ES2352321T3 - Composiciones y métodos para suministrar anticuerpos anti-ras activada en células. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido quimérico que se caracteriza porque dicho polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio, en los que: - el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica mediante la unión a un glicosaminoglicano que se selecciona del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e) (BXmBB)n; f) (BmXX)n; o g) un fragmento de anticuerpo, en el que cada B es independientemente un aminoácido básico, preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo; cada m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es independientemente un número entero entre cero y cinco; y - el segundo dominio comprende un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado, que se une de modo específico a un epitopo sobre la proteína RAS activada.

Description

Composiciones y métodos para suministrar anticuerpos anti-RAS activada en células.

Esta invención se refiere, en general, a composiciones y métodos para tratar enfermedades proliferativas, tales como cánceres y, más en concreto, a composiciones que comprenden un anticuerpo conjugado con un péptido que penetra en células.

Las proteínas RAS son proteínas G prototípicas que han demostrado desempeñar un papel clave en la transducción de señales, la proliferación y la transformación maligna. La proteína RAS-21 activada (oncogénica) se ha implicado, como factor causativo principal, en una alta proporción de tumores sólidos humanos. Se han detectado genes ras mutados en un gran número de cánceres, que comprenden el adenocarcinoma de páncreas (90%), de colon (50%) y de pulmón (30%). La inhibición de la expresión del oncogén Ki-ras en líneas celulares tumorales humanas provoca la regresión completa en modelos animales ((Shirasawa et al., Science, 260, 85-88 (1993)). Por consiguiente, la vía de RAS es una diana atractiva para estrategias terapéuticas (Downward, Nat. Rev. Cancer., 3(1), 11-22 (2003)).

Los anticuerpos son extremadamente específicos, a veces mucho más específicos que los fármacos de molécula pequeña, y no son inherentemente tóxicos. El análisis de unión a antígenos puede presentar afinidades (K_{D}) cercanas al registro nanomolar bajo, según se mide mediante una ELISA de unión. Esta especificidad hace que la tecnología de anticuerpos monoclonales sea valiosa para usos terapéuticos. El anticuerpo monoclonal de rata neutralizante Y13259 (IgG1) (ATCC nº CRL-1742), que reconoce las cuatro proteínas RAS-p21 de mamífero mutadas (H, N, K-4A y K-4B), dificulta enormemente la reacción de intercambio de nucleótidos entre los nucleótidos de guanina unidos a p21 y exógenos (Furth et al., J. Virol., 43, 294-304 (1982); Hattori et al., Mol. Cell. Biol., 7, 1999-2002 (1987)), y ha demostrado que puede revertir el fenotipo de células NIH 3T3 transformadas con el gen oncogénico ras después de una microinyección, o produce la regresión de tumores en ratones atímicos utilizando scFc anti-RAS y un vector adenovírico (Cochet et al., Cancer Res. 58, 1170-1176 (1998); Kung et al., Exp. Cell Res., 162, 363-371 (1986)).

Aunque la proteína RAS-p21 representa una diana terapéutica validada en oncología, las estrategias de anticuerpos terapéuticos no son posibles porque la proteína RAS-p21, al igual que muchas dianas terapéuticas, es una proteína intracelular, y porque los anticuerpos son incapaces de atravesar las membranas celulares o nucleares para interaccionar con sus antígenos intracelulares. Por tanto, un objetivo principal de la invención es proporcionar anticuerpos más eficaces y composiciones farmacéuticas para el tratamiento del cáncer.

La solicitud de patente PCT nº WO 04/041688 describe moléculas inmunológicas capaces de unirse de modo específico a una proteína RAS activada dentro de un entorno intracelular, en las que el anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera. También indica que estas inmunoglobulinas pueden condensarse o conjugarse con un dominio o una secuencia procedente de una proteína responsable de la actividad de translocación (mediante esta forma, la inmunoglobulina es capaz de entrar en la célula o en su núcleo cuando se introduce en la vecindad de la célula), tales como los dominios y las secuencias de la proteína transactivante de VIH-1 (Tat), la proteína del homeodominio de Antennapedia de Drosophila, y la proteína VP22 del virus del herpes simplex-1. Para el transporte de anticuerpos a células también se utiliza el péptido TLM (Oess y Hildt, Gene Ther., 7, 750-758, (2000)), o una tecnología de anticuerpos anti-ADN. El uso de un anticuepo con un único dominio puede tener ciertas limitaciones, incluyendo la estabilidad en sangre durante los estudios in vivo o una baja especificidad de antígeno. Esto demuestra la importancia de un sistema de transporte óptimo que pueda proteger al anticuerpo y mejorar su biodistribución. Los péptidos de transporte indicados se originan de proteínas víricas (Tat, VP22, TLM) o de secuencias no humanas (Antennapedia), y pueden ser tóxicos e inmunogénicos en seres humanos.

Dentro del marco de investigación que ha conducido a esta invención, el solicitante ha conjugado el anticuerpo monoclonal de rata Y13259 (ATCC nº CRL-1742) a ciertos péptidos que penetran en células (CPP) para permitir su translocación hacia el interior de las células.

Esta invención tiene como objetivo, específicamente, un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada conjugado con al menos un péptido que penetra en células (CPP) para mediar una actividad antiproliferativa. El solicitante ha demostrado que la unión de péptidos que penetran en células a anticuerpos monoclonales potencia su eficacia contra células de cáncer.

Según otra realización, el conjugado de anticuerpo neutralizante anti-RAS activada-CPP seleccionado de la presente invención puede utilizarse como composiciones administradas por separado o en combinación con otros fármacos, tales como fármacos citotóxicos, citostáticos o inmunoterapéuticos, y más en concreto, ciclosporina, metotrexato, adriamicina, cisplatino o taxoides (placlitaxel, doxorrubicina, etc.).

La invención proporciona además un método para el tratamiento o la prevención de cánceres o adenocarcinomas en un sujeto, que comprende la administración al sujeto, en una cantidad eficaz para dicho tratamiento o prevención, de un conjugado de anticuerpo neutralizante anti-RAS activada-péptido que penetra en células de la invención. El conjugado de anticuerpo-CPP utilizado para el tratamiento puede estar en forma de una composición, preferiblemente una composición farmacéutica, que comprende dicho conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De manera ventajosa, el anticuerpo es capaz de unirse de modo selectivo a la proteínas RAS activada intracelular in vitro y/o in vivo y, por consiguiente, la proteína RAS activada se inactiva funcionalmente.

Por tanto, la presente invención se refiere a un polipéptido quimérico, que se caracteriza porque dicho polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que:

- el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica mediante la unión a un glicosaminoglicano que se selecciona del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e) (BXmBB)n; f) (BmXX)n; o g) un fragmento de anticuerpo, en el que cada B es independientemente un aminoácido básico, preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo; cada m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es independientemente un número entero entre cero y cinco; y

- el segundo dominio comprende un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado.

Los términos "péptido" y "péptidos" se refieren a un polímero de aminoácidos para los cuales la convención escrita es N o amino terminal a la izquierda, y C o carboxilo terminal a la derecha. Los 20 L-aminoácidos naturales más comunes se denominan, de forma alternativa, mediante un código de tres letras o de una letra. Se considera que los péptidos, tal como se emplean en la presente, incluyen los "análogos de péptidos", modificaciones estructurales que contienen una o más modificaciones de las cadenas laterales de los L-aminoácidos o del esqueleto de alfa-aminoácidos. Un ejemplo de un análogo de péptido con esqueleto modificado es el "peptoide" de N-metilglicina (Zuckermann et al., J. Amer. Chem. Soc., 114: 10646-10647 (1992)).

Las expresiones "péptido que penetra en células" o "péptidos que penetran en células" (CPP) se definen como un péptido vehículo que es capaz de atravesar una membrana biológica o una membrana fisiológica. Los péptidos que penetran en células también se denominan péptidos permeables a células, dominios de transducción de proteínas (PTD) o secuencias de translocación de membrana (MTS). Los CPP tienen la capacidad de translocar in vitro y/o in vivo las membranas de células de mamífero y entrar en las células, y dirigen un compuesto conjugado de interés, tal como un fármaco o un marcador, a un destino celular deseado, por ejemplo hacia el citoplasma (citosol, retículo endoplásmico, aparato de Golgi, etc.) o al núcleo. Por consiguiente, los CPP pueden dirigir o facilitar la penetración de un compuesto de interés a través de una membrana fosfolipídica, mitocondrial, endosómica o nuclear. Los CPP también pueden dirigir un compuesto de interés desde el exterior de la célula a través de la membrana plasmática y hacia el citoplasma, o hacia un emplazamiento deseado dentro de la célula, por ejemplo el núcleo, un ribosoma, una mitocondria, el retículo endoplásmico, un lisosoma o un peroxisoma. Como alternativa o además, los CPP pueden dirigir un compuesto de interés a través de la barrera hematoencefálica, transmucósica, hematorretiniana, de la piel, gastrointestinal y/o pulmonar.

La penetración a través de una membrana biológica o una barrera fisiológica puede determinarse mediante diversos procesos, por ejemplo mediante un ensayo de penetración celular que tenga una primera etapa de incubación para el CPP conjugado con un marcador en presencia de células cultivadas, seguido de una etapa de fijación, y después un revelado de la presencia del péptido marcado dentro de la célula. En otra realización, la etapa de revelado puede realizarse con una incubación del CPP en presencia de anticuerpos marcados y dirigidos contra el CPP, seguido de una detección en el citoplasma o en la proximidad inmediata del núcleo celular, o incluso dentro de él, de la reacción inmunológica entre la secuencia de aminoácidos del CPP y los anticuerpos marcados. El revelado también puede realizarse marcando una secuencia de aminoácidos en el CPP y detectando la presencia del marcaje en los compartimentos celulares. Los ensayos de penetración celular son muy conocidos por los expertos en la técnica. Sin embargo, se describe un ensayo de penetración celular, por ejemplo, en la solicitud de patente nº WO 97/02840.

Se ha descubierto que varias proteínas y sus derivados peptídicos poseen propiedades de internalización en células que incluyen, pero no se limitan a la proteína Tat del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1) (Ruben et al., J. Virol. 63, 1-8 (1989)), la proteína VP22 del tegumento del herpes virus (Elliott y O'Hare, Cell, 88, 223-233 (1997)), la porción homeótica de Antennapedia de Drosophila melanogaster (el CPP se denomina penetratina) (Derossi et al., J. Biol. Chem., 271, 18188-18193 (1996)), el péptido antimicrobiano de protegrina 1 (PG-1) SynB (Kokryakov et al., FEBS Lett., 327, 231-236 (1993)), y el factor del crecimiento de fibroblastos básico (Jans, Faseb J., 8, 841-847 (1994)). Se ha descubierto que otra serie de proteínas distintas y sus derivados peptídicos poseen propiedades de internalización en células similares. Los péptidos vehículo que se han derivado de estas proteínas muestran poca homología de secuencia entre sí, pero todos son muy catiónicos y richos en arginina o lisina. En efecto, se ha demostrado que los péptidos de poliarginina sintéticos se internalizan con un alto nivel de eficacia (Futaki et al., J. Mol. Recognit., 16, 260-264 (2003); Suzuki et al., J. Biol. Chem. (2001)).

