BRPI0709447A2 - conjugado, composição farmacêutica, uso e composto - Google Patents
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Abstract
<B>CONJUGADO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, USO E COMPOSTO <D>A presente invenção se refere a um novo composto para autilização no fornecimento aprimorado de agentes de drogas terapêuticas em células ou tecidos alvo, a composição compreende o mesmo e seus usos. Ocomposto é, mais especificamente, um conjugado de uma porção peptídica e uma camptotecina, um derivado ou análogo do mesmo que apresenta numerosos benefícios, incluindo a intensificação em termos de solubilidade aquosa, farmacocinética e distribuição do tecido, aumento do índice terapêutico e limitação da variabilidade metabólica interpaciente, bem como o aprimoramento do fornecimento do ingrediente biologicamente ativo para as células e tecidos alvo.
Description
"CONJUGADO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E COMPOSTO"
Campo da Invenção
A presente invenção se refere a um composto novo para a utilização no fornecimento melhorado de agentes de droga terapêuticas em células ou tecidos alvo, a composição compreende o mesmo e seus usos. O composto é, mais especificamente, um conjugado de uma porção peptídica e uma camptotecina, um derivado ou análogo do mesmo que apresenta numerosos benefícios, incluindo a intensificação em termos de solubilidade aquosa, farmacocinética e distribuição do tecido, aumento do índice terapêutico e limitação da variabilidade metabólica interpaciente, bem como o aprimoramento do fornecimento do ingrediente biologicamente ativo para as células ou tecidos alvo.
Antecedentes da Invenção
A camptotecina (CPT) é um alcalóide extraído da árvore Camtpotheca acuminata que foi descoberta nos anos de 1960 (Wall et ai, J. Amer. Chem. Soe. 88: 3888 - 3890 (1966)). Esta molécula insolúvel em água mostrou uma atividade antitumoral muito poderosa, mas sua utilização na clínica foi limitada devido a uma toxicidade muito forte na bexiga urinária e diarréia severa (Gottlieb et aí., Câncer Chemother. Rep. 54: 461 - 470 (1970), Moertel et ai, Câncer Chemother. Rep. 56: 95 - 101(1972)). Os estudos de estrutura-atividade identificaram dois derivados hidrossolúveis antineoplásicos que estão atualmente no mercado: irinotecan (CPT-II, Campto®, Camptosar®) e topotecan (Hycamtin®, um derivado de camptotecina hidrossolúvel). Estas duas moléculas são inibidores específicos da DNA topoisomerase I, que induz a quebra na fita simples do DNA que então bloqueia a replicação do DNA (Hsiang et al, J. Biol. Chem. 260: 14873 - 14878 (1985), Kawato et al, Câncer Res. 51: 4187 - 4191 (1991), Satoh et ai, Biol. Pharm. Buli 17: 662 - 664 (1994)).O irinotecan é uma pró-droga hidrossolúvel do SN38 (7-etil-10-hidróxi-camptotecina), o metabólito ativo que é liberado após a quebra enzimática hepática do irinotecan. O SN38 é um inibidor da topoisomerase I poderoso e é pelo menos 2.000 vezes mais ativo do que o irinotecan como um agente antiproliferativo. Entretanto, o SN38 é altamente insolúvel em água e requer sistemas de fornecimento para permitir sua administração adequada e biodisponibilidade. Assim como muitos derivados de camptotecina, o SN38 contém um anel de Iactona que é altamente importante para a eficácia antitumoral.
Este anel de Iactona é instável em pH fisiológico ou pH básico,resultando na conversão da droga ativa para a forma carboxilato inativa (Chabot, Clin. Pharmacokinetics, 33: 245-259 (1997)).
O irinotecan é amplamente utilizado para o tratamento do câncer de cólon. Entretanto, ele encontra diversas limitações. Após a administração, o irinotecan precisa ser convertido em SN38 para ser ativo. A conversão enzimática hepática do irinotecan na droga ativa SN38 é muito parcial em humanos (Rohtenberg et ai, J. Clin. Oncology 11: 2194 - 2204 (1993), Senter et al., Bioconjugate Chem. 12: 1074 - 1080 (2001)). Apenas de 2 a 8% das doses administradas de irinotecan são clivadas pelas carboxilesterases hepáticas e tumorais (CES) no metabólito ativo SN38 (Senter et al., Bioconjugate Chem. 12: 1074 - 1080 (2001), Xu et al., Clin. Câncer Res. 8: 2605 - 2611 (2002)). As análises da cinética deste catabolismo demonstraram heterogeneidade interpaciente substancial devido aos fatores genéticos e ambientais que influenciam a atividade enzimática em até dez vezes (Charasson et al., Drug Metab. Dispôs. 30: 731 - 733 (2002)). Isto leva a um alto nível de variabilidade interindividual no metabolismo do irinotecan e influencia a tolerância e a eficácia de irinotecan e complica significativamente o cuidado dos pacientes. (Ohe et al., J. Nati Câncer Inst. 84: 972 - 974 (1992),Gupta et al, Câncer Res. 54: 3723 - 3725 (1994), Slatter et ai, Drug Metab. Dispôs. 28: 423 - 433 (2000), Kraut et ai, ASCO abstract N0: 2501, 2004). A SN 38 é ainda convertida (detoxificada) em SN38-glicuronida (SN38-G), um glicurono-conjugado inativo, no fígado pela uridina difosfato glicoronosil transferase 1A1 (UGT1A1). A glicuronidação confere a molécula hidrofílica que permite sua excreção gastrintestinal por meio da bile. Uma vez no intestino, a SN38-G é reconvertida em SN38 por meio da flora bacteriana intestinal (enzima beta-glicuronidase). A irinotecan por si é excretada principalmente na bile (> 26%) e pode ser convertida em SN38 pelo CES intestinal (M. Horikawa, Pharmaceutical Res., 19: 1345 - 1353 (2002)). Esta acumulação local do SN38 no intestino é responsável pelo nível elevado de toxicidade intestinal prolongada (diarréia) observada seguindo o tratamento de irinotecan, que é uma das toxicidades Iimitantes da dose principais do irinotecan (Xie et ai, Clin. Pharmacol. Ther, 72: 265 - 275 (2002), Alimonti et ai, Câncer Treatment Rev. 30: 55 - 562 (2004)). A diarréia prolongada é severa (por exemplo, potencialmente fatal) e algumas vezes aparece junto com a febre. Outra toxicidade significante do irinotecan é a Ieucopenia (por exemplo, a neutropenia). As doenças hematológicas podem resultar em aplasias graves, complicadas algumas vezes pelas infecções sistêmicas. Estes efeitos colaterais graves observados após o tratamento resultam no cuidado hospitalar suplementar para os pacientes (maior permanência no hospital; tratamento antidiarréia; terapia de antibióticos profiláticos) (Kehrer et ai, Clin. Câncer Res. 7 : 1136 - 1141 (2001)). Foi apresentado nos testes clínicos que a escalação/ intensificação da dose do irinotecan fornece uma melhor resposta terapêutica. Esta dose-efeito foi provada em pacientes com cânceres metastáticos colorretais (Ychou et ai, Câncer Chemother. Pharmacol. 50: 383 - 391 (2002), Van Cutsem et ai, Br. J. Câncer. 92: 1055 - 1062 (2005)). Entretanto, os efeitos colaterais severos descritos acima limitam as doses que podem seradministradas a um indivíduo, reduzindo a eficácia potencial do irinotecan.
A exposição repetida dos cânceres humanos aos derivados de camptotecina pode levar ao desenvolvimento da resistência à droga (Nakagawa et ai, Câncer Letters in press (2005)). Esta característica induz 5 uma diminuição da eficácia não apenas após o tratamento com os derivados de camptotecina, mas também com outros agentes anticâncer comumente utilizados.
Portanto, há um interesse substancial no desenvolvimento dos sistemas de fornecimento adequados para superar as limitações dos derivados 10 de camptotecina (por exemplo, SN38), descritos acima.
Foram propostas diferentes estratégias para o fornecimento dos derivados de camptotecina, tais como as formulações Iipossomais do SN38 (descritos no pedido de patente WO 2004/035032 depositado pela Neopharm), as formulações de nanopartícula do SN38 (descritas no pedido de patente WO 15 03/103596 depositado por Imarx), conjugados do ácido camptotecina poliglutâmico (descritos no pedido de patente WO 01/70275 depositado pela Cell Therapeutics) ou derivados poliméricos da camptotecina, tais como os conjugados da camptotecina PEG (descritos nos pedidos de patente WO 03/097356 depositado por Enzon e WO 03/031467 depositado por Debio) ou 20 conjugados poliméricos do 20-0-[glicil-aminoacil-glicil]-camptotecinas (descritos no pedido de patente WO 99/17804 depositado por PHARMACIA & UPJOHN).
O sistema de fornecimento da droga peptídica também foi descrito no pedido de patente WO 00/01417 depositado por Cyclacel, objetivando facilitar o fornecimento de diferentes drogas, tais como a 10-25 hidroxicamptotecina. Este pedido de patente descreve a utilização do peptídeo homeobox derivado da homoproteína de Drosophila antennapedia (de preferência, um peptídeo que penetra na célula (CPP) denominado penetratina) para a conjugação em uma série de drogas citotóxicas, aumentando, portanto,seu fornecimento e/ou efeito terapêutico. Entretanto, este pedido de patente não mostra quaisquer experimentos in vitro e in vivo realizados com os conjugados. Consequentemente, o depositante realizou estudos de estabilidade do soro humano in vitro utilizando o conjugado descrito no exemplo 29 deste pedido de patente WO 00/014117. Estes estudos mostraram que o tempo de meia vida (estabilidade) deste conjugado é inferior a três minutos, que não parece suficiente para o fornecimento intracelular das quantidades terapeuticamente eficazes do derivado de camptotecina in vivo.
O pedido de patente WO 01/64738 depositado por Diatos se refere às seqüências de aminoácidos que reagem com aminoglicanos e transferem uma ampla gama de substâncias ativas (isto é, ácidos nucleicos, proteínas, drogas, antígenos ou anticorpos) do meio externo para dentro das células e, mais especificamente, para o núcleo da célula. Tais seqüências derivam das proteínas humanas e, portanto, são peptídeos que penetram na célula não imunogênicos (CPP) quando administrados em um humano que precisa de tratamentos terapêuticos.
Consequentemente, h á uma necessidade na eficiência de um melhor fornecimento, segurança e eficácia do composto ativo (por exemplo, SN38).
Dentro do sistema de referência da pesquisa que levou a estapresente invenção, o Depositante sintetizou diferentes conjugados derivados de camptotecina CPP. Estes conjugados foram então avaliados in vitro e in vivo quanto a sua estabilidade, eficácia e toxicidade.
Em particular, um objeto da presente invenção é fornecer um composto que suavize ou diminua as desvantagens e os efeitos colaterais indesejados descritos acima para os derivados de camptotecina, tais como para o irinotecan. Em particular, a presente invenção objetiva fornecer um composto que é capaz de melhorar a solubilidade do agente biologicamenteativo nas formas farmaceuticamente aceitáveis, que possua estabilidade suficiente para permitir um fornecimento intracelular eficaz, que reduza os efeitos colaterais tóxicos e não desejados, que melhore o início da ação do efeito terapêutico desejado, que forneça vias alternativas para a administração da droga, que reduza a variabilidade interpaciente e/ou modifique a distribuição do tecido e o metabolismo da droga.
Descrição Resumida da Invenção
De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um conjugado que compreende uma porção da droga ligada a uma porção portadora, em que dita porção portadora compreende um peptídeo ou seu análogo facilitando a penetração em uma célula ou tecido de uma carga útil (por exemplo, uma porção da droga) e possuindo a capacidade de aumentar a solubilidade, modificar a farmacocinética, o metabolismo e as propriedades de distribuição da droga no tecido, e/ou diminuir a incidência de resistência à droga, e a porção da droga é qualquer camptotecina, análogo ou seus derivados. Dito peptídeo ou seu análogo também é denominado no presente de Peptídeo que Penetra na Célula (CPP).
A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende tal conjugado e seus usos terapêuticos, em particular, para o tratamento de diversos tipos de doenças, incluindo os cânceres.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 mostra o AUC do sangue do SN38 seguindo a infusão do DPV1047-MIC-SN38 (10, 20, 50 mg/kg, barras pretas), DPV1047-BCH-25 SN38 (5, 10 (n=2), 20 mg/kg, barras cinzas) e do irinotecan (em 30 mg/kg, barra branca) no cachorro. A Figura 2 mostra o AUC do sangue do DPV1047-MIC-SN38, DPV1047-BCH-SN38 e SN38 seguindo a infusão do DPV1047-MIC-SN38 (50 mg/kg) e DPV1047-BCH-SN38 (10 mg/kg). A : DPV1047-MIC-SN38; T : SN38 de DPV1047-MIC-SN38; : DPV1047-BCH- SN38; ·: SN38 do DPV1047-BCH-SN38. Os AUC foram medidos a partir do final da infusão até o limite de quantificação (7,8 ng/mL eq SN38); para DPV1047-MIC-SN38 e DPV1047- BCH-SN38 em suas respectivas doses AUC = AUC 0-4, 42h.
Descrição Detalhada da Invenção
De acordo com uma realização particular, a presente invenção fornece um conjugado que compreende pelo menos uma camptotecina, seus análogos ou derivados e, de maior preferência, o composto SN38, ligado a uma porção portadora, de preferência, por meio de um grupo ligante.
A porção portadora compreende um peptídeo ou seus análogosfacilitando a penetração em uma célula ou tecido de uma carga útil (por exemplo, uma porção da droga), e possuindo a capacidade de aumentar a solubilidade da porção da droga, modificar a farmacocinética, o metabolismo e as propriedades de distribuição do tecido da porção da droga, reduzir a variabilidade interpaciente e/ou diminuir a incidência da resistência à droga.
Os conjugados da presente invenção incluem seus sais, isômeros ópticos e geométricos ou suas misturas.
Os sais dos conjugados são, em particular, sais de adição básicos ou ácidos, de preferência, compatíveis com a utilização farmacêutica. Entre os ácidos inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis, os exemplos não Iimitantes incluem o clorídrico, bromídrico, sulfúrico, fosfórico e nítrico. Entre os ácidos orgânicos farmaceuticamente aceitáveis, os exemplos não Iimitantes incluem o ácido acético, trifluoroacético, láctico, pirúvico, malônico, succínico, glutárico, fumárico, tartárico, maleico, cítrico, benzoico, ascórbico, metano sulfônico, etano sulfônico, 2-hidroxietanessulfônico e camfórico. Entre as bases farmaceuticamente aceitáveis, os exemplos não Iimitantes incluem o hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, trietilamina e ferc-butilamina. De preferência, o conjugado da presente invenção está na forma de um sal clorídrico.Vantajosamente, a conjugação da porção portadora da droga (isto é, o derivado da camptotecina) leva a uma modificação do comportamento farmacocinético da droga, comparado à droga não conjugada.
Vantajosamente, a porção portadora compreende positivamente as porções carregadas (isto é, aminoácidos básicos) induzindo um pH baixo em uma solução aquosa (por exemplo, < 6,5 do valor de pH) do conjugado. Este pH ácido favorece a estabilização do grupo Iactona no derivado de camptotecina na composição farmacêutica (forma Iactona > 95%) e, portanto, permite um equilíbrio plasmático entre as formas da Iactona e carboxilato em favor da forma Iactona (> cerca de 55% da forma lactona) após a injeção em um animal vivo ou indivíduo humano (Kaneda et ai, Biol. Pharm. Buli. 20: 992 -996 (1997)).
Outra vantagem da presente invenção é que a distribuição do tecido e, portanto, o metabolismo in vivo da droga também é alterado (isto é, modificado) por sua conjugação à porção portadora. A modificação do metabolismo inclui a clivagem do conjugado da presente invenção por estearases plasmáticas, bem como tissulares, quando comparado às carboxiestearases hepáticas para a ativação do irinotecan. Juntos, a distribuição tissular modificada (isto é, uma diminuição na ingestão hepática) e o sistema de fornecimento da presente invenção, evitando a necessidade da ativação hepática do conjugado da presente invenção, levam a uma diminuição na variabilidade interindividual do tratamento e uma diminuição na toxicidade intestinal (comparado ao irinotecan), com um fornecimento adicional superior a 60% do metabólito ativo (isto é, a droga em sua forma terapêutica ativa), por exemplo, SN38.
Vantajosamente, o conjugado da presente invenção apresenta estabilidade suficiente para permitir o fornecimento de uma quantidade terapeuticamente aceitável da camptotecina circulante e celular, seus análogosou derivados. De preferência, o conjugado da presente invenção compreende pelo menos uma camptotecina, seu análogo ou derivado, ligada a uma porção portadora, por meio de um grupo ligante, em que a porção portadora é um peptídeo que penetra na célula e em que o tempo de meia vida do conjugado no plasma humano a 37° C in vitro (isto é, tempo para possuir 50% em mol da camptotecina livre, seus análogos ou derivados liberados pelos conjugados da presente invenção) é igual ou superior a 5 minutos.
Os termos "conjuga" ou "conjugado" se referem a uma interação covalente, iônica ou hidrofóbica em que as porções de uma molécula são mantidas juntas e preservadas na proximidade.
O termo "reagido" possui o significado comum para um técnico no assunto da química.
Os termos "ligante" ou "reticulante" são utilizados intercambiavelmente maior preferência e se referem a uma cadeia conjugando/ ligando duas porções juntas e compreendendo um ou mais átomos.
O termo "in vitro" possui sua técnica reconhecida significando, por exemplo, cultura celular, envolvendo os reagentes purificados ou extratos, por exemplo, extratos células. O termo "in vivo" também possui sua técnica reconhecida significando, por exemplo, envolvendo células vivas em um organismo e/ou quaisquer células em um organismo.
O termo "farmacocinética" significa o processo em que uma droga é absorvida, distribuída, metabolizada e eliminada do corpo. O comportamento farmacocinético é, em geral, avaliado a partir da evolução da concentração do sangue, plasma ou soro de uma droga e seus metabólitos como uma função do tempo. O tempo de observação pode estar compreendido entre cerca de 5 minutos e cerca de 24 horas ou mais. O termo "farmacocinética do plasma" se refere à evolução da concentração do sangue, plasma ou soro de uma droga e seus metabólitos ao longo do tempo. O termo "distribuição tissular" é definidacomo a exposição relativa ou absoluta de diferentes tecidos, denominados fígado, pulmão, estômago, intestino, pâncreas, cérebro, bexiga urinária, ovário, testículo, próstata, útero, pele, músculo, baço, linfonodos, tumores ou qualquer outro órgão relevante a uma droga ou seus metabólitos em um tempo definido.
A distribuição tissular é determinada a partir da evolução da droga ou concentração do metabólito nos tecidos como uma função do tempo.
O termo "peptídeo(s)" se refere a um polímero de aminoácidos em que a convenção escrita é N ou amino, a terminação está na esquerda e o C ou carboxil, a terminação está na direita. Os 20 aminoácidos L naturais mais comuns são alternativamente designados por um código de três letras ou de uma letra. Considera-se que os peptídeos, conforme utilizados no presente, incluem "análogos de peptídeos", modificações estruturais contendo uma ou mais modificações nas cadeias laterais de L aminoácido ou na cadeia principal de alfa-aminoácido. Um exemplo de um análogo de peptídeo de cadeia principal modificada é o "peptóide" N-metil glicina (Zuckermann et ai, J. Amer. Chem. Soe. 114: 10646-47 (1992)).
