ES2230860T3

ES2230860T3 - Sistema de administracion de farmacos que comprende un peptido homeobos y un agente citotoxico o antineoplasico.

Info

Publication number: ES2230860T3
Application number: ES99928071T
Authority: ES
Inventors: Peter Martin Fischer; Shudong Wang
Original assignee: Cyclacel Ltd
Current assignee: Cyclacel Ltd
Priority date: 1998-07-03
Filing date: 1999-06-22
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2019-06-22
Also published as: ATE279210T1; GB2340121A; JP2002519392A; US20030119735A1; GB9814527D0; AU756014B2; DE69921138D1; WO2000001417A1; GB9914577D0; DE69921138T2; EP1093383A1; HUP0300246A3; EP1093383B1; US6992169B2; US6472507B1; CA2333145A1; IL140650A0; HUP0300246A2; GB2340121B; CA2333145C

Abstract

Sistema de administración que comprende un grupo farmacéutico ligado a un grupo portador; en el que el grupo portador comprende un péptido con homeosecuencia o un derivado del mismo y el grupo farmacéutico es un fármaco no peptídico, no-oligonucleótido terapeúticamente activo que es un agente citotóxico o antineoplásico.

Description

Sistema de administración de fármacos que comprende un péptido homeobox y un agente citotóxico o antineoplásico.

Campo de la invención

La invención se refiere a un nuevo sistema de administración de fármacos para su utilización en la administración mejorada de agentes terapéuticos de fármacos en las células diana. El sistema de administración proporciona otras ventajas que incluyen la mejora desde el punto de vista del metabolismo, distribución y excreción del fármaco. El sistema de administración puede ser terapéuticamente activo tanto en su estado intacto como disocia-
do.

Técnica anterior

La industria farmacéutica se ha preocupado desde hace muchos años de la administración eficaz de los agentes terapéuticos. Este problema se puede atribuir al corto tiempo de eliminación del agente en el cuerpo (corta vida media), a la situación del punto de actuación o posiblemente a la naturaleza del propio agente terapéutico, por ejemplo, su solubilidad, hidrofobia, etc. Así pues, se han adoptado muchos desarrollos y estrategias, incluyendo la formulación del agente terapéutico con el fin de protegerlo de un medio hostil en la vía de su punto de actuación, por ejemplo, comprimidos recubiertos entéricamente, dispositivos de liberación controlada y similares.

Los agentes terapéuticos derivados de péptidos están muy documentados en la bibliografía. A título de ejemplo, el documento WO 97/19954 da a conocer la utilización de análogos de hormonas de péptidos tales como LH-RH, bombesina y somatostatina para dirigir los derivados de antraciclina anticancerosos. Asimismo, el documento WO 98/13059 da a conocer la utilización de péptidos que son sustratos de una peptidohidrasa localizada en la superficie de las células metastásicas para el direccionamiento de derivados anticancerosos.

El desarrollo de agentes terapéuticos derivados de péptidos ha planteado un problema adicional debido a su susceptibilidad para la degradación enzimática no solamente en el aparato digestivo sino también en el torrente sanguíneo. Un ejemplo de cómo este problema ha sido estudiado se refiere a la incorporación de los péptidos en los liposomas o microesferas poliméricas que dirigen los péptidos al sistema linfático.

Otro problema relacionado, especialmente para los agentes terapéuticos que funcionan intracelularmente es la barrera colocada por la membrana celular. De este modo, puede ser posible aumentar la vida media del agente o asegurar que pase a través del cuerpo sin degradarse, aunque deben introducirse realmente muchos agentes en las células para ejercer su efecto terapéutico.

La patente europea nº 485.578 da a conocer que el homeodominio y particularmente, la hélice 3 de un péptido con homeosecuencia, particularmente el derivado de la Drosophila Antennapedia, es útil como vector de transporte intracelular. La patente da a conocer que una secuencia de 57 aminoácidos específica de un homeopéptido de Drosophila Antennapedia (denominado péptido pAntp) fue capaz de penetrar en los fibroblastos y en las células embrionarias (in vivo). Se hizo hincapié en los últimos 27 aminoácidos de la secuencia que corresponden con las hélices 3 y 4. No existe descripción del péptido pAntp que esté ligado a cualquier otro péptido o agente terapéu-
tico.

Todas las descripciones posteriores (Derossi D et al., J Biol Chem (1994) 269, 10444-10450, Joliot AH et al., (1991) The New Biol 3, 1121-1134 y PNAS (1991) 88, 1864-1868, Pérez F et al., J Cell Sci (1992) 102, 712-722), describen cómo se puede utilizar un péptido sintético de 16 aminoácidos derivado de la tercera hélice del homeodominio de Antennapedia para la administración intracelular de productos bioactivos y de oligonucleótidos de la cadena complementaria. La secuencia de aminoácidos de utilización es RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC. ID nº: 1) conocida también como Penetratina®. Las secuencias de 16 aminoácidos útiles como vectores de introducción se describen también en Prochiantz (Curr. Opin in Neuro biology, vol 6(5), 1996, p629-634). Además, Derossi et al. (base de datos Scisearch [en línea] 1998. Número de registro 141.940 de la base de datos STN) da a conocer que se pueden utilizar numerosos homeopéptidos para introducir los polipéptidos y oligonucleótidos unidos directamente o mediante enlaces disulfuro.

Asimismo, el documento WO 91/18.981 da a conocer que los péptidos con homeosecuencia y los fragmentos de los mismos se pueden utilizar como portadores de internalizatina para moléculas biológicamente activas, en particular secuencias de péptidos y ácidos nucleicos.

En un esfuerzo para impedir la escisión enzimática de la penetratina Brugidou J. et al., (Biochem Biophys Res Comm (1995) 214(2), 685-693) preparó una forma retro-inverso (D-aminoácidos en orden inverso) de SEC. ID nº: 1, sustituyendo los dos restos de isoleucina en las posiciones 3 y 5 de penetratina por valina y añadiendo un resto de glicina en el terminal C para facilitar la unión a la resina. Se preparó otra forma retro-inverso sustituyendo la glicina adicional por un grupo colesterol unido mediante un grupo conectador de sulfhidrilo. La adición del grupo colesterol mejoró la penetración debida al aumento de hidrofobia de la molécula.

Este desarrollo de la forma retro-inverso de la penetratina ha dado lugar al documento WO 97/12912 que da a conocer los péptidos de 16 aminoácidos que comprenden entre 6 y 10 aminoácidos hidrófobos, en los que el sexto aminoácido de uno de los dos extremos es triptófano.

Asimismo, el documento WO 00/29427 da a conocer formas modificadas truncadas de penetratina, incluyendo los péptidos heptámeros que pueden incluir en ellos la variación adicional. Estas descripciones intentan definir las características mínimas de las secuencias capaces de actuar como vectores de interiorización.

Se ha descrito por lo tanto que la penetratina, sus análogos y sus formas retro-inverso son de utilización como portadores para facilitar la interiorización celular de los péptidos u oligonucleótidos conjugados.

Sumario de la invención

La presente invención tiene por objeto proporcionar un sistema de administración para fármacos terapéuticos que sea capaz de facilitar la introducción del fármaco en las células, mejorando de este modo la administración y/o el efecto terapéutico del fármaco. El sistema de administración puede también mejorar la vida media del fármaco en el cuerpo humano o animal, mejorar su solubilidad en los fluidos biológicos, minimizar los efectos secundarios tóxicos o no deseables conocidos, aumentar el principio de actuación del efecto terapéutico deseado, proporcionar vías alternativas para la administración del fármaco, aumentar la biodistribución y el metabolismo del grupo farmacéutico y disminuir la frecuencia de la resistencia al fármaco.

De este modo, la invención se refiere a un sistema de administración que comprende un grupo farmacéutico ligado a un grupo del portador que comprende un péptido con homeosecuencia o un fragmento o derivado del mismo. Como se expone más adelante, el grupo farmacéutico no es un péptido u oligonucleótido y el grupo del portador puede ser un derivado de penetratina.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta la estabilización de la formación de microtúbulos por los sistemas de la presente invención.

La Figura 2 presenta la comparación de la introducción en la célula de un sistema de administración de la presente invención comparado con el grupo del portador solo.

La Figura 3 presenta la introducción de un sistema de administración de la presente invención.

La Figura 4 presenta la estabilidad intracelular de un sistema de administración de la presente invención.

Descripción de las formas de realización preferidas

En una primera forma de realización, el sistema de administración comprende un grupo farmacéutico ligado a un grupo del portador. El grupo farmacéutico puede estar unido directa o indirectamente al grupo de portador. En la forma de realización preferida en la que el grupo farmacéutico está unido indirectamente al portador, el enlace puede ser mediante un grupo de unión intermedio tal como un grupo sulfhidrilo o carboxilo o cualquier grupo mayor, todos los grupos de unión y otros descritos más adelante, se denominan en lo sucesivo fragmentos de enlace.

Según la presente invención, los grupos de fármacos adecuados incluyen cualquier fármaco terapéuticamente activo sin péptido/oligonucleótido.

El grupo farmacéutico es un agente citotóxico o antineoplásico, particularmente los que se utilizan para la terapia del cáncer o dicho fármaco en forma fotoactivable. Dichos fármacos incluyen, en general, agentes que alteran el ADN, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, productos naturales y sus análogos, inhibidores de dihidrofolato reductasa, análogos de pirimidina, análogos de purina, inhibidores de cinasa dependiente de ciclina, inhibidores de timidilato sintetasa, intercaladores de ADN, escindidores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, antraciclinas, fármacos vinca, mitomicinas, bleomicinas, nucleósidos citotóxicos, fármacos de pteridina, diinenos, podofilotoxinas, fármacos que contienen platino, productores de diferenciación y taxanos. Los elementos de estas clases particularmente útiles incluyen, por ejemplo, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, purinas trisustituidas tales como olomoucina, roscovitina, bohemina y purvalanol, flavopiridol, estaurosporina, arabinósido de citocina, melfalán, leurosina, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina D, mitomicina A, carninomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina (y derivados de los mismos), etopósido, cisplatino, carboplatino, vinblastina, vincristina, vindesina, paclitaxel, docetaxel, ácido retinoico de taxotere, ácido butírico, acetil espermidina, tamoxifeno, irinotecano y camptotecina. El fármaco se selecciona más preferentemente de entre metotrexato, podofilotoxina (y derivados de los mismos), etopósido, camptotecina, paclitaxel, doxorrubicina, roscovitina y bohemina.

El grupo del portador tal como se utiliza en la presente invención comprende péptidos con homeosecuencia o derivados de los mismos tal como la hélice 3 de un péptido con homeosecuencia. Preferentemente, el péptido con homeosecuencia procede de la homeoproteína de Drosophila Antennapedia, de secuencias homólogas a ésta o derivados de la misma. Más preferentemente, el grupo del portador es penetratina o un derivado de la misma. Los derivados de penetratina han sido descritos en la bibliografía, por ejemplo en el documento EP 485578B, que da a conocer las secuencias homólogas a pAntp. Otros derivados de penetratina que se pueden utilizar en la presente invención incluyen formas modificadas de penetratina descritas en el documento WO 97/12912.

Dentro de los grupos portadores definidos como penetratina o derivados de la misma, otra modificación que presenta ventajas en el contexto de la presente invención es la transformación del grupo carboxilo libre del resto del aminoácido con terminal carboxi, en un grupo carboxamido. A título de ejemplo, cuando el grupo portador es penetratina (SEC. ID nº: 1) el resto de lisina con terminal carboxi puede tener su grupo carboxilo transformado en un grupo de carboxamida. Se cree que esta modificación aumenta la estabilidad del grupo portador y por consiguiente la del sistema de administración en conjunto.

El grupo portador puede estar en forma L o D ópticamente activa. Tal como se utiliza en la presente memoria, cuando no se da ninguna indicación, el portador está en forma L. D-penetratina se describe en Brugidou J. et al., (Biochem. Biophys. Res. Comm. (1995) 214(2), 685-693). El grupo del portador puede también estar dispuesto en la forma retro, es decir con los restos de aminoácidos en orden inverso a su secuencia paterna. Dichas formas retro pueden existir también en las formas L y D. Así pues, en otra forma de realización preferida el grupo del portador puede ser D-penetratina o la forma D de las formas truncadas y/o modificadas expuestas anteriormente.

El grupo farmacéutico puede estar unido a uno de los dos extremos del grupo portador, p. ej., si el grupo portador es penetratina tal como se muestra en la SEC. ID nº: 1 o un derivado de la misma, el grupo farmacéutico puede estar unido directa o indirectamente a los restos de lisina o arginina terminales. Preferentemente, el grupo farmacéutico está unido al extremo del terminal amino del portador.

Tal como se expuso anteriormente los grupos del fármaco y del portador pueden estar directa o indirectamente unidos mediante un fragmento de enlace. El enlace directo puede tener lugar mediante cualquier grupo funcional conveniente en el grupo farmacéutico, como por ejemplo un grupo hidroxi, carboxi o amino. El enlace indirecto que es preferible, tendrá lugar mediante un grupo de enlace. Los grupos de enlace adecuados incluyen grupos alquilo, arilo, aralquilo o peptídicos bi- y multi-funcionales, aldehídos, ácidos, ésteres y anhídridos de alquilo, arilo o aralquilo, grupos sulfhidrilo o carboxilo, tales como los derivados del ácido maleimido benzoico, derivados del ácido maleimido propiónico y derivados de succinimido o se pueden derivar del bromuro o cloruro cianúrico, carbonildiimidazol, ésteres de succinimidilo o haluros sulfónicos y similares. Los grupos funcionales en el fragmento de enlace utilizados para formar enlaces covalentes entre el conectador y los fármacos por una parte, así como entre grupo el conectador y el portador por otra parte, pueden ser dos o más de entre, p. ej., grupos amino, hidrazino, hidroxilo, tiol, maleimido, carbonilo y carboxilo, etc. El fragmento de enlace puede incluir una secuencia corta de 1 a 4 restos de aminoácidos que incluye opcionalmente un resto de cisteína mediante el cual el fragmento de enlace se une al grupo
portador.

Preferentemente, el fragmento de enlace incluye un resto de cisteína que proporciona el enlace existente al grupo portador como por ejemplo para formar un enlace del tipo fármaco-(conectador-Cys)-portador. Dentro del contexto de la memoria este resto de cisteína se considera como un componente del fragmento de enlace. Así pues, el fragmento de enlace completo solamente se puede formar como resultado de una reacción de acoplamiento fármaco-portador ya que el componente del resto de cisteína del conectador puede prepararse convenientemente como parte del grupo portador. En una forma de realización preferida el fragmento de enlace se selecciona de entre (metilamino)benzoil-Cys, succinimidobenzoil-Cys, succinimidopropionoil-Cys, \beta-alanil-succinil, acetil-Cys y (4''-aminoanilino)-succinimidopropionoil-Cys. En dichas formas de realización preferidas, el resto de cisteína se origina preferentemente como un resto terminal del grupo portador, mientras que el componente sin cisteína del conectador está acoplado al grupo farmacéutico antes de la reacción con el portador. El fragmento de enlace completo se forma por lo tanto únicamente haciendo reaccionar conjuntamente los grupos farmacéutico y portador.

De una manera idéntica a la inclusión de un resto de cisteína en el fragmento de enlace, otros restos de aminoácidos pueden incluirse en el conectador que como el resto de cisteína forman la conexión con el grupo portador. Por ejemplo, pueden estar incluidos los restos de los aminoácidos 3 ó 4 y éstos incluyen preferentemente el resto de cisteína expuesto anteriormente. Puede incluirse cualquier resto de aminoácido; sin embargo es preferible seleccionar los restos de entre cisteína, \beta-alanina y glicina.

En la utilización, el sistema de administración puede disociarse por escisión química o enzimática entre los grupos del fármaco y del portador. En las formas de realización en las que el fragmento de enlace incluye restos de aminoácidos, dicha escisión puede tener lugar en el propio fragmento de enlace.

Según la presente invención cada grupo portador está unido al menos a un grupo farmacéutico. En otra forma de realización, el grupo del portador se prepara de modo que facilite la unión a más de un grupo farmacéutico, siendo cada grupo farmacéutico igual o diferente. Por ejemplo, el grupo portador puede comprender componentes que faciliten por sí mismos la unión de más de un grupo farmacéutico tales como los derivados de los aminoácidos naturales o la inserción de un aminoácido sintético multivalente, o puede estar específicamente adaptado para hacerlo así, por ejemplo mediante una red de restos de lisina ramificados que pueden estar unidos al grupo portador como grupo de enlace y cada resto de lisina se puede unir a un grupo farmacéutico. De esta manera un solo grupo portador puede llevar hasta 32 grupos de fármaco, preferentemente de 2 a 10 o más preferentemente de 4 a 5 grupos de fármaco. En esta otra forma de realización cada grupo farmacéutico se puede unir directa o indirectamente al grupo portador por el mismo o diferente fragmento de enlace. Cuando se une más de un tipo diferente de grupo farmacéutico, es posible coordinar las proporciones y dosis de los fármacos individuales para facilitar la administración de combinaciones de fármaco específicas.

