CN102746316B - 用于抗肿瘤药物的间硝基芳甲氧基喜树碱缺氧激活前药 - Google Patents

Abstract

本发明为一种用于抗肿瘤的间硝基芳甲氧基喜树碱缺氧激活前药，其化学名称为：(4S)-4，11-二乙基-4-羟基-9-(3-硝基芳甲氧基)-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮。它是利用间硝基芳甲醇作为修饰剂，在Mitsunobu反应条件下，与SN-38进行成醚反应，将其羟基保护起来，制成毒性小的间硝基芳甲氧基喜树碱缺氧激活前药，简称间硝基芳甲基SN-38。其用途是作为主要有效成分用于制备抗肿瘤药剂，特别是用于制备治疗肺癌的抗肿瘤药剂。

Description

用于抗肿瘤药物的间硝基芳甲氧基喜树碱缺氧激活前药

技术领域

本发明属新型抗肿瘤药物，涉及用于肺癌治疗的间硝基芳甲氧基喜树碱缺氧激活前药（简称间硝基芳甲基SN-38）及其制备方法。

背景技术

喜树碱（Campotothecin, CPT）是从中国特有的植物喜树中提取出来的生物碱，它可以抑制DNA拓扑异构酶I，阻止癌细胞复制而发挥抗癌作用。拓扑异构酶I 在肿瘤细胞DNA的复制、转录和重组中均起重要的作用。CPT对结直肠癌、胃癌、肝癌、膀胱癌和白血病等恶性肿瘤有较好的疗效。但它有明显骨髓抑制、出血性膀胱炎和胃肠道反应包括恶心、呕吐和腹泻等严重的毒副作用[Fujita K, Sparreboom A. Current Clinical Pharmacology. 2010; 5:2 09-17]。另外，由于CPT的内酯环使其在水溶液中不稳定，极易水解开环形成羟基羟酸盐而失去活性。

为增加喜树碱的稳定性和生物利用度、降低其严重的毒性和副作用，已经进行了许多尝试以便得到具有较高生物活性和稳定性的喜树碱衍生物。经过多年的研究开发，合成了几十种的喜树碱衍生物，进入临床试验阶段的有Exatecan (依沙替康)、Lurtotecan（勒托替康）、Gimatecan、Belotecan、9-氨基喜树碱（9-aminocamptothecin, 9-AC）、9-硝基喜树碱（9-nitrocamptothecin, 9-NC）、GI147211和DX-8951f等。还有Wall等在美国专利No.4943579中描述的几种具有水溶性的酰化喜树碱化合物，以及Cao等在美国专利No.5968943中描述的一种喜树碱衍生物。已经被批准用于癌症病人临床应用的喜树碱衍生物有伊立替康（irinotecan, CPT-11）和拓扑替康（topotecan, TPT）[冯乙巳等，合肥工业大学学报 2007；30（5）：579-582]。应用最为广泛的伊立替康（CPT-11）是日本Daiichi Seiyaku公司和Yakult Honsha公司联合开发的水溶性喜树碱类衍生物。