Los CPP pueden tener cualquier longitud. Por ejemplo, un CPP tiene una longitud menor o igual a 500, 250, 150, 100, 50, 25, 10, 6 ó 4 aminoácidos. Por ejemplo, un CPP tiene una longitud mayor o igual a 4, 5, 6, 10, 25, 50, 100, 150 ó 250 aminoácidos. Los expertos en la técnica pueden determinar con facilidad la longitud y el diseño adecuados del CPP. Como referencias generales sobre los CPP, pueden citarse: PÉPTIDO QUE PENETRA EN CÉLULASS: PROCESSES AND APPLICATIONS, editado por Ulo Langel (2002); o Advanced Drug Delivery Reviews, 57:489-660 (2005); o Dietz y Bähr, Moll Cell. Neurosci., 27: 85-131 (2004).

En realizaciones preferidas, el CPP tiene una longitud de 4, 5, 6, 7, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos.

Los péptidos que penetran en células según la invención pueden ser, pero no se limitan a los descritos a continuación o sus variantes. Un "variante" es al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%-85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95%-99% idéntico a éstos. Por ejemplo, los péptidos pueden tener sustituciones en 1, 2, 3, 4 o más restos. El CPP puede utilizarse en su forma natural (tal como se describió anteriormente) o en su forma polimérica (dímero, trímero, etc.)

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TABLA 1 Selección de péptidos que penetran en células muy conocidos utilizados para el transporte de cargamento

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Si es necesario, los expertos en la técnica pueden utilizar varias estrategias químicas muy conocidas para transformar un CPP en un candidato a fármaco con mayor estabilidad in vivo, biodisponibilidad y/o actividad biológica, tales como:

- modificaciones en el N- y C-terminal para evitar la degradación por exopeptidasas: la amidación C-terminal o la acetilación N-terminal aumenta la lipofilicidad del péptido;

- una ciclación formando un puente disulfuro;

- una alquilación del nitrógeno de amida para evitar la degradación por endopeptidasas;

- la introducción de aminoácidos no naturales para modificar el sitio de reconocimiento de la endopeptidasa (2-metilalanina, glicina alfa-dialquilada, oligocarbamato, oligourea, esqueletos guanidino o amidino ...);

- la incorporación de aminoácidos no codificados genéticamente (metilación, halogenación o cloración de glicina o fenilalanina) en la secuencia de aminoácidos del CPP;

- la sustitución de algunos o de todos los L-aminoácidos por sus correspondientes análogos de D-aminoácidos o beta-aminoácidos. Estos péptidos pueden sintetizarse como formas "inversas" o "retroinversas", es decir, sustituyendo los L-aminoácidos de la secuencia por D-aminoácidos, o invirtiendo la secuencia de los aminoácidos y sustituyendo los L-aminoácidos por D-aminoácidos. Desde el punto de vista estructural, el péptido retroinverso es mucho más similar al péptido original que el D-análogo simple. Los D-péptidos son sustancialmente más resistentes a las peptidasas y, por tanto, son más estables en suero y tejidos comparados con sus homólogos de L-péptidos. En una realización preferida, a los CPP que contienen L-aminoácidos se les introduce un casquete de un único D-aminoácido para inhibir la destrucción por exopeptidasas;

- la síntesis de un oligocarbamato derivado de CPP; el esqueleto de oligocarbamato consiste en un esqueleto de etileno quiral unido a través de grupos carbamato relativamente rígidos (Cho et al., Science, 261: 1303-1305 (1993)).

En otra realización, el CPP contiene aminoácidos o análogos de aminoácidos básicos contiguos o no contiguos, en particular restos guanidilo o amidinilo. Los términos "guanidilo" y "guanidina" se emplean de modo intercambiable para referirse a un resto que tiene la fórmula -HN=C(NH_{2})NH (forma no protonada), por ejemplo, una arginina que contiene un resto guanidilo (guanidino), que también se denomina ácido 2-amino-5-guanidinovalérico o ácido a-amino-6-guanidinovalérico. Los términos "amidinilo" y "amidino" se emplean de forma intercambiable, y se refieren a un resto que tiene la fórmula -C(=NH)(NH2). Un "aminoácido o análogo de aminoácido básico" tiene un pKa de la cadena lateral mayor que 10. Los aminoácidos muy básicos preferidos son la histidina, la arginina y/o la lisina.

En una realización preferida, el CPP según la invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos o análogos de aminoácidos básicos, en particular lisina o arginina.

Según una realización más preferida, el CPP se caracteriza además por su capacidad para reaccionar o para unirse con glicosaminoglicanos (GAG) (moléculas largas sin ramificar que contienen unidades repetidas de disacáridos) o, de modo específico, con ácido hialurónico, heparina, sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de queratina o sulfato de condroitina y sus derivados. Los "derivados de heparina, sulfato de heparano o sulfato de condroitina" o "glicosaminoglicanos" significan cualquier producto o subproducto según se define en las publicaciones citadas en las referencias (Cardin y Weintraub, Arteriosclerosis, 9: 21 (1989); Merton et al., Annu. Rev. Cell Biol., 8: 365 (1992); David, FASEB J., 7: 1023 (1993)).

La capacidad de los CPP para reaccionar o para unirse con glicosaminoglicanos (GAG) puede determinarse mediante ensayos de unión a glicosaminoglicanos directos o indirectos conocidos en la técnica, tales como el ensayo de coelectroforesis de afinidad (ACE) para la unión de glicosaminoglicanos a péptidos, descrito en la solicitud de patente PCT WO 00/45831. Están disponibles otros métodos muy conocidos en la técnica para analizar las interacciones de GAG-péptidos, por ejemplo el método descrito en la solicitud de patente PCT WO 01/64738, o por Weisgraber y Rall (J. Biol. Chem., 262(33): 11097-11103) (un ejemplo específico es la apolipoproteína B-100); o mediante un ensayo ELISA modificado: se revisten placas de 96 pocillos con GAG específicos (sulfato de condroitina A, B y C, heparina, sulfato de heparano, ácido hialurónico, sulfato de queratano, sindecano), entonces se añade un péptido conjugado con un marcador durante un periodo de tiempo definido; después de un lavado a fondo, se determina la unión al péptido utilizando un análisis específico relacionado con el marcador.

Los CPP capaces de reaccionar in vitro y/o in vivo con glicosaminoglicanos se describen en las solicitudes de patente nº WO 01/64738 y nº WO 05/016960, y por De Coupade et al. (Biochem J., 390: 407-418 (2005)). Estos péptidos son secuencias de aminoácidos que se originan de proteínas de unión a heparina humanas y/o anticuerpos anti-ADN seleccionados del grupo que comprende lipoproteínas, tales como apolipoproteína B o E humanas (Cardin et al., Biochem. Biosphys. Res. Com., 154: 741 (1988)), la agrina (Campanelli et al., Development. 122: 1663-1672 (1996)), la proteína de unión al factor del crecimiento de insulina (Fowlkes et al., Endocrinol., 138: 2280-2285 (1997)), el factor del crecimiento derivado de plaquetas humano (Maher et al., Mol. Cell. Biol., 9: 2251-2253 (1989)), la superóxido dismutasa extracelular humana (EC-SOD) (Inoue et al., FEBS, 269: 89-92 (1990)), el factor del crecimiento de tipo factor del crecimiento epidérmico de unión a heparina humano (HB-EGF) (Arkonac et al., J. Biol. Chem., 273: 4400-4405 (1998)), el factor del crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF) (Fromm et al., Arch. Biochem. Bioph., 343: 92 (1997)), el factor del crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (Yayon et al., Cell, 64: 841-848 (1991)), la secuencia de mucina intestinal-2 humana (Xu et al., Glyconjug J., 13: 81-90 (1996)), el gamma-interferón humano (Lortat-Jacob y Grimaud, FEBS, 280: 152-154 (1991)), la subunidad p40 de la interleuquina-12 humana (Hasan et al., J. Immunol., 162: 1064-1070 (1999)), el factor 1-alfa derivado de células estromáticas (Amara et al., J. Biol. Chem., 272: 200-204 (1999)), la "proteína de unión a heparina" derivada de neutrófilos humanos (CAP 37/azurocidina) (Pohl et al., FEBS, 272: 200-204 (1990)), una molécula de inmunoglobulina, tal como las regiones CDR2 y/o CDR3 del anticuerpo monoclonal murino anti-ADN F4.1 (Avrameas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 5601 (1998)), la región hipervariable CDR3 del anticuerpo monoclonal anti-ADN humano RTT79 (Stevenson et al., J. Autoimmunity, 6: 809 (1993)), el área hipervariable CDR2 y/o CDR3 del anticuerpo monoclonal anti-ADN humano NE-1 (Hirabayashi et al., Scand. J. Immunol., 37: 533 (1993)), el área hipervariable CDR3 del anticuerpo monoclonal anti-ADN humano RT72 (Kalsi et al., Lupus, 4: 375 (1995)).

Según una realización más preferida, el CPP comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e) (BXBB)n; y f) un fragmento de anticuerpo, en el que cada B es independientemente un aminoácido básico, preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo, tal como alanina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, triptófano, valina, tirosina o citrulina; cada m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es independientemente un número entero entre cero y cinco. En ciertas realizaciones, n puede ser 2 ó 3, y X puede ser un aminoácido hidrófobo. Un fragmento de anticuerpo pretende incluir un polipéptido de inmunoglobulina más pequeño que su longitud completa, por ejemplo una cadena pesada, una cadena ligera, un Fab, Fab'2, Fv o Fc. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, humano o murino. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo anti-ADN. Preferiblemente, el fragmento de anticuerpo contiene toda o parte de la región CDR2 de un anticuerpo, en particular al menos una porción con una longitud de al menos 6 ó 10 aminoácidos de una región CDR2 de un anticuerpo anti-ADN. Como alternativa, el anticuerpo contiene toda o parte de la región CDR3 de un anticuerpo, en particular al menos una porción con una longitud de al menos 6 ó 12 aminoácidos de una región CDR3 de un anticuerpo anti-ADN. De forma más específica, el fragmento de anticuerpo contiene al menos una región CDR3 de un anticuerpo anti-ADN humano, tal como RTT79, NE-1 y RT72. Estos fragmentos de anticuerpos se han descrito en la solicitud de patente PCT nº WO 99/07414.

Preferiblemente, el CPP según la invención se caracteriza también porque se origina a partir de proteínas humanas (es decir, proteínas que son expresadas en la naturaleza por células humanas). Por tanto, la característica de los CPP derivados de proteínas humanas, comparados con los CPP derivados de proteínas no humanas, es de interés principal en el uso previsto de estos CPP, puesto que se evita o disminuye su inmunogenicidad. Además, De Coupade et al. (Biochem J., 390: 407-418 (2005)) han demostrado que los péptidos derivados de seres humanos tienen unos perfiles de toxicidad in vivo bajos, coherentes con su uso como sistemas de transporte terapéuticos, a diferencia de los péptidos vehículo existentes, tales como los péptidos Tat (Trehin y Merkle, Eur. J. Pharm. Biopharm., 58, 209-223 (2004)).

Entre los CPP descritos anteriormente, se prefieren los que son capaces de penetrar de modo específico en el citoplasma. La penetración de un CPP en el citoplasma puede ser determinada mediante diversos procesos in vitro conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, incubando el CPP con células; después, las células se incuban en presencia de anticuerpos marcados anti-CPP específicos y anticuerpos marcados anti-proteínas citoplásmicas específicos, seguido de la detección en el citoplasma de la reacción inmunológica entre el CPP y los anticuerpos marcados. Otro método es conjugar el CPP a oro coloidal e incubar el conjugado con las células. Las células entonces se tratan como es habitual para utilizar un microscopio electrónico para visualizar la localización intracelular.