Entre los ejemplos preferidos de esta forma de realización se incluyen los casos en que el grupo portador es penetratina con una red de restos de lisina unidos al menos a un extremo que facilita la unión de hasta 32 grupos de fármaco o cuando el grupo portador es penetratina o un derivado de la misma, los fragmentos de enlace son succinimidopropionoilo y los grupos de fármaco se seleccionan de entre podofilotoxina (en ambos extremos del grupo portador) o epipodofilotoxina junto con uno de camptotecina o paclitaxel.

En una forma de realización particularmente preferida de la invención, el grupo portador es penetratina o un derivado de la misma que está unido directamente a un grupo de fármaco seleccionado de entre doxorrubicina, metotrexato, podofilotoxina (y derivados de la misma), etopósido, camptotecina, paclitaxel, doxorrubicina, roscovitina y bohemina.

En otra forma de realización de la invención, el sistema de administración puede comprender además un grupo de direccionamiento. El grupo de direccionamiento es capaz de dirigir el sistema de administración al tipo de célula específico al que es preferible para que funcione el grupo farmacéutico. Así pues, el grupo de direccionamiento actúa como un sistema de dirección que predispone la distribución natural de los cuerpos de los fármacos o al sistema de distribución a un determinado tipo celular. El grupo de direccionamiento puede estar unido al grupo farmacéutico o más preferentemente al grupo portador.

Los grupos de direccionamiento adecuados incluyen las secuencias de péptidos identificadas por E. Ruoslahti et al. en la patente U.S. nº 5.622.699; Pasqualini, R. Ruoslahti, E. Nature (Londres) (1996), 380, 364-366, Ruoslahti, E. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. (1996), 12, 697-715: Arap, W, Pasqualini, R. Ruoslahti, E, Science (1998), 279, 377-380. Estas descripciones, describen determinados péptidos que se ha descubierto que actúan como marcadores de dirección para determinados tipos de células. Dichos péptidos cuando se unen al fármaco o más preferentemente, al grupo portador dirigirán el sistema de administración, a la llegada en la que el grupo portador facilitará la introducción celular del grupo farmacéutico.

Los sistemas de administración descritos en la presente invención son nuevas entidades químicas. Las entidades químicas específicas descritas en esta memoria incluyen:

1

El efecto terapéutico resultante de la administración del sistema de administración puede proceder del sistema de administrador intacto o de cualquiera de sus componentes disociados que incluyan el grupo farmacéutico, es decir, el grupo farmacéutico solo o unido al conectador, parte del conectador o el conectador y parte del portador. De este modo la expresión "sistema de administración" se ha utilizado en esta memoria para que tenga su significado ordinario es decir, el de administrar algo tal como el grupo farmacéutico y además incluir el sistema o cualquier parte del mismo como activa en su estado intacto. Por lo tanto, las ventajas proporcionadas por el sistema expuesto anteriormente son aplicables al sistema farmacéutico y de administración.

Los vectores de administración se pueden preparar por cualquiera de los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el péptido pAntp se puede acoplar utilizando procedimientos de síntesis de péptidos en solución o en fase sólida convencionales, dando un precursor totalmente protegido con solo el grupo amino terminal en forma reactiva desprotegida. Esta función puede hacerse reaccionar a continuación directamente con un grupo farmacéutico o con derivado reactivo adecuado de un grupo farmacéutico. Como alternativa, se puede transformar el grupo amino en un grupo funcional adecuado diferente para la reacción con un grupo farmacéutico o con un conectador. Así pues, p. ej., la reacción del grupo amino con el anhídrido succínico proporcionará un grupo carboxilo selectivamente dirigible, mientras que otra prolongación de la cadena del péptido con un derivado de cisteína producirá un grupo tiol selectivamente dirigible. Una vez se ha obtenido un grupo funcional adecuado selectivamente dirigible en el precursor del vector de administración, se puede conectar un grupo farmacéutico o un derivado del mismo mediante, p. ej., la formación del enlace amida, éster o disulfuro. Como alternativa, se introduce un fragmento de enlace, p. ej., m-maleimidobenzoilo, por reacción de un precursor del fragmento de enlace con la función selectivamente dirigible del precursor del vector de administración, seguido de la formación de un enlace covalente entre el fragmento de enlace y el grupo farmacéutico. Se pueden obtener construcciones multivalentes del fármaco-vector de administración, entre otras, por prolongación sucesiva del precursor del vector de administración selectivamente dirigible con grupos químicos trivalentes. Así pues la extensión de la cadena del péptido, p. ej., con derivados de Lys protegidos por N^{\alpha,\varepsilon}-Fmoc darán precursores de la construcción di-, tetra- y octa-valente después de uno, dos o tres ciclos de acoplamiento/desprotección de Fmoc.

Utilizando estos procedimientos, el experto será capaz de preparar una amplia variedad de conjugados fármaco-portador utilizando una variedad de fragmentos de enlace. Como en los ejemplos más adelante, se puede seleccionar un grupo apropiado en el grupo farmacéutico para la unión al grupo portador y si se desea un conectador unido al grupo farmacéutico o portador o ambos antes de su acoplamiento.

Los compuestos de la presente invención pueden ser formulados con un diluyente o portador fisiológicamente aceptable para su utilización como productos farmacéuticos tanto para utilización veterinaria, por ejemplo en mamíferos, como particularmente para utilización humana por varios procedimientos. Por ejemplo, se pueden aplicar como una composición que incorpora un diluyente o portador líquido, por ejemplo una solución, suspensión o emulsión acuosa o aceitosa, que se puede emplear con frecuencia en forma inyectable para administración parenteral y por lo tanto puede estar adecuadamente esterilizada y exenta de pirógenos. Se puede utilizar también la administración oral y aunque las composiciones con este fin pueden incorporar un diluyente o portador líquido, es más corriente utilizar un sólido, por ejemplo un material portador sólido convencional tales como almidón, lactosa, dextrina o estearato de magnesio. Dichas composiciones sólidas pueden tomar la forma de polvos pero son más convenientemente de un tipo en forma de, por ejemplo, comprimidos, sellos o cápsulas (incluyendo las cápsulas unidas). Tipos alternativos, más especializados de formulación incluyen los liposomas y las nanopartículas.

Otros tipos de administración por inyección o por vía oral que son de utilización tanto en los contextos humano como veterinario incluyen la utilización de supositorios u óvulos vaginales. Otra forma de composición farmacéutica es una para administración bucal o nasal o administración a las vías respiratorias tal como el tejido alveolar. Otras formulaciones de administración tópica incluyen lociones, pomadas, cremas, geles y atomizadores.

Las composiciones se pueden formular en una forma de dosificación unitaria, es decir, en forma de partes discretas que contienen una dosis unitaria o múltiple o una subunidad de una dosis unitaria.

Tal como se describe en los Ejemplos más adelante, el sistema de administración de la presente invención proporciona varias ventajas sobre los sistemas de administración conocidos para los sistemas de administración sin péptido/oligonucleótidos. Estas ventajas incluyen la mejor eficacia en comparación con los tratamientos convencionales, mejor absorción celular del agente terapéutico, mejor solubilidad en agua, reducción de los efectos secundarios y biodisponibilidad celular y disminución de la aparición de la resistencia al fármaco.

Ejemplos Abreviaturas

La nomenclatura de aminoácidos y péptidos se ajusta a las reglas de la IUPAC-IUB (Eur. J. Biochem. 1984, 138, 9-37). Otras abreviaturas: AcOH, ácido acético; Boc, tert-butiloxicarbonilo; Bu^{t}, tert-butilo; DE MALDI-TOF MS, espectrometría de masas por tramos por ionización con desorción por láser asistida por matriz con extracción retardada; DIC, 1,3-diisopropilcarbodiimida; DIEA, diisopropiletilamina; DMAP,4-dimetil-aminopiridina; DMEM, medio de Eagle modificado por Dulbecco; DMF, dimetilformamida; Et_{3}N, trietilamina; EtOAc, acetato de etilo; Et_{2}O, éter dietílico; FCS, suero de ternero fetal; HOBt, 1-hidroxibenzotriazol; MeCN, acetonitrilo; MeOH, metanol; RMN, espectroscopia de resonancia magnética nuclear; PE, fracción de punto de ebullición 40-60ºC de éter de petróleo; PBS, solución salina tamponada con fosfato; Pmc, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo; PyBOP, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio; RP-HPLC, cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa; TFA, ácido trifluoracético; Trt, trifenilmetilo.

General

Se efectuó una RP-HPLC utilizando columnas Vydac 218TP54 (4,5 \times 250 mm) y 218TP1022 (22 \times 250 mm) con fines analíticos y de preparación, respectivamente. Los caudales fueron 1 ml/min para la serie analítica y 9 ml/min para la preparativa. Se efectuó la elución con gradiente (constante 25ºC) utilizando cantidades crecientes de MeCN en agua (conteniendo una concentración constante de TFA al 0,1%) durante 20 min (analítica) ó 40 min (preparativa). La cromatografía de flash se realizó según describe (W.C. Still, M. Kahn, A. Mitra, J. Org. Chem., 1978, 43, 2923-2925) utilizando gel de sílice 60 de Merck, de 230 a 240 mesh. Se realizó la síntesis del péptido utilizando un sintetizador de péptidos 433A de ABI (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Los derivados de aminoácidos fueron de Novabiochem AG, Läufelfingen, Suiza, excepto Fmoc-D-Ile-OH, que era de Bachem AG, Bubendorf, Suiza. Se aplicaron los protocolos de síntesis normalizados (programas "FastMoc MonPrevPk" a escala 0,1 mmol ó 0,25 mmol) basados en la estrategia de protección con Fmoc (G.B. Fields, R.L. Noble, Intl. J. Peptide Protein Res., 1990, 35, 161). Se escindieron las resinas de peptidilo y se desprotegieron utilizando el siguiente reactivo: fenol, agua, tioanisol, 1,2-etanoditiol, TFA 0,75:0,5:0,5:0,25:10 (p/v/v/v/v) (D.S. King, C.G. Fields, G.B. Fields, Intl. J. Peptide Protein Res., 1990, 36, 255). Se realizó DE MALDI-TOF MS utilizando un espectrofotómetro (Thermo BioAnalysis, Hemel Hempstead, Inglaterra). La matriz utilizada fue un ácido ciano-4-hidroxicinnámico. Se calibró el espectrofotómetro utilizando péptidos auténticos con masas apropiadas. Se registraron los espectros RMN en un instrumento DPX300 de Brucker. Paclitaxel, podofilotoxina y 10-hidroxi-camptotecina fueron de Hande Tech Development Co. USA Inc, Houston, TX, USA. Se preparó 4'-desmetilepipodofilotoxina tal como describe (M. Kuhn, C. Keller-Juslén, A. von Wartburg, Helv. Chim. Acta, 1969, 52, 944). Se preparó roscovitina esencialmente como describe (L. Havlicek, J. Hanus, J. Vesely, S. Leclerc, L. Meijer, G. Shaw, M. Strnad. J. Med. Chem. 1977, 40, 408). Se sintetizó igualmente bohemina (6-(benzil-amino)-2-[(3-(hidroxi-propil)amino]-9-isopropilpurina). Se utilizaron en todo el experimento DMF anhidro, ClCH_{2}CH_{2}Cl y CH_{2}Cl_{2}, almacenados sobre tamices moleculares de 4A.

Ejemplo 1 Resina de H-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)

Se montó la secuencia del péptido en Fmoc-Lys(Boc)-[(4-(hidroximetil)fenoxiacetil)-resina] (ABI 401425; 0,5 mmol/g). Se lavó la resina de peptidilo (1,37 g, 100%) final con Et_{2}O y se secó al vacío. Para demostrar la integridad química de este producto intermedio, se escindió una alícuota pequeña de resina de peptidilo y se desprotegió, seguido de análisis del producto H-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH en bruto, que puso de manifiesto una pureza >90% (anal. RP-HPLC) y la identidad química (DE MALDI-TOF MS y análisis cuantitativo de aminoácidos).

Resina de [H-Glu(OBu^{t})-Gly-\betaAla]_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)

Se aciló la resina de peptidilo (137 mg, 25 \mumol) anterior con Fmoc-\betaAla-OH (47 mg, 0,15 mmol), PyBOP (78 mg, 0,15 mmol), HOBt (20 mg, 0,15 mmol) y DIEA (39 \mul, 0,225 mmol) en DMF (2 ml) durante 2 h. Se desprotegió a continuación Fmoc con piperidina al 20% en DMF durante 20 min y se lavó extensamente con DMF. El producto se amplió más mediante dos sucesivos ciclos de acilación y desprotección utilizando Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (0,15 mmol en el primer ciclo; 0,3 mmol en el segundo ciclo) utilizando las etapas de acoplamiento y desprotección similares. Esto fue seguido de prolongación de la cadena posterior con Fmoc-Gly-OH (0,6 mmol) y Fmoc-Glu(OBu^{t})-OH (0,6 mmol), utilizando de nuevo condiciones de acilación y desprotección del Fmoc similares. El producto se desprotegió con Fmoc y se lavó extensamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O, seguido de secado al vacío. Para demostrar la integridad química de este producto intermedio, se escindió una pequeña alícuota de resina de peptidilo y se desprotegió la cadena lateral, seguido de análisis del producto [H-Glu-Gly-\betaAla]_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH en bruto, que puso de manifiesto una pureza (>89%; RP-HPLC, gradiente en MeCN del 15 al 25%, t_{R}= 17,7 min, \lambda = 200-300 nm) y la identidad (DE MALDI-TOF MS: [M+H]^{+} = 3732. C_{165}H_{269}N_{53}O_{44}S = 3731,30).

Resina de {[4-[N-(2,4-diamino-6-pteridinil-metil)-N-metilamino]benzoil]-Glu(OBu^{t})-Gly-\betaAla}_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)

Se hizo reaccionar la resina de peptidilo (76 mg, 25 \mumol) anterior toda la noche a temperatura ambiente con dihidrato de hemihidrocloruro del ácido 4[N-(2,4-diamino-6-pteridinilo-metil)-N-metilamino]benzoico (76 mg, 0,2 mmol) y PyBOP (104 mg, 0,2 mmol), HOBt (27 mg, 0,2 mmol) y DIEA (70 \mul, 0,4 mmol) en DMF (2 ml). Se lavó el producto sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O y se secó al vacío para dar el compuesto del título (85 mg de resina de peptidilo naranja).

{[4-[N-(2,4-diamino-6-pteridinil-metil)-N-metilamino]benzoil]-Glu-Gly-\betaAla}_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH

2

Se escindió y se desprotegió el producto anterior (reactivo de escisión 12 ml, 1,5 h). El resto de resina se filtró a continuación y se lavó en un filtro sinterizado con pequeñas alícuotas de TFA puro. El filtrado y los lavados mezclados se trataron con Et_{2}O (100 ml) y se enfriaron. Se recogió el producto precipitado por centrifugación y se decantó el sobrenadante etéreo. Se lavó el producto tres veces más con Et_{2}O de manera similar. Se secó al vacío el producto final en bruto (61 mg de polvo naranja). Se redisolvió este material en TFA al 0,1% acuoso (4 ml) y se filtró. Se aplicó la solución resultante (dos series independientes) en una columna de RP-HPLC de preparación (series de gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5%) se recogieron las fracciones de los picos, se analizaron (RP-HPLC analítica) y se agruparon de forma apropiada. Después de centrifugación al vacío, se obtuvo el compuesto del título puro (13,5 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,8 (gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5%; pureza > 99%, \lambda = 200-300 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{-}= 4962 (C_{225}H_{321}N_{81}O_{48}S = 4960,54).

Ejemplo 2 H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH

Se aciló la resina de H-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc) (véase ejemplo 1; 411 mg, 75 \mumol) con Fmoc-Cys(Trt)-OH (264 mg, 0,45 mmol), PyBOP (234 mg, 0,45 mmol), HOBt (61 mg, 0,45 mmol) y DIEA (0,12 ml, 0,675 mmol) en DMF (3 ml) durante 3 h. Se lavó la resina de peptidilo resultante con DMF (3 \times 5 min, 25 ml cada uno), se desaguó y se trató con piperidina al 20% en DMF durante 20 min. Después de la filtración del reactivo, el producto resina de H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc) se lavó sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O, antes de secarse al vacío. Este producto se escindió/desprotegió (2 h). Se filtró a continuación el residuo de resina y se lavó en un filtro sinterizado con pequeñas alícuotas de TFA puro. El filtrado y los lavados mezclados se trataron con Et_{2}O (100 ml) y se enfriaron. Se recogió el producto precipitado por centrifugación y se decantó el sobrenadante etéreo. Se lavó el producto tres veces más con Et_{2}O de manera similar. Se secó al vacío el producto final en bruto (238 mg). Se redisolvió una alícuota (119 mg) de este material en TFA acuoso al 0,1% (2 ml) y se filtró. Se purificó la solución resultante por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5%). Se recogieron las fracciones de los picos, se analizaron (RP-HPLC analítica) y se agruparon de forma apropiada. Después de centrifugación al vacío, se obtuvo el compuesto del título puro (60,9 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,8 (gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5%; pureza > 99%, \lambda = 214 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{-}= 2351 (C_{107}H_{173}N_{35}O_{21}S_{2} = 2349,87).