伊立替康化学名称为（4S）-4,11-二乙基-4-羟基-9-[(4－哌啶基哌啶) 羰基]-1H-吡喃并[3，4：6，7]吲哚嗪[1，2b]喹啉-3，14-（4H，12H）-二酮，业内通常也称为7-乙基-10- (4’-哌啶基哌啶-)羰酰氧基喜树碱。伊立替康通过抑制拓扑异构酶I，干扰DNA复制和细胞分裂，达到抑制癌症细胞的增殖。目前伊立替康已经用于结直肠癌、肺癌、肝癌、卵巢癌等癌症的治疗。伊立替康的主要作用机理在于经体内羧酸酯酶转移酶将联哌啶甲酸酯水解为SN-38（其化学名称为(4S)-4，11-二乙基-4，9-二羟基-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮；业内通常也称为7-乙基-10-羟基喜树碱，7-ethyl-10-hydroxycamptothecin)。SN-38作为伊立替康的活性代谢产物第一次在美国专利 4,473,692中出现。SN-38的抑制拓扑酶I的活性是伊立替康的200～1000倍 [Kawato et al. Cancer Res. 1991；51：4187-4191]，显示其强大的抗肿瘤作用。羧酸酯酶转移酶主要分布于小肠和肝脏中，但是在肿瘤组织和细胞内活性较低，造成SN-38在这些组织内的浓度较低带来迟发性腹泻和骨髓移植的毒副作用，而因为肿瘤细胞内的浓度较低，无法更加有效发挥其抗肿瘤作用。而且，SN-38 在水溶液中难溶[ Allen J, et al. Int. J. Pharm. 2004; 270: 93–107.]，生物利用度较低，在血浆代谢较快或不稳定[Burke TG & Mi Z., J. Med. Chem. 1993；36: 2580-2.]，限制了该药物的广泛应用。为此，一些发明针对这一问题进行改进以提高其生物利用度，如合成的喜树碱水溶性羧酸钠盐，但是这种形式的喜树碱有严重的毒性而抗癌活性并不高[Gottlieb, et al. Cancer Chemother Rep 1970;54:461-70；Schaeppi, et al. Cancer Chemother. Rep. 1974: 5: 25-36]，造成临床II期试验不得不中断。后来的研究表明该药的有效性仅仅为天然喜树碱的10% [Giovanella, et al. Cancer Res. 1991; 51: 3052-5]，“用于癌症治疗的水合的喜树碱酯晶体（申请号200880013536.X）”等。

发明内容                                                                                                       

本项发明针对的是几乎所有人类实体肿瘤内包含的缺氧微环境而研发的一种新型喜树碱缺氧激活前药——间硝基芳甲基SN-38。

本项发明针对的是几乎所有人类实体肿瘤内包含的缺氧微环境而研发的一种新型喜树碱缺氧激活前药——间硝基芳甲基SN-38。

本发明的目的是合成一种基于喜树碱衍生物伊立替康的主要代谢产物和活性喜树碱类物质SN-38的新型抗肿瘤药物——间硝基芳甲基SN-38。这种新合成的缺氧激活前药与SN-38相比具有更好的水溶性和生物稳定性。尤其是间硝基苄基SN-38在身体器官组织内正常含氧量的情况下不被激活，是在肝脏和肠道内处于非活化状态；而在我国实体肿瘤（包括我国最常见的结直肠癌、肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肠癌、前列腺癌等）内部特有的缺氧微环境下，被选择性地激活，被转化为具有细胞杀伤作用的SN-38，从而达到选择性地杀死癌细胞的目的。因此，与目前应用最为广泛的喜树碱类药物伊立替康相比较具有肿瘤选择性强、毒性低、生物利用度高的优点。间硝基芳甲基SN-38可能的还原机理如图1所示。

本发明利用间硝基芳甲基对SN-38进行分子结构修饰，将SN-38上的酚羟基用间硝基芳甲基化生成醚，将其羟基保护起来，成为毒性小的前药。提高其水溶性和稳定性，使其在正常组织内有氧状态下不具有抑制拓扑酶的活性或者活性很低，但在肿瘤组织内特有的缺氧微环境下被生物还原酶转化成SN-38，发挥其抗癌的活性。因此，本发明合成的新型抗肿瘤药物间硝基苄基SN-38具有更高的选择性和更低的毒副作用。

 本发明的所提供的用于肺癌治疗的间硝基芳甲氧基喜树碱缺氧激活前药的化学名称为：(4S)-4，11-二乙基-4-羟基-9-(3-硝基芳甲氧基)-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮，简称为间硝基芳甲基SN-38。

  其代表结构式如下：

                                                    