Por consiguiente, los CPP preferidos, derivados de la proteína de unión a heparina humana y capaces de penetrar de modo específico en el citoplasma de una célula diana, se seleccionan del grupo que comprende:

- DPV6 (SEQ ID NO:3): CPP que reacciona con heparina y derivado de la secuencia de aminoácidos de la parte C-terminal de la cadena A del factor del crecimiento derivado de plaquetas humano (Maher et al., Mol. Cell. Biol., 9: 2251-2253 (1989)). Comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula c) (BBXmBBXp)n, en la que m = 0, p = 0, y n = 1;

- DPV7 (SEQ ID NO:4) y DPV7b (SEQ ID NO:5): CPP que reaccionan con la heparina y se derivan de la parte C-terminal de la secuencia del factor del crecimiento de tipo factor del crecimiento epidérmico de unión a heparina humano (HB-EGF) (Arkonac et al., J. Biol. Chem., 273: 4400-4405 (1998)). Ambos CPP comprenden una secuencia de aminoácidos de fórmula c) (BBXmBBXp)n, en la que m = 0, p = 0, y n = 1;

- DPV10 (SEQ ID NO:10): CPP que reacciona con la heparina y se corresponde con la parte C-terminal de la secuencia de mucina intestinal-2 humana (Xu et al., Glyconjug. J., 13: 81-90 (1996)). Comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula e) (BXBB)n, en la que n = 1;

- DVP3/10 (SEQ ID NO:6): CPP que reacciona con la heparina y se deriva de la parte C-terminal de la secuencia de la superóxido dismutasa extracelular humana (EC-SOD) (véase anteriormente), y de la parte C-terminal de la secuencia de mucina intestinal-2 humana (véase anteriormente). Comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula c) (BBXmBBXp)n, en la que m = 1, p = 2, y n = 1;

- DVP10/6 (SEQ ID NO:7): CPP que reacciona con la heparina y se deriva de la parte C-terminal de la secuencia de mucina intestinal-2 humana (véase anteriormente), y de la parte C-terminal de la cadena A del factor del crecimiento derivado de plaquetas (véase anteriormente). Comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula c) (BBXmBBXp)n, en la que m = 1, p = 2, y n = 1;

- DVP1470 (SEQ ID NO:8): CPP que reacciona con la heparina derivada de la secuencia de aminoácidos (3358-3372) de la lipoproteína B humana (Cardin et al., Biochem. Biosphys. Res. Com., 154: 741 (1988)), y de la secuencia del péptido que se corresponde con el área hipervariable CDR3 del anticuerpo monoclonal anti-ADN humano NE-1 (Hirabayashi et al., Scand. J. Immunol., 37: 533 (1993)). Comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula d) (XBBXXBX)n, en la que n = 1, y un fragmento de anticuerpo o una secuencia de aminoácidos de fórmula b) (XBBXBX)n, en la que n = 1;

- DPV15b (SEQ ID NO:11): CPP que reacciona con la heparina y que contiene parte de la secuencia de la "proteína de unión a la heparina" (CAP 37). Comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula d) (XBBXXBX) repetida dos veces.

Un CPP más preferido es DPV3 (SEQ ID NO:2): CPP que reacciona con la heparina y es un dímero de un péptido derivado de la parte C-terminal de la secuencia de la superóxido dismutasa extracelular humana (EC-SOD) (Inoue et al., FEBS, 269: 89-92 (1990)). Comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula c) (BBXmBBXp)n, en la que m = 0, p = 0 y n = 1. DPV3 contiene la secuencia de aminoácidos BBBBBBXXBBBBBBXX.

Una "proteína RAS-p12" o "proteína RAS" se define como una proteína codificada por el gen ras. La familia del gen ras se encuentra en una amplia variedad de células de mamífero nucleadas y participa en la función celular normal. Consiste en tres genes funcionales, H-ras, N-ras y K-ras. Los genes ras codifican proteínas de 21 kDa (denominadas p21), que están asociadas con la membrana plasmática interna (H-RAS, N-RAS, y K-RAS A y K-RAS B, estas dos últimas con un corte y empalme alternativo). Mientras que H-RAS, N-RAS y K-RAS B se expresan de forma ubicua, K-RAS A es inducida durante la diferenciación de células pluripotenciales embrionarias in vitro (Pells et al., Oncogene, 15, 1781-1786 (1997)).

Una "proteína RAS activada" o "RAS activada" se define como la forma de la proteína RAS que es capaz de inducir a las células a que pierdan su control del crecimiento normal. Tal como se emplea en la presente, la expresión "proteína RAS activada" es sinónimo de "proteína RAS oncogénica". Se ha demostrado que las proteínas RAS activadas con frecuencia contienen mutaciones puntuales (una sustitución de un aminoácido) en la posición 12, 13 ó 61 (Reddy et al., Nature, 300, 149-152 (1982); Tabin et al., Nature, 300, 143-149 (1982); y Bos, Cancer Res., 49,
4682-4689 (1989)).

Un "anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado" se define como un anticuerpo neutralizante, su fragmento o su derivado, que se une de modo específico a un epitopo sobre las proteínas RAS activadas, pero que no se une a un epitopo de la proteína RAS normal no activada. La expresión "unión específica a un epitopo sobre una proteína RAS activada" significa que, dentro de una mezcla de reactivos que comprenden RAS activada además de otros antígenos alternativos, sólo se une la RAS activada. Preferiblemente, la unión específica de un anticuerpo según la presente invención a la RAS activada es de alta afinidad, por ejemplo, entre aproximadamente 10^{-11} y aproximadamente 10^{-10} molar. Las mediciones de afinidad pueden realizarse utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo el método de la diálisis en equilibrio.

Un "anticuerpo neutralizante, su fragmento o su derivado" significa un anticuerpo, su fragmento o su derivado, cuya unión a una proteína RAS activada produce la inhibición de la actividad biológica (por ejemplo, la función) de dicha proteína RAS activada. Esta inhibición de la actividad biológica puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de la proteína RAS activada, tal como la reacción de intercambio de nucleótidos entre nucleótidos de guanina unidos a p21 y exógenos, la entrada en la fase S de la síntesis de ADN, y la replicación celular (Hattori et al., Mol. Cell. Biol., 7, 1999-2002 (1987)). El término "inhibición" significa que la capacidad transformadora de células de la RAS activada es inhibida comparada con un control adecuado, en el que las células control no se tratan con un anticuerpo de la presente invención. De forma ventajosa, la capacidad transformadora de células de la RAS activada es inhibida en 20% comparada con un control adecuado. De forma más ventajosa, es inhibida en 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%. En una realización más preferida de este aspecto de la invención, la capacidad transformadora de células de la RAS activada es inhibida en 100% comparada con un control adecuado. Tal como se emplea en la presente, la expresión "capacidad transformadora" (de la RAS activada) se refiere a la capacidad de la RAS activada para inducir a las células a perder su control del crecimiento normal. Por ejemplo, las "células transformadas" muestran una replicación sin fin y una pérdida de la inhibición por contacto.

El término "anticuerpo" según la presente invención se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une de modo inmunoespecífico a una proteína RAS activada. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de moléculas de inmunoglobulina. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos, murinos (por ejemplo, de ratón y de rata), de burro, oveja, conejo, cabra, cobaya, camélido, caballo o pollo. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales, preferiblemente monoclonales.

Tal como se emplea en la presente, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, e incluyen anticuerpos aislados a partir de bancos de inmunoglobulinas humanas, a partir de células B, o a partir de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas, como se describe, por ejemplo, en la patente de EEUU nº 5.939.598.

La expresión "fragmento de anticuerpo" según la presente invención se refiere a anticuerpos que son fragmentos de anticuerpos neutralizantes anti-RAS activada e incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab' y F(ab')2, Fd, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fv unidos mediante disulfuro (sdFv) y fragmentos que comprenden un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpos neutralizantes anti-RAS activada, incluyendo los anticuerpos monocatenarios, pueden comprender la región o regiones variables solas o en combinación con la totalidad o con una porción de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 y CL. También se incluyen en la invención los fragmentos de anticuerpos neutralizantes anti-RAS activada que comprenden cualquier combinación de una región o regiones variables con una región bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 y CL.

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El término "derivados" según la invención se refiere a anticuerpos o sus fragmentos (cualquiera de los anteriores fragmentos de unión a la proteína RAS activada) que tengan una coincidencia de más de 60% con un anticuerpo o sus fragmentos según se definió anteriormente, preferiblemente más del 70% de coincidencia, como ejemplo más de 80% de coincidencia o más del 90% de coincidencia, y lo más preferiblemente más del 95% de coincidencia con un anticuerpo o sus fragmentos según se definió anteriormente.

Preferiblemente, dichos derivados se corresponden con anticuerpos humanizados o sus fragmentos.

Los anticuerpos de la presente invención pueden generarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Pueden producirse anticuerpos policlonales contra una proteína RAS activada mediante diversos procedimientos muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede administrarse una proteína RAS activada a diversos animales hospedantes que incluyen, pero no se limitan a conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la producción de suero que contenga anticuerpos policlonales específicos para la proteína. Pueden emplearse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedante, que incluyen, pero no se limitan a adyuvante de Freund (completo e incompleto), geles minerales, tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas, tales como lisolecitina, polianiones de polioles 5 plurónicos, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianina de lapa, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Estos adyuvantes también son muy conocidos en la técnica.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo el uso de la tecnología de hibridomas, recombinante y de presentación de fagos, o sus combinaciones. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales utilizando técnicas de hibridoma que incluyen las conocidas en la técnica y que se indican, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed., 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (dichas referencias se incorporan como referencia en su totalidad). La expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se emplea en la presente, no se limita a anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridomas. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un único clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no indica el método mediante el cual ha sido producido. Los métodos para producir y seleccionar anticuerpos específicos empleando la tecnología de hibridomas son habituales y muy conocidos en la técnica.

