CZ20011700A3 - Benzoxazolové deriváty a léčiva na jejich bázi - Google Patents

Benzoxazolové deriváty a léčiva na jejich bázi Download PDF

Info

Publication number
CZ20011700A3
CZ20011700A3 CZ20011700A CZ20011700A CZ20011700A3 CZ 20011700 A3 CZ20011700 A3 CZ 20011700A3 CZ 20011700 A CZ20011700 A CZ 20011700A CZ 20011700 A CZ20011700 A CZ 20011700A CZ 20011700 A3 CZ20011700 A3 CZ 20011700A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
group
peptide
amino acid
carrier
carrier group
Prior art date
Application number
CZ20011700A
Other languages
English (en)
Inventor
Sojiro Shiokawa
Yasuo Sato
Masaaki Izumi
Satoshi Yoshida
Hiroshi Murakami
Tomoko Ito
Tetsutaro Niisato
Original Assignee
Meiji Seika Kaisha, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Seika Kaisha, Ltd. filed Critical Meiji Seika Kaisha, Ltd.
Publication of CZ20011700A3 publication Critical patent/CZ20011700A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Description

Peptidová nosná skupina pro transport
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nových peptidových nosných skupin pro transport membránami a vektorů pro transport membránami, obsahujících novou peptidovou nosnou skupinu spolu s dopravovanou skupinou, a použití při zlepšeném dodávání Λ terapeutických látek do cílových buněk.
i
Dosavadní stav techniky
Farmaceutický průmysl se již po mnoho let zabývá účinným dodáváním terapeutických prostředků. Tento problém může být připisován krátké době vylučování léku v těle (krátký poločas), umístění v místě působení nebo také povaze samotného terapeutického prostředku, například jeho rozpustnosti, hydrofobnosti apod. Bylo tedy přijato mnoho směrů vývoje a strategií, včetně formulace terapeutického prostředku tak, aby byl chráněn před nepříznivým prostředím na své cestě do místa působení, například prostřednictví enterosolventních tablet, zařízení pro řízené uvolňování apod.
Vývoj terapeutických prostředků odvozených od peptidů přinesl λ další problém v důsledku jejich vnímavosti vůči enzymatické degradaci, a to nejen v gastrointestinálním traktu, ale i v krevním 4 oběhu. Jeden příklad, jak byl tento problém řešen, se týká vložení peptidů do liposomů nebo polymerních mikrosfér, které směrují peptidy do lymfatického systému.
Další související problém zvláště v případě terapeutických prostředků fungujících intracelulárně je bariéra, kterou představuje buněčná membrána. Může tedy být možné zvýšit poločas
terapeutického prostředku nebo zajistit jeho průchod tělem bez degradace, ale mnoho prostředků musí ve skutečnosti pro dosažení jejich terapeutického účinku vstoupit do buněk.
Homeoproteiny jsou transaktivační faktory, které se účastní celé řady morfologických procesů. Vážou se na DNA prostřednictvím sekvence 60 zbytků aminokyselin, tzv. homeodomény. Struktura této domény se skládá ze tří α-šroubovic, které jsou mezi šroubovicemi 2 a 3 přerušeny β-otočkami (Gehring, W. J. a další, (1990) Trends Genet ji
6, 323 - 9). Fylogenetický vztah mezi četnými homeoproteiny je nápadný na úrovni homeodomény a zvláště v rámci třetí a-šroubovice. Tato šroubovice je odpovědná jak pro interakci s DNA, tak pro schopnost homeoproteinů nespecifickým způsobem provádět translokaci přes buněčné membrány do buněčných jader.
Evropský patent 485 578 uvádí, že homeodoména a zvláště šroubovice 3 peptidu homeoboxu, zvláště odvozeného z Drosophila Antennapedia, se používá jako intracelulární transportní vektor. Patent uvádí, že specifická sekvence o délce 57 aminokyselin homeopeptidu Drosophila Antennapedia (označovaná jako peptid pAntp), byla schopna pronikat do fibroblastů a embryonálních buněk (in vivo). Přitom byl kladem důraz na posledních 27 aminokyselin sekvence, která odpovídá šroubovici 3 a 4. Neuvádí se žádný popis peptidu pAntp navázaného na jakýkoli jiný peptid nebo terapeutický prostředek.
x Další literární prameny (Derossi D. a další, J. Biol. Chem. (1994)
269, 10444 - 10450, Derossi D. a další, J. Biol. Chem. (1996) ? 271,18188 - 18193, Joliot A. H. a další (1991) The New Biol. 3, 1121 1134 a PNAS (1991) 88, 1864 - 1868, Perez F. a další, J. Cell Sci. (1992) 102, 712 - 722), se soustředily na syntetický peptid o délce 16 aminokyselin, odvozený od třetí šroubovice homeodomény Antennapedia, který může být použit pro intracelulární dodávání biologicky aktivních produktů a antisense oligonukleotidů.
- 3 Aminokyselinová sekvence tohoto peptidu je RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID No. 1) a peptid je označován také jako penetratin. V průběhu výzkumů syntetizovali výše uvedení autoři několik variant této sekvence, a to varianty odpovídající zbytkům 41 - 60, 41 - 55 a 46 - 60 peptidu pAntp a ukázali, že ve všech případech byly jediné peptidy pronikající do nitra buněk peptidy, které obsahovaly zbytky 43 - 58 (Derossi D. a další, výše).
V úsilí o zabránění enzymatického štěpení peptidu připravili Brugidou J. a další, (Biochem. Biophys. Res. Comm. (1995) 214 (2), 685 - 693) formu retro-inverso (D aminokyseliny v opačném pořadí) SEQ ID No. 1, substitucí dvou isoleucinových zbytků v polohách 3 a 5 penetratinu valinem a přidáním glycinového zbytku na C-konec pro umožnění vazby na pryskyřici. Další forma retro-inverso byla připravena náhradou nadbytečného glycinu cholesterolovou skupinou navázanou prostřednictvím sulfhydrylové propojovací skupiny. Přidání cholesterolové skupiny zlepšilo pronikání v důsledku zvýšené hydrofobičnosti molekuly.
Tento vývoj formy retro-inverso penetratinu poskytl přihlášku WO 97/12912, která popisuje peptidy o délce 16 aminokyselin obsahující mezi 6 a 10 hydrofobními aminokyselinami, přičemž šestou aminokyselinou od každého konce musí být tryptofan. Tato publikace se pokouší definovat minimální požadované vlastnosti sekvencí schopných působit jako internalizační vektory tak, že jde o zachování tryptofanového zbytku v šesté poloze od aminokonce, a že peptid obsahuje od 6 do 10 zbytků hydrofobních aminokyselin (klasifikace zbytků hydrofobních aminokyselin ve WO 97/12912 nemusí souhlasit s obecně přijímanou klasifikací).
Z výše diskutovaných údajů tak, jak byly shrnuty ve WO 97/12912, byl vyvozen závěr, že pro vlastnosti peptidů homeodomény z hlediska translokace membránou je nezbytná přítomnost tryptofanového zbytku v poloze šestého zbytku od aminokonce.
• ·
S těmito požadavky byla v souladu varianta penetratinu vzorce (KWKK)4, jejíž translokační schopnost byla popsána (Maruta H. a další, Cytoskeletal tumour suppressors that block oncogenic RAS signalling. Presented at Anti-Cancer Proteins a Drugs: Structure, Function and Design; 6. - 9. listopad 1998, New York Academy of Sciences. Poster/abstract No. 11) a Plank C. a další (Human Gen Therapy (1998) 10, 319 - 332), kde se uvádí celá řada rozvětvených membránových translokačních peptidů jako je (KWKK^KGGC, přičemž každá skupina KWKK je navázána na následující lysinový zbytek.
Předkládaný vynález se snaží poskytnout širokou řadu membránových translokačních peptidů založených na penetratinu, včetně peptidů, které neobsahují v šesté poloze od aminového konce zbytek tryptofanu a peptidů, které mají menší velikost než penetratin. Tyto menší nebo zkrácené formy penetratinu jsou výhodné v tom, že jsou přijatelnější pro farmaceutický průmysl jako nosné skupiny pro dodávání prostřednictvím konjugátu nosič - dopravovaná látka, které mají výhodné vlastnosti z hlediska imunogenicity rozpustnosti a vylučování, a v některých případech mají i výhodnou účinnost ve srovnání s použitím konjugátu složeného z penetratinu s úplnou délkou (SEQ ID No. 1). První provedení předkládaného vynálezu se tedy týká zkrácených derivátů penetratinu, zatímco druhé provedení se týká modifikovaných forem penetratinu. Tato první a druhá provedení se podrobněji popisují dále a jsou obě označována jako „nosná skupina“ (nebo nosná část, carrier moiety) systému dodávání dopravované látky (cargo).
Podstata vynálezu
První provedení předkládaného vynálezu se tedy týká peptidové nosné skupiny pro transport membránami vzorce:
·· ···· • ·
QIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID No. 1)
16 kde z aminokonce je odstraněn alespoň jeden zbytek aminokyseliny nebo jejích variant. Bylo překvapivě pozorováno, že na rozdíl od poznatků dosavadního stavu techniky se zachová schopnost přenosu přes buněčnou membránu u sekvencí, které neobsahují úplné zbytky 43 - 58 peptidů pAntp.
Podle předkládaného vynálezu může být z aminokonce odstraněno až 9 aminokyselin, s výhodou se provede delece od 6 do 9 aminokyselin.
Ve výhodném provedení zahrnují peptidové nosné skupiny podle předkládaného vynálezu sloučeniny 2 až 20 ukázané v tabulce 1 níže, kde jsou ukázány společně se skupinou biotinyl-3Ala používanou pro účely biochemického stanovení. Ve výhodnějším provedení je peptidem sloučenina 16, 17, 18 nebo 19.
Ve výhodném provedení tedy obsahuje nosná skupina peptidovou sekvenci RRMKWKK nebo její variantu a může být s výhodou definována jako peptidová nosná skupina pro transport membránami obsahující až do 15 aminokyselinových zbytků a alespoň peptid vzorce
RRMKWKK (I)
7 nebo jeho varianty. Výhodná provedení diskutovaná v souvislosti s prvním provedením se týkají ve svém celku peptidů vzorce (I). V jednom provedení jsou aminokyselinové zbytky navázané na peptid vzorce (I) odpovídající zbytky v penetratinu nebo jeho variantách.
Bylo pozorováno, že tato sekvence (vzorce (I)) a její varianty, jsou minimálními sekvencemi penetratinové molekuly, nezbytnými pro dosažení přenosu membránami. Výše uvedená provedení podporují ·«·· • · « * * *
názor, že přítomnost tryptofanu v poloze 6 od obou konců peptidu, není pro transport membránami nezbytná.
V rámci výše uvedených definicí peptidových nosných skupin podle předkládaného vynálezu mohou být specifické aminokyselinové zbytky peptidu modifikovány takovým způsobem, že zůstane zachována jejich translokační schopnost, a tyto modifikované peptidy budou označovány jako „varianty“.
Mezi varianty nosné skupiny definované výše patří jakákoli variace, kde: (a) jeden nebo více aminokyselinových zbytků je nahrazeno aminokyselinovým zbytkem, který se vyskytuje nebo který se nevyskytuje v přírodě, (b) převrátí se pořadí dvou nebo více aminokyselinových zbytků, (c) současně jsou přítomny variace (a) a (b), (d) mezi jakýmikoli dvěma aminokyselinovými zbytky je přítomna mezerníková skupina (spacer), (e) jeden nebo více aminokyselinových zbytků je v peptoidní formě, (f) byla modifikována kostra (N-C-C) jednoho nebo více aminokyselinových zbytků peptidu, nebo dojde k variacím (a) - (f) v kombinaci. Varianty s výhodou pocházejí z některé z variací (a), (b) nebo (c).
Mohou se tedy vyskytovat homologní substituce (substituce a náhrada se zde používají ve významu záměny existujícího aminokyselinového zbytku za alternativní zbytek), tj. substituce podobných aminokyselinových zbytků jako je bázický zbytek za bázický, kyselý za kyselý, polární za polární apod. Může také docházet k nehomologní substituci, tj. jedné třídy zbytků na jinou třídu, nebo alternativně mohou být zařazeny aminokyseliny, které se v přírodě nevyskytují, jako je ornithin (dále označovaný jako Z), ornithindiaminomáselná kyselina (dále označovaná jako B), norleucinornithin (dále označovaný jako O), pyridylalanin, thienylalanin, naftylalanin a fenylglycin, přičemž podrobnější seznam bude uveden níže. V rámci každé nosné peptidové skupiny může být současně modifikován jeden nebo více aminokyselinových zbytků.
···*
Jak se zde používá, aminokyseliny jsou klasifikovány do následujících tříd:
bazické; Η, K, R kyselé; D, E nepolární; A, F, G, I, L, Μ, Ρ, V, W polární; C, N, Q, S, T, Y, (přičemž pro označení aminokyselin se používá mezinárodního jednopísmenkového kódu), přičemž homologní a nehomologní substituce jsou definovány s použitím těchto tříd. Homologní substituce se tedy používá pro označení substituce v rámci jedné třídy, zatímco nehomologní substituce označuje substituce z rozdílné třídy, nebo substituci aminokyselinou, která se v přírodě nevyskytuje.
Mezi jakékoli dva aminokyselinové zbytky nosné skupiny mohou být vloženy vhodné mezerníkové skupiny, včetně alkylových skupin, jako je methyl, ethyl nebo propyl, navíc k aminokyselinovým mezerníkovým skupinám, jako jsou zbytky glycinu nebo β-alaninu. Další forma variace, typ (e), zahrnuje přítomnost jednoho nebo více zbytků aminokyselin v peptoidní formě, což je termín odborníkům v oboru dobře známý. Aby se zabránilo pochybnostem, „peptoidní forma“ se používá pro označení varianty aminokyselinových zbytků, ve kterých je skupina substituující oc-uhlík přítomna na dusíkovém atomu zbytku, namísto α-uhlíku. Způsoby výroby peptidů v peptoidní formě jsou v oboru dobře známy, viz například Simon R. J. a další, PNAS (1992) 89 (20), 9367 - 9371 a Horwell D. C., Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132 - 134. Modifikace typu (f) se může provádět způsoby popisovanými v mezinárodní patentové přihlášce PCT/GB99/01855.
V rámci definice vzorce (I) bylo ukázáno, že je výhodné, jestliže se variace aminokyselin, s výhodou typu (a) nebo (b), vyskytují nezávisle v jakékoli z poloh 1, 2, 3, 5 nebo 6. Výhodněji se variace aminokyselin vyskytuje v polohách 3 nebo 7, zvláště 3. Bylo zjištěno,
·* ··♦· že homologní substituce je výhodná v polohách 1 a 2, zatímco bylo překvapivě pozorováno, že polohy 3, 4, 5 a 6 přijímají nehomologní substituci. Jak je uvedeno výše, současně může být přítomna více než jedna homologní nebo nehomologní substituce, například v polohách 2 a 3, 4 a 5 nebo 5 a 6. Další variace může probíhat v důsledku obrácení pořadí většího počtu aminokyselinových zbytků v rámci sekvence. Například v peptidové sekvenci RRMKWKK, mohou být převráceny zbytky lysinu a tryptofanu za poskytnutí peptidu RRMWKKK. Tato modifikace se může navíc vyskytovat v kombinaci s homologní nebo nehomologní substitucí, například sekvence RROKWKK poskytne sekvenci RROWKKK.
Nosná skupina může obsahovat další aminokyselinové zbytky na aminovém konci, s výhodou přidáním 1 až 3 aminokyselinových zbytků. Další provedení předkládaného vynálezu se tedy týká peptidu zvoleného ze skupiny RRMKWKK, NRRMKWKK, QNRRMKWKK a FQNRRMKWKK.
V nejvýhodnějším provedení prvního provedení vynálezu má zkrácená forma penetratinu vzorec (I) popsaný výše, nebo výhodněji obsahuje peptid o délce 7 aminokyselin zvolený ze skupiny KRMKWKK, RKMKWKK, RREKWKK, RROKWKK, RROKWKK, RRMKQKK, RRMKWFK, RORKWKK, RRMWKKK, RROWKKK RRMKKWK a RROKKWK, výhodněji je peptidová nosná skupina RRMKWKK.