O termo "peptídeo(s) que penetra(m) na célula" (CPP(s)) é definido como um peptídeo portadora que é capaz de cruzar a membrana biológica ou uma barreira fisiológica. Os peptídeos que penetram na célula também são denominados peptídeos permeáveis na célula, domínios de transdução da proteína (PTD) ou seqüências de translocação da membrana (MTS). Os CPPs possuem a capacidade de translocar in vitro e/ou in vivo as membranas de célula de mamíferos e entrar nas células e/ou no núcleo das células e direcionar um composto conjugado de interesse, tal como uma droga ou marcador, para um destino celular desejado. Consequentemente, o CPP pode direcionar ou facilitar a penetração de um composto de interesse através de uma membrana fosfolipídica, mitocondrial, endossomal ou nuclear. O CPP também pode direcionar um composto de interesse de fora da célula através damembrana do plasma, e no citoplasma ou citosol ou em um local desejado dentro da célula, por exemplo, o núcleo, a mitocôndria, o retículo endoplasmático, um lisossomo ou um peroxissomo. Alternativamente, ou em adição, o CPP pode direcionar um composto de interesse através das barreiras do sangue cerebral ou hematoretinal, da trans-mucosa, da pele, gastrintestinal e/ou pulmonar. Diversas proteínas e seus derivados de peptídeos foram encontrados como possuindo propriedades de internalização celular incluindo, mas não limitado a, Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) proteína Tat (Ruben et al., J. Virol. 63, 1 - 8 (1989)), a proteína do tegumento do vírus da herpes VP22 (Elliott and O1Hare, Cell 88, 223 - 233 (1997)), Penetratin (Derossi et ai, J. Biol. Chem. 271, 18188 - 18193 (1996)), protegrin 1 (PG-1) peptídeo antimicrobiano SynB (Kokryakov et ai, FEBS Lett. 327, 231 - 236 (1993)) e o fator de crescimento do fibroblasto básico (Jans, Faseb J., 8, 841 -847 (1994)). Estes peptídeos portadores mostram pouca homologia na seqüência entre si, mas são todos altamente catiônicos e ricos em arginina ou lisina. De fato, os peptídeos de poli-arginina sintéticos mostraram ser internalizados com alto nível de eficiência (Futaki et ai, J. Mol. Recognit. 16, 260 - 264 (2003); Suzuki et ai, J. Bioi Chem. (2001)).
Consequentemente, em uma realização particular, o conjugado da presente invenção apresenta um CPP selecionado a partir do Vírus da Imunodeficiência Humana tipo 1 (HIV-1) proteína Tat, a proteína do tegumento do vírus da herpes VP22, penetratin, peptídeo antimicrobiano SynB protegrin 1 (PG-1), o fator de crescimento do fibroblasto básico, peptídeos de poli-arginina sintéticos ou seus peptídeos derivados possuindo as propriedades de internalização celular.
De acordo com um aspecto particular da presente invenção, o CPP compreende uma seqüência de aminoácidos possuindo a seguinte fórmula (I):C(X1 )p[(X)o(B)n(X)sBX(X)rXB]m(X2)qC (I)
em que:
- X1 e X2 são, independentemente, seqüências de aminoácidos de 1 a 20 aminoácidos, ρ e que são, independentemente, números inteiros entre 0 e 5, de preferência, 0 ou 1;
- B é, independentemente, um aminoácido básico;
- X é, independentemente, um aminoácido não básico;
-C ê, independentemente, nada ou qualquer porção quecompreende uma ligação tioéter ligada ao restante do conjugado, de preferência, a porção é uma cisteína ou uma cisteamina;
- m é 1 ou 2;
- η é 1, 2 ou 3;
- o é O ou 1;
- r é O ou 1;
- s é O, 1, 2 ou 3.
Em uma realização preferida, o CPP é derivado de proteínas humanas, evitando deste modo a imunogenicidade quando administrada em humanos. De acordo com dita realização particular, o CPP é um peptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos representada pela fórmula (I) conforme definido acima.
Em uma realização de maior preferência, os CPPs da presente invenção também são capazes de solubilizar as moléculas altamente lipofílicas e/ou de modificar sua farmacocinética e distribuição tissular comparado a dita molécula não conjugada a um CPP da presente invenção.
Em uma realização particular, a porção veículo de acordo com a presente invenção compreende um CPP capaz de reagir in vitro e/ou in vivo com as glicosaminoglicanas da superfície celular. Tais CPPs foram descritas nos pedidos de patente WO 01/64738 e WO 05/016960 depositada por Diatose no De Coupade et ai, (Biochem J. 390: 407 - 18 (2005)). Estes peptídeos são seqüências de aminoácidos que se originam das proteínas de ligação à heparina humana e/ou aos anticorpos anti-DNA selecionados a partir do grupo que compreende: as lipoproteínas, tais como a apolipoproteína humana B ou E (Cardin et al., Biochem. Biosphys. Res. Com. 154: 741 (1988)), a agrina (Campanelli et al., Development 122: 1663 - 1672 (1996)), a proteína de ligação ao fator de crescimento da insulina (Fowlkes et al., Endocrinol. 138: 2280 - 2285 (1997)), o fator de crescimento derivado de plaqueta humana (Maher et al., Mol CeH Biol. 9: 2251 - 2253 (1989)), o superóxido dismutase extracelular humano (EC-SOD) (Inoue et al., FEBS 269: 89 - 92 (1990)), o fator de crescimento do tipo fator de crescimento epidérmico Iigante de heparina humana (HB-EGF) (Arkonac et al., J. Biol. Chem. 273: 4400-4405 (1998)), o fato de crescimento do fibroblasto ácido (aFGF) (Fromm et al., Arch. Biochem. Bioph. 343: 92 (1997)), o fator de crescimento do fibroblasto básico (bFGF) (Yayon et al., Cell 64: 841 - 848 (1991)), a seqüência de mucina intestinal humana 2 (Xu et al., Glyconjug J. 13: 81 - 90 (1996)), o interferon gama humano (Lortat- Jacob & Grimaud, FEBS 280: 152-154 (1991)), a subunidade p40 da interleucina humana 12 (Hasan et al., J. Immunol. 162: 1064 - 1070 (1999)), o fator 1-alfa derivado de células estromais (Amara et al., J. Biol. Chem. 272: 200 - 204 (1999)), neutrófilo humano derivado da "proteína de ligação da heparina" (CAP 37/ azurocidina) (Pohl et al., FEBS 272: 200 - 204 (1990)), uma molécula de imunoglobulina, tal como as regiões CDR2 e/ou CDR3 do anticorpo murino monoclonal anti-DNA F4.1 (Avrameas et al., Proc. Nati Acad. Sei. 95: 5601 (1998)), a região hipervariável CDR3 do anticorpo monoclonal anti-DNA humano R.TT79 (Stevenson et ai, J. Autoimmunity 6: 809 (1993)), as regiões CDR2 e/ou CDR3 do anticorpo monoclonal humano anti-DNA NE-I (Hirabayashi et ai, Scand. J. Immunol. 37: 533 (1993)), a região hipervariável CDR3 do anticorpo monoclonal anti-DNA humano RT72 (Kalsi eta/., Lupus 4: 375 (1995)).
A capacidade dos CPPs de reagirem com/ ligarem às glicosaminoglicanas (GAGs) pode ser determinada por ensaios de ligação à glicosaminoglicana diretos ou indiretos conhecidos no estado da técnica, tal como a afinidade da coeletroforese (ACE) para as ligações peptídeo glicosaminoglicanas descritas no pedido de patente WO 00/45831. Diversos outros métodos bem conhecidos no estado da técnica estão disponíveis para a analise das interações de peptídeos GAG1 por exemplo, o método descrito no pedido de patente WO 01/64738 ou por Weisgraber e Rail (J. Bioi Chem., 262(33):11097 - 103) (exemplo específico com a apolipoproteína B-100); ou por um teste ELISA modificado: 96 microplacas são revestidas com GAG específico (sulfato de condroitina A, B e C, heparina, sulfato de heparina, ácido hialurônico, sulfato de queratina, sindecan), o peptídeo conjugado a um marcador é então adicionado por um tempo definido; após lavagens extensivas, o peptídeo Iigante é determinado utilizando as análises específicas especificadas relacionadas ao marcador.
O CPP pode ser de qualquer comprimento. Por exemplo, o CPP é inferior ou igual a 500, 250, 150, 100, 50, 25, 10, 6 ou 4 aminoácidos em comprimento. Por exemplo, o CPP é superior ou igual a 4, 6, 10, 25, 50, 1.00, 150, 250 ou 500 aminoácidos em comprimento. O comprimento e a estrutura apropriados do CPP será facilmente determinado pelos técnicos no assunto. Como referências gerais dos CPPs, podem ser citadas: Cell Penetrating Peptides: Processes and Applications, editado por Ulo Langel (2002); ou Advanced Drug Delivery Reviews 57: 489 - 660 (2005).
Nas realizações preferidas, o CPP é de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos em comprimento.
Em uma realização preferida, o CPP compreende a seqüência deaminoácidos de fórmula (I) ou menos de 50 aminoácidos em comprimento, de preferência, menos de 25. Em geral, a seqüência de aminoácidos de fórmula (I) possui mais de 8 aminoácidos, de preferência, mais de 10.
De acordo com as realizações particulares, a porção portadora é um peptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos de fórmula (I) em que C está ausente ou está em qualquer posição da seqüência de aminoácidos ou, de maior preferência, está na posição terminal C ou N de dita seqüência de aminoácido. Uma porção que compreende um grupo tiol pode ser adicionada em qualquer posição da seqüência de aminoácidos ou na fórmula (I) para conjugar o peptídeo na camptotecina, seus derivados ou análogos, por meio de uma ligação tioéter. De maior preferência, a porção que compreende um grupo tiol está na posição terminal C ou N de dita seqüência de aminoácido (isto é, a porção está presente apenas em uma das posições terminais C ou N, e a outra posição C ou N de fórmula (I) está ausente). Especificamente, a porção é uma cisteína ou cisteamina.
De preferência, X1 e X2 são, independentemente, seqüências amino de 2 a 15 aminoácidos, de maior preferência, de 2 a 10 aminoácidos. Eles podem compreender aminoácidos básicos ou não básicos. Particularmente, X1 e X2 são desprovidos de aminoácido cisteína.
O termo "aminoácido básico" significa qualquer aminoácidoscarregado positivamente em pH 7, em particular, qualquer aminoácido que possui porções guanidila, amidinila ou amino. Os termos "guanidila" e "guanidina" são utilizados intercambiavelmente para se referir a uma porção que possui a fórmula - HN=C(Nhh)NH (forma não protonada). Como exemplo, a arginina contém uma porção guanidila (guanidino) e também é referida como ácido 2-amino-5-guanidinovalérico ou ácido a-amino-6-guanidinovalérico. Os termos "amidinila" e "amidino" são utilizados intercambiavelmente e se referem a uma porção que possui a fórmula -C(=NH)(NH2). Os aminoácidos altamentepreferidos são a histidina (H)1 arginina (R) e/ou Iisina (K) e, de maior preferência, KeR.
O termo "aminoácido não básico" significa qualquer resíduo de aminoácido não carregado positivamente em pH 7 ou abaixo. Isto inclui consequentemente qualquer aminoácido não polar (isto é, ácido amino hidrofóbico), aminoácido polar não carregado e aminoácido negativamente carregado em pH 7.
Conforme utilizados no presente, os aminoácidos não polares são A, I, L, M, F, P, W e V. Os aminoácidos não carregados polares são N, C, Q, G, S, T e Y. Os aminoácidos carregados positivamente são DeE.
De acordo com uma realização preferida, os aminoácidos não básicos compreendidos na porção BX(X)rXB da fórmula (I) são selecionados a partir do ácido glutâmico (E), glicina (G), glutamina (Q)1 serina (S), treonina (T), Ieucina (L), valina (V), prolina (P) e citrulina.
As seqüências preferidas de aminoácidos, de acordo com apresente invenção são aqueles em que:
- o é 1, e/ou
- ρ e/ou q é 1, e/ou
- X1 é a seqüência de 3 a 12 aminoácidos, e/ou
- X2 é a seqüência de 2 a 10 aminoácidos, e/ou
- r é 0 e/ou
- m é 1.
Consequentemente, os CPPs derivados das proteínas de ligação à heparina humana e capazes de penetrar especificamente em uma célula são selecionadas a partir do grupo que consiste em:
- DPV3 (SEQ ID N0: 1): CPP reagindo com a heparina e o dímero de um peptídeo derivado da parte C terminal da seqüência do superóxido dismutase extracelular humano (EC-SOD) (Inoue et al., FEBS 269: 89 - 92(1990)).
- DPV6 (SEQ ID N0: 2): CPP reagindo com a heparina e derivado da seqüência de aminoácido a parte C terminal da cadeia A do fator de crescimento derivado de plaqueta humana (Maher etal., Moi Celi Biol. 9: 2251-2253(1989)).
- DPV7 (SEQ ID N0: 3) e DPV7b (SEQ ID NO: 4): CPP reagindo com a heparina e derivado da parte C terminal da seqüência do fator de crescimento do tipo fator de crescimento epidérmico de ligação à heparina humana (HB-EGF) (Arkonac et ai, J. Biol. Chem. 273: 4400 - 4405 (1998)).
- DPV10 (SEQ ID N0: 5): CPP reagindo com a heparina ecorrespondendo à parte C terminal da seqüência de mucina intestinal humana 2 (Xu et ai, Glyconjug J. 13: 81 - 90 (1996)).
- DPV3/10 (SEQ ID N0: 6): CPP reagindo com a heparina e derivado da parte C terminal da seqüência de superóxido dismutaseextracelular humano (EC-SOD) (vide acima) e da parte C-terminal da seqüência de mucina intestinal humana 2 (vide acima).
- DPV 10/6 (SEQ ID N0: 7): CPP reagindo com a heparina e derivado da parte C terminal da seqüência de mucina intestinal humana 2 (vide acima) e da parte C terminal da cadeia A do fator de crescimento derivado de plaqueta (vide acima).
- DPV1047 (SEQ ID N0: 8) e DPV1048 (SEQ ID N0: 9): CPP reagindo com a heparina, derivada da seqüência de aminoácidos (3358-3372) da lipoproteína humana B (Cardin et al., Biochem. Biosphys. Res. Com. 154: 741 (1988)) e da seqüência de peptídeo correspondente à área hipervariávelCDR3 do anticorpo monoclonal anti-DNA humano NE-I (Hirabayashi et ai, Scand. J. Immunol. 37: 533 (1993)).
- DPV15 (SEQ ID N0: 10) e DPV15b (SEQ ID N0: 11): CPPs reagindo com heparina e contendo parte da sequenciar de "proteína de ligaçãoà heparina" CAP 37.
De acordo com a presente invenção, o peptídeo que penetra na célula é mais especificamente selecionado a partir de um peptídeo identificado na Tabela 1a abaixo.
Tabela 1a
<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table>Conforme mencionado anteriormente, cada um dos peptídeos identificados na Tabela 1a apresenta vantajosamente uma cisteína na posição C ou N da seqüência de aminoácido.
Os peptídeos que penetram na célula de acordo com a presente invenção podem ser, mas não estão limitados a, aqueles descritos acima ou seus análogos. Um "análogo" que é pelo menos cerca de 50%, de preferência, pelo menos cerca de 70%, de maior preferência, pelo menos cerca de 80% a 85%, de preferência, pelo menos cerca de 90% e, de maior preferência, pelo menos cerca de 95% a 99% idêntico ao mesmo. Por exemplo, os peptídeos podem possuir substituições em 1, 2, 3, 4 ou mais resíduos. O CPP pode ser utilizado em sua forma monomérica (tal conforme descrito acima) ou na forma polimérica (dímero, trímero, etc).
Caso necessário, diversas estratégias químicas podem ser utilizadas pelo técnico no assunto para transformar um CPP em um candidato à droga com maior estabilidade in vivo e/ou atividade biológica; tal como:
- modificações terminais NeC para evitar a degradação da exopeptidase: amidação C-terminal ou acetilação N-terminal;
- ciclização pela formação de uma ponte de dissulfeto;
- alquilação do nitrogênio amida para evitar a degradação da endopeptidase;
- introdução de aminoácidos não naturais para modificar o sítio de reconhecimento da endopeptidase (2-metilalanina, glicina alfa-dialquilada, oligocarbamato, oligouréia, cadeias principais de guanidina ou amidina);
- incorporação de aminoácidos não geneticamente codificados (metilação, halogenação ou cloração da glicina ou fenilalanina) na seqüência de aminoácidos CPP;
- substituição de alguns ou até todos os L-aminoácidos com seus D-aminoácidos correspondentes ou análogos de beta-aminoácidos. Taispeptídeos podem ser sintetizados nas formas "inverso" ou "retro-inverso", isto é, pela substituição dos L-aminoácidos da seqüência com D-aminoácidos ou pela inversão da seqüência de aminoácidos e a substituição dos L-aminoácidos com os D-aminoácidos. Estruturalmente, o peptídeo retro-inverso é muito mais similar ao peptídeo original do que o D-análogo simples. Os D-peptídeos são substancialmente mais resistentes às peptidases e, portanto, são mais estáveis no soro e tecidos comparado às suas contrapartes de L-peptídeo. Em uma realização preferida, os CPPs contendo L-aminoácidos são protegidos com um D-aminoácido simples para inibir a destruição da exopeptidase;
- síntese de oligocarbamato derivado de CPP; a cadeia principalde oligocarbamato consiste em uma cadeia principal de etileno quiral ligada através de ligações carbamato relativamente rígidas (Cho et al., Science 261: 1303-1305 (1993)).
O conjugado de acordo com a presente invenção ainda compreende uma captotecina, seus análogos ou derivados.
Conforme utilizado no presente, a "camptotecina, seus análogosou derivados", se refere a qualquer composto biologicamente ativo que possui a propriedade de ligar in vitro e/ou, em particular, in vivo à enzima DNA topoisomerase I e contém a cadeia principal de camptotecina conforme representado pela seguinte fórmula (II):
<formula>formula see original document page 22</formula>
grupo -COO- é de baixo para cima seguindo o modo como a fórmula (II) é escrita) ou um grupo alquila bivalente substituído ou não substituído.Particularmente, a camptotecina, seus análogos ou derivados contém a cadeia principal de camptotecina de fórmula (II) em que qualquer um dos grupos de hidrocarboneto representados no presente pode ser substituído, de preferência, um, dois, três ou quatro grupos de hidrocarboneto são substituídos.
Os substituintes de fórmula (II) podem variar no decorrer de um grande intervalo na medida em que a camptotecina, seus análogos ou derivados apresentam a propriedade de ligar in vitro e/ou, em particular, in vivo à enzima topoisomerase I.
Os substituintes são independentemente os mesmos oudiferentes e são, de preferência, o grupo alquila, grupo arila, halogênio, -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR1R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"\ -NRhC(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(0)2NR'R", -NRSO2R', - CN e - NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcóxi (C1-C4), fluoroalquila (Ci-C4) ou dois grupos adjacentes podem formar juntos com o átomo de carbono que os carrega, um grupo de fórmula -O(CH2)uO-, em que u representa o número inteiro 1 ou 2; e onde R', R", R'" e R"" são, de preferência, selecionados independentemente do hidrogênio, alquila (C1-C8), heteroalquila (C1-C8), arila e heteroarila, alquila (arila não substituída)-(C-i-C4) e alquila (arila não substituída)óxi (C1-C4). Quando um análogo da camptotecina da presente invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é selecionado independentemente como cada um dos grupos R', R", R'" e R"" quando mais de um destes grupos está presente. Ditos substituintes também podem ser substituídos. Por exemplo, qualquer grupo pode ser substituído por pelo menos um grupo alquila, grupo arila, halogênio, -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -SiR'R"R"', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(0)2NR'R", -NRSO2R', - CN e - NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcóxi (C1-C4)1 fluoroalquila (C1-C4).
Em particular, os substituintes são selecionados a partir do grupo que consiste em um grupo alquila, de preferência, um grupo alquila inferior; -OR', em que R' é H; -OC(O)R', em que R' é um grupo alquila incluindo os grupos heteroalquila e, de maior preferência, os grupos heterocicloalquila, tal como a piperidina ou o grupo piperazina; um grupo alquila substituído por -NR'R" ou grupos heteroalquila e, de maior preferência, grupos heterocicloalquila, tal como o grupo piperidina ou piperazina; dois grupos adjacentes podem formar juntos com os átomos de carbono que os carrega um grupo de fórmula -O(CH2)uO-, em que u representa o número inteiro 1 ou 2, de preferência, 2.