N-[3-(maleimido)benzoil]doxorrubicina

3

Se disolvió hidrocloruro de doxorrubicina (5,9 mg, 10 \mumol) en agua (1 ml) y DMF (0,5 ml). Se añadió tampón (fosfato acuoso 0,1 M, pH 7,2; 0,5 ml) en agitación. A la suspensión resultante se añadió gota a gota N-hidroxisuccini-
mida éster del ácido 3-maleimidobenzoico (12,9 mg, 40 \mumol) en DMF (1 ml). Se clarificó temporalmente la mezcla de reacción de color rojo y después de aprox. 10 min se observó precipitación. Se controló la evolución de la reacción por análisis RP-HPLC y después de 2 h toda la doxorrubicina había reaccionado. Se diluyó la mezcla a continuación con H_{2}O (1,5 ml), se enfrió a 4ºC y se centrifugó. Se decantó el sobrenadante. Se redisolvió el sedimento residual en DMF (1 ml) y se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (2 ml). Se aplicó esta solución a un cartucho de extracción en fase sólida (Merck LiChrolut RP-18, 500 mg; sucesivamente preacondicionado con MeOH y TFA acuoso al 0,1%); se lavó el cartucho con TFA acuoso al 0,1% (4 ml) y se eluyó con MeCN/H_{2}O 6:4 (conteniendo TFA al 0,1%) en dos fracciones (2 \times 4 ml). La primera fracción contenía el compuesto del título y se utilizó directamente en la etapa siguiente.

N-{3-[3-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)succinimido]benzoil}doxo-rrubicina

4

Se diluyó la solución de N-[3-(maleimido)benzoil]doxorrubicina anterior con DMF (1 ml) y se añadió Et_{3}N (50 \mul). La solución se volvió marrón oscura. Se añadió a continuación H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (5 mg), disuelto en DMF (1 ml). Se agitó la mezcla y se observó el color marrón al descargar, dejando una solución roja clara. Se controló la reacción por análisis RP-HPLC. Después de 1,5 h, toda la 3-(maleimido)benzoil]doxorrubicina había reaccionado. Se acidificó esta solución con AcOH (0,5 ml), se diluyó con agua (3 ml) y se aplicó a un cartucho de extracción en fase sólida (Merck LiChrolut RP-18, 500 mg). Se lavó el cartucho con TFA acuoso al 0,1% (6 ml) y se eluyó (6 ml de 6: 4MeCN/H_{2}O (conteniendo TFA al 0,1%). Se secó el eluido por centrifugación al vacío. Se redisolvió el residuo en TFA acuoso al 0,1% (2 ml), se filtró y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN del 20 al 40%). Se recogieron las fracciones del pico, se controlaron (RP-HPLC analítica) y se agruparon de forma apropiada. Después de la centrifugación al vacío, se obtuvo el compuesto del título puro (1,2 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,6 y 15,8 min (diastereoisómeros de tioéter parcialmente resueltos) (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 95%, \lambda = 200-300 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3094, [M + 2 H]^{2+} = 1548 (C_{145}H_{207}N_{37}O_{35}S_{2}= 3092,56).

Ejemplo 3 H-Cys-D-Lys-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Met-D-Arg-D-Arg-D-Asn-D-Gln-D-Phe-D-Trp-D-Ile-D-Lys-D-Ile-D-Gln-D-Arg-NH_{2}

Partiendo de la resina de amida AM de Rink (0,64 mmol/g; Novabiochem), se montó la secuencia de la resina H-Cys(Trt)-D-Lys(Boc)-D-Lys(Boc)-D-Trp-D-Lys(Boc)-D-Met-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-D-Asn(Trt)-D-Gln(Trt)-D-
Phe-D-Trp-D-Ile-D-Lys(Boc)-D-Ile-D-Gln (Trt)-D-Arg(Pmc) con rendimiento cuantitativo. Se escindió/desprotegió la resina de peptidilo (10 ml de reactivo de escisión/g; 2 h) y se aisló el péptido en bruto por precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Una alícuota (100 mg) de este material se redisolvió en TFA acuoso al 0,1% (2 ml) y se filtró. Se purificó la solución resultante por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 17,5 a 27,5%) para dar, después de centrifugación al vacío, el compuesto del título puro (36,4 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 16,3 min (gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5%; pureza > 99%, \lambda = 214 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2350,1 (C_{107}H_{174}N_{36}O_{20}S_{2}= 2348,89).

N-{3-[3-(H-Cys-D-Lys-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Met-D-Arg-D-Arg-D-Asn-D-Gln-D-Phe-D-Trp-D-Ile-D-Lys-D-Ile-D-Gln-D-Arg-NH_{2})succinimido]benzoil}doxorrubicina

5

Se disolvieron N-[3-(maleimido)benzoil]doxorrubicina (12,6 mg, 17 \mumol) y H-Cys-D-Lys-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Met-D-Arg-D-Arg-D-Asn-D-Gln-D-Phe-D-Trp-D-Ile-D-Lys-D-Ile-D-Gln-D-Arg-NH_{2} (20 mg, 8,5 \mumol) en DMF (1 ml) y se añadió Et_{3}N (100 \mul). Se agitó la mezcla durante 2 h, se enfrió por adición de AcOH (0,5 ml), se diluyó con agua (0,5 ml) y se filtró. Se purificó el filtrado por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 20 a 40%) para dar el compuesto del título puro como un sólido rojo (6,3 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 16,3 min (gradiente de MeCN de 0 al 60%; pureza > 95%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{-}= 3092,7, (C_{145}H_{208}N_{38}O_{34}S_{2}= 3091,57).

Ejemplo 4 2'-(maleimidopropionoil)paclitaxel

6

Se agitó durante 1 h una mezcla de paclitaxel (29,2 \mumol, 25 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (0,120 mmol, 203, mg) y DIC (66 \mumol, 10,3 \mul) en piridina (1 ml). Se evaporó el disolvente, se trató el residuo con agua y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. Se lavó la fase orgánica con agua y salmuera y se secó sobre MgSO_{4}. Se evaporó el disolvente a sequedad para dar 22,2 mg (76%) de un sólido incoloro, que se recristalizó en EtOAc/hexano para dar el compuesto del título puro. ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,13, 1,22, 1,68, 1,91 (s, cada 3H, CH_{3}), 2,23, 2,47 (s, cada 3H, Ac-CH_{3}), 2,35 (m, 2H, H6), 2,78 (t, 4H, J = 5,40 Hz, CH_{2}), 2,84 (m, 2H, H14), 3,81 (m, 2H, CH_{2}), 3,87 (m, 1H, H3), 4,26 (m, 2H, H20), 4,44 (dd, 1H, J = 10,87, 4,25 Hz, H7), 4,98 (d, 1H, J = 7,69 Hz, H5), 5,47 (d, 1H, J = 3,45 Hz, H2'), 5,68 (d, 1H, J = 7,09 Hz, H3'), 6,05 (dd, 1H, J = 9,28, 5,86 Hz, H_{2}O), 6,28 (s, 1H, H10), 6,18 (t, 1H, J = 8,77 Hz, H13), 6,49 (s, 2H, CH=CH), 8,16-7,34 (m, 15H, Ph), ^{13}C-RMN (75 MHz; CDCl_{3}) \delta: 10,01, 15,20, 21,22, 22,54, 23,09, 27,18, 32,90, 33,71, 35,90, 43,54, 45,96, 52,86, 58,89, 72,18, 72,53, 74,86, 75,51, 76,02, 79,52, 81,42, 84,89, 126,94, 127,91, 128,74, 128,94, 129,14, 129,45, 129,59, 130,65, 132,39, 133,11, 133,85, 134,09, 134,46, 137,17, 143,25, 167,45, 168,10, 169,77, 170,29, 171,10, 171,69, 204,24.

2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]pacli-taxel

7

A una solución de 2'-(maleimidopropionoil)paclitaxel (10 \mumol, 10,05 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (10 \mumol, 23,5 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,39 \mul, 10 \mumol). Se agitó la mezcla de reacción durante 1 h. Se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (0,5 ml), se filtró y purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%). Se obtuvo el compuesto del título puro (20,5 mg, 62%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,4 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3355,9 (C_{161}H_{229}N_{37}O_{38}S_{2}= 3354,90).

Ejemplo 5 4(5)-carboxifluoresceína-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2}

Se montó la secuencia del péptido en resina AM de amida de Rink (0,65 mmol/g, 385 mg; Novabiochem) para dar la resina de H-\betaAla-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly (1,50 g, cuantitativo). Se agitó una alícuota de esta resina de peptidilo (450 mg, 75 \mumol) durante 18 h en la oscuridad con una solución de 4(5)-carboxifluoresceína (113 mg, 0,3 mmol), PyBOP (156 mg, 0,3 mmol), HOBt (41 mg, 0,3 mmol) y DIEA (78 \mul, 0,45 mmol) en DMF (4 ml). Se recogió la resina en un filtro sinterizado y se lavó sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O. Después del secado, se trató la resina con reactivo de escisión (5 ml, 1,5 h) en la oscuridad. Se aisló el producto por precipitación con Et_{2}O y centrifugación (237 mg de polvo amarillo). Se purificó una alícuota (100 mg) por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 22,5 a 32,5%) para dar el compuesto del título puro (36,9 mg) como una película amarilla después del aislamiento por centrifugación al vacío. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 18,6 y 19,2 min (isómeros geométricos de 4- y 5-carboxifluoresceína resueltos) (gradiente de MeCN del 22,5 al 32,5%; pureza > 99%, \lambda = 214 nm). DE MALDI-TOF MS: [M-H]^{-}= 2892,2 [M-Na]^{+} = 2913,7 (C_{135}H_{195}N_{39}O_{29}S_{2}= 2892,4).

2'-[succinimidopropionoil-(4(5)-carboxifluoresceína-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})]paclitaxel

\vskip1.000000\baselineskip

8

A una solución de 2'-(maleimidopropionoil)paclitaxel (12,3 \mumol, 12,4 mg) y 4(5)-carboxifluoresceína-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2}(4,3 \mumol, 12,5 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,8 \mul). Se agitó la mezcla de reacción durante 1 h. Se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (0,5 ml), se filtró y purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el compuesto del título puro (3,2 mg) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 21,6 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3397,35 (C_{189}H_{251}N_{41}O_{46}S_{2}= 3397,40).

Ejemplo 6 H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}

Partiendo de la resina de amida AM de Rink (0,69 mmol/g; Novabiochem), se montó la secuencia de la resina H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc).Después de la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se purificaron alícuotas (total 472 mg) por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 16,5 a 26,5%) para dar el compuesto del título puro (109,9 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 16,0 min (gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5%; pureza > 99%, \lambda = 214 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{-}= 2349,3 (C_{107}H_{174}N_{36}O_{20}S_{2}= 2348,89).

2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]pacli-taxel

\vskip1.000000\baselineskip

9

A una solución de 2'-(maleimidopropionoil)paclitaxel (9 \mumol, 9 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (9 \mumol, 20,9 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,8 \mul). Se agitó la mezcla de reacción durante 1 h. Se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (0,5 ml), se filtró y purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%). Se obtuvo el compuesto del título puro (15,9 mg, 53%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 18,5 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3353,6 (C_{161}H_{230}N_{38}O_{37}S_{2}= 3353,91).

Ejemplo 7 H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}

Partiendo de la resina de amida AM de Rink (0,69 mmol/g; Novabiochem), se montó la secuencia de la resina H-Cys(Trt)-\betaAla-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc). Después de la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se purificaron alícuotas (total 246 mg) por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 6,5 a 16,5%) para dar el compuesto del título puro (106,4 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,8 min (gradiente de MeCN del 6,5 al 16,5%; pureza > 95%, \lambda = 214 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1205,4 (C_{52}H_{92}N_{20}O_{9}S_{2}= 1205,55).

2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]paclitaxel

10

A una solución de 2'-(maleimidopropionoil)paclitaxel (17 \mumol, 17,4 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (15 \mumol, 18,1 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,0 \mul). Se agitó la mezcla durante 1 h, se filtró y purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%). Se obtuvo el compuesto del título puro (9,4 mg) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,2 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2211,7 (C_{106}H_{148}N_{22}O_{26}S_{2}= 2210,57).

Ejemplo 8 2'-metoxiacetil-7-(maleimidopropionoil)paclitaxel

11

Se calentó a reflujo durante 4 h una solución de paclitaxel (29 \mumol, 25 mg), éster N-hidroxisuccinimidílico del ácido metoxiacético (0,176 mmol, 32,8 mg) y de DIEA (0,176 mmol, 30,6 \mul) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml). Se añadió metanol (1,6 \mul). Después de agitar durante 10 min, se lavó la mezcla de reacción con HCl acuoso 0,1 M, agua, salmuera y se secó en MgSO_{4}. Se evaporó el disolvente al vacío para dar 2'-(metoxiacetil)paclitaxel como un sólido blanco (24,8 mg, 91%). Este material (30 \mumol), junto con el ácido 3-maleimidopropiónico, DIC (14,1 \mul, 90 mmol) y DMAP (20 \mumol, 2,6 mg) se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (2,5 ml) y se agitó la mezcla durante 40 min. Se lavó con agua y se secó en MgSO_{4}. Se eliminó el disolvente al vacío para dar un sólido amarillo claro. Se redisolvió en DMF/MeOH, se filtró y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 20 a 70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (24,4 mg, 76%). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 21,8 min (gradiente de MeCN del 10 al 70%; pureza > 98%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,15, 1,20, 1,79, 1,96 (s, cada 3H, CH_{3}\times4), 2,20, 2,45 (s, cada 3H, Ac-CH_{3}\times2), 2,34 (m, 2H, H6), 2,63 (m, 4H, H14, CH_{2}), 3,40 (s, 3H, OCH_{3}), 3,73-3,94 (m, 3H, CH_{2}, H3), 4,16-4,21 (m, 2H, H20), 4,97 (d, 1H, J = 8,06 Hz, H5), 5,54-5,69 (m, 3H, H7, H2, H3'), 5,98 (m, 1H, H2'), 6,22 (s, 1H, H10), 6,24 (m, 1H, H13), 6,68 (s, 2H, CH=CH), 7,12-8,13 (m, 15H, Ph).

2'-metoxiacetil-7-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]paclitaxel

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12

A una solución de 2'-metoxiacetil-7-(maleimidopropionoil)paclitaxel (11 \mumol, 12,3 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (11 \mumol, 26,8 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,58 \mul, 11 \mumol). Se agitó la mezcla de durante 2 h, se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (0,5 ml), y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%). Se obtuvo el compuesto del título puro (15,5 mg, 40%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,1 min (gradiente de MeCN del 0 al 70%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3425,99 (C_{164}H_{233}N_{37}O_{40}S_{2}= 3424,96).

7-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]paclita-xel

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13

A una solución de 2'-metoxiacetil-7-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]paclitaxel (35 \mumol, 11,9 mg) en MeOH (1 ml) se añadió etanolamina (0,21 \mul). Se agitó la mezcla durante 1 h se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (0,5 ml), se filtró y purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%). Se obtuvo el compuesto del título puro (5,6 mg, 48%). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,3 min (gradiente de MeCN del 10 al 70%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3355,7 (C_{161}H_{229}N_{37}O_{38}S_{2}= 3354,90).

Ejemplo 9 2'-(p-metoxitritil)paclitaxel

14

Una solución de paclitaxel (0,632 mmol, 540 mg) y cloruro de p-metoxitritilo (10 mol, eq) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml) se trató con piridina (1,3 ml) en N_{2}. Después de agitar la mezcla durante 22 h, se evaporaron los disolventes al vacío. Se redisolvió el residuo en EtOAc, se lavó con agua y salmuera y se secó en MgSO_{4}. Se evaporó el disolvente para dar un sólido amarillo claro que se purificó por cromatografía de flash (EtOAc/PE 8:9) para dar el compuesto del título puro con rendimiento cuantitativo.

La recristalización en EtOAc/CH_{2}Cl_{2} dio cristales amarillo claro. ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,08, 1,15, 1,51, 1,65, (s, cada 3H, CH_{3}\times4), 1,90 (m, 1H, H6), 2,25, 2,29 (s, cada 3H, Ac-CH_{3}\times2), 2,55 (m, 1H, H6), 2,54 (m, 2H, H14), 3,75 (s, 3H, OCH_{3}), 3,66 (m, 1H, H3), 4,20 (m, 2H, H20), 4,40 (m, 1H, H7), 4,62 (m, 1H, H2'), 4,94 (d, 1H, J=8,06 Hz, H5), 5,61 (m, 1H, H2), 5,70 (m, 2H, H13, H3'), 6,19 (s, 1H, H10), 6,72-8,08 (m, 29H, Ph).

