ES2352321T3 - Composiciones y métodos para suministrar anticuerpos anti-ras activada en células. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido quimérico que se caracteriza porque dicho polipéptido comprende un primer dominio y un segundo dominio, en los que: - el primer dominio comprende una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una membrana biológica mediante la unión a un glicosaminoglicano que se selecciona del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e) (BXmBB)n; f) (BmXX)n; o g) un fragmento de anticuerpo, en el que cada B es independientemente un aminoácido básico, preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo; cada m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es independientemente un número entero entre cero y cinco; y - el segundo dominio comprende un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su derivado, que se une de modo específico a un epitopo sobre la proteína RAS activada.
Description
Composiciones y métodos para suministrar
anticuerpos anti-RAS activada en células.
Esta invención se refiere, en general, a
composiciones y métodos para tratar enfermedades proliferativas,
tales como cánceres y, más en concreto, a composiciones que
comprenden un anticuerpo conjugado con un péptido que penetra en
células.
Las proteínas RAS son proteínas G prototípicas
que han demostrado desempeñar un papel clave en la transducción de
señales, la proliferación y la transformación maligna. La proteína
RAS-21 activada (oncogénica) se ha implicado, como
factor causativo principal, en una alta proporción de tumores
sólidos humanos. Se han detectado genes ras mutados en un
gran número de cánceres, que comprenden el adenocarcinoma de
páncreas (90%), de colon (50%) y de pulmón (30%). La inhibición de
la expresión del oncogén Ki-ras en líneas celulares tumorales
humanas provoca la regresión completa en modelos animales
((Shirasawa et al., Science, 260, 85-88
(1993)). Por consiguiente, la vía de RAS es una diana atractiva
para estrategias terapéuticas (Downward, Nat. Rev. Cancer.,
3(1), 11-22 (2003)).
Los anticuerpos son extremadamente específicos,
a veces mucho más específicos que los fármacos de molécula pequeña,
y no son inherentemente tóxicos. El análisis de unión a antígenos
puede presentar afinidades (K_{D}) cercanas al registro nanomolar
bajo, según se mide mediante una ELISA de unión. Esta especificidad
hace que la tecnología de anticuerpos monoclonales sea valiosa para
usos terapéuticos. El anticuerpo monoclonal de rata neutralizante
Y13259 (IgG1) (ATCC nº CRL-1742), que reconoce las
cuatro proteínas RAS-p21 de mamífero mutadas (H, N,
K-4A y K-4B), dificulta enormemente
la reacción de intercambio de nucleótidos entre los nucleótidos de
guanina unidos a p21 y exógenos (Furth et al., J. Virol., 43,
294-304 (1982); Hattori et al., Mol. Cell.
Biol., 7, 1999-2002 (1987)), y ha demostrado que
puede revertir el fenotipo de células NIH 3T3 transformadas con el
gen oncogénico ras después de una microinyección, o produce
la regresión de tumores en ratones atímicos utilizando scFc
anti-RAS y un vector adenovírico (Cochet et
al., Cancer Res. 58, 1170-1176 (1998); Kung
et al., Exp. Cell Res., 162, 363-371
(1986)).
Aunque la proteína RAS-p21
representa una diana terapéutica validada en oncología, las
estrategias de anticuerpos terapéuticos no son posibles porque la
proteína RAS-p21, al igual que muchas dianas
terapéuticas, es una proteína intracelular, y porque los
anticuerpos son incapaces de atravesar las membranas celulares o
nucleares para interaccionar con sus antígenos intracelulares. Por
tanto, un objetivo principal de la invención es proporcionar
anticuerpos más eficaces y composiciones farmacéuticas para el
tratamiento del cáncer.
La solicitud de patente PCT nº WO 04/041688
describe moléculas inmunológicas capaces de unirse de modo
específico a una proteína RAS activada dentro de un entorno
intracelular, en las que el anticuerpo comprende un dominio
variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera.
