 의해 용액 중에서 검출된다. 전압 인가 하에서의 상기 분해된 단편의 이동은 적당한 크기의 포어를 통과하는 고유한 전류 신호를 제공하여 어느 부위가 분해되었는지를 검출할 수 있고, 따라서 관심 시료에 엔도뉴클레아제가 존재하는지 여부를 검출할 수 있다.
다른 실시형태에서, 도 1 내지 도 2에 도시된 바와 같은 상기 지지체:융합 분자:페이로드 구조물 또한 엔도뉴클레아제 활성을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이 경우, 융합 분자는 상기 표적 DNA 서열을 포함하고, 나노포어에서의 분해 검출을 촉진시키는 페이로드에 부착된다.
멀티플렉싱(multiplexing)은 다양한 방법으로, 예를 들어, 하나 초과의 융합 분자:페이로드를 각 지지체 분자에 부착시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 구조물을 사용하여, 단일 포어 장치는 적절하게 설계된 지지체 및 융합 분자:페이로드(들)로 다수의 표적 분자(예를 들어, 효소) 또는 표적 상태(또는 조건)의 활성을 검출할 수 있다. 다르게는, 2-포어 장치에 상기 지지체를 탑재하여(PCT 공개 번호 WO/2013/012881, 이 문헌의 전체 내용이 인용에 의해 본 명세서에 포함됨) 다수의 표적 분자(예를 들어, 효소) 또는 표적 상태(또는 조건)의 활성을 분석할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 표적 분자 또는 표적 상태(또는 조건)의 "활성 상태"는 상기 융합 분자 내의 상기 절단 가능한 링커가 온전한지(완전한 지지체:융합 분자:페이로드 복합체임) 아니면 손상되었는지(지지체 분자가 페이로드 분자에 결합되어 있지 않음) 여부를 의미한다. 본질적으로, 상기 활성 상태는 이 두 가지 상태 중 하나일 수 있다.
표적 분자 또는 표적 상태(또는 조건)의 활성 상태 검출은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 일 양태에서, 각 상태에서의 분자의 크기가 다르기 때문에, 상기 지지체:융합 분자:페이로드 복합체가 상기 포어를 통과할 때의 전류 신호는 지지체 단독 또는 페이로드 단독으로 상기 포어를 통과할 때와 충분히 구별될 것이다. 일 양태에서, 양의 전압이 인가되고 실험 완충액 내의 KCl 농도가 0.4M 초과이거나 LiCl 농도가 0.2M 초과이면, 전류 신호 측정치(도 2)는 하향하며 따라서 감쇠한다. 도 2의 세 가지 신호는 전류 시프트의 양(깊이) 및/또는 전류 시프트의 지속 시간(폭) 또는 상기 세 가지 이벤트 유형을 구별하는 상기 신호의 임의의 다른 특징에 의해 서로 구별될 수 있다.
다른 양태에서, 양의 전압이 인가되고 실험 완충액 내의 KCl 농도가 0.4M 미만이면, 측정된 전류 신호는 지지체 또는 DNA로 구성된 상기 복합체의 임의의 성분에 대한 전류 증강을 나타낼 수 있다. 이와 같은 결과는 Smeets, Ralph MM 등에 의해 발표된 연구 "Salt dependence of ion transport and DNA translocation through solid-state nanopores." Nano Letters 6.1 (2006): 89-95.에서 DNA 단독에 대해 입증되었다. 이 경우, 상기 세 가지 신호 유형은 일반적으로 전류 시프트(높이) 및/또는 전류 시프트의 지속 시간(폭)의 양이 다를 뿐 아니라, 상기 세 가지 신호 유형은 개방 채널 기준선 전류 레벨(open channel baseline current level)(408)에 대한 이벤트 진폭 방향(극성) 또는 상기 세 가지 이벤트 유형을 구별하는 상기 신호의 임의의 다른 특징에 의해 구별될 수 있다.
도 2의 실시형태의 양태에서, 상기 센서는, 전력원에 연결되고 전류를 검출 할 수 있는 전극을 포함한다. 따라서, 상기 전극 중 하나 또는 모두는 "센서"로서 작용한다. 이 실시형태에서, 상기 포어를 가로지르며 동시에 전압을 공급하고 상기 포어를 통과하는 전류를 측정하기 위해 전압-클램프(voltage-clamp) 또는 패치-클램프(patch-clamp)가 사용된다.
일부 양태에서, 검출을 돕기 위해 페이로드가 상기 복합물에 추가된다. 일 양태에서, 상기 페이로드는 검출을 용이하게 하기 위해 음 또는 양의 전하를 포함한다. 다른 양태에서, 상기 페이로드는 검출을 용이하게 하기 위해 크기를 추가한다. 다른 양태에서, 상기 페이로드는 예를 들어, 나노포어 이동 부위에 초점이 맞춰진 광학 센서로 검출될 수 있는 검출 가능한 표지(label), 예를 들어 형광 물질을 포함한다.
폴리머 지지체
본 발명에서 사용되기에 적합한 폴리머 지지체는 나노포어 장치에 탑재될 수 있고 상기 포어의 일 단부에서 다른 단부로 통과할 수 있는 지지체이다.
폴리머 지지체의 비제한적 예로는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 또는 펩타이드 핵산(PNA)과 같은 핵산, 덴드리머 및 선형화된 단백질 또는 펩타이드를 들 수 있다. 일부 양태에서, 상기 DNA 또는 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥이거나, DNA/RNA 혼성체 분자일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 이중 가닥 DNA가 폴리머 지지체로서 사용된다. 폴리머 지지체로 dsDNA를 사용하는 경우, ssDNA에 비해 몇 가지 장점을 갖는다. 일반적으로, ssDNA에서는 비특이적인 상호 작용과 예측 불가능한 2차 구조 형성이 자주 발생하기 때문에, 나노포어 장치에서 재현 가능한 전류 신호를 생성하는 데에는 dsDNA가 더 적합하다. 또한, ssDNA의 탄성 반응은 dsDNA보다 더 복잡하며, dsDNA에 비해 ssDNA의 특성은 덜 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 많은 실시형태는 폴리머 지지체로 dsDNA를 포함하면서, 본 명세서에서 사용되는 페이로드 분자 및/또는 융합 분자 중 하나 이상을 포함하도록 설계된다.
일 양태에서, 상기 폴리머 지지체는 합성되거나 또는 화학적으로 변형된다. 화학적 변형은 상기 폴리머 지지체를 안정화시키고, 상기 폴리머 지지체에 전하를 가하여 이동성을 증가시키고, 직선성을 유지하거나, 결합 특이성을 추가 또는 변형하거나, 융합 분자 및/또는 페이로드가 테더링될 수 있는 화학 반응 부위를 추가하는 데 도움이 될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 화학적 변형은 아세틸화, 메틸화, 서몰레이션(summolation), 산화, 인산화, 글리코실화, 티올화, 아지드 또는 알킨 또는 활성화된 알킨(DBCO-알킨)의 추가 또는 비오틴의 추가이다.
일부 양태에서, 상기 폴리머 지지체는 전기적으로 하전된다. DNA, RNA, PNA 및 단백질은 일반적으로 생리 상태(또는 조건) 하에서 하전된다. 이러한 폴리머 지지체는 보유 전하를 증가시키거나 감소시키도록 추가로 변형될 수 있다. 다른 폴리머 지지체는 전하를 도입하도록 변형될 수 있다. 상기 폴리머 지지체 상의 전하는 상기 폴리머 지지체가 나노포어 장치의 포어를 통과하도록 유도하는 데 유용할 수 있다. 예를 들어, 하전된 폴리머 지지체는 상기 포어를 가로지르는 전압으로 인해 상기 포어를 가로질러 이동할 수 있다.
일부 양태에서, 전하가 상기 폴리머 지지체에 도입되는 경우, 상기 전하는 상기 폴리머 지지체의 단부에 첨가될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 전하는 상기 폴리머 지지체 위에 균일하게 퍼져 있다.
지지체:융합 분자:페이로드의 구축
바람직한 실시형태에서, 상기 융합 분자는 1) 상기 절단 가능한 링커, 2) 상기 지지체 부착 부위 및 3) 페이로드 부착 부위를 함유한다.
바람직한 실시형태에서, 도 6은 융합 분자:페이로드의 대표적인 예를 도시한다. 구체적으로, 도 6a는 왼쪽부터 오른쪽 순으로, 상기 지지체에 부착하기 위한 아지드 화학 손잡이; 연결기 PEG4; 가요성 Gly-Ser 모티프; MMP9-민감성 펩타이드 서열 SGKGPRQITA; 및 상기 페이로드에 부착하기 위한 가요성 Gly-Ser 모티프를 포함하는 융합 분자를 도시한다. 도 6a는 왼쪽부터 오른쪽 순으로, Cys-5kDa PEG 및 비오틴을 포함하는 페이로드를 도시한다. 활성 검출을 촉진시키기 위해 상기 페이로드에 벌크를 추가하는 옵션은 모노스트렙타비딘을 상기 비오틴 부위에 결합시킴으로써 가능해진다(도 6b). 상기 추가된 벌크로 인해, 효소 활성 이전의 지지체:융합 분자:페이로드와 효소 활성 이후의 지지체 단독 및 페이로드 단독 간의 신호 차이가 보다 명확해질 수 있다.
이 실시형태에서, 이 예의 상기 절단 가능한 링커 펩타이드 서열은 SGKGPRQITA이다. 이 펩타이드는 MMP9 활성에 대해 매우 민감한 것으로 확인된 바 있다(Kridel, Steven J., et al. "Substrate hydrolysis by matrix metalloproteinase-9. Journal of Biological Chemistry 276.23 (2001): 20572-20578).
이 실시형태에서, DNA 지지체로의 부착은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 이 예(도 6)에서, 디벤조시클로옥틴(DBCO) 변형 프라이머를 사용하여 상기 DNA를 생성하여, 모든 DNA 지지체 분자를 DBCO 화학기로 효과적으로 표지하여 구리가 존재하지 않는 "클릭" 화학 반응을 통해 상기 아지드-태그된(azide-tagged) 융합 분자에 접합하는 데 사용되도록 하여, 상기 완전한 지지체:융합 분자:페이로드 복합체(도 6c)를 생성한다.
대표적인 예(도 6)의 경우, MMP9를 함유하는 시료를 상기 지지체:융합 분자:페이로드 시약과 조합시킴으로써 MMP9 활성을 분석할 수 있으며, 활성이 완결되기에 충분한 기간 이후 및 활성을 허용하는 상태(또는 조건)에서(도 7), 상기 조합된 시약을 상기 나노포어로 측정할 수 있다(도 8). 활성은 상기 나노포어에 의해 제공되는 단일 분자 측정치에 의해 분석되며, 도 8에 도시된 바와 같이, 완전한 복합체는 깊고 긴 이벤트 신호를 생성하는 반면 생성물은 빠르고/빠르거나 얕은 이벤트 신호를 생성한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 도 9는 지지체:융합 분자:페이로드의 대표적인 예를 도시한다. 도 9A는 왼쪽에서 오른쪽 순으로 (1) DNA를 포함하는 지지체; (3) 엔도뉴클레아제에 의해 가수 분해되기 쉬운 DNA 서열 및 (2) 페이로드(미도시)로서의 아지드 함유 분자에 접합하기 위해 사용될 수 있는 디벤조시클로옥틴(DBC) 손잡이를 포함하는 융합 분자를 도시한다. 상기 가수 분해되기 쉬운 DNA 서열은 SauI 인식 서열이다. 도 9B는 도 9A의 분자에 결합된 페이로드를 도시하며, Cys-5kDa PEG 및 비오틴을 포함한다.
대표적인 예(도 9)에서, MMP9 활성은 Eco81I를 함유하는 시료를 상기 지지체:융합 분자:페이로드 시약과 조합함으로써 분석할 수 있으며, 활성이 완결되기에 충분한 기간 이후 및 활성을 허용하는 상태(또는 조건)에서(도 10), 상기 조합된 시약을 상기 나노포어로 측정할 수 있다(도 11). 상기 SauI 동일전달제한효소 Eco81I에 노출시, 상기 분자 구조물은 DNA 서열 CCT(N)AGG에서 가수 분해되어, 2개로 절단된다. 활성은 상기 나노포어에 의해 제공되는 단일 분자 측정치에 의해 분석되며, 도 11에 도시된 바와 같이, 완전한 복합체는 깊고 긴 이벤트 신호를 생성하는 반면 생성물은 빠르고/빠르거나 얕은 이벤트 신호를 생성한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 지지체:융합 분자:페이로드 구조물의 융합 분자는 효소 활성을 검출하고 정량하기 위한 2개 이상의 절단 가능한 링커를 포함한다. 대표적인 예(도 12)에서, 상기 융합 분자는 i) 엔도뉴클레아제 Eco81I에 의해 가수 분해되기 쉽고 상기 DNA 지지체에 인접한 DNA 서열 CCT(N)AGG 및 ii) MMP9-민감성 펩타이드 서열 SGKGPRQITA을 포함한다. 이러한 방법으로, 단일 시약을 사용하여 MMP-9 또는 Eco81I의 존재를 검출할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 상기 융합 분자의 상기 지지체 부착 부위는 그 자체가 지지체-결합 도메인인 핵산 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 융합 분자의 상기 지지체-결합 도메인은 단백질의 기능적 부분을 형성하는 펩타이드 서열이지만, 상기 결합 도메인이 단백질일 필요는 없다. 예를 들어, 핵산의 경우, 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer), 티민-티민 다이머, 및 특정 2차 구조, 예를 들어 구부러진 뉴클레오티드 및 단일 가닥이 파손된 서열과 같은 서열(모티프)을 특이적으로 인식하고 결합하는 단백질이 있다.