2'-(p-metoxitritil)-7-(maleimidopropionoil)paclitaxel

15

2'-(p-metoxitritil)paclitaxel (35 \mumol, 38,4 mg) y piridina (125 \mul) se disolvieron en CH_{2}Cl_{2} (2 ml). Se añadió una solución de ácido 3-maleimidopropiónico (1,48 mmol, 250,5 mg), DIC (0,80 mmol, 101,5 mg) y DMAP (10 mg) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) y se agitó la mezcla durante 1 h. Se evaporó el disolvente y se dividió el residuo entre agua y CH_{2}Cl_{2}. Se lavó la capa orgánica con agua, salmuera y se secó en MgSO_{4}. Se eliminó el disolvente y se purificó el residuo por cromatografía en capa fina centrífuga de Chromatotron® (EtOAc/PE 5:4).

La recristalización en EtOAc/CH_{2}Cl_{2} dio el título del compuesto como un sólido incoloro (22 mg, 49%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,18, 1,12, 1,76, 1,96 (s, cada 3H, CH_{3}\times4), 2,17, 2,26 (s, cada 3H, Ac-CH_{3}\times2), 2,10, 2,34 (m, 2H, H6), 2,62 (m, 4H, H14, CH_{2}-Mim), 3,75 (s, 3H, OCH_{3}), 3,73-3,79 (m, 3H, CH_{2}-Mim, H3), 4,06 (m, 2H, H20), 4,61 (d, 1H, J = 3,47 Hz, H2'), 4,76 (d, 1H, J = 9,52 Hz, H5), 5,53 (m, 1H, H7), 5,60 (d, 1H, J = 6,98 Hz, H3'), 5,71 (m, 1H, H2), 6,14 (s, 1H, H10), 6,60 (m, 3H, H13, CH=CH), 6,75-7,79 (m, 29H, Ph).

7-(maleimidopropionoil)paclitaxel

16

Se agitó durante 4 h una solución de 2'-(p-metoxitritil)-7-(maleimidopropionoil)paclitaxel (17 \mumol, 22 mg), anisol (1,72 mmol, 186,4 mg) y ácido cloroacético (0,172 mmol, 16,3 mg) en CH_{2}Cl_{2} (10 ml). Se lavó la mezcla de reacción con Na_{2}CO_{3} acuoso al 1%, salmuera y se secó en MgSO_{4}. Se evaporó el disolvente a sequedad y se purificó el residuo por cromatografía en capa fina centrífuga de Chromatotron® (EtOAc/PE 1:1) para dar el compuesto del título puro como un sólido blanco (24 mg), que se recristalizó en EtOAc/CH_{2}Cl_{2}. ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,15, 1,18, 1,20, 1,76, 2,04 (s, cada 3H, CH_{3}\times4), 2,18, 2,37 (s, cada 3H, Ac-CH_{3}\times2), 2,34 (m, 2H, H6), 2,64 (m, 4H, H14, CH_{2}), 3,78-3,91 (m, 3H, CH_{2}, H3), 4,12(m, 2H, H20), 4,71 (d, 1H, J = 3,25 Hz, H2'), 4,94 (d, 1H, J = 8,17 Hz, H5), 5,54 (dd, 1H, J = 10,46, 7,21 Hz, H7), 5,66 (d, 1H, J = 6,88 Hz, H3'), 5,80 (dd, 1H, J = 8,92, 2,42 Hz, H2), 6,15 (s, 1H, H13), 6,18 (s, 1H, H10), 6,68 (s, 2H, CH=CH), 7,10-8,12 (m, 15H, Ph).

17

A una solución de 7-(maleimidopropionoil)paclitaxel (4,8 \mumol, 4,8 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (4,8 \mumol, 11,2 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (0,67 \mul). Se agitó la mezcla durante 30 min, se filtró y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (8,6 mg, 54%). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,3 min (gradiente de MeCN del 10 al 70%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3355,0 (C_{161}H_{229}N_{37}O_{38}S_{2}= 3354,90).

Ejemplo 10 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina

18

Se agitó durante 1 h una solución de podofilotoxina (60 \mumol, 25,6 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (0,31 mmol, 52,4 mg), DIC (0,17 mmol, 21,5 mg) y DMAP (80 \mumol, 10 mg) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml). Se evaporó el disolvente al vacío y se redisolvió el residuo en DMF/MeOH (1 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 20 a 70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (7,3 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 20,1 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 95%).^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,66-2,71 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH_{2}), 2,82-2,84 (m, 2H, H2 y H3), 3,69 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,75 (s, 3H, OCH_{3}), 3,83 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH_{2}), 4,12 (t, J = 9,92 Hz, 1H, H11), 4,31 (m, 1H, H11), 4,53 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H1), 5,80 (d, J = 8,7 Hz, 1H, H4), 5,92 (dd, J = 5,49, 1,17 Hz, 2H, OCH_{2}O), 6,32 (s, 2H, H2' 6'), 6,47 (s, 1H, H8), 6,66 (s, 2H, CH=CH), 6,74 (s, 1H, H5).

4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]podofi-lotoxina

19

A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (8 \mumol, 5 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (7,7 \mumol, 18 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,06 l, 11,4 \mumol). Se agitó la mezcla de durante 30 min, se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (0,5 ml), se filtró y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 60%) para dar el compuesto del título puro (7,8 mg, 35%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 12,8 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2915,34 (C_{136}H_{200}N_{36}O_{32}S_{2}= 2915,40).

Ejemplo 11 Biotinamidocaproil-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2}

Se agitó la resina de H-\betaAla-Arg (Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys (Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Gly (450 mg, 75 \mumol) con una solución de éster N-hidroxisuccinimidílico del ácido biotinamidocaproico (136 mg, 0,3 mmol), HOBt (41 mg, 0,3 mmol) y DIEA (105 \mul; 0,6 mmol) en DMF (3 ml) durante 18 h. Se recogió la resina de peptidilo en un filtro sinterizado y se lavó sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O. Después del secado al vacío, se trató la resina con reactivo de escisión (5 ml, 1,5 h). Se aisló el péptido biotinilado por precipitación con Et_{2}O y centrifugación (244 mg de producto). Se purificó una alícuota (120 mg) por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 20 a 30%) para dar el compuesto del título puro (63,8 mg) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 16,7 min (gradiente de MeCN del 20 al 30%; pureza > 99%, \lambda = 214 nm). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2874,3, [2M + H]^{+}= 5738,7, [M + H]^{2+}= 1437,8 (C_{130}H_{210}N_{42}O_{26}S_{3}= 2873,52).

4-[succinimidopropionoil-(biotinamidocaproil-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})]podofilotoxina

20

A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (7 \mumol, 4 mg) y biotinamidocaproil-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2} (7 \mumol, 20,7 mg) en DMF (0,5 ml) se añadió Et_{3}N (1,0 \mul). Se agitó la mezcla de reacción durante 1 h, se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (0,5 ml), se filtró y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%). Se obtuvo el compuesto del título puro (2,2 mg) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,2 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3438,9 (C_{159}H_{237}N_{43}O_{37}S_{2}= 3439,05).

Ejemplo 12 4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]podofi-lotoxina

21

A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (20 \mumol, 12,2 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (15 \mumol, 34,7 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (5 \mul). Se agitó la mezcla de reacción durante 40 min y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (30,1 mg, 69%). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,8 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}=2914,4 (C_{136}H_{201}N_{37}O_{31}S_{2}= 2914,41).

Ejemplo 13 H-Cys-D-Arg-D-Gln-D-Ile-D-Lys-D-Ile-D-Trp-D-Phe-D-Gln-D-Asn-D-Arg-D-Arg-D-Nle-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH_{2}

Partiendo de la resina de amida AM de Rink (0,69 mmol/g; Novabiochem), se montó la secuencia de la resina H-Cys(Trt)-D-Arg(Pmc)-D-Gln(Trt)-D-Ile-D-Lys(Boc)-D-Ile-D-Trp-D-Phe-D-Gln(Trt)-D-Asn(Trt)-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-D-Nle-D-Lys(Boc)-D-Trp-D-Lys(Boc)-Lys(Boc). Después de la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se purificaron alícuotas (total 246 mg) por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 17,5 a 27,5%) para dar el compuesto del título puro (45,9 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 16,9 min (gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5%; pureza > 99%, \lambda = 214 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2330,3 (C_{108}H_{176}N_{36}O_{20}S= 2330,85).

4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-D-Arg-D-Gln-D-Ile-D-Lys-D-Ile-D-Trp-D-Phe-D-Gln-D-Asn-D-Arg-D-Arg-D-Nle-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH_{2})]podofilotoxina

22

A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (11 \mumol, 6,2 mg) y H-Cys-D-Arg-D-Gln-D-Ile-D-Lys-D-Ile-D-Trp-D-Phe-D-Gln-D-Asn-D-Arg-D-Arg-D-Nle-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH_{2} (7 \mumol, 17 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,4 \mul). Se agitó la mezcla de reacción durante 30 min, se filtró y purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (10,5 mg, 52%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,8 min (gradiente de MeCN de 0 a 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2895,66 (C_{137}H_{203}N_{37}O_{31}S_{2}= 2896,37).

Ejemplo 14 4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]-podofilotoxina

23

A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (17,7 \mumol, 10 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (25 \mumol, 30,4 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (3,5 \mul). Se agitó la mezcla de reacción durante 40 min, se filtró y purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%). Se obtuvo el compuesto del título puro (17,8 mg, 57%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,8 min (gradiente de MeCN de 0 a 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1772,3 (C_{81}H_{119}N_{21}O_{20}S_{2}= 1771,07).

Ejemplo 15 H-Cys-\betaAla-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH_{2}

Partiendo de la resina de amida AM de Rink (0,69 mmol/g; Novabiochem), se montó la secuencia de la resina H-Cys(Trt)-\betaAla-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-D-Met-D-Lys(Boc)-D-Trp-D-Lys(Boc)-Lys(Boc). Después de la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se purificaron alícuotas (total 237 mg) por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 8 a 18%) para dar el compuesto del título puro (66 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 12,9 min (gradiente de MeCN del 9 a 19%, pureza > 99%, \lambda = 214 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1207,2 (C_{52}H_{92}N_{20}O_{9}S_{2} = 1205,55).

4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH_{2})]podofilotoxina

24

A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (18,9 \mumol, 10,7 mg) y H-Cys-\betaAla-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH_{2} (28 \mumol, 33,8 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (1,5 \mul). Se agitó la mezcla de reacción durante 40 min, se filtró y purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%). Se obtuvo el compuesto del título puro (6,9 mg, 21%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,8 min (gradiente de MeCN de 0 a 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1771,5 (C_{81}H_{119}N_{21}O_{20}S_{2}= 1771,07.

Ejemplo 16 4'-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina

25

Se agitó durante 30 min una solución de 4'-desmetilepipodofilotoxina (12 mmol, 5 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (50 \mumol, 12,2 mg) y DIC (28 \mumol, 3,47 mg) en piridina (1 ml). Se añadió MeOH (0,5 ml) y la mezcla se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (4,2 mg, 62%). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,6 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 95%).^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,84 (m, 1H, H3), 2,99 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 3,32 (dd, J = 14,04, 5,07 Hz, 1H, H2), 3,69 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,95 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 4,39 (dd, J = 8,13, 4,28 Hz, 2H, H11), 4,66 (d, J = 5,00 Hz, 1H, H1), 4,89 (d, J = 3,32 Hz, 1H, H4), 6,01 (d, J = 6,42 Hz, 2H, OCH_{2}O), 6,32 (s, 2H, H2'6'), 6,57 (s, 1H, H8), 6,74 (s, 2H, CH=CH), 6,90 (s, 1H, H5). ^{13}C-RMN (75 MHz, CDCl_{3}) \delta: 28,64, 31,02, 32,55, 37,33, 39,53, 42,99, 55,15, 65,78, 66,56, 100,65, 106,54, 107,97, 109,65, 130,68, 130,92, 133,21, 136,96, 146,62, 147,61, 150,39, 167,36, 169,30, 173,89.

4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]epipo-dofilotoxina

26

A una solución de 4'-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina (2,3 \mumol, 1,3 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (2,3 \mumol, 5,4 mg) en DMF (0,5 ml) se añadió Et_{3}N (0,21 \mul, 2,3 \mumol). Se agitó la mezcla de durante 40 min, se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (1 ml), se filtró y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (3,2 mg, 48%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,6 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2902,2 (C_{135}H_{198}N_{36}O_{32}S_{2}= 2901,37).

Ejemplo 17 4'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]epipo-dofilotoxina

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27

A una solución de 4'-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina (7 \mumol, 4 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (6 \mumol, 15 mg) en DMF (0,5 ml) se añadió Et_{3}N (1 \mul). Se agitó la mezcla de reacción durante 40 min y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (14,1 mg, 81%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 19,7 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2900,4, C_{135}H_{199}N_{37}O_{31}S_{2}= 2900,39.

Ejemplo 18 4'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]-epipo-dofilotoxina

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28

A una solución de 4'-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (14 \mumol, 7,9 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (26 \mumol, 31,5 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,9 \mul). Después de agitar durante 40 min, se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (15,8 mg, 63%). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 13,3 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1757,2 (C_{80}H_{117}N_{21}O_{20}S_{2}= 1757,05).

Ejemplo 19 4'-(cloroacetil)epipodofilotoxina

29

A una solución en agitación de 4'-desmetilepipodofilotoxina (0,50 mmol, 200 mg) y piridina (40 \mul) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) a 0ºC, se añadió gota a gota cloruro de cloroacetilo (0,50 mmol, 56,5 mg). Por análisis de RP-HPLC se consumió aproximadamente 60% de material de partida 4'-desmetilepipodofilotoxina después de 1 h agitando a 0ºC. Se vertió la mezcla de reacción en agua fría y se extrajo esto con CH_{2}Cl_{2}. Se lavó la capa orgánica con agua, salmuera y se secó en MgSO_{4}. Se evaporó el disolvente al vacío y se purificó el residuo por cromatografía de flash (EtOAc/PE 5:4-3:2). Se obtuvo el compuesto del título puro después de recristalización en EtOAc/PE como un sólido incoloro (81,5 mg, 34%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,78 (m, 1H, H3), 3,25 (dd, J = 14,12, 5,07 Hz, 1H, H_{2}), 3,68 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 4,30 (m, 2H, H11), 4,35 (s, 2H, CH_{2}Cl), 4,57 (d, J = 5,12 Hz, 1H, H1), 4,83 (d, J = 3,37 Hz, H4), 5,96 (d, J = 4,10 Hz, 2H, OCH_{2}O), 6,32 (s, 2H, H2'6'), 6,50 (s, 1H, H8), 6,87 (s, 1H, H5).

4'-cloroacetil-4-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina

30

Se agitó durante 1 h una solución de 4'-(cloroacetil)epipodofilotoxina (0,17 mmol, 81,5 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (0,68 mmol, 115,6 mg), DIC (0,376 mmol, 47,5 mg) y DMAP(73 \mumol, 9 mg) y piridina (20 \muL) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml). Se evaporó el disolvente al vacío a sequedad. Se redisolvió en DMF (1 ml) el sólido amarillo claro resultante y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 30 a 70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (54,3 mg, 51%). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 22,0 min (gradiente de MeCN de 0 a 60%; pureza > 97%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,71 (t, 2H, J = 6,80 Hz,CH_{2}-Mim), 2,98 (m, 1H, H3), 3,25 (dd, J = 14,20, 5,13 Hz, 1H, H2), 3,69 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,87 (t, J = 6,83 Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 3,88 (m, 1H, H11), 4,33 (s, 2H, CH_{2}Cl), 4,35 (m, 1H, H11), 4,70 (d, J = 5,10 Hz, 1H, H1), 6,01 (d, J = 4,23 Hz, 2H, OCH_{2}O), 6,13 (d, J = 3,50 Hz, 1H, H4), 6,31 (s, 2H, H2'6'), 6,56 (s, 1H, H8), 6,71 (s, 2H, CH=CH), 6,92 (s, 1H, H5)

4'-cloroacetil-4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]epipodofilotoxina

31

A una solución de 4'-cloroacetil-4-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina (6,8 \mumol, 43 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met- Lys-Trp-Lys-Lys-OH (10 \mumol, 25,4 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (2,5 \mul). Se agitó la mezcla de durante 30 min y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el compuesto del título puro (22 mg, 67%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 16,7 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 99%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2978,3 (C_{137}H_{199}ClN_{36}O_{33}S_{2}= 2977,85).

4'-desmetil-4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]epipodofilotoxina

32

Una solución de 4'-cloroacetil-4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]epipodofilotoxina (5,5 \mumol, 16,4 mg) en DMF (1 ml) y agua (0,5 ml) a 0ºC se trató con solución de NH_{3} acuosa conc. (20 \mul). Después de 2 minutos se acidificó la mezcla de reacción por adición de AcOH acuoso al 5% (0,1 ml). Se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (11,4 mg, 73%). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,9 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 99%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2902,2 (C_{135}H_{198}N_{36}O_{32}S_{2}= 2901,37).

Ejemplo 20 G2-(maleimidopropionoil)etopósido, G3-(maleimidopropionoil)epotósido, y 4'-(maleimidopropionoil)etopósido

Se agitó durante 30 min una solución de etopósido (37,4 \mumol, 22 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (78 \mumol, 13,2 mg) y DIC (39,6 \mumol, 5 mg) en una mezcla de CH_{2}Cl_{2}/piridina (2:0,15). Se eliminaron los disolventes al vacío. Se disolvió el sólido amarillo claro resultante en MeOH (1,5 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar G2-(maleimidopropionoil)etopósido (3,4 mg), G3-(maleimidopropionoil)etopósido (2,4 mg) y 4'-(maleimidopropionoil)etopósido (7,7 mg) como sólidos incoloros (rendimiento total del 48%).

