CN101516404B - 喜树碱-细胞渗透肽缀合物和含有其的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种在治疗药剂向靶细胞或者组织的改进输送中使用的新化合物，包含所述化合物的组合物及其用途。所述化合物更特定的是肽部分和喜树碱的缀合物，其衍生物或者类似物，它们提供许多益处，包括水溶性、药代动力学和组织分布的提高，治疗指数的增加和患者体内代谢变异性的限制以及生物活性成分向靶细胞或者组织输送的改进。

Description

喜树碱-细胞渗透肽缀合物和含有其的药物组合物
本发明涉及一种在治疗药剂向靶细胞或者组织的改进输送中使用的新化合物，包含其的组合物及其用途。所述化合物更特别地是肽部分和喜树碱的缀合物，其衍生物或者类似物，它们提供许多益处，包括水溶性、药代动力学和组织分布的提高，治疗指数的增加，和患者体内代谢变异性的限制以及生物活性成分向靶细胞或者组织输送的改进。
发明背景
喜树碱(CPT)是六十年代发现的从喜树(Camtpotheca acuminata)提取的生物碱(Wall等，J.Amer.Chem.Soc.88：3888-3890(1966))。这种不溶于水的分子显示非常强的抗肿瘤活性，但由于很强的膀胱毒性和严重的腹泻限制了它在临床上的应用(Gottlieb等，Cancer Chemother.Rep.54：461-470(1970)，Moertel等，Cancer Chemother.Rep.56：95-101(1972))。结构-活性研究已经鉴定出两种水溶性的抗肿瘤衍生物，它们目前在市场上销售：依立替康(irinotecan，CPT-11，
Figure G2007800199329D00011
Figure G2007800199329D00012
)和托泊替康(topotecan，
Figure G2007800199329D00013
水溶性的喜树碱衍生物)。这两种分子是DNA拓扑异构酶I的特异性抑制剂，所述DNA拓扑异构酶I诱导DNA的单链断裂从而阻断DNA复制(Hsiang等，J.Biol.Chem.260：14873-14878(1985)，Kawato等，Cancer Res.51：4187-4191(1991)，Satoh等，Biol.Pharm.Bull.17：662-664(1994))。
依立替康是SN38的水溶性前体药物(7-乙基-10-羟基-喜树碱)，而SN38是肝酶切割依立替康后释放的活性代谢产物。SN38是一种有效的拓扑异构酶I抑制剂，作为抗增殖剂时其活性至少是依立替康的2000倍。但是，SN38是高度不溶于水的，需要输送系统以使其充足的给药和生物利用率。和许多喜树碱衍生物一样，SN38包含对于抗肿瘤功效非常重要的内酯环。该内酯环在生理或者碱性pH下是不稳定的，导致活性药物转化为无活性的羧酸形式(Chabot，Clin.Pharmacokinetics，33：245-259(1997))。
依立替康被广泛用于结肠癌的治疗。但是，它受到几个限制。给药后，依立替康必须转化为有活性的SN38。在人类中依立替康经肝酶转化为活性药物SN38是非常少的(Rohtenberg等，J.Clin.Oncology 11：2194-2204(1993)，Senter等，Bioconjugate Chem.12：1074-1080(2001))。只有2-8％的依立替康给药剂量被肝和肿瘤羧酸酯酶(CES)切割为亲脂性的代谢产物SN38(Senter等，Bioconjugate Chem.12：1074-1080(2001)，Xu等，Clin.Cancer Res.8：2605-2611(2002))。对这种分解代谢动力学的分析证明了归因于遗传和环境因素的重要患者体内异质性，这可以影响酶的活性直至10倍(Charasson等，Drug Metab.Dispos.30：731-733(2002))。这导致依立替康代谢在个体体内高水平的变异性，影响依立替康的耐受性和功效并显著的将患者治疗复杂化(Ohe等，J.Natl.Cancer Inst.84：972-974(1992)，Gupta等，Cancer Res.54：3723-3725(1994)，Slatter等，Drug Metab.Dispos.28：423-433(2000)，Kraut等，ASCO abstract No：2501，2004)。SN38在肝脏中被尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)进一步转化(解毒)为SN38-葡糖苷酸(SN38-G)，一种无活性的葡糖醛酸-缀合物。葡萄苷酸化使分子具有亲水性，允许其通过胆汁的胃肠道排泄。一旦进入肠内，SN38-G被肠内细菌群落(beta-葡糖醛酸酶)重新转化为SN38。依立替康本身主要被排泄入胆汁(>26％)，并且能够被肠内的CES转化为SN38(M.Horikawa，Pharmaceutical Res.，19：1345-1353(2002))。SN38在肠内的这种局部积聚造成依立替康治疗后观察到的高水平的迟发肠内毒性(腹泻)，这是依立替康主要的一个剂量限制毒性(Xie等，Clin.Pharmacol.Ther；72：265-275(2002)，Alimonti等，Cancer Treatment Rev.30：55-562(2004))。迟发腹泻是严重的(例如危急生命)，有时与发烧一起出现。依立替康另一个显著的毒性是白细胞减少(例如中性白细胞减少)。血液学紊乱可能导致严重的发育不良，有时并发全身感染。治疗后观察到的这些严重的副作用造成对患者的辅助医院护理(更长的住院；抗腹泻治疗；预防性抗生素疗法)(Kehrer等，Clin.Cancer Res.7：1136-1141(2001))。已经在临床试验中证明依立替康的剂量提高/强化获得改进的治疗应答。这种剂量作用已经在患有转移性结肠直肠癌的患者中得到证明(Ychou等，CancerChemother.Pharmacol.50：383-391(2002)，Van Cutsem等，Br.J.Cancer.92：1055-1062(2005))。但是，如上所述的严重副作用限制了可以给予个体的剂量，这减弱了依立替康的潜在功效。
人类癌症与喜树碱衍生物的反复接触可导致抗药性的产生(Nakagawa等，Cancer Letters in press(2005))。这种特性不仅引起喜树碱衍生物治疗后功效的降低，而且造成其他常用抗癌剂治疗后的功效降低。
因此如上所述，对发展一种能够克服喜树碱衍生物(例如SN38)局限性的合适输送系统存在很大的兴趣。
已经提出不同的策略输送喜树碱衍生物，例如SN38的脂质体制剂(在NEOPHARM提交的公开号为WO2004/035032的PCT专利申请中描述)，SN38的纳米颗粒制剂(在IMARX提交的公开号为WO03/103596的PCT专利申请中描述)，聚谷氨酸-喜树碱缀合物(在CELL THERAPEUTICS提交的公开号为WO01/70275的PCT专利申请中描述)或者喜树碱的聚合衍生物例如PEG-喜树碱缀合物(在ENZON提交的公开号为WO03/097356和DEBIO提交的公开号为WO03/031467的PCT专利申请中描述)或者20-O-[甘氨酰-氨基酰基-甘氨酰]-喜树碱的聚合缀合物(在PHARMACIA&UPJOHN提交的公开号为WO99/17804的PCT专利申请中描述)。
CYCLACEL提交的公开号为WO00/01417的PCT专利申请还描述了肽药物输送系统，其目的在于促进不同药物的输送，例如10-羟基喜树碱。该专利申请描述了使用衍生自果蝇触足同源蛋白(Drosophila antennapediahomoprotein)(优选称为穿膜肽(penetratin)的细胞渗透肽(cell penetratingpeptide，CPP))的同源异形框肽缀合多种细胞毒药物，从而增强它们的输送和/或治疗作用。但是，该专利申请没有显示利用所述缀合物进行的任何体外或者体内实验。因此申请人利用该专利申请WO00/01417的实施例29描述的缀合物在体外进行了人血清稳定性研究。这些研究显示该缀合物的半衰期(稳定性)小于三分钟，这看起来对于体内治疗有效量的喜树碱衍生物的胞内输送是不充分的。
DIATOS提交的公开号为WO01/64738的PCT专利申请涉及一些与氨基聚糖反应的氨基酸序列，并从外部基质将大量活性物质(即核酸、蛋白、药物、抗原或者抗体)转移到细胞内部，更特别地是细胞核。这类序列来自人类蛋白，因此当给予需要治疗的人时是非免疫原性的细胞渗透肽(CPP)。
因此需要活性化合物(例如SN38)的增强的输送效率、安全性和功效。
在本发明研究范围内，申请人合成了不同的CPP-喜树碱衍生物缀合物。然后在体外和体内鉴定这些缀合物的稳定性、功效和毒性。
尤其是本发明的目的是提供一种化合物，所述化合物减轻或者减少喜树碱衍生物例如依立替康的上述缺点和不希望的副作用。尤其是本发明旨在提供一种化合物，所述化合物能够改进采用药学上可接受形式的生物活性物质的可溶性，具有足够的稳定性以允许有效的胞内输送，减少毒性或者不希望的副作用，增强所需治疗功效作用的发生，提供药物给药的替代途径，减少患者体内的变异性，和/或调节药物的组织分布和代谢。
发明概述
根据第一个方面，本发明涉及一种包括与载体部分连接的药物部分的缀合物，其中所述载体部分包括一种肽或者其类似物，所述肽或者其类似物促进有效负载(例如药物部分)渗透入细胞或者组织并且具有以下能力：增加药物的可溶性，调节药物的药代动力学、代谢和组织分布性质，和/或降低抗药性的发生，和所述药物部分是任意的喜树碱、其类似物或者衍生物。本文中所述肽或者其类似物还被称为细胞渗透肽(CPP)。
本发明还涉及包括这种缀合物的药物组合物及其治疗用途，尤其是用于各种类型疾病包括癌症的治疗。
附图简述
图1显示给狗输注DPV1047-MIC-SN38(10、20、50mg/kg，黑色柱)、DPV1047-BCH-SN38(5、10(n＝2)、20mg/kg，灰色柱)和依立替康(30mg/kg，白色柱)后SN38的血液AUC。
图2显示输注DPV1047-MIC-SN38(50mg/kg)和DPV1047-BCH-SN38(10mg/kg)后DPV1047-MIC-SN38、DPV1047-BCH-SN38和SN38的血液AUC。▲：DPV1047-MIC-SN38；
Figure G2007800199329D00041
：来自DPV1047-MIC-SN38的SN38；■：DPV1047-BCH-SN38；●：来自DPV1047-BCH-SN38的SN38。在输注到达定量的极限(7.8ng/mL eq SN38)结束时测量AUC；DPV1047-MIC-SN38和DPV1047-BCH-SN38在它们各自的剂量AUC＝AUC0-4.42h。
发明详述
根据一个特定的实施方案，本发明提供一种缀合物，所述缀合物包括至少一种喜树碱、其类似物或者衍生物，更优选包括化合物SN38，所述SN38与载体部分连接，优选通过连接子基团连接。
载体部分包括一种肽或者其类似物，所述肽或者其类似物促进有效负载(例如药物部分)渗透入细胞或者组织并且具有以下能力：增加药物部分的可溶性，调节药物部分的药代动力学、代谢和组织分布性质，减少患者体内的变异性，和/或降低抗药性的发生。
本发明的缀合物包括它们的盐、光学和几何异构体或者其混合物。
所述缀合物的盐尤其是碱或者酸加成盐，优选适合药物用途。在药学上可接受的无机酸中，非限制性的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。在药学上可接受的有机酸中，非限制性的实例包括乙酸，三氟乙酸，乳酸，丙酮酸，丙二酸，琥珀酸，戊二酸，反丁烯二酸，酒石酸，马来酸，柠檬酸，苯甲酸，抗坏血酸，甲磺酸，乙磺酸，2-羟基乙磺酸和樟脑酸。在药学上可接受的碱中，非限制性的实例包括氢氧化钠，氢氧化钾，三乙胺和叔丁基胺。优选地，本发明的缀合物采用盐酸盐形式。
有利地，载体部分与药物(即喜树碱衍生物)的缀合导致所述药物的药代动力学性能相对于非缀合药物的改变。
有利地，所述载体部分包括带正电荷的部分(即碱性氨基酸)，其在缀合物的水溶液中诱导低pH(例如pH值<6.5)。这种酸性pH有助于药物组合物中喜树碱衍生物的内酯基团的稳定(内酯形式>95％)，因此可使注射到活体动物或者人类个体后内酯和羧酸形式的血浆平衡有利于内酯形式(>大约55％的内酯形式)(Kaneda等，Biol.Pharm.Bull.20：992-996(1997))。
本发明的另一个优点是通过药物与载体部分的缀合，还改变(即调节)所述药物的组织分布进而改变其体内代谢。与活化依立替康的肝羧酸酯酶相比，代谢的改变包括利用血浆以及组织酯酶切割本发明的缀合物。总的来说，本发明改变的组织分布(即肝摄取降低)和输送系统避免了肝活化本发明缀合物的需要，导致个体内治疗变异性的降低和肠毒性的下降(与依立替康相比)，此外输送超过60％的活性代谢产物(即治疗活性形式的药物)例如SN38。
有利地，本发明的缀合物显示足够的稳定性以允许输送治疗有效量的循环性和细胞性喜树碱、其类似物或者衍生物。优选地，本发明的缀合物包括通过连接子基团与载体部分连接的至少一个喜树碱、其类似物或者衍生物，其中所述载体部分是细胞渗透肽，并且其中在体外37℃的人血浆中缀合物的半衰期(即具有50％摩尔比的由本发明缀合物释放的游离喜树碱、其类似物或者衍生物的时间)等于或者超过5分钟。
术语“缀合”或者“缀合的”是指共价、离子或者疏水性相互作用，从而分子的各部分被结合在一起并保持非常接近。术语“反应的”具有对于化学领域技术人员来说常见的含义。术语“连接子”或者“交联剂”在本文中可以互换使用，是指将两个部分偶联/连接在一起的链，其包括一或多个原子。术语“体外”具有本领域公知的含义，例如细胞培养物，涉及纯化的试剂或者提取物，例如细胞提取物。术语“体内”也具有本领域公知的含义，例如涉及生物体内的活细胞和/或生物体内的任意细胞。术语“药代动力学”表示药物被机体吸收、分布、代谢和清除的过程。通常将药物及其代谢物的血液、血浆或者血清浓度的演变作为时间函数来鉴定药代动力学性能。观察时间可以包括大约5分钟至大约24小时或者更长的时间。术语“血浆药代动力学”是指药物及其代谢物的血液、血浆或者血清浓度随时间的演变。术语“组织分布”被定义为在指定时间内不同组织与药物或者其代谢产物的相对或者绝对接触，所述组织即肝，肺，胃，肠，胰腺，脑，膀胱，卵巢，睾丸，前列腺，子宫，皮肤，肌肉，脾，淋巴结，肿瘤或者任意其他相关器官。根据组织中药物或者代谢产物浓度的演变作为时间函数确定组织分布。
术语“肽”是指氨基酸的聚合物，其中书写习惯是N或者氨基端在左边，C或者羧基端在右边。20个最常见的天然L-氨基酸可以选择用3个字母或者1个字母表示。本文使用的肽被认为包括“肽类似物”，含有对L-氨基酸侧链或者α-氨基酸骨架的一或多个修饰的结构修饰。骨架修饰肽类似物的实例是N-甲基甘氨酸“拟肽”(Zuckermann等，J.Amer.Chem.Soc.114：10646-47(1992))。术语“细胞渗透肽”(CPP)被定义为能够穿过生物膜或者生理屏障的载体肽。细胞渗透肽还被称为细胞可渗透肽，蛋白转导结构域(PTD)或者膜易位序列(MTS)。CPP具有以下能力：在体外和/或体内易位哺乳动物细胞膜并进入细胞和/或细胞核，以及指导感兴趣的缀合的化合物例如药物或者标记到需要的细胞终点。因此，CPP能够指导或者促进感兴趣的化合物渗透穿过磷脂、线粒体膜、内体膜或者核膜。CPP还能够指导感兴趣的化合物从细胞外部穿过质膜，进入细胞质或者胞浆或者到达细胞内的预定位置，例如核，线粒体，内质网，溶酶体或者过氧化物酶体。或者或者此外，CPP能够指导感兴趣的化合物穿过血脑屏障或者hematoretinal屏障、跨粘膜屏障、皮肤、胃肠屏障和/或肺部屏障。已经发现数种蛋白和它们的肽衍生物具有细胞内化作用性质，包括但不限于1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)蛋白Tat(Ruben等J.Virol.63，1-8(1989))，疱疹病毒被膜蛋白VP22(Elliott和O′Hare，Cell 88，223-233(1997))，穿膜肽(Derossi等，J.Biol.Chem.271，18188-18193(1996))，protegrin1(PG-1)抗微生物肽SynB(Kokryakov等，FEBS Lett.327，231-236(1993))和碱性成纤维细胞生长因子(Jans，Faseb J.8，841-847(1994))。这些载体肽之间几乎没有序列同源性，但均是高度阳离子的，并且富含精氨酸或者赖氨酸。实际上，已经示出合成的多聚精氨酸肽被高效的内化(Futaki等，J.Mol.Recognit.16，260-264(2003)；Suzuki等，J.Biol.Chem.(2001))。
因此，在一个特定的实施方案中，本发明的缀合物提供选自下列物质的CPP：1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)蛋白Tat，疱疹病毒被膜蛋白VP22，穿膜肽，protegrin1(PG-1)抗微生物肽SynB，碱性成纤维细胞生长因子，合成的多聚精氨酸肽，或者具有细胞内化作用性质的其肽衍生物。
根据本发明的一个特定方面，CPP包括具有下式(I)的氨基酸序列：
C(X1)p[(X)o(B)n(X)sBX(X)rXB]m(X2)qC (I)
其中
X1和X2独立地是1到20个氨基酸的氨基酸序列；p和q独立地是0和5之间的整数，优选是0或者1；
B独立地是碱性氨基酸，X独立地是非碱性氨基酸；
C独立地是不存在的或者是包括与缀合物的其余部分连接的硫醚键的任意部分，优选所述部分是半胱氨酸或者半胱胺；
m是1或者2；
n是1、2或者3；
o是0或者1；
r是0或者1；
s是0、1、2或者3。
在优选的实施方案中，CPP来源于人类蛋白，因此避免了给予人类时的免疫原性。根据所述的特定实施方案，CPP是包括如上限定的式(I)所示氨基酸序列的肽。
在更优选的实施方案中，本发明的CPP还能够溶解高亲脂性的分子和/或与未缀合到本发明CPP的所述分子相比，改变它们的药代动力学和组织分布。