O termo "alquila" por si ou como parte de outro substituinte, significa, salvo indicações em contrário, uma cadeia linear ou ramificada, ou radical hidrocarboneto cíclico, opcionalmente interrompido por pelo menos um heteroátomo incluindo o O, N, Si e S (conforme definido abaixo), ou suas combinações, que podem ser completamente saturado, mono ou poliinsaturado e pode incluir radicais di e multivalentes, possuindo o número de átomos de carbono designado (isto é, significa de um a dez carbonos). Os exemplos de radicais hidrocarboneto saturados incluem, mas não estão limitados a, grupos tais como a metila, etila, n-propila, isopropil, n-butila, í-butila, isobutila, sec-butila, ciclohexila, (ciclohexila) metila, ciclopropilmetila, homólogos e isômeros de, por exemplo, n-pentila, n-hexila, n-heptila, n-octila e similares. Um grupo alquila insaturado é um possuindo uma ou mais ligações duplas (por exemplo, grupos alquenila) ou ligações triplas (por exemplo, grupos alquinila). Os exemplos de grupos alquila insaturados incluem, mas não estão limitados a, vinila, 2-propenila, crotila, 2-isopentenila, 2-(butadienila), 2,4-pentadienila, 3 (1,4-pentadienila), etinila,1- e 3-propinila, 3-butinila e os homólogos superiorese isômeros. O termo "alquila", salvo indicações em contrário, também pretende incluir aqueles derivados de alquila definidos com mais detalhes abaixo, tal como "heteroalquila". Os grupos alquila, que são limitados aos grupos hidrocarboneto são denominados "homoalquila".
O termo "homoalquila" por si ou como parte de outro substituinteinclui o radical mono ou bivalente derivado de um alcano. Entre o radical bivalente, pode-se citar, mas não limitados a, -CH2-, - CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-.
Tipicamente, o grupo alquila irá possuir de 1 a 24 átomos de 10 carbono, cujos grupos que possuem ou menos átomos de carbono sendo preferidos na presente invenção. Uma "alquila inferior" é um grupo alquila de cadeia curta, em geral, possuindo oito ou menos átomos de carbono.
O termo "heteroalquila" por si ou em combinação com outro termo, significa, salvo indicações em contrário, uma cadeia linear ou ramificada estável, ou radical hidrocarboneto cíclico ou suas combinações, que consistem em um número definido de átomos de carbono e pelo menos um heteroátomo selecionado a partir do grupo que consiste em O, N, Si e S, e em que os átomos de nitrogênio, carbono e enxofre podem ser, opcionalmente, oxidados e o heteroátomo de nitrogênio pode ser, opcionalmente, quaternizado. O(s) heteroátomo(s) O, N e S e Si podem ser colocados em qualquer posição interna do grupo heteroalquila ou na posição em que o grupo alquila está ligado ao restante da molécula. Os exemplos incluem, mas não estão limitados a, -CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3 e CH=CH-N(CH3)-CH3. Um grupo de silício se refere a um Si colocado em qualquer posição interna do grupo heteroalquila ou na posição em que o grupo alquila está ligado ao restante da molécula. Até dois heteroátomos podem ser consecutivos, tais como, por exemplo, -CH2-NH-OCH3 e -CH2-O-S-(CH3)3.De modo similar, o termo "heteroalquila" por si ou como parte de outro substituinte inclui os radicais bivalentes derivados da heteroalquila, conforme exemplificado, mas não limitado por, -CH2-CH2-S-CH2-CH2- e -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Os termos "heteroalquila" podem englobar o poli(etileno glicol) e seus derivados. Ainda, para a alquila bivalente e os grupos heteroalquila, nenhuma orientação do grupo de ligação está implícita pela direção em que a fórmula do grupo é escrita. Por exemplo, a fórmula -C(O)2R'-representa ambos -C(O)2R'- e -RO(O)2-. O termo "inferior" em combinação com os termos "heteroalquila" se refere a uma porção que possui de 1 a 8 átomos de carbono.
Os termos "alcóxi", "alquilamino" e "alquiltio" (ou tioalcóxi) são utilizados em seu sentido convencional e se referem àqueles grupos alquila ligados ao restante da molécula por meio de um átomo de oxigênio, um grupo amino ou um átomo de enxofre, respectivamente.
Em geral, um "substituinte acila" também é selecionado a partir dogrupo apresentado acima. Conforme utilizado no presente, o termo "substituinte acila" se refere aos grupos ligados e que preenchem a valência de um carbono da carbonila que está ligado diretamente ou indiretamente aos compostos da presente invenção.
Os termos "cicloalquila" e "heterocicloalquila", por si próprios ouem combinação com outros termos representa, salvo indicações em contrário, as versões da "alquila" substituída ou não substituída (de maior preferência, cicloalquila C1-C10) e "heteroalquila" substituída ou não substituída (de maior preferência, a heterocicloalquila Ci-Ci0), respectivamente. Adicionalmente, para a heterocicloalquila, um heteroátomo pode ocupar a posição em que o heterociclo está ligado ao restante da molécula. Os exemplos de cicloalquila incluem, mas não estão limitados a, ciclopentila, ciclohexila, 1-ciclohexenila, 3-ciclohexenila, cicloheptila e similares. Os exemplos de heterocicloalquilaincluem, mas não estão limitados a, ciclopentila, ciclohexila, 1-ciclohexenila, 3-ciclohexenila, cicloheptila e similares. Os exemplos de heterocicloalquila incluem, mas não estão limitados a, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridila), 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-morfolinila, 3-morfolinila, tetrahidrofuran-2-ila, tetrahidrofuran-3-ila, tetrahidrotien-2-ila, tetrahidrotien-3-ila, 1-piperazinila, 2-piperazinila e similares. Os heteroátomos e os átomos de carbono das estruturas cíclicas são opcionalmente oxidados.
Os termos "halo" ou "halogênio" por si ou como parte de outro substituinte significa, salvo indicações em contrário, um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo. Adicionalmente, os termos tais como "haloalquila" pretendem incluir a monohaloalquila e a polihaloalquila. Por exemplo, o termo "haloalquila (CrC4)" pretende incluir, mas não está limitado a, trifluorometila, 2,2,2-trifluoroetila, 4-clorobutila, 3-bromopropila e similares.
O termo "arila" significa, salvo indicações em contrário, um substituinte de hidrocarboneto, aromático, poliinsaturado, substituído ou não substituído que pode ser um anel simples ou anéis múltiplos (de preferência, de 1 a 3 anéis) que são fundidos juntos ou ligados covalentemente. O termo "heteroarila" se refere aos grupos arila (ou anéis) que contém de um a quatro heteroátomos selecionados a partir de N, O e S, em que os átomos de nitrogênio, carbono e enxofre são opcionalmente oxidados e o(s) átomo(s) de nitrogênio são opcionalmente quatemizados. Um grupo heteroarila pode estar ligado ao restante da molécula através de um heteroátomo. Os exemplos não Iimitantes de grupos arila e heteroarila incluem fenila, 1-naftila, 2-naftila, 4-bifenila, 1-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 3-pirazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila, pirazinila, 2-oxazolila, 4-oxazolila, 2-fenil-4-oxazolila, 5-oxazolila, 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila, 2-furila, 3-furila, 2-tienila, 3-tienila, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidila, 4-pirimidila, 5-benzotiazolila, purinila, 2-benzimidazolila, 5-indolila, 1-isoquinolila, 5-isoquinolila, 2-quinoxalinila, 5-quinoxalinila, 3-quinolila e 6-quinolila.Os substituintes para cada um dos sistemas de anéis de arila e heteroarila citados acima são selecionados a partir do grupo dos substituintes aceitáveis descritos abaixo. "Arila" e "heteroarila" também englobam sistemas de anéis em que um ou mais sistemas de anéis não aromáticos são fundidos, ou então ligados, a um sistema arila ou heteroarila.
Para brevidade, o termo "arila" quando utilizado em combinação com outros termos (por exemplo, arilóxi, ariltióxi, arilalquila) inclui ambos os anéis arila e heteroarila conforme definido acima.
Portanto, o termo "arilalquila" pretende incluir aqueles radicais em que um grupo arila está ligado a um grupo alquila (por exemplo, arilóxi, ariltióxi, arilalquila) incluindo aqueles grupos alquila em que um átomo de carbono (por exemplo, um grupo metileno) foi substituído, por exemplo, por um átomo de oxigênio (por exemplo, fenoximetila, 2-piridiloximetial, 3-(1-naftilóxi)propila e similares).
Entre as camptotecinas, seus análogos e derivados, pode-secitar, de preferência, os compostos descritos nas seguintes patentes/ pedidos de patente: WO 99/09996, WO 99/65493, WO 00/53607, EP 1.101.765, EP 137.145, EP 074.256, US 4.604.463, EP 56.692, EP 88.642, EP 296.612, EP 321.122, EP 325.247, EP 540.099, EP 737.686, WO 90/03169, WO 96/37496, WO 96/38146, WO 96/38449, WO 97/00876, US 7.104.894, a descrição de cada uma delas está incorporada no presente como referência.
Em uma realização preferida, a cadeia principal da camptotecina de fórmula (II) em que t é 0 e Z é um grupo COO conforme definido acima, que pode ser representado pela seguinte fórmula (III):
<formula>formula see original document page 28</formula>De acordo com uma realização de maior preferência, a cadeia principal da camptotecina é representada pela seguinte fórmula (IV):
<formula>formula see original document page 29</formula>
Mais particularmente, a camptotecina, seus análogos ou derivados contêm a cadeia principal da camptotecina de fórmula (III) e, de maior preferência, a fórmula (IV) em que qualquer um dos grupos de hidrocarboneto representados no presente podem ser substituídos conforme definido acima.
Em particular, a camptotecina, seus análogos ou derivados são selecionados a partir do irinotecan, topotecan, GI-147211C, SN38, 7-hidroximetil camptotecina, 9-aminocamptotecina (9-AC), 7-aminometil camptotecina, 10-hidroxicamptotecina e (20S)- camptotecina (denominado camptotecina). As estruturas de ditos compostos são o seguinte:(20S)-camptotecina SN-38 7-hidroximetil camptotecina Topotecan<formula>formula see original document page 30</formula>A porção da droga pode ser ligada diretamente ou indiretamente à porção portadora. Em uma realização preferida, em que a porção da droga está ligada indiretamente ao portador, a ligação pode ser um grupo de ligação intermediário, tal conforme descrito abaixo, todos os grupos de ligação e outros descritos abaixo são, no presente, referidos como porções Iigantes ou são derivados dos reagentes reticulantes definidos abaixo.
De acordo com a presente invenção, cada porção portadora está ligada a pelo menos uma porção da droga e, de maior preferência, a uma porção da droga.
Em uma realização particular, a porção portadora é preparada demodo a facilitar a ligação em mais de uma porção da droga, cada porção da droga sendo a mesma ou diferente. Por exemplo, a porção portadora pode compreender os componentes que facilitam por si próprios a ligação em mais de uma porção da droga, tal como derivados de aminoácidos de ocorrência natural, tal como a cisteína ou a inserção de um aminoácido sintético multivalente ou um Iigante com sítios ativos múltiplos. Desta maneira, uma única porção portadora pode carregar entre 2 a 10 ou mais, de preferência, entre 4 e 5 porções da droga. Nesta realização adicional, cada porção da droga pode ser ligada diretamente ou indiretamente à porção portadora pelas mesmas porções Iigantes ou diferentes. Quando mais de um tipo diferente de porção da droga é ligada, é possível coordenar as proporções e as dosagens das drogas individuais para facilitar a administração das combinações específicas de drogas.
A ligação direta pode ocorrer através de qualquer grupo funcional conveniente na porção da droga, tal como um grupo hidróxi, carbóxi ou amino.
A ligação indireta que é preferível, irá ocorrer através de uma porção ligante. As porções Iigantes também podem fornecer flexibilidade intramolecular ou ajustar as distâncias intramoleculares entre os domíniosconjugados e, portanto, pode ajudar a preservar a atividade biológica. As porções ligantes apropriadas incluem os radicais bi e multifuncionais orgânicos, selecionados independentemente a partir da alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, grupos aldeídos, ácidos, ésteres, anidridos, sulfidrila ou carboxila, tal como os derivados de maleimido conforme definido abaixo, derivados de maleimido ciclohexano, derivados de ácido benzoico maleimido, derivados ácidos de maleimidocaproico e derivados de succinimido ou pode ser derivado do brometo ou cloreto cianogênico, ésteres de succinimidila ou haletos sulfônicos e similares ou suas combinações.
Cada um dos termos acima (por exemplo, "alquila", "heteroalquila", "arila" e "heteroarila") inclui ambas as formas substituídas e não substituídas do radical indicado. Os substituintes preferidos para cada tipo de radical são apresentados abaixo.
Os substituintes para a alquila e os radicais heteroalquila (incluindo aqueles grupos freqüentemente referidos como alquileno, alquenila, heteroalquileno, heteroalquenila, alquinila, cicloalquila, heterocicloalquila, cicloalquenila e heterocicloalquenila) são, em geral, referidos como "substituintes alquila" e "substituintes heteroalquila", respectivamente, e eles podem ser um ou mais de uma variedade de grupos selecionados a partir de, mas não limitados a, -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', halogênio, -SiR'R"R'", -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NRhC(O)2R', -NR-C(NR'R")=NR"', -NR-C(NR'R")=NR"\ -S(O)R', -S(O)2R', -S(0)2NR'R", -NRSO2R', -NRR1SO2R", - CN e - NO2, em um número que varia de zero a (2m' + 1), em que m' é o número total de átomos de carbono em tal radical. R', R", R'" e R"" cada um, de preferência, se refere a um hidrogênio, heteroalquila substituída ou não substituída, arila substituída ounão substituída, por exemplo, arila substituída por 1 a 3 halogênios, alquila substituída ou não substituída, grupos alcóxi ou tioalcóxi, ou arilalquila. Quando um composto da presente invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é selecionado independentemente como cada um dos grupos R', R", R'" e R"" quando mais de um destes grupos está presente. Quando R' e R" estiverem ligados ao mesmo átomo de nitrogênio, eles podem ser combinados com o átomo de nitrogênio para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, NR'R" pretendem incluir, mas sem estarem limitados a, 1-pirrolidinil e 4-morfolinil. A partir da discussão acima dos substituintes, um técnico no assunto irá entender que o termo "alquila" pretende incluir os grupos que incluem os átomos de carbono ligados aos grupos exceto os grupos de hidrogênio, tais como (por exemplo, CF3 e -CH2CF3) e acila (por exemplo, -C(O)CH3, -C(O)CF3, C(O)CH2OCH3, e similares).
Similares aos substituintes descritos para o radical alquila, os substituintes arila e os substituintes heteroarila são, em geral, referidos como "substituintes arila" e "substituintes heteroarila", respectivamente e são variados e selecionados a partir de, por exemplo: halogênio, -OR', =0, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogênio, -SiR'R"R"\ -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NR- C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(0)2NR'R", -NRSO2R', - CN e - NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcóxi (Ci-C4)1 fluoroalquila (Ci-C4), em um número que varia de O ao número total de valências abertas no sistema do anel aromático; e em que R', R", R"' e R"" são, de preferência, independentemente selecionados a partir do hidrogênio, alquila e heteroalquila (Ci-C8)1 arila e heteroarila não substituída, alquila (arila não substituída) (Ci-C4) e alquila (arila não substituída)óxi (Ci-C4). Quando uma porção de ligação da presente invenção inclui mais de um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é, independentemente selecionado como são os grupos R', R", R'" e R"" quandomais de um destes grupos estiver presente.
Dois ou mais substituintes arila nos átomos adjacentes do anel arila ou heteroarila pode ser, opcionalmente, substituído por um substituinte de fórmula -T-C(0)-(CRR')v-U-, em que TeU são independentemente NR-, -O-, - CRR'- ou uma ligação simples, e ν é um número inteiro de O a 3. Alternativamente, dois ou mais substituintes nos átomos adjacentes do anel arila ou heteroarila pode ser, opcionalmente, substituído por um substituinte de fórmula -A-(CH2)x-B-, em que AeB são independentemente -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -S(O)2NR- ou uma ligação simples, e χ é um número inteiro de 1 a 4. Uma das ligações simples do novo anel então formado pode ser opcionalmente substituído por uma ligação dupla. Alternativamente, dois dos substituintes nos átomos adjacentes do anel arila ou heteroarila pode ser, opcionalmente, substituído por um substituinte de fórmula -(CRR')b-X-(CR"R'")d-, onde b e d são independentemente números inteiros de O a 3, e X é -O-, -NR"-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- ou -S(O)2NR'-. Os substituintes R, R', R" e R'" são, de preferência, independentemente selecionados a partir do hidrogênio ou da alquila (C1-C6) substituída ou não substituída.
Conforme utilizado no presente, o termo "heteroátomo" incluir o oxigênio (O), nitrogênio (N)1 enxofre (S) e silício (Si).
Conforme utilizado anteriormente, o símbolo "R" é umaabreviação geral que representa um grupo substituído que é selecionado a partir da alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, e dos grupos heterocíclicos substituídos ou não substituídos.
Os grupos funcionais (isto é, grupos reativos) na porção liganteutilizados para formar ligações covalentes entre o ligante e as drogas por um lado, bem como o Iigante e a porção portadora por outro lado, podem ser o mesmo (isto é, grupos homofuncionais) ou, de preferência, de tipos diferentesde grupos funcionais (isto é, grupos heterofuncionais), incluindo em particular os grupos amino, hidrazino, hidroxila, tiol, maleimido, carbonila e carboxila. De acordo com uma realização preferida, os grupos funcionais são selecionados a partir da carboxila (-COOH) e dos grupos maleimido. A porção Iigante pode incluir uma seqüência curta de 1 a 4 resíduos de aminoácidos que, opcionalmente, incluem um grupo tiol através do qual a porção Iigante se liga à porção portadora.
Nas realizações específicas, o acoplamento da porção portadora e da porção da droga pode ser realizado por meio de um reagente reticulante.
Há diversos reagentes de reticulação intermolecular que podem ser utilizados, vide, por exemplo, Means e Feeney, Chemical Modification ofProteins, Holden-Day, 1974, pág. 39 - 43. Entre estes reagentes estão, por exemplo, o N-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) ou N, N'-(1,3-fenileno) bismaleimida (ambos os quais são altamente específicos para os grupos sulfidrila e formam ligações irreversíveis); N, N'-etileno-bis-(iodoacetamida) ou outro reagente que possui de 6 a 11 pontes de carbono metileno (que são relativamente específicos para os grupos sulfidrila); e 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno (que forma ligações irreversíveis com os grupos amino e tirosina). Outros reagentes de reticulação úteis para este propósito incluem: p,p'-difluoro-N,N'-dinitrodifenilsulfona (que forma reticulações irreversíveis com os grupos amino e fenólico); dimetil adipimidato (que é específico para os grupos amino); fenol-1,4-disulfonilcloreto (que reage principalmente com os grupos amino); hexametilenodiisocianato ou diisotiocianato, ou azofenil-p-diisocianato (que reage principalmente com os grupos amino); glutaraldeído (que reage com diversas cadeias laterais diferentes) e disdiazobenzidina (reage principalmente com tirosina e histidina); ácido /V-3-maleimidopropanoico; ácido A/-6-maleimidocaproico; ácido Λ/-11-maleimidoundecanoico, ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 -carbóxi-6-amidocaproico; ácido 4-[(N-maleimidoetil) CarboxamidoetiI(Peg)4 carboxamidometil] ciclohexanocarboxílico.
