ES2318906T3 - Vectores de transposicion derivados de helice 3 de homeodominio de antennapedia. - Google Patents

Vectores de transposicion derivados de helice 3 de homeodominio de antennapedia. Download PDF

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Abstract

Fracción portadora de péptido de transposición de membrana de fórmula: ** ver fórmula** en la que de 6 a 9 aminoácidos se eliminan de la terminación amino, o una variante de dicha fracción portadora de péptido de transposición de membrana en la que (a) uno o dos restos de aminoácido se sustituyen homólogamente, (b) el orden de dos restos de aminoácido está invertido, o (c) tanto (a) como (b) están presentes conjuntamente.

Description

Vectores de transposición derivados de hélice 3 de homeodominio de Antennapedia.
La presente invención se refiere a nuevas fracciones portadoras de péptido de transposición de membrana y a vectores de transposición de membrana que comprenden una nueva fracción portadora de péptidos junto con una fracción de carga, de utilización en la administración mejorada de agentes terapéuticos en células diana.
La industria farmacéutica se ha preocupado durante muchos años de la administración eficaz de agentes terapéuticos. Este problema puede atribuirse al breve periodo de eliminación del agente en el cuerpo (vida media corta), a la posición del punto de acción o posiblemente a la naturaleza del propio agente terapéutico, por ejemplo, a su solubilidad, hidrofobia, etc.. De este modo, muchos desarrollos y estrategias se han adoptado, incluyendo la formulación del agente terapéutico con el fin de protegerlo de un medio hostil en el camino de su punto de acción, mediante por ejemplo, comprimidos entéricamente recubiertos, dispositivos de liberación controlada y similares.
El desarrollo de agentes terapéuticos derivados de péptidos ha planteado un problema adicional debido a su sensibilidad a la degradación enzimática no solamente en el aparato digestivo sino también en el torrente sanguíneo. Un ejemplo de cómo este problema se ha estudiado se refiere a la incorporación de péptido en los liposomas o de microesferas poliméricas que dirigen los péptidos al sistema linfático.
Un problema relacionado adicional, especialmente para los agentes terapéuticos que funcionan en el interior de la célula es la barrera colocada por la membrana celular. De este modo, puede ser posible aumentar la vida media del agente o asegurar que pase a través del cuerpo sin degradarse, aunque muchos agentes deben realmente entrar en las células para ejercer su efecto terapéutico.
Las homeoproteínas son factores de transactivación implicados en múltiples procesos morfológicos. Se unen al ADN mediante una secuencia de 60 restos de aminoácidos, el denominado homeodominio. La estructura de este dominio está constituida por tres hélices \alpha, interrumpidas por una espira \beta entre las hélices 2 y 3 (Gehring, W.J. et al., (1990) Trends Genet 6, 323-9). La relación filogenética entre numerosas homeoproteínas es sorprendente a nivel del homeodominio y particularmente en la tercera hélice \alpha. Esta hélice es responsable tanto de la interacción con el ADN, como de la capacidad de las homeoproteínas para trasladarse a través de las membranas celulares a los núcleos celulares de manera inespecífica.
La patente europea 485578 da a conocer que el homeodominio y específicamente, la hélice 3 de un péptido con homeosecuencia, específicamente la derivada de la Drosophila Antennapedia, es de utilización como vector de transporte intracelular. La patente da a conocer que una secuencia de 57 aminoácidos de un homeopéptido de Drosophila Antennapedia (denominado péptido pAntp) era capaz de penetrar en fibroblastos y células embrionarias (in vivo). Se hizo incapié en los 27 últimos aminoácidos de la secuencia que corresponden con la hélice 3 y 4. No existe ninguna descripción del péptido pAntp que esté unido a ningún otro péptido o agente terapéutico.
Las descripciones ulteriores (Derossi D. et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 10444-10450, Derossi D. et al., J. Biol. Chem. (1996) 271, 18188-18193, Joliot AH et al., (1991) The New Biol. 3, 1121-1134 y PNAS (1991) 88, 1864-1868, Pérez F. et al., J. Cell Sci. (1992) 102, 712-722), se han enfocado en un péptido sintético de 16 aminoácidos procedente de la tercera hélice del homeodominio de Antennapedia que puede utilizarse para la administración intracelular de productos bioactivos y oligonucleótidos complementarios. La secuencia de aminoácidos de este péptido es
RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC. ID. nº: 1) conocido también como penetratina. En el transcurso de sus investigaciones los autores anteriores sintetizaron varias variantes de esta secuencia, correspondiendo ésta a los restos 41-60, 41-55 y 46-60 del péptido pAntp y demostraron que en todos los casos, los únicos péptidos para interiorizarse en las células eran los que incluían los restos 43-58 (Derossi D. et al., supra).
En un esfuerzo para evitar la escisión enzimática de este péptido Brugidou J. et al., (Biochem. Biophys. Res. Comm. (1995) 214(2), 685-693) preparó una forma retro-inverso (aminoácidos D en orden inverso) de la SEC. ID. nº: 1, sustituyendo los dos restos de isoleucina en las posiciones 3 y 5 de la penetratina por valina y añadiendo un resto de glicina en el terminal C para facilitar la unión a una resina. Una forma retro-inverso adicional se preparó sustituyendo la glicina adicional con un resto de colesterol unido mediante un grupo enlazador sulfhidrilo. La adición del resto de colesterol mejoró la penetración debido al aumento de hidrofobia de la molécula.
El desarrollo de la forma retro-inverso de penetratina ha dado lugar al documento WO 97/12912 que da a conocer péptidos de 16 aminoácidos que comprenden entre 6 y 10 aminoácidos hidrófobos en los que el sexto aminoácido de uno de los dos extremos debe ser triptófano. Esta descripción intenta definir las características mínimas de las secuencias capaces de actuar como vectores de interiorización ya que siendo la retención de un resto de triptófano en la sexta posición del terminal amino y que el péptido contiene de 6 a 10 restos de aminoácidos hidrófobos (la clasificación de los restos amino hidrófobos en el documento WO 97/12912 no se cree que esté de acuerdo con la clasificación generalmente aceptada).
De las descripciones expuestas anteriormente, tal como se resume en el documento WO 97/12912, se ha sacado la conclusión de que es esencial para las propiedades de transposición de la membrana de los péptidos del homeodominio, la presencia de un resto de triptófano en el sexto resto del terminal amino. De acuerdo con estos requisitos ha sido una variante de penetratina de fórmula (KWKK)_{4} que se ha descrito que posee capacidad de transposición (Maruta H. et al. Cytoskeletal tumour suppresors that block oncogenic RAS signalling. Presentado en Anti-Cancer Proteins and Drugs: Structure, Function and Design: 6-9 de noviembre 1998, New York Academy of Sciences. Poster/resumen nº 11) y Plank C. et al. (Human Gene Therapy, (1998) 10, 319-332) que da a conocer un número de péptidos ramificados de transposición de la membrana tales como (KWKK)_{2}KGGC, en la que cada KWKK está unido al resto de lisina siguiente.
La presente invención busca proporcionar una gama más amplia de péptidos de transposición de la membrana basados en la penetratina, incluyendo los péptidos que no contienen un resto de triptófano como el sexto resto del terminal amino y los péptidos que son de tamaño más pequeño que la penetratina. Dichas formas más pequeñas o truncadas de penetratina presentan ventajas porque son más aceptables a la industria farmacéutica como fracciones portadoras del péptido para administración, en virtud del conjugado transportador-carga con una inmunogenicidad ventajosa, solubilidad y eliminación y en algunos casos eficacia ventajosa en comparación con utilizar un conjugado compuesto por penetratina "completa" (SEC. ID. nº: 1). Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invención se refiere a derivados truncados de penetratina, mientras que un segundo aspecto se refiere a formas modificadas de penetratina. Estos primer y segundo aspectos se describen a continuación con mayor detalle y se hace referencia a ambos a continuación como "fracción portadora de péptido" de un sistema de administración de carga.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere por lo tanto a una fracción portadora de péptidos de transposición de la membrana de fórmula:
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en la que de 6 a 9 aminoácidos se eliminan del terminal amino, o las variantes de dicha fracción portadora de péptido de transposición de la membrana. Por lo tanto, se ha observado de manera sorprendente que al contrario que lo dado a conocer en la técnica anterior, la capacidad para transponer una membrana celular se conserva con las secuencias que no contienen el conjunto de los restos 43 a 58 del péptido pAntp.
Más preferentemente, se eliminan 9 aminoácidos.
En una forma de realización preferida, las fracciones portadoras de péptidos de la presente invención incluyen los compuestos 16, 17, 18 y 19 mostrados en la Tabla 1 a continuación donde se presentan junto con una asa de biotinil-\betaAla utilizada con la finalidad de análisis bioquímico.
Por lo tanto, en una forma de realización preferida, la fracción portadora de péptidos incluye la secuencia peptídica RRMKWKK o una variante de la misma y puede estar definida preferentemente como una fracción portadora de péptido de transposición de la membrana que comprende hasta 15 restos de aminoácidos y por lo menos el péptido de fórmula:
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o variantes de la misma. Las formas de realización preferidas expuestas con relación con el primer aspecto aplican en su totalidad al péptido de fórmula (I). En una forma de realización, los restos de aminoácidos añadidos al péptido de fórmula (I) son los restos correspondientes en la penetratina o a variantes de los mismos.
Se ha observado que esta secuencia (de fórmula (I)) y sus variantes son la secuencia mínima de la molécula de penetratina necesaria para facilitar la transposición de la membrana. De este modo, las formas de realización anteriores apoyan la idea de que la presencia del triptófano en la sexta posición de uno de los dos extremos del péptido no es esencial para en traslado en la membrana.