Los métodos para fabricar un "anticuerpo humanizado" son muy conocidos en la técnica. Esta es una técnica para reconstruir el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo no humano (por ejemplo, un anticuerpo de roedor) sobre un anticuerpo humano (Jones, P.T. et al., Nature, 321, 5225-5525 (1986); Verhoeyen, M. et al., Science, 239, 1534-1536 (1988); Riechmann, L. et al., Nature, 332, 323-327 (1988)). En general, el anticuerpo humanizado o su fragmento comprende sustancialmente al menos uno y más preferiblemente dos dominios variables (Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se corresponden con las de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones marco (FR) son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado, de forma óptima, también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), de forma típica la de una inmunoglobulina humana. Normalmente, el anticuerpo contiene la cadena ligera y también al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyen IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y de cualquier isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Normalmente, la región constante es un dominio constante de fijación del complemento, en el que se desea que el anticuerpo humanizado muestre actividad citotóxica, y la clase es, de forma típica, IgG y preferiblemente IgG1. Cuando dicha actividad citotóxica no sea deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG2. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias procedentes de más de una clase o isotipo, y la selección de los dominios constantes concretos para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de la técnica. No es necesario que las regiones FR y CDR del anticuerpo humanizado se correspondan exactamente con las secuencias de origen, por ejemplo, la CDR de importación o la FR consenso pueden mutagenizarse mediante sustitución, inserción o deleción de uno o más restos, de modo que el resto de la CDR o FR en ese sitio no se corresponda al consenso o al anticuerpo de importación. Sin embargo, estas mutaciones no serán extensas y no afectarán notablemente a la unión del anticuerpo a la diana de unión. La expresión "anticuerpo humanizado" también incluye anticuerpos híbridos y recombinantes, y polipéptidos producidos mediante el corte y empalme de una región variable o de una o más CDR de una anticuerpo anti-AF-20 con cualquier proteína o proteínas heterólogas, independientemente de la especie de origen, tipo de proteína, denominación de clase o subclase de inmunoglobulina, con la condición de que los polipéptidos y anticuerpos híbridos y recombinantes muestren la actividad biológica deseada. La expresión "anticuerpo humanizado" también incluye anticuerpos y polipéptidos que se han hechos no inmunogénicos, o que tengan una inmunogenicidad reducida con relación al anticuerpo nativo, para un ser humano mediante el método de determinar al menos parte de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o polipéptido (preferiblemente la parte que no tiene origen humano, tal como la región VH o VK de un anticuerpo no humano), identificar en la secuencia de aminoácidos uno o más epitopos potenciales para células T humanas, y modificar la secuencia o secuencias de aminoácidos de este epitopo o epitopos para eliminar al menos uno de los epitopos de células T identificado para eliminar o reducir la inmunogenicidad de la proteína o sus porciones cuando se exponen al sistema inmunológico humano. En la creación de una anticuerpo humanizado, preferiblemente aproximadamente 75%, más preferiblemente aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente más de aproximadamente 95% de los restos del anticuerpo humanizado se corresponderán con los de las secuencias FR y CDR de origen.

Los fragmentos de anticuerpos que reconocen epitopos específicos sobre la proteína RAS activada pueden generarse mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab')2 de la invención pueden producirse mediante ruptura proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de cadena ligera, y el dominio CH1 de cadena pesada.

En una realización específica, el anticuerpo es el anticuerpo monoclonal neutralizante de rata Y13259 o su derivado (Furth et al., J. Virol., 43, 294-304 (1982); Kung et al., Exp. Cell Res., 162, 363-371 (1986); Hattori et al., Mol. Cell Biol., 7, 1999-2002 (1987); Hamer et al., Hybridoma, 9, 573-587 (1990)). El término "derivado" pretende incluir cualquier forma del anticuerpo Y13259 según se definió anteriormente, en el que uno o más de los aminoácidos dentro de la cadena polipeptídica se ha sustituido por un aminoácido alternativo y/o en el que uno o más de los aminoácidos han sido delecionados, o en el que uno o más de aminoácidos adicionales han sido añadidos a la cadena polipeptídica o a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo Y13259, que todavía mantiene al menos una función del anticuerpo Y13259 nativo, es decir, que sigue siendo un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada. Un derivado de Y13259 muestra al menos aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%-85%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 95%-99% de homología de la secuencia de aminoácidos frente al anticuerpo Y13259 nativo definido. En la técnica se conocen en general muchos programas informáticos adecuados para calcular la "homología" entre dos secuencias de aminoácidos, tales como el programa BLAST (http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/) eligiendo la matriz de puntuación BLOSUM62.

En una realización específica, el anticuerpo monoclonal neutralizante de rata Y13259 es producido por el clon de hibridoma denominado Y13259 que se origina de ATCC, nº CRL-1742.

El CPP y el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada pueden conjugarse (es decir, acoplarse mediante acoplamiento químico) de cualquier manera adecuada conocida en la técnica. Muchos métodos de entrecruzamiento químico no son específicos, es decir, no dirigen el punto de acoplamiento a algún sitio concreto sobre el CPP o el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada adecuado. Como resultado, el uso de reactivos de entrecruzamiento no específicos puede atacar a los sitios funcionales o bloquear estéricamente los sitios activos, produciendo proteínas conjugadas biológicamente inactivas. El anticuerpo neutralizante anti-RAS activada puede acoplarse directamente al CPP en uno de los extremos terminales (N- o C-terminal) o en una cadena lateral de uno de los aminoácidos. El anticuerpo neutralizante anti-RAS activada también puede acoplarse de modo indirecto a través de un brazo conector a uno de los extremos terminales de los péptidos o a una cadena lateral de uno de los aminoácidos.

Una manera para aumentar la especificidad de acoplamiento es mediante un acoplamiento químico directo con un grupo funcional que aparezca sólo una o unas pocas veces en uno o ambos polipéptidos que se van a entrecruzar. Por ejemplo, en muchas proteínas, la cisteína, que es el único aminoácido de proteínas que contiene un grupo tiol, aparece sólo unas pocas veces. Además, por ejemplo, si un polipéptido no contiene restos lisina, un reactivo de entrecruzamiento específico para aminas primarias será selectivo para el amino terminal de este polipéptido. La utilización satisfactoria de esta estrategia para aumentar la especificidad del acoplamiento requiere que el polipéptido tenga los restos reactivos y raros adecuados en áreas de la molécula que puedan alterarse sin la pérdida de la actividad biológica de la molécula.

Los restos cisteína pueden sustituirse cuando aparezcan en partes de la secuencia polipeptídica en las que su participación en una reacción de entrecruzamiento probablemente pueda interferir de otro modo con la actividad biológica. Cuando se sustituye un resto cisteína, de forma típica resulta deseable minimizar los cambios resultantes en el plegamiento del polipéptido. Los cambios en el plegamiento del polipéptido se minimizan cuando la sustitución es química y estéricamente similar a la cisteína. Por estas razones, se prefiere la serina como sustitución para la cisteína. Tal como se demuestra en los ejemplos que aparecen a continuación, un resto cisteína puede introducirse en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para objetivos de entrecruzamiento. Cuando se introduce un resto cisteína, se prefiere la introducción en el amino o carboxi terminal o cerca de éstos. Están disponibles métodos convencionales para estas modificaciones de la secuencia de aminoácidos, tanto si el polipéptido de interés es producido mediante síntesis química como mediante expresión de ADN recombinante.

El acoplamiento de los dos constituyentes puede realizarse a través de un agente de entrecruzamiento. Existen varios reactivos de entrecruzamiento intermolecular que pueden utilizarse; véase, por ejemplo, Means y Feeney, CHEMICAL MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp. 39-43. Entre estos reactivos se encuentran, por ejemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) o N,N'-(1,3-fenilen)bismaleimida (ambos son muy específicos para grupos sulfhidrilo y forman enlaces irreversibles); N,N'-etilen-bis(yodoacetamida) u otro reactivo parecido que tenga de 6 a 11 puentes de carbono metileno (que son relativamente específicos para grupos sulhidrilo); y 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (que forma enlaces irreversibles con grupos amino y tirosina). Otros reactivos de entrecruzamiento útiles para este objetivo incluyen: p,p'-difluoro-N,N'-dinitrodifenilsulfona (que forma enlaces cruzados irreversibles con grupos amino y fenólicos); adipimidato de dimetilo (que es específico para grupos amino); cloruro de fenol-1,4-disulfonilo (que reacciona principalmente con grupos amino); hexametilendiisocianato o diisotiocianato, o azofenil-p-diisocianato (que reaccionan principalmente con grupos amino); glutaraldehído (que reacción con varias cadenas laterales diferentes); y disdiazobenzidina (que reacciona principalmente con tirosina e
histidina).

Los reactivos de entrecruzamiento pueden ser homobifuncionales, es decir, tienen dos grupos funcionales (es decir, grupos reactivos) que sufren la misma reacción. Un ejemplo de un reactivo de entrecruzamiento homobifuncional es bismaleimidohexano ("BMH"). El BMH contiene dos grupos funcionales maleimida, que reaccionan de modo específico con compuestos que contienen sulfhidrilo bajo condiciones suaves (pH 6,5-7,7). Los dos grupos maleimida están conectados por una cadena hidrocarbonada. Por tanto, el BMH es útil para el entrecruzamiento irreversible de polipéptidos que contengan restos cisteína.

Los reactivos de entrecruzamiento también pueden ser heterobifuncionales. Los reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por ejemplo, un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol, que entrecruzarán dos proteínas que tengan aminas y tioles libres, respectivamente. Los reactivos de entrecruzamiento heterobifuncionales preferidos son 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo ("SMCC"), éster de N-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida ("MBS"), y 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimida ("SMPB"), un análogo de cadena extendida de MBS. El grupo succinimidilo de estos reactivos de entrecruzamiento reacciona con una amina primaria para forma un enlace amida, y la maleimida reactiva con tiol forma un enlace tioéter covalente con el tiol de un resto cisteína.

Los reactivos de entrecruzamiento a menudo tienen una baja solubilidad en agua. Puede añadirse un resto hidrófilo, tal como un grupo sulfonato, al reactivo de entrecruzamiento para mejorar su solubilidad en agua. El sulfo-MBS y el sulfo-SMCC son ejemplos de reactivos de entrecruzamiento modificados para su solubilidad en agua.

Muchos reactivos de entrecruzamiento producen un conjugado que fundamentalmente no puede romperse bajo condiciones celulares. Sin embargo, algunos reactivos de entrecruzamiento contienen un enlace covalente, tal como un disulfuro, que puede romperse bajo condiciones celulares. Por ejemplo, el reactivo de Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) ("DSP"), y 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidilo ("SPDP") son reactivos de entrecruzamiento que pueden romperse muy conocidos. Otro ejemplo son los derivados de hidrazina, tal como hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH), 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilhidrazida (M_{2}C_{2}H), o 3-(2-piridiltio)propionil hidrazida (PDPH). El uso de un reactivo de entrecruzamiento que puede romperse permite a la enzima lisosómica separar al CPP después de su transporte a la célula diana. También puede ser útil un enlace disulfuro
directo.

En el mercado están disponibles numerosos reactivos de entrecruzamiento, incluyendo los analizados anteriormente. Las instrucciones detalladas para su uso pueden adquirirse con facilidad a partir de suministradores comerciales. Una referencia general sobre entrecruzamiento de proteínas y preparación de conjugados es: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING, CRC Press (1991).

El entrecruzamiento químico puede incluir el uso de brazos espaciadores. Los brazos espaciadores proporcionan flexibilidad intramolecular o ajustan las distancias intramoleculares entre los dominios conjugados y, con ello, pueden ayudar a conservar la actividad biológica. Un brazo espaciador puede estar en forma de un dominio polipeptídico que incluya aminoácidos espaciadores, por ejemplo, prolina. Como alternativa, un brazo espaciador puede ser parte del reactivo de entrecruzamiento, tal como en "SPDP de cadena larga" (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., nº de catálogo 21651 H).

En una realización de la invención, el CPP se acopla al anticuerpo neutralizante anti-RAS activada mediante al menos una molécula (denominada "molécula de anclaje") que tienen una fuerte afinidad natural por el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada. La afinidad natural de la molécula de anclaje por el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada permite que el CPP interaccione de modo no covalente con el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada y, por tanto, que lo porte a través del recorrido intracelular. Otra ventaja especialmente interesante de este tipo de acoplamiento consiste en el hecho de que, debido a la afinidad natural de la molécula de anclaje por el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, estos dos elementos se acoplan de una manera totalmente natural, sin interacción química ni bioquímica.