在上述结构中，Y可以在苯环的2或4或5或6位置上取代，也可以是这些位置上的相同或者不同的Y双取代；Y可以是如氟、氯、溴、甲基、甲氧基、甲巯基等； Y也可以是氰基、酰胺基、甲酰基、甲酯基、三氟甲基、甲磺酰基和硝基等；Y还可以是0-6个亚甲基联接的二甲胺基、哌啶基、N’-甲基哌嗪基、吡啶基(侧链位置可以是2、3、4)；R为C1-C6脂肪集团或芳香集团。

通过改变苯环上的取代基，改变硝基芳甲基的氧化还原电位，以来调节间硝基芳甲基SN-38在缺氧环境下放出SN-38的难易，达到针对不同癌细胞筛选最佳缺氧选择性的间硝基芳甲基SN-38，同时通过增加取代基的极性，来改进其水溶性和细胞穿透性。

本发明的理论依据和技术背景：

间硝基芳甲基SN-38在肿瘤细胞的缺氧环境下被激活释放SN-38的示意图如图1所示。

间硝基芳甲基SN-38在缺氧环境下由氧化还原酶（如NADPH 细胞色素P450）还原释放去自由基负离子前药，进一步还原消除，脱去芳甲基部分，释放出SN-38。这里第一步的单电子还原是关键步骤，如在正常细胞有常量氧气存在下自由基负离子会氧化，抑制了还原消除的进行。因此第一步的硝基还原电位对前药的能否释放药素和释放速度起关键作用。

硝基苄基还原电位在-400 mA左右，接近氧化还原酶的氧化还原电位范围，故硝基苄基可作为潜在的可生物还原的修饰剂。

  本发明所述的间硝基芳甲氧基喜树碱缺氧激活前药——间硝基芳甲基SN-38的制备方法如下：

利用间硝基芳甲基化方式对SN-38进行分子结构修饰，具体是利用间硝基芳甲醇作为修饰剂，在Mitsunobu反应（光延反应）条件下，与SN-38进行成醚反应，将SN-38上的羟基保护起来，制成毒性小的间硝基芳甲氧基喜树碱缺氧激活前药。

  其化学反应式如下：

     在上述反应式中，Y与间硝基芳甲基SN-38结构式中的Y相同，Y可以在苯环的2或4或5或6位置上取代，也可以是这些位置上的相同或者不同的Y双取代；Y可以是如氟、氯、溴、甲基、甲氧基、甲巯基等； Y也可以是氰基、酰胺基、甲酰基、甲酯基、三氟甲基、甲磺酰基和硝基等。Y还可以是0-6个亚甲基联接的二甲胺基、哌啶基、N’-甲基哌嗪基、吡啶基(侧链位置可以是2、3、4)。

上述间硝基芳甲醇与SN-38进行成醚反应中，投料顺序至关重要。

首先将SN-38，间硝基芳甲醇和三苯基膦溶解于适当的溶剂当中，再加入加入三苯基膦作为氧的受体，然后缓慢滴加活性试剂偶氮化合物，在室温下搅拌反应。超声波可以加速酚与醇的Mitsunobu 反应速度, 尤其是空间位阻比较大的时候更能得到比较好的效果。反应结束后，分出有机相，分离、纯化，即制得权利要求所述的喜树碱缺氧激活前药产品，简称为间硝基芳甲基SN-38或3-硝基芳甲基SN-38。

上述反应中，间硝基芳甲醇与SN-38的摩尔比可以为1.0-2.0；偶氮试剂可选用偶氮二甲酸二乙酯、偶氮二甲酸二异丙酯、偶氮二甲酰二哌啶或/和双(4-氯苄基)偶氮二甲酸酯等，溶剂可选用四氢呋喃、甲苯、乙腈或/和1，4-二氧六环等。

现以无取代基（Y=H）的简单间硝基芳甲醇——间硝基苄醇与SN-38的成醚反应为例，对溶剂、试剂的品种及用量配比进行优选：

活性试剂偶氮化合物种类的优选：

首先，依据试验探索，暂定间硝基苄醇用量为1.5摩尔，偶氮活性试剂用量为1.6摩尔，三苯基膦作为氧的受体用量为1.4摩尔，使用四氢呋喃作为溶剂，用量为10 ml/g SN-38，反应温度优化为室温，时间3小时。