在一个特定的实施方案中，本发明的载体部分包括在体外和/或体内能够与细胞表面的糖胺聚糖类反应的CPP。这类CPP在DIATOS提交的PCT专利申请WO01/64738和WO05/016960以及De Coupade等(Biochem J.390：407-18(2005))中有描述。这些肽是源自人肝素结合蛋白和/或抗DNA抗体的氨基酸序列，所述人肝素结合蛋白和/或抗DNA抗体选自：脂蛋白例如人载脂蛋白B或者E(Cardin等，Biochem.Biosphys.Res.Com.154：741(1988))，agrine(Campanelli等，Development 122：1663-1672(1996))，胰岛素生长因子结合蛋白(Fowlkes等，Endocrinol.138：2280-2285(1997))，人血小板衍生生长因子(Maher等，Mol Cell.Biol.9：2251-2253(1989))，人胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)(Inoue等，FEBS 269：89-92(1990))，人肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)(Arkonac等，J.Biol.Chem.273：4400-4405(1998))，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)(Fromm等，Arch.Biochem.Bioph.343：92(1997))，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(Yayon等，Cell 64：841-848(1991))，人肠粘蛋白2序列(Xu等，Glyconjug J.13：81-90(1996))，人γ干扰素(Lortat-Jacob & Grimaud，FEBS 280：152-154(1991))，人白介素12的亚基p40(Hasan等，J.Immunol.162：1064-1070(1999))，源自基质细胞的因子1-α(Amara等，J.Biol.Chem.272：200-204(1999))，人中性粒细胞衍生“肝素结合蛋白”(CAP37/天青杀素)(Pohl等，FEBS 272：200-204(1990))，免疫球蛋白分子例如抗DNA单克隆鼠抗体F4.1的CDR2和/或CDR3区(Avrameas等，Proc.Natl.Acad.Sci.95：5601(1998))，人抗DNA单克隆抗体RTT79的高变CDR3区(Stevenson等，J.Autoimmunity 6：809(1993))，人抗DNA单克隆抗体NE-1的高变区CDR2和/或CDR3(Hirabayashi等，Scand.J.Immunol.37：533(1993))，人抗DNA单克隆抗体RT72的高变区CDR3(Kalsi等，Lupus 4：375(1995))。CPP与糖胺聚糖类(GAGs)反应/结合的能力可以通过本领域已知的直接或者间接糖胺聚糖结合分析确定，例如PCT专利申请WO00/45831中描述的用于肽糖胺聚糖结合的亲和共同电泳(ACE)分析。本领域还有数种其他公知的方法用于分析GAG-肽相互作用，例如PCT专利申请WO01/64738或者Weisgraber和Rall(J.Biol.Chem.，262(33)：11097-103)描述的方法(利用载脂蛋白B-100的特定实例)；或者通过改良的ELISA试验：96孔板用特定GAG(硫酸软骨素A、B和C，肝素，硫酸肝素，透明质酸，硫酸角蛋白，多配体聚糖)包被，然后添加与标记缀合的肽指定时间；充分洗涤后，利用与所述标记物相关的特异性分析确定肽结合。
CPP可以是任意长度。例如CPP的长度是小于或等于500，250，150，100，50，25，10，6或者4个氨基酸。例如CPP的长度是大于或等于4，6，10，25，50，100，150，250或者500个氨基酸。本领域技术人员可以轻易的确定CPP的合适长度及设计。对于CPP的一般参考文献可以引用：CELLPENETRATING PEPTIDES：PROCESSES AND APPLICATIONS，Ulo Langel编辑(2002)；或者Advanced Drug Delivery Reviews 57：489-660(2005)。
在优选的实施方案中，CPP的长度是5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24或者25个氨基酸。
在优选的实施方案中，CPP包括长度小于50个、优选小于25个氨基酸的式(I)所示的氨基酸序列。通常，式(I)所示的氨基酸序列多于8个氨基酸，优选多于10个。
根据特定的实施方案，载体部分是包括式(I)所示氨基酸序列的肽，其中C不存在或者位于氨基酸序列的任意位置，或者更优选在所述氨基酸序列的C或者N端位置。可以在式(I)所示氨基酸序列的任意位置添加包括硫醇基的部分，以便将肽通过硫醚键缀合到喜树碱、其衍生物或者类似物。更优选地，所述包括硫醇基的部分位于所述氨基酸序列的C或者N端位置(即所述部分只存在于C和N端位置中的一个，而不存在于式(I)的另一C或者N位置)。具体来说，所述部分是半胱氨酸或者半胱胺。
优选地，X1和X2独立地是从2到15个氨基酸的氨基序列，更优选从2到10个氨基酸。它们可以包括碱性或者非碱性氨基酸。更特别地，X1和X2不含半胱氨酸氨基酸。
术语“碱性氨基酸”表示在pH7带正电荷的任意氨基酸，尤其是具有胍基、amidinyl或者氨基部分的任意氨基酸。术语“胍基”和“胍”可以互换使用，均表示具有式-HN＝C(NH2)NH(非质子化形式)的部分。举例来说，精氨酸含有胍基，并且还被称为2-氨基-5-胍基戊酸或者a-氨基-6-胍基戊酸。术语“amidinyl”和“脒基”可以互换使用，均表示具有式-C(＝NH)(NH2)的部分。优选高碱性氨基酸是组氨酸(H)，精氨酸(R)和/或赖氨酸(K)，更优选是K和R。
术语“非碱性氨基酸”表示在等于或者低于pH7时不带正电荷的任意氨基酸残基。因此它包括任意非极性的氨基酸(即疏水性氨基酸)、在pH7极性不带电氨基酸和带负电荷的氨基酸。本文使用的非极性氨基酸是A，I，L，M，F，P，W和V。极性不带电荷的氨基酸是N，C，Q，G，S，T和Y。带负电荷的氨基酸是D和E。根据一个优选的实施方案，式(I)的BX(X)rXB部分包括的非碱性氨基酸选自谷氨酸(E)，甘氨酸(G)，谷氨酰胺(Q)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，亮氨酸(L)，缬氨酸(V)，脯氨酸(P)和瓜氨酸。
本发明优选的氨基酸序列如下列所述：
-o是1，和/或
-p和/或q是1，和/或
-X1是3到12个氨基酸的序列，和/或
-X2是2到10个氨基酸的序列，和/或
-r是0和/或
-m是1。
因此，优选的源自人肝素结合蛋白并且能够特异渗入细胞的CPP选自：-DPV3(SEQ ID NO：1)：与肝素反应的CPP和源自人胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)序列C端部分的肽的二聚体(Inoue等，FEBS 269：89-92(1990))。-DPV6(SEQ ID NO：2)：与肝素反应并源自人血小板衍生生长因子A链的C端部分的氨基酸序列的CPP(Maher等，Mol.Cell.Biol.9：2251-2253(1989))。-DPV7(SEQ ID NO：3)和DPV7b(SEQ ID NO：4)：与肝素反应并源自人肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)序列的C端部分的CPP(Arkonac等，J.Biol.Chem.273：4400-4405(1998))。
-DPV10(SEQ ID NO：5)：与肝素反应并对应于人肠粘蛋白2序列的C端部分的CPP(Xu等，Glyconjug J.13：81-90(1996))。
-DPV3/10(SEQ ID NO：6)：与肝素反应并源自人胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)序列的C端部分(参见上文)和人肠粘蛋白2序列的C端部分(参见上文)的CPP。
-DPV10/6(SEQ ID NO：7)：与肝素反应并源自人肠粘蛋白2序列的C端部分(参见上文)和血小板衍生生长因子A链的C端部分(参见上文)的CPP。
-DPV1047(SEQ ID NO：8)和DPV1048(SEQ ID NO：9)：与肝素反应，源自人脂蛋白B的氨基酸序列(3358-3372)(Cardin等，Biochem.Biosphys.Res.Com.154：741(1988))和对应于人抗DNA单克隆抗体NE-1的高变区CDR3的肽序列(Hirabayashi等，Scand.J.Immunol.37：533(1993))的CPP。
-DPV15(SEQ ID NO：10)和DPV15b(SEQ ID NO：11)：与肝素反应并含有“肝素结合蛋白”CAP37序列的一部分的CPP。
根据本发明，所述细胞渗透肽更特别地选自下表1a所示的一种肽。
                 表1a
 
SEQIDNO： 细胞渗透肽 用一个字母代码表示的氨基酸序列(N端到C端)
1 DPV3 RKKRRRESRKKRRRES
2 DPV6 GRPRESGKKRKRKRLKP
3 DPV7 GKRKKKGKLGKKRDP
4 DPV7b GKRKKKGKLGKKRPRSR
6 DPV3/10 RKKRRRESRRARRSPRHL
7 DPV10/6 SRRARRSPRESGKKRKRKR
8 DPV1047 VKRGLKLRHVRPRVTRMDV
9 DPV1048 VKRGLKLRHVRPRVTRDV
5 DPV10 SRRARRSPRHLGSG
10 DPV15 LRRERQSRLRRERQSR
11 DPV15b GAYDLRRRERQSRLRRRERQSR
12 Buforin II TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK
13 GALA WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA
141516 趋触性肽：CβpreCγCαE KGSWYSMRKMSMKIRPFFPQQKTRYYSMKKTTMKIIPFNRLRGADYSLRAVRMKIRPLVTQ
17 hCT(9-32) LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP
18 HN-1 TSPLNIHNGQKL
19 流感病毒核蛋白(NLS) NSAAFEDLRVLS
20 KALA WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA
21 K-FGF AAVALLPAVLLALLAP
22 Ku70 VPMLKPMLKE
23 MAP KLALKLALKALKAALKLA
24 MPG GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV
25 MPM(IP/K-FGF) AAVALLPAVLLALLAP
26 N50(NF-κB P50的NLS) VQRKRQKLM
2728 Pep-1Pep-7 KETWWETWWTEWSQPKKKRKVSDLWEMMMVSLACQY
 
2930 穿膜肽短穿膜肽 RQIKIWFQNRRMKWKKRRMKWKK
3132 多聚精氨酸-R7多聚精氨酸-R9 RRRRRRRRRRRRRRRR
33 pISL RVIRVWFQNKRCKDKK
34 朊蛋白小鼠PrPc1-28 MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP
35 pVEC LLIILRRRIRKQAHAHSK
36 SAP VRLPPPVRLPPPVRLPPP
37 SV-40(NLS) PKKKRKV
383940 SynB1SvnB3SynB4 RGGRLSYSRRRFSTSTGRRRLSYSRRRFAWSFRVSYRGISYRRSR
41424344 Tat47-60Tat47-57Tat49-57Tat48-60 YGRKKRRQRRRPPQYGRKKRRQRRRRKKRRQRRRGRKKRRQRRRPPQ
45464748 TransportanTransportan 10Transportan衍生物： GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKILAGYLLGKINLKALAALAKKILGWTLNSAGYLLGINLKALAALAKKIL
49 VP22 DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD
50 VT5 DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD
51 DPV51 KRGLKLRH
如前所述，表1a所示的每种肽有利地在氨基酸序列的C或者N位置具有半胱氨酸。
本发明的细胞渗透肽可以是但不限于如上所述的那些或者其类似物。“类似物”是与其至少大约50％、优选至少大约70％、更优选至少大约80％-85％、优选至少大约90％和最优选至少大约95％-99％相同。例如，肽可以在1，2，3，4或更多个残基上具有取代。可以使用CPP的单体形式(例如上述)或者多聚体形式(二聚体，三聚体等等)。
必要时，本领域技术人员可以使用数种公知的化学策略将CPP转变成具有增加的体内稳定性和/或生物活性的药物候选物，例如：
-N-和C-端修饰以预防外肽酶降解：C端酰胺化或者N端乙酰化，
-通过形成二硫键的环化，
-酰胺氮的烷化以预防内肽酶降解，
-引入非天然氨基酸以修饰内肽酶的识别位点(2-甲基丙氨酸，α-二烃基化的甘氨酸，寡聚氨基甲酸酯，低聚尿素(oligourea)，胍基或者脒基骨架...)，
-在CPP氨基酸序列中掺入非遗传编码的氨基酸(甘氨酸或者苯丙氨酸的甲基化，卤化或者氯化)，
-将一些或者甚至全部L-氨基酸替换为它们相应的D-氨基酸或者β-氨基酸类似物。这类肽可以被合成为“反向(inverso)”或者“逆反(retro-inverso)”形式，即用D-氨基酸取代所述序列的L-氨基酸，或者通过逆转氨基酸的序列并用D-氨基酸取代L-氨基酸。在结构上，逆转肽比简单的D-类似物更近似于初始肽。基本上D-肽对肽酶更具抗性，因此与它们的L-肽对应物相比，D-肽在血清和组织中更加稳定。在优选的实施方案中，含有L-氨基酸的CPP用单个D-氨基酸加帽以抑制外肽酶破坏，
-CPP来源的寡聚氨基甲酸酯的合成；寡聚氨基甲酸酯骨架由通过相对刚性的氨基甲酸酯键连接的手性乙烯骨架组成(Cho等，Science 261：1303-1305(1993))。
本发明的缀合物还包括喜树碱、其类似物或者衍生物。
本文使用的“喜树碱、其类似物或者衍生物”是指任意的生物活性化合物，所述化合物具有在体外和/或尤其在体内结合DNA拓扑异构酶I的性质，并且含有下式(II)所代表的喜树碱骨架：
Figure G2007800199329D00131
其中t是0、1或者2，Z是-COO-基团(-COO-的方向是按照式(II)书写的方式从下到上)或者取代的或者未取代的二价烷基。
更特别地，喜树碱、其类似物或者衍生物含有式(II)所示的喜树碱骨架，其中式(II)中的任意一个烃基都可以被取代，优选1、2、3或者4个烃基被取代。式(II)的取代基可以在很大范围内变化，这种范围使喜树碱、其类似物或者衍生物具有在体外和/或尤其在体内结合DNA拓扑异构酶I的性质。
取代基独立地是相同或者不同的，并且优选是烷基，芳基，卤素，-OR′，＝0，＝NR′，＝N-OR′，-NR′R″，-SR′，-SiR′R″R″′，-OC(O)R′，-C(O)R′，-CO2R′-CONR′R″，-OC(O)NR′R，-NR″C(O)R′，-NR′-C(O)NR″R″′，-NR″C(O)2R′，-NR-C(NR′R″)＝NR″′，-S(O)R′，-S(O)2R′，-S(O)2NR′R″，-NRSO2R′，-CN和-NO2，-R′，-N3，-CH(Ph)2，氟(C1-C4)烷氧基，氟(C1-C4)烷基或者两个相邻的基团可以与携带他们的碳原子一起形成式O(CH2)uO-所示的基团，其中u代表整数1或者2；并且其中R′，R″，R″′和R″″优选独立选自氢，(C1-C8)烷基，(C1-C8)杂烷基，芳基和杂芳基，(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。例如，当本发明的喜树碱类似物包括多于一个R基团时，每个R基团被独立地选择，如同当存在R′，R″，R″′和R″″这些基团中的多个时一样独立选择。所述取代基也可以被取代。例如，任意基团可以用以下的基团取代：至少一个烷基，芳基，卤素，-OR′，＝O，＝NR′，＝N-OR′，-NR′R″，-SR′，-SiR′R″R″′，-OC(O)R′，-C(O)R′，-CO2R′，-CONR′R″，-OC(O)NR′R″，-NR″C(O)R′，-NR′-C(O)NR″R″′，-NR″C(O)2R′，-NR-C(NR′R″)＝NR″′，-S(O)R′，-S(O)2R′，-S(O)2NR′R″，-NRSO2R′，-CN和-NO2，-R′，-N3，-CH(Ph)2，氟(C1-C4)烷氧基，氟(C1-C4)烷基。尤其是取代基选自以下基团：烷基，优选低级烷基；-OR′，其中R′是H；-OC(O)R′，其中R′是烷基，包括杂烷基和更优选杂环烷基，例如哌啶或者哌嗪基；被-NR′R″或者杂烷基和更优选杂环烷基例如哌啶或者哌嗪基取代的烷基；两个相邻的基团可以与携带他们的碳原子一起形成式-O(CH2)uO-所示的基团，其中u代表整数1或者2，优选是2。
除非另有说明，术语“烷基”单独或者作为另一个取代基的一部分表示直链或者支链、或者环烃基，任选被至少一个杂原子包括O、N、Si和S(如下所定义)间断，或者其组合，其可以是完全饱和的、单或者多不饱和的，并且可以包括二价和多价基团，具有指定的碳原子数(即C1-C10表示1到10个碳)。饱和烃基的实例包括但不限于基团例如甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，t-丁基，异丁基，仲丁基，环己基，(环己基)甲基，环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等等的同系物和异构体。非饱和的烷基是具有一或多个双键(例如链烯基)或者三键(例如炔基)的基团。非饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基，2-丙烯基，巴豆基，2-异戊烯基，2-(丁二烯基)，2，4-戊二烯基，3(1，4-戊二烯基)，乙炔基，1-和3-丙炔基，3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另作说明，术语“烷基”还意味着包括下面更详细限定的那些烷基衍生物，例如“杂烷基”。限于烃基的烷基被称为“同烷基(homoalkyl)”。
术语“烷基”单独或者作为另一取代基的一部分包括源自烷的一价或者二价基。在二价基中，可以引用但不限于-CH2-，-CH2CH2-，-CH2CH2CH2-，-CH2CH2CH2CH2-。
通常，烷基具有1到24个碳原子，本发明优选这些基团具有10个或者更少的碳原子。“低级烷基”是更短的链烷基，通常具有8个或者更少的碳原子。
除非另有说明，术语“杂烷基”单独使用或者与另一术语联用时表示稳定的直链或者支链、或者环烃基，或者其组合，其由指定数目的碳原子和至少一个选自O、N、Si和S的杂原子组成，其中氮、碳和硫原子任选被氧化和氮杂原子任选被季铵化。杂原子O、N和S和Si可以位于杂烷基的任意内部位置或者位于烷基与分子其余部分连接的位置。实例包括但不限于-CH2-O-CH3，-CH2-CH2-NH-CH3，-CH2-CH2-N(CH3)-CH3，-CH2-S-CH2-CH3，-S(O)-CH3，-CH2-CH2-S(O)2-CH3，-CH＝CH-O-CH3，-Si(CH3)3，-CH2-CH＝N-OCH3和CH＝CH-N(CH3)-CH3。硅基是指位于杂烷基的任意内部位置或者位于烷基与分子其余部分连接的位置的Si。直至两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-S-(CH3)3。