Dentro de las definiciones anteriores de las fracciones portadoras de péptidos de la presente invención, los restos de aminoácidos específicos del péptido pueden modificarse de tal manera que conserven su capacidad para trasladar, dichos péptidos modificados denominados "variantes".
Una variante de la fracción portadora de péptidos definida anteriormente incluye cualquier variación en la que:
(a)
uno o dos restos de aminoácidos están sustituidos de manera homóloga
(b)
el orden de dos restos de aminoácidos está invertido, (c) ambos (a) y (b) están presentes conjuntamente.
Por lo tanto, la sustitución homóloga (sustitución y reemplazamiento se utilizan ambos en la presente memoria para significar el intercambio de un resto de aminoácido existente, por un resto alternativo) puede producirse p. ej. la sustitución semejante por semejante tal como básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc.
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Dentro de cada fracción portadora de péptidos puede modificarse de una vez un resto de aminoácidos.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los aminoácidos se clasifican en las clases siguientes:
básicos: H, K, R
ácidos: D, E
apolares: A, F, G, I, L, M, P, V, W
polares: C, N, Q, S, T, Y,
(utilizando la anotación de aminoácidos de una sola letra aceptada internacionalmente) y la sustitución homóloga se define utilizando estas clases. Por lo tanto, la sustitución homóloga se utiliza para referirse a la sustitución dentro de la misma clase.
Dentro de la definición de la fórmula (I) se ha demostrado que es preferible para la variación del aminoácido, preferentemente de tipo (a) o (b), que se produzca independientemente en cualquiera de las posiciones 1, 2, 3, 5 ó 6. Más preferentemente, la variación del aminoácido se produce en las posiciones 3 ó 7, especialmente 3. Se ha descubierto que la sustitución homóloga es preferible en las posiciones 1 y 2.
Como se mencionó anteriormente puede producirse simultáneamente más de una sustitución homóloga, por ejemplo en las posiciones 2 y 3, 4 y 5 ó 5 y 6. Una variación adicional puede producirse en virtud de la inversión de la secuencia de un número de restos de aminoácidos dentro de una secuencia. Por ejemplo, en la secuencia peptídica RRMKWKK, los restos de lisina y triptófano pueden invertirse para dar un péptido RRMWKKK. Esta modificación puede producirse además en combinación con una sustitución homóloga. la fracción portadora de péptido puede incluir además restos de aminoácidos con el extremo del terminal amino, más preferentemente mediante la adición de 1 a 3 restos de aminoácidos. De este modo, una forma de realización más de este aspecto de la presente invención se refiere a un péptido seleccionado de entre RRMKWKK, NRRMKWKK, QNRRMKWKK y FQNRRMKWKK.
En la forma de realización más preferida del primer aspecto de la invención, la forma truncada de penetratina es la de la fórmula (I) descrita anteriormente o más preferentemente a un péptido de 7 aminoácidos seleccionados de entre KRMKWKK, RKMKWKK, RRMWKKK y RRMKKWK, aún más preferentemente la fracción portadora de péptido es RRMKWKK.
Las fracciones portadoras de péptidos de la presente invención pueden comprender aminoácidos en forma L o D, es decir, uno o más restos, preferentemente todos los restos pueden estar en forma L o D. En esta forma de realización, el péptido puede estar en forma retro.
En una forma de realización preferida de la presente invención, el sexto resto de aminoácido del terminal amino del péptido no es triptófano.
Los péptidos de transposición de la membrana de la presente invención son capaces de trasladarse por la membrana celular y en una forma de realización preferida, también la membrana nuclear. Es irrelevante si el péptido se traslada desde el exterior de la célula/núcleo o desde el interior, es decir, los péptidos pueden originarse dentro del citoplasma o el núcleo (por ejemplo, en virtud de haber sido sintetizados allí o insertados en este compartimento) y trasladarse a una posición exterior al compartimento celular (citoplasma o núcleo) donde se origina. En general, los péptidos se preparan fuera de la célula y se trasladan desde una posición exterior al citoplasma y a continuación opcionalmente, al interior del núcleo.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "transposición de la membrana celular" se refiere a la capacidad del péptido para atravesar la membrana celular e introducirse en el citosol/citoplasma de una célula o a través del citosol/citoplasma de una célula al exterior, al espacio exterior, extracelular o intersticial.
La expresión "transposición de la membrana nuclear" se refiere a la capacidad del péptido para atravesar la estructura de la membrana que rodea el núcleo de la célula, o para atravesar el citosol/citoplasma en una célula hasta el núcleo.
La Figura 1 presenta el análisis RP-HPLC de algunas fracciones portadoras de péptidos preparadas según el primer aspecto de la presente invención.
La Figura 2 presenta los resultados del ensayo de interiorización celular realizados utilizando fracciones portadoras de péptidos preparadas según el primer aspecto de la invención.
La Figura 3 presenta los resultados del ensayo de interiorización celular realizado utilizando el compuesto 39 (penetratina marcada con fluoresceína).
La Figura 4 (A, B y C) muestra la observación en tiempo real del ensayo de interiorización celular realizado utilizando el compuesto 39.
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La Figura 5 presenta los resultados del ensayo de interiorización celular realizado utilizando las fracciones portadoras de péptidos preparadas según el segundo aspecto de la presente invención.
En un aspecto adicional de la invención, una fracción portadora de péptidos (la forma truncada de penetratina según el primer aspecto) se une a una fracción de carga para formar un vector de transposición de la célula). la fracción de carga puede comprender oligonucleótidos, nucleótidos, proteínas, péptidos, compuestos biológicamente activos, agentes para diagnóstico o combinaciones de los mismos.
En una forma de realización preferida la fracción de carga es una proteína o péptido y en una forma de realización más preferida la fracción de carga es un agente biológicamente activo tal como un fármaco.
La fracción de carga puede estar unida directa o indirectamente a la fracción portadora de péptidos. En la forma de realización en la que la fracción de carga está unida indirectamente al transportador de péptidos, el enlace puede ser mediante un grupo intermediario de enlace tal como un grupo sulfhidrilo o carboxilo o cualquier grupo mayor, todos estos grupos de unión se denominan en la presente memoria grupos enlazadores como se expone a continuación. Preferentemente las fracciones portadoras de péptidos y de carga se unen directamente.
Los ejemplos de restos de oligonucleótidos o nucleótidos adecuados incluyen los genes, fragmentos de gen, secuencias de ADN, ADNc, ARN, nucleótidos, nucleósidos, bases heterocíclicas, oligonucleótidos sintéticos y no sintéticos o complementarios incluyendo aquellos con ejes centrales resistentes a la nucleasa, etc. o cualquiera de los anteriores que incorporan un marcador radioactivo, que se desea que sean administrados dentro de una célula o alternativamente sean administrados desde una célula a su exterior. Preferentemente, el grupo de carga de oligonucleótidos es un gen o un fragmento de gen.
Los ejemplos de proteína o de grupos de carga de péptidos adecuados incluyen: proteínas, péptidos y sus derivados tales como: anticuerpos y fragmentos de los mismos; citocinas y derivados o fragmentos de las mismas, por ejemplo, las interleucinas (IL) y especialmente los subtipos IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 e IL-12 de las mismas; factores estimuladores de colonias, por ejemplo el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos, el factor estimulador de colonias de granulocitos (formas alfa y beta), el factor estimulador de colonias de macrófagos (conocido también como CSF-1); hemopoyetinas, por ejemplo eritropoyetina, hemopoyetina-alfa y ligando de kit (conocido también como factor de células madre o factor Steel); interferones (IFNS), por ejemplo IFN-\alpha, IFN-\beta e IFN-\gamma; factores de crecimiento y moduladores de crecimiento bifuncionales, por ejemplo el factor de crecimiento epidérmico, el factor de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento transformante (formas alfa y beta), anfirregulina, somatomedina-C, el factor de crecimiento de huesos, el factor de crecimiento de fibroblastos, los factores de crecimiento similares a la insulina, los factores de crecimiento que se fijan a la heparina y los factores del crecimiento del tumor; factores de diferenciación y similares, por ejemplo el factor de diferenciación de macrófagos, el factor que produce diferenciación (DIF) y el factor inhibidor de la leucemia, factores de activación, por ejemplo el factor activador de plaquetas y el factor de activación de macrófagos, factores de coagulación tal como los agentes fibrinolíticos/anticoagulantes incluyendo la heparina y las proteasas y sus profactores, por ejemplo los factores de coagulación VII, VIII, IX, X, XI y XII, la antitrombina III, la proteína C, la proteína S, estreptocinasa, urocinasa, prourocinasa, el activador tisular de plasminógeno, fibrinógeno e hirudina; hormonas peptídicas, por ejemplo insulina, hormona de crecimiento, gonadotrofinas, la hormona estimulante del folículo, la hormona leutenizante, la hormona de liberación de la hormona de crecimiento y la calcitonina; enzimas tales como la superóxido dismutasa, glucocerebrosidasa, asparaginasa y adenosina desaminasa; vacunas o antígenos de vacunas tales como, por ejemplo, la vacuna contra la hepatitis B, la vacuna contra el paludismo, la vacuna contra el melanoma y la vacuna contra el VIH-1, factores de transcripción y moduladores de transcripción. Más preferentemente, la carga puede ser una proteína o un péptido seleccionado de entre proteínas o péptidos que interfieren con el ciclo celular, tales como los péptidos p53 o fragmentos de los mismos, los péptidos p21^{WAF} o fragmentos de los mismos tales como los descritos en los documentos WO 96/14334 y WO 97/42222, los péptidos FenI o fragmentos de los mismos tales como los descritos en el documento WO 96/35715 o los péptidos p16 o fragmentos de los mismos tales como los descritos en el documento WO 97/11174 o fragmentos y derivados de los mismos.