Como alternativa, el polipéptido quimérico puede producirse mediante modificación genética, en forma de un polipéptido de fusión que incluye el CPP y la secuencia del anticuerpo neutralizante anti-RAS activada adecuada que puede expresarse de modo conveniente en células hospedantes adecuadas conocidas. Los polipéptidos de fusión, tal como se describen en la presente, pueden formarse y utilizarse de forma análoga a las técnicas de ADN recombinante convencionales o adaptarse con facilidad a partir de éstas. Por consiguiente, la presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos y vectores de expresión que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada y un CPP de la invención. Existen abundantes vectores de expresión disponibles y los expertos en la técnica pueden seleccionar con facilidad un vector apropiado. Además, los manuales de laboratorio convencionales sobre ingeniería genética proporcionan métodos de ADN recombinante y métodos para fabricar y utilizar vectores de expresión.

Si se desea, pueden insertarse además uno o más aminoácidos entre el primer dominio peptídico que comprende el CPP, y el segundo dominio peptídico que comprende el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada adecuado. En algunas realizaciones, el primer o el segundo dominio incluye una secuencia que facilita la asociación del CPP con el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada.

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La invención también proporciona un método para tratar o prevenir un cáncer mediante la administración a un sujeto en el que se desea dicho tratamiento o prevención de una composición que comprende un conjugado de anticuerpo neutralizante anti-RAS activada-CPP de la invención, en una cantidad suficiente para tratar o prevenir la enfermedad en el sujeto. En una realización específica, el cáncer es un carcinoma que comprende, pero no se limita a un adenocarcinoma de páncreas, de colon o de pulmón. Cualquier composición puede comprender una cantidad eficaz de un polipéptido quimérico de la invención del 0,1% al 99%, preferiblemente del 1% al 70% de la composición. Como ejemplo, las dosificaciones del polipéptido quimérico de la invención, cuando se emplean para los efectos indicados, estarán entre aproximadamente 0,05 y 1.000 mg, y preferiblemente 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 mg por composición. La eficacia del tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar cánceres. El sujeto puede ser cualquier mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo, un cerdo.

Los conjugados de anticuerpo neutralizante anti-RAS activada-CPP o las moléculas de ácido nucleico que codifican estos conjugados (también denominados en la presente "productos terapéuticos" o "compuestos activos") de la invención, y sus derivados, fragmentos, análogos y homólogos, pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración; estas composiciones comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, la invención se refiere al tratamiento del cáncer con asociaciones de al menos un conjugado de anticuerpo neutralizante anti-RAS activada-CPP según la invención y al menos otro agente antitumoral, tal como antraciclinas (tales como doxorrubicina) y los vinca-alcaloides o agentes antitumorales que tengan efectos antiinflamatorios, tales como metotrexato, y el uso de dichas asociaciones para un tratamiento mejorado.

Tal como se emplea en la presente, un "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso en la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los vehículos adecuados se describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia convencional en el campo, que se incorpora en la presente como referencia. Los ejemplos preferidos de estos vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a agua, disolución salina, disoluciones de Finger, disolución de dextrosa, y albúmina de suero humana al 5%. También pueden utilizarse liposomas y vehículos no acuosos, tales como aceites no volátiles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocido en la técnica. Excepto en el caso de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. Otros compuestos activos también pueden incorporarse en las composiciones.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la vía parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, transdérmica (es decir, tópica) y transmucósica, u oral (por ejemplo, inhalación), administración rectal. Las disoluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril, tal como agua para inyección, disolución salina, aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes, tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos; y agentes para ajustar la tonicidad, tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple fabricados de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles (cuando sean solubles en agua) y polvos estériles para la preparación improvisada de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen disolución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ), glucosa o disolución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que sea puede inyectarse con facilidad. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y conservación, y debe protegerse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo debe ser un disolvente o un medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y sus mezclas adecuadas.

La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio, en la composición. Puede lograrse una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las composiciones orales contienen, en general, un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el objetivo de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. También pueden prepararse composiciones orales utilizando un vehículo fluido, para su uso como colutorio, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral, se enjuaga dentro de la boca y se expectora o se traga. Pueden incluirse agentes ligantes y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un ligante, tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal como almidón o lactosa; un agente disgregante, tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante, tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante, tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante, tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja. Para la administración mediante inhalación, los compuestos se administran en forma de un pulverizado en aerosol a partir de un recipiente o dispensador presurizado que contenga un propelente adecuado, por ejemplo, un gas, tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede realizarse por medios transmucósicos o transdérmicos. Para la administración transmucósica o transdérmica se emplean en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear. Estos penetrantes son conocidos en general en la técnica e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucósica, detergentes, sales biliares, y derivados del ácido fusídico. La administración transmucósica puede lograrse mediante el uso de pulverizados nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles o cremas, como se conoce en general en la técnica.

Las composiciones también pueden prepararse en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.

En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegen al compuesto frente a la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica.

En algunas realizaciones se formulan composiciones orales o parenterales en forma de dosificaciones unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. Una forma de dosificación unitaria, tal como se emplea en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención viene dictada y depende directamente de las características exclusivas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se va a lograr, y de las limitaciones inherentes en la técnica de formación de compuestos con este tipo de compuestos activos para el tratamiento de individuos.

Si se desea pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el compuesto activo, estando dichas matrices en forma de artículos con forma, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EEUU nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como LUPRON DEPOT (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico).

Como ejemplos, las dosificaciones orales de los polipéptidos quiméricos de la invención, cuando se usan para los efectos indicados, estarán entre aproximadamente 0,05 y 1.000 mg/día por la vía oral, y preferiblemente estarán en forma de comprimidos que contienen 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 y 1.000 mg de ingrediente activo. Los niveles plasmáticos eficaces de los vectores o transportadores cargados con al menos una sustancia de interés variarán de 0,002 mg a 50 mg por kilogramo de peso corporal y por día.

Los polipéptidos quiméricos o los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos quiméricos de la invención pueden administrarse en forma de dosis diarias únicas, o la dosis diaria total puede administrarse en dos, tres o cuatro dosis diarias.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, un kit, un paquete o un dispensador, junto con instrucciones para su administración.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención pueden insertarse en vectores y utilizarse como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden administrarse a un sujeto, por ejemplo mediante inyección intravenosa, administración local (véase, por ejemplo, la patente de EEUU nº 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (véase, por ejemplo, Chen, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 :3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se embebe el vehículo de transporte de genes. Como alternativa, cuando el vector de transporte de genes completo pueda producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovíricos, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que produzcan el sistema de transporte de genes.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que contengan un ácido nucleico que codifique un polipéptido condensado de la invención, o sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos. Tal como se emplea en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario lineal o circular en el que pueden acoplarse otros segmentos de ADN. Otro tipo de vector es un vector vírico, en el que pueden acoplarse otros segmentos de ADN o ARN en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula hospedante en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tengan un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos; vectores de levadura). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula hospedante tras su introducción en la célula hospedante y, por tanto, se replican junto con el genoma del hospedante.

Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los cuales están operativamente unidos. Estos vectores se denominan en la presente "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante a menudo tienen forma de plásmidos. En la presente solicitud, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse de modo intercambiable, puesto que el plásmido es la forma de vector que se emplea más habitualmente. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus con replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que tengan funciones equivalentes. Además, algunos vectores víricos son capaces de dirigirse a un tipo celular particular de modo específico o no específico.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en la célula hospedante, lo cual significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedantes que se van a utilizar para la expresión, que está unido operablemente a la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, "unido operablemente" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permita la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedante cuando el vector se introduce en la célula hospedante). La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Estas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:
METHODS IN ENZYMOLOGY, 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedantes y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células hospedantes (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores, tales como la elección de la célula hospedante que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedantes para producir con ello proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por los ácidos nucleicos descritos en la presente (por ejemplo, polipéptidos quiméricos, formas mutantes del polipéptido quimérico, proteínas de fusión, etc.).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para la expresión del polipéptido quimérico en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los polipéptidos quiméricos pueden expresarse en células bacterianas, tales como E. coli, células de insecto (utilizando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura, células vegetales o células de mamífero. Las células hospedantes adecuadas se analizan más a fondo en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY, 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, utilizando las secuencias reguladoras del promotor T7 y la T7 polimerasa. La expresión de proteínas en procariotas a menudo se realiza en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión o de no fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a una proteína codificada en ellos, normalmente en el amino terminal de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión de forma típica cumplen tres propósitos: (1) aumentar la expresión de la proteína recombinante; (2) aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y (3) ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como ligando en una purificación por afinidad. A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio de ruptura proteolítica en la unión del dominio de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del dominio de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Estas enzimas y sus secuencias de reconocimiento cognadas incluyen el factor Xa, la trombina y la enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc.; Smith y Johnson, Gene, 67: 31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.), que condensan la glutatión S-transferasa (GST), la proteína de unión a maltosa E, o la proteína A, respectivamente, con la proteína recombinante diana.

Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli de no fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amrann et al., Gene, 69: 301-315 (1988)) y pET 1ld (Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY, 185, Academic Press, San Diego, Calif. 60-89 (1990)).

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes en E. coli es expresar la proteína en una bacteria hospedante con una capacidad deteriorada para romper proteolíticamente la proteína recombinante. Véase, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY, 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990), 119-128. Otra estrategia es alterar la secuencia del ácido nucleico que se va a insertar en un vector de expresión, de modo que los codones individuales para cada aminoácido son los que se emplean de manera preferente en E. coli (Wada et al., Nucleic Acids Res., 20: 2111-2118 (1992)). Esta alteración de secuencias de ácidos nucleicos de la invención puede realizarse mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales.

En otra realización, el vector de expresión de polipéptidos quiméricos es un vector de expresión de levaduras. Los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae son muy conocidos en la técnica.

Como alternativa, el polipéptido quimérico puede expresarse en células de insecto utilizando vectores de expresión de baculovirus.

En otra realización, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de expresión de mamíferos. Cuando se emplea en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión a menudo son proporcionados por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, los promotores que se emplean habitualmente derivan de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados para células procariotas y eucariotas, véase, por ejemplo, los capítulos 16 y 17 de Sambrook et al.,
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).

En otra realización, el vector de expresión de mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico de manera preferente en un tipo celular particular (por ejemplo, se emplean elementos reguladores específicos de tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido son conocidos en la
técnica.

Otro aspecto de la invención se refiere a células hospedante en las que se ha introducido un vector de expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula hospedante" y "célula hospedante recombinante" se emplean de modo intercambiable en la presente. Se entiende que estos términos se refieren no sólo a la célula sujeto particular sino también a la progenie o a la progenie potencial de dicha célula.

Debido a que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o a influencias del entorno, esta progenie puede de hecho no ser idéntica a la célula de origen, pero se incluye en el alcance del término tal como se emplea en la presente. Además, las células hospedantes pueden modularse una vez que expresen el polipéptido quimérico, y pueden mantener o perder sus características originales.

Una célula hospedante puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, el polipéptido quimérico puede expresarse en células bacterianas, tales como E. coli, células de insecto, células de levadura o de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Como alternativa, una célula hospedante puede ser una célula de mamífero prematura, es decir, una célula pluripotencial. Una célula hospedante también puede derivarse de otro tejido humano. Otras células hospedantes adecuadas son conocidas en la técnica.