Conforme mencionados anteriormente, os reagentes de reticulação podem ser homobifuncional, isto é, possuindo dois grupos funcionais que sofrem a mesma reação. Um exemplo de um reagente de reticulação homobifuncional é o bismaleimidohexano ("BMH"). O BMH contém dois grupos funcionais de maleimido, que reagem especificamente com os compostos contendo sulfidrila em condições suaves (pH 6,5 - 7,7). Os dois grupos maleimida são ligados por uma cadeia de hidrocarboneto. Portanto, o BMH é útil para a reticulação irreversível dos polipeptídeos que contém os resíduos de cisteína. Os reagentes de reticulação também podem ser heterobifuncionais. Os reagentes de reticulação heterobifuncionais possuem dois grupos funcionais diferentes, por exemplo, um grupo amino-reativo e um grupo tiol-reativo, que irá reticular duas porções que possuem aminas e tióis livres, respectivamente. Os reagentes de reticulação heterobifuncionais preferidos são o succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato ("SMCC"), succinimidil-4-(A/-maleimidometil)-ciclohexano-1-carbóxi (6-amidocaproato) ("LC-SMCC"), éster de A/-maleimidobenzoil-A/-hidroxisuccinimida ("MBS") e succinimida 4-(p-maleimidofenil) butirato ("SMPB"), um análogo da cadeia estendida de MBS. O grupo succinimidila destes reagentes de reticulação reagem com uma amina primária formando uma ligação amida e a maleimida reativa ao tiol forma uma ligação tioéter covalente com o grupo tiol (por exemplo, de uma cisteína).
Os reagentes de reticulação possuem freqüentemente baixa solubilidade em água. Uma porção hidrofílica, tal como um grupo sulfonato, pode ser adicionado ao reagente de reticulação para melhorar sua solubilidade em água. O sulfo-MBS e o sulfo-SMCC são exemplos de reagentes de reticulação modificados para a solubilidade em água.
Muitos dos reagentes de reticulação conferem um conjugado queé essencialmente não clivável nas condições celulares. Entretanto, os reagentes de reticulação contêm uma ligação covalente, tal como um dissulfeto, que é clivável nas condições celulares. Por exemplo, o reagente de Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) ("DSP") e /V-succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato ("SPDP") são reagentes de reticulação clivável bem conhecidos. A ligação dissulfeto direta também pode ser útil.
Numerosos reagentes de reticulação, incluindo aqueles descritos acima, estão disponíveis comercialmente. As instruções detalhadas para seus usos estão disponíveis prontamente a partir dos fornecedores comerciais. Uma referência geral na reticulação da proteína e na preparação do conjugado é: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991).
Os Iigantes que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção podem diferir entre si por sua estabilidade nos fluidos biológicos (por exemplo, plasma humano) quando conjugado. O termo "estabilidade" é definido como o tempo de meia vida da liberação do derivado de camptotecina a partir do conjugado da presente invenção, que é dependente do Iigante selecionado. Vantajosamente, o conjugado da presente invenção é estável, em particular, ele apresenta um tempo de meia vida de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 horas. Um conjugado instável irá liberar a porção da droga com um tempo de meia vida mais curto, por exemplo, < 5 minutos. Um conjugado altamente estável possui um tempo de meia vida no plasma acima de 11 horas. De preferência, o conjugado é estável no plasma humano in vitro com um tempo de meia vida de cerca de 1 a 6,5 horas a 37° C. O tempo de meia vida do conjugado é determinado conforme descrito no Exemplo II.
Os reagentes de reticulação heterobifuncional preferidos dapresente invenção compreendem um grupo -COOH livre e um grupo maleimida livre. Entre tais reagentes de reticulação, pode ser citado o seguinte composto:<formula>formula see original document page 38</formula>
Peso molecular: 169,13
Ácido N-3-maleimidopropanoico
comercializado pela Pierce (Ref: 22296)
E mais particularmente, o conjugado da presente invenção derivados seguintes reagentes de reticulação:
<formula>formula see original document page 38</formula>
Peso molecular: 211,21 Ácido N-6-maleimidocaproico
Comercializado pela Sigma (Ref: M8904)
C15H23NO4
Peso molecular: 281,35
Acido N-11-maleimidoundecanoico comercializado pela Pierce (Ref: 22211)
<formula>formula see original document page 38</formula>Peso molecular: 350,41
Ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carbóxi-6-amidocaproico
<formula>formula see original document page 39</formula>
Peso molecular: 555,62
Ácido 4-[(A/-maleimidoetil)carboxamidoetil(Peg)4 carboxamidometil] ciclohexano carboxílico
<formula>formula see original document page 39</formula>
Peso molecular: 489,60
Ácido 4-[(A/-maleimidometil)ciclohexano-1-carbóxi-6-amidohexanocarboxamido metil] ciclohexanocarboxílico
<formula>formula see original document page 39</formula>
C20H28N2O5
Peso molecular: 376,45
Ácido 4-[((N-maleimidometil)ciclohexanocarboxamido)metil]ciclohexanocarboxílicoNeste contexto, outro objeto da presente invenção lida com os
compostos novos, particularmente apropriados como reagentes de reticulação,representados pela seguinte fórmula (V):
<formula>formula see original document page 40</formula>
em que B é um grupo cicloalquila substituído ou não substituído, e R1 e R2 são independentemente nada (isto é, uma ligação covalente) ou um grupo alquila, heteroalquila, arila ou heteroarila bivalente substituído ou não substituído;seus sais e/ou isômeros.
Tais reagentes de reticulação são muito úteis uma vez que os conjugados obtidos a partir dos mesmos são vantajosamente estáveis no plasma humano in vitro com um tempo de meia vida de mais de 5 minutos a 37° C.
Os grupos citados de fórmula (V) são conforme definidos acima.
Em uma realização particular, os compostos são representados pela fórmula (V) em que Ri é um grupo alquila, heteroalquila, arila ou heteroarila bivalente substituído ou não substituído e R2 é nada ou um grupo alquila, heteroalquila, arila ou heteroarila bivalente substituído ou não substituído.
Em outra realização particular, os compostos são representados pela fórmula (V), em que pelo menos um Ri e R2 está interrompido por pelo menos um radical bivalente selecionado a partir de -O-, -NR'-, -SR'-, -SiR1R"-, -OC(O)-, -C(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'-, -NROC(O)- e -NR"C(0)2-, em que R' e R" são, independentemente, conforme definido acima,em particular, R' e R" são selecionados a partir do hidrogênio, grupo alquila (Ci- C8), heteroalquila (Ci- C8), arila e heteroarila.
Quando Ri e/ou R2 são interrompidos por pelo menos um radical bivalente, dita interrupção pode ser colocada em qualquer posição interna do grupo Ri e/ou R2 ou na posição em que o grupo Ri e/ou R2 está ligado ao restante do composto de fórmula (V).
Nas realizações particulares, a presente invenção se refere aos compostos de fórmula (V) em que:
- B é uma cicloalquila (C3-C8), de preferência, cicloalquila não substituída, incluindo o radical ciclopentila ou ciclohexila, e/ou
- Ri é um grupo heteroalquila, em particular, que engloba o poli(etileno glicol) (isto é, PEG) e seus derivados, tais como PEG-3, -4, -5 ou -6, e/ou
- Ri é uma cadeia alquila (CrC8) linear, em particular, -CH2- ou -CH2CH2-, e/ou
- Ri é uma cadeia alquila (Ci-C8)1 opcionalmente interrompida por pelo menos um, de preferência, um ou dois, radicais bivalentes selecionados a partir de -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NROO-, -OC(O)NR'- e -NR"C(0)2-, de preferência, -CONR'- ou -NROC(O)-, em que R' e R", independentemente,entre si são, de preferência, selecionado a partir do hidrogênio e da alquila (Cr C8), e opcionalmente dita cadeia alquileno (CrC8) compreende pelo menos uma cadeia cicloalquila conforme definido acima, e/ou
- R2 é nada, e/ou
- R2 é um grupo heteroalquila, em particular, que engloba o polietileno glicol (isto é, PEG) e seus derivados, tais como PEG-3, -4, -5 ou -6,
e/ou
- R2 é uma cadeia alquila (CrC8) linear, em particular, -CH2- ou -CH2CH2-, e/ou- R2 é uma cadeia alquila (Ci-Ce), opcionalmente interrompida por pelo menos um, de preferência, um ou dois, radicais bivalentes selecionados a partir de -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'- e -NRnC(O)2-, de preferência, -CONR'- ou -NR"0C(0)-, emque R' e R", independentemente, entre si são, de preferência, selecionados a partir do hidrogênio e da alquila (Cr Ce), e opcionalmente dita cadeia alquila (Ci-Ce) compreende pelo menos uma cadeia cicloalquila conforme definido acima.
Em particular, os compostos de fórmula (V) podem ser ilustrados pelos compostos identificados acima, isto é:
ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carbóxi-6-amidocaproico,
- ácido 4-[(N-maleimidoetil)carboxamidoetil(PEG)4 carboxamido metil] ciclohexano carboxílico,
- ácido 4-[(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carbóxi-6-amidohexanocarboxamido metil] ciclohexano carboxílico, ou
ácido 4-[((N-maleimidometil)ciclohexanocarboxamido)metil] ciclohexano carboxílico.
O composto de fórmula (V) pode ser preparado por diferentes métodos bem conhecidos no estado da técnica. Em particular, o composto de fórmula (V) é preparado pelos métodos descritos nos exemplos. De acordo com um aspecto particular da presente invenção, o conjugado compreende uma porção da droga ligada a uma porção portadora conforme definido acima, em que a porção da droga está ligada covalentemente à porção portadora com um Iigante resultante de um composto (reagente de reticulação) de fórmula (V) conforme definido acima.
De acordo com uma realização particular, o conjugado da presente invenção apresenta, de maior preferência, a seguinte fórmula (VI):<formula>formula see original document page 43</formula>
- em que: X é a porção portadora (CPP) conforme definida acima, em particular, representada pela fórmula (I), que está ligada ao restante do composto por uma ligação tioéter; e
- B, Ri, R2 são grupos conforme definido acima; e
- Y é a porção da droga conforme definido acima, em particular, aporção SN38.
Em uma realização particular adicional, o conjugado é representado pela fórmula (VI) em que Y está ligado ao restante do conjugado através de uma ligação tioéter, hidrazona, amida, éster, éter, carbamato ou tiocarbamato, de maior preferência, através de uma ligação éter (-0-), dissulfeto ou tioéter.
Os conjugados descritos no presente, incluindo aqueles de fórmula (VI) são entidades químicas novas. Em um aspecto particular da presente invenção, o conjugado da presente invenção inclui aquele em que a porção portadora é representada pela fórmula (I) (incluindo qualquer realização preferida identificada acima) e opcionalmente em que o grupo Iigante é derivado a partir de um reagente de reticulação que compreende um grupo -COOH livre e um grupo maleimida livre, em particular, do ácido N-6-maleimidocaproico e do ácido 4-[((/\/-maleimidometil) ciclohexanocarboxamido) metil] ciclohexanocarboxílico.
As entidades químicas específicas descritas no presente incluem, mas não estão limitada a:<formula>formula see original document page 44</formula>
- em que X é conforme definido acima, em particular, DPV3, DPV3.10, DPV6, DPV7, DPV7b, DPV15, DPV15b, DPV1047, DPV1048, DPV10 ou DPV10/6, e de maior preferência ainda DPV3, DPV15, DPV15b ou DPV1047.
A presente invenção também se refere aos métodos para apreparação do mesmo.
O conjugado da presente invenção pode ser preparado por qualquer método conhecido no estado da técnica.
Por exemplo, a porção portadora (ou peptídica) pode ser preparada utilizando a solução convencional ou os métodos de síntese de peptídeo de fase sólida. Este peptídeo pode então ser reagido diretamente com a porção da droga, um derivado reativo apropriado de uma porção da droga, ou um reagente de reticulação.
Uma porção da droga ou seu derivado pode estar ligado à porção portadora através, por exemplo, da formação da ligação do tioéter, hidrazona, amida, éster, éter, carbamato, tiocarbamato ou dissulfeto.
Alternativamente, um grupo ligante, conforme descrito acima que é utilizado, em particular, para preparar um conjugado de fórmula (VI), éintroduzido pela reação de um reagente reticulante e, em particular, um reagente reticulante de fórmula (V), com uma função apropriada da porção portadora, em particular, um grupo tiol, seguido pela formação de uma ligação covalente entre o grupo Iigante e a porção da droga. E m uma realização particular do conjugado de fórmula (VI), a droga apresenta uma função apropriada para formar uma ligação covalente com o ligante. Dita função apropriada é, de maior preferência, um grupo hidroxila de modo a formar uma ligação éster entre o grupo ligante e a porção da droga. Os conjugados de fornecimento da droga multivalentes podem ser obtidos, ente outros, pela extensão sucessiva de uma função apropriada da porção portadora com, por exemplo, grupos químicos bivalentes ou trivalentes.
De acordo com outra realização preferida, o reagente de reticulação é acoplado à porção da droga antes da reação com a porção portadora.
Utilizando estes métodos, o técnico no assunto será capaz depreparar uma grande variedade de conjugados portadores da droga utilizando uma variedade de porções ligantes. Conforme exemplificado abaixo, um grupo apropriado na porção da droga pode ser selecionado para a ligação na porção portadora e, caso desejado, um ligante unido à droga ou à porção portadora, ou ambos antes de seu acoplamento. Alternativamente, a droga também pode ser modificada de modo a permitir a conjugação.
Os conjugados da presente invenção podem ser formulados com um suporte, veículo ou excipiente fisiologicamente aceitável para a utilização como produto farmacêutico para ambas as utilizações veterinárias, por exemplo, em mamíferos e, em particular, em humanos por uma variedade de métodos.
A presente invenção pertence às utilizações dos conjugados da presente invenção para os tratamentos terapêuticos conforme descrito infra.Portanto, o escopo da presente invenção se extende para a utilização de um composto da presente invenção para a fabricação de um medicamento (ou farmacêutico) para o tratamento ou a prevenção de uma doença conforme descrito acima. Consequentemente, os conjugados da presente invenção podem ser incorporados nas composições, de preferência, nas composições farmacêuticas, apropriadas para a administração. Tais composições compreendem tipicamente pelo menos um conjugado de acordo com a presente invenção ou uma mistura de conjugados e, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável.
Conforme utilizado no presente, "veículo farmaceuticamenteaceitável" pretende incluir qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento isotônicos e de absorção, e similares, compatíveis com a administração farmacêutica. A utilização de tais meios e agentes para as substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida no estado da técnica. Exceto na medida em que qualquer meio convencional ou agente é incompatível com um conjugado ativo da presente invenção, a sua utilização nas composições é considerada. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
Uma composição da presente invenção, de preferência, acomposição farmacêutica, é formada como sendo compatível com sua via pretendida de administração. Os exemplos de vias de administração incluem a administração do bolus ou a infusão intravenosa, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (por exemplo, tópica), intracraniana, intraespinal e transmucosa. As soluções ou suspensões utilizadas para estas vias de administração podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, tal como a água para injeção, solução salina, óleos fixados, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ououtros solventes sintéticos; agentes antibacterianos, tais como o álcool benzílico ou o metil parabeno; antioxidantes, tais como o ácido ascórbico ou o bissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como o ácido etilenodiaminotetraacético; tampões tais como os acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajuste da tonicidade, tal como o cloreto de sódio ou a dextrose. O pH pode ser ajustado com os ácidos ou as bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser fechada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas fabricadas de vidro ou plástico.
As composições farmacêuticas apropriadas para o uso injetávelincluem as soluções aquosas estéreis (onde hidrossolúvel) ou dispersíveis e pós estéreis para a preparação extemporânea das soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Para a administração intravenosa, os veículos apropriados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ, EUA) ou solução salina tamponada de fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida até o grau em que ela pode ser administrada. Ela deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação de contaminantes de microorganismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e similares), e suas misturas apropriadas. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pela utilização de um revestimento, tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso da dispersão e pela utilização dos tensoativos. A prevenção da ação dos microorganismos pode ser obtida por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, os parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e similares. Em muitos casos, será preferível incluir os agentes isotônicos, por exemplo,açúcares, poliálcoois, tais como o manitol, sorbitol, cloreto de sódio, na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser ocasionada pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, o monoestearato de alumínio e a gelatina.
As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pelaincorporação do conjugado da presente invenção na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido pela filtração esterilizante. Em geral, as dispersões são preparadas pela incorporação do conjugado ativo da presente invenção em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e nos outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados acima. No caso dos pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e a secagem por congelamento que confere um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução estéril -filtrada previamente da mesma.
As composições orais incluem, em geral, um diluente inerte ou um veículo comestível. Elas podem ser englobadas em cápsulas de gelatina ou comprimidas em comprimidos. Para o propósito da administração terapêutica oral, o conjugado ativo da presente invenção pode ser incorporado com os excipientes e utilizado na forma de comprimidos, pastilhas ou cápsulas. As composições orais também podem ser preparadas utilizando um veículo fluido para a utilização como um enxaguatório bucal, em que o conjugado da presente invenção no veículo fluido é aplicado oralmente, espirrado, expectorado ou engolido. Os agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis, e/ou os materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os tabletes, pílulas, cápsulas, pastilhas e similares podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes ou compostos de natureza similar: umligante, tal como a celulose microcristalina, goma tragacanto ou gelatina; um excipiente, tal como o amido ou a Iactose1 um agente de desintegração, tal como o ácido algínico, primogel, ou amido de milho; um lubrificante, tal como o estearato ou esterotes de magnésio; um glidant, tal como o dióxido de silício coloidal; um agente adoçante, tal como a sacarose ou a sacarina; ou um agente flavorizante, tal como a pimenta-hortelã, salicilato de metila ou flavorizantes de laranja.
Para a administração por inalação, os conjugados da presente invenção são fornecidos na forma de um spray aerossol a partir do recipiente pressurizado ou dispensador que contém um propelente apropriado, por exemplo, um gás tal como o dióxido de carbono, ou um nebulizador.
A administração sistêmica também pode ser por meio da transmucosa ou transdérmica, os penetrantes apropriados à barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Tais penetrantes são, em geral, conhecidos no estado da técnica e incluem, por exemplo, para a administração pela transmucosa, detergentes, sais biliares, e derivados de ácido fusídico. A administração pela transmucosa pode ser realizada através da utilização de sprays nasais ou supositórios. Para a administração transdérmica, os conjugados ativos da presente invenção são formulados em pomadas, unguentos, géis ou cremes conforme geralmente conhecido no estado da técnica. Os conjugados da presente invenção também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases supositórios convencionais, tal como manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para o fornecimento retal.
Em uma realização, os conjugados ativos da presente invençãosão preparados com veículos que irão proteger o conjugado da presente invenção contra a eliminação rápida do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo os implantes e os sistemas de fornecimentomicro e macroencapsulados.
Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser utilizados, tal como o acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, polietileno glicóis e ácido poliláctico ou suas combinações.
Os métodos para a preparação de tais formulações serão evidentes para o técnico no assunto. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente pela Alza Corporation, por exemplo, e também pode ser utilizado como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com os métodos conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, conforme descrito na patente US 4.522.811.
É especialmente vantajoso formular as composições orais e parenterais na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem conforme utilizado no presente se refere às unidades fisicamente distintas apropriadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade pré-determinada de conjugado ativo na presente invenção calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação das formas de unidade de dosagem da presente invenção é ditada e diretamente dependente das características únicas do conjugado ativo da presente invenção e do efeito terapêutico particular a ser atingido e as limitações inerentes no estado da técnica de compor tal conjugado ativo da presente invenção para o tratamento de indivíduos.