Druhé provedení předkládaného vynálezu se týká peptidové nosné skupiny pro transport membránami vzorce:
RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID No. 1)
16 kde alespoň jeden aminokyselinový zbytek je nahrazen alternativním aminokyselinovým zbytkem, který se vyskytuje nebo nevyskytuje v přírodě.
♦· ··· · · · -Q-···* ·· · ·· ···
Ve výhodném provedení druhého provedení předkládaného vynálezu je šestý zbytek aminokyseliny, počítáno od aminového konce peptidů, odlišný od tryptofanu. Jak bude popsáno dále, bylo ukázáno, že převážně přijímaný názor o nutnosti přítomnosti tryptofanu v této poloze není podložený, a tím bylo identifikováno širší rozmezí možných peptidů pro transport membránami.
Ve výhodném provedení zahrnují peptidové nosné skupiny podle předkládaného vynálezu sloučeniny 21 až 36 (SEQ ID No. ukázané v if tabulce 3 níže), kde jsou uvedeny spolu se skupinou biotinyl-pAla * používanou pro účely biochemického testu. Ve výhodnějším provedení je peptidem sloučenina jako sloučenina 26, kde šestou aminokyselinou od aminového konce není tryptofan.
V jedněm provedení je zbytek náhradní aminokyseliny zvolen ze zbytků alanin, arginin, asparagin, kyselina asparagová, cystein, kyselina glutamová, glutamin, glycin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, prolin, serin, threonin, tryptofan, tyrosin a valin. Aminokyselinové zbytky používané jako náhrady mohou být navíc zvoleny z aminokyselin, které se v přírodě nevyskytují. V rámci výše uvedených definic peptidových nosných skupin podle předkládaného vynálezu mohou být specifické aminokyselinové zbytky peptidů modifikovány takovým způsobem, že si zachovávají svou transportní schopnost, přičemž tyto modifikované peptidy se označují jako „varianty“.
1 Mezi varianty nosné skupiny tak jak je definována výše, patří jakákoli variace, kde: (a) je jeden nebo více aminokyselinových zbytků nahrazen zbytkem aminokyseliny, který se vyskytuje nebo nevyskytuje v přírodě, (b) převrátí se pořadí jednoho nebo více aminokyselinových zbytků, (c) jsou společně přítomny variace (a) a (b), (d) mezi jakýmikoli dvěma aminokyselinami je přítomna mezerníková skupina, (e) jeden nebo více zbytků aminokyselin je ve formě peptoidu, (f) byla modifikována kostra (N-C-C) jednoho nebo více aminokyselinových
zbytků peptidu, nebo byla provedena jakákoli kombinace variací (a) (f). S výhodou pocházejí varianty z jedné z variací (a), (b) nebo (c).
Mohou se tedy vyskytovat homologní substituce (substituce a náhrada se zde používají ve významu záměny existujícího aminokyselinového zbytku za alternativní zbytek), tj. substituce podobných aminokyselinových zbytků jako je bázický zbytek za bázický, kyselý za kyselý, polární za polární apod. Může také docházet k nehomologní substituci, tj. jedné třídy zbytků na jinou třídu, nebo alternativně mohou být zařazeny aminokyseliny, které se v přírodě nevyskytují, jako je ornithin (dále označovaný jako Z), ornithindiaminomáselná kyselina (dále označovaná jako B), norleucinornithin (dále označovaný jako O), pyridylalanin, thienylalanin, naftylalanin a fenylglycin, přičemž podrobnější seznam bude uveden níže. V rámci každé nosné peptidové skupiny může být současně modifikován jeden nebo více aminokyselinových zbytků.
Jak se zde používá, aminokyseliny jsou klasifikovány do následujících tříd:
bazické; Η, K, R kyselé; D, E nepolární; A, F, G, I, L, Μ, P, V, W polární; C, N, Q, S, T, Y, (přičemž pro označení aminokyselin se používá mezinárodního jednopísmenkového kódu), přičemž homologní a nehomologní substituce jsou definovány s použitím těchto tříd. Homologní substituce se tedy používá pro označení substituce v rámci jedné třídy, zatímco nehomologní substituce označuje substituce z rozdílné třídy, nebo substituci aminokyselinou, která se v přírodě nevyskytuje.
Mezi jakékoli dva aminokyselinové zbytky nosné skupiny mohou být vloženy vhodné mezerníkové skupiny, včetně alkylových skupin, • · · · ···· • ·
. 11 _·:· ·* jako je methyl, ethyl nebo propyl, navíc k aminokyselinovým mezerníkovým skupinám, jako jsou zbytky glycinu nebo β-alaninu. Další forma variace, typ (e), zahrnuje přítomnost jednoho nebo více zbytků aminokyselin v peptoidní formě, což je termín odborníkům v oboru dobře známý. Aby se zabránilo pochybnostem, „peptoidní forma“ se používá pro označení varianty aminokyselinových zbytků, ve kterých je skupina substituující α-uhlík přítomna na dusíkovém atomu zbytku, namísto a-uhlíku. Způsoby výroby peptidů v peptoidní formě jsou v oboru dobře známy, viz například Simon R. J. a další, PNAS (1992) 89 (20), 9367 - 9371 a Horwell D. C., Trends Biotechnol. (1995) 13 (4), 132 - 134.
Jako další deriváty aminokyselin nevyskytující se v přírodě mohou být použity v souvislosti s prvním nebo druhým provedením předkládaného vynálezu: alfa* a alfa-disubstituované* aminokyseliny, N-alkylaminokyseliny*, kyselina mléčná*, halogenové deriváty aminokyselin vyskytujících se v přírodě, jako je trifluortyrosin*, p-CIfenylalanin*, p-Br-fenylalanin*, p-l-fenylalanin*, L-allylglycin*, βalanin*, kyselina L-a-aminomáselná*, kyselina L-y-aminomáselná*, kyselina L-a-aminoisomáselná*, kyselina L-s-aminokapronová#, kyselina 7-aminoheptanová*, L-methioninsulfon#*, L-norleucin*, Lnorvalin*, p-nitro-L-fenylalanin*, L-hydroxyprolin#, L-thioprolin*, methylové deriváty fenylalaninu (Phe), jako je 4-methyl-Phe*, pentamethyl-Phe*, L-Phe (4-amino)#, L-Tyr (methyl)*, L-Phe (4isopropyl)*, L-Tic (1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-karboxylová kyselina)*, kyselina L-diaminopropionová# a L-Phe (4-benzyl)*. Značka * byla použita pro účely výše uvedené diskuse pro označení hydrofobni povahy derivátu, značka # byla použita pro označení hydrofilní povahy derivátu a #* označuje amfipatické vlastnosti.
Peptidové nosné skupiny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat aminokyseliny v L nebo D formě, tj. jeden nebo více zbytků, s výhodou všechny zbytky mohou být v L nebo D formě. V rámci tohoto provedení může být peptid ve formě retro, například peptid KKWKORR.
Ve výhodném provedení není šestý aminokyselinový zbytek od aminového konce peptidů tryptofan.
Peptidy pro transport membránami podle předkládaného vynálezu jsou schopny přemísťovat látky přes buněčnou membránu, a ve výhodném provedení také pres jadernou membránu. Nezáleží na tom, zda peptid přenáší (translokuje) z vnějšku buňky/jádra dovnitř, tj. peptidy mohou pocházet z cytoplasmy nebo jádra (například tam byly • syntetizovány nebo byly do tohoto prostoru vloženy), nebo přenáší do místa vnějšího vzhledem k buněčnému oddílu (cytoplasma nebo jádro), ze kterého peptidy pochází. Obecně se peptidy připravují mimo buňku a přenášejí se z vnějšího umístění do cytoplasmy a potom popřípadě do jádra.
Jak se zde používá, termín „transport, průchod buněčnou membránou“ (cell membrane translocation) označuje schopnost peptidů procházet buněčnou membránou a vstupovat do cytosolu/cytoplasmy buňky nebo přecházet z cytosolu/cytoplasmy buňky do vnějšího, extracelulárního nebo intersticiálního prostoru.
Termín „průchod jadernou membránou“ (nuclear membrane translocation) označuje schopnost peptidů procházet membránovou strukturou obklopující jádro buňky nebo přecházet z cytosolu/cytoplasmy buňky do jádra.
f ’ Obr. 1 ukazuje analýzu RP-HPLC některých peptidových nosných skupin připravených podle prvního provedení předkládaného vynálezu.
Obr. 2 ukazuje výsledek testu přenosu do buňky (internalizace) prováděného s použitím peptidových nosných skupin připravených podle prvního provedení vynálezu.
Obr. 3 ukazuje výsledky testu přenosu do buňky (internalizace) prováděného s použitím sloučeniny 39 (fluoresceinem značený penetratin).
Obr. 4 (A, B a C) ukazuje vizualizaci testu přenosu do buňky prováděného s použitím sloučeniny 39 v reálném čase.
Obr. 5 ukazuje výsledky testu přenosu do buňky prováděného použitím peptidových nosných skupin připravených podle druhého provedení předkládaného vynálezu.
V dalším provedení vynálezu je peptidová nosná skupina (buď zkrácená nebo modifikovaná forma penetratinu podle buď prvního nebo druhého provedení) navázána na dopravovanou skupinu nebo část (cargo moiety) za vytvoření vektoru pro transport do buněk. Dopravovaná skupina může zahrnovat oligonukleotidy, nukleotidy, proteiny, peptidy, biologicky účinné sloučeniny, diagnostické látky nebo jejich kombinace.
Ve výhodném provedení je dopravovanou skupinou protein nebo peptid a ve výhodnějším provedení je dopravovanou skupinou biologicky účinná látka jako je léčivo.
Dopravovaná skupina může být přímo nebo nepřímo navázána na nosnou skupinu. V provedení, kdy je dopravovaná skupina nepřímo navázaná na nosič, může být vazba provedena skupinou jako je sulfydrylová nebo karboxylové skupina nebo jakoukoli větší skupinou, přičemž všechny tyto propojovací skupiny se dále označují jako propojovací skupiny, jak bude diskutováno dále. S výhodou jsou nosná a dopravovaná skupina spojeny přímo.
Mezi příklady vhodných oligonukleotidových dopravovaných skupin patří geny, fragmenty genů, sekvence DNA, cDNA, RNA, nukleotidy, nukleosidy, heterocyklické báze, syntetické a nesyntetické, oligonukleotidy sense nebo antisense včetně oligonukleotidů s kostrou rezistentní vůči nukleázám, nebo jakékoli z výše uvedených látek
- 14 • ··· · · ···· ·· • · · · · · · • · · · · · obsahujících radioaktivní značku, které mají být dodány do buňky nebo alternativně z buňky do vnějšího prostředí. Oligonukleotidovou dopravovanou skupinou je s výhodou gen nebo fragment genu.
Mezi příklady vhodných proteinových nebo peptidových dopravovaných skupin patří: proteiny, peptidy a jejich deriváty, jako jsou protilátky a jejich fragmenty; cytokiny a deriváty jejich fragmentů, například interleukiny (IL) a zvláště subtypy IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, L-5, lL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 a IL-12; faktory stimulující kolonie, například granulocytový - makrofágový faktor stimulující kolonie, granulocytový faktor stimulující kolonie (alfa a beta formy), makrofágový faktor stimulující kolonie (známý také jako CSF-1); hemopoetiny, například erythropoetin, hemopoetin-alfa a kit-ligand (známý také jako faktor kmenových buněk nebo faktor Steel); interferony (IFNS), například IFN-a, IFN-β a IFN-γ; růstové faktory a bifunkční růstové modulátory, například epidermální růstový faktor, růstový faktor odvozený od destiček, transformující růstový faktor (alfa a beta formy), amfiregulin, somatomedin-C, růstový faktor kostí, růstové faktory fibroblastů, růstové faktory podobné inzulínu, růstové faktory vázající heparin a tumorové růstové faktory; diferenciační faktory apod., například makrofágový diferenciační faktor, faktor indukující diferenciaci (DIF) a faktor inhibující leukémii; aktivační faktory, například faktor aktivující destičky a faktor aktivující makrofágy; koagulační faktory jako jsou fibrinolytické/antikoagulační prostředky včetně heparinu a proteáz a jejich profaktorů, například faktory srážlivosti VII, Vlil, IX, X, XI a XII, antithrombin III, protein C, protein S, streptokináza, urokináza, prourokináza, tkáňový plasminogenový aktivátor, fibrinogen a hirudin; peptidové hormony, například inzulín, růstový hormon, gonadotropiny, hormon stimulující folikuly, luteinizační hormon, hormon uvolňující růstový hormon a kalcitonin; enzymy jako je superoxiddismutáza, glukocerebrosidáza, asparagináza a adenosindeamináza; vakcíny nebo vakcínové antigeny, jako je například vakcína proti hepatitidě B, vakcína proti
malárii, vakcína proti melanomu a vakcína proti HIV-1; transkripční faktory a modulátory transkripce. Výhodněji může být dopravovanou skupinou protein nebo peptid zvolený z proteinů nebo peptidů, které interferují s buněčným cyklem, jako jsou peptidy p53 nebo jejich fragmenty, peptidy p21WAF nebo jejich fragmenty jako jsou látky popisované ve WO 96/14334 a WO 97/42222, Fen1 nebo jejich fragmenty, jako jsou látky popisované ve WO 96/35715, peptidy p16 nebo jejich fragmenty, jako jsou látky popisované ve WO 97/11174 a jejich fragmenty a deriváty.
Příklady vhodných nenukleotidových/proteinových biologicky účinných dopravovaných skupin jsou skupiny léků zvolené ze skupiny cytotoxické látky, antineoplastické látky, antihypertenzivní látky, kardioprotektivní látky, antiarytmika, inhibitory ACE, protizánětlivé látky, diuretika, svalová relaxans, lokální anestetika, hormony, látky snižující hladinu cholesterolu, antikoagulační látky, antidepresivní látky, trankvilizéry, neuroleptika, analgetika jako jsou narkotická nebo antipyretická analgetika, antivirové látky, antibakteriální látky, antifungální látky, bakteriostatika, látky působící na CNS, protikřečové látky, anxiolytika, antacida, narkotika, antibiotika, respiračně účinné látky, antihistaminika, imunosupresivní látky, imunoaktivační látky, nutriční aditiva, antitusika, diagnostické látky, emetika a antiemetika, karbohydráty, glykozoaminoglykany, glykoproteiny a polysacharidy; lipidy, například fosfatidylethanolamin, fosfatidylserin a jejich deriváty; sfingosin; steroidy; vitaminy; antibiotika včetně lantibiotik; bakteriostatické a baktericidní látky; antifungální, anthelmintické a jiné látky účinné proti infekčním činitelům včetně jednobuněčných patogenů; malé efektorové molekuly jako je noradrenalin, ligandy alfa adrenergních receptorů, ligandy dopaminového receptoru, ligandy histaminového receptoru, ligandy receptoru GABA/benzodiazepin, ligandy serotoninového receptoru, leukotrienny a trijodothyronin; cytotoxické látky jako je doxorubicin, methotrexát a jejich deriváty.
·· ·· ···♦ ·· • · · · · • · · · ·
- 16 -·** ’
Skupina léčiva je s výhodou cytotoxický nebo antineoplastický prostředek, zvláště látky, které se používají pro léčení rakoviny. Mezi tyto prostředky patří obecně látky poškozující DNA, antimetabolity, antitumorové protilátky, přírodní produkty a jejich analogy, inhibitory dihydrofolát reduktázy, pyrimidinové analogy, purinové analogy, inhibitory cyklin-dependentní kinázy, inhibitory thymidylátsyntázy, interkalační látky DNA, látky štěpící DNA, inhibitory topoisomerázy, anthracykliny, léky ze skupiny vínka, mitomyciny, bleomyciny, cytotoxické nukleosidy, pteridinová léčiva, diyneny, podofylotoxiny, léčiva s obsahem platiny, induktory diferenciace a taxany. Zvláště vhodně použitelné látky z těchto tříd jsou například methotrexát, methopterin, dichlormethotrexát, 5-fluoruracil, 6-merkaptopurin, trisubstituované puriny jako olomoucin, roskovitin a bohemin, flavopiridol, staurosporin, cytosinarabinosid, melfalan, leurosin, aktinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mitomycin D, mitomycin A, karninomycin, aminopterin, tallysomycin, podofylotoxin, etoposid, cisplatina, karboplatina, vinblastin, vinkristin, vindesin, paklitaxel, docetaxel, kyselina taxoterretinová, kyselina máselná, acetylspermidin, tamoxifen, irinotekan a kamptotecin. Nejvýhodněji se léčivo volí ze skupiny olomoucin, roskovitin a bohemin, flavopiridol, staurosporin a podofylotoxin, etoposid, deriváty purvalanolu, taxol, paklitaxel a kamptotecin.