일부 양태에서, 상기 융합 분자의 상기 지지체-도메인은 인식 및 결합을 유발하거나 촉진시키는 화학적 변형을 포함한다. 예를 들어, 메틸화된 DNA 서열은 전사 인자, DNA 메틸 전이효소(DNA methyltransferases) 또는 메틸화 회복 효소(methylation repair enzymes)에 의해 인식될 수 있다. 다른 실시형태에서, 비오틴은 아비딘 패밀리 구성원(avidin family members) 내로 통합되고 이에 의해 인식될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 비오틴은 상기 융합 분자 결합 도메인을 형성하고, 아비딘 또는 아비딘 패밀리 구성원은 상기 융합 분자 상의 폴리머 지지체-결합 도메인이다. 결합 상보성으로 인하여, 융합 분자 결합 도메인 및 폴리머 지지체 도메인이 뒤바뀌어 상기 융합 분자 결합 도메인이 상기 폴리머 지지체 결합 도메인이 될 수 있으며, 그 반대의 경우도 가능하다.
뉴클레오티드 결합 모티프(nucleotide binding motifs)를 특이적으로 인식할 수 있는 분자, 특히 단백질은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix), 징크 핑거, 류신 지퍼(leucine zipper), 윙드 헬릭스(winged helix), 윙드 헬릭스 턴 헬릭스 (winged helix turn helix ), 헬릭스-루프-헬릭스(helix-loop-helix) 및 HMG-박스(HMG-box)와 같은 단백질 도메인이 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있는 것으로 알려져 있다.
일부 양태에서, 상기 융합 분자 결합 도메인은 잠금 핵산(LNA), 가교 핵산(bridged nucleic acid, BNA), 모든 유형의 단백질 핵산(예를 들어, bisPNA, 감마-PNA), 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nucleases(TALENs), 주기적으로 간격을 두고 분포하는 짧은 회문 구조 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeats; CRISPRs), 또는 앱타머(예를 들어, DNA, RNA, 단백질 또는 이들의 조합)일 수 있다.
일부 양태에서, 상기 융합 분자 결합 도메인은 DNA 결합 단백질(예를 들어, 징크 핑거 단백질), 항체 단편(Fab), 화학적으로 합성된 바인더(예를 들어, PNA, LNA, TALENS, 또는 CRISPR), 또는 상기 합성 폴리머 지지체 내의 화학적 변형(즉, 반응성 부분)(예를 들어, 티올레이트, 비오틴, 아민, 카르복실레이트) 중 하나 이상이다.
일부 실시형태에서, 상기 폴리머 지지체는 효소 활성의 다중 검출에 사용되는 융합 분자-결합 도메인의 서열을 포함하며, 각 도메인은 관심 표적 효소에 대해 고유한 절단 가능한 링커를 포함하는 고유한 융합 분자:페이로드를 갖는다.
표적 분자 및 상태(또는 조건)
시료에 존재하는 효소 활성은 독소, 이상 또는 생물체의 기타 질환의 존재를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 인체에서 발견되는 프로테아제는 상처 치유, 세포 신호 전달 및 세포 사멸을 포함한 다양한 정상적인 인체 생리적 과정을 조절하는 매우 중요한 분자이다. 인체 내에서 중요한 역할을 하기 때문에 프로테아제의 비정상적인 활성은 많은 질병 상태와 관련이 있으며, 여기에는, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 류마티스 관절염, 알츠하이머병, 심혈관 질환 및 다양한 악성 종양이 포함된다. 프로테아제는 거의 모든 인체 액체 및 조직에서 발견되며, 이의 활성 수준으로부터 질환의 존재를 알 수 있다.
본 발명의 분석의 가치는, 예를 들어 가수 분해 또는 다른 수단에 의해 화학 결합을 파괴함으로써 관련된 특정한 절단 가능한 링커를 절단하는 임의의 활성 효소(프로테아제 포함)의 존재를 검출하는 단일-분자 방법을 제공한다는 점이다.
절단 가능한 링커 영역을 효소로 변형시킬 수 있는 표적 분자는 가수 분해 효소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 가수 분해 효소는 프로테아제, 엔도뉴클레아제, 글리코실라제, 에스테라아제, 뉴클레아제, 포스포디에스테라아제, 리파아제, 포스파타아제, 또는 임의의 다른 가수 분해 효소의 아강(subclass)일 수 있다.
다른 실시형태에서, 절단 가능한 링커 영역을 효소로 변형시킬 수 있는 표적 분자는 리아제일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 리아제는 다음과 같은 7가지의 아강, 즉, 데카르복실라아제(효소 번호(EC) 4.1.1), 알데히드 리아제(EC 4.1.2), 옥소산 리아제(EC 4.1.3) 및 기타(EC 4.1.99)와 같은 탄소-탄소 결합을 절단하는 리아제; 디히드라타아제(EC 4.2)와 같은 탄소-산소 결합을 절단하는 리아제; 탄소-질소 결합을 절단하는 리아제(EC 4.3); 탄소-황 결합을 절단하는 리아제(EC 4.4); 탄소-할로겐화물 결합을 절단하는 리아제(EC 4.5); 아데닐레이트 시클라제 및 구아닐레이트 시클라제(EC 4.6)와 같은 인-산소 결합을 절단하는 리아제; 및 페로켈라타제(ferrochelatase)(EC 4.99)와 같은 기타 리아제 중 하나일 수 있다.
다른 실시형태에서, 상기 지지체:융합 분자:페이로드 구조물 내의 상기 융합 분자의 상기 절단 가능한 링커 영역은 검출 대상인 표적 상태(또는 조건)에 노출된다. 일 실시형태에서, 상기 표적 상태(또는 조건)는 10 nm 내지 550 nm 파장 범위 내의 빛에 대한 노출을 통해 상기 절단 가능한 링커를 광분해로 변형시킬 수 있다.
절단 가능한 링커 내의 결합의 절단을 촉진하는 광노출 상태(또는 조건)는 다수의 상이한 건강 상의 위험, 건강 문제 또는 질병-유발 또는 질병-촉진 상태와 상관될 수 있는 환경 상태(또는 조건)을 나타낼 수 있다.
태양으로부터의 자외선(UV)은 다양한 인체 상태(또는 조건)와 강력하게 상관되는 것으로 알려져 있으며, 성층권에서의 지속적인 오존 고갈은 지구 표면에 도달하는 자외선의 레벨을 증가시키는 것으로 여겨지고 있다.
자외선은 인간의 수명에 걸쳐 누적되며, 치명적인 형태의 피부암인 흑색종의 주요 요인인 것으로 밝혀졌다. 또한, 자외선은 인간의 눈에 중대한 영향을 미치며, 중요한 백내장 위험 요인일 뿐만 아니라 망막 열화를 증가시키는 것으로 밝혀진 바 있다.
다른 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커를 화학적으로 변형시킬 수 있는 상기 표적 상태(또는 조건)는 친핵성 또는 염기성 시약, 친전자성 또는 산성 시약, 환원 시약, 산화 시약 또는 유기 금속 화합물에 대한 노출을 통한 것이다.
절단 가능한 링커를 화학적으로 변형시킬 수 있는 표적 상태(또는 조건)의 검출은 독성, 지하수 오염 또는 생물학적 위험 또는 생체독소에서의 변화를 검출하는 검출 과정을 포함한 많은 용도를 갖는다.
일 실시형태에서, 상기 절단 가능한 링커를 화학적으로 변형시킬 수 있는 상기 표적 상태(또는 조건)는 산성 pH이다. 국부적인 산성 상태(또는 조건)가 종양, 허혈 및 염증과 같은 다양한 질병 상태와 상관 관계가 있다는 점은 널리 알려져 있다. 보다 구체적으로, 종양 조직에서, 세포외 산성 pH는 빠르게 분열하는 종양 세포로부터의 혐기성 당분해의 결과이며, 종양 미세 환경의 주요 특징이다.
나노포어 장치
본 명세서에 제공된 나노포어 장치는 상기 장치의 내부 공간을 두 개의 용적으로 분리하는 구조에 개구를 형성하는 하나 이상의 포어 및 상기 포어를 통과하는 대상을 식별하도록(예를 들어, 대상을 나타내는 매개 변수의 변화를 검출함으로써) 설정된 하나 이상의 센서를 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법에 사용되는 나노포어 장치는 PCT 공보 WO/2013/012881에도 개시되어 있으며, 이 출원의 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
상기 나노포어 장치의 포어(들)은 나노 규모 또는 마이크로 규모를 갖는다. 일 양태에서, 각 포어는 소분자, 대분자 또는 미생물이 통과할 수 있는 크기를 갖는다. 일 양태에서, 각 포어는 직경이 약 1 nm 이상이다. 대안적으로, 각 포어는 직경이 약 2nm 이상, 3nm 이상, 4nm 이상, 5nm 이상, 6nm 이상, 7nm 이상, 8nm 이상, 9nm 이상, 10nm 이상, 11nm 이상, 12nm 이상, 13nm 이상, 14nm 이상, 15nm 이상, 16 nm 이상, 17 nm 이상, 18 nm 이상, 19 nm 이상, 20 nm 이상, 25 nm 이상, 30 nm 이상, 35 nm 이상, 40 nm 이상, 45 nm 이상, 50 nm 이상, 60 nm 이상, 70 nm 이상, 80 nm 이상, 90 nm 또는 100 nm 이상이다.
일 양태에서, 상기 포어는 직경이 약 100 nm 이하이다. 대안적으로, 상기 포어는 직경이 약 95nm 이하, 90nm 이하, 85nm 이하, 80nm 이하, 75nm 이하, 70nm 이하, 65nm 이하, 60nm 이하, 55nm 이하, 50nm 이하, 45nm 이하, 40nm 이하, 35nm 이하, 30nm 이하, 25nm 이하, 20nm 이하, 15nm 이하 또는 10nm 이하이다.
일 양태에서, 상기 포어는 직경이 약 1 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 2 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 4 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm이다.
일부 양태에서, 상기 나노포어 장치는 상기 포어를 가로질러 폴리머 지지체를 이동시키는 수단 및/또는 상기 포어를 통과하는 대상을 식별하는 수단을 추가로 포함한다. 이하, 이에 대한 자세한 설명을 2-포어 장치의 맥락에서 제공한다.
단일-포어 나노포어 장치에 비해, 2-포어 장치는 상기 포어를 가로지르는 상기 폴리머 지지체의 운동 속도 및 방향을 양호하게 제어하도록 보다 용이하게 설정될 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 나노포어 장치는 복수의 챔버를 포함하며, 각각의 챔버는 하나 이상의 포어를 통해 인접한 챔버와 소통한다. 이들 포어 중, 2개의 포어, 즉 제 1 포어 및 제 2 포어는 폴리머 지지체의 적어도 일부가 상기 제 1 포어로부터 상기 제 2 포어로 이동하도록 배치된다. 또한, 상기 장치는 상기 이동시 상기 폴리머 지지체를 식별할 수 있는 센서를 각 포어에 포함한다. 일 양태에서, 상기 식별은 상기 폴리머 지지체의 개별 성분을 식별하는 것을 수반한다. 또 다른 양태에서, 상기 식별은 상기 폴리머 지지체에 결합된 융합 분자:페이로드 분자를 식별하는 것을 수반한다. 단일 센서 사용시, 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정하기 위해, 상기 단일 센서는 상기 포어 양단에 배치된 2개의 전극을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 상기 단일 센서는 전극 이외의 구성 요소를 포함한다.
일 양태에서, 상기 장치는 2개의 포어를 통해 연결된 3개의 챔버를 포함한다. 4개 이상의 챔버를 갖는 장치는 3-챔버 장치의 일 측면 상에 또는 상기 3개의 챔버 중 임의의 2개 사이에 하나 이상의 추가적인 챔버를 포함하도록 용이하게 설계될 수 있다. 마찬가지로, 상기 챔버를 연결하기 위해 상기 장치 내에 3개 이상의 포어가 포함될 수 있다.
일 양태에서, 복수의 폴리머 지지체가 한 챔버에서 다음 챔버로 동시에 이동할 수 있도록 하기 위해, 2개의 인접한 챔버 사이에 2개 이상의 포어가 존재할 수 있다. 이러한 다중 포어 설계로 인해 상기 장치에서의 효소 활성 분석 처리량이 향상될 수 있다. 다중 검출(multiplexing)을 위해, 한 챔버가 한 표적 유형에 대한 절단 가능한 링커를 갖고, 다른 챔버는 다른 표적 유형에 대한 상이한 절단 가능한 링커를 가질 수 있으며, 시료는 나노포어 감지 이전에 모든 챔버에 노출된다.