当使用不同的偶氮活性试剂，在其他条件不变的情况下，所得的产品收率不同。

        从表1可以看出，当使用偶氮二甲酸二乙酯做活性试剂时，由于其活性较高，能使反应收率有明显提高。其它活性试剂的活性相对于偶氮二甲酸二乙酯较差，所以产率偏低。

偶氮二甲酸二乙酯的用量的优选：

在其他条件不变的情况下，改变偶氮二甲酸二乙酯的用量，也会对收率有影响。

 从表2可以看出，偶氮二甲酸二乙酯的用量越大，收率越高，当超过1.6摩尔时，收率增加的不明显，所以偶氮二甲酸二乙酯的用量优选为1.6摩尔。

三苯基膦用量的优选：

在其他条件不变的情况下，改变三苯基膦的用量，也会对收率有影响。

   从表3可以看出，三苯基膦的用量越大，收率越高，当超过1.4摩尔时，收率增加的不明显，三苯基膦的用量优选为1.4摩尔。

对间硝基苄醇的用量的优化：

在其他条件不变的情况下，改变间硝基苄醇的用量，也会对收率有影响。 

   从表4可以看出，间硝基苄醇的用量越大，收率越高，当超过1.5摩尔时，收率增加的不明显，间硝基苄醇的用量优选为1.5摩尔。

对溶剂的优选：

此反应需要在极性非质子性溶剂中进行，所以我们分别试验了以下几种溶剂，以摸索溶剂的变化对反应收率的影响。

由表5可以看出，使用极性很大的乙腈或者极性偏小的二氯甲烷都会降低反应的收率，所以我们将反应的溶剂优选为四氢呋喃。

溶剂用量的优选：

确定四氢呋喃为溶剂，在其他条件不变的情况下，优选四氢呋喃的用量。结果见表6：

由表6可以看出，溶剂用量偏少，反应受影响，收率偏低，用量在10-15时收率较高，用量提高至20时，收率反而有下降趋势，可能是用量过高致使产品纯化回收时造成损失。

综合上述优选结果，可以确认本发明所述SN-38与间硝基苄醇反应中的最佳组合用量配比如下：

间硝基苄醇用量为1.2-2摩尔（优化为1.5摩尔），使用偶氮二甲酸二乙酯作为活性试剂，用量为1.2-1.8摩尔（优化为1.6摩尔），使用三苯基膦作为氧的受体用量为1.2-1.8摩尔（优化为1.4摩尔），使用四氢呋喃作为溶剂，溶剂的用量为（10-15） ml/g SN-38（优化为10 ml/g SN-38），反应温度优化为室温，时间2-5小时（优化为3小时）。

本发明所述的间硝基芳甲基SN-38可作为主要有效成分用于制备抗肿瘤药剂；特别是用于制备治疗肺癌的抗肿瘤药剂。

本发明所述间硝基苄基SN-38的有益效果如下：

本发明所提供的间硝基苄基SN-38与目前广泛应用于癌症治疗的喜树碱衍生物类药物（以伊立替康为例）相比较，具有明显的较低的毒副作用，主要表现在对肠粘膜的损害低、腹泻程度轻、治疗后体重减轻程度小。两种药物对人肺癌肿瘤的抑制率，包括肿瘤大小、肿瘤细胞增殖指数、细胞凋亡指数和肿瘤微血管密度等，无显著性差异。静脉注射两种药物后，血浆内的抗肿瘤活性物质SN-38的浓度变化不大，但是注射SN-38后肿瘤组织内的浓度显著比伊立替康高，而在肝脏和小肠组织内SN-38的浓度低。表明本发明间硝基苄基SN-38具有较小的毒副作用和较强的肿瘤靶向性。