El ADN del vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas a través de técnicas de transformación, transducción, infección o transfección convencionales. Tal como se emplean en la presente, los términos "transformación", "transducción", "infección" y "transfección" pretenden indicar una diversidad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir un ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN) en una célula hospedante, incluyendo la coprecipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrano, la lipofección o la electroporación. Además, la transfección puede ser mediada por un agente de transfección. Un "agente de transfección" pretende incluir cualquier compuesto que medie en la incorporación de ADN en la célula hospedante, por ejemplo, un liposoma. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedantes pueden encontrarse en Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), y otros manuales de laboratorio.

La transfección puede ser "estable" (es decir, la integración del ADN extraño en el genoma del hospedante) o "transitoria" (es decir, el ADN se expresa episómicamente en las células hospedantes).

Para la transfección estable de células de mamífero se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la técnica de transfección utilizados, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma, quedando el resto del ADN episómico. Para identificar y seleccionar estos integrantes, en general se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, la resistencia a antibióticos) en las células hospedantes, junto con el gen de interés. Diversos marcadores seleccionables incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede introducirse en una célula hospedante sobre el mismo vector que el ácido nucleico codificador, o puede introducirse sobre un vector distinto. Las células transfectadas de modo estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección de fármacos (por ejemplo, las células que tengan incorporado el gen del marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células morirán).

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra la inmunodetección de la proteína RAS-p21 en extractos celulares MCF7-RAS utilizando el anticuerpo Y13259, DPV3-Y13259 o un anticuerpo IgG de rata no específico, como anticuerpos primarios, y un anticuerpo anti-rata-HRP como anticuerpo secundario para la inmunodetección. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.

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La figura 2 muestra el transporte intracelular de Y13259 solo o conjugado con DPV3 o DPV15b. Se incubaron células de cáncer humano HCT 116 con 50 \mug/ml del anticuerpo DPV3-Y13259, DPV15b-Y13259 o Y13259 durante 4 horas a 37ºC y después se fijaron en metanol/acetona antes de la tinción de inmunofluorescencia. La inmunotinción del anticuerpo Y13259 se realizó utilizando un anticuerpo anti-rata-TRITC. (a) Células no tratadas (como control negativo), (b) células tratadas con Y13259, (c) con DPV3-Y13259 o (d) con DPV15b-Y13259; una tinción DAPI (e, f, g, h) muestra núcleos para cada una de las citadas condiciones.

La figura 3 muestra experimentos de inmunoprecipitación realizados en células MCF7-RAS que demuestran el transporte intracelular del anticuerpo Y13259 activo por DPV3. Las células se incubaron con 50 \mug/ml de IgG de rata como anticuerpo no específico, Y13259 o DPV3-Y13259 durante 4 horas a 37ºC. Los lisados de proteína totales se inmunoprecipitaron con proteína G-Sepharose, se cargaron en una SDS-PAGE y se inmunotranfirieron con el anticuerpo pan RAS. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.

La figura 4 muestra el efecto inhibidor de DPV3-Y13259 sobre la proliferación de células HCT 116 K-RAS^{mt}. Las células se incubaron durante 120 horas con el anticuerpo solo (Y13259, 700 nM) o con el conjugado de DPV3-Y13259 (700 nM), con DPV3-maleimida como control interno (DPV3-mal, 700 nM). Se emplearon inmunoglobulinas anti-peroxidasa IgG1 no relevantes (IgG PO, 700 nM) y un inhibidor de la RAS farnesiltransferasa (FTI-276, 100 nM) como controles internos. Los resultados se expresan como la media \pm EEM de tres experimentos independientes realizados por duplicado. * p < 0,05 frente a células no tratadas.

La figura 5 muestra la carencia de efecto de DPV3-Y13259 sobre la proliferación de células HT-29 RAS de tipo salvaje. Las células se incubaron durante 72 horas con el anticuerpo solo (Y13259, 700 nM) o conjugado con DPV3 (conjugado de DPV3-Y13259, 700 nM), con DPV3-maleimida como control interno (700 nM). Los resultados se expresan como la media \pm EEM de dos experimentos independientes realizados por duplicado.

La figura 6 demuestra que DVP3-Y13259 puede potenciar la apoptosis inducida por Taxol® en células HCT 116 (RAS activada) pero no en células HT-29 (RAS de tipo salvaje). Las células se expusieron a concentraciones crecientes de Taxol® durante 4 horas, seguido de la retirada del medio y de una incubación durante 72 horas más; el DPV3-Y13259 se combinó con Taxol® siguiendo diferentes protocolos. (A) Las células HCT 116 se incubaron con Taxol® durante 4 horas antes de añadir DPV3-Y13259 durante 72 horas más. (B) Se añadió DPV3-Y13259 a las células HCT 116 cultivadas 24 horas antes de una corta incubación con Taxol® (4 horas). El medio se retiró y las células se volvieron a incubar con DPV3-Y13259. No se observó efecto cuando HCT 116 se incubaron con DPV3-Y13259 y Taxol® durante 4 horas (C), así como cuando las células HT-29 RAS de tipo salvaje se trataron con Taxol® durante 4 horas, seguido de la retirada del medio y de una incubación durante 72 horas más (D). Los datos muestran la media \pm EEM de 3 experimentos independientes.

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Ejemplos

Otras ventajas y características de la invención surgirán de los siguientes ejemplos que hacen referencia a las anteriores figuras. Los ejemplos se ofrecen para ilustrar la invención pero no limitan el alcance de las reivindicaciones.

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I- Materiales y métodos I-1 Productos

- Y13259: el anticuerpo monoclonal de rata anti-RAS (isotipo IgG1; Hamer et al., Hybridoma, 9, 573-587 (1990)) se obtuvo a partir de la producción de clones de hibridoma Y13259 (Serotec) (linfocitos B; ATCC nº CRL-1742). PM = 150 kDa.

- IgG de rata normal (Santa Cruz, nº sc-2026): se emplea como control negativo para aplicaciones de transferencia Western e inmunoprecipitación.

- Péptidos que penetran en células:

\bullet

DPV3 (SEQ ID NO:2) que contiene además una cisteína (Cys) en la posición C-terminal de la secuencia de aminoácidos,

\bullet

DPV15b (SEQ ID NO:12) que contiene además una cisteína (Cys) en la posición N-terminal de la secuencia de aminoácidos.

- DPV3-Y13259 y DPV15b-Y13259: las conjugaciones del péptido que penetra en células DPV3 o del péptido que penetra en células DPV15b a Y13259 se realizaron de modo químico (véase el ejemplo I-3-a). Se unieron entre dos y tres péptidos que penetran en células por IgG. PM = 150 kDa.

- DPV3-maleimida y DPV15b-maleimida: un grupo maleimida se ha conjugado con la cisteína terminal de DPV3 y DPV15b.

- FTI-276 (Calbiochem, nº 344550): un peptidomimético selectivo y muy potente del carboxilo terminal de proteínas RAS. Inhibidor de la farnesiltransferasa (FTasa) in vitro (PM = 433,6). Se ha demostrado que bloquea el crecimiento de un carcinoma de pulmón humano que expresa K-RAS en ratones atímicos.

- Anticuerpo pan RAS IgG2b monoclonal de ratón (clon F132 de Santa Cruz, nº sc-32): reconoce todas las formas de RAS mutadas. Se emplea para el estudio de inmunoprecipitación.

- IgG anti-rata de burro purificado por afinidad conjugado con rodamina (TRITC) (TEBU, nº 712-025-150): se emplea para la inmunocitoquímica.

- IgG anti-rata purificado por afinidad conjugado con peroxidasa (TEBU, nº 612-1302): utilizado para la inmunodetección mediante transferencia Western y como control negativo para los ensayos de viabilidad celular.

- Proteína G-Sepharose (Amersham, nº 17061801): para aplicaciones de inmunoprecipitación.

- Taxol®/paclitaxel (Hauser-Lab): PM = 853,92 g/mol. Disolución madre en Cremophore al 20%, conservado a temperatura ambiente.

I-2 Líneas celulares

- HCT 116: células epiteliales de carcinoma de colon humano, expresan Ki-RAS mutada. Origen: ATCC, nº CRL-247. Las células se cultivaron en medio 5a de Mc Coy + L-glutamina 1,5 mM + FCS al 10%.

- MCF7-RAS: células epiteliales de carcinoma de mama humano, transfectadas con v-H-RAS. Origen: G. Perret (Bobigny, Francia). Las células se cultivaron en DMEM + FCS al 10% + L-glutamina 1,5 mM.

- HT-29: células epiteliales humanas de adenocarcinoma de colon humano, expresan RAS de tipo salvaje. Origen: ATCC, nº HTB-38. Las células se cultivaron en medio 5a de Mc Coy + FCS al 10% + L-glutamina 1,5 mM.

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I-3-a Conjugación química de CPP al anticuerpo

Se empleó una estrategia de conjugación en dos etapas para la conjugación química de un CPP (por ejemplo, DPV3 y DPV15b) a un anticuerpo. La primera etapa fue la activación del anticuerpo con el reactivo de entrecruzamiento heterobifuncional 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC). Este conector heterobifuncional reacciona con la amina de la lisina disponibles del anticuerpo. Después de la eliminación del exceso de reactivo de entrecruzamiento mediante diafiltración (Visapin®, límite de exclusión 3000 daltons) se añadió entonces el CPP, y su función tiol (cisteína N- o C-terminal) reacciona con el resto maleimida del SMCC. Los conjugados entrecruzados se analizaron mediante SDS-PAGE (al 12%)-tinción con azul de Coomassie R-250 y MALDI-TOF.

Los ejemplos de acoplamiento entre un CPP y un anticuerpo pueden encontrarse en las solicitudes de patente PCT nº WO 01/64738 y WO 05/016960.

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I-3-b Conjugación química de CPP con maleimida

Se empleó una estrategia de conjugación en una etapa para la conjugación química de la maleimida al CPP, para generar un CPP control (por ejemplo, DPV3-maleimida y DPV15b-maleimida). Esta conjugación se realizó en DMF con un exceso de maleimida y enmascara las funciones tiol accesibles sobre el CPP. Después de 30 min de incubación, el exceso de maleimida se retiró mediante 3 extracciones con agua/diclorometano. El conjugado (en la capa acuosa) después se liofilizó.

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I-4 Análisis de la transferencia Western

Se cargaron proteínas (50 \mug de los lisados celulares totales en tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasas) sobre una SDS-PAGE según Laemmli, y se electrotransfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. Las proteínas inmunorreactivas se detectaron después de una inmunotransferencia con anticuerpos Y13259 o DPV3-Y13259 (50 \mug/ml).

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I-5 Inmunoprecipitación

Las células se incubaron con 50 \mug/ml de IgG de rata normal (control negativo) o Y13259 no conjugado, o conjugado de DPV3-Y13259 durante 4 horas a 37ºC, después se tripsinizó (para eliminar el material unido a la superficie celular), se lisó, se incubó con proteína G-Sepharose, se trasladó a una membrana de PVDF (poli(difluoruro de vinilideno)) y se transfirió con pan-RAS monoclonal de ratón.