类似地，术语“杂烷基”单独使用或者作为另一取代基的一部分包括源自杂烷基的二价基，以下举例说明但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。术语“杂烷基”可以包括聚(乙二醇)和其衍生物。此外，对于二价烷基和杂烷基，没有按照基团化学式书写的方向指明连接基团的方向。例如，式-C(O)2R′-代表-C(O)2R′-和-R′C(O)2-。术语“低级”与术语“杂烷基”联用表示具有1到8个碳原子的部分。
术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷基硫”(或者硫代烷氧基)均采用它们的常规含义，是指那些分别通过氧原子、氨基或者硫原子与分子其余部分连接的烷基。
通常，“酰基取代基”也选自上述基团。本文使用的术语“酰基取代基”是指与羰基碳连接并且填充羰基碳的原子价的基团，所述羰基碳与本发明的化合物直接或者间接连接。
除非另有说明，术语“环烷基”和“杂环烷基”单独或者与其他术语联用时分别表示取代或者未取代“烷基”(更优选C1-C10环烷基)和取代或者未取代“杂烷基”(更优选C1-C10杂环烷基)的环状形式。此外，对于杂环烷基，杂原子可以占据杂环与分子其余部分连接的位置。环烷基的实例包括但不限于环戊基，环己基，1-环己烯基，3-环己烯基，环庚基等等。杂环烷基的实例包括但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)，1-哌啶基，2-哌啶基，3-哌啶基，4-吗啉基，3-吗啉基，四氢呋喃-2-基，四氢呋喃-3-基，四氢噻吩-2-基，四氢噻吩-3-基，1-哌嗪基，2-哌嗪基等等。环状结构的杂原子和碳原子任选被氧化。
除非另有说明，术语“卤”或者“卤素”单独或者作为另一取代基的一部分表示氟、氯、溴或者碘原子。此外，术语例如“卤烷基”表示包括单卤烷基和多卤烷基。例如，术语“卤(C1-C4)烷基”表示包括但不局限于三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，4-氯丁基，3-溴丙基等等。
除非另有说明，术语“芳基”表示取代或者未取代的多不饱和、芳香族烃取代基，其可以是被融合在一起或者共价连接的单环或者多环(优选从1到3个环)。术语“杂芳基”是指包含1到4个杂原子的芳基(或者环)，所述杂原子选自N、O和S，其中氮、碳和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。杂芳基可以通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基，1-萘基，2-萘基，4-联苯基，1-吡咯基，2-吡咯基，3-吡咯基，3-吡唑基，2-咪唑基，4-咪唑基，吡嗪基，2-噁唑基，4-噁唑基，2-苯基-4-噁唑基，5-噁唑基，3-异噁唑基，4-异噁唑基，5-异噁唑基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-嘧啶基，4-嘧啶基，5-苯并噻唑基，嘌呤基(purinyl)，2-苯并咪唑基，5-吲哚基，1-异喹啉基，5-异喹啉基，2-喹喔啉基，5-喹喔啉基，3-喹啉基和6-喹啉基。
上述各种芳基和杂芳基环状系统的取代基选自如下所述可接受的取代基。“芳基＂和“杂芳基”还包括环状系统，其中一或多个非芳香环系统与芳基或者杂芳基系统融合或者结合。
为了简便起见，当与其他术语(例如芳氧基，芳硫氧基(arylthioxy)，芳烷基)联用时，术语“芳基”包括如上文限定的芳基和杂芳基环。
因此，术语“芳烷基”包括芳基与烷基连接的那些基团(例如苯甲基，苯乙基，吡啶基甲基等等)，所述烷基包括其中碳原子(例如亚甲基)已经被例如氧原子取代的那些烷基(例如苯氧基甲基，2-吡啶基氧基甲基，3-(1-萘基氧基)丙基等等)。
在喜树碱、其类似物和衍生物中，可以更优选引用下列专利/专利申请中描述的化合物：WO 99/09996，WO 99/65493，WO 00/53607，EP 1 101 765，EP 137,145，EP 074,256，US 4,604,463，EP 56,692，EP 88,642，EP 296,612，EP321,122，EP 325,247，EP 540,099，EP 737,686，WO 90/03169，WO 96/37496，WO 96/38146，WO 96/38449，WO 97/00876，US 7,104,894，这些文献的内容在此引入作为参考。
在优选的实施方案中，喜树碱骨架如式(II)所示，其中t是0，Z是如上文限定的COO基团，其可以用下式(III)表示：
Figure G2007800199329D00171
根据更优选的实施方案，喜树碱骨架用下式(IV)表示：
Figure G2007800199329D00172
更特别地，喜树碱、其类似物或者衍生物含有式(III)、更优选式(IV)所示的喜树碱骨架，其中任意烃基都可以如上文限定被取代。
尤其是喜树碱、其类似物和衍生物选自依立替康，托泊替康，GI-147211C，SN38，7-羟甲基喜树碱，9-氨基喜树碱(9-AC)，7-氨基甲基喜树碱，10-羟基喜树碱和(20S)-喜树碱(称为喜树碱)。所述化合物的结构如下所示：
Figure G2007800199329D00181
(20S)-喜树碱                       SN-38
Figure G2007800199329D00182
7-羟甲基喜树碱                    托泊替康
Figure G2007800199329D00183
GI-147211C
Figure G2007800199329D00184
依立替康
Figure G2007800199329D00191
7-氨基甲基喜树碱
9-氨基喜树碱
药物部分可以与载体部分直接或者间接连接。在优选的实施方案中，其中所述药物部分与所述载体间接连接，键可以是例如下面所述的中间键合基团，所有这类连接基团和如下所述的其他基团在以下均称为连接子部分，或者来源于下面限定的交联试剂。
根据本发明，每个载体部分与至少一个药物部分连接，更优选与一个药物部分连接。
在一个特定实施方案中，将载体部分制备为例如有利于与超过一个的药物部分连接，各药物部分可以是相同的也可以是不同的。例如，载体部分可以包括自身促进连接超过一个药物部分的组分，例如天然氨基酸如半胱氨酸的衍生物，或者插入具有多个活性位点的多价合成氨基酸或者连接子。采用这种方式，单个载体部分可以载有2到10个或者更优选4到5个药物部分。还在这种实施方案中，各药物部分可以通过相同或者不同的连接子基团与载体部分直接或者间接连接。当连接超过一种不同类型的药物部分时，就可以协调各个药物的比例和剂量以有利于特异药物组合的给药。
可以通过所述药物部分的任意合适官能团例如羟基、羧基或者氨基进行直接连接。
优选的间接连接将通过连接部分进行。连接部分还提供分子内柔性或者调节缀合的结构域之间的分子内距离，从而有助于维持生物学活性。合适的连接部分包括双功能和多功能有机基团，其独立地选自取代或者未取代的烷基，取代或者未取代的杂烷基，取代或者未取代的芳基，取代或者未取代的杂芳基、醛类、酸类、酯类、酐类、巯基或者羧基，例如下面限定的马来酰亚胺基衍生物，马来酰亚胺基环己烷衍生物，马来酰亚胺基安息香酸衍生物，马来酰亚胺基己酸衍生物和琥珀酰亚胺基衍生物或者可以源自溴化氰或者氯化氰，琥珀酰亚胺酯或者磺酸卤化物和类似物或者其组合。
上述术语(例如“烷基”，“杂烷基”，“芳基”和“杂芳基”)包括指定基团的取代和未取代的两种形式。下面提供各种类型基团优选的取代基。
烷基和杂烷基(包括那些经常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基)的取代基一般分别被称为“烷基取代基”和“杂烷基取代基”，它们可以是但不限于选自以下基团的一或多种不同基团：-OR′，＝O，＝NR′，＝N-OR′，-NR′R″，-SR′，-卤素，-SiR′R″R″′，-OC(O)R′，-C(O)R′，-CO2R′，-CONR′R″，-OC(O)NR′R″，-NR″C(O)R′，-NR′-C(O)NR″R″′，-NR″C(O)2R′，-NR-C(NR′R″)＝NR″′，-NR-C(NR′R″)＝NR″′，-S(O)R′，-S(O)2R′，-S(O)2NR′R″，-NRSO2R′，NRR′SO2R″，-CN和-NO2，其数量从0到(2m′+1)，其中m′是这类基团上碳原子的总数。R′，R″，R″′和R″″均优选独立地是指氢，取代或者未取代的杂烷基，取代未取代的芳基，例如用1-3个卤素取代的芳基，取代或者未取代的烷基，烷氧基或者硫代烷氧基，或者芳烷基。例如当本发明的化合物包括多于一个R基团时，每个R基团被独立地选择，就如当存在R′，R″，R″′和R″″这些基团中的多个时一样独立地选择。当R′和R″与相同的氮原子连接时，它们可以和氮原子结合形成5-、6-或者7-元环。例如，NR′R″表示包括但不局限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据上文关于取代基的讨论，本领域技术人员将了解术语“烷基”意在包括包含与氢基以外的基团结合的碳原子的基团，例如卤烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3，-C(O)CF3，C(O)CH2OCH3等等)。
与对于烷基描述的取代基类似，芳基取代基和杂芳基取代基一般分别被称为“芳基取代基”和“杂芳基取代基”，它们是不同的并选自例如：卤素，-OR′，＝O，＝NR′，＝N-OR′，-NR′R″，-SR′，-卤素，-SiR′R″R″′，-OC(O)R′，-C(O)R′，-CO2R′，-CONR′R″，-OC(O)NR′R″，-NR″C(O)R′，-NR′-C(O)NR″R″′，-NR″C(O)2R′，-NR-C(NR′R″)＝NR″′，-S(O)R′，-S(O)2R′，-S(O)2NR′R″，-NRSO2R′，-CN和-NO2，-R′，-N3，-CH(Ph)2，氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数量从0到芳香环体系中开放化合价的总数；其中R′，R″，R″′和R″″优选独立选自氢，(C1-C8)烷基和杂烷基，未取代的芳基和杂芳基，(未取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。例如当本发明的连接部分包括多于一个R基团时，每个R基团独立选择，就如当存在R′，R″，R″′和R″″这些基团中的多个时一样独立选择。
芳基或者杂芳基环上相邻原子的两个芳基取代基任选用式-T-C(O)-(CRR′)v-U-所示的取代基取代，其中T和U独立是NR-，-O-，-CRR′-或者单键，v是从0到3的整数。或者，芳基或者杂芳基环上相邻原子的两个取代基任选用式-A-(CH2)x-B-所示的取代基取代，其中A和B独立是-CRR′-，-O-，-NR-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2NR′-或者单键，x是从1到4的整数。这样形成的新环的单键之一任选用双键取代。或者，芳基或者杂芳基环上相邻原子的两个取代基任选用式-(CRR′)b-X-(CR″R″′)d-所示的取代基取代，其中b和d独立是从0到3的整数，X是-O-，-′-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-或者-S(O)2NR′-。取代基R，R′，R″和R″′优选独立选自氢或者取代或者未取代的(C1-C6)烷基。
本文使用的术语“杂原子”包括氧(O)，氮(N)，硫(S)和硅(Si)。
就像之前使用的，符号“R”是代表取代基团的常见缩写，选自取代或者未取代的烷基，取代或者未取代的杂烷基，取代或者未取代的芳基，取代或者未取代的杂芳基，和取代或者未取代的杂环基团。
一方面用于在连接子和药物之间以及另一方面用于在连接子和载体部分之间形成共价键的连接子部分上的官能团(即活性基团)可以是相同的(即同官能团)或者优选不同类型的官能团(即杂官能团)，更特别包括氨基，肼基，羟基，硫醇，马来酰亚胺基，羰基和羧基。根据优选的实施方案，所述官能团选自羧基(-COOH)和马来酰亚胺基。所述连接子部分可以包括1到4个氨基酸残基的短序列，所述短序列任选包括硫醇，通过其连接子部分与载体部分连接。
在特定的实施方案中，可以通过交联剂实现载体部分与药物部分的偶联。存在数种可供使用的分子间交联剂，参见例如Means and Feeney，CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS，Holden-Day，1974，pp.39-43。这些试剂是例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)或者N，N′-(1，3-苯撑)双马来酰亚胺(这两种试剂对巯基高度特异，并且形成不可逆的连接)；N，N′-亚乙基-双-(碘乙酰胺)或者其他这类具有6到11个碳亚甲基桥的试剂(其对巯基相对特异)；和1，5-二氟-2，4-二硝基苯(其与氨基和酪氨酸基团形成不可逆的连接)。可用于该目的的其他交联试剂包括：p，p′-二氟-N，N′-二硝基二苯砜(其与氨基和苯酚基形成不可逆的交叉连接)；己二亚胺酸二甲酯(dimethyl adipimidate)(其对氨基特异)；苯酚-1，4-二磺酰氯(其主要与氨基反应)；六亚甲基二异氰酸酯或者二异硫氰酸酯，或者偶氮苯基-p-二异氰酸酯(其主要与氨基反应)；戊二醛(其与数种不同的侧链反应)和disdiazobenzidine(其主要与酪氨酸和组氨酸反应)；N-3-马来酰亚胺基丙酸；N-6-马来酰亚胺基己酸；N-11-马来酰亚胺基十一酸，4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰氨基已酸；4-[(N-马来酰亚胺基乙基)甲酰氨基乙基(Peg)4甲酰氨基甲基]环己烷羧酸。
如前所述，交联剂可以是同双功能的，即具有进行相同反应的两个官能团。同双功能交联剂的实例是双马来酰亚胺基己烷(bismaleimidohexane，“BMH”)。BMH含有两个马来酰亚胺官能团，所述官能团在温和条件下(pH6.5-7.7)特异与含巯基化合物反应。所述两个马来酰亚胺基团通过烃链连接。因此，BMH可用于含半胱氨酸残基的多肽的不可逆交联。交联剂也可以是异双功能的。异双功能交联剂具有两个不同的官能团，例如胺活性基团和硫醇活性基团，它们将分别交联具有游离胺和硫醇的两个部分。优选的异双功能交联剂是4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(″SMCC″)，琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基(6-酰氨基己酸酯)(″LC-SMCC″)，N-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(″MBS″)和4-(p-马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(″SMPB″)，一种MBS的伸展链类似物。这些交联剂的琥珀酰亚胺基团与伯胺反应形成酰胺键，硫醇-反应性马来酰亚胺与硫醇基(例如半胱氨酸的)形成共价硫醚键。
交联剂通常在水中具有低溶解度。亲水性部分例如磺酸基可以添加到交联剂以提高其水溶性。硫代-MBS和硫代-SMCC是进行水溶性改性的交联剂的实例。
许多交联剂产生一种在细胞条件下基本上不可切割的缀合物。但是，一些交联剂含共价键，例如二硫化物，其在细胞条件下是可切割的。例如，Traut′s试剂，二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(″DSP″)和N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(″SPDP″)是公知的可切割交联剂。直接的二硫键也是有用的。
许多交联剂，包括上文讨论的那些，是可商购。从商品供应商那里可以轻易获得关于它们使用的详细说明书。关于蛋白交联和缀合制剂的一般参考文献是：Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION ANDCROSS-LINKING，CRC Press(1991)。
根据缀合时在生物体液(例如人血浆)中的稳定性可以区分本发明使用的连接子。术语“稳定性”被定义为从本发明缀合物释放的喜树碱衍生物的半衰期，这取决于选择的连接子。有利地，本发明的缀合物是稳定的，尤其是它表现出1，2，3，4，5，6，7，8，9或者10小时的半衰期。不稳定的缀合物将释放更短半衰期的药物部分，例如<5分钟。高度稳定的缀合物具有超过11小时的血浆半衰期。优选地，缀合物在体外人血浆中是稳定的，37℃的半衰期为大约1到6.5小时。按照实施例II的描述测定缀合物的半衰期。
优选的本发明的异双功能交联剂包括游离-COOH基团和游离马来酰亚胺基团。这类交联剂可以引用下列化合物：
Figure G2007800199329D0023161952QIETU
N-3-马来酰亚胺基丙酸
PIERCE出售(Ref：22296)
更特别地，本发明的缀合物衍生自下列交联剂：
Figure G2007800199329D0023162108QIETU
N-6-马来酰亚胺基己酸
Sigma出售(Ref：M8904)
Figure G2007800199329D0023162128QIETU
N-11-马来酰亚胺基十一酸
PIERCE出售(Ref：22211)
Figure G2007800199329D0024162259QIETU
4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰氨基已酸
Figure G2007800199329D0024162328QIETU
4-[(N-马来酰亚胺基乙基)甲酰氨基乙基(Peg)4甲酰氨基甲基]环己烷羧酸
Figure G2007800199329D0024162406QIETU
4-[(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰氨基己烷甲酰氨基甲基]环己烷羧酸
Figure G2007800199329D0024162420QIETU
4-[((N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酰氨基)甲基]环己烷羧酸
本文中，本发明的另一个目的涉及新化合物、其盐和/或异构体，尤其是适合作为交联剂的化合物，如下式(V)所示：
Figure G2007800199329D0024162454QIETU