Jak je diskutováno výše, léčivo a nosné skupiny mohou být navázány přímo nebo nepřímo prostřednictvím propojovací skupiny. Přímá vazba může vzniknout prostřednictvím jakékoli běžné funkční skupiny na skupině léčiva, jako je skupina hydroxy, karboxy nebo amino. Nepřímá vazba, která je výhodná, se bude uskutečňovat prostřednictvím propojovací skupiny. Vhodné propojovací skupiny zahrnují bi- a multifunkční arylové, alkylové nebo peptidové skupiny, estery alkyl-, aryl- nebo aralkylaldehydových kyselin a anyhdridy těchto látek, sulfydrylové nebo karboxylové skupiny, jako jsou deriváty kyseliny maleimidobenzoové, deriváty kyseliny maleimidoproprionové
a sukcinimidové deriváty, nebo mohou být odvozeny z kyanurbromidu nebo chloridu, karbonyldiimidazolu, sukcinimidylesterů nebo halogensulfonů apod. Funkční skupiny propojovací skupiny použité pro vytvoření kovalentních vazeb mezi propojovací skupinou a léčivem na jedné straně, stejně jako propojovací skupinou a nosnou skupinou na straně druhé mohou být dvě nebo více skupin, například skupiny amino, hydrazino, hydroxyl, thiol, maleimido, karbonyl a karboxyl atd. Propojovací skupina může obsahovat krátkou sekvenci 1 až 4 aminokyselinových zbytků, a případně zahrnuje cysteinový zbytek, kterým se propojovací skupina váže na nosnou skupinu.
Podle předkládaného vynálezu může být každá nosná skupina navázána na alespoň jednu skupina léčiva. V dalším provedení je nosná skupina připravena tak, aby byla umožněna vazba na více než jednu dopravovanou skupinu, přičemž každá dopravovaná skupina je stejná nebo různá. Například nosná skupina může obsahovat složky, které samy umožňují navázání jedné nebo více dopravované skupiny jako jsou deriváty v přírodě se vyskytujících aminokyselin, nebo vložení multivalentní syntetické aminokyseliny, nebo může být specificky upravena pro vytvoření vazeb například sítí rozvětvených lysinových zbytků, které mohou být navázány na nosnou skupinu jako propojovací skupinu, a každý lysinový zbytek může být potom navázán na dopravovanou skupinu. Tímto způsobem může jediná nosná skupina nést až do 32 dopravovaných skupin, s výhodou od 2 do 10 nebo výhodněji od 4 do 5 dopravovaných skupin. V dalším provedení může být každá dopravovaná skupina přímo nebo nepřímo navázána na nosnou skupinu. Jestliže je navázán více než jeden různý typ nosné skupiny, je možné koordinovat poměry a dávkování jednotlivých léčiv, aby bylo umožněno podávání specifických kombinací dopravovaných látek.
Ve výhodném příkladu tohoto provedení je nosnou skupinou peptidová nosná skupina definovaná výše, která má na alespoň jednom konci navázanou síť lysinových zbytků, které umožní napojení •♦·· φ· ···· • · · · · až 32 dopravovaných skupin.
V dalším provedení může translokační vektor dále obsahovat zaměřovači skupinu. Zaměřovači skupina je schopná směrovat nosnou skupinu do specifického typu buňky, ve které má dopravovaná skupina s výhodou fungovat. Zaměřovači skupina tedy působí jako adresovací systém, který obchází přirozenou distribuci léčiv v těle, nebo jako dodávací systém do určitého typu buněk. Zaměřovači skupina může být navázána na dopravovanou skupinu, nebo výhodněji na nosnou skupinu, a bude směrovat dodávací systém do požadovaného místa, přičemž po dosažení tohoto místa umožní nosná skupina průnik dopravované látky do buňky. Vhodné zaměřovači skupiny zahrnují peptidové sekvence identifikované autory E. Ruoslahti a další, v US patentu 5 622 699; Pasqualini, R., Ruoslahti, E., Nátuře (London) (1996), 380, 364 - 366, Ruoslahti, E., Ann. Rev. Cell Dev. Biol. (1996), 12, 697 - 715; Arap, W., Pasqualini, R., Ruoslahti, E., Science (1998), 279, 377 - 380. Tyto prameny, které se tímto zařazují odkazem, popisují určité peptidy, u kterých bylo zjištěno, že působí jako adresovací značky pro určité typy buněk.
Podle jakéhokoli z výše definovaných provedení předkládaného vynálezu mohou být aminokyseliny (jakýkoli jejich počet, ale s výhodou všechny) obsahující peptidovou nosnou skupinu v L nebo D (inverso) formě. Výhodněji jsou v L formě.
V dalším provedení může být nosná skupina popsaná výše ve formě retro. V rámci tohoto dalšího provedení mohou být aminokyseliny (jakýkoli jejich počet, ale s výhodou všechny) obsahující peptidovou nosnou skupinu v L nebo D formě.
Jestliže je dopravovaná skupina sama o sobě protein nebo peptid, nosné a dopravované skupiny mohou být obě ve formách L nebo D, nebo může být alternativně nosná skupina v L formě a dopravovaná skupina v D formě, nebo může být nosná skupina v D formě a dopravovaná skupina v L formě. V rámci nosných skupin definovaných jako penetratin nebo jeho deriváty je další modifikace, která je prospěšná v souvislosti předkládaného vynálezu, konverze volné karboxylové kyseliny zbytku karboxykoncové kyseliny na karboxamidovou skupinu. Jako příklad, jestliže má nosná skupina vzorec I (RRMKWKK), karboxykoncový lysinový zbytek může mít svou karboxylovou skupinu převedenou na karboxamidovou skupinu. Předpokládá se, že tato modifikace zvyšuje stabilitu nosné skupiny, a proto i dodávacího systému jako celku. Zbytek C-koncové aminokyseliny může být tedy ve formě -C(O)-NRR’, kde R a R’ jsou nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku, C1.6 alkyl, C1.6 alkylen nebo C1.6 alkinyl (souhrnně označované jako „alk“), aryl jako je benzyl nebo alkaryl, vždy popřípadě substituované heteroatomy jako jsou O, S nebo N. S výhodou je alespoň jedna ze skupin R nebo R’ atom vodíku, nejvýhodněji jsou obě atomy vodíku.
V nejvýhodnějším provedení se tedy předkládaný vynález týká nosné skupiny RRMKWKK s popřípadě amidovaným zbytkem koncového lysinu, přímo zpracované na dopravovanou skupinu zvolenou z peptidů odvozených od p21WAF, peptidů nebo léčiv odvozených od p16, roscovitinu, taxolu nebo podofylotoxinu.
Dodávací systémy popsané v předkládané přihlášce jsou nové chemické jednotky. Mezi specifické chemické jednotky popisované v předkládané přihlášce, patří
# Skupina léčiva Propojovací skupina Nosná skupina
paklitaxel 2’-sukcinimido- -propionoyl-CpA RRMKWKK-NHz
podofylotoxin 4-sukcinimido- -propionoyl-CpA RRMKWKK-NH2
podofylotoxin 4-sukcinimido- -propionoyl-CpA (D-R)(D-R)(D-M)(D-K) (D-W)(D-K)(D-K-NH2)
··«·
# Skupina léčiva Propojovací skupina Nosná skupina
epipodofylotoxin 4’-sukcinimido- -propionoyl-CpA RRMKWKK-NH2
podofylotoxin 4-acetyl-CpA RRMKWKK-NH2
4'-demethylepipodo-fylotoxin 4-acetyl-CpA RRMKWKK-NH2
podofylotoxin 4-sukcinimido- -propionoyl-GCpA RRMKWKK-NH2
C-konec podofylotoxin 4-sukcinimido- -propionoyl-C 4-sukcinimido- RRMKWKK
N-konec podofylotoxin -propionoyl-C
N-konec epipodofylotoxin 4'-sukcinimido- -propionoyl-C RRMKWKK
C-konec kamptotecin 10-O-sukcinimido- -propionoyl-C
N-konec epipodofylotoxin 4’-sukcinimido- -propionoyl-C 2'-(sukcinimido)- RRMKWKK
C-konec paklitaxel -propionoyi-C
4’-methoxyepipodo- -fylotoxin 4-(4”-aminoanilino)- -sukcinimidopropiono- -yl-CpA RRMKWKK-NH2
4’-demethylepipodo-fylotoxin 4-(4”-aminoanilino)- -sukcinimidopropiono- -yl-CpA RRMKWKK-NH2
Terapeutický účinek pocházející z podávání dodávacího systému může pocházet z intaktního dodávacího systému nebo jakékoli z jeho disociovaných skupin, které zahrnují dopravovanou
- 21 ·· ··· · · · ···· ·· · ·· · · · skupinu, tj. dopravovanou skupinu samostatně, nebo navázanou na propojovací skupinu, část propojovací skupiny nebo propojovací skupinu a část nosiče. Proto zde byl termín „dodávací systém“ používán ve svém obvyklém významu, tj. dodávání určité látky, jako je dopravovaná skupina, a navíc se zahrnutím systému nebo jakékoli jeho části, které jsou aktivní v intaktním stavu. Prospěšné účinky poskytované výše diskutovaným systémem jsou tedy použitelné na dopravovaný i dodávací systém.
Dodávací vektory mohou být připraveny jakýmikoli metodami známými v oboru. Například peptid nosné skupiny může být sestaven s použitím běžných metod syntézy peptidů v roztoku nebo na pevné fázi, které poskytují úplně chráněný prekurzor pouze s jednou koncovou nechráněnou aminoskupinou v reaktivní formě. Tato funkční skupina potom může přímo reagovat s dopravovanou skupinou nebo vhodným reaktivním derivátem dopravované skupiny. Alternativně může být tato aminoskupina převedena na odlišnou funkční skupinu vhodnou pro reakci s dopravovanou skupinou nebo propojovací skupinou. Tak například reakce aminoskupiny s anhydridem kyseliny jantarové poskytne selektivně adresovatelnou karboxylovou skupinu, zatímco další prodloužení peptidového řetězce derivátem cysteinu poskytne selektivně adresovatelnou thiolovou skupinu. Jakmile byla v prekurzoru dodávacího vektoru získána vhodná selektivně adresovatelná funkční skupina, mohou být dopravovaná skupina nebo její derivát navázány prostřednictvím vytvoření amidové, esterové nebo disulfidické vazby. Alternativně se zavádí propojovací skupina, například m-maleimidobenzoyl, reakcí prekurzoru propojovací skupiny se selektivně adresovatelnou funkční skupinou prekurzoru dodávacího vektoru, s následným vytvořením kovalentní vazby mezi propojovací skupinou a dopravovanou skupinou. Vícečetné konstrukty dopravovaná skupina - dodávací vektor mohou být mj. získány postupným rozšiřováním selektivně adresovatelného prekurzoru dodávacího vektoru o trojvazné chemické skupiny. Rozšíření • toto·· toto totototo tototo ·· · · · · to tototo • · · · · to toto • · · · · · · · ·· • · · ♦ · · ·· ···♦ ·· · «· « · · peptidového řetězce o například Na,s-Fmoc-chráněné deriváty lysinu poskytne di-, tetra- a oktavalentní prekurzorové konstrukty po jednom, dvou nebo třech cyklech vazba/odstranění ochranné skupiny Fmoc.
Použitím těchto metod může být odborník v oboru schopen připravit širokou řadu konjugátů dopravovaná skupina - nosič s použitím celé řady propojovacích skupin. Jak je na příkladech uvedeno níže, pro navázání na nosnou skupinu, a v případě potřeby propojovací skupinu navázanou na dopravovanou nebo nosnou skupinu, nebo na obě tyto části, může být zvolena vhodná skupina na dopravované skupiny před vazbou.
Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být formulovány s fyziologicky přijatelným ředivem nebo nosičem pro použití jako farmaceutické prostředky jak pro veterinární, například u savců, tak i zvláště pro humánní použití celou řadou metod. Mohou být například použity jako prostředek obsahující kapalné ředivo nebo nosič, například vodný nebo olejový roztok, suspenzi nebo emulzi, který může být často použit v injikovatelné formě pro parenterální podávání, a proto by měl vhodně být sterilní a apyrogenní. Je také možno používat orálního podávání, a ačkoli mohou prostředky pro tento účel obsahovat kapalný nosič nebo ředivo, je obvyklejší používat pevný, například běžný pevný nosný materiál jako je škrob, laktóza, dextrin nebo stearan hořečnatý. Tyto pevné prostředky mohou mít formu prášku, ale obvykle jsou tvarovaného typu, například ve formě tablet, oplatek nebo kapslí (včetně dražé s plynulým dávkováním). Alternativně zahrnují specializovanější typy prostředku liposomy a nanočástice.
Další typy podávání než injekční nebo orální cestou použitelné v humánním a veterinárním lékařství, zahrnují použití čípků nebo pesarů. Další forma farmaceutického prostředku je forma pro bukální nebo nazální podávání, nebo podávání do dýchacích cest, jako je alveolární tkáň. Mezi další formulace pro místní podávání patří mléka,
000Φ
Φ» 0*0«
masti, krémy, gely a spreje.
Prostředky mohou být formulovány v jednotkové dávkové formě, tj. ve formě diskrétních množství obsahujících jednotkové dávky, nebo více jednotkových dávek nebo podjednotky jednotkových dávek.
Translokační vektory podle předkládaného vynálezu poskytují proti známým dodávacím systémům několik výhod. Mezi tyto výhody patří zlepšená účinnost ve srovnání s běžnými způsoby léčení, zlepšený příjem terapeutického prostředku buňkami, zlepšená rozpustnost ve vodě, snížení vedlejších účinků a buněčné biologické dostupnosti a snížení výskytu rezistence na léčivo.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava řady peptidů (peptidy 1 - 20) jako zkrácených forem penetratinu (SEQ ID No. 1)
Použité zkratky
Nomenklatura aminokyselin a peptidů odpovídá pravidlům IUPAC-IUB (Eur. J. Biochem. 1984, 138, 9 - 37). Další zkratky jsou: Ahx, 6-aminohexanoyl; APase, alkalická fosfatáza; DE MALDITOF MS, hmotnostní spektroskopie typu delayed-extraction matrixassisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry; DIEA, Λ/,/V-diisopropylethylamin; PBS, fyziologický roztok s fosfátovým pufrem (10 mM fosfát, 150 mM NaCI, pH 7,4); PyBOP, benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinofosfoniumhexafluorfosfát; RP-HPLC, vysoce účinná kapalinová chromatografie s reverzními fázemi; TFA, kyselina trifluoroctová.
• ···· ·· ···♦ ·· ·
v· • • * • * 9 ··
• • • · • • · •
• •
• • • <« • • · •
* ·· .·* ··
1,1: Materiály a methody
Obecné informace
Směs pro odstraňování ochranných skupin/štěpení, používaná při experimentech, byla následující: 0,75 : 0,5 : 0,5 : 0,25 : 10 (hmotn./obj./obj./obj./obj.) PhOH, H2O, PhSMe, 1,2-ethandithiol, TFA (Beavis, R. C., a další (1992) Organic Mass Spectrometry 27, 156 158). Analytická a preparativní RP-HPLC byla prováděna S použitím kolon Vydac 218TP54 (4,6 x 250 mm), popřípadě 218TP1022 (22 x 250 mm). Pro analytické účely byl používán průtok 1 ml/min a pro preparativní účely 9 ml/min (při 25 °C). Gradientová eluce byla prováděna se vzrůstajícím množstvím MeCN v H2O (s obsahem 0,1% TFA) v průběhu 20 min (anal.) a 40 min (prep.). Eluenty byly monitorovány při λ = 200 - 300 nm. Vzorky peptidů byly také analyzovány hmotnostní spektrometrií DE MALDI-TOF (přístroj ThermoBioAnalysis Dynamo). Jako matrice byla použita kyselina a-kyano-4-hydroxyskořicová (Beavis, R. C., a další (1992), Organic Mass Spectrometry 27, 156 - 158) a příslušný poměr m/z byl kalibrován použitím standardů autentických peptidů v rozmezí m/z 1 000 - 2 600.