일부 양태에서, 상기 장치는 폴리머 지지체를 한 챔버에서 다른 챔버로 이동시키는 수단을 추가로 포함한다. 일 양태에서, 상기 이동으로 인해, 상기 폴리머 지지체가 상기 제 1 포어 및 상기 제 2 포어 둘 다를 동시에 가로지르면서 탑재되게 된다. 또 다른 양태에서, 상기 수단으로 인해, 상기 폴리머 지지체가 동일한 방향으로 두 포어 모두를 통과하여 이동할 수 있다.
예를 들어, 3-챔버 2-포어 장치("2-포어"장치)에서, 상기 챔버 각각은 전원 공급 장치에 연결하기 위한 전극을 포함할 수 있어서 상기 챔버 사이의 포어 각각을 가로질러 별도의 전압이 인가될 수 있다.
일 실시형태에 따르면, 본 발명은 상부 챔버, 중간 챔버 및 하부 챔버를 포함하는 장치를 제공하며, 상기 상부 챔버는 제 1 포어를 통해 상기 중간 챔버와 소통하고, 상기 중간 챔버는 제 2 포어를 통해 상기 하부 챔버와 소통한다. 이러한 장치는 이전에 "이중-포어 장치(Dual-Pore Device)"라는 명칭의 미국 특허 출원 공보 제 2013-0233709호에 개시된 크기 또는 기타 특성 중 임의의 것을 가질 수 있으며, 이 출원의 전체 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일 양태에서, 각 포어는 직경이 약 1 nm 이상이다. 대안적으로, 각각의 포어는 약 2nm 이상, 3nm 이상, 4nm 이상, 5nm 이상, 6nm 이상, 7nm 이상, 8nm 이상, 9nm 이상, 10nm 이상, 11nm 이상, 12nm 이상, 13nm 이상, 14nm 이상, 15nm 이상, 16 nm 이상, 17 nm 이상, 18 nm 이상, 19 nm 이상, 20 nm 이상, 25 nm 이상, 30 nm 이상, 35 nm 이상, 40 nm 이상, 45 nm 이상, 50 nm 이상, 60 nm 이상, 70 nm 이상, 80 nm 이상, 90 nm 이상 또는 100 nm 이상이다.
일 양태에서, 각 포어는 직경이 약 100 nm 이하이다. 대안적으로, 상기 포어는 직경이 약 95nm 이하, 90nm 이하, 85nm 이하, 80nm 이하, 75nm 이하, 70nm 이하, 65nm 이하, 60nm 이하, 55nm 이하, 50nm 이하, 45nm 이하, 40nm 이하, 35nm 이하, 30nm 이하, 25nm 이하, 20nm 이하, 15nm 이하 또는 10nm 이하이다.
일 양태에서, 상기 포어는 직경이 약 1 nm 내지 약 100 nm, 또는 약 2 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 4 nm 내지 약 60nm, 또는 약 5nm 내지 약 50nm, 또는 약 10nm 내지 약 40nm, 또는 약 15nm 내지 약 30nm이다.
일부 양태에서, 상기 포어는 실질적으로 둥근 형상을 갖는다. 본 명세서에서 사용된 "실질적으로 둥근(substantially round)"은 약 80% 또는 90% 이상 원통형인 형상을 의미한다. 일부 실시형태에서, 상기 포어는 정사각형, 직사각형, 삼각형, 타원형 또는 육각형 형상이다.
일 양태에서, 상기 포어는 깊이가 약 1 nm 내지 약 10,000 nm, 또는 약 2 nm 내지 약 9,000 nm, 또는 약 3 nm 내지 약 8,000 nm 등이다.
일부 양태에서, 상기 나노포어는 멤브레인을 통해 연장된다. 예를 들어, 상기 포어는 지질 이중막에 삽입된 단백질 채널일 수 있다. 또는 상기 포어는 이산화규소, 질화규소, 그래핀(graphene)과 같은 고체 상태의 기질 또는 이들 재료의 조합 또는 다른 재료와의 조합으로 형성된 층을 통과하여 상기 포어를 드릴링(drilling), 에칭(etching) 또는 다른 방법으로 형성함으로써 제작될 수 있다. 나노포어는 상기 지지체:융합 분자:페이로드 또는 촉매 활성 이후의 이 분자의 생성물이 상기 포어를 통과할 수 있도록 크기가 부여된다. 다른 실시형태에서, 상기 포어의 일시적인 차단이 분자 유형 식별에 바람직할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 나노포어의 길이 또는 깊이는 두 개의 별도의 용적을 연결하는 채널을 형성할 정도로 충분히 크다. 이러한 일부 양태에서, 각각의 포어는 깊이가 100 nm 초과, 200 nm 초과, 300 nm 초과, 400 nm 초과, 500 nm 초과, 600 nm 초과, 700 nm 초과, 800 nm 초과 또는 900 nm 초과이다. 일부 양태에서, 각 포어는 깊이가 2000 nm 이하 또는 1000 nm 이하이다.
일 양태에서, 상기 포어는 약 10 nm 내지 약 1000 nm의 거리로 이격되어 있다. 일부 양태에서, 상기 포어들 사이의 거리는 1000 nm 초과, 2000 nm 초과, 3000 nm 초과, 4000 nm 초과, 5000 nm 초과, 6000 nm 초과, 7000 nm 초과, 8000 nm 초과 또는 9000 nm 초과이다. 일부 양태에서, 상기 포어는 30000 nm 이하, 20000 nm 이하 또는 10000nm 이하의 거리로 이격되어 있다. 일 양태에서, 상기 거리는 약 10 nm 이상, 또는 대안적으로 약 20 nm 이상, 30 nm 이상, 40 nm 이상, 50 nm 이상, 60 nm 이상, 70 nm 이상, 80 nm 이상, 90 nm 이상, 100 nm 이상, 150 nm 이상, 200 nm 이상, 250 nm 이상 또는 300 nm 이상이다. 다른 양태에서, 상기 거리는 약 1000 nm 이하, 900 nm 이하, 800 nm 이하, 700 nm 이하, 600 nm 이하, 500 nm 이하, 400 nm 이하, 300 nm 이하, 250 nm 이하, 200 nm 이하, 150 nm 이하 또는 100 nm 이하이다.
또 다른 양태에서, 상기 포어 간의 거리는 약 20 nm 내지 약 800 nm, 약 30 nm 내지 약 700 nm, 약 40 nm 내지 약 500 nm 또는 약 50 nm 내지 약 300 nm이다 .
상기 2개의 포어는, 상기 챔버들 간의 유체 소통이 허용되고 소정의 크기 및 거리를 갖는 한 임의의 위치에 배치될 수 있다. 일 양태에서, 상기 포어는 포어들 사이에 직접적인 막힘이 없도록 배치된다. 일 양태에서, 상기 포어는 실질적으로 동축이다(coaxial).
일 양태에서, 상기 장치는 하나 이상의 전원 공급 장치에 연결된 전극을 상기 챔버 내에 갖는다. 일부 양태에서, 상기 전원 공급 장치는 전압-클램프 또는 패치-클램프를 포함하며, 이들은 각 포어를 가로질러 전압을 공급하고 각 포어를 통과하는 전류를 독립적으로 측정할 수 있다. 이러한 관점에서, 상기 전원 공급 장치 및 상기 전극 구성은 상기 중간 챔버를 두 전원 공급 장치에 대한 공통 접지로 설정할 수 있다. 일 양태에서, 상기 전원 공급 장치 또는 장치들은 상기 상부 챔버(챔버 A) 및 상기 중간 챔버(챔버 B) 사이에 제 1 전압(V1)을 인가하고 상기 중간 챔버 및 상기 하부 챔버(챔버 C) 사이에 제 2 전압(V2)을 인가하도록 설정된다.
일부 양태에서, 상기 제 1 전압(V1) 및 상기 제 2 전압(V2)은 독립적으로 조절 가능하다. 일 양태에서, 상기 중간 챔버는 상기 두 전압에 대하여 접지가 되도록 조절된다. 일 양태에서, 상기 중간 챔버는 상기 중간 챔버 내의 전극과 각각의 포어 사이에 컨덕턴스를 제공하기 위한 매질을 포함한다. 일 양태에서, 상기 중간 챔버는 상기 중간 챔버 내의 전극과 각각의 포어 사이에 저항을 제공하기 위한 매질을 포함한다. 나노포어 저항에 비해 이러한 저항을 충분히 작게 유지하는 것은 상기 포어를 가로지르는 상기 두 전압 및 전류를 분리시키는데 유용하며, 이는 상기 전압을 독립적으로 조절하는 데 도움이 된다.
상기 전압의 조절은 상기 챔버 내에서의 하전된 입자의 이동을 제어하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 두 전압이 동일한 극성으로 설정된 경우, 적절하게 하전된 입자는 상기 상부 챔버로부터 상기 중간 챔버로, 그리고 하부 챔버로, 또는 반대로, 순차적으로 이동될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 두 전압이 반대 극성으로 설정된 경우, 하전된 입자는 상기 상부 또는 하부 챔버로부터 상기 중간 챔버로 이동되어 거기에 머무를 수 있다.
상기 장치에서의 상기 전압의 조절은 두 포어를 동시에 가로지를 정도로 충분히 큰 대분자, 예를 들어 하전된 폴리머 지지체의 이동을 제어하는데 특히 유용할 수 있다. 이러한 양태에서, 상기 분자의 이동 방향 및 속도는 아래에 기술된 바와 같이 전압의 상대적인 크기 및 극성에 의해 제어될 수 있다.
상기 장치는 액체 시료, 특히 생물학적 시료를 수용하는데 적합한 물질 및/또는 나노 제조에 적합한 물질을 함유할 수 있다. 일 양태에서, 이러한 물질에는 유전체 물질, 예를 들어 규소, 질화규소, 이산화규소, 그래핀, 탄소 나노튜브, TiO2, HfO2, Al2O3 또는 기타 금속층, 또는 이들 물질들의 임의의 조합이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일부 양태에서, 예를 들어, 약 0.3 nm 두께의 그래핀 멤브레인의 단일 시트가 상기 포어-함유 멤브레인으로 사용될 수 있다.
미세 유체 장치이며 2-포어 미세 유체 칩 구현물(two-pore microfluidic chip implementations)을 수용하는 장치를 다양한 수단 및 방법에 의해 제작할 수 있다. 두 개의 평행한 멤브레인으로 구성된 미세 유체 칩과 관련하여, 단일 빔으로 두 멤브레인을 동시에 뚫어 두 개의 동심 포어를 형성할 수 있지만, 임의의 적합한 정렬 기술과 함께 상기 멤브레인의 각 측면 상에 상이한 빔을 사용할 수도 있다. 일반적으로, 상기 하우징(housing)은 챔버 A 내지 챔버 C의 밀봉된 분리를 보장한다.
일 양태에서, 상기 장치는 스페이서(spacer)로 연결된 두 개의 평행한 멤브레인으로 구성된 미세 유체 칩("이중-포어 칩"으로 분류됨)을 포함한다. 각 멤브레인은 멤브레인의 중앙을 통과하여 단일 빔으로 뚫린 포어를 함유한다. 또한, 상기 장치는 바람직하게는 상기 칩을 위한 테프론®(Teflon®) 하우징 또는 폴리카보네이트 하우징을 갖는다. 상기 하우징은 챔버 A 내지 챔버 C의 밀봉된 분리를 보장하며, 상기 전극에 대한 최소 접근 저항을 제공하여 각 전압이 주로 각각의 포어를 가로질러 인가되도록 한다.
보다 구체적으로, 상기 포어-함유 멤브레인은 5-100 nm 두께의 규소, 질화규소, 또는 이산화규소 창을 갖는 투과 전자 현미경(TEM) 격자를 이용하여 제조될 수 있다. 상기 멤브레인들을 분리하는데 스페이서가 사용될 수 있으며, 여기에는 절연체, 예를 들어 SU-8, 포토레지스트, PECVD 산화물, ALD 산화물, ALD 알루미나, 또는 증발된 금속 물질, 예를 들어 Ag, Au, 또는 Pt가 사용되며, 이는 상기 멤브레인들 사이의 챔버 B에서, 상기 멤브레인이 없으면 수성일 부분 내에 작은 용적을 차지한다. 홀더는 챔버 B의 가장 큰 용적 분획으로 구성된 수성 배스(aqueous bath) 내에 배치된다. 챔버 A 및 챔버 C는 멤브레인 밀봉 부분으로 이어지는 보다 큰 직경의 채널(낮은 접근 저항을 위한 것임)에 의해 접근 가능하다.