A eficácia terapêutica e a toxicidade de tais conjugados dapresente invenção pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou modelos de animais experimentais, por exemplo, para determinar o MTD (Dose Máxima Tolerada), o TGI (inibição docrescimento tumoral (% de TGI) definido como 100/-T/C (%)) e o T/C (proporção do volume tumoral médio em animais tratados para significar o volume do tumor nos grupos controle). A proporção da dose entre os efeitos terapêuticos e tóxicos é o índice terapêutico e ele pode ser expresso como a proporção ED50/ LD50. Os conjugados da presente invenção que exibem maiores índices terapêuticos são preferidos. Embora os conjugados da presente invenção que exibem efeitos colaterais tóxicos possam ser utilizados, deve ser tomado cuidado para criar um sistema de fornecimento que tem como objetivo tais conjugados da presente invenção para o sítio do tecido afetado de modo a minimizar o dano potencial em células não tumorais e, portanto, reduzir os efeitos colaterais.
Os dados obtidos a partir de estudos em animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem para a utilização em seres humanos. A dosagem de tais conjugados da presente invenção permanece, de preferência, dentro de um intervalo que inclui o nível de dose efetivo com toxicidade aceitável ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro deste intervalo dependendo da forma da dosagem empregada e a via de administração utilizada. Para qualquer conjugado da presente invenção utilizado no método da presente invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios em modelos animais. Tal informação pode ser utilizada para determinar mais precisamente as doses úteis em humanos.
Uma quantidade terapeuticamente eficaz (isto é, uma dosagem efetiva) de uma composição contendo um conjugado da presente invenção é facilmente determinada por um técnico no assunto. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que inibe o crescimento tumoral dos cânceres humanos xenoenxertados por, pelo menos 20%. As maiores porcentagens de inibição, por exemplo, 45, 50, 75, 85, 90% ou maiorpode ser preferido em certas realizações. As doses exemplares incluem as quantidades em miligramas ou microgramas do composto da presente invenção por quilograma do peso em questão (por exemplo, cerca de 1 μιτι/Kg a cerca de 1 g/Kg, cerca de 1 pm/Kg a cerca de 50 pm/Kg, ou cerca de 50 pm/Kg a cerca de 5 mg/Kg). As composições podem ser administradas pelo menos uma vez por semana, mas também uma vez por dia ou a cada 2, 3, 4, 5 ou 6 dias, por entre cerca de 1 a 10 semanas, por exemplo, entre 2 a 8 semanas ou entre cerca de 3 a 7 semanas, ou por cerca de 4, 5 ou 6 semanas.
Um técnico no assunto irá considerar que certos fatores podem influenciar a dosagem e o tempo requerido para tratar efetivamente um indivíduo, incluindo, mas não limitado a severidade da doença ou distúrbio, tratamentos anteriores, a saúde geral e/ou a idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição pode incluir um único tratamento ou uma serie de tratamentos.
Além disso, é entendido que as doses apropriadas de uma composição dependem da potência da composição com relação à expressão ou atividade a ser modulada.
Quando um ou mais destes compostos da presente invenção for administrado a um animal (por exemplo, humano), um médico, veterinário ou pesquisador pode, por exemplo, prescrever inicialmente uma dose relativamente baixa, aumentando subseqüentemente a dose até uma resposta apropriada ser obtida. Em adição, entende-se que o nível de dose específico para qualquer indivíduo particular irá depender de uma variedade de fatores que incluem a atividade do composto específico da presente invenção empregado, a idade, o peso corpóreo, a saúde geral, o sexo, e a dieta do indivíduo, o tempo de administração, a via de administração, a velocidade de excreção, qualquer combinação de droga e o grau de expressão ou deatividade a ser modulado.
As composições farmacêuticas podem ser incluídas em um recipiente, embaladas ou dispensadas junto com as instruções para a administração.
Em uma realização particular, os compostos da presenteinvenção podem ser administrados simultaneamente ou seqüencialmente com outros regimes terapêuticos ou agentes (por exemplo, regimes de drogas múltiplas) em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em particular, outros regimes terapêuticos ou agentes correspondem aos tratamentos anticâncer ou às drogas, tais como a 5-fluorouracil, leucovorin, oxaliplatina, capecitabina, vincristina, celebrex, temozolomida, oligoelementos (por exemplo, selênio), talidomida, cetuximab, gemcitabina, docetaxel, 3-AP (Triapina®), carboplatina, bortezomib, bevacizumab, sorafenib, cisplatin, gefitinib, flavopiridol, elvorin, carboplatin, amrubicin, trastuzumab, pemetrexed, erlotinib, mitomicin C, AMG706, panitumab, paclitaxel, raltitrexed, imatinib, abciximab, infliximab, palivizumab, rituximab, gemtuzumab ozogamicin, alemtuzumab ou ibritumomab tiuxetan.
Quando a administração simultânea é realizada, o agente ativo pode ser administrado na mesma composição ou diferente. Este co-tratamento objetiva aumentar o benefício terapêutico e/ou diminuir a toxidade.
Em outra realização particular, a presente invenção se refere à combinação da radioterapia e dos compostos da presente invenção administrados simultaneamente ou seqüencialmente.
De acordo com outro aspecto, a presente invenção se refere à utilização de uma quantidade eficaz de pelo menos um composto da presente invenção conforme definido acima para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença, em particular o câncer.
Os compostos preferidos para a utilização, de acordo com apresente invenção, incluem quaisquer subgrupos conforme definidos acima e para quaisquer compostos especificados conforme identificado acima.
Um objeto adicional da presente invenção é um método para o tratamento de um câncer, que compreende a administração em um paciente com necessidades de tais tratamentos, uma quantidade eficaz de pelo menos um composto conforme descrito acima.
Por causa da porção da droga compreendida no conjugado da presente invenção, os conjugados da presente invenção são apropriados para o tratamento de uma variedade de doenças em uma variedade de condições. Com relação a isto, "tratamento" ou "tratar" inclui ambos os tratamentos terapêuticos e profiláticos. Consequentemente, os conjugados podem ser utilizados em estágios muito iniciais de uma doença ou após a progressão significativa, incluindo a metástase. O termo "tratamento" ou "tratar" designa, em particular, uma redução do fardo de um paciente, tal como uma redução na velocidade da proliferação celular, uma destruição das células proliferativas doentes, uma redução da massa tumoral ou do tamanho do tumor, uma redução nas metástases tumorais, um retardamento da progressão tumoral, bem como a supressão tumoral completa, melhor da sobrevivência ou qualquer outro ponto final (endpoint) clínico apropriado.
Os conjugados da presente invenção são, particularmente,apropriados para o tratamento de cânceres, tal como os tumores sólidos ou os tumores linfóides. Os exemplos específicos incluem o câncer de cólon, câncer de pulmão (isto é, pequenas células, células não pequenas, cânceres brônquicos), câncer de pâncreas, câncer ovariano, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça, estômago e pescoço, câncer de bexiga urinaria, câncer de Iinfoma não-Hodgkin, melanoma, leucemia, neuroblastoma ou glioblastoma.
Os conjugados podem, de acordo com diversas rotas, seradministrados tipicamente por injeção, tal como injeção(ões) sistêmica(s). A via preferida de administração é intravenosa, através de bolus ou por infusão, durante 15 minutos até 1 a 2 dias. Entretanto, outras vias de administração podem ser utilizadas, tal como o intramuscular, intradérmico, intratumoral subcutâneo, etc. Além disso, injeções repetidas podem ser realizadas, caso necessário.
Uma dieta adicional da presente invenção é um método para reduzir a proliferação celular do câncer pela administração em um indivíduo com câncer de uma quantidade eficaz do conjugado de acordo com a presente invenção.
Um objeto adicional da presente invenção é um método para o tratamento de cânceres metastáticos pela administração em um indivíduo que precisa de tal tratamento de uma quantidade eficaz do conjugado de acordo com a presente invenção.
Um objeto adicional da presente invenção é a utilização de umconjugado conforme definido acima para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de cânceres metastáticos ou para a redução da proliferação celular do câncer.
Os aspectos adicionais e as vantagens da presente invenção serão descritos nos seguintes exemplos que deveriam ser considerados como ilustrativos e não Iimitantes do escopo do presente relatório descritivo.
Exemplos (I) Materiais de Métodos (1.1 a) Peptídeos que Penetram na Célula (CPPs)
- DPV3: Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg ArgGlu Ser (SEQ ID N0: 1);
- DPV 1047: Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val (SEQ ID N0. 8);- DPV 15: Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln SerArg (SEQ IDN0. 10);
- DPV 15b: Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg (SEQ ID N0. 11);
- DPV7: Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro (SEQ ID N0 3);
- Tat4S -60· Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln (SEQ ID N0. 44);
- Penetratina: Arg Gln He Lys lie Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys (SEQ ID N0 29);
- DPV51(d): D-Lys D- Arg Gly D-Leu D-Lys D-Leu D- Arg D-His (SEQ ID N0. 51);
- DPV1047(d): Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val (SEQ ID N0. 8 em uma conformação D).
De modo a permitir a conjugação entre o CPP e a porção SN38 ligante (vide, por exemplo, I.4):
- DPV3, DPV15, DPV7 e Tat4S^o ainda contêm uma cisteína (Cys) na posição do terminal C da seqüência de aminoácidos.
- DPV 1047, DPV 15b, a penetratina e o DPV51 ainda contêm uma cisteína (Cys) na posição terminal N da seqüência de aminoácido.
As seqüências de aminoácido foram sintetizadas pela Neosystem, França.
ÍI.Ib) Peptídeos que Não Penetram na Célula
PoIíE(i6): Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu (SEQ ID N0. 52) para permitir a conjugação entre o PoliE(i6) e a porção ligante SN38 (vide, por exemplo, o I.4), o poliE(16) ainda contém uma cisteína (Cys) na posição N terminal da seqüência de aminoácido.
A seqüência de aminoácido foi sintetizada por Neosystem, França.Porções ligantes (ligantes) f Ligante #1)
Ácido Ν-3-maleimidopropanoico (PIERCE , France1 product Ref: 22296)
<formula>formula see original document page 57</formula>
C7H7NO4
Peso molecular: 169,13
Ligante # 2 (também denominado "MIC") Ácido Ν-6-maleimidocaproico (SIGMA, França, Product Ref: M8904)
<formula>formula see original document page 57</formula>
C10H13NO4
Peso molecular: 211,21
Ligante #3
ácido N-11-Maleimidoundecanoico
(PIERCE, França, Product Ref: 22211)
<formula>formula see original document page 57</formula>
C15H23NO4
Peso molecular: 281,35Ligante #4
Ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1 -carbóxi-6-amidocaproico
<formula>formula see original document page 58</formula>
C18H26N2O5
Peso molecular: 350,41
Ligante #5 (Também Denominado "BCH")
Ácido 4- [((N-maleimidometil)ciclohexanocarboxamido)metil]ciclohexanocarboxílico
<formula>formula see original document page 58</formula>
C20H28N2O5
Peso molecular: 376, 46 Ácido
Ligante #6
4-[(N-maleimidoetil)carboxamidoetil(Peg)4carboxamidometil]ciclohexanocarboxílico
<formula>formula see original document page 58</formula>
C26H41N3O10
Peso molecular: 169,13Ligante #7
ácidos 4-[(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carbóxi-6-amidohexanocarboxamido metil] cyclohexanocarboxílico.
<formula>formula see original document page 59</formula>
C26H39N3O6
Peso molecular: 489,60
1.3 Síntese dos ligantes de 4 a 7 1.3.1 Síntese do ligante #4
Uma solução de 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de succinimidila (PIERCE Ref: 22360) (25 mmol) em DMF (100 mL) foi agitada por 5 minutos, e foi adicionada à temperatura ambiente em uma solução de ácido 6-aminohexanoico (50 mmol) (SIGMA Ref: A2504) em H2O (50 mL). A mistura foi agitada por 4 horas à temperatura ambiente. O diclorometano foi adicionado (100 mL) e a camada orgânica foi lavada com água (3 χ 150 mL) e então com ácido cítrico aquoso a 5% (3 χ 150 mL) para remover o excesso de ácido de ácido 6-aminohexanoico. A camada orgânica foi seca em vácuo e o pó branco resultante foi armazenado a -20° C.
1.3.2 Síntese do ligante #5 ("BCH") Uma solução de 4-[N-maleimidometil]ciclohexano-1-carboxilato de succinimidila (PIERCE Ref: 22360) (25 mmol) em DMF (100 mL) foi agitada por 5 minutos e foi adicionada à temperatura ambiente em uma solução de ácido trans-A-(aminometil)ciclohexanocarboxílico (50 mmol) (SIGMA Ref: 08455) em H2O (50 mL). A mistura foi agitada por 4 horas à temperatura ambiente. O diclorometano foi adicionado (100 mL) e a camada orgânica foi lavada com água (3 χ 150 mL) e então com ácido cítrico aquoso a 5% (3 χ 150 mL) para remover o excesso de ácidofrans-4-(aminometil)ciclohexano carboxílico. A camada orgânica foi seca em vácuo e o pó branco resultante foi armazenado a -20° C.
1.3.3 Síntese do ligante #6
Uma solução de MaUdPeg4-NHS (Quanta BioDesign Ref: 10214) (25 mmol) em DMF (100 ml_) foi agitada por 5 minutos e foi adicionada à temperatura ambiente em uma solução de ácido trans-4-(aminometil) ciclohexanocarboxílico (50 mmol) (SIGMA Ref: 08455) em H2O (50 ml_). A mistura foi agitada por 4 horas à temperatura ambiente. O diclorometano foi adicionado (100 ml_) e a camada orgânica foi lavada com água (3 χ 150 mL) e então com ácido cítrico aquoso a 5% (3 χ 150 mL) para remover o excesso de ácido frans-4-(aminometil)ciclohexano carboxílico. A camada orgânica foi seca em vácuo e o pó branco resultante foi armazenado a -20° C.
1.3.4 SÍNTESE DO LIGANTE #7
Uma solução de 4-[A/-maleimidometil]ciclohexano-1-carbóxi-[6-amidocaproato] de succinimidila (PIERCE Ref: 22362) (25 mmol) em DMF (100 mL) foi agitada por 5 minutos e foi adicionada à temperatura ambiente em uma solução de ácido frans-4-(aminometil)ciclohexanocarboxílico (50 mmol) (SIGMA Ref: 08455) em H2O (50 mL). A mistura foi agitada por 4 horas à temperatura ambiente. O diclorometano foi adicionado (100 mL) e a camada orgânica foi lavada com água (3 χ 150 mL) e então com ácido cítrico aquoso a 5% (3 χ 150 mL) para remover o excesso de ácido frans-4-(aminometil)ciclohexano carboxílico. A camada orgânica foi seca em vácuo e o pó branco resultante foi armazenado a -20° C.
I.4 Camptotecina ε seus Derivados
<formula>formula see original document page 60</formula>Camptotecina
C20H16N2O4
Peso molecular: 348,35
<formula>formula see original document page 61</formula>
10-hidroxicamptotecina
C20Hi6N2O4
Peso molecular: 364,35
<formula>formula see original document page 61</formula>
7-etil-10-hidroxicamptotecina C22H2ON4OOsS 1
Peso molecular: 956,72
<formula>formula see original document page 61</formula>
I.5 Método para a Preparação dos Conjugados SN38 Ligantes de CPP
Os conjugados SN38 Iigantes de CPP foram preparados seguindo o método descrito abaixo. O mesmo método foi utilizado para conjugar os CPPs diferentes em SN38 utilizando os Iigantes diferentes descritos acima.
Preparação do 10-0- Ligante-SN38
O SN 38 e o "ligante" sofrem condensação mediada por O-(1H-6-clorobenzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametilurônio em N-metil-2-pirrolidinona. Após a extração com diclorometano e a remoção de N-metil-2-pirrolidinona por lavagens aquosas, o ligante intermediário SN38 foi isolado e purificado por precipitação a partir do diclorometano/ metil terc-butil éter.
O exemplo da via de síntese:
<formula>formula see original document page 62</formula>
Uma solução do Iigante (15,29 mmol, por exemplo 3,23 gpara MIC) e 0-(1 H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HCTU) (6,1 g, 14,74 mmol) e diisopropiletilamina (DIPEA) (5,4 mL, 30,9 mmol) em N-metil-2-pirrolidinona (NMP) (50 mL) a 0°C foi agitada por 15 min. A esta mistura de reação foi adicionado o SN38 (5 g, 12,75 mmol) como um pó sólido amarelo. A mistura foi agitada por 2 horas a 0°C. A solução foi recolhida em diclorometano (130 mL), extraída sucessivamente com NaCl 1M (3x130 mL) e então com ácido cítrico aquoso a 5% (3x130 mL). A camada orgânica foi adicionada lentamente (durante um mínimo de 30 minutos) ao metil ferc-butil éter (MTBE) (600 mL) a 0°C. O precipitado amarelo que formou foi então filtrado e seco em vácuo (200 mBar) durante a noite.
Acoplamento do CPPs ao 10-Q-ligante-SN38 A porção do ligante SN38 foi conjugada ao CPP para fornecer uma mistura do conjugado CPP-ligante-SN38 em DMF (dimetil formamida). O produto foi extraído em água e Iiofilizado para fornecer um sólido amarelo.O exemplo da via de síntese:
<formula>formula see original document page 63</formula>
C32H31N3O8 p.mol.: 585,60
CPP-MIC-SN38
Uma solução do CPP-SH (5,69 mmol), por exemplo DPV1047contendo uma cisteína na posição N-ter (21,49 g), em dimetilformamida (DMF) (200 mL) foi agitada por 5 minutos, à temperatura ambiente. Então, o 10-0-ligante-SN38 (5 g, 8,54 mmol) foi adicionado como um pó sólido amarelo. A mistura foi agitada por 3 horas à temperatura ambiente. A água foi adicionada (200 mL) e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (5 χ 150 mL) para remover o excesso de 10-O-Iigante-SN38. A camada aquosa foi armazenada a -80° C por 4 horas e então liofilizada. O conjugado CPP-ligante-SN38 foi armazenado a -20° C. O teor líquido do CPP-ligante-SN38 foi determinado por HPLC. A comparação com uma curva padrão SN38 (364 nm) permitiu o cálculo do teor líquido.mediada por 0-(1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio em N-metil-2-pirrolidinona. Após a extração com diclorometano e a remoção do N-metil-2-pirrolidinona por lavagens aquosas, o intermediário 10-0-ligante-hidroxicamptotecina foi isolado e purificado por precipitação a partir do diclorometano/ metil terc-butil éter.
Preparação da 10-Q-ligante-hidroxicamptotecina
A 10-hidroxicamptotecina e o "ligante" sofrem condensação
Exemplo da via de síntese:<formula>formula see original document page 64</formula>
10-O-BCH-hidroxicamptotecina C20H28N2O5 C40H42N4O9
p. mol: 376,45 p. mol: 722,78
Uma solução do ligante (16,47 mmol, por exemplo, 6,20 parao BCH) e 0-(1 H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio (HCTU) (6,53 g, 15,78 mmol) e diisopropiletilamina (DIPEA) (5,74 mL, 32,94 mmol) em N-metil-2-pirrolidinona (NMP) (50 mL) a 0°C foi agitada por 15 min. A esta mistura de reação foi adicionado o 10-hidroxicamptotecina (5 g, 13,72 mmol) como um pó sólido amarelo. A mistura foi agitada por 2 horas a 0°C. A solução foi recolhida em diclorometano (130 mL), extraída sucessivamente com NaCl 1M (3x130 mL) e então com ácido cítrico aquoso a 5% (3x130 mL). A camada orgânica foi adicionada lentamente (durante um mínimo de 30 minutos) ao metil ferc-butil éter (MTBE) (600 mL) a 0°C. O precipitado amarelo que formou foi então filtrado e seco em vácuo (200 mBar) durante a noite.