Los ejemplos de fracciones de carga no nucleotídicas/proteínicas biológicamente activas son las fracciones de fármacos seleccionadas de entre los agentes citotóxicos, agentes antineoplásticos, antihipertensores, agentes cardioprotectores, antiarrítmicos, inhibidores de ACE, antiinflamatorios, diuréticos, relajantes musculares, anestésicos locales, hormonas, fármacos reductores del colesterol, anticoagulantes, antidepresores, tranquilizantes, neurolépticos, analgésicos tales como los analgésicos narcóticos o antipiréticos, antivíricos, antibacterianos, antimicóticos, bacterioestáticos, agentes activos en el SNC, anticonvulsionantes, anxiolíticos, antiácidos, narcóticos, antibióticos, agentes respiratorios, antihistamínicos, inmunosupresores, agentes inmunoactivadores, aditivos de la nutrición, antitusígenos, agentes de diagnóstico, eméticos y antieméticos, carbohidratos, glucosoaminoglucanos, glucoproteínas y polisacáridos, lípidos, por ejemplo fosfatidil-etanolamina, fosfatidilserina y derivados de los mismos; esfingosina; esteroides; vitaminas; antibióticos incluyendo los agentes antibióticos bacterioestáticos y bactericidas; antimicóticos; antihelmínticos y otros agentes eficaces contra los agentes infecciosos incluyendo los patógenos unicelulares; pequeñas moléculas efectoras tales como la noradrenalina, los ligandos del receptor alfa adrenérgico, los ligandos del receptor de dopamina, ligandos del receptor del histamina, ligandos del receptor GABA/benzodiazepina, ligandos del receptor de serotonina, leucotrienos y triyodotironina; agentes citotóxicos tales como doxorrubicina, metotrexato y derivados de los mismos.
Preferentemente el grupo del fármaco es un agente citotóxico o antineoplásico, particularmente los que se utilizan para la terapia contra el cáncer. Dichos fármacos incluyen, en general, agentes destructores del ADN, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, productos naturales y sus análogos, inhibidores de la dihidrofolato reductasa, análogos de pirimidina, análogos de purina, inhibidores de cinasa dependiente de ciclina, inhibidores de timidilato sintasa, intercaladores de ADN, segmentadores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, antraciclinas, fármacos de los vinca, mitomicinas, bleomicinas, nucleósidos citotóxicos, fármacos de pteridina, diynenos, podofilotoxinas, fármacos que contienen platino, provocadores de diferenciación y taxanos. Los miembros particularmente útiles de estas clases incluyen, por ejemplo, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, purinas trisustituidas tales como olomoucina, roscovitina y bohemina, flavopiridol, estaurosporina, arabinósido de citosina, melfalán, leurosina, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina D, mitomicina A, carninomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina, etopósido, cisplatino, carboplatino, vinblastina, vincristina, vindesina, paclitaxel, docetaxel, taxotere, ácido retinoico, ácido butírico, acetil espermidina, tamoxifeno, irinotecán y camptotecina. Más preferentemente el fármaco se selecciona de entre olomoucina, roscovitina y bohemina, flavopiridol, estaurosporina y podofilotoxina, etopósido, derivados de purvalanol, taxol, paclitaxel y camptotecina.
Como se expuso anteriormente el fármaco y las fracciones portadoras del péptido pueden unirse directa o indirectamente mediante una fracción enlazadora. El enlace directo puede producirse mediante cualquier grupo funcional conveniente en la fracción de fármaco tal como un grupo hidroxi, carboxi o amino. El enlace indirecto que es preferible, se producirá mediante un grupo enlazador. Los grupos enlazadores adecuados incluyen los grupos alquilo bi y multifuncional, arilo, aralquilo o los peptídicos, los ésteres de alquilo, arilo o aldehídos ácidos de aralquilo y los grupos anhidrido, sulfhidrilo o carboxilo, tales como los derivados del ácido maleimidobenzoico, los derivados del ácido maleimido propiónico y los derivados de succinimido o pueden proceder de bromuro o cloruro cianúrico, carbonil diimidazol, ésteres de succinimidilo o haluros sulfónicos y similares. Los grupos funcionales o el grupo enlazador utilizado para formar los enlaces covalentes entre el enlazador y los fármacos por una parte, así como el grupo enlazador y el transportador de péptidos por la otra, pueden ser de dos o más de entre, p. ej., los grupos amino, hidrazino, hidroxilo, tiol, maleimido, carbonilo y carboxilo, etc. La fracción enlazadora puede incluir una secuencia corta de 1 a 4 restos de aminoácidos que opcionalmente incluye un resto de cisteína mediante el cual la fracción enlazadora se une a la fracción portadora de péptidos.
Según la presente invención cada fracción portadora de péptidos puede unirse a por lo menos una fracción de fármaco. En una forma de realización adicional, la fracción portadora de péptidos se prepara de tal manera que facilite enlace a más de una fracción de carga, siendo la fracción de carga igual o diferente, por ejemplo, la fracción portadora de péptidos puede comprender componentes que faciliten el acoplamiento de más de una fracción de carga tales como los derivados de los aminoácidos naturales o la inserción de un aminoácido sintético multivalente o pueden adaptarse específicamente a hacer esto por ejemplo mediante una red de restos de lisina ramificados que pueden estar unidos a la fracción portadora de péptidos como un grupo enlazador y cada resto de lisina puede acoplarse a continuación a una fracción de carga. De esta manera una sola fracción portadora de péptidos puede transportar hasta 32 fracciones de carga, preferentemente de 2 a 10 o más, preferentemente de 4 a 5 fracciones de carga. En esta forma de realización adicional cada fracción de carga puede unirse directa o indirectamente a la fracción portadora de péptidos. Cuando se une más de un tipo diferente de fracción de carga, es posible coordinar las relaciones y dosis de los fármacos individuales para facilitar la administración de combinaciones de carga específica.
En un ejemplo preferido de la presente forma de realización, la fracción portadora de péptidos es una fracción portadora de péptidos como se definió anteriormente, con una red de restos de lisina unida a por lo menos el extremo que facilita el acoplamiento de hasta 32 fracciones de carga.
En una forma de realización adicional, el vector de transposición puede comprender además una fracción de direccionamento. La fracción de direccionamiento es capaz de dirigir la fracción portadora de péptidos al tipo de célula específica al cual es preferible para que funcione la fracción de carga. De este modo, una fracción de direccionamiento actúa como un sistema de dirección que tiene predisposición a la distribución natural de los cuerpos de los fármacos o el sistema de distribución a un tipo de célula específico. Una fracción de direccionamiento puede estar unida a una fracción de carga o más preferentemente a la fracción portadora de péptidos y dirigirá el sistema de administración al punto deseado, en el momento de la llegada al cual la fracción portadora de péptidos facilitará la interiorización celular de la carga. Las fracciones de direccionamiento adecuadas incluyen las secuencias peptídicas identificadas por E. Ruoslahti et al. en la patente U.S. nº 5.622.699; Pasqualini, R., Ruoslahti, E. Nature (London) (1996), 380, 364-366, Ruoslahti, E. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. (1996), 12, 697-715; Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E., Science (1998), 279, 377-380. Estas exposiciones describen determinados péptidos que se ha descubierto que actúan como marcadores de dirección para determinados tipos de células.
Según cualquiera de las anteriores formas de realización definidas de la presente invención, los aminoácidos (cualquier número de ellos, preferentemente todos ellos) que comprende la fracción portadora de péptidos puede estar en forma L o D (inverso). Más preferentemente están en forma L.
En una forma de realización la fracción portadora de péptidos como se describió anteriormente puede estar en forma retro. En esta forma de realización adicional, los aminoácidos (cualquier número de ellos, pero preferentemente todos ellos) que comprende la fracción portadora de péptidos puede estar en forma L o D.
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Cuando la propia fracción de carga es una proteína o péptido, el transportador de péptidos y las fracciones de carga pueden estar ambos en forma L o D o alternativamente el transportador de péptidos puede estar en forma L y la carga en forma D o el transportador de péptidos en forma D y la carga en forma L.
En una forma de realización, el vector de transposición de la membrana se desplaza por la membrana celular y permanece en el citosol.
En otra forma de realización, el vector de transposición de la membrana desplaza la membrana celular y la membrana nuclear.
En las fracciones portadoras de péptidos definidas como penetratina o derivados de la misma, una modificación adicional que es de utilidad en el contexto de la presente invención es la conversión del grupo carboxilo libre del resto de aminoácido del terminal carboxi, a un grupo carboxamida. A título de ejemplo, cuando la fracción portadora de péptidos tiene la fórmula I (RRMKWKK) el resto de lisina en el terminal carboxi puede tener su grupo carboxilo convertido en un grupo carboxamida. Esta modificación se cree que aumenta la estabilidad de la fracción portadora de péptidos y por consiguiente el sistema de administración en conjunto. Por lo tanto, el resto de aminoácido del terminal C puede estar en forma -C(O)-NRR', en la que R y R' se seleccionan cada una independiente de entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquileno C1-6 o alquinilo C1-6 (denominado vulgarmente "alk"), arito tal como bencilo o alcarilo, sustituido opcionalmente cada uno por heteroátomos tales como O, S o N. Preferentemente, por lo menos uno de entre R o R' es hidrógeno, más preferentemente ambos son hidrógeno.
Preferentemente la fracción portadora de péptidos es RRMKWKK-NH_{2}.