집속 전자 또는 이온 빔을 사용하여 상기 멤브레인을 통과하여 포어를 뚫고 이들을 자연스럽게 정렬할 수 있다. 또한, 상기 포어는 각 층에 집중된 정확한 빔을 적용함으로써 더 작은 크기로 만들(축소할) 수 있다. 단일 나노포어 드릴링 방법을 사용하여, 정해진 방법 및 상기 멤브레인의 두께에 대해 가능한 드릴 깊이를 고려하여 상기 두 개의 멤브레인에 한 쌍의 포어를 뚫을 수도 있다. 소정의 깊이로 마이크로포어를 미리 뚫은 다음 멤브레인의 나머지 부분에 나노포어를 뚫어서 멤브레인 두께를 추가로 개선할 수도 있다.
상기 장치의 포어에 존재하는 전압으로 의해, 하전된 분자가 챔버 사이의 포어를 통과하여 이동될 수 있다. 상기 이동의 속도 및 방향은 상기 전압의 크기 및 극성에 의해 제어될 수 있다. 또한, 두 전압 각각이 독립적으로 조절될 수 있기 때문에, 하전된 분자의 이동 방향 및 속도가 각 챔버에서 정교하게 제어될 수 있다.
일 실시예는 두 개의 포어의 깊이와 상기 두 개의 포어 간의 거리의 합을 포함하는 조합된 거리보다 긴 길이를 갖는 하전된 폴리머 지지체, 예를 들어 DNA에 관한 것이다. 예를 들어, 1000 bp dsDNA는 길이가 약 340 nm이고, 이는 깊이가 10 nm이고 20 nm만큼 이격되어 있는 두 개의 포어에 걸진 길이인 40 nm보다 훨씬 더 길 것이다. 제 1 단계에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 상부 또는 하부 챔버로 탑재된다. 약 7.4 pH의 생리 상태(또는 조건) 하에서의 음전하로 인해, 상기 폴리뉴클레오티드는 전압이 인가되는 포어를 가로질러 이동할 수 있다. 따라서, 제 2 단계에서는, 동일한 극성 및 동일하거나 유사한 크기의 두 개의 전압을 포어에 인가하여, 두 포어를 가로질러 상기 폴리뉴클레오티드를 순차적으로 이동시킨다.
상기 폴리뉴클레오티드가 상기 제 2 포어에 도달할 때쯤, 상기 전압 중 하나 또는 모두를 변화시킬 수 있다. 상기 두 포어 간의 거리가 상기 폴리뉴클레오티드의 길이보다 더 짧도록 선택되기 때문에, 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 제 2 포어에 도달할 때, 이는 또한 제 1 포어 내에도 존재한다. 따라서, 상기 제 1 포어에서의 전압의 극성을 신속히 변화시키면, 상기 폴리뉴클레오티드를 상기 제 2 포어로부터 끌어당기는 힘이 발생될 것이다.
상기 두 포어가 동일한 전압-힘 영향 하에 있고 |V1| = |V2| + δV이라고 가정할 때, |V1| (또는 V2) 방향으로 조율 가능한 이동을 하기 위해 δV값 > 0 (또는 < 0)을 조절할 수 있다. 실제로, 각 포어에서의 전압-유도된(voltage-induced) 힘은 V1 = V2와 동일하지는 않지만, 보정 실험을 수행하여 정해진 2-포어 칩에 대하여 동일한 당김력(pulling forces)을 초래할 적절한 바이어스 전압을 확인할 수 있으며; 그런 다음, 이 바이어스 전압 주변에서의 변화를 이용하여 방향을 제어할 수 있다.
여기에서, 상기 제 1 포어에서의 전압-유도된 힘의 크기가 상기 제 2 포어에서의 전압-유도된 힘의 크기보다 작으면, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 제 2 포어를 향해, 하지만 더 낮은 속도로, 두 포어를 가로질러 계속 이동할 것이다. 이러한 점에서, 상기 폴리뉴클레오티드의 이동 속도 및 방향은 두 전압의 극성 및 크기에 의해 제어될 수 있다는 점이 쉽게 인식된다. 아래에 추가로 기술되는 바와 같이, 이러한 정교한 이동 제어는 광범위하게 응용 가능하다. 효소 활성의 정량에 있어 2-포어 장치 구현물의 유용성은, 제어된 전달 및 감지 동안 상기 절단 가능한 링커의 변형 및 절단이 반복적으로 측정될 수 있어 검출 결과에 신뢰 수준을 부가한다는 것이다. 또한, 상기 지지체를 따라 별개의 부위에 두 개 이상의 융합 분자:페이로드를 추가할 수 있어서 한 번에 두 개 이상의 효소의 활성을 검출할 수 있다(멀티플렉싱).
따라서, 일 양태에서, 본 명세서는 나노포어 장치를 통과하는 하전된 폴리머 지지체의 이동을 제어하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 실시형태 중 어느 하나의 장치의 상기 상부 챔버, 중간 챔버 또는 하부 챔버 중 하나에 하전된 폴리머 지지체를 포함하는 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 장치는 상기 상부 챔버 및 상기 중간 챔버 사이에 제 1 전압을 공급하고 상기 중간 챔버 및 상기 하부 챔버 사이에서 제 2 전압을 제공하기 위한 하나 이상의 전원 공급 장치에 연결되는 단계; 상기 폴리머 지지체가 상기 챔버 사이를 이동하도록 초기 제 1 전압 및 초기 제 2 전압을 설정하여, 상기 제 1 및 제 2 포어 둘 다를 가로지르도록 상기 폴리머 지지체를 배치시키는 단계; 및 상기 제 1 전압 및 상기 제 2 전압을 조절하여 두 전압이 상기 중간 챔버로부터 상기 하전된 폴리머 지지체를 끌어당기는 힘을 생성하도록 하는 단계(전압-경쟁 방식)로서, 상기 두 전압은 제어된 상태(또는 조건) 하에서 크기가 상이하여 상기 하전된 폴리머 지지체가 두 포어를 가로질러 어느 방향으로든 제어된 방식으로 이동하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 상기 하전된 폴리머 지지체를 함유하는 상기 시료가 상기 상부 챔버에 탑재되고 상기 초기 제 1 전압은 상기 하전된 폴리머 지지체를 상기 상부 챔버로부터 상기 중간 챔버로 끌어당기도록 설정되고 상기 초기 제 2 전압은 상기 폴리머 지지체를 상기 중간 챔버로부터 상기 하부 챔버로 끌어당기도록 설정된다. 마찬가지로, 상기 시료는 초기에 상기 하부 챔버에 탑재될 수 있고, 상기 하전된 폴리머 지지체는 상기 중간 및 상부 챔버로 끌어당겨질 수 있다.
또 다른 양태에서, 상기 하전된 폴리머 지지체를 함유하는 상기 시료는 상기 중간 챔버에 탑재되고; 상기 초기 제 1 전압은 상기 하전된 폴리머 지지체를 상기 중간 챔버로부터 상기 상부 챔버로 끌어당기도록 설정되고; 상기 초기 제 2 전압은 상기 하전된 폴리머 지지체를 상기 중간 챔버로부터 상기 하부 챔버로 끌어당기도록 설정된다.
일 양태에서, 단계 (c)에서의 상기 제 1 전압 및 상기 제 2 전압에 대한 실시간 또는 온라인 조절이 최고 수백 메가헤르츠의 클록 속도(clock rate)에서 전용 하드웨어 및 소프트웨어를 사용하여 능동 제어 또는 피드백 제어에 의해 수행된다. 상기 제 1 전압, 제 2 전압, 또는 두 전압 모두에 대한 자동화된 제어는 제 1 전압, 제 2 전압, 또는 두 전압 모두에 대한 이온 전류 측정치 피드백에 기초한다.
센서
상술한 바와 같이, 다양한 양태에서, 상기 나노포어 장치는 상기 표적 분자(예를 들어, 효소)의 활성 상태 검출을 수행하기 위한 하나 이상의 센서를 추가로 포함한다.
상기 장치에 사용되는 센서는 상기 표적 분자 또는 표적 상태(또는 조건)에 의한 상기 절단 가능한 링커의 절단을 식별하는 데 적합한 임의의 센서일 수 있다. 예를 들어, 센서는 상기 폴리머와 관련된 전류, 전압, pH 값, 광학적 특징 또는 체류 시간을 측정함으로써 상기 폴리머(예를 들어, 폴리머 지지체)를 식별하도록 설정될 수 있다. 다른 양태에서, 상기 센서는 상기 폴리머의 하나 이상의 개별 성분 또는 상기 폴리머에 결합되거나 부착된 하나 이상의 성분을 식별하도록 설정될 수 있다. 상기 센서는 측정 가능한 매개 변수의 변화를 검출하도록 설정된 임의의 구성 요소로 형성될 수 있으며, 여기에서 상기 변화는 상기 폴리머, 상기 폴리머의 성분, 또는 바람직하게는 상기 폴리머에 결합되거나 부착된 성분을 나타낸다. 일 양태에서, 상기 센서는 분자 또는 기타 개체, 특히 폴리머 지지체가 포어를 통해 이동할 때 상기 포어를 가로지르는 이온 전류를 측정하기 위해, 상기 포어의 양 측면에 배치된 전극 쌍을 포함한다. 특정 양태에서, 상기 포어를 통과하는 폴리머 지지체 부분이 융합 분자:페이로드 분자에 결합하는 경우, 상기 포어를 가로지르는 이온 전류는 측정 가능하게 변화한다. 이러한 전류의 변화는, 예를 들어 상기 융합 분자:페이로드 분자의 존재, 부재 및/또는 크기에 따라 예측 가능하고 측정 가능한 방식으로 변화할 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 상기 센서는, 전압을 인가하고 상기 나노포어를 가로지르는 전류를 측정하는데 사용되는 전극을 포함한다. 상기 나노포어를 통과하는 분자의 이동은 옴의 법칙 V = IZ에 따라 상기 나노포어를 통과하는 전류에 영향을 주는 전기 임피던스(Z)를 제공하며, 여기에서 V는 인가된 전압, I는 상기 나노포어를 통과하는 전류이고, Z는 임피던스이다. 반대로, 나노포어 이벤트를 신호하고 정량하기 위해 컨덕턴스 G = 1/Z가 관찰된다. 분자가 전기장 내에서(예를 들어, 전압 인가 하에서) 나노포어를 통해 이동할 때의 결과는 전류 신호의 추가 분석시 상기 나노포어를 통과하는 분자와 상관될 수 있는 전류 신호이다.
상기 전류 신호로부터의 체류 시간 측정치가 사용되는 경우, 상기 구성 요소의 크기는 상기 감지 장치를 통과하는데 걸리는 시간의 길이에 기초하여 상기 특정 구성 요소와 상관될 수 있다.
일 실시형태에서, 상기 폴리머, 상기 폴리머의 성분(또는 단위), 또는 상기 폴리머에 결합되거나 부착된 성분의 광학적 특성을 측정하는 센서가 상기 나노포어 장치에 제공된다. 이러한 측정의 일례에는 특정 단위에 고유한 흡수 밴드를 적외선(또는 자외선) 분광법으로 식별하는 것이 포함된다.
일부 실시형태에서, 상기 센서는 전기 센서이다. 일부 실시형태에서, 상기 센서는 형광성 신호를 검출한다. 이 신호를 검출하기 위해 상기 포어의 출구에 배치된 방사선원(radiation source)이 사용될 수 있다.
배경으로부터의 식별
일부 양태에서, 상기 시료 내에 존재하는 상기 표적 분자는 방대한 배경 분자 집단을 포함하는 원시(original)(심지어 여과된) 천연 유체(혈액, 타액, 소변 등)일 수 있다. 이러한 배경 분자는 양의 전압 인가로 충분히 음으로 하전될 때 상기 나노포어를 통과한다. 일부 경우에서는, 이러한 나노포어 이벤트가 상기 지지체:융합 분자:페이로드 구조물 또는 상기 절단 가능한 링커의 절단 이후의 생성물(지지체, 페이로드)처럼 보일 수 있다. 따라서, 이러한 배경 분자는 거짓 양성(false positives)를 생성할 수 있어 검출 오류율을 높일 수 있다. 시료 준비 단계를 충분히 추가하여 큰 분자를 제거하면 도움이 되지만 거짓 양성 이벤트를 유발하는 배경 분자가 여전히 존재한다.
배경 분자와 지지체 분자(상기 융합 분자:페이로드가 부착되거나 부착되지 않음)를 식별하기 위해, 지지체 표지 방법(scaffold-labeling scheme)이 사용될 수 있다. 지지체 표지 방법은 미국 가출원 제 61/993,985호에 개시되어 있으며, 이 출원의 내용은 인용에 의해 본 명세서에 포함된다.
구체적으로, 표지(label) 또는 표지 서열이 상기 폴리머 지지체에 결합되어, 나노포어를 통해 이동한 폴리머 지지체의 존재 및/또는 아이덴티티(identity)를 확인하는데 사용될 수 있는 고유한 전류 신호를 제공한다. 동일한 이벤트 신호 내에서 상기 융합 분자:페이로드의 존재 여부는 상기 절단 가능한 링커가 해당 분자 상에서 변형되었는지 여부를 나타낸다.
또 다른 실시형태에서, 상기 지지체 단독의 길이만으로도 배경과 충분하게 구별되는 차별적인 신호를 제공하며, 지지체:융합 분자:페이로드 및 지지체 단독(상기 절단 가능한 링커의 절단 후) 간의 판별력 또한 유지한다.