G2-(Maleimidopropionoil)etopósido

33

Anal. RP-HPLC: t_{R} = 16,7 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 99%).^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,39 (d, J = 4,99 Hz, 3H, CH_{3}), 2,39 (t, J = 7,30 Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 2,87 (m, 1H, H3), 3,14 (dd, J = 14,20, 5,09 Hz, 1H, H2), 3,39 (m, 2H, G4,5), 3,63 (m, 2H, G2,6), 3,72 (m, 2H, CH_{2}-Mim), 3,76 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,84 (t, J = 8,9 Hz, 1H, G3), 4,19 (m, 2H, H11, G6), 4,38 (m, 1H, H11), 4,60 (d, J = 4,10 Hz, 1H, H4), 4,74-4,84 (m, 2H, H1, G6), 6,00 (d, J = 5,10 Hz, 2H, OCH_{2}O), 6,24 (s, 2H, H2'6'), 6,54 (s, 1H, H8), 6,70 (s, 2H, CH=CH), 6,75 (s, 1H, H5). ^{13}C-RMN (75 MHz, CDCl_{3}) \delta: 20,66, 33,48, 33,95, 37,86, 41,46, 44,00, 56,87, 66,75, 68,07, 68,34, 72,15, 74,61, 75,26, 80,24, 100,29, 100,434, 102,07, 108,33, 109,00, 111,33, 128,75, 130,90, 133,40, 134,50, 134,66, 146,80, 147,27, 149,09, 169,94, 170,78, 175,08.

G3-(maleimidopropionoil)etopósido

34

Anal. RP-HPLC: t_{R} = 18,4 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 99%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,33 (d, J = 5,0 Hz, 3H, CH_{3}), 2,74 (t, J = 7,35 Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 2,91 (m, 1H, H3), 3,28 (dd, J = 14,01, 5,26 Hz, 1H, H2), 3,38 (m, 2H, G4,5), 3,54 (m, 2H, G2,6), 3,87 (m, 2H, CH_{2}-Mim), 3,76 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 4,16-4,26 (m, 2H, H11, G3), 4,42 (t, J =8,98 Hz, 1 H), 4,61 (d, J = 5,09 Hz, 1H, H1), 4,68 (m, 1H, G1), 4,91 (d, J = 3,34 Hz, H4), 5,13 (m, 1H, G3), 6,00 (d, J = 11,25 Hz, 2H, OCH_{2}O), 6,26 (s, 2H, H2'6'), 6,54 (s, 1H, H8), 6,71 (s, 2H, CH=CH), 6,83 (s, 1H, H5). ^{13}C-RMN (75 MHz, CDCl_{3}) \delta: 0,67, 33,59, 34,13, 37,93, 41,62, 44,11, 56,84, 66,87, 68,26, 68,38, 73,39, 74,38, 74,49, 100,17, 102,01, 102,54, 108,25, 109,51, 111,10, 128,38, 130,89, 133,28, 134,50, 134,66, 146,84, 147,59, 149,29, 170,64, 170,80, 175,38.

4'-(maleimidopropionoil)etopósido

\vskip1.000000\baselineskip

35

Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,7 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 99%).^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,39 (d, J = 4,82 Hz, 3H, CH_{3}), 2,88 (m, 1H, H3), 2,96 (t, J = 7,24 Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 2,91 (m, 1H, H3), 3,34 (dd, J = 14,01, 5,26 Hz, 1H, H2), 3,36 (m, 2H, G4,5), 3,45-3,58 (m, 2H, G2,6), 3,92 (t, J =3,20 Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 3,65 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,76 (m, 1H, G3), 4,15-4,27 (m, 2H, H11, G6), 4,43 (m, 1H, H11), 4,62-4,67 (m, 2H, H1, G1), 4,75 (m, 1H, G7), 4,91 (d, J = 3,27 Hz, H4), 6,00 (d, J = 6,68 Hz, 2H, OCH_{2}O), 6,25 (s, 2H, H2'6'), 6,54 (s, 1H, H8), 6,71 (s, 2H, CH=CH), 6,82 (s, 1H, H5). ^{13}C-RMN (75 MHz, CDCl_{3}) \delta: 20,62, 32,41, 33,94, 37,87, 41,61, 44,31, 56,52, 66,84, 68,44, 73,47, 74,13, 74,88, 80,06, 100,24, 102,10, 102,30, 107,89, 109,36, 111,22, 128,65, 132,68, 134,61, 138,28, 147,74, 149,29, 151,76, 168,90, 170,76, 175,56.

G2-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]etopó-sido

\vskip1.000000\baselineskip

36

A una solución de G2-(maleimidopropionoil)etopósido (4,4 \mumol, 3,3 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (5,7 \mumol, 13,4 mg) en DMF (0,5 ml) se añadió Et_{3}N (0,7 \mul, 4,9 \mumol). Se agitó la mezcla de durante 30 min y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (10,8 mg, 80%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,6 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3091,1 (C_{143}H_{210}N_{36}O_{37}S_{2}= 3089,55).

G3-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]etopó-sido

37

A una solución de G3-(maleimidopropionoil)etopósido (3,1 \mumol, 2,3 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (4,3 \mumol, 10,2 mg) en DMF (0,5 ml) se añadió Et_{3}N (0,6 \mul, 4,4 \mumol). Se agitó la mezcla de durante 30 min, se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (1 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (10,8 mg, 80%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,7 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3090,3 (C_{143}H_{210}N_{36}O_{37}S_{2}= 3089,55).

4'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]etopó-sido

38

A una solución de 4'-(maleimidopropionoil)etopósido (4,8 \mumol, 3,6 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (5,9 \mumol, 13,9 mg) en DMF (0,5 ml) se añadió Et_{3}N (0,7 \mul, 5,1 \mumol). Se agitó la mezcla de durante 30 min, se diluyó con TFA acuoso al 0,1% (1 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (11,2 mg, 77%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,6 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 99%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3090,9 (C_{143}H_{210}N_{36}O_{37}S_{2}= 3089,55).

Ejemplo 21 O-(maleimidoropionoil)roscovitina

39

Se agitó durante 40 min una solución de roscovitina (20 \mumol, 10,3 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (64 \mumol, 10,8 mg), DIC (35 \mumol, 4,4 mg) y DMAP (2 \mumol, 0,35 mg) en piridina (1 ml). Se evaporó el disolvente al vacío y se redisolvió el sólido amarillo claro resultante en CH_{2}Cl_{2}, se lavó y salmuera y se secó en MgSO_{4}. Se evaporó el disolvente y se obtuvo el compuesto del título como un sólido amarillo claro (14,1 mg, 96%). Este material se utilizó sin purificación posterior en la reacción siguiente.

O-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]rosco-vitina

40

A una solución de O-(maleimidopropionoil)roscovitina (28 \mumol, 14,1 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (14,9 \mumol, 35 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (2 \mul, 14,5 \mumol). Se agitó la mezcla de durante 1 h y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 60%) para dar el compuesto del título puro (7,2 mg) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,5 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2856,1 (C_{133}H_{204}N_{42}O_{25}S_{2}= 2855,44).

Ejemplo 22 O-\betaAla-bohemina

41

Se agitó durante 2,5 h una solución de bohemina (58,8 \mumol, 20 mg), Boc-\betaAla-OH (0,128 mmol, 24,2 mg), DIC (70 \mumol, 8,8 mg) y DMAP (9,8 \mumol, 1,2 mg) en CH_{2}Cl_{2}. Se evaporó el disolvente al vacío y el sólido blanco resultante se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar O-(Boc-\betaAla)bohemina como un sólido incoloro (30 mg). Análisis por RP-HPLC: t_{R} = 19,8 min (gradiente de MeCN de 0 a 60%, pureza > 99%). Se agitó durante 1 h una solución de O-(Boc-\betaAla)bohemina (7,6 mg) en TFA/agua 9:1 (1 ml). Se evaporó el disolvente a sequedad y el residuo del compuesto del título se utilizó sin purificación posterior en la reacción siguiente (pureza por análisis RP-HPLC fue > 98%).

O-(\betaAla-succinil-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)bohemina

42

Se agitó durante 2 h una mezcla de resina de succinil-\betaAla-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc) (14,9 \mumol, 81,7 mg), O-\betaAla-bohemina (14,9 \mumol, 7,6 mg), PyBOP (14,9 \mumol, 7,8 mg), HOBt (14,9 \mumol, 2,4 mg) y DIEA (0,2295 mmol, 29,7 mg) en DMF (2 ml). Se filtró la resina de peptidilo, se lavó con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O y se secó al vacío (82 mg). Se trató el producto con reactivo de escisión (5 ml, 2 h). Se obtuvo el producto en bruto (42 mg) por precipitación con Et_{2}O y centrifugación/decantación. Se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (14,3 mg). Análisis RP- HPLC: t_{R} = 14,8 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 93%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2812,7 (C_{132}H_{204}N_{42}O_{25}S= 2811,37).

Ejemplo 23 (Maleimidopropionoil)bohemina

43

Se disolvió ácido 3-maleimidopropiónico (12,8 mg, 76 \mumol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml). Se agitó la mezcla y se añadió DIC (5,3 mg, 42 \mumol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (0,5 ml). Se dejó continuar la reacción en agitación durante 40 min. Se eliminó a continuación el disolvente a presión reducida. Se redisolvió el residuo de anhídrido del ácido 3-maleimidopropiónico en piridina anhidra (0,5 ml). Se añadió una solución de bohemina (10,3 mg, 30 \mumol) y DMAP (0,35 mg, 2 \mumol) en piridina (0,5 ml) y se agitó la mezcla bajo N_{2} durante 1 h. Se evaporó a continuación a sequedad a presión reducida. Se redisolvió el residuo en DMF (1 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación en columna (gradiente de MeCN de 10 a 60%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (14,7 mg, 88%). Análisis RP-HPLC: t_{R} = 17,7 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 95%).^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) y los espectros MS de DE MALDI-TOF eran acordes con la estructura propuesta (C_{25}H_{29}N_{7}O_{4}= 491,54).

O-[Succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]bohe-mina

44

Se disolvió (maleimidopropionoil)bohemina (0,74 mg, 1,5 \mumol) en DMF (0,3 ml) y se añadió Et_{3}N (50 \mul). Se añadió a continuación H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (3,5 mg, 1,5 \mumol), disuelto en DMF (0,25 ml). Se agitó la mezcla bajo N_{2} y se controló por análisis de RP-HPLC. Después de 1 h, se completó la reacción. Se filtró la mezcla y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 60%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (1,7 mg, 40%). Análisis RP-HPLC: t_{R} = 15,0 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 95%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2842 (C_{132}H_{202}N_{42}O_{25}S_{2}= 2841,42).

Ejemplo 24 4-(yodoacetil)podofilotoxina

45

Se enfrió a 0ºC una mezcla de podofilotoxina (0,49 mmol, 204 mg), ácido yodoacético (1,03 mmol, 192 mg), DIC (0,552 mmol, 69,7 mg) y DMAP (0,164 mmol, 20 mg) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (5 ml). Se añadió piridina (0,2 ml) y la mezcla de reacción se dejó en agitación durante 1 h a 0ºC. Se evaporó la mezcla a sequedad. Se redisolvió el residuo amarillo claro resultante en MeCN y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN del 20 al 70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (89,5 mg). Análisis RP-HPLC: t_{R} = 22,3 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 95%).^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,85 (m, 2H, H2,3), 3,70 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,72 (s, 2H, CH_{2}I), 3,74 (s, 3H, OCH_{3}), 4,13 (m, 1H, H11), 4,34 (m, 1H, H11), 4,53 (d, 1H, J = 3,60 Hz, H1), 5,83 (d, 1H, J = 8,43 Hz, H4), 5,93 (dd, 2H, J = 4,35, 1,17 Hz, OCH_{2}O)), 6,31 (s, 2H, H2'6'), 6,48 (s, 1H, H8), 6,77 (s, 1H, H5).

4-[acetil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]podofilotoxina

\vskip1.000000\baselineskip

46

A una solución de 4-(yodoacetil)podofilotoxina (17 \mumol, 10 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (6 \mumol, 14 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (0,9 \mul, 6 \mumol). Se agitó la mezcla de durante 1 h. Se añadió MeCN (0,5 ml) y se purificó la solución por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 60%) para dar el compuesto del título puro (9,9 mg, 59%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,4 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2806,8 (C_{131}H_{195}N_{35}O_{30}S_{2}= 2804,30).

Ejemplo 25 4-[acetil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]podofilotoxina

47

A una solución de 4-(yodoacetil)podofilotoxina (17 \mumol, 10 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (23 \mumol, 28,6 mg) en DMF(1 ml) se añadió Et_{3}N (2,4 \mul, 17 \mumol). Después de agitar durante 1 h se añadió MeCN (0,5 ml) y se purificó la solución por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (29,4 mg, 100%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,1 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1661,0 (C_{76}H_{114}N_{20}O_{18}S_{2}= 1659,97).

Ejemplo 26 4'-desmetil-(yodoacetil)epipodofilotoxina

48

A una solución de 4'-desmetilepipodofilotoxina (0,26 mmol, 104 mg), ácido yodoacético (0,53 mmol, 98,8 mg) y DIC (0,32 mmol, 40,1 mg) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) a 0ºC se añadió piridina (50 \mul) y DMAP (0,1 mmol, 12,8mg). Después de 1 h en agitación se evaporaron los disolventes. Se redisolvió el residuo en DMF (1 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 20 a 60%) para dar el compuesto del título puro (35,7 mg, 24%) como un sólido incoloro. Análisis RP-HPLC: t_{R} = 20,3 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 96%).^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,02 (m, 1H, H3), 3,20 (m, 1H, H2), 3,71 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,63 (s, 2H, CH_{2}I), 3,74 (s, 3H, OCH_{3}), 4,05 (m, 1H, H11), 4,27 (m, 1H, H11), 4,60 (d, 1H, J = 4,94 Hz, H1), 6,06 (d, 1H, J = 3,41 Hz, H4), 5,92 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,21 (s, 2H, H2'6'), 6,49 (s, 1H, H8), 6,80 (s, 1H, H5).

4'-desmetil-4-[acetil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]epipodofilotoxina

49

A una solución de 4'-desmetil-4-(yodoacetil)epipodofilotoxina (17,6 \muvvmol, 10 mg) y H-Cys-\betavAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (14,9 \mumol, 18 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,1 ml, 15 \mumol). Después de agitar durante 1 h se purificó la mezcla de reacción por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (11,2 mg, 46%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 12,8 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1647,2 (C_{75}H_{112}N_{20}O_{18}S_{2}= 1645,95).

Ejemplo 27 4'-desmetil-4-[acetil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]epipodofilo-toxina

50

A una solución de 4'-desmetil-4-(yodoacetil)epipodofilotoxina (22 \mumol, 12,6 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (8 \mumol, 20 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,2 \mul, 9 \mumol). Después de agitar durante 1 h se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (13,3 mg, 56%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,5 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 96%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2789,5 (C_{130}H_{194}N_{36}O_{29}S_{2}= 2789,29).

Ejemplo 28 4-(Boc-Gly)podofilotoxina

\vskip1.000000\baselineskip

51

Se agitó durante 1 h una mezcla de podofilotoxina (400 mg, 0,97 mmol), Boc-Gly-OH (510 mg, 2,91 mmol), DIC (1,73 mmol, 273 \mul), DMAP (0,41 mmol, 50 mg) y piridina (173 \mul) en CH_{2}Cl_{2} (5 ml). Se evaporaron los disolventes. Se redisolvió el residuo en DMF (1,5 ml) y se purificó por RP-HPLC (gradiente de MeCN de 20 a 70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (502,6 mg, 91%). Análisis RP-HPLC: t_{R} = 22,1 min (gradiente de MeCN de 0 a 60%; pureza > 97%).

4-(H-Gly)podofilotoxina

52

A una solución de 4-(Boc-Gly)podofilotoxina (0,24 mmol, 137 mg) en CH_{2}Cl_{2} (8 ml) se añadió TFA (0,5 ml). Después de agitar durante 1 h se evaporaron los disolventes. El residuo sólido amarillo claro resultante se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el compuesto del título puro (41,7 mg, 37%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,2 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%).

4-(maleimidopropionoil-Gly)podofilotoxina

53

A una solución de ácido 3-maleimidopropiónico (70 \mumol, 11,8 mg) y DIC (38 \mumol, 4,83 mg) en DMF (1 ml) se añadió 4-(H-Gly)podofilotoxina (17 \mumol, 8 mg), DMAP (10 \mumol, 1,2 mg) y piridina (20 \mul). Después de agitar durante 1 h se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (1,1 mg). Análisis RP-HPLC: t_{R} = 18,2 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%).