Por lo tanto, su forma de realización más preferida, la presente invención se refiere a una fracción portadora de péptidos RRMKWKK con un resto de lisina con terminal opcionalmente amidado, directamente unido a una fracción de carga seleccionada de entre los péptidos derivados de p21^{WAF}, péptidos derivados de p16 o los fármacos, roscovitina, taxol o podofilotoxina.
Los sistemas de administración descritos en la presente memoria son nuevas entidades químicas. Las entidades químicas específicas dadas a conocer en la presente memoria incluyen:
1 
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El efecto terapéutico procedente de la administración del sistema de administración puede presentarse en el sistema de administración intacto o en cualquiera de sus componentes disociados que incluyen la fracción de carga, es decir, la fracción de carga sola o unida al enlazador, parte del enlazador o el enlazador y una parte del portador de péptidos. De este modo la expresión "sistema de administración" se ha utilizado en la presente memoria en su sentido ordinario, es decir, el de administrar algo tal como la fracción de carga y además incluir el sistema o cualquier parte del mismo que es activa en su estado intacto. Por lo tanto, la utilidad proporcionada por el sistema expuesto anteriormente es aplicable a la carga y al sistema de administración.
Los vectores de administración pueden prepararse por algunos procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la fracción portadora de péptidos puede ensamblarse utilizando los procedimientos convencionales de síntesis de péptidos en solución o en fase sólida, que proporcionan un precursor completamente protegido únicamente con el grupo amino terminal en forma reactiva desprotegida. Esta función puede hacerse reaccionar a continuación directamente con una fracción de carga o un derivado reactivo adecuado de una fracción de carga. Alternativamente, este grupo amino puede convertirse en un grupo funcional diferente adecuado para la reacción con una fracción de carga o un enlazador. Por lo tanto, p. ej. la reacción del grupo amino con el anhídrido succínico proporcionará un grupo carboxilo selectivamente dirigible, mientras que la extensión de la cadena del péptido adicional con un derivado de cisteína producirá un grupo tiol selectivamente dirigible. Una vez se ha obtenido un grupo funcional adecuado selectivamente dirigible en el precursor del vector de administración, una fracción de carga o un derivado del mismo puede acoplarse mediante p. ej. la formación de un enlace amida, éster o disulfuro. Alternativamente, un grupo enlazador, p. ej., m-maleimidobenzoílo, se introduce mediante la reacción de un precursor del grupo enlazador con la función selectivamente dirigible del precursor del vector de administración, seguido de la formación de un enlace covalente entre el grupo enlazador y un grupo de carga. Los montajes multivalentes del vector de administración de la carga pueden obtenerse, entre otros, mediante la extensión sucesiva del precursor del vector de administración selectivamente dirigible con grupos químicos trivalentes. De este modo la extensión de la cadena peptídica con derivados p. ej. de Lys protegidos con N^{\alpha,\sigma}-Fmoc proporcionarán precursores de montajes di-, tetra- y octa-valentes después de uno, dos o tres ciclos de acoplamiento/desprotección con Fmoc.
Utilizando estos procedimientos, un experto será capaz de preparar una amplia variedad de conjugados carga-transportador utilizando una variedad de fracciones enlazadoras. De manera ejemplificativa a continuación, un grupo apropiado en la fracción de carga puede seleccionarse para el acoplamiento a la fracción portadora de péptido y si se desea un enlazador unido a la carga o a la fracción portadora de péptido o a ambos antes de su acopla-
miento.
Los compuestos de la presente invención pueden formularse con un diluyente o transportador fisiológicamente aceptable para su utilización como productos farmacéuticos tanto para utilización veterinaria, por ejemplo en mamíferos, como particularmente humana mediante una variedad de procedimientos. Por ejemplo, pueden aplicarse como composición incorporando un diluyente o transportador líquido, por ejemplo una solución, suspensión o emulsión acuosa o aceitosa, que puede emplearse con frecuencia en forma inyectable para la administración parenteral y por consiguiente puede ser convenientemente estéril y exenta de pirógenos. Puede utilizarse también la administración oral y aunque las composiciones con este objetivo puedan incorporar un diluyente o transportador líquido, es más habitual utilizar un sólido, por ejemplo un material transportador sólido convencional tal como almidón, lactosa, dextrina o estearato de magnesio. Dichas composiciones sólidas pueden tomar la forma de polvos pero son más convenientemente de un tipo formado, por ejemplo en forma de comprimidos, sellos o cápsulas (incluyendo spansules). Como alternativa, los tipos más especializados de formulación incluyen liposomas y nano-
partículas.
Otros tipos de administración que por inyección o por vía oral que son de utilización tanto en los contextos humano como veterinario incluyen la utilización de supositorios u óvulos vaginales. Otra forma de composición farmacéutica es aquella para la administración bucal o nasal o la administración a las vías respiratorias tales como el tejido alveolar. Otras formulaciones de administración tópica incluyen lociones, pomadas, cremas, geles y atomizadores.
Las composiciones pueden formularse en forma farmacéutica urinaria, es decir en forma de porciones discretas que contienen una dosis unitaria, una múltiple o una subunidad de una dosis unitaria.
Los vectores de transposición de la presente invención proporcionan varias ventajas sobre los sistemas de administración conocidos. Estas ventajas incluyen mejor eficacia en comparación con los tratamientos convencionales, mejor absorción celular del agente terapéutico, mejor solubilidad en agua, reducción de los efectos secundarios y biodisponibilidad celular y disminución de la aparición de la resistencia a los fármacos.
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Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de una serie de péptidos (péptidos 1-20), que son formas truncadas de penetratina (SEC. ID. nº: 1) Abreviaturas
La nomenclatura de aminoácidos y péptidos está de acuerdo con las reglas IUPAC-IUB (Eur. J. Biochem. 1984, 138, 9-37). Otras abreviaturas: Ahx, 6-aminohexanoil; APasa, fosfatasa alcalina. DE MALDI-TOF MS, espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización con desorción por láser asistido en la matriz con extracción retardada. DIEA, N,N-diisopropiletilamina. PBS, solución salina tamponada con fosfato (fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4); PyBOP, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio; RP-HPLC, cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa; TFA, ácido trifluoroacético.
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1.1: Materiales y procedimientos General
La mezcla de desprotección/escisión del péptido utilizada en todo los experimentos fue la siguiente: 0,75 : 0,5 :
0,5 : 0,25 : 10 (w/v/v/v/v) PhOH, H_{2}O, PhSMe, 1,2-etanoditiol, TFA (Beavis, R.C. et al., (1992) Organic Mass Spectrometry 27, 156-158). Se realizó la RP-HPLC analítica y de preparación utilizando las columnas Vydac 218TP54 (4,6 \times 250 mm) y 218TP1022 (22 \times 250 mm), respectivamente. Se utilizaron caudales de 1 ml/min para las series analíticas y de 9 ml/min para el trabajo de preparación (a 25ºC). Se realizó elución con gradiente con aumentos crecientes de MeCN en H_{2}O (que contiene 0,1% de TFA) durante 20 min. (anal.) y 40 min. (prep.). Se controlaron los eluyentes a \lambda = 200-300 nm. Se analizaron también muestras de péptido por espectrometría de masas DE MALDI-TOF (instrumento ThermoBioAnalysis Dynamo). Se utilizó una matriz del ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinnámico (Beavis, R.C. et al., (1992) Organic Mass Spectrometry 27, 156-158) y se calibró el intervalo m/z apropiado utilizando patrones de péptido auténticos en el intervalo m/z 1.000-2.600.
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1.2: Síntesis múltiple simultánea de los péptidos 1-20
Se sintetizaron péptidos utilizando un kit para síntesis de péptidos Multipin (Chiron Technologies Pty. Ltd., Clayton, VIC, Australia). Las cadenas peptídicas se reunieron en "Macro Crowns" (SynPhase HM Series I, Rink Amide Linker; 5.3 \mumol/crown) utilizando Fmoc-aminoácidos (100 mM en DMF) y la química de acoplamiento PyBOP/HOBt)/DIEA (1 : 1 : 1,5). Los grupos protectores de la cadena lateral de aminoácidos fueron 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Arg), tritilo (Asn y Gln) y t-butiloxicarbonilo (Lys y Trp). Las soluciones de aminoácidos activados se repartieron utilizando un dispositivo PinAID (Chiron Technologies). Se dejaron proceder las reacciones de acoplamiento durante un mínimo de 4 h. Todas las demás manipulaciones del montaje de la cadena, incluyendo las reacciones de desprotección repetitivas (20% de piperidina en DMF) y los ciclos de lavado (DMF y MeOH) se realizaron según los procedimientos indicados en el manual del kit. Tras el acoplamiento y la desprotección de los restos \betaAla del terminal N, se acopló (+)-biotina (300 mM en DMF) (la química fue como anteriormente para los aminoácidos) durante 4 h. Tras el lavado y secado, se retiraron las "Macro Crowns" del dispositivo de síntesis y se colocaron en tubos de 10 ml tapados con polipropileno. A cada tubo se añadieron 1,5 ml de mezcla de escisión/desprotección. Después de 2 h, se retiraron las "Macro Crowns" y se lavaron con 0,5 ml cada una de TFA puro. Se añadió a cada tubo que contenía las mezclas de escisión combinadas y lavados con Et_{2}O (8 ml). Después del enfriamiento a 4ºC, se recogieron los péptidos precipitados por centrifugación (4 min a 5.000 r.p.m.) y decantación. Se volvieron a poner en suspensión los sedimentos en Et_{2}O (5 ml/tubo). Se enfriaron de nuevo las suspensiones y se aislaron los péptidos como anteriormente. Se repitió el procedimiento de lavado una vez más antes de que se secaran los péptidos en bruto al vacío.