附图说明

图1为 间硝基芳甲基SN-38还原释放SN-38示意图。     

图2为 间硝基苄基SN-38的核磁氢谱图。

图3为小鼠肺癌肿瘤生长曲线。

图4为肿瘤组织内细胞增殖、细胞凋亡和新生血管生成。

图5为给药后的荷瘤小鼠肝脏、小肠组织以及血液中SN-38的含量。

图6为小鼠体重曲线图。

图7为小鼠空肠粘膜损伤对比分析。

图8 三种硝基苄基SN-38治疗小鼠肺癌的效果和生存率对比分析。

具体实施方式

实施例1：间硝基苄基SN-38及其制备方法实例

1） 间硝基苄基SN-38的化学名称为：

(4S)-4，11-二乙基-4-羟基-9-(3-硝基苄氧基)-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮 ；

 结构式为：

2）间硝基苄基SN-38的优选制备方法如下：

将2.30克间硝基苄醇（3-硝基苄醇）和3.92克SN-38溶于40毫升四氢呋喃中，室温下加入3.67克三苯基膦，冷却至0℃，滴加2.78克偶氮二甲酸二乙酯加完后升至室温，搅拌3小时后，加入200毫升二氯甲烷和200毫升水，分出有机相，水层用200毫升二氯甲烷萃取3次。合并有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得到粗产品经柱层析分离（以二氯甲烷/甲醇作为流动相）得到产品为黄色固体3.31克，收率57%。

3）间硝基苄基SN-38的核磁氢谱数据如下：（图谱见图2）

MS (ESI) 528.1 [(M + H)+]. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ ppm 0.88 (t, J=4.8 Hz, 3H), 1.24 (t, J=5.0 Hz, 3H), 1.80-1.90 (m, 2H), 3.19 (d, J=5.6 Hz, 2H), 5.31 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 5.55 (s, 2H), 6.51 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.63(t, J=2.4 Hz, 2H), 7.70-7.76 (m, 1H), 8.03 (d, J=4.8 Hz, 1H), 8.10-8.13 (m, 1H), 8.12-8.24 (m, 1H), 8.45 (s, 1H).。

    4） 其他制备方法对比：

将2.30克3-硝基苄醇和3.92克SN-38溶于43毫升1，4-二氧六环中，室温下加入3.67克三苯基膦，冷却至0℃，滴加2.78克偶氮二甲酸二异丙酯加完后升至室温，搅拌3小时后，加入200毫升二氯甲烷和200毫升水，分出有机相，水层用二氯甲烷萃取（50毫升×3）。合并有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂得到粗产品经柱层析分离（以二氯甲烷/甲醇作为流动相）得到产品为黄色固体2.03克，收率35%。

实施例2. 间硝基苄基SN-38的应用效果及与喜树碱衍生物类标准药物伊立替康的对比

1）间硝基苄基SN-38抗癌活性的鉴定及与伊立替康的对比分析：

图3 显示间硝基苄基SN-38与伊立替康治疗后裸鼠皮下肺癌A549肿瘤生长情况，以及与对照组肿瘤生长的比较分析。

在6 周龄雌性Balb/c裸鼠背部皮下注射1 × 106 对数生长期的人肺癌A549 细胞。当肿瘤成长至100 mm3 (day 0), 动物随机分为三组，即对照组，伊立替康组和间硝基苄基SN-38组，分别给予腹腔注射生理盐水，伊立替康 （50mg/kg, 山梨醇/乳酸缓冲液 [45 mg/ml 山梨醇/0.9 mg/ml 乳酸]和间硝基苄基SN-38（50mg/kg），每四天一次，给药时间点为0, 4, 8, 12, 16和20天。药物通过腹腔注射完成，每两天测量肿瘤一次，并计算肿瘤体积 (mm3) = (长×宽2)/2。从生长曲线图（图3A）可以看出，伊立替康和间硝基苄基SN-38治疗组A549肺癌肿瘤的生长均显著慢于对照组（P值均小于0.001），而伊立替康和间硝基苄基SN-38组肿瘤生长曲线几乎重叠。治疗第20天给药2小时后处死动物。切除肿瘤，测量其重量。如图3B所示，两组肿瘤的重量也均小于对照组。然而，伊立替康和间硝基苄基SN-38治疗组的肿瘤生长曲线，以及治疗20天后的肿瘤重量几乎相同，没有显著性差异。以上结果说明间硝基苄基SN-38治疗肺癌的疗效与伊立替康相似。