1.2: Simultánní vícenásobná syntéza peptidů 1 - 20
Peptidy byly syntetizovány na přístroji Multipin Peptide Synthesis Kit (Chiron Technologies Pty. Ltd., Clayton, VÍC, Austrálie). Peptidové řetězce byly sestavovány na materiálu „Macro Crowns“ (SynPhase HM Series I, Rink Amide Linker; 5,3 pmol/crown) s použitím chemismu vazby Fmoc-aminokyselin (100 mM v DMF) a PyBOP/HOBt)/DIEA (1:1: 1,5). Jako ochranné skupiny vedlejších řetězců aminokyselin byly použity 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6sulfonyl (Arg), trityl (Asn a Gin) a ř-butyloxykarbonyl (Lys a Trp). Roztoky aktivovaných aminokyselin byly dávkovány zařízením PinAID (Chiron Technologies). Vazebné reakce byly ponechány probíhat
- 25 minimálně 4 hod. Všechny další manipulace související se sestavováním řetězců včetně opakujících se reakcí odstraňování ochranných skupin (20% piperidin v DMF) a promývacích cyklů (DMF a MeOH), byly prováděny způsoby uvedenými v příručce kitu. Po provedení vazby a odstranění ochranných skupin byly v průběhu 4 hod navazovány A/-koncové zbytky pAla, (+)-biotin (300 mM v DMF) s použitím stejných chemických reakcí jako výše u aminokyselin. Po promytí a usušení byl materiál „Macro Crowns“ odstraněn ze syntezátoru a vložen do 10 ml polypropylenových zkumavek opatřených víčkem. Do každé zkumavky bylo přidáno 1,5 ml roztoku pro štěpení/odstranění ochranných skupin. Po 2 hod byl materiál „Macro Crowns“ odstraněn a promyt, vždy 0,5 ml čisté TFA. Do každé zkumavky obsahující spojené štěpící směsi a promývací roztoky byl přidán EÍ2O (8 ml). Po ochlazení na 4 °C byly vysrážené peptidy odděleny centrifugací (4 min při 5 000 ot/min) a dekantací. Centrifugáty byly resuspendovány v Et2O (5 ml/zkumavka). Suspenze byly znovu ochlazeny a peptidy byly izolovány jako předtím. Promývací proces byl opakován ještě jednou před tím, než byly surové peptidy sušeny ve vakuu.
Surové peptidy byly znovu rozpuštěny v 0,1% vodné TFA použitím sonikace (2 ml/vzorek) a byly naneseny na předpřipravené (MeOH, potom 0,1% vodná TFA) extrakční patrony s pevnou fází (Měrek LiChrolut RP-18, 500 mg). Ty byly postupně promyty (2 x 2 ml vždy 0,1% vodná TFA) a eluovány (2 ml 0,1 % TFA v 6:4 MeCN/H2O). Eluáty byly odpařeny do sucha vakuovou centrifugací. Výtěžky a analytické údaje pro sloučeniny uvedené v názvu jsou shrnuty v tabulce 2.
• · · · • · · · • · ·· ··· ···
CD Ol i
Tabulka 1
04 X JZÍ 04 ζ
OT OT
04 >1
re Ζ Ζ
Z 1 1
I OT OT
ω <N
Z Ζ Ζ
Z z I 1
I 1 CL CL
ot ω 04 β β
ί>Ί Z Ζ Ζ
Z ι—-1 z 1 1
I 1 1 ω OT
CL z z 04 >Ί
β β β Z ζ ζ
Z Z Z z 1 1
I 1 1 1 ζ ζ
OT ot OT OT 04 φ (D
Ι>Ί ί>Ί Z
z Z z Z z 1 1
I 1 1 1 1 0 0
z Z Z z z <N β β
Φ Φ Φ Φ Φ Z < 1 <
s Z Z z z z 1
I 1 1 1 1 1 tP 0
cn W 0 0 0 0 04 β β
β S-l S-l S-l β β Ζ < 1
< < < < < < ζ I
σ> σ 0 σ 0 0 0 04 C C0 £ ω
β í-l S-l β β β β Ζ <
< < < < < < ζ 1 I
β β β β β β β β 04 β β
ot w OT OT OT 0) OT OT z (Π 0
< < < < < < < < z 1 I
T5 I 1 1 1 1 1 1 1 1 φ φ
•H β β c β β β β β β ζ ζ
1--------1 1--------1 i—1 Γ—| ι—1 1--------1 ι—1 1--------1 1---------1 Cu Ο-ι
CL 0 0 0 0 0 0 0 0 0 I I
<u 1 1 1 1 1 1 1 1 CL CL
(2Li Φ Φ Φ Φ Φ φ φ Φ φ 04 μ β
Z Z z z Z ζ ζ Ζ z ζ Η Ζ
CL CL ÍL z z ζ ζ Ζ z ζ I 1
CL CL CL CL CL 0 CL CL CL CL φ φ
β S-l í-l S-l β β β β β β ΗΗ 1—1
Z Z Z Z Z ζ Η Ζ Z Ζ I 1
Φ i) i) Φ φ Φ Φ Φ φ W ω >1
1---------1 1—I 1-------------1 1---------1 i—1 1--------1 ι—1 1—1 1---------1 ι—1 ζ ζ
l-l 1—1 l-l l-l H 1—1 ΗΗ 1—1 1—1 1—1 I ι
1 1 1 1 1 1 I 1 1 1 Φ φ
ot OT OT OT OT OT OT OT OT OT
Ι>Ί ✓Ί !>1 >1 ί>Ί ί>Ί Η1 1—1
Z z Z z Z Ζ Ζ Ζ z ζ I 1
0) <L> Φ i) Φ φ φ φ Φ φ β
1---------1 r—1 1--------1 1—1 l—1 1—1 1—1 1--------1 t—| 1---------1 0
Η1 H l-l l-l H Η Η I—1 H Η I CQ.
£ β β β β β β β β β rtf 1 ι—ί
1---------1 1—I 1--------1 t—1 Z 1--------1 ι—1 1--------1 1---------1 1---------1 < >Ί
0 0 0 0 0 0 ο 0 0 0 CQ- β
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I Η
σ 0 σ σ 0 0 0 0 σ 0 ζ
β S-l β β β β β β β β >Ί ο
< < < < < < < < < β •Η
1 1 1 I 1 1 1 1 ι 1 •1—1 ζ
Íú OT OT OT OT OT OT OT OT OT ζ
1---------1 1--------1 1------1 1--------1 z ι—1 ι—| 1------1 1------1 1---------1 ο
< < < < < < < <
CQ. CQ CQ. CQ. CQ. CQ ca. CQ. CQ. CQ. ζ
1---------1 i—1 1-------------1 1--------1 rH ι—1 1—1 1------1 I—1 1—1
£>ί >1 £>ί £>ί >1 ί>Ί ί>Ί
£ c β β β β β β β β
•H -r—1 •H •Η •β •Η Ή •Η Ή •Η
4-1 Z z z z ζ ζ ζ z ζ
O O o o o ο 0 ο ο ο
-H ♦H •H •H •H •Η •Η •Η •Η Ή
Cd Z CQ z z ζ Ζ ζ ζ ζ
o ο T“ οι
Z r— Ol CO LO CD Ζ co σ> V V“
h04
Tabulka 1 - pokračování
OJ OJ OJ Ol OJ OJ Ol Ol
cc z z z K z z
z z z z z z z
<n co CO co co co co co
ΐ>Ί ί>Ί £*1 >1 ί>Ί
p p P P P P P P
to co co co co ω co 00
Ι>Ί >1 £>ί Ξ>ί ^>Ί ^*1 ί>Ί
P p P P P P P P
o O o o o a a
p P P p P P P P
P P P P P P P P
to to to co co co co co
ί>Ί ί>Ί ί>Ί ί>Ί ί>Ί
p P P P P P P P
p P P P P P P P
Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ φ
S s s S s s s s
σ» 0 0 0 0 0 0 0
P P P P P P P P
< < < < < < <
tn en 0 tn 0 0 0 (0
P P P P P P P rH
< < < < < < < <
1 1 1 1 1 1 1 co.
c c C a C c <0 1
co CO co co co co 1---------1 i—1
< < < < < < < >1
1 1 1 1 1 1 CQ. C
C c c C C co 1 Ή
1--------1 1---------1 1---------1 1---------1 1---------1 r—1 r—1 P
0 0 0 0 0 < >Ί 0
1 1 1 1 1 CQ. •H
Φ CD Φ Φ 05 1 •H CQ
p 4=: P P 1—1 1---------1 P
cu Oj P P < £>ί o
1 1 1 1 co. H
n. O o rC 1 •H CQ
P p P i—1 1---------1 P
P P P < £>ί o
1 1 1 co. Ή
Φ <D rC 1 •H CQ
1------1 <—1 1------1 ,—| P
H HH < o
1 1 CQ. •H
m 0! 1 •H CQ
1--------1 1--------1 P
P < o
1 CQ. c •H
(0 1 H 03
r—1 r—| P
< !>ί 0
CQ. c •r-l
1 •H «
1--------1 P
ί>Ί o
c Ή
•r—| CQ
P
O
Ή
cfl
CO Tf m CD b- 00 CD O
V T“ V“ 04
- 28 • ···
Tabulka 2
Analýza peptidů 1-20 chromatografii a hmotnostní spektrometrií
No Vzorec Mr MSa Výtěžek Anal.RP-HPLC
[M+H]+ mgb pmol %c Ír (min)d Čistota (%)e
1 Of17HI88N38O22S2 2543,12 2544,1 6,7 2,6 50 19,0 78
2 Ci 11Η ϊ 764N36O21S2 2414,95 2416,0 6,8 2,8 53 19,4 78
3 C105H1164N34O20S2 2286,77 2287,8 4,8 2,1 40 20,3 79
4 C94H154N32O19S2 2100,56 2101,6 7,5 3,6 67 18,5 75
5 C88Hl42N3oOigS2 1972,39 1973,4 6,5 3,3 62 19,1 81
6 C83H133N29O17S 1841,20 1842,2 5,6 3,1 58 18,5 98
7 C77H121N25O16S 1685,01 1686,0 7,0 4,2 78 19,0 95
8 C71H109N21O15S 1528,82 1529,8 4,8 3,1 59 19,7 95
9 C67H103N19O13S 1414,72 1415,7 4,8 3,4 64 20,2 90
10 C53H86N16O10S 1139,42 1140,4 3,2 2,8 53 17,9 93
11 C111H176N34O21S2 2386,93 2387,9 5,1 2,1 40 19,5 82
12 C106H168N32O19S2 2258,80 2259,8 5,0 2,2 42 19,8 85
13 C100H157N31O18S2 2145,65 2146,7 5,8 2,7 51 17,6 90
14 C94HI45N29O17S2 2017,47 2018,5 6,6 3,3 62 19,1 87
15 C88H134N28O16S2 1904,32 1905,3 5,3 2,8 53 17,9 90
16 C77H124N26O15S2 1718,11 1719,1 5,3 3,1 58 14,9 91
17 C68H115N25O14S2 1570,93 1571,9 5,6 3,6 67 12,2 93
18 C63H107Ν23θ12^2 1442,80 1443,8 4,4 3,0 57 12,4 93
19 C59H101N21O10S2 1328,70 1329,7 5,1 3,9 73 12,7 94
20 C53H89N7O9S2 1172,5 1173,5 5,0 4,3 81 13,2 96
a Provedeno metodou DE MALDI-TOF MS.
b Po extrakci na pevné fázi a centrifugaci ve vakuu.
c Vzhledem k 5,3 pmol naneseným pro syntézu ‘crowns’.
d Gradient 5 - 35 % (peptidy 1-20) v 0,1% vod. TFA 20 min.
e Z integrace chromatogramu (λ = 214 nm).
Příprava redukovaných lineárních a oxidovaných cyklických peptidů a 38
Peptidová sekvence byla sestavována na Fmoc-Cys(Trt)io pryskyřici (manipulační skupina kyselina phydroxymethylfenoxyoctová, funkčnost 0,50 mmol/g, 0,50 g, 0,25 mmol; ABI 401418), s použitím přístroje ABI 433A Peptide Synthesizer (Perkin-Elmer Applied Biosystems) a standardních chemických reakcí typu „0,25 mmol FastMoc MonPrevPk“. Po 15 konečném odstranění ochranných skupin Fmoc a promytí (Et2O), byla peptidylová pryskyřice usušena ve vakuu (1,43 g, 91 %). Alikvot (285 mg, přibližně 0,05 mmol) tohoto materiálu byl resuspendován v DMF, odsát a ponechán reagovat s biotinamidokaproát-N-hydroxysukcinimidovým esterem (137 mg, 0,3 mmol), HOBt (50 mg, 20 0,3 mmol) a DIEA (0,14 ml 0,8 mmol) v DMF (3 ml) 18 hod v atmosféře
N2. Pryskyřice byla potom postupně promyta DMF, CH2CI2 a Et2O, a potom byla usušena ve vakuu.
Biotinylovaná peptidylová pryskyřice získaná výše popsaným postupem (290 mg, přibližně 0,05 mmol) byla zpracována působením 25 směsi pro štěpení/odstranění ochranných skupin (5 ml) 2,5 hod. Zbytek pryskyřice byl potom odfiltrován. Filtrát byl smísen s Et2O (45 ml), směs byla ochlazena a vysrážený peptid byl oddělen centrifugaci (2 min při 4 000 ot/min). Surový biotinylovaný peptid (141 mg, přibližně kvantitativní) byl ještě dvakrát podobným způsobem 30 promyt Et2O před sušením ve vakuu. Vzorek (20 mg) tohoto materiálu
- 30 byl rozpuštěn v 0,1% vodné TFA (2 ml), roztok byl zfiltrován a frakcionován preparativní RP-HPLC. Frakce obsahující čistý materiál (zjišťováno analytickou RP-HPLC) byly spojeny a lyofilizovány za poskytnutí čistého peptidu 37 (12,1 mg). Výsledky analytické RP5 HPLC: tR = 20,8 min, čistota >99 % při λ = 214 nm (20 - 30% gradient
MeCN). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 2776, [2 M + H]2+ = 1389 (C127H205N39O25S3 = 2774,43).
Surový peptid 37 (před preparativní RP-HPLC, 35 mg) byl rozpuštěn ve vodném roztoku NH4HCO3 (0,1 M, 70 ml). Nezakrytá 10 směs byla míchána 18 hod při pokojové teplotě. Získaná suspenze byla potom okyselena na pH 4 AcOH (přibližně 2 ml) za získání čirého roztoku, který byl odpařen do sucha vakuovou centrifugací 18 hod. Zbytek byl znovu rozpuštěn v 0,1% vodné TFA (2 ml) a čištěn preparativní RP-HPLC podobným způsobem jako byl popsán výše pro 15 redukovaný prekurzor 37 s tím rozdílem, že bylo použito gradientu 20 30 % MeCN. Po lyofilizaci byl získán čistý peptid 38 (4,5 mg). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 15,7 min, čistota >99 % při λ = 214 nm (20 - 30 % gradient). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 2774, [2 M + H]2+ = 1388 (C127H203N39O25S3 = 2772,42).
Příprava penetratinu 39 značeného fluoresceinem
Tato sekvence byla sestavena podobným způsobem jak bylo popsáno pro peptid 37 s tím rozdílem, že bylo použito pryskyřice Fmoc-Lys (Boc) (naneseno 0,5 mmol/g; ABI 401425). Materiál H-pAla25 Arg(Pmc)-Gln(Trt)-lle-Lys(Boc)-lle-Trp-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-pryskyřice (300 mg, přibližně 0,055 mmol) byl ponechán reagovat s 5karboxyfluoresceinem (103 mg, 0,27 mmol; Sigma C 0537), PyBOP (142 mg, 0,27 mmol)), HOBt (37 mg, 0,27 mmol), a DIEA (71 ml, 30 0,41 pmol) v DMF (5 ml) v atmosféře N2 a temnu v průběhu 18 hod.