其中B是取代或者未取代的环烷基，R1和R2独立地是不存在的(即共价键)或者是取代或者未取代的二价烷基、杂烷基、芳基或者杂芳基。
这类交联剂是非常有用的，因为如此获得的缀合物在体外在人血浆中有利地稳定，37℃的半衰期超过5分钟。
式(V)引用的基团如上文所限定。
在一个特定的实施方案中，所述化合物如式(V)所示，其中R1是取代或者未取代的二价烷基、杂烷基、芳基或者杂芳基，R2是不存在的或者是取代或者未取代的二价烷基、杂烷基、芳基或者杂芳基。
在另一个特定的实施方案中，所述化合物如式(V)所示，其中至少一个R1和R2被选自下列基团的至少一个二价基团间断：-O-，-NR′-，-SR′-，-SiR′R″-，-OC(O)-，-C(O)-，-CO2-，-CONR′-，-NR′CO-，-OC(O)NR′-，-NR″OC(O)-和-NR″C(O)2-，其中R′和R″独立地如上文所限定，尤其是R′和R″选自如上文限定的氢，(C1-C8)烷基，(C1-C8)杂烷基，芳基和杂芳基。
当R1和/或R2被至少一个二价基团间断时，所述间断可以位于R1和/或R2基团的任意内部位置或者位于R1和/或R2与式(V)所示化合物的其余部分连接的位置。
在特定的实施方案中，本发明涉及式(V)所示的化合物，其中：
-B是环(C3-C8)烷基，优选未取代的环烷基，包括环戊基或者环己基，和/或
-R1是杂烷基，尤其是包括聚(乙二醇)(即PEG)和其衍生物，例如PEG-3、PEG-4、PEG-5或者PEG-6，和/或
-R1是直链(C1-C8)烷基链，尤其是-CH2-或者-CH2CH2-，和/或
-R1是(C1-C8)烷基链，任选被选自下列基团的至少一个、优选一或两个二价基团间断：-OC(O)-，-CO2-，-CONR′-，-NR′CO-，-OC(O)NR′-和-NR″C(O)2-，优选-CONR′-或者-NR″OC(O)-，其中R′和R″彼此独立优选选自氢和(C1-C8)烷基，和任选所述(C1-C8)烷基链包括如上文限定的至少一个环烷基链，和/或
-R2不存在，和/或
-R2是杂烷基，尤其是包括聚(乙二醇)(即PEG)和其衍生物，例如PEG-3、PEG-4、PEG-5或者PEG-6，和/或
-R2是直链(C1-C8)烷基链，尤其是-CH2-或者-CH2CH2-，和/或
-R2是(C1-C8)烷基链，任选被选自下列基团的至少一个、优选一或两个二价基团间断：-OC(O)-，-CO2-，-CONR′-，-NR′CO-，-OC(O)NR′-和-NR″C(O)2-，优选-CONR′-或者-NR″OC(O)-，其中R′和R″彼此独立优选选自氢和(C1-C8)烷基，和任选所述(C1-C8)烷基链包括如上文限定的至少一个环烷基链。
特别地，式(V)所示的化合物可以用上文鉴定的化合物说明，即：
4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰氨基已酸，
4-[(N-马来酰亚胺基乙基)甲酰氨基乙基(Peg)4甲酰氨基甲基]环己烷羧酸，
4-[(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰氨基己烷甲酰氨基甲基]环己烷羧酸，或者
4-[((N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酰氨基)甲基]环己烷羧酸。
式(V)所示的化合物可以用本领域公知的的不同方法制备。特别地，式(V)所示的化合物可以用实施例中描述的方法制备。根据本发明的特定方面，所述缀合物包括如上述与载体部分连接的药物部分，其中所述药物部分与所述载体部分通过连接子共价连接，所述连接子得自上述式(V)所示的化合物(交联剂)。
根据这个特定实施方案，本发明的缀合物更特别的如下式(VI)所示：
Figure G2007800199329D00261
其中X是如上文限定的载体部分(CPP)，尤其如式(I)所示，其与化合物的其余部分通过硫醚键连接，及
B、R1、R2是如上文限定的基团，
和Y是如上文限定的药物部分，尤其是SN38部分，
在另一个特定的实施方案中，所述缀合物如式(VI)所示，其中Y通过下列键与缀合物的其余部分连接：硫醚、腙、酰胺、酯、醚、氨基甲酸酯或者硫代氨基甲酸酯键，更特别是通过醚键(-O-)、二硫键或者硫醚键。
本文描述的缀合物，包括式(VI)所示的那些，是新的化学实体。在本发明的一个特定方面，本发明的缀合物包括其中载体部分如式(I)所示(包括上文确定的任意优选实施方案)以及任选其中连接子基团来源于包括游离-COOH基团和游离马来酰亚胺基团的交联剂、尤其是来源于N-6-马来酰亚胺基己酸和4-[((N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酰氨基)甲基]环己烷羧酸的那些缀合物。
本文公开的特定化学实体包括但不限于：
Figure G2007800199329D00271
其中X如上文限定，尤其是DPV3，DPV3.10，DPV6，DPV7，DPV7b，DPV15，DPV15b，DPV1047，DPV1048，DPV10或者DPV10/6，和甚至更优选是DPV3，DPV15，DPV15b或者DPV1047。
本发明还涉及制备相同化学实体的方法。
本发明的缀合物可以通过本领域已知的任意方法制备。例如，载体部分(或者肽)可以利用常规的溶液-或者固相肽合成法制备。然后这种肽就可以与药物部分、药物部分的适当反应性衍生物或者交联剂直接反应。
药物部分或者其衍生物可以通过例如以下的键形成与载体部分连接：硫醚、腙、酰胺、酯、醚、氨基甲酸酯、硫代氨基甲酸酯或者二硫键形成。
或者，通过交联剂尤其是式(V)所示的交联剂与载体部分的合适官能团尤其是硫醇基团的反应引入如上所述的尤其是用于制备式(VI)所示缀合物的连接子基团，然后在连接子基团和药物部分之间形成共价键。式(V)所示缀合物的特定实施方案中，所述药物具有合适的官能团与连接子形成共价键。所述合适的官能团更优选是羟基以便在连接子基团和药物部分之间形成酯键。尤其是通过载体部分的合适官能团与例如二价或者三价化学基团的逐次延伸可以获得多价药物-输送缀合物。
根据另一个优选的实施方案，在与载体部分反应前，交联剂先与药物部分偶联。
利用这些方法，技术人员能够利用各种连接子部分制备各种各样的药物-载体缀合物。如下面举例说明的，可以选择药物部分上的合适基团以连接载体部分，以及如果需要，连接子连接药物或者载体部分，或者二者均在它们偶联前进行。或者，也可以对药物进行修饰以允许缀合。
本发明的缀合物可以与生理上可接受的支持物、载体或者赋形剂一起配制为药物，所述药物通过各种方法用于兽医，例如用于哺乳动物并且尤其是人类。
本发明涉及本发明的缀合物用于下述治疗的用途。因此，本发明的范围扩展到本发明的化合物用于制备治疗或者预防上文所述疾病的药剂(或者药物)的用途。因此，本发明的缀合物可以被掺入组合物，优选适于给药的药物组合物。这种组合物通常包括至少一种本发明的缀合物或者缀合物的混合物，并且任选包括药学上可接受的载体。
本文使用的“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。这类介质和药剂用于药学活性物质的用途是本领域公知的。除非任意常规介质或者试剂与本发明的活性缀合物不相容，那么均可以预期其在组合物中的使用。所述组合物中还可以掺入辅助活性化合物。
本发明的组合物优选药物组合物被配制为与其预定的给药途径相容。给药途径的实例包括静脉内推注或者输注，真皮内、皮下、腹膜内、肌内、口服(例如吸入)、透皮(例如局部)、颅内、椎管内和透粘膜给药。用于这些给药途径的溶液或者悬浮液可以包括下列组分：无菌稀释剂例如注射用水，盐溶液，非挥发油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或者其他合成溶剂；抗菌剂例如苯甲醇或者对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠；螯合剂例如依地酸；缓冲液比如乙酸盐，柠檬酸或者磷酸盐和用于张力调整的物质例如氯化钠或者葡萄糖。利用酸或者碱例如盐酸或者氢氧化钠可以调节pH。肠胃外制剂可以装入安瓿、一次性注射器或者由玻璃或者塑料制成的多剂量小瓶。
适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或者分散剂和用于无菌注射溶液或者分散剂的临时制备的无菌粉末。对于静脉内给药，合适的载体包括生理盐水，抑菌水，Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或者磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况下，所述组合物必须是无菌的并且应该流动到能够给药的程度。它在制备和储存条件下应该是稳定的并且必须保持抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。所述载体可以是溶剂或者分散介质，含例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液态聚乙二醇等等)和其合适的混合物。例如，通过使用包衣例如卵磷脂，就分散剂来说通过维持要求的粒度以及通过使用表面活性剂可以维持适当的流动性。微生物作用的预防可以通过不同的抗细菌剂和抗真菌剂实现，例如对羟苯甲酸类，氯丁醇，苯酚，抗坏血酸，硫柳汞等等。很多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇例如甘露醇，山梨糖醇，氯化钠。通过在组合物中包括延缓吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶可以实现注射组合物的延长吸收。
通过将所需量的本发明缀合物以及上文列举的一种成分或者成分组合掺入合适的溶剂可以制备无菌注射溶液，然后根据需要过滤灭菌。通常，通过将本发明的活性缀合物掺入无菌载体来制备分散液，所述载体含有碱性分散介质和来自那些上文列举的所需其他成分。就用于制备无菌注射溶液的无菌粉末来说，优选的制备方法是真空干燥和冻干，这产生一种活性成分以及任意其他所需成分的粉末，所述其他所需成分来自其先前无菌过滤的溶液。
口服组合物通常包括惰性稀释剂或者可食载体。它们可以被装入胶囊或者压成片剂。为了口服治疗给药目的，本发明的活性缀合物可以与赋形剂混合，并且以片剂、锭剂或者胶囊的形式使用。还可以使用液体载体将口服组合物制备为漱口剂，其中所述液体载体中的本发明缀合物被口服使用，swished，咳出或者吞服。药学上相容的结合剂和/或佐剂材料可以被包括作为所述组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、锭剂等等可能含任意下列成分或者相似性质的化合物：结合剂例如微晶纤维素，西黄蓍胶或者明胶；赋形剂例如淀粉或者乳糖，崩解剂例如藻酸，Primogel，或者玉米淀粉；润滑剂例如硬脂酸镁或者Sterotes；助流剂例如胶体二氧化硅；甜味剂例如蔗糖或者糖精；或者调味剂例如薄荷，水杨酸甲酯，或者柑桔调味料。
对于通过吸入给药，本发明的缀合物以气溶胶喷雾的形式从压力容器或者分配器或者喷雾器输送，所述分配器含有合适的喷射剂例如气体例如二氧化碳。
全身性给药还可以通过透粘膜或者透皮方法。对于透粘膜或者透皮给药，在制剂中使用对将渗透的屏障合适的渗透剂。这类渗透剂通常是本领域已知的，并且包括例如对于透粘膜给药来说是去污剂、胆盐和褐霉酸衍生物。通过利用鼻腔喷雾或者栓剂可以实现透粘膜给药。对于透皮给药，本发明的活性缀合物被配制入本领域公知的软膏、油膏、凝胶或者乳剂。
本发明的缀合物还可以被制备成栓剂形式(例如利用常规栓剂基质例如可可脂和其他甘油酯类)或者用于直肠输送的保留灌肠剂形式。
在一个实施方案中，本发明的活性缀合物与载体一起配制，所述载体保护本发明的缀合物被机体快速清除，所述载体例如是控释制剂，包括埋植剂和微囊或者大包囊化的输送系统。
可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚正酯类，聚乙二醇和聚乳酸，或者其组合。
制备这类制剂的方法对本领域技术人员来说是显而易见的。
所述材料还可以例如从Alza Corporation购买，也可以被用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如如美国专利4,522,811中所述。
特别有利的是配制剂量单位形式的口服或者肠胃外组合物以便给药和剂量统一。本文使用的剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单一剂量的物理分离单位；每个单位含有预定量的本发明活性缀合物以及所需的药物载体，所述预定量的本发明活性缀合物预期产生所需的治疗效果。本发明剂量单位形式的规格由以下因素确定并直接取决于它们：本发明活性缀合物的独特性质和待实现的特定治疗效果，以及本发明活性缀合物这类化合物用于个体治疗领域中的固有局限性。
本发明这类缀合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或者实验动物模型中的标准医药步骤确定，例如测定MTD(最大耐受剂量)，TGI(定义为100-T/C(％)的肿瘤生长抑制率(TGI％))和T/C(治疗动物的平均肿瘤体积相对于对照组的平均肿瘤体积的比例)。治疗功效和毒性之间的剂量比例是治疗指数，其可以表示为ED50/LD50的比值。显示更高治疗指数的本发明缀合物是优选的。尽管可以使用显示毒性副作用的本发明缀合物，但应该考虑设计一个输送系统将本发明的这类缀合物靶向患病组织部位以便将对非肿瘤细胞的潜在损害最小化，从而减少副作用。
在配制给人使用的剂量范围时可以使用从动物研究获得的数据。本发明这类缀合物的剂量优选处于包括有效剂量水平的范围内，并且其毒性是可接受或者不存在。该范围内的剂量可能是不同的，这取决于使用的剂型和给药途径。对于本发明方法使用的任何本发明缀合物，最初都可以从动物模型的分析估算治疗有效剂量。这类信息可用于更精确地确定人类的有效剂量。
含有本发明缀合物的组合物的治疗有效量(即有效剂量)可以由本领域技术人员轻易确定。例如，治疗有效量是抑制至少20％的异种移植的人类癌症的肿瘤生长的量。在某些实施方案中，更高的抑制百分比例如45、50、75、85、90％或者更高的百分比是优选的。示范性的剂量包括毫克或者微克量的本发明化合物每千克受试者体重(例如大约1微克每公斤到大约1克每公斤，大约1微克每公斤到大约50微克每公斤，或者大约50微克每公斤到大约5毫克每公斤)。组合物可以每周给药至少一次，但是也可以每天一次或者每2、3、4、5或者6天一次，持续大约1至10周，例如2至8周或者大约3至7周，或者持续大约4、5或者6周。
本领域技术人员将理解某些因素可能影响有效治疗受试者所要求的剂量和时间，包括但不限于疾病或者紊乱的严重性，先前的治疗，受试者的一般健康状态和/或年龄，以及其他疾病。此外，利用治疗有效量的组合物对受试者的治疗可以包括单一治疗或者一系列治疗。
还应理解，考虑到被调节的表达或者活性，组合物的合适剂量依赖于组合物的效力。
当将一或多种本发明的这些化合物给予动物(例如人)时，医生、兽医或者研究人员例如可以首先给出相对低的剂量，随后提高剂量直到获得适当的应答。此外，应当理解对于任何特定受试者的特定剂量水平将依赖于各种因素，包括使用的本发明特定化合物的活性，受试者的年龄、体重、一般健康状态、性别和饮食，给药时间，给药途径，排泄速率，任何药物组合，以及表达或者活性被调节的程度。
药物组合物可以与给药说明书一起装入容器、包装或者分配器中。
在一个特定实施方案中，可以治疗有效量将本发明的化合物与其他治疗方案或者药物(例如多重药物方案)同时或者依次给予。特别地，其他治疗方案或者药物是抗癌治疗或者药物，例如5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂(oxaliplatine)、卡培他滨(capecitabine)、长春花新碱、塞来昔布(celebrex)、替莫唑胺(temozolomide)、微量元素(例如硒)、沙利度胺(thalidomide)、西妥昔单抗(cetuximab)、吉西他滨(gemcitabine)、多西紫杉醇(docetaxel)、3-AP(
Figure G2007800199329D00311
)、卡铂(carboplatine)、硼替佐米(bortezomib)、贝伐单抗(bevacizumab)、索拉非尼(sorafenib)、顺铂(cisplatin)、吉非替尼(gefitinib)、flavopiridol、elvorin、卡铂、氨柔比星(amrubicin)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、培美曲塞(pemetrexed)、埃罗替尼(erlotinib)、丝裂霉素C、AMG706、帕尼妥单抗(panitumab)、紫杉醇、雷替曲塞(raltitrexed)、伊马替尼(imatinib)、阿昔单抗(abciximab)、英夫利昔单抗(infliximab)、帕利珠单抗(palivizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、吉姆单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)或替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)。
当进行同时给药时，活性药物可以在相同的或者不同的组合物中给予。这种联合治疗(cotreatment)的目的在于增强疗效和/或减少毒性。
在另一个特定实施方案中，本发明涉及放疗与本发明化合物的联用，其同时或者依次施用。
根据另一方面，本发明涉及有效量的至少一种如上所述的本发明化合物在制备用于治疗疾病、尤其是癌症的药物组合物中的用途。
根据本发明优选的可以使用的化合物包括如上文限定的任何亚组和如上文鉴定的任何特定化合物。
本发明的另一个目的是治疗癌症的方法，包括给予需要这类治疗的患者有效量的至少一种如上所述的化合物。
因为本发明的缀合物包含药物部分，所以本发明的缀合物适用于治疗各种情况下的各种疾病。在这方面，“治疗”包括治疗性和预防性治疗。因此，可以在疾病非常早期的阶段或者在其显著进展包括转移后使用所述缀合物。术语“治疗”尤其表示患者负荷的降低，例如细胞增殖率的降低，患病增殖细胞的破坏，肿瘤质量或者肿瘤大小的降低，肿瘤转移的减少，肿瘤进展的延缓，以及完全的肿瘤抑制，存活率的提高或者任何其他适当的临床终点。
本发明的缀合物尤其适合于治疗癌症，例如实体瘤或者淋巴瘤。特定实例包括结肠癌，肺癌(即小细胞、非小细胞、支气管癌)，胰腺癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，肝癌，头、胃和颈癌，膀胱癌，非何杰金氏淋巴瘤，黑素瘤，白血病，成神经细胞瘤和恶性胶质瘤。
所述缀合物可以采用不同途径给药，通常通过注射，例如全身注射。优选的给药途径是静脉内通过推注或者输注，持续15分钟至1或者2天。但是，也可以使用其他给药途经，例如肌内、真皮内、皮下、瘤内等等。此外，如果需要，可以进行重复注射。