Se redisolvieron los péptidos en bruto en TFA ac. al 0,1% utilizando tratamiento con ultrasonidos (2 ml/muestra) y se aplicaron a cartuchos de extracción en fase sólida cebados (MeOH y a continuación TFA ac. al 0,1%) (Merck LiChrolut RP-18, 500 mg). Éstos se lavaron sucesivamente (2 \times 2 ml de TFA ac. al 0,1% cada uno) y se eluyeron (2 ml de TFA al 0,1% en MeCN/H_{2}O 6 : 4). Se evaporaron los eluidos a sequedad por centrifugación al vacío. Los rendimientos y los datos analíticos para los compuestos del título se resumen en la Tabla 2.
TABLA 1
2
TABLA 2 Análisis cromatográfico y espectrométrico de masas de los péptidos 1-20
3
Preparación de péptidos 37 y 38 lineales reducidos y cíclicos oxidados
La secuencia peptídica se montó en Fmoc-Cys(Trt)-resina (asa del ácido p-hidroxi-metilfenoxiacético, 0,50 mmoles/g de grupo funcional, 0,50 g, 0,25 mmoles; ABI 401418) utilizando un sintetizador de péptidos ABI 433A (Perkin-Elmer Applied Biosystems) y la química convencional "0,25 mmoles FastMoc MonPrevPk". Tras la desprotección final con Fmoc y lavado (Et_{2}O), la resina peptidílica se secó al vacío (1,43 g, 91%). Se volvió a poner en suspensión una alícuota (285 mg, aprox. 0,05 mmoles) de este material en DMF, se purgó y se hizo reaccionar con éster del biotinamidocaproato con N-hidroxisuccinimida (137 mg, 0,3 mmoles), HOBt (50 mg, 0,3 mmoles) y DIEA (0,14 ml, 0,8 mmoles) en DMF (3 ml) durante 18 h bajo N_{2}. La resina se lavó a continuación sucesivamente con DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O, secándose antes al vacío.
La resina peptidílica biotinilada anterior (290 mg, aprox. 0,05 mmoles) se trató con la mezcla de escisión/despro-
tección (5 ml) durante 2,5 h. El residuo de la resina se filtró a continuación. Se trató el filtrado con Et_{2}O (45 ml), se enfrió la mezcla y el péptido precipitado se recogió por centrifugación (2 min. a 4.000 r.p.m.). El péptido biotinilado en bruto (141 mg, aprox. cuantitativo) se lavó dos veces más con Et_{2}O de manera similar secándose antes al vacío. Se disolvió una muestra (20 mg) de este material en TFA ac. al 0,1% (2 ml), se filtró la solución y se fraccionó por RP-HPLC de prep. Las fracciones que contenían el material puro (por RP-HPLC anal.) se agruparon y se liofilizaron para proporcionar el péptido 37 puro (12,1 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 20,8 min, pureza > 99% a \lambda = 214 nm (gradiente en MeCN de 20-30%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.776, [2 M + H]^{2+} = 1.389 (C_{127}G_{205}N_{39}O_{25}S_{3} = 2.774,43).
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El péptido 37 en bruto (antes de la RP-HPLC de prep., 35 mg) se disolvió en solución ac. de NH_{4}HCO_{3} (0,1 M, 70 ml). La mezcla destapada se agitó durante 18 h a temperatura ambiente. La solución resultante se acidificó a continuación a pH 4 con AcOH (aprox. 2 ml) para proporcionar una solución transparente que se evaporó a sequedad por centrifugación al vacío durante 18 h. El residuo se volvió a disolver en TFA ac. al 0,1% (2 ml) y se purificó por RP-HPLC de prep. de manera similar al precursor 37 reducido anteriormente excepto que el gradiente se desarrolló en MeCN del 20 al 30%. Tras la liofilización, se obtuvo el péptido 38 puro (4,5 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 15,7 min, pureza > 99% a \lambda = 214 nm (gradiente en 20-30%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.774, [2 M + H]^{2+} = 1.388 (C_{127}H_{203}N_{39}O_{25}S_{3} = 2.772,42).
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Preparación de Penetratina 39 marcada con fluoresceína
Se montó la secuencia de manera similar a la descrita para el péptido 37, excepto que se utilizó la resina con Fmoc-Lys(Boc) (carga de 0,5 mmoles/g; ABI 401425). Se hizo reaccionar la resina H-\betaAla-Arg(Pmc)-Gln(Trt)-Ile-Lys(Boc)-Ile-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc) (300 mg, aprox.
0,055 mmoles) con 5-carboxifluoresceína (103 mg, 0,27 mmoles; Sigma C 0537), PyBOP (142 mg, 0,27 mmoles)), HOBt (37 mg, 0,27 mmoles) y DIEA (71 ml, 0,41 \mumoles) en DMF (5 ml) bajo N2 yen la oscuridad durante 18 h. Se lavó a continuación (DMF, CH_{2}Cl_{2} y Et_{2}O) y se secó al vacío. Tras el tratamiento durante 2 horas con mezcla de escisión/desprotección (12 ml) a la oscuridad y preparación como anteriormente, se obtuvo el péptido en bruto (183 mg). Se purificó una alícuota (90 mg) por RP-HPLC de preparación para dar el péptido puro tras la liofilización (38 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 15,7 min, pureza > 99% a \lambda = 214 nm (gradiente en 22,5-32,5%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.677, [2 M + H]^{2+} = 5.359 (C_{128}H_{183}N_{35}O_{27}S_{3} = 2.676,11).
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1.3: Ensayo de interiorización de péptidos
Se sembraron células HaCaT (estirpe celular de fibroblasto humano "normal" inmortalizada) en placas de 96 pocillos a razón de 50.000 células por pocillo en medio (DMEM) con suero de ternero fetal al 10% y antibióticos. Tras una incubación toda la noche, se prepararon los péptidos como series de dilución en medio de células y se añadieron a las células. Al final del periodo de incubación (normalmente 10 y 60 min.), se enjuagaron las células tres veces con PBS y se fijaron durante 20 min. a -20ºC en EtOH/AcOH (95 : 5). Tras la fijación, las células se hicieron permeables por tratamiento durante 10 min. con PBS que contenía Tween-20 al 3%. Se neutralizó la actividad de la fosfatasa alcalina endógena por incubación a 65ºC durante 60 min. Se incubaron las células durante 30 min. a temperatura ambiente con fosfatasa alcalina-estreptavidina (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, UEA) en BSA al 0,1% en PBS y se lavó extensamente con PBS. Se añadió a cada pocillo la solución del sustrato recién preparada (1 mg/ml de fosfato disódico de p-nitrofenilo (Pierce Chemical Co.) en dietanolamina 10 mM (pH 9,5) que contenía MgCl_{2} 0,5 mM y se incubó hasta que se hubo desarrollado color suficiente (aprox. 30 min.). La reacción enzimática se interrumpió añadiendo NaOH ac. 2 M a cada pocillo. Se midió la actividad de fosfatasa alcalina por espectrometría a 405 nm.
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1.4: Resultados 1.4.1: Síntesis de péptidos
Se prepararon los péptidos 1-20 simultáneamente utilizando el procedimiento denominado Multipin^{TM} (Valerio, R.M. et al., (1993) International Journal of Peptide and Protein Research 42, 1-9). Se realizaron un promedio de 2 ciclos de acoplamiento/desprotección al día y la síntesis completa (incluyendo la biotinilación, escisión/desprotección, purificación por extracción en fase sólida y análisis, se completó durante una quincena. Los rendimientos aislados y purificados de los péptidos oscilaron entre 40 y 81% y las purezas fueron del 75 al 96% (Tabla 2). La excelente calidad de los péptidos se demuestra en la Figura 1. Las principales impurezas observadas (MS, datos no mostrados) eran trazas de péptidos que contenían Met(O) (picos principales en las trazas en la Fig. 1). La formación de sulfóxido de metionina parece ser un problema general asociado al procedimiento Multipin, supuestamente debido a la oxidación durante los ciclos de secado con aire extendido tras las etapas de acilación y desprotección. En principio es posible volver a reducir el Met(O) en los péptidos; p. ej., a escala analítica pudieron convertir la impureza que contiene
Met(O) en 1 limpiamente utilizando NH_{4}I/Me_{2}S en TFA (Nicolás, E. et al., (1995) Tetrahedron 51, 57013) (resultados no mostrados).
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1.4.2: Determinación de la secuencia activa mínima
Como se expuso anteriormente, el péptido de 16 elementos que abarca los restos 43 al 58 del homeodominio de Antennapedia se identificó originalmente como la secuencia mínima que conserva propiedades de transposición eficaces utilizando los péptidos correspondientes a los restos 41-60, 43-58, 41-55 y 46-60. Los resultados (Figura 2) demuestran que el truncamiento del terminal C del péptido 1 produce una reducción en el grado de interiorización pero no obstante, los péptidos truncados eran todavía capaces de desplazarse en la membrana celular. El truncamiento sucesivo del terminal N del péptido 1, sin embargo demuestra que se conservan niveles significativos de transposición en los péptidos truncados en muchos casos aproximándose al nivel alcanzado por el propio péptido 1. Se perdió poca actividad en las tres primeros truncamientos (11-13) pero sólo aproximadamente la mitad de la señal original se dejó con los derivados 14 y 15. Sin embargo, en la etapa del polímero de 10 a 7 elementos (16-19) casi la eficacia de transposición de la membrana completa en comparación con el péptido de referencia 1 se volvió a obtener antes de que se observara una caída severa con el péptido 20 de 6 elementos con terminal C. Este efecto fue reproducible en varios experimentos independientes. Aunque los valores para solamente una concentración de péptido se presentan en la Figura 2, las curvas de respuesta a la dosis para cada péptido individual han demostrado que se observa el mismo modelo, independientemente de la concentración del péptido. Se ha descubierto que la unión no específica en ausencia de células es uniforme e insignificante (resultados no mostrados).