Pryskyřice byla potom promyta (DMF, CH2CI2 a EÍ2O) a sušena ve • ···· ·· ···· ·· · • · · · · · *··· • · · · · ··· • · ···· ··· ♦ ·· «·· · · · ···· · · · · · · · ·
- 31 vakuu. Po 2 hod reakci se směsí pro štěpení/odstraňování ochranných skupin (12 ml) v temnotě a při zpracování jak bylo uvedeno výše, byl získán surový peptid (183 mg). Alikvot (90 mg) byl čištěn preparativní RP-HPLC za získání čistého peptidů po lyofilizaci (38 mg). Výsledky 5 analýzy RP-HPLC: tR = 15,7 min, čistota >99 % při λ = 214 nm (22,5 -
32,5 % gradient). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 2677, [2 M + H]2+ = 5359 (C428H183N35O27S = 2676,11).
1.3: Test vstupu peptidů do buňky (internalizace) io Buňky HaCaT (imortalizovaná buněčná linie „normálních“ lidských fibroblastů) byly zaočkovány do 96-jamkových destiček v množství 50 000 buněk/jamku v médiu (DMEM) s 10 % fetálního telecího séra a antibiotiky. Po inkubaci prováděné přes noc byly peptidy připraveny ve formě sériových ředění v buněčném médiu 15 a byly přidány k buňkám. Na konci období inkubace (obvykle 10 až 60 min) byly buňky třikrát opláchnuty PBS a fixovány 20 min při -20 °C v EtOH/AcOH (95 : 5). Po fixaci byly buňky permeabilizovány působením 10 min roztokem PBS s obsahem 3% Tween-20. Aktivita endogenní alkalické fosfatázy byla neutralizována inkubací při 65 °C 20 60 min. Buňky byly inkubovány 30 min při pokojové teplotě s činidlem alkalická fosfatáza-streptavidin (Pierce Chemical Co, Rockford, IL, USA) v 0,1% BSA v PBS a důkladně promyty PBS. Do každé jamky byl přidán čerstvě připravený roztok substrátu (1 mg/ml p-nitrofenylfosfát ve formě dvojsodné soli (Pierce Chemical Co.), v 10 mM 25 diethanolaminu (pH 9,5) s obsahem 0,5 mM MgCI2 a byla provedena inkubace až do vyvinutí dostatečného zbarvení (přibližně 30 min). Enzymatická reakce byla zastavena přídavkem 50 pl 2 M vodného NaOH do každé jamky. Aktivita alkalické fosfatázy byla měřena spektrofotometricky při 405 nm.
1.4: Výsledky
1.4.1: Syntéza peptidů
Peptidy 1 - 20 byly připravovány současně s použitím tzv. metody Multipin™ (Valerio, R. M. a další (1993), Intemational Journal 5 of Peptide and Protein Research 42, 1 - 9). Za den byly prováděny v průměru dva cykly vazby/odstranění ochranných skupin a celá syntéza včetně biotinylace, štěpení/odstranění ochranných skupin, čištění extrakcí na pevné fázi a analýza byla hotova během 14 dnů. Izolované a čištěné výtěžky peptidů se pohybovaly od 40 do 81 % io a byly dosahovány čistoty 75 až 96 % (tabulka 2). Výborná kvalita peptidů je ukázána na obr. 1. Hlavní pozorované nečistoty (MS, data nejsou ukázána) byly peptidy obsahující Met(O) (úvodní vrcholy ve stopách na obr. 1. Zdá se. že tvorba methioninsulfoxidu je obecným problémem, který je vlastní metodě Multipin, pravděpodobně 15 v důsledku oxidace během dlouhých cyklů sušení vzduchem po acylaci a krocích odstraňování ochranných skupin. V podstatě je možné provést zpětnou redukci Met(O) na peptidy; například v analytickém měřítku byli autoři vynálezu schopni převést nečistotu obsahující Met(O) na látku 1 čistě s použitím směsi NHJ/MeaS v TFA (Nicolás, E.
a další (1995), Tetrahedron 51, 57013) (výsledky nejsou ukázány).
1.4.2: Stanovení minimální aktivní sekvence
Jak je uvedeno výše, jako minimální sekvence zachovávající účinné translokační vlastnosti použitím peptidů odpovídajících zbytkům 25 41 - 60, 43 - 58, 41 - 55 a 46 - 60 byly původně identifikovány zbytky
- 58 odpovídající 16mernímu peptidů homeodomény Antennapedia. Výsledky (obr. 2) ukazují zkrácení na C-konci peptidů 1, které vede ke snížení stupně internalizace, nicméně zkrácené peptidy byly stále ještě schopny přemístění přes buněčnou membránu. Postupné 30 zkracování od N-konce peptidů 1 však ukazuje, že u zkrácených peptidů se zachovávají podstatné míry translokace, které se v mnoha • φφφφ ·· φφφφ ·· φ
Φ · · · 9 Φ 9 · · Φ • Φ · Φ · ΦΦΦ
9 9 9·· φφφ Φ
Φ Φ · · · ΦΦΦ •ΦΦΦ ΦΦ 9 Φ* ΦΦΦ
- 33 případech blíží úrovni dosahované u samotného peptidu 1. Malé množství aktivity bylo ztraceno po prvních třech kráceních (11-13) ale pouze přibližně polovina původního signálu zůstala zachována u derivátů 14 a 15. V případě stupně 10meru až 7meru (16 - 19) však byla zachována téměř úplná translokační schopnost membránou vzhledem ke kontrolnímu peptidu 1 před tím, než byl pozorován podstatný pokles u C-koncového 6merního peptidu 20. Tento efekt byl reprodukovatelný v několika nezávislých experimentech. Zatímco na obr. 2 jsou ukázány hodnoty pouze pro jednu koncentraci peptidu, křivky závislosti na dávce pro každý jednotlivý peptid ukázaly, že stejný obraz je možno pozorovat bez ohledu na koncentraci peptidu. Bylo zjištěno, že nespecifická vazba v nepřítomnosti buněk, je stejnoměrná a zanedbatelná (výsledky nejsou ukázány).
1.4.3: Test internalizace peptidu u penetratinu 39 značeného fluoresceinem
Tento test umožnil studium a měření transportu do buňky bez možnosti pozorování artefaktů pocházejících z buněčných manipulací, které jsou nezbytné v případě biotinylovaných peptidů. Obr. 4 ukazuje přímé měření internalizace peptidu do živých buněk (čtverce v t = 10 min, kosočtverce při t = 60 min). Jak je vidět z obr. 4, biotinylovaný penetratin 1 se lokalizuje převážně do buněčného jádra a akumuluje se v jadérkách, přičemž v cytosolu se dosahuje nižší koncentrace. Distribude je jasně velmi podobná, jestliže se použije přímé fluorescenční sondy 39, čímž se ověří nepřímý přístup vizualizace biotin-avidin. Skutečnost, že penetratin se lokalizuje zejména do jádra ukazuje, že tento peptid může ve skutečnosti přecházet jak přes plasmatickou, tak i jadernou membránu. Akumulace v jádru může být způsobena nespecifickou vazbou pozitivně nabitého peptidu na DNA.
♦ ··· « • • · * • ···♦ ·· • ♦ • ·
» · 4 * • •
• • • · • •
• · • · * • · • ·
Příklad 2
Další zkrácené deriváty penetratinu:
2.1 S použitím metod popsaných v částech 1.1 a 1.2 výše byly připraveny následující peptidy:
RRMKWKK,
NRRMKWKK,
QNRRMKWKK,
KRMKWKK,
RKMKWKK, io RREKWKK,
RRQKWKK,
RROKWKK,
RRMKWFK,
RORKWKK,
RRMWKKK,
RROWKKK,
RRMKKWK,
RROKKWK,
KKWKORR.
Každý z těchto peptidů byl použit při testu internalizace peptidu popsaném v části 1.3 výše a bylo zjištěno, že vstupuje do buněk.
Příklad 3
Příprava řady peptidů s úplnou délkou, ve kterých je každý zbytek 25 substituován alaninem (21 - 36)
3.1: Simultánní mnohonásobná syntéza peptidů 21 - 36
Peptidy byly připravovány podobným způsobem jak bylo popsáno v částech 1.1 a 1.2 výše. Výtěžek a analytická data pro
3o sloučeniny uvedené v názvu jsou shrnuty v tabulce 3.
ΙΟ co
Tabulka 3
• ·«·· ·· • ••Φ ·· ·
«« • Φ Φ • • • • ·
• Φ • • • 9 • •
• • • · • • 9 · ♦ •
• • • • • 9 • •
• 4« Φ • Φ Φ ·· • Φ Φ
Ό Η
X
Ζ Φ Cl,
ΟΙ ΟΙ CN ΟΙ Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol Ol
X X χ X X X X X X X X X
Ζ Ζ I ζ I ζ I z I Z z | z I z I z I z I z 1
1 C0 1 ω 1 (η ca 1 m ca cn ca ca ca ca CO
>1 >1 Ζ- Ζ Z z z Z Z z z Z
X X 1 41 I XI I 41 X | X | X | X | X I X I X I
1 ca 1 ω W <η m CO (fí ca ca ca ca CO
Ζ >1 Ζ ζ z Z z Z Z Z Z Z
X X [ 41 I X 1 X | X | X I X I X | X I X I
1 ζ 1 Ζ 1 Ζ ζ z z 1 z z z z z z
Ρ Ρ Ρ Ρ P P P P P P P P
X X X 1 X ι X I X 1 X X I X I X I X 1 X 1
1 m 1 ca 1 ω I CQ 1 0) 1 CQ i co 1 ca ca co m co
>1 >1 £>ί Z £>ί Z Z Z z Z z
1-1 1 41 I 41 1 41 I X | X I X X I X 1 X I X I X 1
1 X 1 ζ 1 -Ρ 1 X 1 X 1 X 1 X 1 X l X X X X
φ φ φ φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ
S S S I S I s I s I S 1 s I s s | s I s I
1 Ζ I Ζ 1 Ζ 1 Ζ 1 Z 1 z 1 z 1 z z z z 05
Ρ Ρ Ρ Ρ p P P P P P P 1--------1
< < < | < I < t < i < 1 i < | < < | |
1 Ζ 1 Ζ 1 ζ 1 ζ 1 Z 1 z 1 z z z z 4 z
Ρ Ρ Ρ Ρ P P P P P P I--------1 P
< < | < I < I < I < I < I < 1 < | < I | < 1
1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 c 1 4 05 4 4
ω m m C0 Ca co co ca ca 1--------1 ca CO
< < [ < < 1 < I < I < I < < | < I 1 |
I 4 1 ρ 1 4 1 4 1 4 1 c 1 4 1 4 4 4 4 4
ι—I ι—1 ι—1 1—1 i—1 1--------1 1—1 >—1 i—1 I--------1 1—i i—1
0 0 0 0 I 0 1 0 j 0 I 0 I < I 0 I 0 I 0 I
1 Φ 1 φ 1 φ φ Φ Φ Φ 1 OJ Φ Φ Φ Φ
X χ χ χ X! X X i—1 X X X X
X X CU χ X X X I < 1 X 1 X 1 X I X I
1 ζ I ζ ι Ζ 1 ζ 1 z 1 z 1 1 Z 1 Z 1 Z z z
Ρ Ρ Ρ Ρ P P I--------1 P P •H P P
X X X 1 X I X I X I < | X | X 1 X | X | X |
1 φ Φ φ φ Φ 1 (0 Φ Φ Φ Φ Φ Φ
t—1 1—1 <Ή 1--------1 1---------1 1--------1 1--------1 1---------1 t—1 l—1 rd 1—1
Η Η ΗΗ 1-1 f 1—1 1 < 1 1—1 I H I H r Hd | l-d | H I
1 CQ 1 cn 1 CQ 1 cq 1 cd i co CQ CQ CQ CQ CQ CQ
>1 Σ>ι >1 Ξ>ί 1—1 z >1 Í>1 ^>Ί £>ί
μΐ μι I μ I μ ι < I X I μ | μ I μΐ | μ I μ I μ I
1 φ I Φ φ 1 (ϋ Φ Φ Φ Φ Φ φ φ φ
1--------1 ι—1 1---------1 1—I i—1 i—| i—1 1--------1 i—1 1--------1 1--------i 1—1
1-1 1-1 1—1 < I IH t 1—1 1 Hd i H I hd I Η-l 1 1—1 1 Η ι
1 μ 1 0 1 cd 1 0 1 0 1 c 1 C 1 0 1 a 1 C I c I c
ι—1 1--------1 ι—1 ι—1 •H i—1 1--------1 1---------1 1---------1 1--------1 1—1 <—1
0 0 < 0 I 0 ] 0 I 0 I 0 i 0 I 0 I 0 I 0 |
1 cn 1 1 Ζ 1 Ζ I 1 z 1 z 1 Cn On OP σ»
μ <—1 Ρ Ρ P P μ μ μ μ μ
< < | < I < I < I < < | < 1 < | < | I I
1 cd 1 cd 1 ίϋ 1 cd cd 1 cd cd cd cd cd cd φ
1--------1 1--------1 I—ι t—ι r—i 1--------1 f—1 1---------1 r—1 r—1 r—1 Γ—1
< < < < < <
CCL ca ca 1 ca 1 ca 1 ca 1 ca. I ca I ca I ca I ca I ca 1
1 1--------1 1 1—I 1 1--------1 I l---------1 1 i—1 1 i—1 1 i—1 1 i—1 <—1 l--------1 l—1 1—1
κ*Ί ί>Ί z ί>Ί ί>Ί ί>Ί £*ί
4 4 4 4 4 a
Η •Η •Η •H Ή -H •H •H •H -H •H •Η
-Ρ -Ρ χ) X χ) X X -P -μ -μ 4-> μ
0 0 0 o O 0 0 0 0 O 0 Ο
•Η ·γ4 •Η Ή Η •d •1—1 •H •H •H •H Η
cq CQ CQ CQ CQ CQ CQ cq CQ CQ CQ
V“ CN co Ν’ LO CO r^- 00 σ> O V
τ- OJ CN CN CN CN CN Ol Ol OJ CO C0
·♦♦·
Tabulka 3 - pokračování
CM <N CM CM CM
Z Z Z z
Z i 1 Z I Z | z |
1 co ω co CO 05
>u i—1
X I i~q I X 1 X I < 1
1 CO 1 ω 1 co 05 CO
Σ>ί I---------1
X I i-q t XI I < 1 X I
1 Cu I 1 1 cl l CL
P μ 1—1 P P
E-H i Η 1 < | E-< I Eh I
1 co 1 (Ú cn CO CO
I—1
£ I < 1 i-q I X | X I
1 05 1 P> 1 X 1 P X
i—1 Φ Φ Φ Φ
< | S 1 s j Z | s I
1 Cn 1 ím 1 Cm Cm im
P P P P P
< < 1 < 1 < I < I
1 σι 1 Co tm cm CO
P P p P P
< < 1 < 1 < < |
1 C i c 1 c 1 X 1 a
co co co co
< | < I < 1 < 1 < 1
1 c 1 c 1 c 1 c 1 X
i—1 1—1 1---------1 1—1 1---------1
o o I 0 | O I 0 I
1 Φ 1 Φ Φ Φ Φ
X! x: £ X £
cu □j cu I Cu t CU I
1 cu 1 cu 1 a, 1 CL 1 CL
P P P P P
Eh i Eh i X I Η I E-< |
1 (1) Φ Φ Φ Φ
1--------1 1--------1 1—1 1---------1 1--------1
Hl H 1 H 1 Η1 1 H |
1 cn 1 cn 1 ω cn cn
í>t £>ί
i-q n-q t ι-q I r-q I π-q I
1 Φ 1 0) (D CD CD
1—I 1—I 1—I 1—1 1—1
Hl 1—1 Hl 1 H I Η1 1
1 £ 1 a i a 1 C 1 a
i—1 1--------1 1—1 r—1 1--------1
0 0 I 0 I 0 | 0 I
1 σ> 1 Cn 1 Cn CH Cn
P M μ
< I < I < | < I < |
1 m 1 fd (0 fd cd
i-1 i—1 |—1 i—1 1—1
< < < < <
CQ. O2L I co. 1 CO. I co. I
1 i—1 1 1—1 1 1—1 1 i—1 i—1
ί>Ί q*i £>ί ^*Ί
c c z C
•H •H •H •H •H
X P 4-) X 4J
O o 0 0 0
•H •H •H Ή •H
m Cfl m Cfl m
CM co LO CD
CO co co co CO
Tabulka 4
Analýza peptidů 1 a 21 - 36 chromatografií a hmotnostní spektrometrií
No Vzorec Mr MSa Výtěžek Anal.RP-HPLC
[M+H]+ mgb pmol %° Ír (min)d Čistota (%)e
1 C117H188N38O22S2 2543,12 2544,1 6,7 2,6 50 19,0 78
21 C114H181N35O11S2 2458,01 2459,0 5,7 2,3 44 16,8 66
22 C115H185N37O21S2 2486,00 2487,1 6,2 2,5 47 16,9 79
23 C114H182N38O22S2 2501,04 2502,0 5,8 2,3 44 12,9 80
24 C114H181N37O22S2 2486,00 2487,0 6,4 2,6 48 17,6 76
25 C114H182N38O22S2 2501,04 2502,0 6,8 2,7 51 15,7 80
26 C109H183N37O22S2 2427,99 2429,0 6,2 2,7 52 12,5 80
27 C111H184N38O22S2 2467,02 2468,0 6,1 2,5 47 12,8 79
28 C115H185N37O21S2 2486,07 2487,1 6,5 2,6 49 15,9 78
29 C116H187N37O21S2 2500,09 2501,1 5,7 2,3 43 16,2 75
30 C114H181N35O22S2 2458,01 2459,0 5,6 2,3 43 18,7 77
31 C114H181N35O22S2 2458,01 2459,0 7,5 3,1 58 16,8 77
32 C115H184N38O22S2 2483,00 2484,0 6,4 2,6 49 15,4 96
33 C114H181N37O22S2 2486,03 2487,0 6,8 2,7 52 16,6 79
34 C109H183N37O22S2 2427,99 2429,0 8,5 3,5 66 14,3 83
35 C114H181N37O22S2 2486,03 2487,0 9,0 3,6 68 16,5 78
36 C114H181N37O22S2 2486,03 2487,0 10,1 4,0 76 16,4 73
Provedeno metodou DE MALDI-TOF MS.
b Ρθ extrakci na pevné fázi a centrifugaci ve vakuu.
c Vzhledem k 5,3 pmol naneseným pro syntézu ‘crowns’.
d Gradient 15-35 % (peptidy 21-36) v 0,1% vod. TFA 20 min.
e Z integrace chromatogramu (λ = 214 nm).