Acoplamento do CPPs ao 10-Q-ligante-hidroxicamptotecina
O 10-0-ligante-hidroxicamptotecina foi conjugado com o CPP para fornecer uma mistura do conjugado CPP-10-0-ligante-hidroxicamptotecina em dimetilformamida. O produto foi extraído em água e Iiofilisado para fornecer um sólido amarelo.O exemplo da via de síntese:
<formula>formula see original document page 65</formula>
C40H42N4O9
CPP-10-O-BCH
Uma solução do CPP-SH (4,61 mmol), por exemplo DPV1047contendo uma cisteína na posição N-ter (17,42 g), em dimetilformamida (200 ml) foi agitada por 5 minutos, à temperatura ambiente. Então, o 10-O-Iigante-hidroxicamptotecina (5 g, 6,92 mmol) foi adicionado como um pó sólido amarelo. A mistura foi agitada por 3 horas à temperatura ambiente. A água foi adicionada (200 mL) e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (5 χ 150 mL) para remover o excesso de 10-0-ligante-hidroxicamptotecina. A camada aquosa foi armazenada a -80°C por 4 horas e então liofilizada. O conjugado CPP-IO-O-Iigante-hidroxicamptotecina foi armazenado a -20°C. O teor líquido do CPP-IO-O-Iigante-hidroxicamptotecina foi determinado por HPLC. A comparação com uma curva padrão de 10-hidroxicamptotecina (364 nm) permitiu o cálculo do teor líquido.
Preparação do 20-Q-ligante Camptotecina #1
Exemplo da síntese da via:
<formula>formula see original document page 65</formula><table>table see original document page 66</column></row><table>
Uma solução do Iigante #1 (16,47 μιηοΙ, 2,78 mg) e do diciclohexilcarbodiimida (6,8 mg, 33 pmol) em 1 ml_ de diclorometano a O0C foi agitada por 12 horas. O precipitado formado (DCU, Ν,Ν'-diciclohexiluréia) foi removido por filtração e o filtrado foi adicionado à camptotecina (3,4 mg, 9,7 μιτιοΙ) e DMAP (2 mg, 16,47pmol), a 0°C. A mistura foi agitada por 4 horas a O0C e então foi extraída sucessivamente com NaCI 1 M (3 χ 1 mL) e com ácido cítrico a 5% (3x1 mL). A camada orgânica foi adicionada lentamente ao metil terc-butil éter (10 mL) a O0C. O precipitado amarelo que formou (20-0-ligante #1-camptotecina) foi então filtrado e seco em vácuo (200 mBar) durante a noite.
Acoplamento dos CPPs ao 20-0-ligante #1-camptotecina
Exemplo de síntese:
<formula>formula see original document page 66</formula>
Uma solução de CPP-SH (4,61 μπιοΙ), por exemplo, o DPV1047 contendo uma cisteína na posição N-terminal (16,6 mg), emdimetilformamida (1 mL) foi agitado por 5 min, à temperatura ambiente. Então, o 20-0-ligante #1 -camptotecina (3,4 mg, 7 μητιοΙ) foi adicionado como um pó amarelo sólido. A mistura foi agitada por 3 horas à temperatura ambiente. A água foi adicionada (1 mL) e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (5x1 mL) para remover o excesso de 20-0-ligante-camptotecina. A camada aquosa foi armazenada a -80°C 2h e então liofilizada. O conjugado CPP-20-0-ligante-camptotecina foi armazenado a -20°C. O teor líquido do CPP-20-0-ligante-camptotecina foi determinado por HPLC. A comparação com uma curva padrão da camptotecina (364 nm) permitiu o cálculo do teor líquido.
Preparação do 20-Q-ligante #5-camptotecina
Exemplo da via de síntese:
Camptotecina Iigante BCH 20-0-BCH-camptotecina
C20Hi6N2O4 C20H28N2O OH42N4O8
p. mol.: 348,35 p. mol.: 376,45 p. mol.: 706,78
A uma solução de camptotecina (10 mg, 28,7 μιτιοΙ) em diclorometano (10 mL) foi adicionado o DMAP (10,5 mg, 86,2 μιηοΙ) e o Iigante #5 (BCH, 21,6 mg, 57,7 μηιοΙ). A solução foi agitada por 5 minutos e então uma solução de EDC (11,1 mg, 57,7 μιτιοΙ) e trietilamina (12 μΙ, 86,2 μηηοΙ) em diclorometano (50,5 mL) foi adicionada. A mistura foi agitada por 18 horas à temperatura ambiente. A solução foi extraída sucessivamente com NaCI 1 M (3 χ 10 mL) e então com ácido cítrico aquoso a 5% (3 χ 10 mL). A camada orgânica foi evaporada até um volume de 1 mL ser obtido, e a solução foiadicionada lentamente (por um mínimo de 5 minutos) ao metil ferc-butil éter (20 ml_) a 0°C. O precipitado amarelo que formou foi então filtrado e seco em vácuo (200 mBar) durante a noite.
Acoplamento dos CPPs ao 20-Q-ligante #5-camptotecina
Exemplo de via de síntese:
<formula>formula see original document page 68</formula>
Uma solução do CPP-SH (4,61 mmol), por exemplo DPV1047 contendo uma cisterna na posição N-terminal (16,6 g), em dimetilformamida (1 ml) foi agitada por 5 minutos, à temperatura ambiente. Então, o 20-0-ligante-camptotecina (5 g, 7 μηηοΙ) foi adicionado como um pó sólido amarelo. A mistura foi agitada por 3 horas à temperatura ambiente. A água foi adicionada (1 mL) e a camada aquosa foi extraída com diclorometano (5 χ 1 mL) para remover o excesso de 20-0-BCH-camptotecina. A camada aquosa foi armazenada a -80°C por 2 horas e então liofilizada. O conjugado CPP-20-BCH-camptotecina foi armazenado a -20°C. O teor líquido do CPP-20-0-ligante-camptotecina foi determinado por HPLC. A comparação com uma curva padrão de camptotecina (364 nm) permitiu o cálculo do teor líquido.
Estudo de Estabilidade De modo a testar o impacto do Iigante na estabilidade do conjugado, diferentes conjugados foram sintetizados com o mesmo CPP, mas com Iigantes diferentes.CPP#2-SN38
<formula>formula see original document page 69</formula>
CPP-LIGANTE #3-SN38
<formula>formula see original document page 69</formula>
CPP-LIGANTE #4-SN38
<formula>formula see original document page 69</formula>
CPP-LIGANTE #5-SN38
<formula>formula see original document page 69</formula>CPP-ugante #6-SN38
A estabilidade dos conjugados foi testada no plasma citrado (tampão de citrato de sódio a 10% (v/v), 0,106 M) de espécies diferentes (vide Tabela 1 abaixo). Os conjugados a 2,55 μΜ foram incubados a 37°C no plasma. As amostras foram analisadas utilizando o método de HPLC fluorescente descrito abaixo (vide equipamento e condições cromatográficas) seguindo a extração do TFA/ acetonitrila e a quantidade de camptotecina livre, seus análogos ou derivados (por exemplo, SN38) liberados pelos conjugados foram medidos.
Equipamento ε Condições Cromatográficas 150 μΙ de cada amostra foi colocada em 1,5 ml de tubos de microcentrífuga. Foi adicionado 450 μΙ de TFA a 5% (v/v) em H2O para cada tubo e a mistura foi agitada em vórtex por 5 segundos. As amostras foram então centrifugadas a 16.000 g, 3 minutos a + 4o C. 100 μΙ do sobrenadante foram colocados em 1,5 mL de tubos de microcentrífuga. O metanol (100 μΙ) foi então adicionado imediatamente e agitado em vórtex por 5 segundos. As amostras foram então centrifugadas a 16.000 g, 3 minutos à temperatura ambiente.Foram recuperados 150 μΙ do sobrenadante para a análise em HPLC. Os conjugados, metabólitos e derivados de camptotecina (isto é, SN38) foram separados por cromatografia líquida de alta performance (HPLC; Agilent 1100 series equipado com um detector fluorescente) utilizando uma coluna Luna C 18(2) (Phenomenex ref. 00D-4251-E0, Le Pecq1 França) de 4,6 χ 100 mm (tamanho de partícula de 3 μηη). O componente aquoso da fase móvel (A) era TFA a 0,1% (v/v) em água. O modificador orgânico (B) era a acetonitrila contendo TFA a 0,1% (v/v). Para o conjugado e seus metabólitos, um gradiente de eluição aumentando linearmente na proporção de B de 15 a 37% em 2 min, de 37 a 47% em 6 min, seguido por 2 min a 90% foi aplicado com uma velocidade de fluxo constante de 1,2 ml_/ min. A proporção de B foi então retornada à condição inicial por 3,0 min.
Tabela 1
Tempo de Meia Vida (em Minutos) do ligante DPV1447-SN38 em Plasma a 37°C
<table>table see original document page 71</column></row><table>
A meia vida do conjugado corresponde ao tempo necessário para possuir 50% em mol de camptotecina livre, seus análogos ou derivados liberados pelos conjugados da presente invenção. No plasmahumano, o tempo de meia vida do conjugado Iigante DPV1047 #1-SN38 (menos de 5 min) foi mais curta do que o conjugado Iigante DPV1047 #2-SN38 (6-7 min), que, por sua vez, era mais curta do que aquela do conjugado ligante DPV1047 #3-SN38 (12 min). O conjugado mais estável foi verificado como sendo o ligante DPV1047 #5-SN38 (400 min), sendo seu tempo de meia vida 60 vezes mais longo do que o conjugado Iigante DPV1047 #2-SN38. O conjugado que compreende o Iigante #5 também é o mais estável em plasma de rato.
III Determinação da Eficácia de Quatro Conjugados CPP-MIC-SN38 em Humanos HCT116 do Modelo do Tumor de Còlon Xenoenxertado
Implantado em Camundongos Nude (atímico) Um estudo de eficácia antitumoral foi realizado para identificar o conjugado Iigante CPP #2-SN38 de interesse (os conjugados foram gerados conforme definido no Exemplo I.4), utilizando um cronograma de administração Q4Dx3 (uma injeção a cada quatro horas repetido três vezes) em fêmeas de camundongos atímico NMRi (6 semanas de idade) (Janvier, França) que carregava tumores HCT 116 de origem humana. As células tumorais HCT 116 (ATCC Number: CCI-247) foram estabilizadas por uma implantação intradérmica de suspensões de células na costela direita do camundongo. A primeira injeção da droga foi realizada no dia 3 após a implantação da célula tumoral, quando os tumores atingiram um tamanho de cerca de 100 mm3 (calculado com a seguinte fórmula: [comprimento χ largura]/2), os camundongos foram randomizados em grupos de 6 e foram tratados com o CPP-MIC-SN38 em sua Dose Máxima Administrável (MAD) previamente determinada por injeção intravenosa do bolus a 10 pL/g na veia lateral da cauda seguindo um cronograma de administração Q4Dx3.
O T/C% mínimo reflete a inibição do crescimento do tumormáxima obtida.
Durante e seguinte ao tratamento dos sinais clínicos, o peso corporal e o tamanho do tumor foram registrados de modo a avaliar a eficácia e a toxicidade dos conjugados injetados. A razão da porcentagem dos volumes do tumor médios da droga tratada versus os grupos tratados veículo (T/C χ 100) e a inibição do crescimento tumoral (%TGI) definidos como 100/T/C (%) foram utilizados para avaliar a eficácia do tratamento.
Os parâmetros terapêuticos de quatro conjugados CPP-MIC-SN38 estão resumidos na Tabela 2 abaixo.
Tabela 2
Eficácia de Quatro Conjugados CPP-MIC-SN38 em um Modelo de Tumor Carcinoma Colorretal humano HCT116 Implantado Intradermicamente emCamundongo atímico
<table>table see original document page 73</column></row><table>
***: p<0,001 contra o controle (teste Dunett)
D = dia quando o T/C mínimo é atingido
Três dos conjugados CPP-MIC-SN38 (DPV15b-MIC-SN38,DPV15-MIC-SN38 e DPV1047-MIC-SN38) exibiram atividade antitumoral significativa (TGI = 60 a 63%) comparado à solução salina controle, enquanto o conjugado DPV3-MIC-SN38 exibiu apenas uma atividade antitumoral moderada (TGI = 32 %) no modelo de tumor HCT 116. Não foram observados sinais clínicos de toxicidade, tal como perda de peso corpóreo, diarréia ou alopecia durante o estudo quando os conjugados CPP-MIC-SN38 foram administrados em seus MADs.
Os conjugados administráveis em altos níveis de doses (30 a 50 μιτιοΙ/ kg) exibiram a maior atividade antitumoral comparado à solução salina controle conforme demonstrado com DPV15b-MIC- SN38, DPV15-MIC-SN38 e DPV1047-MIC-SN38.
IV Avaliação da influência da estabilidade do ligante na eficácia terapêutica dos conjugados CPP- ligantes SN38 no modelo de tumor de Colon Xenoenxertado Implantado em Camundongos Atímicos ou Modelo de Tumor de Colon Xenoenxertado LS174T Humano Implantado em Ratos
Atímicos
A influência da estabilidade do ligante na eficácia do ligante CPP-SN38 foi avaliada em dois modelos xenoenxertados. Os Iigantes foram selecionados com base em sua estabilidade do plasma in vitro: o ligante MIC (ligante #2) era relativamente instável no plasma humano, enquanto que o ligante BCH (ligante #5) mostrou alta estabilidade no plasma humano. Quatro conjugados, DPV15-MIC-SN38, DPV1047-MIC- SN38, DPV15-BCH-SN38 e DPV1047-BCH-SN38, foram caracterizados em camundongos. Dois conjugados, DPV1047-MIC-SN38 e DPV1047-BCH-SN38, foram caracterizados em ratos.
A implantação e o crescimento tumoral HTC 116 foi realizado conforme descrito no Exemplo III. No dia da primeira injeção, os camundongos foram randomizados em grupos de 6 e foram tratados comos conjugados do CPP-ligante-SN38 na mesma dose equimolar (30 μηιοΙ/kg) por injeção intravenosa do bolus a 10 μί/g na veia lateral da cauda seguindo um cronograma de administração Q4Dx3 (uma injeção a cada quatro dias, três vezes).
O estudo LS 174T foi realizado utilizando ratos fêmeasatímicas (8 semanas de idade) adquiridas pelo centro de reprodução Harlan (Gannat, França). Os tumores LS 174T foram estabilizados por uma implantação subcutânea de suspensões de células (número ATCC: CCI- 188) na costela direita dos animais. A primeira injeção da droga foi realizada quando os tumores atingiram um tamanho de cerca de 100 mm3. O volume do tumor foi calculado utilizando a seguinte fórmula: [comprimento χ largura2]/2. No dia da primeira injeção, os ratos foram randomizados em grupos de 8 e foram tratados com o conjugado CPP-MIC-SN38 em sua MAD previamente determinada por injeção intravenosa do bolus a 10 μL na veia lateral da cauda seguindo um cronograma de administração Q3/4Dx5 (a cada três ou quatro dias, cinco vezes).
Durante o curso do experimento, os sinais clínicos, peso corporal e o tamanho do tumor foram controlados duas vezes por semana. A razão da porcentagem dos volumes do tumor médios dos grupos tratados versus os tratados com veículo (controle) (T/C χ 100) e a inibição do crescimento tumoral (%TGI) definidos como 100/T/C foram utilizados para avaliar a eficácia do tratamento.
A %T/C mínima reflete a inibição do crescimento tumoral máxima obtida.
Os parâmetros terapêuticos de quatro conjugados CPP-MIC-SN38 em camundongos que carregam o tumor HCT 116 estão resumidos na Tabela 3.Tabela 3
Influência dos Dois Ligantes Químicos na Eficácia do Ligante Conjugado CPP-SN38 em um Modelo de Tumor Carcinoma Coloretal Humano HCT116 Implantado Intradermicamente em Camundongos Atímicos
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***: p<0,001 versus o controle (teste Dunett)
D = dia em que o T/C mínimo é atingido Todos os quatro conjugados mostraram eficácia antitumoral significante no modelo de tumor HCT 116. O DPV1047-BCH-SN38 (TGI = 80%) era significativamente mais ativo do que o DPV1047-MIC-SN38 (TGI = 60%), DPV15-BCH-SN38 (TGI = 61%) e mais ativo do que o DPV15-MIC-SN38 (TGI = 63%).
Não foram detectados sinais clínicos de toxicidade, tais como perda de peso corpóreo, diarréia ou alopecia durante o estudo quando os conjugados CPP-MIC-SN38 ou CPP-BCH-SN38 foram administrados emseus MADs.
A eficácia dos dois Iigantes conjugados DPV1047- SN38 em ratos que carregam o tumor LS 174T está apresentada na Tabela 4.
Tabela 4
<table>table see original document page 77</column></row><table>
***: p<0,001 contra o controle (teste Dunett) D = dia em que o T/C mínimo é atingido
Ambos o DPV1047-MIC-SN38 and DPV1047-BCH-SN38 (TGI = 56 to 57%) mostraram a mesma atividade antitumoral significativa no modelo de tumor LS 174T.
Não foram detectados sinais clínicos de toxicidade, tais como perda de peso corpóreo, diarréia ou alopecia durante o estudo quando os conjugados CPP-MIC-SN38 ou CPP-BCH-SN38 foram administrados em seus MADs.
No camundongo que carrega o tumor, o DPV1047-BCH-SN38 era o mais ativo dos quatro conjugados testados. Nos ratos que carregam o tumor DPV1047-MIC-SN38 e D PV1047-BCH-SN38 exibiam a mesmaatividade.
V Eficácia Comparativa do Conjugado DPV1047-BCH-SN38 e outros derivados SN38 no modelo de tumor de cólon HCT 116 humano implantado em camundongo ATÍMICO
A atividade do conjugado DPV1047-BCH-SN38 (= DPV1047-ligante #5-SN38) e dos derivados SN38 utilizando outros sistemas de fornecimento que permitem a solubilização da molécula ativa foram comparados. O DPV1047-BCH-SN38 (mostrado acima como possuindo a maior eficácia in vivo de todos os CPPs e Iigantes testados), foi comparado com o: irinotecan, pró-droga comercial solúvel do SN38 (Campto®, Aventis) e o conjugado (ácido glutâmico) 16Cys-MIC-SN38 (PolyE(16)-MIC- SN38). O peptídeo PolyE(16) foi selecionado como um peptídeo que penetra na célula de acordo com a presente invenção e por causa de sua biocompatibilidade, propriedades não tóxicas, hidrofilicidade e propriedades de solubilização.
A implantação e o crescimento tumoral HTC 116 foi realizado conforme descrito acima. O dia da primeira injeção do camundongo foi randomizado em grupo de 6 e foram tratados com conjugados diferentes seguindo suas condições de administração ótima (vide Tabela 5) pela injeção intravenosa do bolus a 10 μΙ/g na veia lateral da cauda.
Durante o curso do experimento, os sinais clínicos, peso corporal e o tamanho do tumor foram controlados duas vezes por semana. A razão da porcentagem dos volumes do tumor médios dos grupos tratados com a droga versus os tratados com veículo (T/C χ 100%) e a inibição do crescimento tumoral (%TGI) definidos como 100/T/C (%) foram utilizados para avaliar a eficácia do tratamento.
A %T/C mínima reflete a inibição do crescimento tumoral máximaobtida.
Os parâmetros terapêuticos dos diferentes conjugados SN38 estão resumidos na Tabela 5.Tabela 5
Eficácia Comparativa do Conjugado DPV1047-BCH-SN38 e outros Derivados do SN38 em um Modelo de Tumor Carcinoma Coloretal Humano HCT116 Implantado Intradermicamente em Camundongo atímico
Tabela 5
<table>table see original document page 79</column></row><table>
***: p<0,001 contra o controle (teste Dunett) D = dia em que o T/C mínimo é atingido
O DPV1047-BCH-SN38 exibiu um TGI similar, seja qual for o cronograma de administração no modelo de tumor HCT 116. O cronograma Q2D3x3W induziu uma atividade mais prolongada do que outros cronogramas.
O PolyE(16)-MIC-SN38, embora administrado em um nível de dose elevado (40 μηιοΙ/ kg) utilizando o cronograma de administração Q4Dx3, não foi ativo neste modelo. A solubilização do SN38 por conjugação com a seqüência peptídica hidrofílica PolyE(16) não foi suficiente para permitir o fornecimento eficaz do SN38 em uma forma ativa in vivo.