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1.4.3 Ensayo de interiorización de péptidos de Penetratina 39 marcada con fluoresceína
Este ensayo permitió el estudio y la medición de la interiorización celular sin la posibilidad de observar artefactos que provienen de las manipulaciones celulares necesarias con los péptidos biotinilados. La Figura 4 presenta la medición directa de la interiorización del péptido en células vivas. (cuadrados cuando t = 10 min., rombos cuando
t = 60 min.). Como puede apreciarse en la Figura 4, la Penetratina biotinilada 1 se sitúa principalmente en el núcleo celular y se acumula en los nucleolos, con concentración menor en el citosol. Evidentemente la distribución es muy similar cuando se utiliza la sonda fluorescente 39 directa, validando de este modo el método de visualización indirecto de biotina-avidina. El hecho de que aparezca la Penetratina para localizar principalmente el núcleo demuestra que este péptido puede trasladarse de hecho a través tanto de las membranas plasmática como nuclear. La acumulación nucleolar puede ser debida a la fijación no específica del péptido con carga positiva al ADN.
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Ejemplo 2 Derivados de Penetratina más truncados
2.1 Según los procedimientos descritos en los apartados 1.1 y 1.2 anteriormente, se prepararon los péptidos siguientes:
RRMKWKK,
NRRMKWKK,
QNRRMKWKK,
KRMKWKK,
RKMKWKK,
RRMWKKK,
RRMKKWK,
Cada uno de estos péptidos se utilizaron en el ensayo de interiorización del péptido descrito en el apartado 1.3 anterior y se observó que se interiorizaban en las células.
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Ejemplos 5-17
Utilizando los procedimientos descritos anteriormente los vectores de transposición que comprenden la fracción portadora unida a una carga se prepararon tal como se describe.
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Ejemplo 5
H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2}
Partiendo de la resina Rink Amida AM (0,69 mmoles/g, Novabiochem), se montó H-Cys(Trt)-\betaAla-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-resina. Tras la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se purificaron las alícuotas (246 mg totales) por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN 6,5-16,5%) para proporcionar el compuesto del título puro (106,4 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 15,8 min (gradiente en MeCN del 6,5 al 16,5%, pureza >95%, \lambda = 214 nm). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.205,4, (C_{52}H_{92}N_{20}O_{9}S_{2} = 1.205,55).
2'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]paclitaxel 
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4
A una solución de 2'-(maleimidopropionoil)paclitaxel (17 \mumoles, 17,4 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (15 \mumoles, 18,1 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,0 \mul). Se agitó la mezcla durante 1 h, se filtró y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN 10-70%). El compuesto del título puro (9,4 mg) se obtuvo como un sólido incoloro. RP-HPLC anal.: t_{R} = 17,2 min, (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza >97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.211,7 = 1.388 (C_{106}H_{148}N_{22}O_{26}S_{2} = 2.210,57).
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Ejemplo 6
4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina 
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5 
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Se agitó durante 1 h una solución de podofilotoxina (60 \mumoles, 25,6 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (0,31 mmoles, 52,4 mg), DIC (0,17 mmoles, 21,5 mg) y DMAP (80 \mumoles, 10 mg) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml). Se evaporó el disolvente al vacío y el residuo se volvió a disolver en DMF/MeOH (1 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 20 al 70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (7,3 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 20,1 (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza >95%). RMN-H^{1} (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,66-2,71 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH_{2}), 2,82-2,84 (m, 2H, H2 y H3), 3,69 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,75 (s, 3H, OCH_{3}), 3,83 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH_{2}), 4,12 (t, J = 9,92 Hz, 1H, H11), 4,31 (m, 1H, H11), 4,53 (d, J = 11,4 Hz, 1H, H1), 5,80 (d, J = 8,7 Hz, 1H, H4), 5,92 (dd, J = 5,49, 1,17 Hz, 2H, OCH_{2}O), 6,32 (s, 2H, H2'6'), 6,47 (s, 1H, H8), 6,66 (s, 2H, CH=CH), 6,74 (s, 1 H, H5).
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4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]podofilotoxina 
\vskip1.000000\baselineskip
6
A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (17,7 \mumoles, 10 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (25 \mumoles, 30,4 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (3,5 \mul). Se agitó la mezcla durante 40 min., se filtró y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al 60%). Se obtuvo el compuesto del título puro como un sólido incoloro (17,8 mg, 57%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 14,8 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1772,3 (C_{81}H_{119}N_{21}O_{20}S_{2} = 1.771,07).
\newpage
Ejemplo 7
H-Cys-\betaAla-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH_{2}
Partiendo de la resina Rink Amide AM (0,69 mmoles/g, Novabiochem), se montó la resina H-Cys(Trt)-\betaAla-D-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-D-Met-D-Lys(Boc)-D-Trp-D-Lys(Boc)-D-Lys(Boc). Tras la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se purificaron las alícuotas (237 mg en total) por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 8 al 18%) para dar el compuesto del título puro (66 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 12,9 min. (gradiente en MeCN del 9 al 19%, pureza > 99%, \lambda = 214 nm). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.207,2 (C_{52}H_{92}N_{20}O_{9}S_{2} = 1.205,55).
\vskip1.000000\baselineskip
4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH_{2})] podofilotoxina 
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7 
\vskip1.000000\baselineskip
A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (18,9 \mumoles, 10,7 mg) y H-Cys-\betaAla-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys (28 \mumoles, 33,8 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (1,5 \mul). Se agitó la mezcla durante 40 min., se filtró y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al 60%). Se obtuvo el compuesto del título puro como un sólido incoloro (6,9 mg, 21%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 14,8 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.771,5 (C_{81}H_{119}N_{21}O_{20}S_{2} = 1.771,07).
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Ejemplo 8
4'-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina 
\vskip1.000000\baselineskip
8 
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Una solución de 4'-desmetilepipodofilotoxina (12 mmoles, 5 mg), ácido 3-maleimido-propiónico (50 \mumoles, 12,2 mg) y DIC (28 \mumoles, 3,47 mg) en piridina (1 ml) se agitó durante 30 min. Se añadió MeOH (0,5 ml) y la mezcla se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al 60%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (4,2 mg, 62%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 17,6 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 95%). RMN-^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,84 (m, 1H, H3), 2,99 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 3,32 (dd, J = 14,04, 5,07 Hz, 1H, H2), 3,69 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,95 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH_{2}-Mim), 4,39 (dd, J = 8,13, 4,28 Hz, 2H, H11), 4,66 (d, J = 5,00 Hz, 1H, H1), 4,89 (d, J = 3,32 Hz, 1H, H4), 6,01 (d, J = 6,42 Hz, 2H, OCH_{2}O), 6,32 (s, 2H, H2'6'), 6,57 (s, 1H, H8), 6,74 (s, 2H, CH=CH), 6,90 (s, 1H, H5). ^{13.}C-RMN (75 MHz, CDCl_{3}) \delta: 28,64, 31,02, 32,55, 37,33, 39,53, 42,99, 55,15, 65,78, 66,56, 100,65, 106,54, 107,97, 109,65, 130,68, 130,92, 133,21, 136,96, 146,62, 147,61, 150,39, 167,36, 169,30, 173,89.
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4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]epipodofilotoxina 
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9
A una solución 4'-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina (14 \mumoles, 7,9 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (26 \mumoles, 31,5 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1,9 \mul). Después de la agitación durante 40 min., la mezcla se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente del 0 al 60%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (15,8 mg, 63%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 13,3 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.757,2 (C_{80}H_{117}N_{21}O_{20}S_{2} = 1.757,05).
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Ejemplo 9
4-(yodoacetil)podofilotoxina 
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10
Una mezcla de podofilotoxina (0,49 mmoles, 204 mg), ácido yodoacético (1,03 mmoles, 192 mg), DIC (0,552 mmoles, 69,7 mg) y DMPA (0,164 mmoles, 20 mg) en CH_{2}Cl_{2} anhidro (5 ml) se enfrió a 0ºC. Se añadió piridina (0,2 ml) y la mezcla de reacción se dejó agitar durante 1 h a 0ºC. Se evaporó la mezcla a sequedad. El residuo amarillo claro resultante se volvió a disolver en MeCN y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 20 al 70%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (89,5 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 22,3 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 95%). RMN-^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,85 (m, 2H, H2,3), 3,70 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,72 (s, 2H, CH_{2}l), 3,74 (s, 3H, OCH_{3}), 4,13 (m, 1H, H11), 4,34 (m, 1H, H11), 4,53 (d, 1H, J = 3,60 Hz, H1), 5,83 (d, 1H, J = 8,43 Hz, H4), 5,93 (dd, 2H, J = 4,35, 1,17 Hz, OCH_{2}O)), 6,31 (s, 2H, H2'6'), 6,48 (s, 1H, H8), 6,77 (s, 1H, H5).
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4-[acetil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]podofilotoxina 
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11
Una solución de 4-(yodoacetil)podofilotoxina (17 \mumoles, 10 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (23 \mumoles, 28,6 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,4 \mul, 17 \mumoles). Después de agitación durante 1 h se añadió MeCN (0,5 ml) y la mezcla se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 a 60%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (29,4 mg, 100%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 14,1 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.661,0 (C_{76}H_{114}N_{20}O_{18}S_{2} = 1.659,97).