* a * a • ·
3.2: Testy internalizace peptidů byly prováděny podle části 1.3
3.3: Výsledky
3.3,1: Syntéza peptidů
Peptidy 21 - 36 byly připravovány současně s použitím tzv.
metody Multipin™ (Valerio, R. M. a další (1993) International Journal of Peptide and Protein Research 42, 1 - 9). Za den byly prováděny průměrně dva cykly vazby/odstranění ochranných skupin a celá syntéza včetně biotinylace, štěpení/odstranění ochranných skupin, io čištění extrakcí na pevné fázi a analýza byly ukončeny během 14 dnů.
Izolované a purifikované výtěžky peptidů se pohybovaly od 43 do 76 % a čistoty byly 66 až 96 % (tabulka 2). Hlavní pozorované nečistoty (MS, data nejsou ukázána) byly peptidy obsahující Met(O). Zdá se, že tvorba methioninsulfoxidu je hlavním problémem souvisejícím 15 s metodou Multipin, pravděpodobně způsobeným oxidací během dlouhých období sušení na vzduchu po krocích acylace a odstraňování ochranných skupin. V podstatě je možné zpětně redukovat Met(O) na peptidy; například v analytickém měřítku byli autoři vynálezu schopni převádět nečistoty obsahující Met(O) na látku 1 čistě s použitím 20 NH4l/Me2S v TFA (Nicolas, E. a další (1995) Tetrahedron 51, 57013) (výsledky nejsou ukázány).
3.3.2: Vliv substituce zbytků
Výsledky s použitím sady peptidů, ve kterých byl každý zbytek 25 substituován Ala (peptidy 21 - 36) jsou ukázány na obr. 5. Výsledky jasně ukazují, že neexistují žádné velmi přísné požadavky na nějaký konkrétní hydrofóbní zbytek. Jinde bylo ukázáno, že například oba zbytky Ile mohou být substituovány Val, zjevně bez ztráty aktivity (Brugidou, J. a další (1995) Biochemical and Biophysical Research 30 Communications 214, 685 - 693). Navíc je Met12 volně zaměnitelný • · *·· · · · • · · · · · »·· · .:. : ·..· : ’·· ·:·
- 39 buď za Leu nebo Nle (výsledky nejsou ukázány). Tyto výsledky jasně ukazují, že na rozdíl od zkušeností dosavadního stavu techniky není zapotřebí přítomnost Trp6.
Příklad 4
Další modifikované deriváty penetratinu
S použitím metod popsaných v částech 1.1 a 1.2 výše je možno připravit další modifikované peptidy SEQ ID No. 1 náhradou alaninového zbytku ukázaného tučně jakýmkoli jiným zbytkem io aminokyseliny včetně následujících peptidů, které byly všechny účinné při testu internalizace popsaném v části 1.3 výše.
Modifikace penetratinu* Sekvence
Met55Nle RQIKIWFQNRROKWKK
Met55 Nle (retro) KKWKORRNQFWIKIQR
Gln50Pro RQIKIWFPNRRMKWKK
45,50,55Pro RQPIKIWFPSRRMPWKK
Trp48,56Phe RQIKIFFQNRRMKFKK
* Číslování se týká odpovídajících zbytků, tak jak se objevují v
Antennapedia, kde se penetratin označuje jako AntP (43 - 58)
Příklady 5 až 17
S použitím metod popsaných býše byly podle popisu připraveny translokační vektory obsahující nosnou skupinu navázanou na dopravovanou látku.
KOO*) « t · • · • · • · resin ,69 mmol/g, ♦ · *·«· »«·· ♦ · · 9 99 • 999 9 99 ♦ 9 9 9 99
9 9 99 ·· ·
Příklad 5
H-Cys-gAla-Arq-Arq-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NHg
Vycházeje z pryskyřice Rink Amide AM
Novabiochem), byl sestaven peptid H-Cys(Trt)-pAla-Arg(Pmc)-Arg 5 (Pmc)-Met-Lys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-pryskyřice. Po odstranění ochranných skupin (1,5 hod) byl získán surový peptid vysrážením z ΕΪ2Ο, centrifugací/dekantací a sušením. Alikvoty (celkově 246 mg) byly čištěny preparativní RP-HPLC (6,5 - 16,5 % MeCN gradient)za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu (106,4 mg). Výsledky 10 analýzy RP-HPLC: tR = 15,8 min (6,5 - 16,5 % MeCN gradient, čistota >95 %, λ = 214 nm). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 1205,4 (C52H92N20O9S2 - 1205,55).
2’-[Sukcinimidopropionoyl-(H-Cys-6Ala-Arq-Arq-Met-Lys-Trp-Lvs-Lys15 NH2)]paklitaxel
K roztoku 2’-(maleimidopropionoyl)paklitaxelu (17 pmol,
17,4 mg) a H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH2 (15 pmol,
18,1 mg) v DMF (1 ml) byl přidán Et3N (2,0 μΙ). Směs byla míchána 25 1 hod, filtrována a čištěna preparativní RP-HPLC (10 až 70 % gradient
MeCN). Čistá sloučenina uvedená v názvu (9,4 mg) byla získána jako bezbarvá pevná látka. Výsledky analýzy: RP-HPLC: tR = 17,2 min (0 60 % MeCN gradient, čistota >97 %). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ =
2211,7 (C106H148N22O26S2 = 2210,57.
Pl/ W-yw
4-(Maleímidopropiononyl)podofylotoxin <·· · · • ·♦· ·:·-ΝΪ
• • · ♦ • * · ♦ * • · • · 99
• • · · • ·
·· Φ 99
Příklad 6 kyseliny 3maleimidopropionové (0,31 mmol, 52,4 mg), DIC (0,17 mmol, 21,5 mg) a DMAP (80 pmol, 10 mg) v CH2CI2 (2 ml) byl míchán 1 hod. Rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu a zbytek byl znovu rozpuštěn v DMF/MeOH (1 ml) a čištěn preparativní RP-HPLC (20 - 70 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (7,3 mg). Výsledky analýzy RP-HPLC: ír = 20,1 min (0 60 % MeCN gradient, čistota >95 %). 1H-NMR (300 MHz, CDCI3) δ: 2,66-2,71 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH2), 2,82-2,84 (m, 2H, H2 a H3), 3,69 (s, 6H, OCH3 x 2), 3,75 (s, 3H, OCH3), 3,83 (t, J= 6,3 Hz, 2H, CH2), 4,12 (t, J= 9,92 Hz, 1H, H11), 4,31 (m, 1H, H11), 4,53 (d, J= 11,4 Hz, 1H, H1), 5,80 (d, J= 8,7 Hz, 1H, H4), 5,92 (dd, J= 5,49, 1,17 Hz, 2H, OCH2O), 6,32 (s, 2H, H2’6’), 6,47 (s, 1H, H8), 6,66 (s, 2H, CH=CH), 6,74 (s, 1H, H5).
Roztok podofylotoxinu (60 pmol, 25,6 mg),
4-[Sukcinimidopropionoyl-(H-Cvs-8Ala-Arq-Arq-Met-Lys-Trp-Lys-LysNHÚlpodofylotoxin
• · ·· ·· ·
PI/ W<J-J. 51W
K roztoku 4-(maleimidopropionoyl)podofylotoxinu (17,7 pmol, 10 mg) a H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NI-h (25 pmol,
30,4 mg) v DMF (1,5 ml) byl přidán Et3N (3,5 μΙ). Směs byla míchána 40 min, zfiltrována a čištěna preparativní RP-HPLC (0 - 60 % gradient MeCN). Čistá sloučenina uvedená v názvu byla získána jako bezbarvá pevná látka (17,8 mg, 57 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 14,8 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >98 %). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 1772,3 (CgiHngN2i02oS2 = 1771,07).
Příklad 7
H-Cys-BAla-D-Arq-D-Arq-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys-NH?
S použitím pryskyřice Rink Amide AM (0,69 mmol/g, Novabiochem) jako výchozí látky byl sestaven peptid H-Cys(Trt)-pAlaD-Arg(Pmc)-D-Arg(Pmc)-D-Met-D-Lys(Boc)-D-Trp-D-Lys(Boc)-DLys(Boc)-pryskyřice. Po odstranění ochranných skupin (1,5 hod) byl surový peptid získán vysrážením z Et2O, centrifugací/dekantací a sušením. Alikvoty (celkem 237 mg) byly čištěny preparativní RP-HPLC (8-18 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu (66 mg). Výsldky analýzy RP-HPLC: tR = 12,9 min (9-19 % MeCN gradient, čistota >99 %, λ = 214 nm). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ =
1207,2 (C52Hg2N2oOgS2 = 1205,55).
• «· · • · · ·
4-[Sukcinimidopropionoyl-(H-Cvs-B-Ala-D-Arq-D-Arq-D-Met-D-Lys-DTrp-D-Lys-D-Lys-NH^lpodofylotoxin
K roztoku 4-(maleimidopropionoyl)podofylotoxinu (18,9 pmol, 10,7 mg) a H-Cys-pAla-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-LysNH2 (28 pmol, 33,8 mg) v DMF (1,5 ml) byl přidán Et3N (1,5 μΙ). Směs byla míchána 40 min, zfiltrována a čištěna preparativní RP-HPLC (0 60 % MeCN gradient). Čistá sloučenina uvedená v názvu byla získána jako bezbarvá pevná látka (6,9 mg, 21 %). Výsledky analýzy RPHPLC: tR = 14,8 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >98%). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 1771,5 (C81H119N21O20S2 = 1771,07).
Příklad 8
4,-(Maleimidopropionoyl)epipodofylotoxin OH cočq
o ···· • · · ·
-44 Roztok 4’-demethylepipodofylotoxinu (12 mmol, 5 mg), kyseliny
3-maleimidopropionové (50 pmol, 12,2 mg) a DIC (28 pmol, 3,47 mg) v pyridinu (1 ml) byl míchán 30 min. Byl přidán MeOH (0,5 ml) a směs byla čištěna preparativní RP-HPLC (0 - 60 % MeCN gradient) za 5 získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (4,2 mg, 62 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 17,6 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >95%). 1H-NMR (300 MHz, CDCI3) δ: 2,84 (m, 1H, H3), 2,99 (t, J = 7,44 Hz, 2H, CH2-Mim), 3,32 (dd, J= 14,04, 5,07 Hz, 1H, H2), 3,69 (s, 6H, OCH3x2), 3,95 (t, J= 7,44 Hz, 2H, CH210 Mim), 4,39 (dd, J = 8,13, 4,28 Hz, 2H, H11), 4,66 (d, J = 5,00 Hz, 1H, H1), 4,89 (d, J= 3,32 Hz, 1H, H4), 6,01 (d, J= 6,42 Hz, 2H, OCH2O), 6,32 (s, 2H, H2’6’), 6,57 (s, 1H, H8), 6,74 (s, 2H, CH=CH), 6,90 (s, 1H, H5). 13C-NMR (75 MHz, CDCI3) δ: 28,64, 31,02, 32,55, 37,33, 39,53, 42,99, 55,15, 65,78, 66,56, 100,65, 196,54, 107,97, 109,65, 130,68, 15 130,92, 133,21, 136,96, 146,62, 147,61, 150,39, 167,36, 169,30,
173,89.
4’-[Sukcinimidopropionoyl-(H-Cys-3Ala-Arq-Arq-Met-Lys-Trp-Lys-LvsNH2)1epipodofylotoxin
OH
K roztoku 4’-(maleimidopropionoyl)epipodofylotoxinu (14 pmol,
7,9 mg) a H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH2 (26 pmol, • ·« · • · · ·
31,5 mg) v DMF (1 ml) byl přidán EÍ3N (1,9 μΙ). Po míchání 40 min byla směs čištěna preparativní RP-HPLC (0 - 60 % gradient) za získání sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (15,8 mg, 63 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 13,3 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >98 %). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 1757,2 (C80H117N21O20S2 = 1757,05).
Příklad 9
4-(Jodacetvl)podofylotoxin
Směs podofylotoxinu (0,49 mmol, 204 mg), kyseliny jodoctové (1,03 mmol, 192 mg), DIC (0,552 mmol, 69,7 mg) a DMAP (0,164 mmol, 20 mg) v suchém CH2CI2 (5 ml) byla ochlazena na 0 °C. Byl přidán pyridin (0,2 ml) a reakční směs byla ponechána míchat 1 hod při 0 °C. Směs byla odpařena do sucha. Získaný světležlutý zbytek byl znovu rozpuštěn v MeCN a čištěn preparativní RP-HPLC (20 - 70 % MeCN gradient) za získání sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (89,5 mg). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 22,3 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >95 %). 1H-NMR (300 MHz, CDCI3) δ: 2,85 (m, 2H, H2, 3), 3,70 (s, 6H, OCH3 x 2), 3,72 (s, 2H, CH2I, 3,74 (s, 3H, OCH3), 4,13 (m, 1H, H11), 4,34 (m, 1H, H11), 4,53 (d, 1H, J =3,60 Hz, H1), 5,83 (d, 1H, J = 8,43 Hz, H4), 5,93 (dd, 2H, J = 4,35, 1,17 Hz, OCH2O)), 6,31 (s, 2H, H2’6’), 6,48 (s, 1H, H8), 6,77 (s, 1H, H5).
·· ··· ·
4-fAcetyl-(H-Cys-3Ala-Arq-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-LysNH^jpodofylotoxin
Roztok 4-(jodacetyl)podofylotoxinu (17 pmol, 10 mg) a H-CyspAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH2 (23 pmol, 28,6 mg) v DMF (1 ml) byl smíchán s Et3N (2,4 pl, 17 pmol). Po míchání 1 hod byl přidán MeCN (0,5 ml) a směs byla čištěna preparativní RP-HPLC (0 15 60 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (29,4 mg, 100 %). Výsledky analýzy RPHPLC: ír - 14,1 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >98 %). DE MALDI-TOF MS: [M + Hf = 1661,0 (CyeHmNzoO^Sz = 1659,97).