검출의 통계적 유의성 부여
일부 실시형태에서는, 시간에 따라 기록된 센서 측정치 세트를 종합하고 수학적 도구를 적용하여, 이전 절에서 상세히 설명한 바와 같은 시료에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 수준의 검출에 신뢰 수준 수치를 부여한다.
나노포어 이벤트 집단 특성의 차이에 기초하여 배경(즉, 다른 분자 유형)으로부터 분자 유형을 구별하는 정량 방법이 최근 개발되었다 (Morin, T.J., et al., "Nanopore-based target sequence detection," submitted to PloS One, Dec. 31, 2015). 이러한 구별 방법은 다양한 유형의 다른 배경 분자의 존재 하에서 특정 분자 유형이 검출될 수 있고, 검출의 통계적 중요성이 부여될 수 있음을 의미한다(예를 들어, 99% 신뢰 수준에서 시약 X 검출). 상기 방법을 후술되는 실시예에 적용하기 위해, 먼저 상기 방법을 아래에 요약한다.
보편적으로, 상기 포어 위의 챔버 내에는 두 가지 범주의 분자가 존재한다. 유형 1은 모든 배경 분자이고, 유형 2는 관심 분자이다. 아래의 실시예 3에서는, 예를 들어 DNA-페이로드를 유형 2 분자로 간주하고, DNA 단독을 배경(유형 1)으로 간주할 수 있다. 실험 데이터를 기반으로, 유형 2 이벤트의 상당 부분에 존재하고 유형 1 이벤트에는 상대적으로 작은 부분에 존재하는 이벤트 신호 기준을 확인한다. 일정 이벤트에 대해 상기 신호 기준이 충족되면, 해당 이벤트는 유형 2로 "태그(tagged)"된다. 신호는 δG, 지속 시간, 각 이벤트 내의 레벨의 갯수 및 특성 및/또는 이벤트 신호로부터 계산된 임의의 기타 수치 또는 수치의 조합에 의해 결정될 수 있다. 포집 이벤트가 유형 2일 확률을 p로 정의한다. 유형 2 분자가 존재하지 않는 대조군 실험에서 p = 0이며, 유형 2 분자가 존재하는 실험에서 p > 0이나 그 값은 알 수 없다. 거짓 양성 확률은 q1 = Pr(태그된 이벤트 | 유형 1 이벤트)로 정의한다. 유형 2 분자가 존재하지 않는 대조군 실험 또는 실험 세트에서, q1은 많은 포집 이벤트로부터 우수한 정확도로 측정된다. 유형 2 분자가 벌크 용액에 존재하는지 여부를 측정하기 위한 검출 실험에서, 포집 이벤트가 태그될 확률은 p의 함수이며, 다음과 같이 근사될 수 있다:
Q(p) = (태그된 이벤트의 개수) / N
상기 공식에서, N은 총 이벤트 수이다. 99% 신뢰 구간 Q(p) ± Qsd(p)는 Qsd(p)=2.57*sqrt{Q(p)*(1-Q(p))/N}로 계산될 수 있으며, 여기에서 sqrt{ }는 제곱근 함수이다. 실험 과정에서 Q(p) 값은 수렴하며 불확도 범위는 이벤트 갯수 N이 증가함에 따라 감소한다. 기록 시간의 함수로서의 Q(p) ± Qsd(p)의 플롯은 각 시약 유형별로 변화한다(실시예 3에 관한 도 19b). 유형 2 분자가 존재하지 않는 대조군 실험에서, Q(0) = q1이다. 유형 2 분자가 일정 확률 p* > 0로 존재하는 것으로 알려진 대조군 실험에서, 계산된 Q(p*) 값은 유형 2 분자가 존재하는지 여부를 측정하기 위한 검출 실험에서 아래에 정의된 바와 같이 사용될 수 있다.
검출 실험에서, 다음 기준이 참일 때 99% 신뢰 수준에서 유형 2 분자가 존재한다:
Q(p) - Qsd(p) > q1 (1)
상기 기준이 참이면, p > 0으로 간주한다. 상기 기준이 참이 아니면, p > 0이라고 말할 수 없다. 검출 실험에서 다음 기준이 참일 때, 99% 신뢰 수준에서, 유형 2 분자가 존재하지 않는다:
Q(p) + Qsd(p) < Q(p*) (2)
상기 기준이 참일 때, p = 0으로 결론 내린다; 그렇지 않으면 결론내릴 수 없다. 아래에 기재된 실시예에서는 상기 프레임워크가 사용된다.
목표 분자의 농도 추정
일부 실시형태에서, 시간에 따라 기록된 센서 측정치 세트를 종합하고 수학적 도구를 적용하여 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 목표 분자 또는 상태(또는 조건)의 농도를 추정한다.
일부 실시형태에서, 상기 지지체, 융합 분자, 페이로드 및/또는 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태(또는 조건) 중의 하나 이상의 농도를 변화시키면서 상기 공정(시료를 지지체:융합 분자:페이로드 시약과 배양하고 나노포어 실험을 수행함)을 반복할 수 있다. 그런 다음 상기 데이터 세트를 결합하여 더 많은 정보를 수집할 수 있다. 일 실시형태에서, 활성 효소의 총 농도는 상기 종합된 데이터 세트에 수학적 도구를 적용함으로써 추정된다.
문헌(Wang, Hongyun, et al., "Measuring and Modeling the Kinetics of Individual DNA-DNA Polymerase Complexes on a Nanopore." ACS Nano 7, no. 5 (May 28, 2013): 3876-86. doi:10.1021/nn401180j; Benner, Seico, et al., "Sequence-Specific Detection of Individual DNA Polymerase Complexes in Real Time Using a Nanopore." Nature Nanotechnology 2, no. 11 (October 28, 2007): 718-24 (doi:10.1038/nnano.2007.344)에 기재된 방법에 따라 생물 물리학적 모델을 나노포어 데이터에 적용하여 표적 효소와 그의 기질(예를 들어, 절단 가능한 링커 또는 절단 가능한 도메인) 간의 결합, 결합 파괴 및 이후의 해리 동역학을 정량할 수 있다.
본 명세서의 분석에서, 상기 나노포어는 벌크 상(bulk-phase)으로부터 개별 분자를 조사하고 측정한다. 표적 분자의 존재시, 상기 지지체:융합 분자:페이로드 내의 상기 절단 가능한 링커는 상기 표적의 농도에 비례하는 소정의 속도로 변형(예를 들어, 절단)될 것이다. 상기 지지체:융합 분자:페이로드 농도에 비해 높은 표적 농도에서는 빠르게 절단이 진행되며, 상기 절단 가능한 링커는 모두 절단되어 지지체, 페이로드 분자 및 임의의 기타 배경 분자만이 검출될 것이다. 상기 지지체:융합 분자:페이로드의 농도에 비해 낮은 농도에서는 절단이 천천히 진행될 것이며, 기록 시간 10분 이내에 지지체 이벤트의 대부분이 상기 포어를 통과하는 손상되지 않은 지지체:융합 분자:페이로드를 나타낼 것이다. 상기 지지체:융합 분자:페이로드의 농도에 비해 중간 농도에서는, 0이 아닌(non-zero) 지지체 이벤트 비율이 손상되지 않은 지지체:융합 분자:페이로드로 표시되며, 이 비율은 시간이 지나 반응이 완료되어 감에 따라 감소할 것이다.
총 활성 효소 농도를 추정하기 위해, 나노포어와 상이한 농도(낮게는 1 pM부터 높게는 100 nM)의 지지체:융합 분자:페이로드 시약을 사용하여 반복적인 실험을 수행할 수 있다. 공통 시료의 일부를 사용함으로써 표적 분자 농도를 보존한다. 손상되지 않은 지지체:융합 분자:페이로드로 플래그된(flagged) 지지체 이벤트의 비율의 시간에 따른 변화를 측정함으로써, 인용된 연구에서와 유사한 모델링 프레임워크를 사용하여 총 효소 농도를 정량할 수 있다. 구체적으로, 시간-의존적 측정치는 총 효소 농도를 분명히 추정할 수 있는 모델과 함께 Wang, Hongyun, et al., "Measuring and Modeling the Kinetics of Individual DNA-DNA Polymerase Complexes on a Nanopore." ACS Nano 7, no. 5 (May 28, 2013): 3876-86. doi:10.1021/nn401180j에서 사용된 바 있다.
총 활성 효소 농도를 추정하기 위해, 다중-나노포어 어레이가 구현될 수 있다. 각 나노포어는 상이한 농도(낮게는 1 pM부터 높게는 100 nM)의 지지체:융합 분자:페이로드 시약을 측정한다. 손상되지 않은 지지체:융합 분자:페이로드로 플래그된 지지체 이벤트의 비율의 시간에 따른 변화를 측정함으로써, 인용된 연구에서와 유사한 모델링 프레임워크를 사용하여 총 효소 농도를 정량할 수 있다.
실시예
하기 실시예 및 실험을 참조하여 본 발명을 추가로 정의한다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 많은 변형이 실시될 수 있다는 점은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예 1: DNA 지지체의 나노포어 검출
고체 상태 나노포어는 두 개의 수성 용적을 분리하는 얇은 고체 상태 멤브레인에 형성된 나노 규모 개구이다. 전압-클램프 증폭기는 상기 개방된 포어를 통과하는 이온 전류를 측정하면서 상기 멤브레인에 전압 V를 인가한다. 다른 단일 분자 센서와 달리, 상기 나노포어 장치는 매우 저렴한 비용으로 휴대용 형태 인자에 포장될 수 있다. 이중 가닥 DNA(dsDNA)와 같은 단일 하전 분자가 전기 영동에 의해 상기 포어를 통해 포집되고 구동될 때, 전류 시프트 측정치, 컨덕턴스 시프트 깊이(δG = δI/V) 및 지속 시간이 상기 이벤트를 특징짓는 데 사용된다(도 17a).
실험 도중의 많은 이벤트를 기록한 후, 상기 이벤트의 분포를 분석하여 대응하는 분자를 특징짓는다. 도 17b는 전압 V = 100 mV(1M LiCl)에서 27 nm 직경의 나노포어를 통과하는 3.2 kb dsDNA의 이벤트 특성을 도시한다. 두 개의 원으로 표시된 대표적인 이벤트는, DNA가 펼쳐진 상태로 통과할 때 더 넓고 얕은 이벤트가 생성되고, DNA가 접힌 상태로 통과할 때 더 빠르지만 더 깊은 이벤트가 생성됨을 나타낸다. ~1kb 이하의 dsDNA는 펼쳐진 상태로만 상기 포어를 통과한다.
실시예 2: 프로테아제에 대한 절단 가능한 링커 및 엔도뉴클레아제에 대한 절단 가능한 링커를 함유하는 지지체:융합 분자:페이로드
본 명세서의 분석을 실험적으로 증명하기 위해, 도 12에 도시된 바와 같이, 단일 융합 분자 내에 2개의 별개의 절단 가능한 링커를 포함하는 단일 구조물을 설계하고 구축하였다. 이러한 단일 구조물을 이용하여, 엔도뉴클레아제의 활성 검출 및 별도로 프로테아제의 활성 검출을 입증하고자 하였다.
디벤조시클로옥틴(DBCO) 변형된 프라이머를 사용하여 DNA 지지체를 생성하여, 상기 분자를 DBCO 화학기로 효과적으로 표지하여, 구리가 존재하지 않는 "클릭" 화학 반응을 통한 접합에 사용되도록 하였다(도 6). 상기 PCR 주형은 엔도뉴클레아제 민감성 서열인 CC/T(N)AGG(/는 절단 부위를 나타내고, N은 임의의 DNA 핵염기 C, G, T 또는 A를 나타냄)을 포함하였다. 엔도뉴클레아제 활성 분석에서, 상기 융합 분자의 일부는 상기 표적 DNA 서열을 포함한다(도 12a). 이후, 이러한 변형된 DNA 지지체를 1000배 초과량의, 펩타이드 서열SGKGPRQITA을 함유하는 아지드-태그된 분자와 함께 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다(0.01M 인산 나트륨 + 300mM NaCl, pH 7.4). 이 펩타이드는 이전에 파지 디스플레이 라이브러리로부터 분리되었으며 MMP9 활성에 매우 민감한 것으로 밝혀진 바 있다(Kridel, Steven J., et al. "Substrate hydrolysis by matrix metalloproteinase-9. Journal of Biological Chemistry 276.23 (2001): 20572-20578). 프로테아제 MMP9 활성 분석에서, 상기 융합 분자의 일부는 상기 표적 펩타이드 서열을 포함한다(도 12a). 상기 지지체:융합 분자:페이로드 분자는 N-말단에서 C-말단으로, DNA 지지체, DNA 융합 분자(상기 DNA 말단에 엔도뉴클레아제 서열 절단 가능한 링커를 포함함), 아지드 화학 손잡이, PEG4, 가요성 Gly-Ser 모티프, MMP9-민감성 펩타이드 서열 SGKGPRQITA, 가요성 Gly-Ser 모티프, Cys-5kDa PEG 및 비오틴을 포함한다(도 12a, 텍사스주 루이스빌에 소재한 Bio-Synthesis, Inc.사에 의해 합성됨).