4-[(succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})] podofilotoxina

54

A una solución de 4-(maleimidopropionoil-Gly)podofilotoxina (1,8 \mumol, 1,1 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (4 \mumol, 5 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (0,5 \mul, 4 \mumol). Se agitó la mezcla durante 1 h. Se diluyó con MeCN (0,5 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (1,1 mg, 33%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,7 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1829,8 (C_{83}H_{122}N_{22}O_{21}S_{2}= 1828,12).

Ejemplo 29 10-O-(maleimidopropionoil)camptotecina

\vskip1.000000\baselineskip

55

A una solución de 10-hidroxicamptotecina (40 \mumol, 14,7 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (0,228 mmol, 38,5 mg) y DIC (0,125 mmol, 15,8 mg) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) se añadió piridina (0,2 ml). Después de agitar durante 1 h, se evaporó la mezcla a sequedad. Se redisolvió en DMF (1 ml) el sólido amarillo claro resultante y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el compuesto del título puro (9,2 mg, 45%) como un sólido amarillo claro. Análisis RP-HPLC: t_{R} = 15,7 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 1,05 (t, 3H, J = 7,5 Hz, CH_{3}), 1,91 (m, 2H, J = 7,8 Hz, CH_{2}), 2,98 (t, 2H, J = 7,8 Hz, CH_{2}), 4,04 (t, 2H, J = 7,8 Hz, CH_{2}), 5,32 (m, 3H, H5, H17), 6,77 (s, 2H, CH=CH), 7,60 (m, 1H, H11), 7,72 (m, 2H, H14, H9), 8,24 (d, 1H, J = 9,2 Hz, H12), 8,36 (s, 1H, H7).

10-O-[succinimidopropionoil)-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})camptotecina

\vskip1.000000\baselineskip

56

A una solución de 10-O-(maleimidopropionoil)camptotecina (9 \mumol, 4,6 mg) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (4 \mumol, 10 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (0,55 \mul, 4 \mumol). Después de agitar durante 1 h se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (6,5 mg, 57%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,0 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2864,7 (C_{134}H_{195}N_{39}O_{28}S_{2}=
2864,36).

Ejemplo 30 H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2}

Partiendo de la resina de amida AM de Rink (0,69 mmol/g; Novabiochem), se montó la secuencia de la resina H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Cys(Trt). Después de la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se purificaron alícuotas (total 258 mg) por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 9 a 19%) para dar el compuesto del título puro (132,4 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 20,3 min (gradiente de MeCN del 8 a 18%, pureza > 99%, \lambda = 214 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1238,6 (C_{52}H_{92}N_{20}O_{9}S_{3} = 1237,63).

Bis-[4-(succinimidopropionoil)podofilotoxina]-(H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2})

57

A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (19 \mumol, 11 mg) y H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2} (12 \mumol, 15 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,8 \mul). Después de agitar la mezcla durante 1 h se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el compuesto del título puro (9,0 mg, 32%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,4 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2369,7 (C_{110}H_{146}N_{22}O_{31}S_{3}= 2368,66).

Ejemplo 31 4'-(succinimidopropionoil)epipodofilotoxina]-(H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2})

58

A una solución de 10-O-(maleimidopropionoil)camptoctecina (0,005 \mumol, 2,6 mg), 4'-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina (5,6 \mumol, 3,1 mg) y H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2} (11 \mumol, 13 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (1,5 \mul). Después de agitar la mezcla durante 1,5 h se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el compuesto del título puro (1,9 mg) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 14,8 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 96%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2304,6 (C_{107}H_{138}N_{24}O_{28}S_{3}= 2304,58).

Ejemplo 32 4'-(succinimidopropionoil)epipodofilotoxina-(H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2})-2'-(succinimidopro-pionoil)paclitaxel

59

A una solución de 4'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2})]pipodofilotoxina (2 \mumol, 3,5 mg), 2'-(maleimidopropionoil)paclitaxel (2 \mumol, 2 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (0,3 \mul). Después de agitar durante 1,5 h se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el compuesto del título puro (1,5 mg) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,8 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2794,5 (C_{134}H_{173}N_{23}O_{37}S_{3}= 2794,14).

Ejemplo 33 4'-metoxi-(4''-aminoanilino)epipodofilotoxina y 4'-desmetil-(4''-aminoanilino)-epipodofilotoxina

Se mantuvo a 0ºC una solución de podofilotoxina (3,6 mmol, 1,5 g) en ClCH_{2}CH_{2}Cl (15 ml) y se pasó gas HBr a través de la solución. Después de 45 min, se pasó N_{2} a través de la mezcla de reacción para conducir el HBr en exceso. A esta solución se añadieron carbonato de bario anhidro (4,32 mmol, 0,85 g) y 4-nitroanilina (4,32 mmol, 0,6 g). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante 18 h en N_{2}. Se diluyó con EtOAc y se filtró. Se lavó el filtrado con agua, se secó en MgSO_{4}, y se purificó por cromatografía de flash (CH_{2}Cl_{2}/EtOAc/acetona 100:5:5) para dar 4'-metoxi-(4''-nitroanilino)epipodofilotoxina y 4'-desmetil-(4''-nitroanilino)epipodofilotoxina en bruto. La purificación posterior por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) dio los productos puros como sólidos amarillos.

4'-metoxi-4-(4''-nitroanilino)epipodofilotoxina

60

Análisis RP-HPLC: t_{R} = 22,3 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 95%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,09 (m, 2H, H2,3), 3,77 (s, 6H, OCH_{3}), 3,83 (s, 3H, OCH_{3}), 3,86 (m, 1H, H11), 4,42 (m, 1H, H11), 4,63 (m, 2H, H1,4), 4,84 (m, 1H, NH), 6,00 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,31 (s, 2H, H2',6'), 6,57 (m, 3H, H8, Ar), 6,76 (s, 1H, H5), 8,16 (d, 2H, J=9,08 Hz, Ar).

4'-desmetil-4-(4''-nitroanilino)epipodofilotoxina

61

Análisis RP-HPLC: t_{R} = 20,5 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 95%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,07 (m, 2H, H2,3), 3,79 (s, 6H, OCH_{3}), 3,81 (m, 1H, H11), 4,40 (m, 1H, H11), 4,60 (m, 2H, H1), 4,73 (m, 1H, H4), 4,83 (m, 1H, NH), 5,45 (br, 1H, OH), 5,98 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,31 (s, 2H, H2',6'), 6,57 (m, 3H, H8, Ar), 6,76 (s, 1H, H5), 8,14 (d, 2H, J = 9,04 Hz, Ar).

A una solución de 4'-metoxi-4-(4''-nitroanilino)epipodofilotoxina ó 4'-desmetil-(4''-nitroanilino)epipodofilotoxina en EtOAc/MeOH 10:1 se añadió paladio al 10% en carbón activado. Se agitó la mezcla bajo H_{2} durante 3 h. Se filtró el catalizador y se lavó varias veces con MeOH. El filtrado y los lavados combinados se evaporaron a sequedad para dar un sólido amarillo claro que se redisolvió en MeCN y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el producto como sólidos amarillos con rendimiento cuantitativo.

4'-metoxi-4-(4''-aminoanilino)epipodofilotoxina

62

Análisis RP-HPLC: t_{R} = 16,1 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 95%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 287 (m, 1H, H3), 3,11 9m, 1H, H_{2}), 3,68 (s, 6H, OCH_{3}), 3,73 (s, 3H, OCH_{3}), 3,61 (m, 1H, H11), 4,15 (m, 1H, H11), 4,52-4,62 (m, 2H, H1,4), 5,86 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,28 (s, 2H, H2',6'), 6,37 (m, 2H, Ar), 6,45 (s, 1H, H8), 6,69 (s, 1H, H5), 7,03 (m, 2H, Ar).

4'-desmetil-4-(4''-aminoanilino)epipodofilotoxina

63

Análisis RP-HPLC: t_{R} = 14,2 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 97%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,05 (m, 1H, H3), 3,18 (m, 1H, H2), 3,78 (s, 6H, OCH_{3}), 3,93 (m, 1H, H11), 4,38 (m, 1H, H11), 4,60 (d, 1H, J = 5,91 Hz, H1), 4,70 (d, 1H, J = 3,86 Hz, H4), 5,96 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,33 (s, 2H, H2'6'), 6,53 (s, 1H, H8), 6,62 (d, 2H, J = 8,66 Hz, Ar), 6,75 (s, 1H, H5), 7,19 (d, 2H, J = 8,60 Hz, Ar).

4'-metoxi-4-[4''-aminoanilino-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina

64

A una solución de 4'-metoxi-4-(4''-aminoanilino)epipodofilotoxina (41 \mumol, 20,8 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (0,226 mmol, 38,2 mg), DIC (0,124 mmol, 15,7 mg) y DMAP (40 \mumol, 4,9 mg) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) se añadió piridina (0,2 ml). Después de agitar durante 1 h, se evaporó la mezcla a sequedad. Se redisolvió en DMF (1 ml) el sólido amarillo claro resultante y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 20 a 70%) para dar el compuesto del título puro (10,1 mg, 38%) como un sólido incoloro. Análisis RP-HPLC: t_{R} = 19,5 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 96%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,71 (t, 2H, J = 7,0 Hz, CH_{2}), 2,91 (m, 1H, H3), 3,14 (m, 1H, H2), 3,76 (s, 6H, OCH_{3}), 3,82 (s, 3H, OCH_{3}), 3,93 (t, 2H, J = 7,0 Hz, CH_{2}), 3,97 (m, 1H, H5,H11), 3,49 (m, 1H, H11), 4,63 (m, 2H, H1,4), 5,97 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,32 (s, 2H, H2'6'),6,50 (m, 2H, Ar), 6,53 (s, 1H, H8), 6,73 (s, 2H, CH=CH), 6,74 (s, 1H, H5), 7,32 (m, 2H, Ar).

4'-metoxi-4-[4''-aminoanilino-(succinimidopropionoil)-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})epipodofilotoxina

65

A una solución de 4'-metoxi-4-[4''-aminoanilino-(maleimidopropionoil)]epipodofilotoxina (6 \mumol, 4,1 mg), y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (6 \mumol, 14 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2 \mul). Después de agitar la mezcla durante 1 h se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (5,8 mg, 32%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 16,0 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 99%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 3003,9 (C_{142}H_{207}N_{39}O_{30}S_{2}= 3004,54).

Ejemplo 34 4'-metoxi-4-[4''-aminoanilino-(succinimidopropionoil)-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})epipodofilotoxina

66

A una solución de 4'-metoxi-4-[4''-aminoanilino-(maleimidopropionoil)]epipodofilotoxina (7 \mumol, 4,6 mg), y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (14 \mumol, 16,3 mg) en DMF (1 \muL) se añadió Et_{3}N (1 ml). Después de agitar la mezcla durante 1 h se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (6,4 mg, 49%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,2 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1861,6 (C_{87}H_{125}N_{23}O_{19}S_{2}= 1861,20).

Ejemplo 35 4'-desmetil-4-[4''-aminoanilino-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina

67

A una solución de 4'-desmetil-4-(4''-aminoanilino)epipodofilotoxina (24 \mumol, 12 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (49 \mumol, 8,3 mg) y DIC (27 \mumol, 3,4 mg) en DMF/CH_{2}Cl_{2} (2 ml) en 1:1 (2 ml) se añadió piridina (10 \muL). Después de agitar durante 1 h, se evaporó la mezcla de reacción a sequedad. El sólido amarillo claro resultante se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 10 a 70%) para dar el compuesto del título puro (5,3 mg, 34%) como un sólido incoloro. Análisis RP-HPLC: t_{R} = 19,5 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 96%). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,65 (t, 2H, J = 7,3 Hz, CH_{2}), 2,98 (m, 1H, H3), 3,17 (m, 1H, H2), 3,79 (s, 6H, OCH_{3}), 3,93 (t, 2H, J = 7,0 Hz, CH_{2}), 3,99 (m, 1H, H5,H11), 4,38 (m, 1H, H11), 4,58 (d, 1H, J = 4,95 Hz, H1), 4,64 (d, 1H, J = 3,95 Hz, H4), 5,96 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,33 (s, 2H, H2'6'), 6,49-6,53 (m, 3H, H8, Ar), 6,74 (s, 2H, CH=CH), 6,75 (s, 1H, H5), 7,33 (m, 2H, Ar).

4'-desmetil-4-[4''-aminoanilino-(succinimidopropionoil)-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})epipodofilotoxina

68

A una solución de 4'-desmetil-(4''-aminoanilino)-(maleimidopropionoil)]-epipodofilotoxina (8,3 \mumol, 5,3 mg), y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (13 \mumol, 15,6 mg) en DMF (1,5 \muL) se añadió Et_{3}N (2 \mul). Después de agitar la mezcla durante 1 h se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente de MeCN de 0 a 60%) para dar el compuesto del título puro (14,9 mg, 97%) como un sólido incoloro. Anal. RP-HPLC: t_{R} = 13,7 min (gradiente de MeCN del 0 al 60%; pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 1847,1 (C_{86}H_{123}N_{23}O_{19}S_{2}= 1847,17).

Ejemplo 36 Actividad citotóxica in vitro de {[4[N-(2,4-diamino-6-pteridinil-metil)-N-metilamino]benzoil]-Glu-Gly-\betaAla}_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH

En este compuesto (abreviado "MTX-Pen" en las tablas a continuación) se evaluó su capacidad para inhibir la proliferación celular de células humanas normales (inmortalizadas) (células HaCaT, Tablas 1 y 2) y una línea celular (HT29, Tabla 3) de cáncer colorrectal humano. El fármaco metotrexato libre ("MTX" en las Tablas 1 a 3) y el vector H-Ala-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH libre (abreviado "Pen" en la Tabla 1 a continuación) se incluyeron a título comparativo.

Procedimiento de análisis - Se sembraron células en placas de 96 pocillos a razón de 2.500 células/pocillo en DMEM con FCS al 10% y antibióticos. Después de incubación durante la noche, se prepararon diluciones del compuesto de ensayo en medio celular y se añadieron a las células. Se extrajeron muestras 1, 2, 3 y 4 días después de la adición del compuesto. Se añadió Nucleotide Releasing Reagent (kit ViaLight de LumiTech) para lisar las células y liberar el ATP. Después de incubación a temperatura ambiente (5 min), se transfierieron las mezclas a placas opacas de 96 pocillos y se almacenaron a -20ºC hasta su análisis. Después de colocar las placas en un luminómetro (Lucy 1, Labtech Internacional), se añadió sucesivamente a cada pocillo ATP Monitoring Reagent (20 \mul/pocillo, kit ViaLight de LumiTech) y se midió inmediatamente la intensidad de la luz. Se tomaron seis lecturas por muestra. Se comprobó cada punto de ensayo utilizando seis réplicas y referencias apropiadas. Se observó que la bioluminiscencia del ATP era proporcional al recuento de células viables en todo el intervalo de células/pocillo utilizado.

Los resultados estadísticamente significativos en las tablas siguientes están impresos en negrita.

TABLA 1 Células HaCaT

69

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TABLA 2 Células HaCaT

70

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TABLA 3 Células HT 29

71

Ejemplo 37 Estabilización de la formación microtubular por paclitaxel y 2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]paclitaxel

Procedimiento de análisis - Se incubó una solución de tubulina bovina y de tubulina marcada con tetrametilrodamina (concentración total de 0,5 mg/ml) en tampón G-PEM (PIPES 80 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, GTP 1 mM) en presencia de paclitaxel (A) 10 \muM en la Figura 1 más adelante), 2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]paclitaxel (B) 10 \muM, o sin el compuesto de ensayo (C) durante 30 min a 37ºC. Se obsevó la formación de microtúbulos en un microscopio de fluorescencia Eclipse E800 de Nikon. Las imágenes se captaron con una cámara digital Kodak DCS 420 y se analizaron utilizando el programa informático Adobe 5.0.

Ejemplo 38 Introducción de 4-[succinimidopropionoil-(biotinamidocaproil-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})]podofilotoxina en las células

Se sembraron células A549 en placas de 96 pocillos a razón de 50.000 células por pocillo en DMEM con FCS al 10% y antibióticos. Después de incubación durante la noche, 4-[succinimidopropionoil-(biotinamidocaproil-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})]podofilotoxina ("conjugado" marcado en la Figura 2 más adelante) o biotinamidocaproil-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2} ("vector" marcado) se prepararon como una serie de dilución de seis concentraciones decrecientes en medio celular y se añadieron a las células. Al final del periodo de incubación (60 min), se enjuagaron las células tres veces con PBS y se fijaron durante 20 min a -20ºC en etanol/ácido acético (95/5). Después de la fijación, se permeabilizaron las células durante 10 min con PBS conteniendo Tween-20 al 3%. Se neutralizó con fosfatasa alcalina endógena incubando la placa a 65ºC durante 60 min. Se incubaron las células durante 30 min a temperatura ambiente con fosfatasa alcalina-estreptavidina (Pierce Chemical Co.) en BSA al 0,1% en PBS y se lavaron extensamente con PBS. Se añadió una solución reciente de 1 mg/ml de fosfato de nitrofenilo en dietanolamina 10 mM (pH 9,5), MgCl_{2} 0,5 mM a cada pocillo y se incubó hasta desarrollar suficiente color (aproximadamente 30 min). Se interrumpió la reacción enzimática añadiendo 50 \mul de NaOH acuoso 2 M. Se midió la actividad de la fosfatasa alcalina por espectrofotometría a 405 nm.