Příklad 10
4,-Demethyl-4-(jodacetvl)epipodofylotoxin
φφ φ φ φ φ φ φ
Κ roztoku 4’-demethyiepipodofylotoxinu (0,26 mmol, 104 mg), kyseliny jodoctové (0,53 mmol, 98,8 mg) a DIC (0,32 mmol, 40,1 mg) v CH2CI2 (2 ml) při 0 °C byl přidán pyridin (50 pl) a DMAP (0,1 mmol, 12,8 mg). Po 1 hod míchání byla rozpouštědla odpařena. Zbytek byl 5 znovu rozpuštěn v DMF (1 ml) a čištěn preparativní RP-HPLC (20 60 % MeCN gradient) za získání sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (35,7 mg, 24 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 20,3 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >96 %). 1H-NMR (300 MHz, CDCIs) δ: 3,02 (m, 1H, H3), 3,20 (m, 1H, H2), 3,71 (s, 6H, 10 OCH3 x 2), 3,63 (s, 2H, CH2I), 3,74 (s, 3H, OCH3), 4,05 (m, 1H, H11), 4,27 (m, 1H, H11), 4,60 (d, 1H, J=4,94 Hz, H1), 6,06 (d, 1H, J=3,41 Hz, H4), 5,92 (m, 2H, OCH2O), 6,21 (s, 2H, H2'6’), 6,49 (s, 1H, H8), 6,80 (s, 1H, H5).
4’-Demethvl-4-[acetvl-(H-Cvs-3Ala-Arq-Arq-Met-Lys-Trp-Lvs-LysNH2)l--epipodofylotoxin
K roztoku 4’-demethyl-4-(jodacetyl)epipodofylotoxinu (17,6 pmol,
10 mg) a H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH2 (14,9 pmol, mg) v DMF (1 ml) byl přidán EtsN (2,1 pl, 15 pmol). Po míchání 1 hod byla reakčni směs čištěna preparativní RP-HPLC (0 - 60 % MeCN gradient) za získání sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (11,2 mg, 46 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 12,8 min (0 *·,···:
% MeCN gradient, čistota >98 %). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ -
1647,2 (C75H1 i2N2oOigS2= 1645,95).
Příklad 11
4-(Boc-Glv)podofylotoxin
Směs podofylotoxinu (400 mg, 0,97 mmol), Boc-Gly-OH (510 mg, 2,91 mmol) DIC (1,73 mmol, 273 μΙ), DMAP (0,41 mmol, 50 mg) a pyridinu (173 μΙ) v CH2CI2 (5 ml) byla míchána 1 hod. Rozpouštědla byla odpařena. Zbytek byl znovu rozpuštěn v DMF (1,5 ml) a čištěn RP-HPLC (20 - 70 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (502,6 mg, 91 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 22,1 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >97 %).
4-(H-Gly) podofylotoxin ·φ·φ • 9 9 9 · 9ΦΦ φ 9 9999 9 9 · Φ • 9 ΦΦΦ 9ΦΦ ·«· · ΦΦ Φ φ· ΦΦ Φ
- 49 Κ roztoku 4-(Boc-Gly)podofylotoxinu (0,24 mmol, 137 mg) v CH2CI2 (8 ml) byla přidána TFA (0,5 ml). Po míchání 1 hod byla rozpouštědla odpařena. Výsledný světležlutý pevný zbytek byl čištěn RP-HPLC (10-70 % MeCN gradient) za získání sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (41,7 mg, 37 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: Ír = 15,2 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >97 %).
4-(Maleimidopropionoyl-Gly)podofylotoxin
K roztoku kyseliny 3-maleimidopropionové (70 pmol, 11,8 mg) a DIC (38 pmol, 4,83 mg) v DMF (1 ml) byl přidán 4-(H-Gly)podofylotoxin (17 pmol, 8 mg), DMAP (10 pmol, 1,2 mg) a pyridin (20 pl). Po míchání 1 hod byla směs čištěna preparativní RP-HPLC (0 - 60 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (1,1 mg). Výsledky analýzy RP-HPLC: ír =
18,2 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >97%).
4-[(Sukcinimidopropionoyl-Glv)-(H-Cys-8Ala-Arq-Arq-Met-Lvs-Trp-LysLys-NH2)lpodofylotoxin • ·· · ·♦· ·
o^o
K roztoku 4-(maleimidopropionoyl-Gly)podofylotoxinu (1,8 pmol,
1,1 mg) a H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH2 (4 pmol, io 5 mg) v DMF (1 ml) byl přidán Et3N (0,5 pl, 4 pmol). Směs byla míchána 1 hod. Byla zředěna MeCN (0,5 ml) a čištěna preparativní
RP-HPLC (0 - 60 % MeCN gradient) za získání sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (1,1 mg, 33 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: ír = 14,7 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >97 %).
DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 1829,8 (CgsH^zNzaOsiSz = 1828,12).
Příklad 12
H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH?
Při použití výchozí pryskyřice Rink Amide AM (0,69 mmol/g,
Novabiochem) byla sestavena H-Cys(Trt)Arg(Pmc)-Arg(Pmc)-MetLys(Boc)-Trp-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-pryskyřice. Po odstranění ochranných skupin (1,5 hod) byl surový peptid získán srážením z Et2<D, centrifugací/dekantací a sušením. Alikvoty (celkem 258 mg) byly čištěny preparativní RP-HPLC (9-19 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu (132,4 mg). Výsledky analýzy RPHPLC: tR = 20,3 min (8-18 % MeCN gradient, čistota >99 %, λ = 214 nm). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 1238,6 (C52H92N2o09S3 = 1237,63).
···· ·· ····
Bis-r4-(sukcinimidopropionoyl)podofvlotoxin]-(H-Cvs-Arq-Arq-Met-LysT rp-Lvs-Lvs-Cvs-NHg)
K roztoku 4-(maleimidopropionoyl)podofylotoxinu (19 pmol, 11 mg) a H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH2 (12 pmol, 15 mg), v DMF (1 ml) byl přidán Et3N (2,8 pl). Po míchání 1 hod byla směs čištěna preparativní RP-HPLC (10-70 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (9,0 mg, 32 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 17,4 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >98 %). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 2369,7 (C110H146N22O31S3 = 2368,66).
Příklad 13
4’-(Sukcinimidopropionovl)epipodofylotoxin-(H-Cvs-Arq-Arq-Met-LvsTrp-Lys-Lvs-Cvs-NH2)-10-O-(sukcinimidopropionoyl)kamptotecin
K roztoku
10-O-(maleimidopropionoyl)kamptotecinu (0,005 mmol, 2,6 mg), 4’-(maleimidopropionoyl)epipodofylotoxin (5,6 pmol, 3,1 mg) a H-Cys-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-Cys-NH2 (11 pmol, 13 mg), v DMF (1,5 ml) byl přidán Et3N (1,5 pl). Po míchání
1,5 hod byla směs čištěna preparativní RP-HPLC (10 -70 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (1,9 mg). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 14,8 min (0 60 % MeCN gradient, čistota >96 %). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ =
2304,6 (CiQ7H-i3sN24O2gS3 - 2304,58).
Příklad 14
4’-(Sukcinimidopropionoyl)epipodofvlotoxin-(H-Cys-Arq-Arq-Met-Lys20 Trp-Lvs-Lvs-Cys-NH2)-2'-(sukcinimidopropionyl)paklitaxel
OH ···· • · · ·
K roztoku 4’-[sukcinimidopropionoyl-(H-Cys-Arg-Arg-Met-LysTrp-Lys-Lys-Cys-NH2)]epipodofylotoxinu (2 pmol, 3,5 mg), 2’-(maleimidopropionyl)paklitaxelu (2 pmol, 2 mg) v DMF (1 ml) byl přidán Et3N (0,3 pl). Po míchání 1,5 hod byla reakční směs čištěna 5 preparativní RP-HPLC (10 - 70 % MeCN gradient) za získání sloučeniny uvedené v názvu v čistém stavu jako bezbarvé pevné látky (1,5 mg). Výsledky analýzy RP-HPLC: ír = 17,8 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >98 %). DE MALDI-TOF MS: [M+H]+ = 2794,5 (C134H173N23O37S3 = 2794,14).
Příklad 15
4,-Methoxy-4-í4”-aminoanilino-(sukcinimidopropionoyl)-(H-Cvs-3AlaArg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-NH^Iepipodofylotoxin ď^o
NH
K roztoku 4’-methoxy-[4”-aminoanilino-(maleimidopropionoyl)]-epipodofylotoxinu (7 pmol, 4,6 mg) a H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-LysTrp-Lys-Lys-NH2 (14 pmol, 16,3 mg) v DMF (1 ml) byl přidán Et3N (1 pl). Po míchání 1 hod byla směs čištěna preparativní RP-HPLC (0 25 60 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (6,4 mg, 49 %). Výsledky analýzy RPHPLC: ír = 15,2 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >98 %). DE MALDI-TOF MS: [M + H]+ = 1861,6 (CszH^sNzsOigSa = 1861,20).
Příklad 16
4’-Demethyl-4-[4'’-aminoanilino-(maleimidopropionoyl)l-epipodofylotoxin ·♦»· ·· ···*
K roztoku 4'-demethyl-4-(4”-aminoanilino)epipodofylotoxinu (24 pmol, 12 mg), kyseliny 3-maleimidopropionové (49 pmol, 8,3 mg), a DIC (27 pmol, 3,4 mg) ve směsi 1 : 1 DMF/CH2CI2 (2 ml) byl přidán pyridin (10 pl). Po míchání 1 hod byla reakční směs odpařena. Získaná světležlutá pevná látka byla čištěna preparativní RP-HPLC (10 - 70 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (5,3 mg, 34 %). Výsledky analýzy RP-HPLC: tR = 19,5 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >96 %). 1HNMR (300 MHz, CDCI3) δ: 2,65 (t, 2H, J= 7,3 Hz, CH2), 2,98 (m, 1H, H3), 3,17 (m, 1H, H2), 3,79 (s, 6H, OCH3), 3,93 (t, 2H, J= 7,0 Hz,
CH2), 3,99 (m, 1H, H5, H11), 4,38 (m, 1H, H11), 4,58 (d, 1 H, J = 4,95
Hz, H1), 4,64 (d, 1H, J= 3,95 Hz, H4) 5,96 (m, 2H, OCH2O), 6,33 (s, 2H, H2’6’), 6,49 - 6,53 (m, 3H, H8, Ar), 6,74 (s, 2H, CH=CH), 6,75 (s, 1H, H5), 7,33 (m, 2H, Ar).
4'-Demethyl-4-[4l,-aminoanilino-(sukcinimidopropionovl)-(H-Cys-3AlaArq-Arq-Met-Lvs-Trp-Lys-Lys-NHzjlepipodofvlotoxin
K roztoku 4’-demethyl-[4”-aminoanilino-(maleimidopropiono-yl)]epipodofylotoxinu (8,3 pmol, 5,3 mg) a H-Cys-pAla-Arg-Arg-Metio Lys-Trp-Lys-Lys-NH2 (13 pmol, 15,6 mg) v DMF (1,5 ml) byl přidán Et3N (2 μΙ). Po míchání 1 hod byla směs čištěna preparativní RP-HPLC (0 - 60 % MeCN gradient) za získání čisté sloučeniny uvedené v názvu jako bezbarvé pevné látky (14,9 mg, 97 %). Výsledky analýzy RPHPLC: tR = 13,7 min (0 - 60 % MeCN gradient, čistota >98 %). 15 DE MALDI-TOF MS: [M+Hf = 1847,1 (C86H123N23O19S2 = 1847,17).
Příklad 17
Vyhodnocení derivátů etoposidu a podofylotoxinu testem inhibice topoisomerázy II
Test na topoisomerázu II - plasmidová DNA (0,3 pg) byla inkubována při 37 °C se čtyřmi jednotkami čištěné rekombinantní lidské topoisomerázy II ve štěpícím pufru (30 mM Tris.HCI, pH 7,6, 60 mM NaCl, 3 mM ATP, 15 mM merkaptoethanol, 8 mM MgCI2) s nebo bez přídavku testované sloučeniny (při konečné koncentraci
1 mM, 100 μΜ, nebo 10 uM). Reakce byly ukončeny bezprostředním přidáním SDS (1 % hmotnost/objem konečné koncentrace). Vzorky byly zpracovány působením proteinázy K (30 min při 37 °C) a dvakrát extrahovány stejným objemem směsi 42 : 1 CHCI3/i-amylalkohol. Po přidání nanášecího barviva byly vzorky naneseny na 4 x TAE, 1% ·♦·* ··*·
- 56 agar'pzpvý gel obsahující 0,5 mg/ml ethidiumbromidu a byla provedena elektroforéza v trvání 16 až 24 hod. Inhibice topoisomerázy II byla posuzována produkcí lineární plasmidové DNA, reprezentující zachycený meziprodukt štěpení, a poměrem substrátu 5 (nadšroubovicová DNA) k produktu (relaxovaná DNA). Test relaxace byl proveden stejným způsobem s tím rozdílem, že reakční pufr byl optimalizován pro detekci katalýzy spíše než pro štěpení, tj. ve vzorku bylo použito pouze dvou jednotek enzymu. Reakční pufr měl složení 50 mM Tris.HCI, pH 8, 120 mM KCI, 0,5 mM ATP, 0,5 mM io dithiothreitol, 10 mM MgCh Inhibice topoisomerázy II byla posuzována poměrem substrátu (nadšroubovicová DNA) k produktu (relaxovaná DNA).
Tabulka 8
Testovaná sloučenina Pozorovaná aktivita3
Etoposid IC
Podofylotoxin -
4’-Demethylepipodofylotoxin IC
4’-Demethyl-4-(4”-aminoanilino)epipodofylotoxin I
H-pAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-N H2 -
4-[Sukcinimidopropionoyl-(H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys- T rp-Lys-Lys-Nhhjjpodofylotoxin -
4’-[Sukcinimidopropionoyl-(H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys- Trp-Lys-Lys-NH2)]epipodofylotoxin IC
4’-Demethyl-4-[acetyl-(H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-l_ys-Trp- Lys-Lys-NH2)]epipodofylotoxin IC
4’-Demethyl-4-[4”-aminoanilino-(sukcinimidopropionoyl)(H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-LysNH2)]epipodofylotoxin I
a) I znamená inhibici relaxace nadšroubovicového plasmidu topoisomerázou II. C znamená akumulaci reakčního meziproduktu topoisomerázy II.
Příklad 18
Porovnání úplného a zkráceného penetratinu jako vektoru pro skupinu léčiva
Pro porovnání cytotoxického biologického účinku na rakovinné buňky (buněčné linie uvedené v tabulce 9) skupinou léčiva io používaných za pomoci úplných a zkrácených penetratinových nosných skupin byly buňky vystaveny v příslušných koncentracích působení vhodných podofylotoxinových konjugátů (podofylotoxin(16mer vektor), 4--[sukcinimidopropionoyl-(H-Cys-Arg-Gln-lle-Lys-lleT rp-Phe-GIn-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-T rp-Lys-Lys-Gly-Cys-Gly15 NH2)]podofylotoxin; podofylotoxin-7mer vektor, 4[sukcmimidopropionoyl-(H-Cys-pAla-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-LysNH2)]-podofylotoxin). Buňky byly vystaveny sériovým ředěním testovaných sloučenin. Po inkubaci v trvání 96 hod byla zjišťována cytotoxicita s použitím standardního testu proliferace buněk založeného na sulforhodaminu B (SRB). Hodnoty IC50 jsou shrnuty v tabulce 9.
- 58 Tabulka 9
A2780 A2780 CÍSR CH1 CH1 Doxr CH1 TaxolR HCT116 HT29 KM12
podofylotoxin, 16-mer1 0,55 0,48 0,46 0,49 0,21 0,52 0,54 0,48
podofylotoxin, - 2 7-mer 0,115 0,125 0,12 0,115 0,115 0,14 0,17 0,39
1. maximální tolerovaná dávka při i.v. podání myším ion je přibližně mg/kg (x myši)
2. maximální tolerovaná dávka při i.v. podání myším ion je přibližně 5 75 mg/kg (x myši)
Jak je vidět z tabulky, konjugát zkrácený penetratin podofylotoxin je z hlediska antiproliferativního účinku na tumorové buňky účinnější, čímž je dosaženo nižší celkové toxicity.

Claims (46)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Peptidová nosná skupina pro transport membránou vzorce:
    5 RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID No. 1)
    1 16 kde na aminokonci je provedena delece alespoň jednoho aminokyselinového zbytku, nebo její varianty.
    io
  2. 2. Nosná skupina podle nároku 1, ve které je provedena delece až do 9 aminokyselin.
  3. 3. Nosná skupina podle nároku 2, ve které je provedena delece šesti až devíti aminokyselin.