DNA 특이적 염료인 Sybr Green 으로 염색된 EMSA 겔을 통해, 도 12a에 나타낸 바와 같이 상기 페이로드 분자의 성공적인 연결을 확인하였다(도 13, 레인 2, 상부 밴드). 상기 DNA 지지체를 상기 민감한 절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자:페이로드 분자에 접합시켜 ~50%의 원하는 생성물을 생성시켰다(도 13, 레인 2, 상부 밴드). 비접합 DNA로부터 순수한 접합 구조물을 정제하기 위해, 상기 생성물을 상기 폴리아크릴아미드 겔로부터 겔 추출하고 제조사의 지시에 따라 효소 활성 완충액에 재현탁시켰다(도 14의 레인 1 및 레인 3은 이 공정의 결과인 순수 DNA-페이로드를 나타낸다).
실시예 3: DNA, DNA- 페이로드 및 DNA- 페이로드 - 모노스트렙타비딘의 나노포어 검출 및 식별
15 nm 나노포어로 500 bp DNA 지지체 단독을 측정하였고(0.2 nM, 100 mV, 1M LiCl, 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0), 30분 동안 97건의 이벤트가 생성되었다(도 18a). 1 nS 이상의 깊이에 다다른 이벤트는 8.3%에 불과했다(도 18b). 상기 나노포어에 인접한 챔버로부터 상기 DNA를 제거한 후, 0.2 nM DNA-페이로드 시약을 첨가하였다. 여기에서 DNA-페이로드는 실시예 2 및 도 12에서 참조된 복합체를 의미한다. 상기 DNA-페이로드 시약은 30분 동안 190건의 이벤트를 생성하였고, 1 nS 이상의 깊이에 도달하는 이벤트는 21.1%로 증가했다(도 18b). 상기 DNA-페이로드 시약을 제거한 후 모노스트렙타비딘과 함께 배양된 0.2nM DNA-페이로드(도 13, 레인 3, 상부 밴드)를 나노포어 측정을 위해 상기 챔버에 첨가하였으며, 여기에서 모노스트렙타비딘은 상기 페이로드 말단의 자유 비오틴에 결합한다(도 6b에 도시된 바와 같음). 모노스트렙타비딘을 첨가함으로써 각 DNA-페이로드-모노스트렙타비딘 분자의 크기가 증가하여 18분 동안 기록된 414건의 이벤트의 대부분에서 이벤트 깊이와 지속 시간이 증가하였다(도 18a). 상기 집단은 1 nS 이상의 깊이에 도달하는 이벤트가 43.5%로 증가하였다(도 18b).
이벤트 집단에서의 시각적 시프트(도 18a)는 분자 크기의 증가와 일치하여, DNA에서 DNA-페이로드로, 그리고 DNA-페이로드-모노스트렙타비딘 순으로 증가한다. 다양한 유형의 배경 분자의 존재 하에 특정 분자 유형을 검출하기 위한 본 명세서의 정량 방법이 이러한 데이터에 적용될 수 있으므로 검출의 통계적 유의성이 부여될 수 있다.
DNA를 유형 1로 간주하고 DNA-페이로드를 유형 2로 간주하는 경우의 예시적인 기준은 δG > 1nS이면 해당 이벤트를 유형 2로 태그하는 것이다. DNA 단독 집단을 사용하여 q1 = 0.082(8.2 %)를 계산할 수 있다. 상기 DNA-페이로드 실험은 모의 검출 실험으로 사용될 수 있으며 상기 수학적 프레임워크의 방정식 (1)을 적용하여 유형 2 분자가 존재하는지 측정할 수 있다. 결과는 0.211 - 0.076 = 0.134 > 0.082이며, 이는 유형 2(DNA-페이로드) 분자가 존재한다고 99% 신뢰 수준에서 말할 수 있음을 의미한다.
다음으로, DNA 및 DNA-페이로드를 유형 1로 간주하고 DNA-페이로드-모노스트렙타비딘을 유형 2로 간주하며, 동일한 기준(δG > 1nS)을 사용하여 일정 이벤트를 유형 2로 태그할 수 있다. 상기 DNA 단독 및 DNA-페이로드 집단을 사용하여 q1 = 0.211(0.082와 0.211의 두 값 중 더 큰 값을 거짓 양성 확률로 사용함)을 확인할 수 있다. 이전 예에서와 같이, 상기 DNA-페이로드-모노스트렙타비딘 집단이 모의 검출 실험으로 사용될 수 있으며, 방정식 (1)을 적용하여 유형 2 분자를 시험한다. 결과는 0.435 - 0.063 = 0.372 > 0.211이며 이는 유형 2(DNA-페이로드-모노스트렙타비딘) 분자가 존재한다고 99% 신뢰 수준에서 말할 수 있음을 의미한다.
DNA-페이로드-모노스트렙타비딘을 관심 유형 2 분자로서 유지하면서, 상기 수학적 프레임워크의 방정식 (2)을 적용하는 모의 보완 시험(mock complementary test)을 수행할 수 있다. 특히, 상기 DNA-페이로드 데이터를, 벌키한(큰 덩어리의) DNA-페이로드-모노스트렙타비딘이 존재하는지 여부를 알려주는 "미지의" 시약으로 간주할 수 있다. 상기 기준(ΔG > 1 nS)을 사용하여 일정 이벤트를 유형 2로 태그한다. 상기 DNA-페이로드-모노스트렙타비딘 대조군 실험에서 Q(p*) = 0.435이다. 상기 "미지의"(DNA-페이로드) 데이터와 방정식 (2)을 적용했을 때, 결과는 0.211+0.076 = 0.287 < 0.435이며, 이는 유형 2 (DNA-페이로드-모노스트렙타비딘) 분자가 상기 "미지의" 모의 시약(모노스트렙타비딘이 없는 DNA-페이로드)에는 존재하지 않는다고 99% 신뢰 수준에서 말할 수 있음을 의미한다.
실시예 4: MMP9 민감성 분자 구조물의 분해 및 나노포어 검출
매트릭스 메탈로프로티나아제 9(MMP9)는 광범위한 인체 생리 과정에 관여하는 것으로 밝혀진 92kDa 세포외 기질 분해 효소(ECM)이다. ECM의 적시 분해는 조직 복구, 형태 발생 및 발달의 중요한 특징이다. MMP9는 정상적인 인체 생리 작용에서 중요한 역할을 하기 때문에 MMP9의 비정상적인 발현 및/또는 활성은 인간의 무수한 중증 질병과 관련되어 있으며, 여기에는, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, 심혈관 질환, 류마티스 관절염 및 다양한 악성 종양이 포함된다(Nagase, Hideaki, Robert Visse, and Gillian Murphy. "Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs." Cardiovascular research 69.3 (2006): 562-573). 이를 고려하여, MMP9 발현 및 단백질 분해 활성은 귀중한 임상 진단 바이오마커로 의학계에서 간주되어 왔다.
300bp 또는 500bp DNA 지지체:융합 분자:페이로드 구조물 내에서 그의 표적 기질 SGKGPRQITA를 절단하는 MMP9의 능력을 EMSA 겔을 통해 먼저 확인하였다. 완전한 효소 분해를 보장하기 위해, MMP9(39kDa, Enzo Life Sciences)의 활성 촉매 아단위(subunit)를 상기 페이로드 분자에 접합된 DNA 지지체와 함께 MMP9 활성 완충액(50mM Tris, 10mM CaCl2, 150mM NaCl, 0.05% Brij35, pH7.5) 내에서 프로테아제 대 기질 비율 1:10으로 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다(도 14, 레인 2). 이러한 MMP9와의 배양은 완전한 구조물(도 14, 레인 1 및 레인 3)와 비교하여 아크릴아미드 겔에서의 이동성이 보다 높은 분자를 생성하였는데, 이는 아마도 상기 표적 기재의 절단 부위로 알려진 글루타민과 이소류신 잔기 사이에서 상기 구조물이 완전히 효소 분해되었기 때문일 것이다(Kridel, Steven J., et al. "Substrate hydrolysis by matrix metalloproteinase-9. Journal of Biological Chemistry 276.23 (2001): 20572-20578). 비활성 MMP9를 동일한 구조물과 배양한 경우 상기 겔에서 시료간의 시프트가 관찰되지 않았으며(데이터 미도시), 이는 레인 2에 나타난 전기 영동 이동성의 변화가 오로지 관심 프로테아제인 MMP9의 단백질 분해 활성에 기인한다는 것을 나타낸다.
다음으로, 300 bp DNA:융합 분자:페이로드 구조체(DNA-페이로드로 지칭함) 내의 표적 기질 SGKGPRQITA를 절단하는 MMP9의 나노포어 검출 방법을 시험하였다. 먼저, 직경 15nm의 포어를 사용하여 0.4 nM의 300bp DNA 지지체 단독을 시험하였고(100mV, 1M LiCl), 이는 30분 동안 146건의 이벤트를 생성하였으며 이 중에서 지속 시간이 0.1 ms를 초과하는 건은 5.5%에 불과했다(도 19a, 도 19b). 이어서, MMP9 활성에 노출되지 않은 DNA-페이로드를 시험하였다. 이 시료는 30분 동안 49건의 이벤트를 생성하였으며, 이 중 지속 시간이 0.1 ms를 초과하는 건은 16.3%였다(도 19a, 도 19b). 다음으로, 전술한 바와 같은 DNA-페이로드와 MMP9 간의 배양 기간 후, 상기 반응 혼합물을 1.2 nM의 DNA-페이로드 등가 농도에서 상기 포어 상에서 시험하였으며, 이는 30분 동안 327건의 이벤트를 생성하였다. MMP9가 기질(즉, 상기 절단 가능한 링커)의 대부분을 분해했다면, 상기 반응 혼합물은 DNA 단독 및 페이로드 단독을 포함할 것이고, 그 결과 분해되지 않은 DNA-페이로드에 비해 지속 시간이 0.1 ms를 초과하는 이벤트의 비율이 감소할 것이다. 이는 실제로 사실이어서, MMP9 분해 후 DNA-페이로드의 경우 0.1 ms를 초과하는 이벤트는 7.6%였고, 이는 분해되지 않은 DNA 페이로드의 16.3%보다 감소된 수치이다(도 19a, 도 19b). 기록 시간의 함수로서의 Q(p) ± Qsd(p)의 플롯을 각 시약 유형에 대해 도시하였다(도 19b).
다음으로, 나노포어 검출 분석에 통계적 유의성을 부여하기 위한 상기 기재된 방법을 실시하였다. 특히 방정식 (2)과 함께, DNA-페이로드와 MMP9 간의 반응 혼합물에 의해 생성된 데이터를 사용하여 DNA-페이로드 분자 구조물이 존재하는지 여부를 시험함으로써 MMP9 활성을 암묵적으로 검출할 수 있다. 이 경우, DNA-페이로드가 검출 대상인 유형 2 분자이며, 최소 이벤트 지속 시간 0.1 ms을 유형 2 플래그 기준으로 선택한다. DNA-페이로드가 존재하는 것으로 알려진 대조군 실험(MMP9 부재)에서, Q(p*) = 0.163를 확인하였다. 다음으로, MMP9 활성 이후의 상기 DNA-페이로드를 "미지의" 데이터로 취급하여, 방정식 (2)를 적용한다. 결과는 0.0765 + 0.038 = 0.117 < 0.163이며, 이는 유형 2(DNA-페이로드) 분자가 존재하지 않는다고 99% 신뢰 수준에서 말할 수 있음을 의미한다. 앞서 언급한 바와 같이, DNA-페이로드의 부재는 MMP9가 기질을 포함하는 분자 중 충분한 비율을 분해하였다는 것을 암시한다. 도 19c는 방정식 (2)를 적용한 MMP9 프로테아제 활성 결과를 나타낸다.
실시예 5: 소변 농도 증가 하에서의 MMP9 민감성 분자 구조물의 분해
MMP9는 난소 암을 포함하는 다수의 인간 악성 종양의 소변에서 과발현되고 과다 활성을 나타내는 것으로 확인된 바 있다(Coticchia, Christine M., et al. "Urinary MMP-2 and MMP-9 predict the presence of ovarian cancer in women with normal CA125 levels." Gynecologic oncology 123.2 (2011): 295-300). 이러한 이유로 인해 인간의 소변에 존재하는 MMP9의 농도 및/또는 활성 수준을 분석하기 위해 여러 가지의 상용 키트(GE Healthcare, R&D Systems, Abcam)가 제조되었다. 이 실시예에서는, 소변 농도를 증가시키면서 상기 지지체:융합 분자:페이로드 구조물을 분해시키는 MMP9의 능력을 EMSA 겔에 의해 분석하였다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 상기 절단 가능한 링커:페이로드를 DBCO-변형된 DNA 지지체에 접합시킨 결과, 최종 생성물이 75%를 초과하였다(도 16, 레인 5 상부 밴드). 정제된 시료를 인간 소변 양을 증가시키면서 MMP9와 함께 배양하였다. 정상 효소 활성 완충액에서, 상기 구조물의 완전한 절단이 상기 상부 접합 밴드의 소멸을 통해 관찰되었다(레인 1). 소변 농도가 증가함에 따라 용액 내 소변이 15%를 초과할 때 완전한 효소 저해가 발생하였고(도 16, 레인 3 및 레인 4), 5% 소변 용액에서 중간 수준의 효소 활성이 확인되었다 (도 16, 레인 2). 프로테아제 저해 메커니즘은 조사되지 않았지만, 여러 요인들에 기인할 수 있으며, 여기에는, 예를 들어 이에 제한되는 것은 아니지만, pH 변화, 소변 내의 천연 억제제의 존재 또는 단백질 3차 구조의 우레아-매개된 펼침(urea-mediated unfolding)이 포함된다.