Ejemplo 39 Visualización de la introducción de las células por 4-[succinimidopropionoil-(biotinamidocaproil-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})]podofilotoxina

Se sembraron células en portaobjetos de la cámara de 8 pocillos a razón de 50.000 células por pocillo en DMEM con suero de ternero fetal al 10% y antibióticos. Después de incubación durante la noche, se preparó 4-[succinimido-
propionoil-(biotinamidocaproil-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})]podofilotoxina en el medio elular a una concentración de 10 \muM y se añadió a las células. Al final del periodo de incubación (60 min), se enjuagaron las células tres veces con PBS y se fijaron durante 20 min a -20ºC en etanol/ácido acético (95/5). Después de la fijación, se permeabilizaron las células durante 10 min con PBS conteniendo Tween-20 al 3%. Se incubaron los portaobjetos con estreptavidina-FITC (Pierce Chemical Co.), diluido en PBS durante 30 min. a temperatura ambiente, se lavaron extensamente con PBS y se montaron en Hydromount (BDH). Se analizó la distribución de la fluorescencia en un microscopio de fluorescencia Eclipse E800 de Nikon. Las imágenes se captaron con una cámara digital Kodak DCS 420 y se analizaron utilizando el programa informático Adobe 5.0. En la Figura 3 se muestra una imagen representativa.

Ejemplo 40 Estabilidad intracelular de 4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]podofilotoxina

Se incubaron 10 \times 10^{6} células HL60 durante 1 h con 4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})] podofilotoxina 15 \muM (A en la Figura 4 más adelante) o sin el compuesto de ensayo (B) en DMEM. Después de la incubación, se lavaron las células extensamente con PBS hasta que no se detectó ningún compuesto del ensayo en los lavados. Se incubaron las células durante otra hora con medio puro. A continuación se sedimentaron las células, se volvieron a poner en suspensión en Tris-50 mM pH 7,5, conteniendo una mezcla de inhibidores de proteasa y se solubilizaron por tratamiento con ultrasonidos durante 1 min. Se sedimentó la fracción insoluble durante 15 min utilizando una centrifugadora Eppendorf y se analizó el sobrenadante por análisis RP-HPLC (gradiente de MeCN de 0 a 60%, \lambda = 254 nm). Se identificó el compuesto de ensayo intacto por referencia a los cromatogramas obtenidos con el compuesto de ensayo auténtico y por análisis de MS de DE MALDI-TOF de la fracción del pico indicado indicado con una flecha en la Figura 4. Se extrajeron posteriormente los sedimentos con DMSO y asimismo se analizaron los extractos, no se detectó ningún compuesto del ensayo.

Ejemplo 41 Estabilidad en el suero de los vectores del péptido

Se disolvieron los compuestos del ensayo en medio de cultivo de tejido acondicionado por las células (FCS al 10% en DMEM) a concentraciones que oscilan entre 1 y 40 \muM. Se incubaron las soluciones a 37ºC y se extrajeron muestras a intervalos. Después de la filtración, se analizaron alícuotas por RP-HPLC (utilizando un detector de UV con fotodiodo). Se identificaron los vectores intactos por referencia a los cromosomas obtenidos con péptidos auténticos y por análisis DE MALDI-TOF de las fracciones en pico apropiadas. En la Tabla 4 se resumen las vidas medias de cuatro vectores diferentes. Se obtuvieron resultados similares cuando se sustituyó el suero humano o murino por suero bovino (FCS). Este último se seleccionó preferentemente con el fin de replicar las condiciones utilizadas para los ensayos de citotoxicidad en los cultivos celulares. En todos los casos el producto de metabolismo principal del péptido hexadecámero ácido H-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH fue el pentadecámero resultante del truncado C-terminal de un resto de Lys. Se observó que este péptido pentadecámero sobrevive durante varias horas antes de la degradación carboxi-terminal posterior. Se degradaron las amidas del péptido del vector que contiene L-aminoácidos mucho más lentamente, no se pudieron identificar metabolitos individuales. Todos los vectores de péptido que contienen D-aminoácidos estudiados eran muy estables y normalmente se podían detectar después de incubaciones de 72 h.

TABLA 4

72

Ejemplo 42 Estabilidad del suero de enlaces fármaco-éster

Los compuestos de ensayo (Tabla 5: A, 4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]podofilotoxina; B, 4-[acetil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]podofilotoxina; C, 2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]paclitaxel) se disolvieron en medio de cultivo de tejido acondicionado con células (FCS al 10% en DMEM) a concentraciones que oscilan entre 1 y 40 \muM. Se incubaron las soluciones a 37ºC y se extrajeron muestras a intervalos. Después de la filtración, se analizaron alícuotas por RP-HPLC (utilizando un detector de UV con fotodiodo). La hidrólisis de los enlaces éster entre los grupos hidroxi del fármaco y los grupos carboxilo del conectador se evaluó por la aparición de podofilotoxina o paclitaxel libres. En la Tabla 5 se resumen las vidas medias de tres vectores diferentes para tres combinaciones de fármaco-conectador diferentes. Se obtuvieron resultados similares cuando se sustituyó el suero humano o murino por suero bovino (FCS). Este último se seleccionó preferentemente con el fin de replicar las condiciones utilizadas para los ensayos de citotoxicidad en los cultivos celulares.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5

73

Ejemplo 43 Comparación de las actividades citotóxicas de paclitaxel y sus conjugados del vector

Para demostrar el efecto biológico citotóxico en células cancerosas (líneas celulares de carcinoma de pulmón A549 y de carcinoma de mama MCF7 en Tabla 6) de los conjugados de paclitaxel (paclitaxel-(vector hexadecámero), 2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})]paclitaxel); paclitaxel-(vector heptadecámero), 2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]paclitaxel), se expusieron las células a los compuestos de ensayo durante 1 h solamente, es decir, un periodo durante el cual los conjugados demostraron que eran metabólicamente estables en las condiciones de los procedimientos del ensayo (referirse a los Ejemplos 41 y 42). En la Tabla 6 se resumen los valores de IC_{50} para exposiciones de 1 h y 3 días y se comparan con las obtenidas con paclitaxel libre. Debería indicarse que debido a la insignificante solubilidad en agua del paclitaxel no conjugado, el lavado del compuesto no introducido en las células después de la exposición fue mucho menos eficaz que para los conjugados, que tienen solubilidad en medio fisiológico de > 10 mg/ml. Se puede concluir que para resultados de exposición de 1 h, la actividad citotóxica completa se puede atribuir a los conjugados de paclitaxel intactos (referirse también al Ejemplo 37).

Procedimiento de análisis - Se sembraron células en placas de 96 pocillos a razón de 2.500 células por pocillo en DMED, conteniendo FCS al 10% y antibióticos. Después de incubación durante la noche, se prepararon los compuestos de ensayo como series de dilución en medio celular (adición de sulfóxido de dimetilo en el caso de paclitaxel libre para efectuar la disolución parcial) y se añadieron a las células. Durante la exposición de 1 h de las muestras, se continuó la incubación durante 1 h, se eliminaron los sobrenadantes del medio de cultivo celular y se lavaron los pocillos después con medio de cultivo celular (5 \times 2 min). Se analizaron cuantitativamente las células viables totales después de un total de 72 h de incubación utilizando un análisis con MTT normalizado.

TABLA 6

74

Ejemplo 44 Evaluación de los conjugados paclitaxel- y podofilotoxina-vector en el panel de la línea celular de carcinoma

Se aplicaron a las líneas celulares diluciones en serie de los compuestos de ensayo (Tabla 7: conjugado del vector 2'-paclitaxel con 2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]paclitaxel; conjugado del vector 7-paclitaxel con 7-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]paclitaxel; conjugado del vector 4-podofilotoxina con 4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)]podo-
filotoxina). Después de la incubación durante 96 h, se evaluó la citotoxicidad utilizando el ensayo SRB normalizado.

TABLA 7 Evaluación de citotoxicidad (\muM) por IC_{50} durante 96 h en el panel de la línea celular

75

Ejemplo 45 Evaluación de los derivados de etopósido y podofilotoxina en el ensayo de inhibición de topoisomerasa II

Ensayo en Topoisomerasa II - Se incubó ADN del plásmido (0,3 \mug) a 37ºC con 4 unidades de topoisomerasa II humana recombinante purificada en tampón de escisión (Tris 30 mM\cdotHCl, pH 7,6, NaCl 60 mM, ATP 3 mM, mercaptoetanol 15 mM, MgCl_{2} 8 mM) con o sin adición de compuesto de ensayo (a una concentración final de 1 mM, 100 \muM ó 10 \muM). Se interrumpieron las reacciones mediante la adición inmediata de SDS (1% p/v final). Se trataron las muestras con proteinasa K (30 min a 37ºC) y se extrajeron dos veces con un volumen igual de CHCl_{3}/ alcohol i-amílico 42:1. Después de añadir colorante de carga, se cargaron las muestras en un 4 \times TAE, gel de agarosa al 1% conteniendo 0,5 mg/ml de bromuro de etidio y se realizó la electroforesis durante 16 a 24 h. La inhibición de la topoisomerasa II fue interpretada por la producción de ADN del plásmido lineal, que representa el producto intermedio de escisión ocluido y por la proporción de sustrato (ADN superenrollado) a producto (ADN relajado). Se realizó de igual manera un ensayo de relajación, excepto que el tampón de reacción se optimizó para la detección de la catálisis en lugar de para la escisión, es decir, únicamente se utilizaron dos unidades de enzima por muestra. El tampón de reacción fue Tris\cdotHCl 50 mM, pH 8, KCl 120 mM, ATP 0,5 mM, ditiotreitol 0,5 mM, MgCl_{2} 10 mM. La inhibición de topoisomerasa II se interpretó por la proporción de sustrato (ADN superenrollado) a producto (ADN relajado).

TABLA 8

76

Ejemplos Abreviaturas

Boc	tert-butiloxicarbonilo
Bu^{t}	tert-butilo
CF_{3}COOH	Ácido trifluoracético
CH_{2}Cl_{2}	Diclorometano
DE MALDI-TOF MS	\begin{minipage}{120mm} Espectrometría de masas por tramos por ionización con desorción por láser asistida por matriz con extracción retardada\end{minipage}
DMF	N,N-Dimetilformamida
Et_{2}O	Éter dietílico
Fmoc	9-fluorenilmetiloxicarbonil
HMBA	p-hidroximetilbenzoilo
HOBt	1-hidroxibenzotriazol
MeCN	Acetonitrilo
Pmc	2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo
Pr^{1}_{2}NEt	N,N-diisoprpiletilamina
PyBOP	Hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio
RP-HPLC	Cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa
Trt	Tritil (trifenilmetilo).

Ejemplo 1a Resina H-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)

Se realizó el montaje del péptido utilizando un sintetizador de péptidos 433A de ABI (Perkin-Elmer Applied Biosystems). Se aplicó un protocolo de síntesis normalizado ("FastMoc 0,25 mmol MonPrevPk"). La resina de partida era Fmoc-Lys(Boc)-[(4-(hidroximetil)fenoxiacetil)-resina] (ABI 401425; 0,5 mmol/g).Se lavó la resina de peptidilo (1,37 g, 100%) final con Et_{2}O y se secó al vacío.

Para demostrar la integridad química de este producto intermedio, se escindió una alícuota pequeña de resina de peptidilo y se desprotegió, seguido del análisis del producto H-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH en bruto, que puso de manifiesto una pureza >90% (anal. RP-HPLC) y la identidad química (DE MALDI-TOF MS y análisis cuantitativo de aminoácidos).

Se aciló la resina de peptidilo (137 mg, 0,025 mmol) anterior con Fmoc-\betaAla-OH (47 mg, 0,15 mmol), PyBOP (78 mg, 0,15 mmol), HOBt (20 mg, 0,15 mmol) y Pr^{i}_{2}NEt (39 ml, 0,225 mmol) en DMF (2 ml) durante 2 h. Se desprotegió a continuación Fmoc con piperidina al 20% en DMF durante 20 min y se lavó extensamente con DMF. El producto se amplió más mediante dos sucesivos ciclos de acilación y desprotección utilizando Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (0,15 mmol en el primer ciclo; 0,3 mmol en el segundo ciclo) utilizando las etapas de acoplamiento y desprotección similares. Esto fue seguido de prolongación de la cadena posterior con Fmoc-Gly-OH (0,6 mmol) y Fmoc-Glu(OBu^{t})-OH (0,6 mmol), utilizando de nuevo condiciones de acilación y desprotección del Fmoc similares. El producto se desprotegió con Fmoc y se lavó extensamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O, seguido de secado al vacío.

Para demostrar la integridad química de este producto intermedio, se escindió una pequeña alícuota de resina de peptidilo y se desprotegió la cadena lateral, seguido de análisis del producto [H-Glu-Gly-\betaAla]_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH en bruto, que puso de manifiesto una pureza (>89%; RP-HPLC en 1 ml/min de Vydac 218TP54, 25ºC, MeCN del 15 al 25% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 20 min, t_{R}= 17,7 min, \lambda = 200-300 nm) y la identidad (DE MALDI-TOF MS: [M+H]^{+} = 3732. C_{165}H_{269}N_{53}O_{44}S = 3731,30).

Resina de {[4-[N-(2,4-diamino-6-pteridinilmetil)-N-metilamino]benzoil]-Glu(OBu^{t})-Gly-\betaAla}_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)

Se hizo reaccionar la resina de peptidilo (76 mg, 0,025 mmol) anterior toda la noche a temperatura ambiente con dihidrato de hemihidrocloruro del ácido 4[N-(2,4-diamino-6-pteridinilo-metil)-N-metilamino]benzoico (Aldrich 86;155-3; 76 mg, 0,2 mmol) y PyBOP (104 mg, 0,2 mmol), HOBt (27 mg, 0,2 mmol) y Pr^{i}_{2}NEt (70 ml, 0,4 mmol) en DMF (2 ml). Se lavó el producto sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O y se secó al vacío para dar el compuesto del título (85 mg de resina de peptidilo naranja).

77

El producto anterior se trató durante 1,5 h a temperatura ambiente con fenol/H_{2}O/tioanisol/1,2-ditioetano/CF_{3}
COOH, 0,75 : 0,5 : 0,5 : 0,25 : 10, (12 ml). Se filtró a continuación el residuo de resina y se lavó en un filtro sinterizado con pequeñas alícuotas de CF_{3}COOH puro. El filtrado y los lavados mezclados se trataron con Et_{2}O (100 ml) y se enfriaron. Se recogió el producto precipitado por centrifugación y se decantó el sobrenadante etéreo. Se lavó el producto tres veces más con Et_{2}O de manera similar. Se secó al vacío el producto final en bruto (61 mg de polvo naranja). Se redisolvió este material en 4 ml de CF_{3}COOH acuoso al 0,1% y se filtró. Se aplicó la solución resultante (dos series independientes) en una columna de RP-HPLC (Vydac 218TP1022; 22 \times 250 mm). Se eluyó la columna a 9 ml/min utilizando un gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 40 min (25ºC). Se recogieron las fracciones de los picos, se controlaron (RP-HPLC analítica) y se agruparon de forma apropiada. Después de centrifugación al vacío, se obtuvo el compuesto del título puro (13,5 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,8 (Vydac 218TP54, gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 20 min, 1 ml/min, 25ºC; pureza > 99%, \lambda = 200-300 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 4962 (C_{225}H_{321}N_{81}O_{48}S = 4960,54).

Ejemplo 2a H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH

Se aciló la resina de H-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc) (véase ejemplo 1; 411 mg, 0,075 mmol) con Fmoc-Cys(Trt)-OH (264 mg, 0,45 mmol), PyBOP (234 mg, 0,45 mmol), HOBt (61 mg, 0,45 mmol) y DIEA (0,12 ml, 0,675 mmol) en DMF (3 ml) durante 3 h. Se lavó la resina de peptidilo resultante con DMF (3 \times 5 min, 25 ml cada uno), se desaguó y se trató con piperidina al 20% en DMF durante 20 min. Después de la filtración del reactivo, el producto resina de H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc) se lavó sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O, antes de secarse al vacío.

El producto anterior se trató durante 2 h a temperatura ambiente con fenol/H_{2}O/tioanisol/1,2-ditioetano/CF_{3}COOH, 0,75 : 0,5 : 0,5 : 0,25 : 10, (12 ml). Se filtró a continuación el residuo de resina y se lavó en un filtro sinterizado con pequeñas alícuotas de CF_{3}COOH puro. El filtrado y los lavados mezclados se trataron con Et_{2}O (100 ml) y se enfriaron. Se recogió el producto precipitado por centrifugación y se decantó el sobrenadante etéreo. Se lavó el producto tres veces más con Et_{2}O de manera similar. Se secó al vacío el producto final en bruto (238 mg). Se redisolvió una alícuota (119 mg) de este material en 2 ml de CF_{3}COOH acuoso al 0,1% y se filtró. Se aplicó la solución resultante a una columna de RP-HPLC (Vydac 218TP1022; 22 \times 250 mm). Se eluyó la columna a 9 ml/min utilizando un gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 40 min (25ºC). Se recogieron las fracciones de los picos, se controlaron (RP-HPLC analítica) y se agruparon de forma apropiada. Después de centrifugación al vacío, se obtuvo el compuesto del título puro (60,9 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,8 (Vydac 218TP54, gradiente de MeCN del 17,5 al 27,5% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 20 min, 1 ml/min, 25ºC; pureza > 99%, \lambda = 214 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{-}= 2351 (C_{107}H_{173}N_{35}O_{21}S_{2} = 2349,87).