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I-6 Estudios de internalización in vitro

Las células en medio de cultivo completo se incubaron durante 4 horas a 37ºC con conjugados de CPP-Y13259 o anticuerpo Y-13259 no conjugado a 50 \mug/ml, después se enjuagó en tampón fosfato y se fijó en metanol/acetona durante 5 min, y se permeabilizó en tampón fosfato que contenía Triton X100 al 0,25% y BSA al 1%. Las células se marcaron con anticuerpo anti-rata-TRITC y se contratiñeron con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol). Las células se montaron en disolución anti-pérdida de señal clara SlowFade con DAPI y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia.

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I-7 Eficacia in vitro sobre líneas de células de carcinoma humanas

Se sembraron HCT 116 y HT-29 a 8 x 10^{3} células/pocillo (placas de 96 pocillos) en medio + FCS (suero de ternera fetal) al 0,5% y al 10%, respectivamente. Al día siguiente, las células se trataron con concentraciones crecientes de compuestos de ensayo en medio completo (+ FCS al 10%), y las células se contaron a lo largo del tiempo a las 24 h, 48 h, 72 h y 120 h utilizando el método WST-1, descrito a continuación. El medio se retiró y se añadieron 100 \mul de medio fresco sin FCS suplementado con disolución de WST-1 al 10% sobre las células durante 2 h a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se realizaron las mediciones de A_{450 nm}-A_{690 \ nm} (blanco = 0 células) para determinar los números celulares.

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I-8 Ensayos de viabilidad

Se realizaron ensayos de viabilidad sobre células adherentes como sigue: se sembraron células en placas de 96 pocillos 24 horas antes del tratamiento. Para definir el mejor programa para la combinación de dos fármacos, se ensayó una exposición simultánea o secuencial. Según los efectos biológicos esperados y los datos de eficacia clínica, toxicidad y farmacodinámica que ya estaban disponibles, se utilizó un tiempo de exposición corto para Taxol® y un tiempo de exposición largo para DVP3-Y13259, en 4 programas de combinación diferentes, como se describe a continuación.

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Protocolo nº 1: Programa secuencial

Las células se expusieron a Taxol® o vehículo durante 4 h, se lavaron y posteriormente se incubaron en medio que contenía DPV3-Y13259 durante 72 h.

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Protocolo nº 2: Programa secuencial inverso

Las células se trataron con DPV3-Y13259 o vehículo durante 24 h. Después, las células se expusieron a Taxol® durante 4 h y después se lavaron, seguido de un tratamiento con DPV3-Y13259 continuado hasta 72 h.

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Protocolo nº 3: Combinación continua, tiempo corto

Las células se colocaron en un medio que contenía Taxol® y DPV3-Y13259 o vehículo, y se incubaron durante 4 h, exponiendo a las células a ambos agentes de modo continuo.

Las células se trataron según los diferentes protocolos. Entonces se analizó la viabilidad celular utilizando el ensayo WST-1 y se estimaron los valores de IC_{50} (concentración molar que inhibe 50% de la viabilidad celular) a partir de la regresión sigmoidal, utilizando el programa informático Graph Pad Prism 3.02.

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I-9 Análisis estadístico

Los datos se muestran como la media \pm error estándar de la media (EEM) de n observaciones diferenciadas. Las comparaciones estadísticas se analizaron mediante ANOVA, seguido de un ensayo post hoc de Tukey. En todos los casos, un valor umbral de p < 0,05 se consideró como nivel mínimo de significancia. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa informático Graph Pad Prism 3.02 y CalcuSyn para el análisis del efecto de la dosis.

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I-10 Análisis de los datos para los tratamientos de combinación

Los términos sinergia y antagonismo se emplean con frecuencia de diferentes maneras para describir el efecto de combinar dos o más fármacos en distintas líneas celulares, ratones que portan tumores o en una clínica. En experimentos de cultivos celulares, la sinergia y el antagonismo se refieren a una inhibición del crecimiento/citotoxicidad que es mayor o menor que la predicha de una acción de un fármaco independiente, respectivamente. Esto surge cuando un fármaco modula la actividad de un segundo fármaco, por ejemplo, afectando a la captación del fármaco, el metabolismo, la distribución de las fases del ciclo celular, la inhibición de la diana/vía o cambiando el umbral para la apoptosis. La adición es el resultado de dos o más fármacos que actúan independientemente, contribuyendo ambos por igual a la actividad. Diversos modelos matemáticos están disponibles, incluyendo isobologramas, modelos de respuesta de superficie y el análisis del efecto de la mediana de Chou y Talalay. Los efectos de un tratamiento con múltiples fármacos sobre la viabilidad celular se analizan según el método por ordenador de Chou y Talalay (Adv. Enzyme Regul., 22, 27-55 (1984)). El intervalo del índice de combinación (CI) y los símbolos se definen a partir de los descritos previamente por Chou. CI < 1, = 1 y > 1 indican sinergia, efecto aditivo y antagonismo, respectivamente. Véase la tabla 2 a continuación.

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TABLA 2 Símbolos recomendados para describir la sinergia o el antagonismo en estudios de combinación de fármacos analizados con el método del índice de combinación

3

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II- Transporte intracelular de Y13259 utilizando el péptido que penetra en células DPV3 y DPV15b

El objetivo de este estudio es internalizar el anticuerpo anti-RAS Y13259 utilizando un péptido que penetra en células para dirigir, de modo específico, la señalización de la RAS mutada. Se trataron diferentes líneas celulares con Y13259 unido químicamente a un CPP que permite la penetración de la membrana celular para determinar si los conjugados de CPP-anticuerpo anti-RAS pueden bloquear de modo selectivo el crecimiento de células de cáncer transformadas con RAS.

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II-1 Unión de Y13259 a la proteína RAS

Para comprobar que la conjugación de CPP no modifica la afinidad de Y13259 por RAS se realizó un análisis de la transferencia Western con extractos celulares totales procedentes de MCF7-RAS. Se comparó la unión de DPV3-Y13259 a RAS con la del anticuerpo libre. Tal como se muestra en la figura 1, el conjugado de DPV3-Y13259 es capaz de reconocer su RAS diana.

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II-2 Análisis cualitativo de CPP-Y13259

Se incuban DPV3-Y13259 y DPV15b-Y13259 en células HCT 116 durante 4 horas a 37ºC. Tal como se muestra en la figura 2, el DPV3 permite la internalización de IgG en el citoplasma (figura 2c y 2g). Estudios previos han indicado que DPV3 y DPV15b unidos a IgG anti-peroxidasa se localizan en el citoplasma o en el núcleo, respectivamente. Sin embargo, los conjugados de DPV15b-Y13259 también se localizan en el citoplasma (figura 2d y 2h). Estos datos demuestran que la afinidad del anticuerpo anti-RAS por su diana citoplásmica es determinante para el sitio de acumulación del conjugado de CPP.

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II-3 Transporte intracelular de Y13259 por DPV3

La internalización con Y13259, DPV3-Y13259 e IgG de rata se realizó en células MCF7-RAS durante 4 horas; las células se recolectaron con tripsina (esta etapa retira el CPP-anticuerpo unido a la superficie) y se lisa en tampón RIPA para un análisis de RAS mediante transferencia Western. Tal como se muestra en la figura 3, DPV3-Y13259 se internaliza y es capaz de inmunoprecipitar la proteína RAS, mientras que el Y13259 desnudo o la IgG no relevante no pueden, lo cual sugiere que DPV3 permite el transporte intracelular de un anticuerpo activo completo. La unión de DPV3-Y13259 a RAS puede producirse durante la etapa de internalización (lo cual demuestra que el conjugado se fue a la fracción del citosol).

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II-4 Actividad antiproliferativa in vitro

Los conjugados de CPP-Y13259 se ensayaron en un ensayo de proliferación celular en líneas celulares que expresan RAS mutada y RAS de tipo salvaje (HCT 116 y HT-29, respectivamente). FTI-276, un inhibidor de la farnesiltransferasa que inhibe la proliferación celular mediada por RAS, constituye el control positivo. Para HCT 116, las células se trataron con concentraciones crecientes de conjugados de CPP (hasta 700 nM) en medio completo (FCS al 10%) de 0 a 120 h.

Tal como se muestra en la figura 4, FTI-276 inhibe la proliferación de células HCT 116; su efecto dura al menos 120 horas. Tal como sugieren los estudios de internalización e inmunoprecipitación, las IgG de ratas (Y13259 o anti-peroxidasa) no fueron capaces de atravesar la membrana por sí mismas y no pudo detectarse un efecto inhibidor sobre la velocidad de crecimiento. Y13259 y CPP-maleimida no mostraron un efecto inhibidor sobre la proliferación de células HCT 116, mientras que los conjugados de CPP-Y13259 infrarregularon la proliferación celular. Este efecto se observó a las 72 horas después de la exposición al fármaco y duró al menos 120 horas (tiempo máximo ensayado). De manera interesante, el conjugado de Y13259 que está unido a un CP "citoplásmico" (DVP3) (De Coupade et al., Biochem J. (2005)) produjo una mejor inhibición que el unido a un CPP "nuclear" (DPV15b) (De Coupade et al., Biochem J. (2005)) (figura 4). Las concentraciones eficaces para DPV3-Y13259 variaron de 85 a 700 nM, mientras que las concentraciones menores no produjeron efecto (los datos no se muestran).

Se observó una falta de actividad de DPV3-Y13259 en células que expresan RAS de tipo salvaje después de 72 horas de exposición continua (figura 5). Este resultado demuestra la especificidad de acción del anticuerpo transportado. En este experimento no se ensayó DPV15b puesto que es menos activo que DPV3 en el modelo de HCT 116.

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II-5 Conclusión

Este estudio demostró que un péptido que penetra en células (por ejemplo, DPV3 o DPV15) puede transportar intracelularmente un anticuerpo completo (150 kDa) sin alterar sus propiedades bioquímicas (afinidad o localización celular). En términos de actividad biológica, los conjugados de CPP-Y13259 redujeron la velocidad de crecimiento del cáncer de mamífero que implica a células RAS mutadas pero no a sus homólogas (de tipo salvaje). Cuando se conjuga con Y13259, el péptido DPV3, del cual se indica que es un péptido que penetra en células muy eficaz para el transporte citoplásmico de un cargamento, produjo un mayor efecto inhibidor que DPV15b.

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III- Evaluación in vitro de un tratamiento combinado de DPV3-Y13259 y Taxol® en una línea celular tumoral en cultivo

El objetivo de este estudio es investigar aún más la influencia de dos entidades, DPV3-Y13259 y Taxol®, por separado y en combinación, sobre la proliferación de células de cáncer. La base para combinar dos o más agentes terapéuticos es lograr dosis menores de fármaco, reducir la toxicidad y minimizar o retrasar la aparición de resistencia por las células diana, e identificar un efecto sinérgico potencial. El objetivo fue investigar 1) el potencial de DPV3-Y13259 para potenciar la citotoxicidad de agentes antitumorales basados en Taxol®, y 2) cuáles son los mejores programas de combinación posibles.

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III-1 Ensayos de viabilidad

La figura 6 presenta los resultados obtenidos con diferentes concentraciones de DPV3-Y13259 en combinación con Taxol®. Tal como se describe en la sección de materiales y métodos, se ensayaron 3 protocolos.