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Ejemplo 10
4'-desmetil-4-(yodoacetil)epipodofilotoxina
12
A una solución de 4'-desmetilepipodofilotoxina (0,26 mmoles, 104 mg), ácido yodoacético (0,53 mmoles, 98,8 mg) y DIC (0,32 mmoles, 40,1 mg) en CH_{2}Cl_{2} (2 ml) a 0ºC se añadió piridina (50 \mul) y DMAP (0,1 mmoles, 12,8 mg). Tras 1 h en agitación se evaporaron los disolventes. Se redisolvió el residuo en DMF (1 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 20 al 60%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (35,7 mg, 24%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 20,3 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 96%). RMN-^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 3,02 (m, 1H, H3), 3,20 (m, 1H, H2), 3,71 (s, 6H, OCH_{3}\times2), 3,63 (s, 2H, CH_{2}I), 3,74 (s, 3H, OCH_{3}), 4,05 (m, 1H, H11), 4,27 (m, 1H, H11), 4,60 (d, 1H, J = 4,94 Hz, H1), 6,06 (d, 1 H, J = 3,41 Hz, H4), 5,92 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,21 (s, 2H, H2'6'), 6,49 (s, 1H, H8), 6,80 (s, 1H, H5).
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4'-desmetil-4-[acetil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]epipodofilotoxina
13
A una solución de 4'-desmetil-4-(yodoacetil)epipodofilotoxina (17,6 \mumoles, 10 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (14,9 \mumoles, 18 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,1 \mul, 15 \mumoles). Tras la agitación durante 1 h se purificó la mezcla de reacción por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al 60%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (11,2 mg, 46%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 12,8 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.647,2 (C_{75}H_{112}N_{20}O_{18}S_{2} = 1.645,95).
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Ejemplo 11
4-(Boc-Gly)podofilotoxina
14 
\newpage
Se agitó durante 1 h una mezcla de podofilotoxina (400 mg, 0,97 mmoles), Boc-Gly-OH (510 mg, 2,91 mmoles), DIC (1,73 mmoles, 273 \mul), DMAP (0,41 mmoles, 50 mg) y piridina (173 \mul) en CH_{2}Cl_{2} (5 ml). Se evaporaron los disolventes. Se redisolvlió el residuo en DMF (1,5 ml) y se purificó por RP-HPLC (gradiente en MeCN del 20 al 70%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (502,6 mg, 91%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 22,1 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 97%).
\vskip1.000000\baselineskip
4-(H-Gly)podofilotoxina
15
A una solución de 4-(Boc-Gly)podofilotoxina (0,24 mmoles, 137 mg) en CH_{2}Cl_{2} (8 ml) se añadió TFA (0,5 ml). Después de agitar durante 1 h se evaporaron los disolventes. El residuo sólido amarillo claro resultante se purificó presión RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 10 al 70%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (41,7 mg, 37%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 15,2 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 97%).
\vskip1.000000\baselineskip
4-(maleimidopropionoil-Gly)podofilotoxina
16
A una solución de ácido 3-maleimidopropiónico (70 \mumoles, 11,8 mg) y DIC (38 \mumoles, 4,83 mg) en DMF (1 ml) se añadió 4-(H-Gly)podofiilotoxina (17 \mumoles, 8 mg), DMAP (10 \mumoles, 1,2 mg) y piridina (20 \mul). Después de agitar durante 1 h la mezcla se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al 60%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (1,1 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 18,2 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 97%).
\vskip1.000000\baselineskip
4-[(succinimidopropionoil-Gly)-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]podofilotoxina 
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17
A una solución de 4-(maleimidopropionoil-Gly)podofilotoxina (1,8 \mumoles, 1,1 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (4 \mumoles, 5 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (0,5 \mul, 4 \mumoles). Se agitó la mezcla durante 1 h. Se diluyó con MeCN (0,5 ml) y se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al 60%) para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (1,1 mg, 33%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 14,7 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 97%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.829,8 (C_{83}H_{122}N_{22}O_{21}S_{2} = 1.828,12).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 12
H-Cys-Arg-Arg-M et-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2}
Partiendo de la resina Rink Amide AM (0,69 mmoles/g, Novabiochem), se montó H-Cys(Trt)-Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-resina. Tras la desprotección (1,5 h), se obtuvo el péptido en bruto por precipitación en Et_{2}O, centrifugación/decantación y secado. Se purificaron las alícuotas (258 mg en total) por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 9 al 19%) para proporcionar el compuesto del título puro 8132,4 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 20,3 min. (gradiente en MeCN del 8 al 18%, pureza > 99%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.238,6 (C_{52}H_{92}N_{20}O_{9}S_{3} = 1.237,63).
\vskip1.000000\baselineskip
Bis-[4-(succinimidopropionoil)podofilotoxina]-(H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2})
18
A una solución de 4-(maleimidopropionoil)podofilotoxina (19 \mumoles, 11 mg) y H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-CysNH_{2} (12 \mumoles, 15 mg), en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (2,8 \mul). Tras agitación durante 1 h la mezcla se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 10 al 70%) para dar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (9,0 mg, 32%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 17,4 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.369,7 (C_{110}H_{146}N_{22}O_{31}S_{3} = 2.368,66).
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Ejemplo 13
4'-(succinimidopropionoil)epipodofilotoxina-(H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2})-10-O-(succinimi-dopropionoil)camptotecina
19
A una solución de 10-O-(maleimidopropionoil)camptotecina (0,005 mmoles, 2,6 mg), 4'-(maleimidopropionoil)epipodofilotoxina (5,6 \mumoles, 3,1 mg) y H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2} (11 \mumoles, 13 mg), en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (1,5 \mul). Tras agitación durante 1,5 h se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 10 al 70%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (1,9 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 14,8 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 96%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.304,6 (C_{107}H_{138}N_{24}O_{28}S_{3} = 2.304,58).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 14
4'-(succinimidopropionoil)epipodofilotoxina-(H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2})-2'-(succinimi-dopropionoil)paclitaxel
20
A una solución 4'-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH_{2})]epipodofilotoxina (2 \mumoles, 3,5 mg), 2'-(maleimidopropionil)paclitaxel (2 \mumoles, 2 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (0,3 \mul). Tras agitación durante 1,5 h se purificó la mezcla de reacción por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 10 al 70%) para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (1,5 mg). RP-HPLC anal.: t_{R} = 17,8 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 2.794,5 (C_{134}H_{173}N_{23}O_{37}S_{3} = 2.794,14).
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Ejemplo 15
4'-metoxi-4-(4''-aminoanilino-(succinimidopropionoil)-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]epipo-dopilotoxina
21
A una solución de 4'-metoxi-[4''-aminoanilino-(maleimidopropionoil)]epipodofilotoxina (7 \mumoles, 4,6 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (14 \mumoles, 16,3 mg) en DMF (1 ml) se añadió Et_{3}N (1 \mul). Tras agitación durante 1 h, la mezcla se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al 60%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (6,4 mg, 49%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 15,2 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.861,6 (C_{87}H_{125}N_{23}O_{19}S_{2} = 1.861,20).
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Ejemplo 16
4'-desmetil-4-[4''-aminoanilino-(maleimidopropionoil)]epipodofilotoxina
22
A una solución de 4'-desmetil-4-(4''-aminoanilino)epipodofilotoxina (24 \mumoles, 12 mg), ácido 3-maleimidopropiónico (49 \mumoles, 8,3 mg) y DIC (27 \mumoles, 3,4 mg) en DMF/CH_{2}Cl_{2} (2 ml) se añadió piridina (10 \mul). Después de agitar durante 1 h, se evaporó la mezcla de reacción. El sólido amarillo claro resultante se purificó por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 10 al 70%) para proporcionar el compuesto del título puro como un sólido incoloro (5,3 mg, 34%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 19,5 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 96%). RMN-^{1}H (300 MHz, CDCl_{3}) \delta: 2,65 (t, 2H, J = 7,3 Hz, CH_{2}), 2,98 (m, 1H, H3), 3,17 (m, 1H, H2), 3,79 (s, 6H, OCH_{3}), 3,93 (t, 2H, J = 7,0 Hz, CH_{2}), 3,99 (m, 1H, H5, H11), 4,38 (m, 1H, H11), 4,58 (d, 1 H, J = 4,95 Hz, H1), 4,64 (d, 1 H, J = 3,95 Hz, H4), 5,96 (m, 2H, OCH_{2}O), 6,33 (s, 2H, H2'6'), 6,49-6,53 (m, 3H, H8, Ar), 6,74 (s, 2H, CH=CH), 6,75 (s, 1 H, H5), 7,33 (m, 2H, Ar).
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4'-desmetil-4-[4''-aminoanilino-(succinimidopropionoil)-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]epipodofilotoxina
23
A una solución de 4'-desmetil-4-[4''-aminoanilino-(maleimidopropionoil)]epipodofilotoxina (8,3 \mumoles, 5,3 mg) y H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2} (13 \mumoles, 15,6 mg) en DMF (1,5 ml) se añadió Et_{3}N (2 \mul). Después de agitar durante 1 h, se purificó la mezcla por RP-HPLC de preparación (gradiente en MeCN del 0 al 60%) para proporcionar el compuesto del título como un sólido incoloro (14,9 mg, 97%). RP-HPLC anal.: t_{R} = 13,7 min. (gradiente en MeCN del 0 al 60%, pureza > 98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]^{+} = 1.847,1 (C_{86}H_{123}N_{23}O_{19}S_{2} = 1.847,17).