   图4显示肿瘤组织内肿瘤细胞增殖指数、细胞凋亡指数和微血管密度的变化。

本发明还对上述肿瘤的细胞增殖、细胞凋亡以及肿瘤新生血管的生成进行检测（见图4 A,B,C）。上述小鼠在治疗20天后，处死留取肿瘤标本，进行冰冻切片，分别利用抗Ki67抗体（检测细胞增殖）或抗CD31抗体（检测肿瘤微血管密度）进行免疫组化染色，或用TUNEL试剂（检测细胞凋亡）进行染色。观察计算细胞增殖指数、细胞凋亡指数和微血管密度。如图4所示，伊立替康和间硝基苄基SN-38治疗组两组肿瘤的细胞增殖指数显著受到抑制（P值均小于0.001）。而且，伊立替康和间硝基苄基SN-38显著提高了肿瘤细胞的凋亡指数和降低了肿瘤微血管的密度。与伊立替康相比较，间硝基苄基SN-38抑制细胞增殖的能力比伊立替康强，促进细胞凋亡的能力比伊立替康弱，但二者比较差异均无统计学意义；二者在抑制肿瘤新生血管生成方面几乎一样。

2）间硝基苄基SN-38与伊立替康在体内的代谢产物SN-38在血浆、肝脏、小肠和肿瘤组织内浓度的对比分析：

图5 显示的是注射伊立替康或间硝基苄基SN-38 (方法同图6)后，小鼠血浆、肿瘤、肝脏和小肠组织内SN-38含量。

伊立替康的主要抗肿瘤机理在于经体内羧酸酯酶转移酶（主要存在与肝脏和小肠组织）把10位的联哌啶甲酸酯水解为SN-38，而SN-38的抑制拓扑酶I的活性是伊立替康的200～1000倍 。间硝基苄基SN-38的抗肿瘤机制在于在肿瘤组织内缺氧环境下，经氧化还原酶（如NADPH 细胞色素P450）等还原释放出药素SN-38。因此，本发明对SN-38在血浆、肝脏、小肠和肿瘤组织内的浓度进行检测。上述小鼠在治疗20天最后一次给药2小时后，处死，留取血浆、肝脏、小肠和肿瘤组织，血液4oC下离心（1000 x g）10分钟后得到血浆。肿瘤、肝脏和小肠组织立即放入在冰浴的甲醇/乙腈（1：1）溶液中搅拌制成匀浆，离心后上清液蒸发干燥后，调整至流动相，利用高效液相色谱技术测量肿瘤、肝脏、小肠和血液中SN-38的浓度。如图5所示，间硝基苄基SN-38组动物血浆SN-38的浓度略低于伊立替康组，但二者无显著性差异（P>0.05）（图5A）。然而，间硝基苄基SN-38治疗组肿瘤组织内的SN-38的浓度显著高于伊立替康治疗组（P<0.001）（图5B）；而且，伊立替康治疗组肝脏和小肠组织内的SN-38的浓度显著高于间硝基苄基SN-38治疗组（P<0.001）（图5C）。本结果提示，间硝基苄基SN-38具有较强的肿瘤选择性，使其在肿瘤组织内缺氧环境下被氧化还原释放出SN-38。

3）间硝基苄基SN-38与伊立替康对小鼠体重、腹泻、小肠粘膜损害的对比分析。

3.1）小鼠体重

SN-38强大的拓扑酶抑制能力也带来诸多的毒副作用，其中最常见的副作用是因为对胃肠道粘膜的损伤而引起的腹泻。由于内羧酸酯酶转移酶在肝脏和小肠内含量很高，使得伊立替康治疗后，这些组织中SN-38的含量很高，而肿瘤组织内SN-38的浓度较低。反之，由于间硝基苄基SN-38是通过肿瘤组织内缺氧环境下经氧化还原酶作用而释放SN-38，而在小肠和肝脏中含量较低。