本发明的另一个目的是减少癌细胞增殖的方法，通过给予患有癌症的受试者有效量的本发明缀合物。
本发明的另一个目的是治疗转移癌的方法，通过给予需要这类治疗的受试者有效量的本发明缀合物。
本发明的另一个目的是如上文限定的缀合物在制备用于治疗转移性癌或者减少癌细胞增殖的药物组合物中的用途。
本发明的其他方面和优点将在下面的实施例中公开，其应被认为是说明性的，不是用于限制本申请的范围。
实施例
I.材料和方法
I.1a  细胞渗透肽(CPP)
DPV3：Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser(SEQ ID NO.1)
DPV1047：Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met Asp Val(SEQ ID NO.8)
DPV15：Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg(SEQ ID NO.10)
DPV15b：Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Arg Glu ArgGln Ser Arg(SEQ ID NO.11)
DPV7：Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro(SEQ ID NO.3)
Tat48-60：Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln(SEQ ID NO.44)
穿膜肽：Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys(SEQ ID NO.29)
DPV51(D)：D-Lys D-Arg Gly D-Leu D-Lys D-Leu D-Arg D-His(SEQ ID NO.51)
DPV1047(D)：Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg Met AspVal(SEQ ID NO.8，采用D构像)
为了让CPP和连接子-SN38部分缀合(参见实施例1.4)：
-DPV3、DPV15、DPV7和Tat48-60在氨基酸序列的C末端位置还包含一个半胱氨酸(Cys)。
-DPV1047、DPV15b、穿膜肽和DPV51在氨基酸序列的N末端位置还包含一个半胱氨酸(Cys)。
通过Neosystem，France合成所述氨基酸序列。
I.1b  非细胞渗透肽
PolyE(16)：Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu(SEQ ID NO.52)
为了让PolyE(16)和连接子-SN38部分缀合(参见实施例1.4)，PolyE(16)还在氨基酸序列的N末端位置包含一个半胱氨酸(Cys)。
通过Neosystem，France合成所述氨基酸序列。
I.2  连接部分(连接子)
连接子#1：
N-3-马来酰亚胺基丙酸
(PIERCE，France，产品Ref：22296)
连接子#2(也称为″MIC″)：
N-6-马来酰亚胺基己酸
(SIGMA，France，产品Ref：M8904)
Figure G2007800199329D0034162652QIETU
连接子#3：
N-11-马来酰亚胺基十一酸
(PIERCE，France，产品Ref：22211)
连接子#4：
4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰氨基已酸
Figure G2007800199329D0034162818QIETU
连接子#5(也称为″BCH″)
4-[((N-马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酰氨基)甲基]环己烷羧酸
Figure G2007800199329D0035162847QIETU
连接子#6：
4-[(N-马来酰亚胺基乙基)甲酰氨基乙基(Peg)4甲酰氨基甲基]环己烷羧酸，
Figure G2007800199329D0035162910QIETU
连接子#7：
4-[(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧基-6-酰氨基己烷甲酰氨基甲基]环己烷羧酸
I.3连接子4至7的合成
I.3.1连接子#4的合成
将于DMF(100mL)的琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯(PIERCE Ref：22360)(25mmol)溶液搅拌5分钟，然后在室温下将其添加到于H2O(50mL)的6-氨基己酸(50mmol)(SIGMA Ref：A2504)溶液。室温下搅拌所述混合物4h。添加二氯甲烷(100mL)，先用水(3×150mL)然后用5％水性柠檬酸(3×150mL)洗涤有机层以除去过量的6-氨基己酸。真空干燥所述有机层，并将所获白色粉末保存在-20℃。
I.3.2  连接子#5(″BCH″)的合成
将于DMF(100mL)的琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯(PIERCE Ref：22360)(25mmol)溶液搅拌5分钟，然后在室温下将其添加到于H2O(50mL)的反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸(50mmol)(SIGMARef：08455)溶液。室温下搅拌所述混合物4h。添加二氯甲烷(100mL)，先用水(3×150mL)然后用5％水性柠檬酸(3×150mL)洗涤有机层以除去过量的反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸。真空干燥所述有机层，并将所获白色粉末保存在-20℃。
I.3.3  连接子#6的合成
将于DMF(100mL)的Mal-dPeg4-NHS(Quanta BioDesign Ref：10214)(25mmol)溶液搅拌5分钟，然后在室温下将其添加到于H2O(50mL)的反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸(50mmol)(SIGMA Ref：08455)溶液。室温下搅拌所述混合物4h。添加二氯甲烷(100mL)，先用水(3×150mL)然后用5％水性柠檬酸(3×150mL)洗涤有机层以除去过量的反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸。真空干燥所述有机层，并将所获白色粉末保存在-20℃。
I.3.4  连接子#7的合成
将于DMF(100mL)的琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基-[6-氨基己酸])(PIERCE Ref：22362)(25mmol)溶液搅拌5分钟，然后在室温下将其添加到于H2O(50mL)的反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸(50mmol)(SIGMA Ref：08455)溶液。室温下搅拌所述混合物4h。添加二氯甲烷(100mL)，先用水(3×150mL)然后用5％水性柠檬酸(3×150mL)洗涤有机层以除去过量的反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸。真空干燥所述有机层，并将所获白色粉末保存在-20℃。
I.4  喜树碱和其衍生物
Figure G2007800199329D0036163052QIETU
I.5制备CPP-连接子-SN38缀合物的方法
按照下文描述的方法制备CPP-连接子-SN38缀合物。利用上文所述的不同连接子，采用相同的方法将不同的CPP缀合到SN38。
10-O-连接子-SN38的制备
SN38和连接子在于N-甲基-2-吡咯烷酮的O-(1H-6氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲介导下进行缩合。在利用二氯甲萃取并通过水洗涤除去N-甲基-2-吡咯烷酮后，中间产物连接子-SN38被分离并且通过从二氯甲烷/甲基叔丁基醚沉淀而纯化。
合成途径的实例：
在0℃将于N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(50mL)的连接子(15.29mmol，例如MIC是3.23g)和O-(1H-6氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HCTU)(6.1g，14.74mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA)(5.4mL，30.9mmol)溶液搅拌15分钟。向该反应混合物添加黄色固体粉末形式的SN38(5g，12.75mmol)。在0℃搅拌所述混合物2小时。所述溶液加入二氯甲烷(130mL)中，依次用NaCl 1M(3×130mL)然后是5％水性柠檬酸(3×130mL)萃取。在0℃将有机层缓慢(至少超过30分钟)添加到甲基叔丁基醚(MTBE)(600mL)。然后过滤形成的黄色沉淀并真空(200mBar)干燥过夜。
CPP与10-O-连接子-SN38的偶联
连接子-SN38部分与CPP缀合产生于DMF(二甲基甲酰胺)的CPP-连接子-SN38缀合物的混合物。用水萃取所述产物，并冻干产生黄色固体。
合成途径的实例：
在室温下将于二甲基甲酰胺(DMF)(200mL)的CPP-SH(5.69mmol)(例如在N末端位置含有一个半胱氨酸的DPV1047(21.49g))的溶液搅拌5分钟。然后，添加黄色固体粉末形式的10-O-连接子-SN38(5g，8.54mmol)。室温下搅拌所述混合物3h。加水(200ml)，并用二氯甲烷(5×150mL)萃取水层以去除过量的10-O-连接子-SN38。将水层在-80℃保存4h，然后冻干。CPP-连接子-SN38缀合物保存于-20℃。通过HPLC测定CPP-连接子-SN38的净含量。与SN38标准曲线(364nm)比较可以计算净含量。
10-O-连接子-羟基喜树碱的制备
10-羟基喜树碱和“连接子”在于N-甲基-2-吡咯烷酮的O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲介导下进行缩合。在利用二氯甲烷萃取并通过水洗涤除去N-甲基-2-吡咯烷酮后，中间产物10-O-连接子-羟基喜树碱被分离并且通过从二氯甲烷/甲基叔丁基醚沉淀而纯化。
合成途径的实例：
在0℃将于N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)(50mL)的连接子(16.47mmol，例如BCH是6.20g)和O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲(HCTU)(6.53g，15.78mmol)和二异丙基乙胺(DIPEA)(5.74mL，32.94mmol)溶液搅拌15分钟。向该反应混合物添加黄色固体粉末形式的10-羟基喜树碱(5g，13.72mmol)。在0℃搅拌所述混合物2小时。所述溶液加入二氯甲烷(130mL)，依次用NaCl 1M(3×130mL)然后是5％水性柠檬酸(3×130mL)萃取。在0℃将有机层缓慢(至少超过30分钟)添加到甲基叔丁基醚(MTBE)(600mL)。然后过滤形成的黄色沉淀并真空(200mBar)干燥过夜。
CPP与10-O-连接子-羟基喜树碱的偶联
10-O-连接子-羟基喜树碱与CPP缀合产生于二甲基甲酰胺的CPP-10-O-连接子-羟基喜树碱缀合物的混合物。用水萃取所述产物，并冻干产生黄色固体。
合成途径的实例：
Figure G2007800199329D00391
在室温下将于二甲基甲酰胺(200mL)的CPP-SH(4.61mmol)(例如在N末端位置含有一个半胱氨酸的DPV1047(17.42g))的溶液搅拌5分钟。然后，添加黄色固体粉末形式的10-O-连接子-羟基喜树碱(5.0，6.92mmol)。室温下搅拌所述混合物3h。加水(200ml)，并用二氯甲烷(5×150mL)萃取水层以去除过量的10-O-连接子-羟基喜树碱。将水层在-80℃保存4h，然后冻干。CPP-10-O-连接子-羟基喜树碱缀合物保存于-20℃。通过HPLC测定CPP-10-O-连接子-羟基喜树碱的净含量。与10-羟基喜树碱标准曲线(364nm)比较可以计算净含量。
20-O-连接子#1-喜树碱的制备
合成途径的实例：
Figure G2007800199329D00392
在0℃将于1mL二氯甲烷的连接子#1(16.47μmol，2.78mg)和二环己基碳二亚胺(6.8mg，33μmol)溶液搅拌12小时。在+0℃，通过过滤去除形成的沉淀(DCU，N，N′-二环己基脲)，并将滤液添加到喜树碱(3.4mg，9.7μmol)和DMAP(2mg，16.47μmol)。在0℃搅拌所述混合物4小时，然后依次用NaCl1M(3×1mL)然后是5％水性柠檬酸(3×1mL)萃取。在0℃将有机层缓慢添加至甲基叔丁基醚(10ml)。然后过滤形成的黄色沉淀(20-O-连接子#1-喜树碱)并真空(200mBar)干燥过夜。
CPP与20-O-连接子#1-喜树碱的偶联
合成途径的实例：
Figure G2007800199329D00401
在室温下搅拌于二甲基甲酰胺(1mL)的CPP-SH(4.61μmol)(例如在N末端位置含有一个半胱氨酸的DPV1047(16.6mg))溶液5分钟。然后，添加黄色固体粉末形式的20-O-连接子#1-喜树碱(3.4mg，7μmol)。室温下搅拌所述混合物3h。加水(1ml)，并用二氯甲烷(5×1mL)萃取水层以去除过量的20-O-连接子-喜树碱。将水层在-80℃保存2h，然后冻干。CPP-20-O-连接子-喜树碱缀合物保存于-20℃。通过HPLC测定CPP-20-O-连接子-喜树碱的净含量。与喜树碱标准曲线(364nm)比较可以计算净含量。
20-O-连接子#5-喜树碱的制备
合成途径的实例：
Figure G2007800199329D00402
向于二氯甲烷(10mL)的喜树碱(10mg，28.7μmol)溶液添加DMAP(10.5mg，86.2μmol)和连接子#5(BCH，21.6mg，57.7μmol)。搅拌所述溶液5分钟，然后添加于二氯甲烷(50.5mL)的EDC(11.1mg，57.7μmol)和三乙胺(12μL，86.2μmol)溶液。室温下搅拌所述混合物18小时。所述溶液依次用NaCl1M(3×10mL)然后是5％水性柠檬酸(3×10mL)萃取。蒸发有机层直至获得的体积为1mL，在0℃将溶液缓慢(至少超过5分钟)添加到甲基叔丁基醚(20mL)。然后过滤形成的黄色沉淀并真空(200mBar)干燥过夜。
CPP与20-O-连接子#5-喜树碱的偶联
合成途径的实例：
Figure G2007800199329D00411
室温下将于二甲基甲酰胺(1mL)的CPP-SH(4.61μmol)(例如在N末端位置含有一个半胱氨酸的DPV1047(16.6mg))的溶液搅拌5分钟。然后，添加黄色固体粉末形式的20-O-连接子-喜树碱(5mg，7μmol)。室温下搅拌所述混合物3h。加水(1mL)，并用二氯甲烷(5×1mL)萃取水层以去除过量的20-O-BCH-喜树碱。将水层在-80℃保存2h，然后冻干。CPP-20-O-BCH-喜树碱缀合物保存于-20℃。通过HPLC测定CPP-20-O-连接子-喜树碱的净含量。与喜树碱标准曲线(364nm)比较可以计算净含量。
II稳定性研究
为了检验连接子对缀合物稳定性的影响，合成具有相同CPP但具有不同连接子的不同缀合物。
CPP-连接子#1-SN38
Figure G2007800199329D00412
CPP-连接子#2-SN38
Figure G2007800199329D00421
CPP-连接子#3-SN38
Figure G2007800199329D00422
CPP-连接子#4-SN38
Figure G2007800199329D00423
CPP-连接子#5-SN38
Figure G2007800199329D00424
CPP-连接子#6-SN38
Figure G2007800199329D00425
CPP-连接子#7-SN38
Figure G2007800199329D00426
在不同种属的枸橼酸钠血浆(10％(v/v)柠檬酸钠缓冲液，0.106M)中检验缀合物的稳定性(参见下表1)。37℃在血浆中保温2.55μM的缀合物。利用如下所述的HPLC荧光法(参见色谱设备和条件)分析样品，然后用TFA/乙腈萃取，并测量缀合物释放的游离喜树碱、其类似物或者衍生物(例如SN38)的量。
色谱设备和条件：每种样品取150μL置于1.5mL微量离心管中。每管添加450μL于H2O的5％(v/v)TFA，涡旋振荡所述混合物5秒。然后将样品在+4℃以16000g离心3分钟。将100μL上清置于1.5mL微量离心管。然后立即添加甲醇(100μL)，并涡旋振荡5秒。然后将样品在室温下以16000g离心3分钟。
回收150μL上清用于HPLC分析。利用4.6×100mm(3μm粒度)LunaC18(2)柱(Phenomenex ref.00D-4251-E0，Le Pecq，France)通过高效液相层析(HPLC；Agilent 1100系列，配备荧光检测器)分离缀合物、代谢产物和喜树碱衍生物(即SN38)。流动相(A)的水性组分是于水的0.1％(v/v)TFA。有机调节剂(B)是含0.1％(v/v)TFA的乙腈。对于缀合物和其代谢产物，使用梯度洗脱，B的比例在2分钟内从15％线性增加到37％，6分钟内从37％到47％，然后在2分钟内到达90％，流速恒定为1.2mL/分钟。然后B的比例回到初始条件3.0分钟。
表1：DPV1047-连接子-SN38在37℃血浆中的半衰期(分钟)
缀合物的半衰期对应于本发明缀合物释放50％(按摩尔量计算)的游离喜树碱、其类似物或者衍生物需要的时间。在人血浆中，缀合物DPV1047-连接子#1-SN38的半衰期(小于5分钟)比缀合物DPV1047-连接子#2-SN38(6-7分钟)的半衰期更短，其依次比缀合物DPV1047-连接子#3-SN38(12分钟)的半衰期更短。发现最稳定的缀合物是DPV1047-连接子#5-SN38(400分钟)，其半衰期比DPV1047-连接子#2-SN38缀合物长60倍。包含连接子#5的缀合物在大鼠血浆中也是最稳定的。
III检测4种CPP-MIC-SN38缀合物在植入裸鼠的人HCT 116异种移植结肠 肿瘤模型中的功效
在载有人源HCT 116肿瘤的雌性NMRi裸鼠(6周龄)(Janvier，France)中利用Q4D×3给药方案(每四天注射一次，重复三次)进行抗肿瘤功效研究以鉴定感兴趣的CPP-连接子#2-SN38缀合物(按照实施例1.4描述产生的缀合物)。通过将细胞悬液真皮内移植到小鼠右胁腹种植HCT 116肿瘤细胞(ATCC Number：CCl-247)。肿瘤细胞移植后第3天进行第一次药物注射，当肿瘤大小达到大约100mm3(按照下列公式计算：[长×宽2]/2)时，小鼠被随机分组，每组6只，并按照先前确定的最大给药剂量(Maximal AdministrableDose，MAD)用CPP-MIC-SN38治疗，以10μL/g在尾侧静脉静脉推注，然后是Q4D×3给药方案。