Los datos de viabilidad celular obtenidos en presencia de Taxol® indican que un tratamiento combinado con DPV3-Y13259 induce una disminución dependiente de la dosis en la viabilidad de células HCT 116 para los protocolos 1 y 2 (figuras 6A y 6B). Se sabe que Taxol® rompe el equilibrio entre la tubulina fresca y los microtúbulos, provocando la estabilización de microtúbulos en el citoplasma. Por tanto, un tratamiento con Taxol® antes de una incubación con DPV3-Y13259 puede afectar a la endocitosis del conjugado de CPP. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre el protocolo 1 y 2. No se observó efecto de DPV3-Y13259 sobre la citotoxicidad de Taxol® para el protocolo 3 (figura 6C). Esta falta de efecto puede ser debida al corto tiempo de incubación con DPV3-Y13259.

Tal como se esperaba, no se observo efecto de DPV3-Y13259 sobre la proliferación de células HT-29, que expresan la proteína RAS de tipo salvaje, con el protocolo 1 (figura 6D).

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III-2 Análisis de los efectos de múltiples fármacos

Se empleó el análisis del efecto de múltiples fármacos de Chou y Talalay, que se basa en el principio del efecto de la mediana (Chou y Talalay, Adv. Enzyme Regul., 22: p. 27-55 (1984); Chou et al., J. Natl. Cancer Inst., 86(20): p. 1517-1524 (1994)) para estudiar la naturaleza de la interacción observada entre DPV3-Y13259 y Taxol®. Para determinar si el efecto aumentado sobre la viabilidad celular observado después de un tratamiento combinatorio de células HCT 116 con DPV3-Y13259 y Taxol®, en comparación con un tratamiento separado, se corresponde con efectos aditivos o sinérgicos, se realizó un análisis detallado de los efectos de múltiples fármacos según el método de Chou y Talalay. Los parámetros del efecto de la dosis CI calculados se ofrecen en la tabla 3 a continuación.

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TABLA 3 Valores experimentales para CI mutuamente no excluyentes. Parámetros de relación entre dosis-efecto para Taxol® y DPV3-Y13259 en células de cáncer de pulmón HCT 116. CI < 1, = 1 y > 1 indican sinergia, efecto aditivo o antagonismo, respectivamente

4

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Según el análisis de Chou y Talalay, DPV3-Y13259 y Taxol® sinergizan para inducir una menor viabilidad celular en células HCT 116. El efecto sinérgico es especialmente notable a dosificaciones bajas de Taxol®, y es independiente del programa de tratamiento. El índice de combinación es entre 0,1 y 0,85 para la concentración más baja de Taxol®. Para la concentración más fuerte de Taxol®, mayor que 1,2 \muM, el índice de combinación es mayor que 1 con el protocolo 2. El efecto sinérgico es notable a una concentración menor de Taxol® (< 1,2 \muM), en especial con el protocolo 2.

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III-3 Conclusión

DPV3-Y13259 combinado con Taxol® induce citotoxicidad de una manera sinérgica en células de cáncer de colon. Transferido a los estudios in vivo, la combinación de DPV3-Y13259 con Taxol® puede permitir una reducción en la dosis de Taxol®. En resumen, estos datos demuestran que DPV3-Y13259 puede combinarse de manera provechosa con otros fármacos citotóxicos, tales como paclitaxel.

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IV- Evaluación de la actividad antitumoral de DPV3-Y13259 en combinación con paclitaxel en un modelo de xenoinjerto de carcinoma de colon HCT 116: estudio propuesto

El objetivo de este estudio propuesto es ensayar la eficacia de DPV3-Y13259 en combinación con una dosis subóptima de paclitaxel en el modelo de xenoinjerto de carcinoma de colon HCT 116 en ratones atímicos. Los expertos en la técnica pueden determinar con facilidad la dosis subóptima de paclitaxel. El solicitante ha descubierto que era de 5 mg/kg tras un programa de administración de Q7D1x3W (administración intravenosa).

Agentes terapéuticos: Y13259, DPVW-Y13259 y paclitaxel (PTX).

Animales: raza de ratones atímicos nu/nu NMRI-nude.

Modelo tumoral: el modelo de carcinoma de colon HCT 116 puede seleccionarse porque esta línea celular expresa una forma activada constitutiva del oncogén ras: K-ras.

Inducción del tumor: las células se descongelan en un matraz de 75 cm^{2} y se amplifican. Después de la amplificación, las células se suspenden en medio DMEM (1 x 10^{7} células/100 \mul). Los tumores HCT 116 se establecen mediante la inyección intradérmica de 100 \mul de la suspensión celular en el flanco derecho de ratones utilizando jeringas Terumo de 1 ml con agujas 26G1/2-0,45 x 12 mm (Polylabo) siguiendo el procedimiento FD 31/10/01 V1.

Disoluciones de DPV3-Y13259, Y13259 y paclitaxel: el conjugado de DPV3-Y13259 e Y13259 solo se diluyen en PBS, NaCl 0,3 M, para administrar la dosis adecuada. Se diluyó paclitaxel de calidad clínica en NaCl al 0,9% para administrar la dosis adecuada.

Los ratones se trataron mediante una inyección intravenosa en embolada, siguiendo un programa Q3D2x3W (2 inyecciones semanales durante 3 semanas) o Q7D1x3W (1 inyección semanal durante 3 semanas). Las inyecciones se realizan cuando los tumores alcanzan un tamaño de aproximadamente 100 mm^{3}. Las dosis de DPV3-Y13259 se expresan en mg equivalentes de Y13259 por kg. Los grupos son:

5

Análisis de los datos

Se controla el peso corporal, el volumen tumoral y los parámetros de supervivencia 3 veces a la semana. Los volúmenes tumorales se determinan a partir de mediciones con calibrador, [longitud x (anchura)^{2}/2]. Cada ratón individual se sacrifica cuando su tumor alcanza aproximadamente 1500 mm^{3} o si el animal muestra señales de sentir dolor, tales como encorvamiento, convulsiones, pérdida del 25% de peso corporal durante 2 mediciones consecutivas, o pérdida del 30% de peso corporal en una medición. Todos estos parámetros se indican. La mortalidad de los animales se registra cada día excepto en fin de semana.

El valor tratado/control (T/C) es la proporción entre el volumen medio tumoral de los animales tratados y el volumen medio tumoral de animales control, expresado como porcentaje.

El análisis estadístico del crecimiento tumoral y los parámetros de supervivencia (ensayos de Dunnett y LogRank, respectivamente) se evalúan cada semana utilizando el programa informático GraphPad prism 3.02.

<110> DIATOS S.A.

\hskip1cm

DE COUPADE, Catherine

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<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA SUMINISTRAR ANTICUERPOS ANTI-RAS ACTIVADA

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<130> 46408/PCT

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<140> PCT/IB2007/001546

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<141> 2007-06-08

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<150> EP 06290952.8

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<151> 2006-06-12

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<160> 48

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<170> PatentIn version 3.3

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<210> 1

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 1

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 2

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<223> péptido que penetra en células

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<223> péptido que penetra en células

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<223> péptido que penetra en células

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<223> péptido que penetra en células

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<223> péptido que penetra en células

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<223> péptido que penetra en células

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> péptido que penetra en células

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\hskip1cm

23

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<210> 19

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\hskip1cm

24

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<210> 20

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<211> 30

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\hskip1cm

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\hskip1cm

26

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<210> 22

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\hskip1cm

27

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<210> 23

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

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28

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<210> 24

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\hskip1cm

29

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<210> 25

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\hskip1cm

30

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<210> 26

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\hskip1cm

31

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<210> 27

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\hskip1cm

32

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<210> 28

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\hskip1cm

33

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<210> 29

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\hskip1cm

34

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<210> 30

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

35

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<210> 31

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 31

\hskip1cm

36

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<210> 32

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 32

\hskip1cm

37

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<210> 33

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 33

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38

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<210> 34

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 34

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39

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<210> 35

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 35

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40

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<210> 36

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 36

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41

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<210> 37

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 37

\hskip1cm

42

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<210> 38

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 38

\hskip1cm

43

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<210> 39

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 39

\hskip1cm

44

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<210> 40

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 40

\hskip1cm

45

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<210> 41

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 41

\hskip1cm

46

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<210> 42

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 42

\hskip1cm

47

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<210> 43

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 43

\hskip1cm

48

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<210> 44

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 44

\hskip1cm

49

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<210> 45

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 45

\hskip1cm

50

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<210> 46

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 46

\hskip1cm

51

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<210> 47

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<211> 34

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 47

\hskip1cm

52

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<210> 48

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<211> 26

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<212> PRT

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<213> Artificial

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<220>

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<223> péptido que penetra en células

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<400> 48

\hskip1cm

53

Claims (19)

1. Un polipéptido quimérico que se caracteriza porque dicho polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio, en los que:

- el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica mediante la unión a un glicosaminoglicano que se selecciona del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e) (BXmBB)n; f) (BmXX)n; o g) un fragmento de anticuerpo, en el que cada B es independientemente un aminoácido básico, preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo; cada m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es independientemente un número entero entre cero y cinco; y

- el segundo dominio comprende un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado, que se une de modo específico a un epitopo sobre la proteína RAS activada.

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2. El polipéptido quimérico según la reivindicación 1, en el que el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica, que tiene una longitud de más de 4 aminoácidos, preferiblemente más de 6 aminoácidos, y lo más preferiblemente más de 13 aminoácidos.

3. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica, que tiene una longitud menor que 500 aminoácidos, preferiblemente menor que 35 aminoácidos, y lo más preferiblemente menor que 25 aminoácidos.

4. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada X es independientemente alanina, ácido glutámico, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, triptófano, valina, tirosina o citrulina.

5. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12.

6. El polipéptido quimérico según la reivindicación 1, en el que el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos (BmXX)n, en la que B es cualquier aminoácido básico, X es cualquier aminoácido no básico, cada m es independientemente un número entero entre 1 y 10, y cada n es independientemente un número entero entre 1 y 4.

7. El polipéptido quimérico según la reivindicación 6, en el que el primer dominio comprende la secuencia de aminoácidos BBBBBBXXBBBBBBXX, en la que B es independientemente un aminoácido básico, y X es independientemente un aminoácido no básico.

8. El polipéptido quimérico según la reivindicación 7, en el que X se selecciona del grupo que comprende ácido glutámico y serina.

9. El polipéptido quimérico según la reivindicación 8, en el que el primer dominio comprende SEQ ID NO:2.

10. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado tienen la capacidad de unirse a una proteína RAS activada, dando como resultado la inhibición de la actividad biológica de dicha proteína RAS activada.

11. El polipéptido quimérico según la reivindicación 10, en el que el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo monoclonal de rata Y13259 (producido mediante el clon de hibridoma originado de ATCC, nº CRL-1742), sus fragmentos y sus derivados.

12. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína RAS activada se selecciona del grupo que comprende H-RAS, N-RAS, K-RAS A y K-RAS B.

13. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado se conjuga en el N- o C-terminal del primer dominio.

14. El polipéptido quimérico según la reivindicación 13, en el que el anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado se conjuga con el primer dominio a través de un conector.

15. El polipéptido quimérico según la reivindicación 14, en el que el conector es 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) o N-maleimidobutilamina.

16. El polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que ambos dominios se condensan mediante modificación genética.

17. Un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido según la reivindicación 16.

18. Una composición que comprende un polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o un polinucleótido según la reivindicación 17, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

19. Un uso de un polipéptido quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o un polinucleótido según la reivindicación 17, para la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.