  4. 4. Nosná skupina podle nároku 3, ve které je provedena delece devíti aminokyselin.
  5. 5. Nosná skupina podle nároku 3, která je zvolena ze skupiny
    20 RRMKWKK, NRRMKWKK, QNRRMKWKK a FQNRRMKWKK.
  6. 6. Varianta nosné skupiny definované v jakémkoli z předcházejících nároků, kde: (a) jeden nebo více aminokyselinových zbytků je nahrazeno aminokyselinovým
    25 zbytkem, který se vyskytuje nebo který se nevyskytuje v přírodě, (b) převrátí se pořadí dvou nebo více aminokyselinových zbytků, (c) současně jsou přítomny variace
    - 60 (a) a (b), (d) mezi jakýmikoli dvěma aminokyselinovými zbytky je přítomna mezerníková skupina, nebo (e) jeden nebo více aminokyselinových zbytků je v peptoidní formě, (f) je modifikována kostra (N-C-C) jednoho nebo více
    5 aminokyselinových zbytků peptidů, nebo je přítomna kombinace jakékoli variace (a) - (f).
  7. 7. Nosná skupina podle nároku 6, zvolená ze skupiny KRMKWKK, RKMKWKK, RREKWKK, RRQKWKK, RROKWKK, RRMKQKK, io RRMKWFK, RORKWKK, RRMWKKK, RROWKKK, RRMKKWK a RROKKWK.
  8. 8. Nosná skupina podle nároku 1, reprezentovaná jakoukoli ze sloučenin 2 až 20.
  9. 9. Peptidová nosná skupina pro transport membránami vzorce
    RQIKIWFQNRRMKWKK (SEQ ID No. 1)
    1 16 ve které alespoň jeden zbytek aminokyseliny je nahrazen 2o alternativním nahrazujícím zbytkem α-aminokyseliny, který se vyskytuje nebo který se nevyskytuje v přírodě.
  10. 10. Nosná skupina podle nároku 9, kde šestou aminokyselinou od aminového konce není tryptofan.
  11. 11. Nosná skupina podle nároku 9 nebo 10, kde nahrazující zbytek α-aminokyseliny je zvolen ze zbytků alanin, arginin, asparagin, kyselina asparagová, cystein, kyselina glutamová, glutamin, • · · · • · glycin, histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenyalanin, prolin, serin, threonin, tryptofan, tyrosin a valin.
  12. 12. Nosná skupina podle nároku 11, reprezentovaná jakoukoli ze sloučenin 21 - 36.
  13. 13. Nosná skupina podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde volná karboxylové skupina karboxykoncového zbytku aminokyseliny je ve formě -C(O)-NRR’, kde R a R’ jsou vždy nezávisle zvoleny ze skupiny atom vodíku, C1-6 alkyl, C1-6 alkylen nebo C1-6 alkinyl, aryl, kde každá tato skupina může být popřípadě substituována heteroatomy jako jsou O, S nebo N.
  14. 14. Nosná skupina podle nároku 13, kde volná karboxylové skupina karboxykoncového zbytku aminokyseliny je karboxamidová skupina.
  15. 15. Nosná skupina podle nároku 14 vzorce RRMKWKK-NH2.
  16. 16. Nosná skupina podle některého z předcházejících nároků, kde peptid se skládá z aminokyselinových zbytků v L formě.
  17. 17. Nosná skupina podle některého z předcházejících nároků, kde peptid se skládá z aminokyselinových zbytků v D formě.
  18. 18. Nosná skupina podle některého z nároků 16 nebo 17, kde peptid je ve formě retro.
    • ·♦ · ·· ···♦ · · • · · · · · ·
  19. 19. Vektor pro transport membránami, vyznačující se tím, že obsahuje peptidovou nosnou skupinu pro transport membránami podle některého z nároků 1 až 18
    5 navázanou na dopravovanou skupinu.
  20. 20. Vektor pro transport podle nároku 19, vyznačující se tím, že dopravovaná skupina je oligonukleotid, nukleotid, protein, peptid, biologicky aktivní sloučenina nebo io diagnostická látka.
  21. 21. Vektor pro transport podle nároku 20, vyznačující se tím, že dopravovaná skupina je oligonukleotid nebo nukleotid zvolený z genů, fragmentů genů, sekvencí DNA,
    15 cDNA, RNA, nukleotidů, nukleosidů, heterocyklických bází, syntetických a nesyntetických, a oligonukleotidů typu sense nebo anti-sense.
  22. 22. Vektor pro transport podle nároku 20, vyznačující
    20 s e t í m , ž e dopravovaná skupina je protein nebo peptid, který interferuje s buněčným cyklem.
  23. 23. Vektor pro transport podle nároku 22, vyznačující se tím, že nosná skupina je zvolena z fragmentů
    25 peptidu p53, fragmentů peptidu p21WAF, fragmentů peptidu
    Fen1 a fragmentů peptidu p16.
  24. 24. Vektor pro transport podle nároku 20, vyznačující se tím, že dopravovanou skupinou je léčivo.
    • · · · ·· · ·
  25. 25. Vektor pro transport podle nároku 24, vyznačující se tím, že dopravovaná skupina je odvozená z cytotoxického léčiva.
  26. 26. Vektor pro transport podle nároku 25, vyznačující se tím, že dopravovaná skupina je zvolená ze skupiny látky poškozující DNA, antimetabolity, antitumorové protilátky, přírodní produkty a jejich analogy, inhibitory dihydrofolátreduktázy, pyrimidinové analogy, purinové analogy, inhibitory cyklin-dependentní kinázy, inhibitory thymidylátsyntázy, interkalační látky DNA, látky štěpící DNA, inhibitory topoisomerázy, anthracykliny, léky ze skupiny vinka, mitomyciny, bleomyciny, cytotoxické nukleosidy, pteridinová léčiva, diyneny, podofylotoxiny, léčiva s obsahem platiny, induktory diferenciace a taxany.
  27. 27. Vektor pro transport podle nároku 26, vyznačující se tím, že dopravovaná skupina je zvolena ze skupiny methotrexát, methopterin, dichlormethotrexát, 5-fluoruracil, 6merkaptopurin, trisubstituované puriny jako olomoucin, roskovitin a bohemin, flavopiridol, cytosinarabinosid, melfalan, leurosin, staurosporin, aktinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mitomycin D, mitomycin A, karninomycin, aminopterin, tallysomycin, podofylotoxin, etoposid, cisplatina, karboplatina, vinblastin, vinkristin, vindesin, paklitaxel, docetaxel, kyselina taxoterretinová, kyselina máselná, acetylspermidin, tamoxifen, irinotekan a kamptotecin.
    - 64
  28. 28. Vektor pro transport podle některého z nároků 19 až 27, vyznačující se tím, že dopravovaná skupina je přímo navázána na nosnou skupinu.
    5
  29. 29. Vektor pro transport podle některého z nároků 19 až 27, vyznačující se tím, že dopravovaná skupina je navázána na nosnou skupinu nepřímo prostřednictvím propojovací skupiny.
  30. 30. Vektor pro transport podle některého z nároků 19 až 29, vyznačující se tím, že dále obsahuje zaměřovači skupinu.
  31. 31. Vektor pro transport podle nároku 30, vyznačující se tím, že zaměřovači skupina je navázána na nosnou skupinu.
  32. 32. Vektor pro transport podle nároku 30, vyznačující se tím, že zaměřovači skupina je navázána na
    20 dopravovanou skupinu.
  33. 33. Vektor pro transport podle některého z nároků 19 až 32, vyznačující se tím, že každá nosná skupina nese více než jednu dopravovanou skupinu.
  34. 34. Vektor pro transport podle nároku 33, vyznačující se tím, že dopravované skupiny jsou různé.
    ···· ·· ··· · ·· • · · · · · ·
  35. 35. Vektor pro transport podle některého z nároků 33 nebo 34, vyznačující se tím, že dopravované skupiny jsou navázány na nosič prostřednictvím sítě lysinových zbytků.
  36. 36. Vektor pro transport podle některého z nároků 19 až 25, vyznačující se tím, že peptid nosné skupiny je složen z aminokyselinových zbytků v L formě.
  37. 37. Vektor pro transport podle některého z nároků 19 až 36, vyznačující se tím, že peptid nosné skupiny je složen z aminokyselinových zbytků v D formě.
  38. 38. Vektor pro transport podle některého z nároků 19 až 37, vyznačující se tím, že peptid nosné skupiny je ve formě retro.
  39. 39. Vektor pro transport podle některého z nároků 23 nebo 24, vyznačující se tím, že jak peptid nosné skupiny, tak i dopravované skupiny jsou v L formě.
  40. 40. Vektor pro transport podle některého z nároků 23 nebo 24, vyznačující se tím, že jak peptid nosné skupiny, tak i dopravované skupiny jsou v D formě.
  41. 41. Vektor pro transport podle některého z nároků 23 nebo 24, vyznačující se tím, že peptid nosné skupiny je v D formě a dopravované skupiny v L formě.
  42. 42. Vektor pro transport podle některého z nároků 23 nebo 24, vyznačující se tím, že peptid nosné skupiny je v L formě a peptid dopravované skupiny je v D formě.
    5
  43. 43. Vektor pro transport podle některého z nároků 19 až 42, vyznačující se tím, že prochází buněčnou membránou a zůstává v cytosolu.
  44. 44. Vektor pro transport podle některého z nároků 19 až 42, io vyznačující se tím, že prochází buněčnou membránou a jadernou membránou.
  45. 45. Peptidová nosná skupina pro transport membránou, vyznačující se tím, že obsahuje až do 15 15 aminokyselinových zbytků a alespoň peptid vzorce:
    RRMKWKK (I) nebo jeho varianty.
  46. 46. Dodávací systémy zvolené ze skupiny:
    # Skupina léčiva Propojovací skupina Nosná skupina paklitaxel 2'-sukcinimido- -propionoyl-CpA rrmkwkk-nh2 podofylotoxin 4-sukcinimido- -propionoyi-CpA rrmkwkk-nh2 podofylotoxin 4-sukcinimido- -propionoyl-ΟβΑ (D-R)(D-R)(D-M)(D-K) (D-W)(D-K)(D-K-NH2) epipodofylotoxin 4’-sukcinimido- -propionoyl-CpA rrmkwkk-nh2
CZ20011700A 1998-11-20 1999-11-19 Benzoxazolové deriváty a léčiva na jejich bázi CZ20011700A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP33127498 1998-11-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20011700A3 true CZ20011700A3 (cs) 2001-10-17

Family

ID=18241866

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20011700A CZ20011700A3 (cs) 1998-11-20 1999-11-19 Benzoxazolové deriváty a léčiva na jejich bázi

Country Status (23)

Country Link
US (1) US7045516B1 (cs)
EP (1) EP1134220B1 (cs)
JP (1) JP4557112B2 (cs)
KR (1) KR100675033B1 (cs)
CN (1) CN1333771A (cs)
AT (1) ATE273974T1 (cs)
AU (1) AU753797B2 (cs)
BR (1) BR9916793A (cs)
CA (1) CA2351446A1 (cs)
CZ (1) CZ20011700A3 (cs)
DE (1) DE69919575T2 (cs)
ES (1) ES2222763T3 (cs)
HU (1) HUP0104238A3 (cs)
ID (1) ID30143A (cs)
IL (1) IL143178A0 (cs)
NO (1) NO20012443L (cs)
PL (1) PL348426A1 (cs)
RU (1) RU2204558C2 (cs)
SK (1) SK6772001A3 (cs)
TR (1) TR200101945T2 (cs)
TW (1) TW520370B (cs)
WO (1) WO2000031073A1 (cs)
ZA (1) ZA200104620B (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6660858B2 (en) * 2001-03-28 2003-12-09 Lion Bioscience Ag 2-aminobenzoxazole derivatives and combinatorial libraries thereof
GB0203061D0 (en) * 2002-02-08 2002-03-27 Novartis Ag Organic compounds
JP4399862B2 (ja) * 2002-08-09 2010-01-20 味の素株式会社 腸疾患および内臓痛の治療薬
WO2007005780A2 (en) * 2005-07-01 2007-01-11 Dynogen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating gastrointestinal hypomotility and associated disorders
AU2007229492B2 (en) 2006-03-28 2011-11-03 High Point Pharmaceuticals, Llc Benzothiazoles having histamine H3 receptor activity
US8178666B2 (en) * 2008-10-23 2012-05-15 Albany Molecular Research, Inc. 2-aminobenzoxazole process
KR101579688B1 (ko) 2014-07-08 2015-12-24 재단법인 전남생물산업진흥원 좁쌀풀 추출물을 유효성분으로 함유하는 과민성 대장증후군에 의한 내장 통증 억제예방 또는 치료용 약학 조성물
BR112022025169A2 (pt) * 2020-06-12 2022-12-27 Hk Inno N Corp Uso de uma composição farmacêutica compreendendo composto derivado de benzimidazol, um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, um hidrato ou solvato do mesmo, ou uma mistura dos mesmos

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3193560B2 (ja) * 1993-04-16 2001-07-30 明治製菓株式会社 新規ベンゾオキサゾール誘導体
JP3520177B2 (ja) * 1996-05-09 2004-04-19 明治製菓株式会社 セロトニン５−ｈｔ３受容体部分活性薬

Also Published As

Publication number Publication date
IL143178A0 (en) 2002-04-21
KR100675033B1 (ko) 2007-01-29
CA2351446A1 (en) 2000-06-02
EP1134220B1 (en) 2004-08-18
AU753797B2 (en) 2002-10-31
DE69919575D1 (de) 2004-09-23
EP1134220A1 (en) 2001-09-19
JP4557112B2 (ja) 2010-10-06
TR200101945T2 (tr) 2001-11-21
SK6772001A3 (en) 2001-12-03
ES2222763T3 (es) 2005-02-01
US7045516B1 (en) 2006-05-16
TW520370B (en) 2003-02-11
BR9916793A (pt) 2001-11-13
RU2204558C2 (ru) 2003-05-20
ATE273974T1 (de) 2004-09-15
ID30143A (id) 2001-11-08
ZA200104620B (en) 2002-02-04
HUP0104238A3 (en) 2003-05-28
KR20010086448A (ko) 2001-09-12
DE69919575T2 (de) 2005-09-29
NO20012443L (no) 2001-07-12
AU1185000A (en) 2000-06-13
WO2000031073A1 (fr) 2000-06-02
PL348426A1 (en) 2002-05-20
HUP0104238A2 (en) 2002-08-28
NO20012443D0 (no) 2001-05-18
EP1134220A4 (en) 2001-12-19
CN1333771A (zh) 2002-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7101967B2 (en) Transport vectors
CA2333145C (en) Drug delivery system comprising a homeobox peptide and a non-peptide, non-nucleotide drug
EP2213680B1 (en) Peptides having pharmacological activity for treating disorders associated with altered cell migration, such as cancer
Gunasekera et al. Making ends meet: microwave-accelerated synthesis of cyclic and disulfide rich proteins via in situ thioesterification and native chemical ligation
NO319448B1 (no) PTH-analoger, fremgangsmater for deres fremstilling og farmasoytiske preparater inneholdende disse, samt nukleotidsekvenser, ekspresjonsvektorer og vertsceller.
AU2368899A (en) New peptide compounds that are analogues of the glucagon-like peptide-1 (7-37), a process for their preparation and pharmaceutical compositions containing them
BG103957A (bg) Паратиреоиден хормон
US20180094030A1 (en) Cell penetrating peptides &amp; methods of identifying cell penetrating peptides
AU2020334993B2 (en) Methods of making incretin analogs
EP4108676A1 (en) Human transferrin receptor binding peptide
CA3089279A1 (en) Cell-permeable stapled peptide modules for cellular delivery
CA2757874C (en) Short-chain peptides as parathyroid hormone (pth) receptor agonist
CZ20011700A3 (cs) Benzoxazolové deriváty a léčiva na jejich bázi
WO2016208761A1 (ja) 薬物複合体
JP2018504381A (ja) 細胞透過性ペプチド
Fragiadaki et al. Synthesis and biological activity of oxytocin analogues containing conformationally-restricted residues in position 7
Zamudio Vázquez Synthesis, Biological Evaluation and Insights into the Mode of Action of Quinoxaline Containing Peptides
CZ200132A3 (cs) Podávači systém
Usui et al. Control of Site-Specific Silica Precipitation Using PNA Peptides and DNAs