最小T/C％反映了实现的最大肿瘤生长抑制。
在治疗临床症状期间或者之后，记录体重和肿瘤大小以便评价注射的缀合物的功效和毒性。药物治疗组相对载体治疗组的平均肿瘤体积百分比(T/C×100)和定义为100-T/C(％)的肿瘤生长抑制率(TGI％)被用于评价治疗功效。
4种CPP-MIC-SN38缀合物的治疗参数概述于下表2。
表2：4种CPP-MIC-SN38缀合物在真皮内植入裸鼠的HCT 116人结肠盲肠 癌肿瘤模型中的功效
Figure G2007800199329D00441
***：相对于对照p<0.001(Dunnett检验)
D＝当达到最小T/C时的天数
在HCT 116肿瘤模型中，与盐水对照相比，3种CPP-MIC-SN38缀合物(DPV15b-MIC-SN38、DPV15-MIC-SN38和DPV1047-MIC-SN38)显示显著的抗肿瘤活性(TGI＝60-63％)，而DPV3-MIC-SN38缀合物只显示中等的抗肿瘤活性(TGI＝32％)。
当按照MAD给予CPP-MIC-SN38缀合物时，在研究期间没有观察到毒性的临床症状例如体重减轻、腹泻或者掉毛。
用DPV15b-MIC-SN38、DPV15-MIC-SN38和DPV1047-MIC-SN38已经证明，与盐水对照相比，以高剂量水平(30-50μmol/kg)给药的缀合物显示最大的抗肿瘤活性。
IV在植入裸鼠小鼠的人HCT 116异种移植结肠肿瘤模型或者植入裸鼠大 鼠的人LS 174T异种移植结肠肿瘤模型中评估连接子稳定性对CPP-连接子 -SN38缀合物的治疗功效的影响
在两种异种移植模型中评价连接子稳定性对CPP-连接子-SN38功效的影响。根据体外血浆稳定性选择连接子：MIC连接子(连接子#2)在人血浆中相对不稳定，而BCH连接子(连接子#5)显示高人血浆稳定性。在小鼠中分析了4种缀合物：DPV15-MIC-SN38、DPV1047-MIC-SN38、DPV15-BCH-SN38和DPV1047-BCH-SN38的特征。在大鼠中分析了两种缀合物：DPV1047-MIC-SN38和DPV1047-BCH-SN38的特征。
按照实施例III的描述进行移植和HCT116肿瘤生长。在第一次注射当天，小鼠被随机分组，每组6只，并用相同等摩尔剂量(30μmol/kg)的CPP-连接子-SN38缀合物治疗，以10μL/g尾侧静脉静脉推注，然后是Q4D×3(每四天注射一次，三次)给药方案。
利用购自Harlan繁殖中心(Gannat，France)的雌性裸鼠大鼠(8周龄)进行LS 174T研究。通过将细胞(ATCC号：CCl-188)悬浮液皮下移植到动物右胁腹种植LS 174T肿瘤。当肿瘤达到大约1000mm3的大小时，进行药物的第一次注射。利用下列公式计算肿瘤体积：[长×宽2]/2。在第一次注射当天，大鼠被随机分组，每组8只，按照先前确定的MAD用CPP-连接子-SN38缀合物治疗，以10μL/g尾侧静脉静脉推注，然后是Q3/4D×5(每3天或者4天，5次)给药方案。
实验期间，每周两次监控临床症状、体重和肿瘤大小。药物治疗组相对载体(对照)治疗组的平均肿瘤体积百分比(T/C×100％)和定义为100-T/C的肿瘤生长抑制率(TGI％)用于评价治疗功效。
最低T/C％反映了实现的最大肿瘤生长抑制。
4种CPP-连接子-SN38缀合物在HCT 116荷瘤小鼠中的治疗参数概述于表3。
表3：两种化学连接子对CPP-连接子-SN38缀合物在真皮内植入裸鼠的HCT 116人结肠直肠癌肿瘤模型中功效的影响
Figure G2007800199329D00461
***.相对于对照p<0.001(Dunnett检验)
D＝当达到最小T/C时的天数
在HCT 116肿瘤模型中所有4种缀合物均显示显著的抗肿瘤功效。DPV1047-BCH-SN38(TGI＝80％)的活性显著高于DPV1047-MIC-SN38(TGI＝60％)、DPV15-BCH-SN38(TGI＝61％)并且高于DPV15-MIC-SN38(TGI＝63％)。
当按照MAD给予CPP-MIC-SN38或者CPP-BCH-SN38缀合物时，在研究期间没有检测到毒性的临床症状例如体重减轻、腹泻或者掉毛。
LS 174T荷瘤大鼠中两种DPV1047-连接子-SN38缀合物的功效显示于表4。
表4：两种化学连接部分对CPP-连接子-SN38缀合物在皮下植入裸鼠大鼠 的LS174T人结肠直肠癌肿瘤模型中功效的影响
Figure G2007800199329D00462
***：相对于对照p<0.001(Dunnett检验)
D＝当达到最小T/C时的天数
DPV1047-MIC-SN38和DPV1047-BCH-SN38(TGI＝56-57％)在LS 174T肿瘤模型中均显示相同显著的抗肿瘤活性。
当按照MAD给予CPP-MIC-SN38或者CPP-BCH-SN38缀合物时，在研究期间没有检测到毒性的临床症状例如体重减轻、腹泻或者掉毛。
在荷瘤小鼠中，DPV1047-BCH-SN38是4种被测缀合物中活性最高的。在荷瘤小鼠中，DPV1047-MIC-SN38和DPV1047-BCH-SN38显示相同的活性。
V比较DPV1047-BCH-SN38缀合物和其他SN38衍生物在植入裸鼠的人 HCT 116结肠肿瘤模型中的功效
将DPV1047-BCH-SN38(＝DPV1047-连接子#5-SN38)缀合物与利用其他输送系统的SN38衍生物的活性进行比较，所述输送系统使活性分子能够溶解。DPV1047-BCH-SN38(上文证明其在所有被检测的CPP和连接子中具有最大的体内功效)与依立替康(SN38的商品化可溶性前体药物(Campto
Figure G2007800199329D0047155538QIETU
，Aventis))和(谷氨酸)16Cys-MIC-SN38缀合物(PolyE(16)-MIC-SN38)进行了比较。因为其生物相容性、非毒性、亲水性和增溶性，PolyE(16)肽被选作本发明的非细胞渗透肽。
按照上文描述进行移植和HCT 116肿瘤生长。在第一次注射当天，小鼠被随机分组，每组6只，并按照最佳给药条件(参见表5)接受不同的缀合物治疗，以10μL/g尾侧静脉静脉推注。
实验期间，每周两次监控临床症状、体重和肿瘤大小。药物治疗组相对载体治疗组的平均肿瘤体积百分比(T/C×100％)和定义为100-T/C(％)的肿瘤生长抑制率(TGI％)被用于评价治疗功效。
最低T/C％反映了实现的最大肿瘤生长抑制。
不同SN38缀合物的治疗参数概述于表5。
表5：DPV1047-BCH-SN38缀合物和其他SN38衍生物在真皮内植入裸鼠的 HCT 116人结肠直肠癌肿瘤模型中的功效比较
 
治疗分子 剂量(累积)μmol/kg 方案 最小T/C(％)(D) TGI(100-T/C％)
DPV1047-BCH-SN38 18(90)30(90)25(225) Q1D5Q4D×3Q2D3×3W 7(D18)10(D14)3(D28) 93***90***97***
 
PolyE(16)-MIC-SN38 40(120) Q4D×3 70.0(D14) 30
依立替康 18(90)48(144)48(432) Q1D5Q4D×3Q2D3×3W 10(D18)10(D18)1(D28) 90***90***99***
***.相对于对照p>0.001(Dunnett检验)
D＝当达到最小T/C时的天数
在HCT 116肿瘤模型中，无论采用什么给药方案，DPV1047-BCH-SN38均显示相似的TGI。Q2D3×3W方案比其他两种方案引起更长的活性。
尽管利用Q4D×3给药方案以高剂量水平(40μmol/kg)给药，但是PolyE(16)-MIC-SN38在该模型中是没有活性的。缀合亲水性肽序列PolyE(16)对SN38的增溶作用不足以将SN38以体内活性形式有效输送。
采用Q2D3×3W方案，DPV1047-BCH-SN38和依立替康显示最好的功效，导致延长的肿瘤生长抑制，在28天后达到最小的T/C％。
在小鼠的功效研究中，无论采用什么给药方案，依立替康均显示与DPV1047-BCH-SN38相似的活性。小鼠中依立替康向SN38的转化显著高于人的，这归因于羧酸酯酶类的种间变化，因此依立替康的功效在小鼠模型中被高估(J.Thompson等，BBA 1998；1400：301-319)。
当以MAD给予DPV1047-BCH-SN38缀合物时，在研究期间没有观察到毒性的临床症状例如体重减轻、腹泻或者掉毛。
VI  DPV1047-BCH-SN38、DPV1047-MIC-SN38和依立替康在犬中的毒性 和药代动力学比较研究
在比格犬中评价了DPV1047-连接子-SN38缀合物相对于依立替康的肠和血液学毒性。该犬是一种合适的模型，因为该物种中依立替康的代谢类似于人的(M.Inaba等，Cancer Chem.Pharmacol.41：130-108(1998))，并且因为该犬显示的延迟腹泻症状与从人类观察到的一致。
成年雌性和雄性比格犬被分笼饲养，可以自由饮用自来水。每天分发颗粒食物。
通过头部静脉或者隐静脉对犬(每种药物和剂量1条犬)进行静脉内灌注。利用一次性导管(
Figure G2007800199329D00481
)以及连接注射泵的塑料注射器完成这些静脉内输注。注射期间，动物被束缚在吊床上。
通过45分钟输注(0.3-0.4mL/min)，分别给药5、10和20mg/kg的DPV1047-BCH-SN38(DPV1047-连接子#5-SN38)。通过20分钟输注(0.3-0.4mL/min)分别给药10和20mg/kg的DPV1047-MIC-SN38(DPV1047-连接子#2-SN38)；通过45分钟输注(0.3-0.4mL/min)分别给药50和70mg/kg的DPV1047-MIC-SN38(DPV1047-连接子#2-SN38)。通过20分钟输注(0.3-0.4mL/min)按照其最大耐受量(MTD)即30mg/kg(F.Lavelle等，Seminar inOncology(1996))注射依立替康(临床级)。将缀合物溶于注射用水(终体积的10％)，并用0.9％NaCl稀释至终浓度。根据体重调整每只动物的给药体积。
在输注后的15天时间段监测临床症状、血液学和肠毒性。每天至少两次检测每只动物的死亡或者疾病症状。
在-1、4、10和13天记录每只动物的体重。
在-1、5、11和14天采集外周血样品到EDTA管以测定下列参数：红细胞，血红蛋白，平均细胞体积，细胞压积，平均细胞血红蛋白浓度，平均细胞血红蛋白，血小板，白细胞，根据细胞形态的差异白细胞计数。
接受依立替康治疗的犬显示典型的依立替康毒性临床症状(F.Lavelle I，Seminar in Oncology，1996)：早期(第1天)和晚期腹泻(第4-6天)，体重减轻(-8.5％)，呕吐以及第5天报告严重但可逆的血液毒性(hematoxicity)(92％的白细胞耗竭，参见下表6)。
接受5和10mg/kg DPV1047-BCH-SN38治疗的犬没有显示任何临床症状，只显示中度但不依赖于剂量的白细胞(WBC)计数降低，就像使用低于其MTD的许多细胞毒性分子观察到的那样。当DPV1047-BCH-SN38为20mg/kg时，观察到白细胞的显著降低(WBC降低93％)，并伴随食物摄入的减少，表明已达到最大耐受量(MTD)。30mg/kg的DPV1047-BCH-SN38显示明显的毒理学症状，包括腹泻和严重血液毒性。
接受10、20、40和50mg/kg DPV1047-MIC-SN38治疗的犬没有显示任何临床症状，只显示白细胞(WBC)的中度减少。70mg/kg的DPV1047-MIC-SN38显示毒性症状，包括：胃肠毒性、腹泻和呕吐。并且报告了严重的血液毒性(94％的WBC耗竭)。
这些结果提示DPV1047-BCH-SN38的MTD是大约20mg/kg(相当于2.6mg SN38)，DPV1047-MIC-SN38的MTD是50-70mg/kg(相当于6.5-9.1mg SN38)。由此可见DPV1047-BCH-SN38的毒性高于DPV1047-MIC-SN38。
两种不同的SN38缀合物在比格犬中的毒性研究概述于表6。
表6：输注依立替康、DPV1047-BCH-SN38和DPV1047-MIC-SN38后比格犬的毒性研究
Figure G2007800199329D00501
WBC白细胞，D天
作为这些研究的一部分，比较了DPV1047-BCH-SN38、DPV1047-MIC-SN38、依立替康和其主要代谢产物的药代动力学。在输注后不同时间采集外周血样品进行药代动力学分析。对于10和20mg/kg的依立替康和DPV1047-MIC-SN38，在时间0(输注前)，输注即将结束时(20分钟)和输注结束后10、20、40、220、460分钟从血液取样。对于其他所有组，在时间0(输注前)，输注即将结束时(45分钟)和输注结束后10、20、40、120、220分钟从血液取样。
将血液样品(2.5mL)采集到含2.5mL5％TFA(v/v)的5mL枸橼酸钠管(Sarstedt S-
Figure G2007800199329D00502
 9NC)，并在-80℃保存(少于两周)前涡旋振荡5秒。
然后在TFA和乙腈萃取之后通过如下所述的HPLC荧光方法分析样品。样品在室温下的水浴中解冻5分钟，用5毫升含2.5％TFA(v/v)的H2O稀释两倍。用TFA酸化全血样品以保护缀合物的酯键免受水解并沉淀蛋白以提高缀合物和SN38的回收。
然后每种样品取500微升到1.5mL微量离心管中，在+4℃以16000×g离心3分钟。取100微升上清到1.5mL微量离心管中，然后添加20μL新制备的1.12μg/mL喜树碱溶液(内标；在+4℃冰浴静置不超过4小时)。然后立即添加甲醇(100μL)，并剧烈搅拌所述混合物(涡旋振荡)5秒。然后将样品在室温下以16000×g离心3分钟。
回收150微升上清进行HPLC分析。
HPLC分析
通过高效液相层析(具有荧光检测器的HPLC Agilent 1100)使用下列方法分离DPV1047-BCH-SN38和其代谢产物SN38：
溶剂A：于H2O中的0.1％(v/v)TFA
溶剂B：于乙腈中的0.1％(v/v)TFA
柱：Luna，C18(2)，3μM，100×4.6mm(Phenomenex ref.00D-4251-E0)
洗脱：15-37％的B、2min，37-47、6min，到90％的B、0.5min，然后是90％的B、2min，15％的B、2min。
注射体积：100μL
流速：1.2mL/min
检测：荧光；激发375nm，发射560nm(灵敏度18)
通过高效液相层析(具有荧光检测器的HPLC Agilent 1100)使用下列方法分离DPV1047-MIC-SN38、依立替康和他们的代谢产物SN38：
溶剂A：于H2O中的0.1％(V/V)TFA
溶剂B：于乙腈中的0.1％(V/V)TFA
柱：Luna，C18(2)，3μ，100×4.6mm(Phenomenex ref.00D-4251-E0)
洗脱：15-50％的B、10min，到90％的B、0.5min，然后是90％的B、2min，15％的B、2min。
注射体积：100μL
流速：1.2mL/min
检测：荧光；激发375nm，发射560nm(灵敏度18)
图1比较了相对于30mg/kg依立替康，输注不同剂量的DPV1047-BCH-SN38和DPV1047-MIC-SN38后对于SN38的血液暴露(AUC)。在DPV1047-BCH-SN38(剂量<20mg/kg)和DPV1047-MIC-SN38(剂量≤％50mg/kg)的无毒剂量，SN38 Cmax和AUC均随缀合物的剂量线性增加。输注30mg/kg(其MTD)的依立替康后，SN38(依立替康的活性代谢产物)的AUC比输注DPV1047-MIC-SN38或者DPV1047-BCH-SN38(剂量大约是它们各自的MTD)后的SN38的AUC低超过80倍。与依立替康相反，在血液的无毒剂量水平，DPV1047-连接子-SN38缀合物输送显著更多量的活性代谢产物SN38。与等摩尔量的DPV1047-MIC-SN38相比，输注DPV1047-BCH-SN38后SN38的AUC显著更高(图1)。
DPV1047-BCH-SN38在血液中的循环半衰期比DPV1047-MIC-SN38长，因此DPV1047-BCH-SN38输送的SN38的AUC大于DPV1047-MIC-SN38释放的(图2)。观察到的DPV1047-BCH-SN38的毒性增加与活性(细胞毒性)分子SN38的AUC增加密切相关。
犬的毒性研究证明DPV1047-BCH-SN38缀合物的毒性比DPV1047-MIC-SN38缀合物更高。BCH和MIC缀合物均显示特征为胃肠毒性和血液毒性的相同毒性谱。BCH缀合物的MTD比MIC缀合物低大约3倍，但与BCH缀合物释放的显著更多的SN38密切相关。当DPV1047-BCH-SN38的注射剂量在5-20mg/kg和DPV1047-MIC-SN38的注射剂量在10-50mg/kg时，观察到SN38的AUC剂量依赖性增加。
这些结果证明DPV1047-连接子-SN38缀合物能够比依立替康输送显著更多的循环SN38，并且毒性显著降低。这极其重要，因为已知依立替康对人的剂量加强提高对治疗的应答，这归因于对活性代谢产物SN38的更多暴露(de Jonge M.J.，等，J Clin Oncol，18：195-203，2000；Ychou，M.，等，CancerChemotherapy And Pharmacology，50：383-391，(2002))，但因为依立替康的剂量限制毒性，这种剂量加强是基本上不可能的。
VII在植入啮齿类动物的人肿瘤模型范围中评估DPV1047-BCH-SN38缀合 物的体内功效
在多种不同的肿瘤模型中评估DPV1047-BCH-SN38缀合物的活性以便确定该缀合物对各种肿瘤类型的适用性。选择了5种人肿瘤模型：HCT 116结肠直肠癌模型(ATCC号：CC1-247)，LS 174T结肠直肠癌模型(ATCC号：CC1-188)，HT-29结肠直肠癌模型(ATCC号：HTB-38)，NCI-H460肺癌(ATCC号：HTB-177)和MDA-MB-231乳腺癌模型(ATCC号：HTB-26)。
通过将细胞真皮内或者皮下移植到7周龄雌性NMRi裸鼠的右胁腹(分别注射1×107、1×107、3×106和3×106个细胞)(Janvier，France)建立HCT116、HT-29、NCI-H460和MDA-MB-231肿瘤。LS 174T肿瘤细胞被植入Rhrnu/rnu裸鼠大鼠(2×107个细胞)。当小鼠中的肿瘤大小达到100mm3或者大鼠中的肿瘤大小达到1000mm3(利用下列公式计算：[长×宽2]/2)时，治疗开始。第一次注射当天，动物被随机分成不同的组(每组6或者8只动物)，并通过尾侧静脉静脉推注(i.v.)将于盐水中的10μL/g DPV1047-BCH-SN38进行输送(表7)。