图6.显示的是注射伊立替康或间硝基苄基SN-38（方法同图6）后，小鼠体重（图6A）和与治疗前体重对比变化（图6B）。

    为了进一步验证比较这两种药物对小肠的毒副作用，本发明检测了上述小鼠的体重。如图6所示，与对照组相比较，伊立替康和间硝基苄基SN-38治疗组小鼠体重均显著下降（P<0.001），而伊立替康治疗组小鼠的体重明细低于间硝基苄基SN-38治疗组（P<0.05）。

3.2）小鼠腹泻

为了进一步观察伊立替康所造成的小鼠腹泻，本发明进行如下实验：8周龄雌性C57B/L 小鼠分为三组（每组10只）：对照组（注射盐水），伊立替康 （100mg/kg, 山梨醇/乳酸缓冲液 [45 mg/ml 山梨醇/0.9 mg/ml 乳酸]）， 间硝基苄基SN-38组（100mg/kg）。药物通过腹腔注射完成，每日一次，连续4天。第5天，观察动物腹泻情况，并对腹泻的严重程度用如下标准进行半定量计数，0：正常，正常大便或没有大便；1：轻度，轻度湿或松软大便；2：中度：湿和不成形的大便，伴有中度肛周毛发沾染大便；3：重度：水样大便，肛周毛发重度沾染大便。

表7显示的是注射伊立替康或间硝基苄基SN-38后小鼠腹泻程度对比分析。如表7所示，对照组动物大便正常，没有出现任何异常现象；而伊立替康和间硝基苄基SN-38治疗组动物均出现程度不同的腹泻；间硝基苄基SN-38治疗组动物的腹泻程度显著低于伊立替康治疗组（P<0.05）。

3.3）小肠粘膜损伤

动物体重的变化和腹泻程度反应了胃肠道消化吸收的功能，为了进一步对小肠的损伤做客观分析，本发明对上述小鼠的空肠进行了如下检测：显微镜下测量空肠绒毛的高度；利用TUNEL染色观察绒毛内凋亡细胞的数目；测量肠组织内γ-GGT的活性。

    图7显示的是伊立替康或间硝基苄基SN-38治疗后，小鼠空肠肠粘膜绒毛平均高度（图7A）, 空肠粘膜腺窝凋亡细胞的平均数目（图7B）和肠组织内γ-GGT的活性(图7C)的对比分析。

  动物的处理同前。小鼠处死后，收集空肠组织，并进行如下三个部分的检查用于判断小肠损害情况：一半肠组织用10%福尔马林固定后，包埋，切片。其中部分切片用苏木精—伊红染色，显微镜下测量空肠绒毛的高度 ，部分切片用TUNEL染色观察记录绒毛内凋亡的细胞数目。一半肠组织用于测量γ-GT的活性。“**”提示与伊立替康和间硝基苄基SN-38组相比较，小鼠体重及其变化有显著性统计学差异（P<0.001）。“＃”提示与伊立替康组相比较，小鼠体重及其变化有显著性统计学差异（P<0.05）。

如图7A所示，伊立替康和间硝基苄基SN-38治疗组小鼠空肠粘膜绒毛的高度均显著低于对照组（P<0.001），而间硝基苄基SN-38治疗组小鼠空肠粘膜绒毛的高度显著大于伊立替康治疗组（P<0.05）。伊立替康和间硝基苄基SN-38治疗组小鼠空肠绒毛凋亡细胞的数量均显著高于对照组（P<0.001），而间硝基苄基SN-38治疗组小鼠空肠绒毛凋亡细胞的数量显著小于伊立替康治疗组（P<0.05）（图7B）。伊立替康和间硝基苄基SN-38治疗组小鼠空肠组织γ-GGT的活性均显著低于对照组（P<0,001），而间硝基苄基SN-38治疗组小鼠空肠组织γ-GGT的活性显著大于伊立替康治疗组（P<0.05）（图7C）。