O DPV1047-BCH-SN38 e o irinotecan exibiram a melhor eficácia seguindo um cronograma Q2D3x3W que resultou em uma inibição do crescimento tumoral prolongada com um T/C% mínimo após 28 dias.Nos estudos de eficácia em camundongos, o irinotecan mostrou uma atividade similar ao do DPV1047-BCH- SN38, seja qual for o cronograma de administração. Nos camundongos, a conversão do irinotecan para SN38 é significativamente maior do que em humanos, devido à variação interespécie nas carboxilesterases, portanto, a eficácia do irinotecan é superestimada em modelos de camundongos (J. Thompson et ai, BBA 1998; 1400: 301 - 319).
Não foram detectados sinais clínicos de toxicidade, tais como perda de peso corpóreo, diarréia ou alopecia durante o estudo quando o conjugado DPV1047-BCH-SN38 foi administrado em seu MAD. Vl Toxicidade Comparativa de Estudos de Farmacocinética do DPV1047-BCH-SN38. DPV1047- MIC-SN38 e Irinotecan no cachorro
As toxicidades intestinal e hematológicas dos conjugados Iigantes DPV1047- SN38 comparadas ao irinotecan, foram avaliadas no cão beagle. P cachorro é um modelo apropriado na medida em que o metabolismo do irinotecan nesta espécie é similar àquela em humanos (M. Inaba et ai, Câncer Chem. Pharmacol. 41: 130 - 108 (1998)) e porque o cão demonstra os mesmos sintomas de diarréia prolongada conforme observado em humanos.
Cães beagle fêmeas e machos adultos foram hospedados individualmente com livre acesso à água corrente. Uma dieta de pellets foi distribuída diariamente. Os cães (1 cachorro para cada droga e dose) foram infundidos intravenosamente através da veia cefálica ou safena. Estas infusões intravenosas foram realizadas utilizando um cateter de uso único (Intraflon®) e uma seringa plástica conectada a uma bomba da seringa. Durante e injeção, os mamíferos foram colocados em uma maca.
O DPV1047-BCH-SN38 (DPV1047-ligante #5-SN38) foiadministrado a 5, 10 e 20 mg/kg por uma infusão de 45 min (0,3 a 0,4 mL/min). O DPV1047-MIC-SN38 (DPV1047-linker #2-SN38) foi administrado a 10 e 20 mg/kg por uma infusão de 20 min e a 50 e 70 mg/kg por uma infusão de 45 min(0,3 a 0,4 mL/min). O irinotecan (grau clínico) foi injetado em sua Dose Máxima Tolerada (MTD), isto é, 30 mg/kg (F. Lavelle et ai, Seminarin Oncology (1996)) por uma infusão de 20 min (0,3 a 0,4 mL/min). Os conjugados foram dissolvidos em água para injeção (10% do volume final) e diluído com NaCI a 0,9% em sua concentração final. O volume administrado em cada animal foi ajustado de acordo com o peso corporal.
Os sinais clínicos, toxicidades hematológicas e intestinais foram monitorados durante um período de 15 dias após a infusão. Cada animal foi verificado pelo menos duas vezes quanto à mortalidade ou sinais de morbidez.
O peso corporal de cada animal foi registrado nos dias 1,4, 10 e13. As amostras de sangue periférico foram recolhidas em tubos com EDTA para a determinação dos seguintes parâmetros nos dias 1, 5, 11 e 14: eritrócitos, hemoglobina, volume celular médio, packed cell volume, concentração de hemoglobina celular média, hemoglobina celular média, trombócitos, leucócitos, contagem celular branca diferencial com morfologia celular.
O cão tratado com o irinotecan exibiu os sinais clínicos clássicos da toxicidade de irinotecan (F. Lavelle I, Seminar in Oncology, 1996): inicialmente (Dia 1) e posteriormente diarréia (Dias 4 a 6), perda de peso corporal (-8,5%), êmese e hematotoxicidade severa, porém reversível foram relatados no Dia 5 (92% de depleção dos glóbulos brancos, vide Tabela 6 abaixo).
Os cães tratados com DPV1047-BCH-SN38 a 5 e 10 mg/kg não mostraram sinais clínicos e apenas uma diminuição moderada, mas não dose dependente na contagem dos glóbulos brancos (WBC), conforme foi observado para muitas moléculas citotóxicas abaixo de seus MTD. A 20 mg/kg de DPV 1047- BCH-SN38, uma diminuição significativa nos glóbulos brancos (93% de redução nos WBCs) foi observada, junto com uma diminuição na ingestãoalimentar sugerindo que a dose máxima tolerada (MTD) tinha sido atingida. A 30 mg/kg, o DPV1047-BCH-SN38 mostrou sinais toxicológicos claros incluindo a diarréia e a hematotoxicidade severa.
Os cães tratados com DPV1047-MIC-SN38 a 10, 20, 40 e 50 mg/kg não mostraram sinais clínicos e apenas uma redução moderada nos glóbulos brancos (WBC). O DPV1047-MIC-SN38 a 70 mg/kg mostrou sinais de toxicidade que incluíam: toxicidade gastrointestinal, diarréia e êmese. Uma hematotoxicidade severa foi relatada (94% de depleção de WBC).
Estes resultados indicam que o MTD para o DPV1047-BCH-SN38 é de cerca de 20 mg/kg (2,6 mg equivalente de SN38) e entre 50 e 70 mg/kg (6,5-9,1 mg equivalente de SN38) para DPV10 47-MIC-SN38. O DPV1047-BCH-SN38 é, consequentemente mais tóxico do que DPV1047- MIC-SN38.
Os estudos de toxicidade no cão beagle de dois conjugados diferentes SN38 estão resumidos na Tabela 6.
Tabela 6
Estudos de Toxicidade no Cão Beagle Seguindo a Infusão de Irinotecan.
<table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table>
WBC, glóbulos brancos, dia D.
Como parte destes estudos, a farmacocinética do DPV1047-BCH-SN38, DPV1047-MIC- SN38, irinotecan e seus metabólitos principais foram comparados. As amostras de sangue periférico foram recolhidas em tempos diferentes seguindo a infusão em tempos diferentes para a análise farmacocinética. Para o irinotecan e o DPV1047-MIC-SN38 a 10 e 20 mg/kg, o sangue foi testado no tempo 0 (antes da infusão), pouco antes do final da infusão (20 minutos) e 10, 20, 40, 220, 460 minutos após o final da infusão. Para todos os outros grupos, o sangue foi testado no tempo 0 (antes da infusão), pouco antes do final da indução (45 minutos) e 10, 20, 40, 120, 220 minutos após o final da infusão.
As amostras de sangue (2,5 ml_) foram coletadas em 5 ml_ em tubos de citrato de trissódio (Sarstedt S- Monovette® 9NC) contendo 2,5 mL de TFA a 5% (v/v) e agitadas em vórtex por 5 segundos antes de armazenar a 80°C (por menos de duas semanas).As amostras foram então analisadas após uma extração com TFA e acetonitrila por um método de fluorescência HPLC1 descrito abaixo. Eles foram derretidos em um banho de água à temperatura ambiente por 5 minutos, diluídos duas vezes com 5 mililitros de HaO1 contendo TFA a 2,5% (v/v). As amostras de sangue total foram acidificadas com TFA para proteger a ligação éster do conjugado contra a hidrólise e permitir a precipitação da proteína para melhorar o conjugado e a recuperação do SN38.
500 microlitros de cada amostra foram então colocados em 1,5 mL de tubos de microcentrífuga e centrifugados a 16.000 xg 3 min a +4° C. 100 μl do sobrenadante foram colocados em 1,5 mL de tubos de microcentrífuga seguido por 20 μl de solução de camptotecina a 1,12 μg/ml recém preparada (padrão interno; mantido a +4° C em um banho de água gelada por não mais que 4 horas). O metanol (100 μl) foi então adicionado imediatamente e a mistura agitada vigorosamente (em vórtex) por 5 segundos. As amostras foram então centrifugadas a 16.000 xg, 3 minutos à temperatura ambiente.
Foram recuperados 150 μl do sobrenadante para a análise em HPLC.
Análise em HPLC
O DPV1047-BCH-SN38 e seus metabólitos SN38 foram separados por cromatografia líquida de alta performance (HPLC Agilent 1100 com um detector fluorescente) utilizando o seguinte método:
- Solvente A : TFA a 0,1% (v/v) em H2O,
- Solvente B : TFA a 0,1% (v/v) em acetonitrila
- Coluna: Luna, C18(2), 3 μΜ, 100 χ 4,6 mm (Phenomenex ref. 25 00D-4251-E0)
- Eluição: 15-37% de B em 2 min, 37-47 em 6 min, a 90% de B em 0,5 min, seguido por 2 min a 90% de B. 15% de B por 2 min.
- Volume injetado: 100 μl- Velocidade de fluxo: 1,2 mL/min
- Detecção: fluorescência; excitação a 375 nm, emissão a 560 nm (sensibilidade 18).
O DPV1047-MIC-SN38, irinotecan e seus metabólitos SN38 foram separados por cromatografia líquida de alta performance (HPLC Agilent 1100 com um detector fluorescente) utilizando o seguinte método:
- Solvente A : TFA a 0,1% (v/v) em H2O1
- Solvente B : TFA a 0,1% (v/v) em acetonitrila
- Coluna: Luna1 C18(2), 3 μΜ, 100 χ 4,6 mm (Phenomenex ref. 00D-4251-E0)
- Eluição: 15-50% de B em 10 min, a 90% de B em 0,5 min, seguido por 2 min a 90% de B. 15% de B por 2 min.
- Volume injetado: 100 μΙ_
- Velocidade de fluxo: 1,2 mL/min
- Detecção: fluorescência; excitação a 375 nm, emissão a 560 nm
>,% (sensibilidade 18).
A Figura 1 compara a exposição do sangue (AUC) ao SN38 depois da infusão de DPV1047-BCH-SN38 e DPV1047-MIC-SN38 em doses diferentes comparadas ao irinotecan a 30 mg/kg. Em doses não tóxicas de DPV1047-BCH-SN38 (as doses < 20 mg/kg) e DPV1047-MIC-SN38 (dose < % 50 mg/kg), ambos o Cmax e o AUC SN38 aumentaram linearmente com a dose do conjugado. Seguinte a infusão do irinotecan a 30 mg/kg (seu MTD), o AUC do SN38 (metabólito ativo do irinotecan) é mais do que 80 vezes menor do que o AUC do SN38 depois da infusão do DPV1047-MIC-SN38 ou DPV1047-BCH- SN38 em doses ao redor de seus respectivos MTDs. Em contraste ao irinotecan, o conjugado DPV1047-ligante-SN38 forneceu quantidades significativamente maiores do metabólito ativo, SN38, no sangue em doses não tóxicas. O AUC do SN38 é significativamente maior depois da infusão deDPV1047-BCH-SN38 em comparação com o DPV1047-MIC-SN38 em uma dose equimolar (Figura 1).
O tempo de meia vida do DPV1047-BCH-SN38 no sangue é maior do que o do DPV1047-MIC-SN38 e, como conseqüência, o AUC do SN38 fornecido pelo DPV1047-BCH- SN38 é maior do que aquele liberado pelo DPV1047-MIC-SN38 (Figura 2). A maior toxicidade observada com o DPV1047-BCH-SN38 se correlaciona bem com o maior AUC da molécula ativa (citotóxica), SN38.
Os estudos de toxicidade em cães mostraram que o conjugado DPV1047-BCH-SN38 é mais tóxico do que o conjugado DPV1047-MIC-SN38.
Ambos os conjugados BCH e o MIC exibem o mesmo perfil de toxicidade caracterizado pela toxicidade gastrointestinal e a hematotoxicidade. O MTD do conjugado BCH é de cerca de três vezes menor do que o conjugado MIC, mas se correlacionar bem como a liberação de significativamente mais SN38 do conjugado BCH. Um aumento da dose dependente no AUC foi observado quando o DPV1047-BCH-SN38 foi injetado em doses entre 5 - 20 mg/kg e q uando o DPV1047-MIC-SN38 foi injetado ente 10-50 mg/kg.
Estes resultados demonstram que os conjugados DPV1047-ligante-SN38 são capazes de fornecer significativamente mais SN38 circulante do que o irinotecan com toxicidade significativamente reduzida. Isto é extremamente importante porque é bem conhecido que a intensificação da dose com o irinotecan em humanos melhora a resposta ao tratamento devido à maior exposição ao metabólito ativo, SN38, (de Jonge M. J., et ai, J Clin Oncol, 18: 195 - 203, 2000; Ychou1 M., et a!., Câncer Chemotherapy And Pharmacology, 50: 383 - 391, (2002)), e porque tal intensificação da dose é raramente possível devido à toxicidadedose Iimitante do irinotecan.
Vll Avaliação da Eficácia in vivo do Conjugado DPV1047-BCH-SN38 em uma Gama de Modelos de Tumores Humanos Implantados em Roedores
A atividade do conjugado DPV1047-BCH-SN38 foi avaliada em uma série de modelos de tumor diferentes de modo a determinar a aplicabilidade deste conjugado em uma ampla gama de tipos de tumores. Cinco modelos de tumor humano foram selecionados: o modelo de carcinoma colorretal HCT 116 (ATCC número: CC1-247), o modelo de carcinoma colorretal LS 174T (ATCC número: CCI-188), o modelo de carcinoma colorretal HT-29 (ATCC número: HTB-38), o carcinoma de pulmão NCI-H460 (ATCC número: HTB- 177) e os modelos de carcinoma de mama MD A-MB-231 (ATCC número: HTB-26).
Os tumores HCT 116, HT-29, NCI-H460 e o MD A-MB-231 foram estabilizados por um implante de células intradérmico ou subcutâneo na costela direita de um camundongo atímico NMRi fêmea de 7 semanas (1 χ 107, 1 χ 107, 3 χ 106 e 3 χ 106 células injetadas, respectivamente) (Janvier, França). As células tumorais LS 174T foram implantadas em ratos Rh rnu/rnu atímico (2 χ 107 células). Os tratamentos foram iniciados quando os tumores tinham atingido um tamanho de 100 mm3 em camundongos ou 1000 mm3 em ratos (calculado utilizando a seguinte fórmula: [comprimento χ largura2]/2). No dia da primeira injeção, os animais foram randomizados em grupos diferentes (6 ou 8 animais por grupo) e o DPV1047-BCH-SN38 foi dissolvido em solução salina foi fornecido por injeção intravenosa do bolus (i.v.) a 10 μί/g na veia lateral da cauda (Tabela 7).
Durante o curso do experimento, os sinais clínicos, peso corporal e o tamanho do tumor foram controlados duas vezes por semana. A razão da porcentagem dos volumes do tumor médios dos grupos tratados com a drogaversus os tratados com veículo (T/C χ 100%) e a inibição do crescimento tumoral (%TGI) definidos como 100/T/C foram utilizados para avaliar a eficácia do tratamento.
O T/C% mínimo reflete a inibição do crescimento do tumor máxima obtida.
A eficácia do conjugado DPV1047-BCH-SN38 em diferentes modelos de tumores é resumida na Tabela 7.
Tabela 7
Avaliação da Eficácia do Conjugado DPV1047-BCH-SN38 em Diferentes Modelos de Tumor Humano Implantados Intradermicamente ouSubcutaneamente em Roedores
<table>table see original document page 88</column></row><table>
*: p<0,05, ***: p<0,001 controle comparativo (teste Dunnett)
Dia = dia no qual o T/C mínimo é atingido
O conjugado DPV1047-BCH-SN38 (= DPV1047-linker #5-SN38) exibiu um nível significativo de atividade antitumoral em todos os modelos de câncer colorretal, pulmão e mama testados, demonstrando que o DPV1047-BCH-SN38 possui atividade em uma ampla gama de tumores humanos. Além disso, quando doses diferentes foram testadas, uma eficácia dependente da dose foi observada.
Vll Avaliação da Eficácia in vivo do Conjugado DPV1047-BCH-SN38 em Combinação com o Bevacizumab ou o 5-Fluorouracil O iritotecan tem mostrado clinicamente possuir efeitos sinérgicos com os agentes, tais como o 5-fluorouracil (5-FU) (Teva® Pharma) e o bevacizumab (Avastin®, Roche). A combinação destes estudos foi, portanto, realizada para avaliar a ação do DPV1047-BCH-SN38 em combinação com estes agentes. Os camundongos foram implantados com os tumores HT-29 e tratados pela administração intraperitoneal (bevacizumab) ou a injeção intravenosa do bolus (5-FU ou DPV1047-BCH-SN38) a 10 μΐ/g. As doses subótimas experimentalmente definidas do DPV1047-BCH-SN38, 5-FU e bevacizumab, foram administradas seguindo os cronogramas estabelecidos por Prewett et al., Clin Câncer Res. Maio; 8(5): 994 - 1003 (2002) e Azrak et al., Clin Câncer Res. Fevereiro 1 ;10(3): 1121 - 9. (2004). A proporção T/C foi calculada seguindo o tratamento com o bevacizumab, 5-FU ou DPV1047-BCH-SN38. Estas proporções T/C fora utilizadas para avaliar o T/C esperado para o tratamento combinado com o bevacizumab e o DPV1047-BCH-SN38, ou 5-FU e DPV1047-BCH-SN38 (T/C de DPV1047-BCH-SN38 χ T/C do bevacizumab ou 5-FU). O T/C observado seguindo a combinação do tratamento foi definido experimentalmente. O índice de combinação das duas moléculas foi calculado pela divisão do T/C esperado pelo T/C observado. Um índice >1 demonstra u m efeito sinérgico, um índice de cerca de 1 indica um efeito aditivo e um índice <1 indica um efeitoantagonista. Os resultados destes experimentos estão resumidos na Tabela 8.
Tabela 8
Avaliação do Efeito Sinérgico do DPV1047-BCH-SN38 em Combinação com o Bevacizumab no Modelo de Tumor HT-29
<table>table see original document page 90</column></row><table>
* T/C esperado = DPV1047-BCH-SN38 T/c χ droga de referência; $índice de combinação = T/C esperado / T/C observado
Nestes experimentos, o DPV1047-BCH-SN38 aumentou a eficácia antitumoral em combinação com o 5-FU ou o bevacizumab. Para o 5-FU, o efeito da combinação foi sinérgica (índice de combinação > 1), enquanto que para o bevacizumab, o efeito da combinação foi aditivo (índice de combinação de cerca de 1).
IX Avaliação da Atividade in vitro ε in vivo do DPV1047-BCH-SN38-TFA Comparado com o DPV1047-BCH-SN38-HC1
A eficácia e a toxicidade de ambos os compostos DPV1047-BCH-SN38-TFA e o DPV1047-BCH-SN38-HC1 foram então comparados.
O cloreto de DPV1047-BCH-SN38 (DPV1047-BCH-SN38-HC1)foi formado por cromatografia de troca iônica do DPV1047-BCH-SN38-TFA. A Amberlite IRA-410 resina de troca iônica (475g) (FIuka) foi suspensa em HCI 2N por 30 min. A resina foi então carregada em uma coluna e lavada com água. 24 g de DPV1047-BCH-SN38-TFA foram dissolvidos em 125 mL de água, carregado em uma coluna e eluído com água. A concentração de DP V 1047- BCH-SN38-HC1 nas diferentes frações foi determinada por absorbância UV a 364 nm, utilizando um Espectrofotômetro HIACHI U-2000. As frações relevantes foram então unidas, congeladas e liofilizadas. O conjugado DPV1047-BCH-SN38HC1 foi então armazenado a -20°C sob argônio. Não foi observada diferença na eficácia entre das duas formas do sal de DPV1047-BCH-SN38; os estudos de citotoxicidade in vitro e eficácia in vivo no modelo de adenocarcinoma de pulmão NCI-H460 (ATCC Número: HTB-177) confirmou que o DPV1047-BCH-SN38-HC1 manteve atividade com um T/C ótimo in vivo de 2 2,9% e 1 8,4% para o DPV 1047-BCH-SN38-TFA e o DPV1 047- BCH -SN38-HC1, respectivamente (vide Tabela 9).