실시예 6: 엔도뉴클레아제 민감성 구조물의 가수 분해 및 나노포어 검출
박테리아 세포에서, 제한 엔도뉴클레아제는 외래 DNA의 흡수에 대한 중요한 방어 기작으로서 작용한다. 엔도뉴클레아제는 특정 DNA 서열을 인식하고 분해하여 바이러스 감염 등을 일으킬 수 있는 잠재적으로 해로운 외래 DNA를 파괴하면서 "자신"을 보호한다. 황색 포도상 구균은 표면성 피부 병변에서부터 중증 전신 질환에 이르기까지 다양한 종류의 인체 감염을 유발하는 것으로 밝혀진 병원성 박테리아이다. 이 실시예에서는 먼저, 제한 효소 SauI의 인식 서열인 CC/T(N)AGG(N은 C, G, T 또는 A를 나타냄)를 포함하는 DBCO-변형된 500 bp DNA(상기 지지체 및 상기 융합 분자의 일부를 포함함)를 제조한다. SauI는 황색 포도상 구균의 모든 분리주에서 발견되는 엔도뉴클레아제이다(Veiga, Helena, and Mariana G. Pinho. "Inactivation of the SauI type I restriction-modification system is not sufficient to generate Staphylococcus aureus strains capable of efficiently accepting foreign DNA." Applied and environmental microbiology 75.10 (2009): 3034-3038). 그런 다음, 상기 융합 분자의 이 DNA 부분을 페이로드 분자에 접합시킨다. 상업적 공급 업체로부터 SauI을 입수하는 데 한계가 있는 관계로, 동일한 인식 서열에서의 가수 분해 절단이 가능한 엔도뉴클레아제인 Eco81I를 사용하였다.
상기 조작된 DNA 지지체:융합 분자:페이로드 구조물을 분해시키는 Eco81I의 능력을 평가하기 위해, 완전한 DNA 서열-특이적 가수 분해가 보장되도록 상기 두 물질을 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다(1X 탱고 완충액(Tango Buffer) 내의 20U Eco81I, Thermo Scientific사 제조). 상기 엔도뉴클레아제와 상기 지지체:융합 분자:페이로드의 배양 이후, EMSA 겔을 사용하여 상기 효소 반응의 결과물을 분석하였다. Eco81I를 사용하지 않고 배양된 접합된 DNA 지지체의 시료(도 15, 레인 1)는 손상되지 않은 구조물을 나타내는 상부 밴드와 상기 페이로드 분자에 접합되지 않은 DNA를 나타내는 하부 밴드를 나타냈다. 그러나, 레인 1의 시료를 Eco81I와 함께 배양한 경우, DNA의 완전한 분해가 관찰되었다(도 15, 레인 3). Eco81I의 인식 서열은 상기 DNA 지지체의 3' 말단으로부터 194bp 떨어져 있고 상기 페이로드 분자에 코딩된 상기 프로테아제 절단 가능한 링커와는 독립적이므로, 접합 물질 및 비접합 물질 모두(도 15, 레인 1, 상부 및 하부 밴드)가 Eco81I에 의해 가수 분해되었다. DNA 상에서의 Eco81I의 가수 분해 반응 후 생성될 것으로 예상되는 304 및 196bp 생성물이 레인 3에서 분명히 확인된다.
상기 엔도뉴클레아제 민감성 구조물의 Eco81I-매개 분해에 대한 겔 확인 후, 나노포어 분석을 수행하여 생성된 단편의 전류 임피던스를 평가하였다. 페이로드 분자가 존재함을 고려할 때, 이상적인 전류 임피던스는 상기 생성물에 비교할 때 완전한 구조물에서 신호가 더 클 것으로 예측된다. 이 가설을 시험하기 위해, 500 bp DNA를 사용하여, 상기 지지체:융합 분자:페이로드 구조물 (이하, DNA-페이로드로 지칭함)을 1M LiCl에서 나노포어 내로 탑재하고 Eco81I-매개 분해 전후에 대해 비교하였다(도 20).
상기 나노포어 분석에서, 먼저 18 nm 직경의 포어를 사용하여 1 nM의 비접합 500 bp DNA 단독을 시험하였다(100 mV, 1 M LiCl). 이 시료는 32분 동안 530건의 이벤트를 생성하였으며 이 중 7.5%만이 지속 시간 0.06 ms을 초과하였다(도 20a, 도 20b). 이어서, 0.2nM의 DNA-페이로드를 시험하였다. 이는 31분 동안 117건의 이벤트를 생성하였으며, 이 중 22.2%가 지속 시간 0.06 ms를 초과하였다(도 20a, 도 20b). 다음으로, 전술한 바와 같은 DNA-페이로드와 Eco81I 간의 배양 기간 후에, 상기 반응 혼합물을 0.2nM의 DNA-페이로드 등가 농도에서 상기 포어 상에서 시험하였으며, 이는 40분 동안 52건의 이벤트를 생성하였다. Eco81I가 상기 절단 가능한 링커의 대부분을 절단했다면, 상기 반응 혼합물은 DNA 단독 및 페이로드 단독을 포함할 것이고, 그 결과 분해되지 않은 DNA-페이로드에 비해 지속 시간이 0.06 ms를 초과하는 이벤트의 비율이 감소할 것이다. 이는 실제로 사실이어서, Eco81I 분해 후 DNA-페이로드의 경우 0.06 ms를 초과하는 이벤트는 7.7%였고, 이는 분해되지 않은 DNA-페이로드의 22.2%보다 감소된 수치이다(도 20a, 도 20b). 기록 시간의 함수로서의 Q(p) ± Qsd(p)의 플롯을 각 시약 유형에 대해 도시하였다(도 20b).
나노포어 검출 분석에 통계적 유의성을 부여하기 위한 상기 기재된 방법을 또 다시 실시하였다. 특히 방정식 (2)과 함께, DNA-페이로드와 Eco81I 간의 반응 혼합물에 의해 생성된 데이터를 사용하여 DNA-페이로드 분자 구조물이 존재하는지 여부를 시험함으로써 Eco81I 활성을 암묵적으로 검출할 수 있다. 이 경우, DNA-페이로드가 검출 대상인 유형 2 분자이며, 최소 이벤트 지속 시간 0.06 ms가 유형 2 플래그 기준으로 선택된다. DNA-페이로드가 존재하는 것으로 알려진 대조군 실험(Eco81I 부재)에서, Q(p*) = 0.222를 확인하였다. 다음으로, Eco81I 활성 이후의 상기 DNA-페이로드를 "미지의" 데이터로 취급하여, 방정식 (2)를 적용한다. 결과는 0.0769 + 0.0951 = 0.172 < 0.222이며, 이는 유형 2(DNA-페이로드) 분자가 존재하지 않는다고 99% 신뢰 수준에서 말할 수 있음을 의미한다. 앞서 언급한 바와 같이, DNA-페이로드의 부재는 Eco81I가 절단 가능한 링커 중 충분한 비율을 절단하였다는 것을 암시한다. 도 20c는 방정식 (2)를 적용한 Eco81I 엔도뉴클레아제 활성 결과를 나타낸다.

Claims (82)

  1. 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자의 존재 여부를 검출하는 방법으로서,
    절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자와 상기 시료를 접촉시키는 단계로서, 상기 절단 가능한 링커는 상기 표적 분자의 존재시 특이적으로 절단되는 것인 단계;
    나노포어를 포함하는 장치에 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계;
    상기 나노포어를 통해 폴리머 지지체(scaffold)를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 융합 분자의 제 1 부분이 상기 폴리머 지지체에 결합하고, 상기 융합 분자의 제 2 부분이 페이로드 분자에 결합하며, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및
    상기 절단 가능한 링커가 절단되었는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 시료 내에 상기 표적 분자가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자의 존재 여부를 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키는 단계는 상기 시료를 상기 장치에 탑재하기 전에 수행되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 시료를 장치에 탑재하는 단계는 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키기 전에 수행되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 분자는 폴리머 지지체 결합 도메인을 포함하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 시료를 폴리머 지지체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체를 상기 폴리머 지지체 결합 도메인에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용(planar stacking interaction) 또는 금속 결합을 통해 상기 폴리머 지지체 결합 도메인에 결합되는 방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체 결합 도메인은 아지드기(azide group)를 포함하는 방법.
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체 결합 도메인은 DNA, RNA, PNA, 폴리펩타이드, 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  10. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체 결합 도메인은 잠금 핵산(locked nucleic acid(LNA)), 가교 핵산(bridged nucleic acid, BNA), 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(transcription activator-like effector nucleases(TALEN), 주기적으로 간격을 두고 분포하는 짧은 회문구조의 반복서열(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)(크리스퍼, CRISPR), 앱타머(aptamer), DNA 결합 단백질 및 항체 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거(zinc finger) 단백질을 포함하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 상기 항체 단편은 항원-결합 분절(Fab) 단편을 포함하는 방법.
  13. 제 4 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체 결합 도메인은 화학적 변형을 포함하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 분자는 페이로드 분자 결합 도메인을 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 시료를 페이로드 분자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 페이로드 분자를 상기 페이로드 분자 결합 도메인에 결합시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 페이로드 분자는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용 또는 금속 결합을 통해 상기 페이로드 분자 결합 도메인에 결합하는 방법.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 페이로드 분자 결합 도메인은 DBCO를 포함하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 분자는 폴리머 지지체 결합 도메인 및 페이로드 분자 결합 도메인을 포함하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 분자의 상기 제 1 부분은 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용, 또는 금속 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 상기 폴리머 지지체에 결합한 것인 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 분자의 상기 제 2 부분은 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용, 또는 금속 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 상기 페이로드 분자에 결합한 것인 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 페이로드 분자 또는 상기 폴리머 지지체는 직접 공유 테더링(direct covalent tethering)을 통해 상기 융합 분자에 결합한 것인 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 융합 분자는 상기 폴리머 지지체 또는 상기 융합 분자를 상기 절단 가능한 링커에 직접 공유 테더링시키기 위한 연결기를 포함하는 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체는 상기 융합 분자를 포함하는 방법.
  25. 제 1 항에 있어서, 상기 검출은 상기 폴리머 지지체가 상기 융합 분자를 통해 상기 페이로드 분자에 결합되어 있는지 여부를 센서로 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제 1 항에 있어서, 상기 센서는 상기 나노포어 내의 전기 신호를 검출하는 것인 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 전기 신호는 전류인 방법.
  28. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 분자는 가수 분해 효소 또는 리아제(lyase)인 방법.
  29. 제 1 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 아조 화합물, 이황화 결합, 술폰, 에틸렌 글리콜 디숙신산염, 히드라존, 아세탈, 이민, 비닐 에테르, 인접 디올(vicinal diol) 및 피콜리네이트 에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  31. 제 1 항에 있어서, 상기 표적 분자는 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 탄소-탄소 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 상기 절단 가능한 링커 내의 결합을 특이적으로 절단하는 것인 방법.
  32. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체는 디옥시리보핵산(DNA), 덴드리머, 펩타이드 핵산(PNA), 리보핵산(RNA), 폴리펩타이드, 나노로드(nanorod), 나노튜브(nanotube), 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  33. 제 1 항에 있어서, 상기 페이로드 분자는 덴드리머, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, DNA 앱타머, 형광 발색단, 단백질, 폴리펩타이드, 나노비드(nanobead), 나노로드, 나노튜브, 풀러렌, PEG 분자, 리포솜 및 콜레스테롤-DNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  34. 제 1 항에 있어서, 상기 센서는 전극 쌍을 포함하며, 상기 전극 쌍은 상기 두 용적 사이에 전압차를 인가하고, 상기 나노포어를 통과하는 전류 흐름을 검출하는 방법.
  35. 제 1 항에 있어서, 상기 융합 분자는 2개 이상의 절단 가능한 링커를 포함하는 방법.
  36. 제 1 항에 있어서, 상기 장치는 2개 이상의 나노포어를 연달아 포함하며, 상기 폴리머 지지체는 상기 2개 이상의 나노포어에서 동시에 포집되고 검출되는 것인 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체의 이동은 상기 나노포어 각각에 고유한 전압을 인가함으로써 제어되는 방법.