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Ejemplo 17
Evaluación de los derivados del etopósido y podofilotoxina en el ensayo de inhibición de la topoisomerasa II
Ensayo con topoisomerasa II - Se incubó ADN plásmido (0,3 \mug) a 37ºC con 4 unidades de topoisomerasa II humana recombinante purificada en tampón de escisión (Tris\cdotHCl 30 mM, pH 7,6, NaCl 60 mM, ATP 3 mM, mercaptoetanol 15 mM, MgCl_{2} 8 mM) con o sin adición del compuesto de ensayo (a una concentración final de 1 mM, 100 \muM o 10 \muM). Se interrumpieron las reacciones mediante la adición inmediata de SDS (p/v final al 1%). Se trataron las muestras con proteinasa K (30 min. a 37ºC) y se extrajo dos veces con un volumen igual de CHCl_{3}/alcohol i-amílico 42:1. Después de añadir colorante de carga, se cargaron las muestras hasta una 4 \times TAE, gel de agarosa al 1% que contiene 0,5 mg/ml de bromuro de etidio y se realizó la electroforesis durante 16 a 24 h. La inhibición de topoisomerasa II fue interpretada por la producción del ADN plásmido lineal, que representa el producto intermedio de escisión atrapado y mediante la relación del sustrato (ADN superenrollado) para el producto (ADN distendido). Se realizó un ensayo de distensión de manera idéntica, excepto que el tampón de la reacción fue optimizado para la detección de catálisis en lugar de escisión, es decir, solamente 2 unidades de enzima se utilizaron por muestra. El tampón de reacción fue Tris\cdotHCl 50 mM, pH 8, KCl 120 mM, ATP 0,5 mM, ditiotreitol 0,5 mM, MgCl_{2} 10 mM. La inhibición con topoisomerasa II fue interpretada por la relación del sustrato (ADN superenrollado) a producto (ADN distendido).
TABLA 8
24
a)
I indica inhibición de la relajación del plásmido superenrollado por topoisomerasa II. C indica la acumulación del compuesto intermedio de la reacción de la topoisomerasa II.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 18 Comparación de penetratina completa y truncada como vector para una fracción de fármaco
Con objeto de comparar el efecto biológico citotóxico en células de cáncer (estirpes celulares en la Tabla 9) de las fracciones de fármaco aplicadas utilizando la longitud completa y las fracciones portadoras de penetratina truncadas, se expusieron los conjugados apropiados de podofilotoxina (podofilotoxin-(vector de 16 elementos), 4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly-NH_{2})]podofilotoxina; vector de 7 elementos de podofilotoxina, 4-[succinimidopropionoil-(H-Cys-\betaAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH_{2})]-podofilotoxina, se expusieron a las células a concentraciones apropiadas.
Se aplicaron diluciones en serie de los compuestos de ensayo a las estirpes celulares. Tras la incubación durante 96 h, se evaluó la citotoxicidad utilizando un ensayo de proliferación celular con sulforrodamina B patrón (SRB). En la Tabla 9 se resumen los valores de IC_{50}.
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TABLA 9
25 
\vskip1.000000\baselineskip
Como puede apreciarse en la Tabla, el conjugado de penetratina-podofilotoxina truncado es más eficaz desde el punto de vista de la actividad antiproliferante en células tumorales en cuanto que presenta toxicidad generalizada menor.

Claims (39)

1. Fracción portadora de péptido de transposición de membrana de fórmula:
102
en la que de 6 a 9 aminoácidos se eliminan de la terminación amino, o una variante de dicha fracción portadora de péptido de transposición de membrana en la que (a) uno o dos restos de aminoácido se sustituyen homólogamente, (b) el orden de dos restos de aminoácido está invertido, o (c) tanto (a) como (b) están presentes conjuntamente.
2. Fracción portadora de péptido según la reivindicación 1, que comprende por lo menos el péptido de fórmula:
103
3. Fracción portadora de péptido según la reivindicación 1, en la que se eliminan 9 aminoácidos.
4. Fracción portadora de péptido según la reivindicación 1, seleccionada de entre RRMKWKK, NRRMKWKK, QNRRMKWKK y FQNRRMKWKK.
5. Fracción portadora de péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, seleccionada de entre
KRMKWKK, RKMKWKK, RRMWKKK y RRMKKWK.
6. Fracción portadora de péptido según la reivindicación 1, representada por cualquiera de los compuestos 16 a 19 a continuación.
26
7. Fracción portadora de péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el grupo carboxilo libre del resto de aminoácido del terminal carboxi esta en la forma -C(O)-NRR', en la que R y R' se seleccionan cada uno independiente de entre hidrógeno, alquilo C1-6, alquileno C1-6 o alquinilo C1-6, arilo, opcionalmente sustituido cada uno por heteroátomos tales como O, S o N.
8. Fracción portadora de péptido según la reivindicación 7, en la que el grupo carboxilo del resto del aminoácido del terminal carboxi es un grupo carboxamida.
9. Fracción portadora de péptido según la reivindicación 8, de fórmula RRMKWKK-NH_{2}.
10. Fracción portadora de péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el péptido está compuesto de restos de aminoácidos en su forma L.
11. Fracción portadora de péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el péptido está compuesto de restos de aminoácidos en su forma D.
12. Fracción portadora de péptido según la reivindicación 10 u 11, en la que el péptido está en forma retro.
13. Vector de transposición de membrana que comprende una fracción portadora de péptido de transposición de membrana según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, unido a una fracción de carga.
14. Vector de transposición según la reivindicación 13, en el que la fracción de carga es un oligonucleótido, nucleótido, proteína, péptido, compuesto biológicamente activo o agente de diagnóstico.
15. Vector de transposición según la reivindicación 14, en el que la fracción de carga es un oligonucleótido o nucleótido seleccionado de entre genes, fragmentos de gen, secuencias de ADN, ADNc, ARN, nucleótidos, nucleósidos, bases heterocíclicas, oligonucleótidos complementarios o mensajeros sintéticos y no sintéticos.
16. Vector de transposición según la reivindicación 14, en el que la fracción de carga es una proteína o péptido que interfiere en el ciclo celular.
17. Vector de transposición según la reivindicación 16, en el que la fracción de carga se selecciona de entre fragmentos del péptido p53, fragmentos del péptido p21^{WAF}, fragmentos del péptido Fen1 o fragmentos del péptido p16.
18. Vector de transposición según la reivindicación 13, en el que la fracción de carga es un fármaco.
19. Vector de transposición según la reivindicación 18, en el que la fracción de carga procede de un fármaco citotóxico.
20. Vector de transposición según la reivindicación 19, en el que la fracción de carga se selecciona de entre agentes destructores del ADN, antimetabolitos, antibióticos antitumorales, productos naturales y sus análogos, inhibidores de la dihidrofolato reductasa, análogos de pirimidina, análogos de purina, inhibidores de cinasa dependiente de ciclina, inhibidores de timidilato sintasa, intercaladores de ADN, segmentadores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, antraciclinas, fármacos de vinca, mitomicinas, bleomicinas, nucleósidos citotóxicos, fármacos de pteridina, diynenos, podofilotoxinas, fármacos que contienen platino, inductores de diferenciación y taxanos.
21. Vector de transposición según la reivindicación 20, en el que la fracción de carga se selecciona de entre metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, purinas trisustituidas tales como olomoucina, roscovitina y bohemina, flavopiridol, estaurosporina, arabinósido de citosina, melfalán, leurosina, actinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, mitomicina D, mitomicina A, carninomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina, etopósido, cisplatino, carboplatino, vinblastina, vincristina, vindesina, paclitaxel, docetaxel, taxotere, ácido retinoico, ácido butírico, acetil espermidina, tamoxifeno, irinotecán y camptotecina.
22. Vector de transposición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en el que la fracción de carga está unida directamente a la fracción portadora de péptidos.
23. Vector de transposición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en el que la fracción de carga está unida indirectamente a la fracción portadora de péptidos mediante una fracción enlazadora.
24. Vector de transposición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 23, que comprende además una fracción de direccionamiento.
25. Vector de transposición según la reivindicación 24, en el que la fracción de direccionamiento está unida a la fracción portadora de péptidos.
26. Vector de transposición según la reivindicación 24, en el que la fracción de direccionamiento está unida a la fracción de carga.
27. Vector de transposición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 26, en el que cada fracción portadora de péptidos presenta más de una fracción de carga.
28. Vector de transposición según la reivindicación 27, en el que las fracciones de carga son diferentes.
29. Vector de transposición según la reivindicación 27 ó 28, en el que las fracciones de carga están unidas a a fracción portadora de péptidos por una red de restos de lisina.
30. Vector de transposición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que la fracción portadora de péptidos está compuesta por restos de aminoácidos en su forma L.
31. Vector de transposición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 30, en el que la fracción portadora de péptidos está compuesta por restos de aminoácidos en su forma D.
32. Vector de transposición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 31, en el que la fracción portadora de péptidos está en la forma retro.
33. Vector de transposición según la reivindicación 17 ó 18, en el que tanto la fracción portadora de péptidos como la fracción de carga están en la forma L.
\newpage
34. Vector de transposición según la reivindicación 17 o 18, en el que tanto la fracción portadora de péptidos como la fracción de carga están en la forma D.
35. Vector de transposición según la reivindicación 17 ó 18, en el que la fracción portadora de péptidos está en la forma D y la fracción de carga en la forma L.
36. Vector de transposición según la reivindicación 17 ó 18, en el que la fracción portadora de péptidos está en la forma L y la fracción de carga en la forma D.
37. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 36, que transpone la membrana celular y permanece en el citosol.
38. Vector según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 36, que transpone la membrana celular y la membrana nuclear.
39. Sistema de administración que comprende una fracción de fármaco unida a una fracción portadora mediante una fracción enlazadora, en el que dichas fracción de fármaco, fracción portadora y fracción enlazadora se seleccionan de entre las combinaciones presentadas en la tabla siguiente:
27
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