Tabela 9
Avaliação da Eficácia in vitro (IC50) ε in vivo do DPV1047-BCH-SN38-TFA e DO DPV1047-BCH-SN38-HC1
<table>table see original document page 91</column></row><table>**ρ<0,01, **ρ<0,001 versus controle (teste Dunnett) X Avaliação da Solubilidade do DPV1047-BCH-SN38 A solubilidade do DPV1047-BCH-SN38 (= DPV1047-ligante #5-SN38), em água, foi revelada como sendo muito maior do que aquela do SN38 ou do irinotecan: DPV1047-BCH-SN38HC1 > 1 g/mL, irinotecan < 2,5 mg/mL e SN38 < 5pg/mL.
Xl Avaliação da Estabilidade ε da Eficácia in citro de uma Gama de Derivados de Ligantes CPP Camptotecina
Os estudos toxicocinéticos comparativos no cão mostraram que a estabilidade do Iigante entre o DPV 1047 e o SN38 correlaciona com um aumento no AUC do plasma do SN38 (Vide o Exemplo VI).
Portanto, os estudos executaram a avaliação da estabilidade in vitro de diferentes derivados de CPP-ligante-camptothecin. Os conjugados foram sintetizados com CPPs diferentes, os Iigantes diferentes e duas camptotecinas: SN38 ou 10-hidroxicamptotecina.
Conjugados CPP-ligante-SN38:
- DPV1047-ligante #5-SN38;
- DPV1047- Iigante #1-SN38;
- Penetratina- Iigante #5-SN38;
- Penetratina- Iigante #1-SN38;
- DPV7- Iigante #5-SN38;
- Tat- Iigante #5-SN38;
- DPV1047D-Hnker #5-SN38;
- DPV51 D-Hnker #5-SN38;
- Conjugados de CPP- Iigante - 10-hidroxicamptotecina:
- Penetratina- Iigante #5-10-hidroxicamptotecina;
- Penetratina- Iigante #1-10-hidroxicamptotecina (descrito no pedido de patente WO 00/01417);- DPV 1047- ligante #5-10-hidroxicamptotecina;
- DPV 1047- ligante #1-10-hidroxicamptotecina;
- Tat- ligante #4-10-hidroxicamptotecina;
- Tat- ligante #7-10-hidroxicamptotecina.
Como no Exemplo II, a estabilidade destes conjugados foi testadano plasma humano ou do cão. Depois da incubação a 37° C, as amostras foram analisadas após uma extração por acetonitrila do TFA pelo método de fluorescência HPLC descrito no Exemplo II. A citotoxicidade in vitro (IC50) dos compostos também foi avaliada.
A avaliação citotóxica foi realizada por células cultivadas por 24horas antes da adição do composto terapêutico. As células foram incubadas por 48 horas (37°C) com diluições diferentes do composto terapêutico. A viabilidade celular foi então avaliada utilizando o teste WST-I (Roche). Os resultados são expressos como as concentrações citotóxicas média (valor de IC5O ou concentração molar que inibe 50% da viabilidade celular) que foram calculados a partir da regressão sigmóide, utilizando o software Graph Pad Prism 3.02.
Duas linhagens celulares foram utilizadas no estudo:
- HCT 116 (ATCC #: CCL-247): células de carcinoma de cólon epitelial humano. As células foram cultivadas em meio Mc Coy1s 5a + 1,5 mM de L-glutamina e 10% de soro fetal bovino. As células foram plaqueadas em uma densidade de 8.000 células/ poço em placa de 96-poços.
- NCI-H460 (ATCC#: HTB-177): células de carcinoma de pulmão epitelial humano. As células foram cultivadas em RPMI 1640 + glutamax e 10% de soro fetal bovino. As células foram plaqueadas em uma densidade de 10.000 células/poço em placas de 96-poços.
Conjugados de CPP- ligante -SN38
Conforme mostrado na Tabela 10, o DPV1047- ligante #5-SN38era o conjugado mais estável (tempo de meia vida de 360 min e 260 min em plasma humano e de cachorro, respectivamente), com uma estabilidade consistente com aquela observada anteriormente (Vida Exemplo II). Em ambos os plasmas de cachorro e humano, em que o CPP estava acoplado ao SN38, o conjugado CPP- Iigante #5-SN38 era sempre mais estável do que o conjugado CPP- Iigante #1-SN38, confirmando que o Iigante #5 (= BCH) era mais estável do que o Iigante #1.
Tabela 10
<table>table see original document page 94</column></row><table>
A citotoxicidade dos compostos mais estáveis (contendo o Iigante#5) foi avaliada para determinar se a natureza citotóxica destes compostos foi mantida. A Tabela 11 confirma que todos os conjugados CPP- Iigante #5-SN38 mantém a atividade citotóxica equivalente aquela do SN38, nas duas linhagens celulares testadas.
Tabela 11: a concentração da droga que inibe 50% da viabilidadecelular (IC50) nas duas linhagens celulares diferentes após 48-h de exposição contínua. Os dados são expressos em nM e representam o valor médio dos três experimentos independentes.Tabela 11
<table>table see original document page 95</column></row><table>
A estabilidade do plasma in vitro e a citotoxicidade do conjugadoCPP-Iigante #5-SN38 com o CPP em uma conformação D também foi avaliada. Conforme mostrado na Tabela 12, a estabilidade de ambos os conjugados CCP-Iigante #5-SN38 D-isoforme é significativamente meio do que aquela observada para os conjugados CPP- Iigante #1-SN38 (vide Tabela 10). A estabilidade dos conjugados CCP- Iigante #5-SN38 D-isoformes, embora possuindo um tempo de meia vida superior a 100 minutos no plasma humano são menos estáveis do que o conjugado DPV1047- Iigante #5-SN38. Os resultados são mostrados na Tabela 12 abaixo.
Tabela 12
<table>table see original document page 95</column></row><table>
A citotoxicidade in vitro destes conjugados foi avaliada paradeterminar se a natureza citotóxica destes compostos foi mantida. A Tabela 13 confirma que os dois conjugados CPP- Iigante #5-SN38 D-isoforme mantém a atividade citotóxica equivalente àquela do DPV1047- Iigante #5-SN38. Os resultados são mostrados na Tabela 13 abaixo.
Tabela 13: Concentração da droga que inibe 50% da viabilidade celular (IC50) após uma exposição contínua por 48 horas. Os dados são expressos em nM.Tabela 13
<table>table see original document page 96</column></row><table>
Conjugados CPP- ligante -10-hidroxicamptotecina
A estabilidade de diferentes combinações de CPP - ligante também foi testada com a 10-hidroxicamptotecina. Assim como o conjugado CPP- ligante #5-SN38, os conjugados de CPP- ligante #5-10-hidroxicamptotecina foram sempre mais estáveis do que os conjugados de CPP- ligante #1-10-hidroxicamptotecina. Conforme observado para o DPV1047- ligante #5-SN38, a estabilidade do conjugado DPV1047- ligante #5-10-hidroxicamptotecina era maior do que os outros conjugados de CPP- ligante #5-10-hidroxicamptotecina em ambos os plasmas humano e canino. Os resultados são mostrados na Tabela 14 abaixo.
Tabela 14: Tempo de meia vida (em minutos) dos conjugados de 10-hidroxicamptotecina no plasma a 37°C.
Tabela 14
<table>table see original document page 96</column></row><table>
A citotoxicidade da maioria dos compostos (contendo o ligante#5) foi avaliada para determinar se a natureza citotóxica destes compostos foi mantida. A Tabela 15 confirma que todos os conjugados de CPP- Iigante #5-10-hidroxicamptotecina mostraram uma atividade similar, levemente menor, mas equivalente àquela da 10-hidroxicamptotecina, para ambas as linhagens celulares testadas.
Tabela 15: Concentração da droga que inibe 50% da viabilidade celular (IC50) em duas linhagens diferentes de células após 48 horas de exposição contínua. Os dados são expressos em nM e representam o valor médio de três experimento independentes.
Tabela 15
<table>table see original document page 97</column></row><table>
Os ligantes #4 e #5 mostram maior estabilidade do que o Iigante
#1 com todos os conjugados CPP testados. A estabilidade deste ligante #5 também era maior do que o ligante #1 para ambos SN38 e derivados de 10-hidroxicamptotecina.Listagem de Seqüências
<110> DIATOS
<120> CONJUGADOS DE CAMPTOTECINA-PEPTÍDEO E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÉM
<130> B0438WO
<160> 52
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1 <211> 16 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 1
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser 15 10 15
<210> 2 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 2
Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys 15 10 15
Pro
<210> 3 <211> 15 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 3
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro 15 10 15
<210> 4 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 4
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Pro Arg Ser 15 10 15Arg
<210> 5 <211> 14 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 5
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly 15 10
<210> 6 <211> 18 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 6
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg 15 10 15
His Leu
<210> 7 <211> 19 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 7
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys 15 10 15
Arg Lys Arg
<210> 8 <211> 19 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 8
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg 15 10 15
Met Asp Val
<210> 9
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg 15 10 15Asp Val
<210> 10 <211> 16 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 10
Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg 15 10 15
<210> 11 <211> 22 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 11
Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg 15 10 15
Arg Glu Arg Gln Ser Arg 20
<210> 12 <211> 21 <212> PRT
<213> homo sapiens <400> 12
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His 15 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys 20
<210> 13 <211> 30 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 13
Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His 15 10 15
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala 20 25 30
<210> 14 <211> 21 <212> PRT
<213> Homo sapiens<400> 14
Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met Ser Met Lys Ile Arg Pro 15 10 15
Phe Phe Pro Gln Gln 20
<210> 15 <211> 20 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 15
Lys Thr Arg Tyr Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro 15 10 15
Phe Asn Arg Leu 20
<210> 16 <211> 20 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 16
Arg Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Arg Ala Val Arg Met Lys Ile Arg Pro 15 10 15
Leu Val Thr Gln 20
<210> 17 <211> 24 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 17
Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln 15 10 15
Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro 20
<210> 18 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 18Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu 15 10
<210> 19 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens <4 00> 19
Asn Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser 15 10
<210> 20 <211> 30 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 20
Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His 15 10 15
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala 20 25 30
<210> 21 <211> 16 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 21
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 15 10 15
<210> 22 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 22
Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu 15 10
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys 15 10 15Leu Ala
<210> 24 <211> 27 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 24
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 15 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25
<210> 25 <211> 16 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 25
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro 15 10 15
<210> 26 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 26
Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met 1 5
<210> 27 <211> 21 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 27
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys 15 10 15
Lys Lys Arg Lys Val 20
<210> 28 <211> 15 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr 15 10 15
<210> 29 <211> 16 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 29
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 15 10 15
<210> 30 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 30
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5
<210> 31 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 31
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 ' 5
<210> 32 <211> 9 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 32
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
<210> 33 <211> 16 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 33
Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys 15 10 15
<210> 34 <211> 28 <212> PRT<213> Homo sapiens <400> 34
Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp 15 10 15
Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro 20 25
<210> 35 <211> 18 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 35
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His 15 10 15
Ser Lys
<210> 36 <211> 18 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 36
Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro 15 10 15
Pro Pro
<210> 37 <211> 7 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 37
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5
<210> 38 <211> 18 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 38
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr 15 10 15
Gly Arg<210> 39 <211> 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 39
Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe 15 10
<210> 40 <211> 17 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 40
Ala Trp Ser Phe Arg Val Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Tyr Arg Arg Ser 15 10 15
Arg
<210> 41 <211> 14 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 41
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 15 10
<210> 42 <211> 11 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 42
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 15 10
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5
<210> 44<211> 13 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 44
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 15 10
<210> 45 <211> 27 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu 15 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 20 25
<210> 46 <211> 21 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu 15 10 15
Ala Lys Lys Ile Leu 20
<210> 47 <211> 12 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 47
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly 15 10
<210> 48 <211> 14 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 48
Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu 15 10
<210> 49<211> 34 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 49
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr 15 10 15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro 20 25 30
Val Asp
<210> 50 <211> 26 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 50
Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr 15 10 15
Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp 20 25
<210> 51 <211> 8 <212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 51
Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His 1 5
<210> 52 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial
<220>
<223> Peptideo que não penetra na célula <400> 52
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 15 10 15
Claims (19)
1. CONJUGADO, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma camptotecina, seus análogos ou derivados, ligada a uma porção portadora, por meio de um grupo ligante, em que a porção portadora éum peptídeo que penetra na célula e em que o tempo de meia vida do conjugado é igual ou superior a 5 minutos no plasma humano a 37°C in vitro.
2. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo ligante deriva de um reagente de reticulação selecionado a partir de:- ácido Ν-6-maleimido caproico, e- ácido N-11-maleimido undecanoico.
3. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dito conjugado possui a seguinte fórmula (VI):<formula>formula see original document page 109</formula>- em que X representa o peptídeo que penetra na célula (CPP), que é ligado ao restante do conjugado por uma ligação tioéter,- Y representa a camptotecina, seus análogos ou derivados,- B é um grupo cicloalquila substituído ou não substituído, e Ri e R2 são, independentemente, nada ou grupos alquila, heteroalquila, arila ou heteroarila bivalente substituído ou não substituído.
4. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que Y está ligado ao restante do conjugado por uma ligação tioéter, hidrazona, amida, éster, éter, carbamato ou tiocarbamato, mais particularmente por uma ligação éter, ligação dissulfeto ou tioéter.
5. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de- 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a camptotecina, seus análogos ou derivados, é um composto biologicamente ativo que possui a propriedade de ligar in vitro e/ou em particular in vivo à enzima DNA topoisomerase I e contém a cadeia principal de camptotecina conforme representado pela seguinte fórmula (II):<formula>formula see original document page 110</formula>em que t é 0, 1 ou 2 e Z é um grupo -COO- ou um grupo alquila bivalente substituído ou não substituído.
6. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a cadeia principal da camptotecina é de fórmula (II), em que t é 0 e Z é um grupo COO1 que pode ser representado pela seguinte fórmula (III):<formula>formula see original document page 110</formula>
7. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a cadeia principal da camptotecina é representada pela seguinte fórmula (IV):
8. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a camptotecina, seus análogos e derivados são selecionados a partir da irinotecan, topotecan, GI-147211C, SN38, 7-hidroximetil camptotecina, 9-amino camptotecina, 7-aminometilcamptotecina, 10-hidróxi camptotecina e (20S)-camptotecina.
9. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de 3 a 8, caracterizado pelo fato de que pelo menos um Ri e R2 está interrompido por pelo menos um radical bivalente selecionado a partir de -O-, -NR'-, -SR'-, -SiR'R"- , -OC(O)-, - C(O)-, -CO2-, -CONR'-, - NR'CO-, -OC(O)NR'-, -NROC(O)-e -NR"C(0)2-, em que R' e R" são, independentemente, selecionados a partir do hidrogênio, grupo alquila (Cr C8), heteroalquila (C-i- Ce), arila e heteroarila.
10. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de 3 a 9, caracterizado pelo fato de que Ri é uma alquila substituída ou não substituída, heteroalquila, arila ou grupo heteroarila bivalente e R2 é nada ouum grupo alquila, heteroalquila, arila ou heteroarila bivalente substituído ou não substituído.
11. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de 3 a 10, caracterizado pelo fato de que possui a fórmula (VI), em que:- B é uma cicloalquila (C3-Ce), de preferência, cicloalquila nãosubstituída, incluindo o radical ciclopentila ou ciclohexila, e/ou- R1 é um grupo heteroalquila, em particular que engloba o polietilenoglicol (isto é, PEG) e seus derivados, tais como PEG-3, -4, -5 ou -6, e/ou- R1 é uma cadeia alquila (CrCe) linear, em particular, -CH2- ou -CH2CH2-, e/ou- R1 é uma cadeia alquila (CrC8), opcionalmente interrompida porpelo menos um, de preferência um ou dois radicais bivalentes selecionados a partir de -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NR'CO-, -OC(O)NR'- e -NR"C(0)2-, de preferência, -CONR'- ou -NROC(O)-, em que R' e R", independentementeentre si são, de preferência, selecionados a partir do hidrogênio e alquila (C1-C8), e opcionalmente a dita cadeia alquileno (C1-C8) compreende pelo menos uma cadeia cicloalquila, e/ou- R2 é nada, e/ou- R2 é um grupo heteroalquila, em particular que engloba polietilenoglicol (isto é, PEG) e seus derivados, tais como PEG-3, -4, -5 ou -6, e/ou- R2 é uma cadeia alquila (C1-C8) linear, em particular, -CH2- ou -CH2CH2-, e/ou- R2 é uma cadeia alquila (C1-C8), opcionalmente interrompida por pelo menos um, de preferência um ou dois radicais bivalentes selecionados a partir de -OC(O)-, -CO2-, -CONR'-, -NROO-, -OC(O)NR'- e -NRX(O)2-, de preferência, -CONR'- ou -NROC(O)-, em que R' e R", independentemente entre si são, de preferência, selecionados a partir do hidrogênio e alquila (C1- C8), e opcionalmente dita cadeia alquila (C1-C8) compreende pelo menos uma cadeia cicloalquila.
12. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a camptotecina, seus análogos ou derivados, está covalentemente ligada à porção portadora com um Iigante resultante de um composto selecionado a partir de:ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carbóxi-6-amido caproico,ácido 4-[(N-maleimidoetil)carboxamidoetil(PEG)4 carboxamidometil]ciclohexano carboxílico,ácido 4-[(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carbóxi-6-amido hexanocarboxamidometil] ciclohexano carboxílico, eácido 4-[((N-maleimidometil)ciclohexanocarboxamido)metil] ciclohexano carboxílico.
13. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de-1 a 12, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir de:<formula>formula see original document page 113</formula>- em que X é conforme definido na reivindicação 3.
14. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o peptídeo que penetra na célula (ou X) éaltamente catiônico e rico em arginina ou lisina.
15. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a porção portadora é um peptídeo derivado de uma proteína de ligação à heparina humana e capaz de penetrar em uma célula outecido e é selecionado a partir do grupo que consiste em;- DPV3 (SEQ ID NO: 1): Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser,- DPV6 (SEQ ID NO: 2): Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys Pro,- DPV7 (SEQ ID NO: 3): Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu GlyLys Lys Arg Asp Pro,- DPV7b (SEQ ID NO: 4): Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys LeuGly Lys Lys Arg Pro Arg Ser Arg1- DPV10 (SEQ ID NO: 5): Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly1- DPV3/10 (SEQ ID NO: 6): Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu,- DPV10/6 (SEQ ID NO: 7): Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg1- DPV1047 (SEQ ID NO: 8): Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Vai,- DPV1048 (SEQ ID NO: 9): Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg HisVal Arg Pro Arg Val Thr Arg Asp Vai,- DPV15 (SEQ ID NO: 10): Leu Arg Arg Glu Arg Gln SerArg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg,- DPV15b (SEQ ID NO: 11): Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg GluArg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg1- em particular SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11 e SEQ ID NO 8.
16. CONJUGADO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o peptídeo apresenta uma cisteína na posição C ou N.
17. CONJUGADO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 16, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partir de:<formula>formula see original document page 115</formula>
18. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fatode que compreende, em um veículo farmaceuticamente aceitável, pelo menos um composto, conforme definido em uma das reivindicações de 1 a 17.
19. COMPOSTO, caracterizado pelo fato de ser selecionado apartir de:- ácido 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carbóxi-6-amidocaproico,ácido 4-[(N-maleimidoetil)carboxamidoetil(PEG)4carboxamidometil]ciclohexano carboxílico,ácido 4-[(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carbóxi-6-amido hexanocarboxamidometil] ciclohexano carboxílico, eácido 4-[((N-maleimidometil)ciclohexanocarboxamido)metil] ciclohexano carboxílico.
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