实验期间，每周两次监控临床症状、体重和肿瘤大小。药物治疗组相对载体治疗组的平均肿瘤体积百分比(T/Cx100％)和定义为100-T/C(％)的肿瘤生长抑制率(TGI％)被用于评价治疗功效。
最低T/C％反映了实现的最大肿瘤生长抑制。
DPV1047-BCH-SN38缀合物在不同肿瘤模型中的功效概述于表7。
表7：DPV1047-BCH-SN38缀合物在真皮内或者皮下植入啮齿类动物的不 同人类肿瘤模型中功效的评价。
Figure G2007800199329D00531
*p<0.05，***：p<0.001，相对于对照(Dunnett检验)
D＝当达到最小T/C时的天数
DPV1047-BCH-SN38(＝DPV1047-连接子#5-SN38)缀合物在所有被检测的结肠直肠癌、肺癌和乳腺癌模型中均显示显著的抗肿瘤活性水平，证明DPV1047-BCH-SN38在大量人类肿瘤中具有活性。此外，当检测不同的剂量时，观察到剂量依赖性功效。
VIII DPV1047-BCH-SN38缀合物与贝伐单抗或者5-氟尿嘧啶联用的体内功 效的评价
在临床上已经证明依立替康与药物如5-氟尿嘧啶(5-FU)(
Figure G2007800199329D00541
 Pharma)和贝伐单抗(
Figure G2007800199329D00542
Roche)具有协同作用。因此进行联合研究以评估DPV1047-BCH-SN38与这些药物联用的作用。小鼠被植入HT-29肿瘤并以10μL/g通过腹膜内给予(贝伐单抗)或者静脉推注(5-FU或者DPV1047-BCH-SN38)进行治疗。根据Prewett等，Clin Cancer Res.May；8(5)：994-1003(2002)和Azrak等，Clin Cancer Res.Feb l；10(3)：1121-9.(2004)制定方案，给予按照实验确定的亚适量DPV1047-BCH-SN38、5-FU和贝伐单抗。在用贝伐单抗、5-FU或者DPV1047-BCH-SN38治疗后计算T/C比例。这些T/C比例用于评价贝伐单抗和DPV1047-BCH-SN38或者5-FU和DPV1047-BCH-SN38联合治疗的预期T/C(DPV1047-BCH-SN38的T/C×贝伐单抗或者5-FU的T/C)。用实验方法确定联合治疗后观察到的T/C。通过用预期T/C除以观察到的T/C，计算这两种分子的组合指数(combinationindex)。指数>1证明是协同作用，指数大约为1提示叠加作用，指数<1提示拮抗作用。这些实验的结果概述于表8。
表8：DPV1047-BCH-SN38与5-FU或者贝伐单抗联用在HT-29肿瘤模型中 协同作用的评价。
Figure G2007800199329D00543
*预期的T/C＝DPV1047-BCH-SN38T/C×参照药物T/C；$组合指数＝预期的T/C/观察到的T/C
在这些实验中，DPV1047-BCH-SN38与5-FU或者贝伐单抗联用增强抗肿瘤功效。对于5-FU来说，联用效果是协同的(组合指数>1)，而对于贝伐单抗来说，联用效果是叠加的(组合指数大约为1)。
IX与DPV1047-BCH-SN38·HC1相比，DPV1047-BCH-SN38·TFA体外和体 内活性的评价
然后比较DPV1047-BCH-SN38·TFA和DPV1047-BCH-SN38·HCl化合物的功效和毒性。
通过DPV1047-BCH-SN38·TFA的离子交换层析形成盐酸DPV1047-BCH-SN38(DPV1047-BCH-SN38·HCl)。Amberlite IRA-410离子交换树脂(475g)(Fluka)在2N HCl中悬浮30min。然后将树脂装到柱中并用水洗涤。将24g DPV1047-BCH-SN38·TFA溶于125mL水，上样到柱上，并用水洗脱。利用HIACHI U-2000分光光度计通过364nm的UV吸光度确定不同级分中DPV1047-BCH-SN38·HCl的浓度。然后合并相关级分，冰冻干燥。然后将DPV1047-BCH-SN38·HCl缀合物保存在-20℃的氩气中。没有观察到DPV1047-BCH-SN38两种盐形式功效的差异；NCI-H460肺腺癌模型(ATCC号：HTB-177)的体外细胞毒性和体内功效研究证实了DPV1047-BCH-SN38·HCl仍保持活性，对于DPV1047-BCH-SN38·TFA和DPV1047-BCH-SN38·HCl的体内最佳T/C分别是22.9％和18.4％(参见表9)。
表9：DPV1047-BCH-SN38·TFA和DPV1047-BCH-SN38·HCl的体外(IC 50 ) 和体内功效的评价
*p<0.01，***：p<0.001，相对于对照(Dunnett检验)
X DPV1047-BCH-SN38可溶性的评价
发现DPV1047-BCH-SN38(＝DPV1047-连接子#5-SN38)在水中的溶解度远远高于SN38或者依立替康的：DPV1047-BCH-SN38·HCl≥1g/mL，依立替康≤2.5mg/mL和SN38≤5μg/mL。
XI各种CPP-连接子喜树碱衍生物的稳定性和体外功效的评价
犬中的比较毒物动力学研究证明了DPV1047和SN38之间连接子的稳定性与SN38血浆AUC的增加相关(参见实施例VI)。
因此进行研究以评价不同CPP-连接子-喜树碱衍生物的体外稳定性。用不同的CPP、不同的连接子和两种喜树碱：SN38或者10-羟基喜树碱来合成缀合物。
CPP-连接子-SN38缀合物：
DPV1047-连接子#5-SN38
DPV1047-连接子#1-SN38
穿膜肽-连接子#5-SN38
穿膜肽-连接子#1-SN38
DPV7-连接子#5-SN38
Tat-连接子#5-SN38
DPV1047D-连接子#5-SN38
DPV51D-连接子#5-SN38
CPP连接子-10-羟基喜树碱缀合物：
穿膜肽-连接子#5-10-羟基喜树碱
穿膜肽-连接子#1-10-羟基喜树碱(PCT专利申请WO00/01417中描述)
DPV1047-连接子#5-10-羟基喜树碱
DPV1047-连接子#1-10-羟基喜树碱
Tat-连接子#4-10-羟基喜树碱
Tat-连接子#7-10-羟基喜树碱
就像实施例II一样，在人或者犬血浆中检测这些缀合物的稳定性。37℃保温后，通过实施例II描述的HPLC荧光方法在TFA乙腈萃取后分析样品。还评价了这些化合物的体外细胞毒性(IC50)。
在添加治疗化合物前通过种植细胞24h来进行细胞毒性评价。将细胞与不同稀释度的治疗化合物保温48h(37℃)。然后利用WST-1分析(Roche)评价细胞活性。结果表示为平均细胞毒性浓度(IC50值或者抑制50％细胞活性的摩尔浓度)，这是利用Graph Pad Prism 3.02软件根据sigmoid回归分析估算的。
该研究中使用两种细胞系：
-HCT116(ATCC#：CCL-247)：人上皮结肠癌细胞。在Mc Coy′s 5a培养基+1.5mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清中培养细胞。以8000细胞/孔的密度将细胞种于96孔板。
-NCI-H460(ATCC#：HTB-177)：人上皮肺癌细胞。在RPMI 1640+glutamax和10％胎牛血清中培养细胞。以10000细胞/孔的密度将细胞种于96孔板。
CPP-连接子-SN38缀合物：
如表10所示，DPV1047-连接子#5-SN38是最稳定的缀合物(在人和犬的血浆中半衰期分别为360分钟和260分钟)，与之前观察到的稳定性一致(参见实施例II)。在犬和人的血浆中，无论哪种CPP与SN38偶联，CPP-连接子#5-SN38缀合物总是比CPP-连接子#1-SN38缀合物稳定，证实连接子#5(＝BCH)比连接子#1更稳定。
表10：37℃血浆中SN38缀合物的半衰期(分钟)
 
CPP-连接子-SN38缀合物 人血浆半衰期(分钟) 犬血浆半衰期(分钟)
DPV1047-连接子#5-SN38 360 260
DPV1047-连接子#1-SN38 <3 11.3
穿膜肽-连接子#5-SN38 60 150
穿膜肽-连接子#1-SN38 <3 16.5
DPV7-连接子#5-SN38 162 112
Tat-连接子#5-SN38 335 122
评价最稳定化合物(含有连接子#5)的体外细胞毒性以确定这些化合物的细胞毒性性质是否仍被保留。表11证实在被测的两种细胞系中，全部CPP-连接子#5-SN38缀合物都保留与SN38相当的细胞毒性。
表11：48h连续暴露后，两种不同细胞系中抑制50％细胞活性的药物浓度(IC50)。数据以nM表示，代表3次独立实验的平均值。
 
细胞系 DPV1047-连接子#5-SN38 穿膜肽-连接子#5-SN38 Tat-连接子#5-SN38 DPV7-连接子#5-SN38 SN38
HCT116 24 57 29 71 7
NCI-H460 40 53 42 53 22
还评价了CPP为D构象的CPP-连接子#5-SN38缀合物的体外血浆稳定性和细胞毒性。如表12所示，两种CCP-连接子#5-SN38 D-亚型缀合物的稳定性均显著高于观察到的CPP-连接子#1-SN38缀合物的(参见表10)。尽管CCP-连接子#5-SN38D-亚型缀合物在人血浆中的半衰期大于100分钟，但其稳定性低于DPV1047-连接子#5-SN38缀合物。结果显示于下表12。
表12：37℃血浆中SN38缀合物的半衰期(分钟)
 
CPP-连接子#5-SN38缀合物 人血浆半衰期(分钟) 犬血浆半衰期(分钟)
DPV1047-连接子#5-SN38 382 240
DPV51(D)-连接子#5-SN38 267 175
DPV1047(D)-连接子#5-SN38 110 165
评价这些缀合物的体外细胞毒性以确定这些化合物的细胞毒性性质是否仍被保留。表13证实两种CPP-连接子#5-SN38 D-亚型缀合物都保留与DPV1047-连接子#5-SN38相当的细胞毒性。结果显示于下表13。
表23：48h连续暴露后，抑制50％细胞活性的药物浓度(IC50)。数据以nM表示。
 
细胞系 DPV1047-连接子#5-SN38 DPV51(D)-连接子#5-SN38 DPV1047(D)-连接子#5-SN38
HCT116 29 61 23
CPP-连接子-10-羟基喜树碱缀合物：
还检测了不同CPP-连接子与10-羟基喜树碱连接的稳定性。就像CPP-连接子#5-SN38缀合物一样，CPP-连接子#5-10-羟基喜树碱缀合物总是比CPP-连接子#1-10-羟基喜树碱缀合物更稳定。就像对于DPV1047-连接子#5-SN38的观察一样，DPV1047-连接子#5-10-羟基喜树碱缀合物在人和犬血浆中的稳定性大于其他CPP-连接子#5-10-羟基喜树碱缀合物。结果显示于下表14。
表14：37℃血浆中10-羟基喜树碱缀合物的半衰期(分钟)
 
CPP-连接子-10-羟基喜树碱缀合物 人血浆半衰期(分钟) 犬血浆半衰期(分钟)
DPV1047-连接子#5-10羟基喜树碱 214 180
DPV1047-连接子#1-10羟基喜树碱 <3 3
穿膜肽-连接子#5-10羟基喜树碱 32 110
穿膜肽-连接子#1-10羟基喜树碱 <3 6
Tat-连接子#4-10羟基喜树碱 7.3 20
评价最稳定化合物(含有连接子#5)的体外细胞毒性以确定这些化合物的细胞毒性性质是否仍被保留。表15证实了对于被测的两种细胞系，全部CPP-连接子#5-10羟基喜树碱缀合物均显示相似的活性，稍低但相当于10-羟基喜树碱的活性。
表15：48h连续暴露后，两种不同细胞系中抑制50％细胞活性的药物浓度(IC50)。数据以nM表示，代表3次独立实验的平均值。
 
细胞系 DPV1047-连接子#5-10羟基喜树碱 穿膜肽-连接子#5-10羟基喜树碱 Tat-连接子#4-10羟基喜树碱 Tat-连接子#7-10羟基喜树碱 10-羟基喜树碱
HCT116 185 194 238 158 64
NCI-H460 112 161 87 127 21
对于所有被检测的CPP缀合物，连接子#4和#5都显示比连接子#1更高的稳定性。对于SN38和10-羟基喜树碱衍生物，这种连接子#5的稳定性也大于连接子#1。
序列表
<110>迪亚特斯公司
<120>喜树碱-细胞渗透肽缀合物和含有其的药物组合物
<130>B0438WO
<160>52
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>16
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>1
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser
1               5                   10                  15
<210>2
<211>17
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>2
Gly Arg Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys Arg Lys Arg Leu Lys
1               5                   10                  15
Pro
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>3
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro
1               5                   10                  15
<210>4
<211>17
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>4
Gly Lys Arg Lys Lys Lys Gly Lys Leu Gly Lys Lys Arg Pro Arg Ser
1               5                   10                  15
Arg
<210>5
<211>14
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>5
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg His Leu Gly Ser Gly
1               5                   10
<210>6
<211>18
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>6
Arg Lys Lys Arg Arg Arg Glu Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg
1               5                   10                  15
His Leu
<210>7
<211>19
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>7
Ser Arg Arg Ala Arg Arg Ser Pro Arg Glu Ser Gly Lys Lys Arg Lys
1               5                   10                  15
Arg Lys Arg
<210>8
<211>19
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>8
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
1               5                   10                  15
Met Asp Val
<210>9
<211>18
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>9
Val Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His Val Arg Pro Arg Val Thr Arg
1               5                   10                  15
Asp Val
<210>10
<211>16
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>10
Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg
1               5                   10                  15
<210>11
<211>22
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>11
Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu Arg Gln Ser Arg Leu Arg Arg
1               5                   10                  15
Arg Glu Arg Gln Ser Arg
            20
<210>12
<211>21
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>12
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1               5                   10                  15
Arg Leu Leu Arg Lys
            20
<210>13
<211>30
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>13
Trp Glu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu His
1               5                   10                  15
Leu Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala
            20                  25                  30
<210>14
<211>21
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>14
Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met Ser Met Lys Ile Arg Pro