N-[3-(maleimido)benzoil]-doxorrubicina

Se disolvió hidrocloruro de doxorrubicina (Aldrich, 86.036-0; 5,9 mg, 0,01 mmol) en agua (1 ml) y DMF (0,5 ml). Se añadió tampón (fosfato acuoso 0,1 M, pH 7,2; 0,5 ml) en agitación. A la suspensión resultante se añadió gota a gota N-hidroxisuccinimida éster del ácido 3-maleimidobenzoico (Sigma, M2786; 12,9 mg, 0,04 mmol) en DMF (1 ml). Se clarificó temporalmente la mezcla de reacción de color rojo y después de aprox. 10 min se observó precipitación. Se controló la evolución de la reacción por análisis RP-HPLC y después de 2 h toda la doxorrubicina había reaccionado. Se diluyó la mezcla a continuación con H_{2}O (1,5 ml), se enfrió a 4ºC y se centrifugó. Se decantó el sobrenadante. Se redisolvió el sedimento residual en DMF (1 ml) y se diluyó con CF_{3}COOH acuoso al 0,1% (2 ml). Se aplicó esta solución a un cartucho de extracción en fase sólida (LiChrolut RP-18, 500 mg; Merck) sucesivamente preacondicionado con MeOH y TFA acuoso al 0,1%); se lavó el cartucho con CF_{3}COOH acuoso al 0,1% (4 ml) y se eluyó con MeCN/H_{2}O 6:4 (conteniendo CF_{3}COOH al 0,1%) en dos fracciones (2 \times 4 ml). La primera fracción contenía el compuesto del título y se utilizó directamente en la etapa siguiente.

N-{3-[3-(Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)succinimido]benzoil}doxo-rrubicina

78

Se diluyó la solución de N-[3-(maleimido)benzoil]doxorrubicina anterior con DMF (1 ml) y se añadió Et_{3}N (50 ml). La solución se volvió marrón oscura. Se añadió a continuación H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (5 mg), disuelto en DMF (1 ml). Se agitó la mezcla y se observó el color marrón al descargar, dejando una solución roja clara. Se controló la reacción por análisis RP-HPLC. Después de 1,5 h, toda la 3-(maleimido-benzoil)-doxorrubicina había reaccionado. Se acidificó esta solución con AcOH (0,5 ml), se diluyó con H_{2}O (3 ml) y se aplicó a un cartucho de extracción en fase sólida (LiChrolut RP-18, 500 mg; Merck). Se lavó el cartucho con CF_{3}COOH acuoso al 0,1% (6 ml) y se eluyó (6 ml de 6: 4MeCN/H_{2}O (conteniendo CF_{3}COOH al 0,1%)). Se secó el eluido por centrifugación al vacío. Se redisolvió el residuo en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% (2 ml), se filtró y se aplicó a una columna de RP-HPLC (Vydac 218TP1022; 22 \times 250 mm). Se eluyó la columna a 9 ml/min utilizando un gradiente de MeCN de 20 a 40% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 40 min (25ºC). Se recogieron las fracciones del pico, se controlaron (RP-HPLC analítica) y se agruparon de forma apropiada. Después de la centrifugación al vacío, se obtuvo el compuesto del título puro (1,2 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 15,6 y 15,8 min (diastereoisómeros de tioéter parcialmente resueltos) (Vydac 218TP54 gradiente de MeCN del 0 al 60% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 20 min, 1 ml/min, 25ºC; pureza > 95%, \lambda = 200-300 nm), DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{-}= 3094, [M + 2 H]^{2+} = 1548 (C_{145}H_{207}N_{37}O_{35}S_{2}= 3092,56).

Ejemplo 3a 2'-[(3-maleimidopropionoil)]-paclitaxel

Se disolvió ácido 3-maleimidopropiónico (5,7 mg, 0,034 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (0,5 ml). Se agitó la mezcla y se añadió diisopropilcarbodiimida (2,4 mg, 0,019 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (0,5 ml). Se dejó continuar la reacción en agitación durante 30 min. Se eliminó a continuación el disolvente a presión reducida. Se redisolvió el residuo de anhídrido del ácido 3-maleimidopropiónico en piridina anhidra (0,5 ml). Se añadió una solución de paclitaxel (Aldrich 41.701-7; 1 mg, 0,0012 mmol) en piridina anhidra (0,5 ml) y se agitó la mezcla en N_{2} durante 3 h. Se evaporó a continuación a sequedad a presión reducida. Se trató el residuo con H_{2}O (1,5 ml). Después de 10 min, se extrajo con CH_{2}Cl_{2} (3 \times 5 ml). Se lavaron los extractos combinados con H_{2}O (3 \times 1 ml), se secó con MgSO_{4}, se filtró y se evaporó a sequedad para dar un residuo blanco del compuesto del título.

2'-{3-[3-(Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)succinimido]propionoil}-paclitaxel

79

Se redisolvió el producto de la reacción anterior en DMF (0,25 ml) y H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (2,5 mg, 0,0011 mmol), se disolvió en DMF (0,25 ml) se añadió a continuación, junto con Et_{3}N (aprox. 0,05 ml). Se agitó la mezcla bajo N_{2} y se controló por análisis RP-HPLC. Después de 45 min, terminó la reacción. Se diluyó la mezcla hasta 2 ml con CF_{3}COOH acuoso al 0,1%, se filtró y se aplicó a una columna de RP-HPLC (Vydac 218TP1022; 22 \times 250 mm). Se eluyó la columna a 9 ml/min utilizando un gradiente de MeCN de 0 a 60% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 40 min (25ºC). Se recogieron las fracciones del pico, se controlaron (RP-HPLC analítica) y se agruparon de forma apropiada. Después de la centrifugación al vacío, se obtuvo el compuesto del título puro (1,2 mg). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,4 Y 17,5 min (diastereoisómeros de tioéter parcialmente resueltos) (Vydac 218TP54 gradiente de MeCN del 0 al 60% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 20 min, 1 ml/min, 25ºC; pureza > 95%, \lambda = 200-300 nm). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{2-}= 3356, [M + 2H]^{+}= 1679 (C_{161}H_{229}N_{37}O_{38}S_{2}= 3354,90).

Ejemplo 4a Actividad citotóxica in vitro de {[4[N-(2,4-diamino-6-pteridinil-metil)-N-metilamino]benzoil]-Glu-Gly-\betaAla}_{4}-Lys_{2}-Lys-\betaAla-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH

Se evaluó la capacidad de este compuesto (abreviado "MTX-Pen" en las tablas a continuación) para inhibir la proliferación celular de células humanas normales (inmortalizadas) (células HaCaT, Tablas 1 y 2) y una línea celular (HT29, Tabla 3) de cáncer colorrectal humano. El fármaco metotrexato libre ("MTX" en las Tablas 1 a 3) y el vector H-Ala-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH libre (abreviado "Pen" en la Tabla 1 a continuación) se incluyeron a título comparativo.

Procedimiento de análisis - Se sembraron células en placas de 96 pocillos a razón de 2.500 células/pocillo en DMEM con suero de ternero fetal al 10% y antibióticos. Después de incubación durante la noche, se prepararon diluciones del compuesto de ensayo en medio celular y se añadieron a las células. Se extrajeron muestras 1, 2, 3 y 4 días después de la adición del compuesto. Se añadió Nucleotide Releasing Reagent (kit ViaLight de LumiTech) para lisar las células y liberar el ATP. Después de incubación a temperatura ambiente (5 min), se transfierieron las mezclas a placas opacas de 96 pocillos y se almacenaron a -20ºC hasta su análisis. Después de colocar las placas en un luminómetro (Lucy 1, Labtech Internacional), se añadió sucesivamente a cada pocillo ATP Monitoring Reagent (20 ML/pocillo, kit ViaLight de LumiTech) y se midió inmediatamente la intensidad de la luz. Se tomaron seis lecturas por muestra. Se comprobó cada punto de ensayo utilizando seis réplicas y referencias apropiadas. Se observó que la bioluminiscencia del ATP era proporcional al recuento de células viables en todo el intervalo de células/pocillo utilizado.

En las tablas siguientes los resultados estadísticamente significativos están impresos en negrita.

TABLA 1 Células HaCaT

80

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TABLA 2 Células HaCaT

81

TABLA 3 Células HT 29

82

Ejemplo 5a (Maleimidopropionoil)bohemina

83

Se disolvió ácido 3-maleimidopropiónico (12,8 mg, 76 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (1 ml). Se agitó la mezcla y se añadió DIC (5,3 mg, 42 mmol) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (0,5 ml). Se dejó continuar la reacción en agitación durante 40 min. Se eliminó a continuación el disolvente a presión reducida. Se redisolvió el residuo de anhídrido del ácido 3-maleimidopropiónico en piridina anhidra (0,5 ml). Se añadió una solución de bohemina ({6-(bencilamino)-2-[(3-hidroxipropil)amino]-9-isopropilpurina}, 10,3 mg, 30 mmol) y DMAP (0,35 mg, 2 mmol) en piridina (0,5 ml) y se agitó la mezcla bajo N_{2} durante 1 h. Se evaporó a continuación a sequedad a presión reducida. Se redisolvió el residuo en DMF (1 ml) y se aplicó a una columna de RP-HPLC (Vydac 218TP1022; 22 \times 250 mm). Se eluyó la columna a 9 ml/min utilizando un gradiente de MeCN de 10 a 60% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 40 min (25ºC). Se recogieron las fracciones del pico, se controlaron (RP-HPLC analítica) y se agruparon de forma apropiada. Después de la centrifugación al vacío, se obtuvo el compuesto del título puro (14,7 mg, 87,8%). Anal. RP-HPLC: t_{R} = 17,7 min (Vydac 218TP54, gradiente de MeCN de 0 a 60% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 20 min, 1 ml/min, 25ºC; pureza > 95%, \lambda = 200-300 nm). ^{1}H-RMN (CDCl_{3}) y los espectros MS de DE MALDI-TOF eran acordes con la estructura propuesta (C_{25}H_{29}N_{7}O_{4}= 491,54).

O-{3-[3-(Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH)succinimido]propionoil}-bohemina

84

Se disolvió el producto de la reacción anterior (0,74 mg, 1,5 mmol) en DMF (0,3 ml) y se añadió Et_{3}N (50 ml). Se añadió a continuación H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-OH (3,5 mg, 1,5 mmol), disuelto en DMF (0,25 ml). Se agitó la mezcla bajo N_{2} y se controló por análisis de RP-HPLC. Después de 1 h, se completó la reacción. Se filtró la mezcla y se aplicó a una columna de RP-HPLC (Vydac 218TP1022; 22 \times 250 mm). Se eluyó la columna a 9 ml/min utilizando un gradiente de MeCN de 10 a 60% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 40 min (25ºC). Se recogieron las fracciones del pico, se controlaron (RP-HPLC analítica) y se agruparon de forma apropiada. Después de la centrifugación al vacío, se obtuvo el compuesto del título puro (1,7 mg, 40%). Análisis RP-HPLC: t_{R} = 15,0 min (Vydac 218TP54, gradiente de MeCN de 0 a 60% en CF_{3}COOH acuoso al 0,1% durante 20 min, 1 ml/min, 25ºC; pureza > 95%, \lambda = 200-300 nm). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+}= 2842 (C_{132}H_{202}N_{42}O_{25}S_{2}= 2841,42).

Claims

1. Sistema de administración que comprende un grupo farmacéutico ligado a un grupo portador; en el que el grupo portador comprende un péptido con homeosecuencia o un derivado del mismo y el grupo farmacéutico es un fármaco no peptídico, no-oligonucleótido terapeúticamente activo que es un agente citotóxico o antineoplásico.

2. Sistema de administración según la reivindicación 1, en el que dicho agente citotóxico o antineoplásico es para la terapia del cáncer.

3. Sistema de administración según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en el que el agente citotóxico o antineoplásico está en forma fotoactivable.

4. Sistema de administración según cualquier reivindicación anterior, en el que el sistema de administración es terapeúticamente activo en su estado intacto.

5. Sistema de administración según cualquier reivindicación anterior, en el que el péptido con homeosecuencia procede de la secuencia de la hélice 3 de un péptido con homeosecuencia o un derivado del mismo.

6. Sistema de administración según la reivindicación 5, en el que el péptido con homeosecuencia procede del péptido de Drosophila antennapedia o de un derivado del mismo.

7. Sistema de administración según la reivindicación 5 ó 6, en el que el grupo portador es penetratina o un derivado de la misma.

8. Sistema de administración según la reivindicación 7, en el que el grupo portador es la SEC ID nº: 1.

9. Sistema de administración según la reivindicación 7 u 8, en el que el grupo carboxilo libre del resto de aminoácido del terminal carboxi del grupo portador se transforma en un grupo carboxamido.

10. Sistema de administración según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en el que el péptido con homeosecuencia está compuesto por aminoácidos D.

11. Sistema de administración según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grupo farmacéutico se selecciona de entre agentes que alteran el ADN, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, productos naturales y sus análogos, inhibidores de dihidrofolato reductasa, análogos de pirimidina, análogos de purina, inhibidores de cinasa dependiente de ciclina, inhibidores de timidilato sintetasa, intercaladores de ADN, escindidores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, antraciclinas, fármacos vinca, mitomicinas, bleomicinas, nucleósidos citotóxicos, fármacos de pteridina, diinenos, podofilotoxinas, fármacos que contienen platino, productores de diferenciación y taxanos.

12. Sistema de administración según la reivindicación 11, en el que el grupo farmacéutico se selecciona de entre metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, purinas trisustituidas tales como olomoucina, roscovitina y bohemina, flavopiridol, arabinósido de citocina, melfalán, leurosina, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina D, mitomicina A, carninomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina (y derivados de la misma), etopósido, cisplatino, carboplatino, vinblastina, vincristina, vindesina, paclitaxel, docetaxel, ácido retinoico de taxotere, ácido butírico, acetil espermidina, tamoxifeno, irinotecano y camptotecina.

13. Sistema de administración según la reivindicación 12, en el que el grupo farmacéutico se selecciona de entre metotrexato, podofilotoxina (y derivados de la misma), etopósido, camtoptecina, paclitaxel, doxorrubicina, roscovitina y bohemina.

14. Sistema de administración según cualquier reivindicación anterior, en el que el grupo farmacéutico está unido directamente al grupo portador.

15. Sistema de administración según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el grupo farmacéutico está unido indirectamente al grupo portador por medio de un fragmento de enlace.

16. Sistema de administración según la reivindicación 15, en el que el fragmento de enlace se selecciona de entre (metilamino)benzoil-Cys, succinimidobenzoil-Cys, succinimidopropionoil-Cys, \beta-alanil-succinil, acetil-Cys y (4''-aminoanilino)-succinimidopropionoil-Cys.

17. Sistema de administración según cualquier reivindicación anterior, en el que cada grupo portador lleva un grupo farmacéutico.

18. Sistema de administración según la reivindicación 17, en el que los grupos farmacéuticos son diferentes.

19. Sistema de administración según las reivindicaciones 17 ó 18, en el que cada grupo farmacéutico está unido al grupo portador por medio de un fragmento de enlace.

20. Sistema de administración según la reivindicación 19, en el que cada grupo farmacéutico está unido al grupo portador por medio de un fragmento de enlace idéntico.

21. Sistema de administración según la reivindicación 19, en el que cada grupo farmacéutico está unido al grupo portador por medio de un fragmento de enlace diferente.

22. Sistema de administración según la reivindicación 17, en el que más de uno de los grupos farmacéuticos están unidos al portador por una red de restos de lisina.

23. Sistema de administración según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que más de uno de los grupos farmacéuticos están unidos al portador por un fragmento de enlace seleccionado de entre (metilamino)benzoil-Cys, succinimidobenzoil-Cys, succinimidopropionoil-Cys, \beta-alanil-succinil, acetil-Cys y (4''-aminoanilino)-succinimidopropionoil-Cys.

24. Sistema de administración según la reivindicación 23, en el que el fragmento de enlace es succinimidopropionoil-Cys.

25. Sistema de administración según cualquier reivindicación anterior, que comprende además un grupo de direccionamiento.

26. Sistema de administración según la reivindicación 25, en el que el grupo de direccionamiento está unido al grupo portador.

27. Sistema de administración según la reivindicación 25, en el que el grupo de direccionamiento está unido al grupo farmacéutico.

28. Macromolécula seleccionada de entre cualquiera de los sistemas de administración definidos en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

29. Macromolécula seleccionada de entre los sistemas de administración;

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(Tabla pasa a página siguiente)

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