  38. 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태의 존재 여부를 검출하는 방법으로서,
    절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자와 상기 시료를 접촉시키는 단계로서, 상기 절단 가능한 링커는 상기 표적 분자 또는 상태의 존재시 특이적으로 절단되는 단계;
    나노포어를 포함하는 장치에 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계;
    상기 나노포어를 통해 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 융합 분자의 제 1 부분이 상기 폴리머 지지체에 결합하고, 상기 융합 분자의 제 2 부분이 페이로드 분자에 결합하며, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및
    상기 절단 가능한 링커가 절단되었는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 시료 내에 상기 표적 분자 또는 상태가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태의 존재 여부를 검출하는 방법.
  39. 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태의 존재 여부를 검출하는 방법으로서,
    상기 시료를 융합 분자, 폴리머 지지체 및 페이로드 분자와 접촉시키는 단계로서, 상기 융합 분자는 절단 가능한 링커를 포함하고, 상기 표적 분자는 상기 절단 가능한 링커, 폴리머 지지체 결합 도메인 및 페이로드 분자 결합 도메인을 특이적으로 절단하는 것인 단계;
    나노포어를 포함하는 장치에 상기 융합 분자, 상기 폴리머 지지체, 상기 페이로드 분자 및 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계;
    상기 나노포어를 통해 상기 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및
    상기 절단 가능한 링커가 상기 페이로드 분자에 결합되어 있는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 표적 분자 또는 상태가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태의 존재 여부를 검출하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 표적 분자는 가수 분해 효소 또는 리아제를 포함하는 방법.
  41. 제 39 항에 있어서, 상기 표적 분자 또는 상태는 10nm 내지 550nm의 파장을 포함하는 빛에 상기 절단 가능한 링커를 노출시킴으로써 상기 절단 가능한 링커를 광분해로 절단하는 것인 방법.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 광분해 절단에 민감한 절단 가능한 링커는 오르토-니트로벤질 유도체 및 페나실 에스테르 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제 39 항에 있어서, 상기 표적 분자 또는 상태는, 상기 절단 가능한 링커를 친핵성 시약, 염기성 시약, 친전자성 시약, 산성 시약, 환원 시약, 산화 시약 및 유기 금속 화합물로 구성된 군으로부터 선택된 시약에 노출시킴으로써 상기 절단 가능한 링커를 화학적으로 절단하는 것인 방법.
  44. 제 39 항에 있어서, 상기 장치 내의 2개의 용적 중 적어도 하나는 상기 융합 분자와 상기 폴리머 지지체의 결합 및 상기 융합 분자와 상기 페이로드 분자의 결합을 허용하는 상태를 포함하는 방법.
  45. 제 39 항에 있어서, 상기 융합 분자는 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키기 전에 상기 폴리머 지지체 및 상기 페이로드 분자에 결합되는 것인 방법.
  46. 제 39 항에 있어서, 상기 융합 분자는 상기 융합 분자를 상기 장치에 탑재하기 전에 상기 폴리머 지지체 및 상기 페이로드 분자에 결합되는 것인 방법.
  47. 제 39 항에 있어서, 상기 장치 내의 하나 이상의 용적은, 상기 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 상기 표적 분자 또는 상태가 상기 절단 가능한 링커를 절단할 수 있게 하는 상태를 포함하는 방법.
  48. 제 39 항에 있어서, 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키는 단계는 상기 시료를 상기 장치에 탑재하기 전에 수행되는 방법.
  49. 제 39 항에 있어서, 상기 시료를 상기 장치에 탑재하는 단계는 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키기 전에 수행되는 방법.
  50. 제 39 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체는 디옥시리보핵산(DNA), 덴드리머, 펩타이드 핵산(PNA), 리보핵산(RNA), 폴리펩타이드, 나노로드, 나노튜브, 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  51. 제 39 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  52. 제 39 항에 있어서, 상기 표적 분자 또는 상태는 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 탄소-탄소 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 상기 절단 가능한 링커 내의 결합을 특이적으로 절단하는 것인 방법.
  53. 제 39 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커는 아조 화합물, 이황화 결합, 술폰, 에틸렌 글리콜 디숙신산염, 히드라존, 아세탈, 이민, 비닐 에테르, 인접 디올 및 피콜리네이트 에스테르로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  54. 제 39 항에 있어서, 상기 페이로드 분자는 덴드리머, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 DNA, DNA 앱타머, 형광 발색단, 단백질, 폴리펩타이드, 나노비드, 나노로드, 나노튜브, 풀러렌, PEG 분자, 리포솜 및 콜레스테롤-DNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  55. 제 39 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체 및 상기 융합 분자는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용 또는 금속 결합을 통해 결합한 것인 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 지지체 및 상기 융합 분자는 직접 공유 테더링을 통해 결합한 것인 방법.
  57. 제 55 항에 있어서, 상기 융합 분자는 상기 폴리머 지지체에 직접 공유 테더링하기 위한 연결기를 포함하며, 상기 연결기는 상기 절단 가능한 링커와 결합하는 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 연결기는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 방법.
  59. 제 55 항에 있어서, 상기 융합 분자는 DNA, RNA, PNA, 폴리펩타이드, 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 폴리머 지지체 결합 도메인을 포함하는 방법.
  60. 제 55 항에 있어서, 상기 융합 분자는 잠금 핵산(LNA), 가교 핵산(BNA), 전사 활성화 인자-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 주기적으로 간격을 두고 분포하는 짧은 회문 구조 반복서열(크리스퍼, CRISPR), 앱타머, DNA 결합 단백질 및 항체 단편으로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  61. 제 60 항에 있어서, 상기 DNA 결합 단백질은 징크 핑거 단백질을 포함하는 방법.
  62. 제 60 항에 있어서, 상기 항체 단편은 항원-결합 분절(Fab) 단편을 포함하는 방법.
  63. 제 55 항에 있어서, 상기 융합 분자는 화학적 변형을 포함하는 방법.
  64. 제 39 항에 있어서, 상기 절단 가능한 링커 및 상기 페이로드 분자는 공유 결합, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호 작용, 양이온-파이(pi) 상호 작용, 평면 적층 상호 작용 또는 금속 결합을 통해 직접 또는 간접적으로 결합되는 방법.
  65. 제 39 항에 있어서, 상기 센서는 전극 쌍을 포함하며, 상기 전극 쌍은 상기 두 용적 사이에 전압차를 인가하고, 상기 나노포어를 통과하는 전류 흐름을 검출하는 방법.
  66. 제 39 항에 있어서, 상기 융합 분자는 2개 이상의 절단 가능한 링커를 포함하는 방법.
  67. 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태를 검출하는 방법으로서,
    상기 시료를 폴리머 지지체와 접촉시키는 단계로서, 상기 폴리머 지지체는 절단 가능한 도메인을 포함하고, 상기 절단 가능한 도메인은 상기 표적 분자의 존재시 특이적으로 절단되는 것인 단계;
    나노포어를 포함하는 장치에 상기 폴리머 지지체를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계;
    상기 나노포어를 통해 상기 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및
    상기 절단 가능한 도메인이 절단되었는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 시료 내에 상기 표적 분자 또는 상태가 존재하는지 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태를 검출하는 방법.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 폴리머 지지체는 디옥시리보핵산(DNA), 덴드리머, 펩타이드 핵산(PNA), 리보핵산(RNA), 폴리펩타이드, 나노로드, 나노튜브, 콜레스테롤/DNA 혼성체 및 DNA/RNA 혼성체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  69. 제 67 항에 있어서, 상기 절단 가능한 도메인은 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 폴리펩타이드로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  70. 제 67 항에 있어서, 상기 표적 분자 또는 상태는 탄소-산소 결합, 탄소-황 결합, 탄소-질소 결합 및 탄소-탄소 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 상기 절단 가능한 도메인 내의 결합을 특이적으로 절단하는 방법.
  71. 제 67 항에 있어서, 상기 절단 가능한 도메인은 상기 표적 분자 또는 상태의 존재시 광분해로 절단되며, 상기 절단 가능한 도메인은 오르토-니트로벤질 유도체 및 페나실 에스테르 유도체로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  72. 제 67 항에 있어서, 상기 절단 가능한 도메인은 상기 표적 분자 또는 상태의 존재시 화학적으로 절단되며, 상기 절단 가능한 도메인은 아조 화합물, 이황화 결합, 술폰, 에틸렌 글리콜 디숙신산염, 히드라존, 아세탈, 이민, 비닐 에테르, 인접 디올 및 피콜리네이트 에스테르로 구성된 군으로부터 선택된 분자를 포함하는 방법.
  73. 제 67 항에 있어서, 상기 장치는 2개 이상의 나노포어를 연달아 포함하며, 상기 폴리머 지지체는 이동 중에 상기 2개 이상의 나노포어 내에 동시에 존재하는 방법.
  74. 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태를 정량하는 방법으로서,
    상기 시료를 융합 분자, 폴리머 지지체 및 페이로드 분자와 접촉시키는 단계로서, 상기 융합 분자는 절단 가능한 링커를 포함하고, 상기 절단 가능한 링커는 상기 표적 분자 또는 상태, 폴리머 지지체 결합 도메인 및 페이로드 분자 결합 도메인 존재시 특이적으로 절단되는 것인 단계;
    나노포어를 포함하는 장치에 상기 융합 분자, 상기 폴리머 지지체, 상기 페이로드 분자 및 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계;
    상기 나노포어를 통해 상기 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계; 및
    상기 폴리머 지지체가 상기 페이로드 분자에 결합되어 있는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 표적 분자가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및
    상기 센서로부터의 측정치를 사용하여 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태의 농도 또는 활성을 추정하는 단계를 포함하는, 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태를 정량하는 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 상기 농도 또는 활성의 측정은 상기 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태의 검출에 신뢰 수준 수치를 할당하는 단계를 포함하는 방법.
  76. 제 74 항에 있어서, 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키는 단계, 상기 융합 분자, 상기 폴리머 지지체, 상기 페이로드 분자 및 상기 시료를 상기 장치에 탑재하는 단계, 상기 장치를 설정하는 단계 및 상기 폴리머 지지체가 상기 페이로드 분자에 결합되어 있는지 여부를 측정하는 단계는 상기 폴리머 지지체, 상기 융합 분자, 상기 페이로드 분자 또는 상기 시료 내의 상기 표적 분자 또는 상태 중 하나 이상의 농도 또는 활성을 변화시키면서 반복하는 방법.
  77. 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자를 정량하는 방법으로서,
    절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자와 상기 시료를 접촉시키는 단계로서, 상기 절단 가능한 링커는 상기 표적 분자의 존재시 특이적으로 절단되는 것인 단계;
    나노포어를 포함하는 장치에 상기 시료를 탑재하는 단계로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하는 것인 단계;
    상기 나노포어를 통해 상기 폴리머 지지체를 통과시키도록 상기 장치를 설정하는 단계로서, 상기 융합 분자의 제 1 부분이 상기 폴리머 지지체에 결합하고, 상기 융합 분자의 제 2 부분이 페이로드 분자에 결합하며, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 포함하는 것인 단계;
    상기 절단 가능한 링커가 절단되었는지 여부를 상기 센서로 측정함으로써 상기 시료 내에 상기 표적 분자가 존재하는지 여부를 검출하는 단계; 및
    상기 센서로부터의 측정치를 사용하여 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태의 농도를 추정하는 단계를 포함하는, 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자를 정량하는 방법.
  78. 제 77 항에 있어서, 상기 농도 측정은 상기 시료 내에 존재하는 것으로 의심되는 표적 분자 또는 상태의 검출에 신뢰 수준 수치를 할당하는 단계를 포함하는 방법.
  79. 제 77 항에 있어서, 상기 시료를 상기 융합 분자와 접촉시키는 단계, 상기 시료를 상기 장치에 탑재하는 단계, 상기 장치를 설정하는 단계 및 상기 절단 가능한 링커가 절단되었는지 여부를 측정하는 단계는 상기 폴리머 지지체, 상기 융합 분자, 상기 페이로드 분자 또는 상기 시료 내의 상기 표적 분자 또는 상태 중 하나 이상의 농도를 변화시키면서 반복하는 방법.
  80. 키트(kit)로서,
    나노포어를 포함하는 장치로서, 상기 나노포어는 상기 장치의 내부 공간을 2개의 용적으로 분리하고, 상기 장치는 하나 이상의 포어를 통해 상기 핵산을 통과시키도록 설정되고, 상기 장치는 상기 나노포어를 통과하는 대상을 식별하도록 설정된 센서를 각 포어에 대해 포함하는 것인 장치;
    절단 가능한 링커를 포함하는 융합 분자로서, 상기 절단 가능한 링커는 표적 분자의 존재시 특이적으로 절단되는 것인 융합 분자;
    페이로드 분자;
    폴리머 지지체; 및
    시료 내에 상기 표적 분자가 존재하는지 여부를 검출하기 위한 사용 설명서를 포함하는 키트.
  81. 제 80 항에 있어서, 상기 융합 분자가 상기 페이로드 분자에 결합하는 것인 키트.
  82. 제 80 항에 있어서, 상기 융합 분자가 상기 폴리머 지지체에 결합하는 것인 키트.
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