以上结果提示，与伊立替康相比较，间硝基苄基SN-38所造成的胃肠道毒副作用明显降低。

4） 三种硝基苄基SN-38治疗小鼠肺癌的效果和生存率对比分析：

图8A和图8B 显示间硝基、对硝基和邻硝基苄基SN-38与伊立替康治疗后裸鼠皮下肺癌肿瘤A549生长曲线（图8A），以及荷瘤小鼠生存率(图8B)，与对照组的比较分析。

  在6 周龄雌性Balb/c裸鼠背部皮下注射1 × 106 对数生长期的人肺癌A549 细胞。当肿瘤成长至100 mm3 (day 0), 动物随机分为五组，即对照组、伊立替康组、间硝基苄基SN-38组、对硝基苄基SN-38组和邻硝基苄基SN-38组，分别给予腹腔注射生理盐水、伊立替康 （50mg/kg, 山梨醇/乳酸缓冲液 [45 mg/ml 山梨醇/0.9 mg/ml 乳酸]、间硝基苄基SN-38（50mg/kg）、对硝基苄基SN-38（50mg/kg）和邻硝基苄基SN-38（50mg/kg），每四天一次。药物通过腹腔注射完成。每两天测量肿瘤一次，绘制治疗20天内的生长曲线。密切观察动物的生存情况，出现如下两个或两个以上情况时处死动物：大量腹水、肿瘤直径大于2厘米、严重脱水、昏睡、消瘦（体重降幅大于开始体重的20%），绘制生存曲线。

     从生长曲线图（图8A）可以看出，伊立替康、以及间硝基、对硝基和邻硝基苄基SN-38治疗组，肺癌肿瘤的生长均显著慢于对照组（P值均小于0.05）。肿瘤生长曲线在间硝基SN-38治疗组肿瘤最小，其次为伊立替康，但二者没有显著性差异，说明间硝基苄基SN-38在治疗肺癌的疗效不低于伊立替康。然而，对硝基和邻硝基苄基SN-38治疗组肿瘤生长快于伊立替康和间硝基苄基SN-38治疗组。

 从小鼠生存曲线图（图8B）可以看出，伊立替康、以及间硝基、对硝基和邻硝基苄基SN-38治疗组，小鼠的生存率均显著高于对照组（P值均小于0.05）。其中间硝基苄基SN-38治疗组，小鼠的生存率最高，其次为对硝基苄基SN-38， 再次为邻硝基苄基SN-38，伊立替康治疗组小鼠的生存率最低。

Claims (3)

1.用于抗肿瘤药物的间硝基苄氧基喜树碱缺氧激活前药，其化学名称为：(4S)-4，11-二乙基-4-羟基-9-(3-硝基苄氧基)-1H-吡喃并[3'，4'：6，7]吲哚嗪并[1，2-b]喹啉-3，14(4H，12H)-二酮，简称间硝基苄基SN-38；其化学结构式如下：

。

2.如权利要求1所述的用于抗肿瘤药物的间硝基苄氧基喜树碱缺氧激活前药的制备方法，其特征在于利用间硝基苄醇作为修饰剂与SN-38进行成醚反应；具体步骤和工艺条件如下：

将 2.30克间硝基苄醇和3.92克SN-38溶于40毫升四氢呋喃中，室温下加入3.67克三苯基膦，冷却至0℃，滴加2.78克偶氮二甲酸二乙酯，加完后升至室温，搅拌3小时后，加入200毫升二氯甲烷和200毫升水，分出有机相，水层用200毫升二氯甲烷萃取3次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，减压除去溶剂，所得粗产品经柱层析分离，得到黄色固体间硝基苄基产品。

3.如权利要求1所述的间硝基苄氧基喜树碱缺氧激活前药在用于制备治疗肺癌的抗肿瘤药物以及治疗其他癌症的抗肿瘤药物中的应用。