1               5                   10                  15
Phe Phe Pro Gln Gln
          20
<210>15
<211>20
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>15
Lys Thr Arg Tyr Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro
1               5                   10                  15
Phe Asn Arg Leu
            20
<210>16
<211>20
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>16
Arg Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Arg Ala Val Arg Met Lys Ile Arg Pro
1               5                   10                  15
Leu Val Thr Gln
            20
<210>17
<211>24
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>17
Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln
1               5                   10                  15
Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro
                            20
<210>18
<211>12
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>18
Thr Ser Pro Leu Asn Ile His Asn Gly Gln Lys Leu
1               5                   10
<210>19
<211>12
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>19
Asn Ser Ala Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Ser
1               5                   10
<210>20
<211>30
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>20
Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His
1               5                   10                  15
Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala
            20                  25                  30
<210>21
<211>16
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>21
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1               5                   10                  15
<210>22
<211>10
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>22
Val Pro Met Leu Lys Pro Met Leu Lys Glu
1               5                   10
<210>23
<211>18
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>23
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Ala
<210>24
<211>27
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>24
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1               5                   10                  15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
            20                  25
<210>25
<211>16
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>25
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1               5                   10                  15
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>26
Val Gln Arg Lys Arg Gln Lys Leu Met
1               5
<210>27
<211>21
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>27
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1               5                   10                  15
Lys Lys Arg Lys Val
            20
<210>28
<211>15
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>28
Ser Asp Leu Trp Glu Met Met Met Val Ser Leu Ala Cys Gln Tyr
1               5                   10                  15
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>29
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1               5                   10                  15
<210>30
<211>7
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>30
Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1               5
<210>31
<211>7
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>31
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5
<210>32
<211>9
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>32
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1               5
<210>33
<211>16
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>33
Arg Val Ile Arg Val Trp Phe Gln Asn Lys Arg Cys Lys Asp Lys Lys
1               5                   10                  15
<210>34
<211>28
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>34
Met Ala Asn Leu Gly Tyr Trp Leu Leu Ala Leu Phe Val Thr Met Trp
1               5                   10                  15
Thr Asp Val Gly Leu Cys Lys Lys Arg Pro Lys Pro
            20                  25
<210>35
<211>18
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>35
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1               5                   10                  15
Ser Lys
<210>36
<211>18
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>36
Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro Pro Pro Val Arg Leu Pro
1               5                   10                  15
Pro Pro
<210>37
<211>7
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>37
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1               5
<210>38
<211>18
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>38
Arg Gly Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe Ser Thr Ser Thr
                5                   10                  15
Gly Arg
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>39
Arg Arg Leu Ser Tyr Ser Arg Arg Arg Phe
1               5                   10
<210>40
<211>17
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>40
Ala Trp Ser Phe Arg Val Ser Tyr Arg Gly Ile Ser Tyr Arg Arg Ser
1               5                   10                  15
Arg
<210>41
<211>14
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>41
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1                   5                   10
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>42
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5                   10
<210>43
<211>9
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>43
Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1               5
<210>44
<211>13
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>44
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1               5                   10
<210>45
<211>27
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>45
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1               5                   10                  15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
            20                  25
<210>46
<211>21
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>46
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu
1               5                   10                  15
Ala Lys Lys Ile Leu
        20
<210>47
<211>12
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>47
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly
1               5                   10
<210>48
<211>14
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>48
Ile Asn Leu Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
1               5                   10
<210>49
<211>34
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>49
Asp Ala Ala Thr Ala Thr Arg Gly Arg Ser Ala Ala Ser Arg Pro Thr
1               5                   10                  15
Glu Arg Pro Arg Ala Pro Ala Arg Ser Ala Ser Arg Pro Arg Arg Pro
            20                  25                  30
Val  Asp
<210>50
<211>26
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>50
Asp Pro Lys Gly Asp Pro Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr
1               5                   10                  15
Val Thr Gly Lys Gly Asp Pro Lys Pro Asp
            20                  25
<210>51
<211>8
<212>PRT
<213>homo sapiens
<400>51
Lys Arg Gly Leu Lys Leu Arg His
1               5
<210>52
<211>16
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>non cell penetrating peptide
<400>52
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu
1               5                   10                  15

Claims (8)

1.一种包括至少一个喜树碱的缀合物，其选自：
Figure FSB00000963663300011
Figure FSB00000963663300021
Figure FSB00000963663300031
2.一种药物组合物，其在药学上可接受的载体中包括至少一种权利要求1所述的缀合物。
3.如权利要求2所述的药物组合物，用于口服、颅内、椎管内、肠内或者肠胃外给药。
4.如权利要求2或3所述的药物组合物，用于和其他治疗方案或者药剂同时或者依次给药。
5.如权利要求2或3所述的药物组合物，用于治疗癌症。
6.如权利要求2或3所述的药物组合物，用于治疗结肠癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、头、胃和颈癌、膀胱癌、非何杰金氏淋巴瘤、黑素瘤、白血病、成神经细胞瘤或者恶性胶质瘤。
7.如权利要求4所述的药物组合物，通过和其他治疗方案或者药剂同时或者依次治疗来进行抗癌治疗，所述药剂选自5-氟尿嘧啶、甲酰四氢叶酸、奥沙利铂、卡培他滨、长春花新碱、塞来昔布、替莫唑胺、硒、沙利度胺、替莫唑胺、西妥昔单抗、吉西他滨、多西紫杉醇、3-AP、卡铂、硼替佐米、贝伐单抗、索拉非尼、顺铂、吉非替尼、flavopiridol、elvorin、卡铂、氨柔比星、甲酰四氢叶酸、曲妥珠单抗、培美曲塞、埃罗替尼、丝裂霉素C、AMG706、帕尼妥单抗、紫杉醇、雷替曲塞、伊马替尼、阿昔单抗、英夫利昔单抗、帕利珠单抗、利妥昔单抗、吉姆单抗奥佐米星、阿仑珠单抗和替伊莫单抗。
8.有效量的至少一种权利要求1所述的缀合物用于制备治疗癌症的药物组合物的用途。
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