También indica que estas inmunoglobulinas pueden condensarse o
conjugarse con un dominio o una secuencia procedente de una proteína
responsable de la actividad de translocación (mediante esta forma,
la inmunoglobulina es capaz de entrar en la célula o en su núcleo
cuando se introduce en la vecindad de la célula), tales como los
dominios y las secuencias de la proteína transactivante de
VIH-1 (Tat), la proteína del homeodominio de
Antennapedia de Drosophila, y la proteína VP22 del virus del
herpes simplex-1. Para el transporte de anticuerpos
a células también se utiliza el péptido TLM (Oess y Hildt, Gene
Ther., 7, 750-758, (2000)), o una tecnología de
anticuerpos anti-ADN. El uso de un anticuepo con un
único dominio puede tener ciertas limitaciones, incluyendo la
estabilidad en sangre durante los estudios in vivo o una
baja especificidad de antígeno. Esto demuestra la importancia de un
sistema de transporte óptimo que pueda proteger al anticuerpo y
mejorar su biodistribución. Los péptidos de transporte indicados se
originan de proteínas víricas (Tat, VP22, TLM) o de secuencias no
humanas (Antennapedia), y pueden ser tóxicos e inmunogénicos en
seres humanos.
Dentro del marco de investigación que ha
conducido a esta invención, el solicitante ha conjugado el
anticuerpo monoclonal de rata Y13259 (ATCC nº
CRL-1742) a ciertos péptidos que penetran en células
(CPP) para permitir su translocación hacia el interior de las
células.
Esta invención tiene como objetivo,
específicamente, un anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada conjugado con al menos un péptido
que penetra en células (CPP) para mediar una actividad
antiproliferativa. El solicitante ha demostrado que la unión de
péptidos que penetran en células a anticuerpos monoclonales potencia
su eficacia contra células de cáncer.
Según otra realización, el conjugado de
anticuerpo neutralizante anti-RAS
activada-CPP seleccionado de la presente invención
puede utilizarse como composiciones administradas por separado o en
combinación con otros fármacos, tales como fármacos citotóxicos,
citostáticos o inmunoterapéuticos, y más en concreto, ciclosporina,
metotrexato, adriamicina, cisplatino o taxoides (placlitaxel,
doxorrubicina, etc.).
La invención proporciona además un método para
el tratamiento o la prevención de cánceres o adenocarcinomas en un
sujeto, que comprende la administración al sujeto, en una cantidad
eficaz para dicho tratamiento o prevención, de un conjugado de
anticuerpo neutralizante anti-RAS
activada-péptido que penetra en células de la
invención. El conjugado de anticuerpo-CPP utilizado
para el tratamiento puede estar en forma de una composición,
preferiblemente una composición farmacéutica, que comprende dicho
conjugado y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De manera
ventajosa, el anticuerpo es capaz de unirse de modo selectivo a la
proteínas RAS activada intracelular in vitro y/o in
vivo y, por consiguiente, la proteína RAS activada se inactiva
funcionalmente.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
polipéptido quimérico, que se caracteriza porque dicho polipéptido
comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que:
- el primer dominio comprende una secuencia de
aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una
membrana biológica mediante la unión a un glicosaminoglicano que se
selecciona del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b)
(XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e)
(BXmBB)n; f) (BmXX)n; o g) un fragmento de anticuerpo,
en el que cada B es independientemente un aminoácido básico,
preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un
aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo; cada
m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es
independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es
independientemente un número entero entre cero y cinco; y
- el segundo dominio comprende un anticuerpo
neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su
derivado.
Los términos "péptido" y "péptidos" se
refieren a un polímero de aminoácidos para los cuales la convención
escrita es N o amino terminal a la izquierda, y C o carboxilo
terminal a la derecha. Los 20 L-aminoácidos
naturales más comunes se denominan, de forma alternativa, mediante
un código de tres letras o de una letra. Se considera que los
péptidos, tal como se emplean en la presente, incluyen los
"análogos de péptidos", modificaciones estructurales que
contienen una o más modificaciones de las cadenas laterales de los
L-aminoácidos o del esqueleto de
alfa-aminoácidos. Un ejemplo de un análogo de
péptido con esqueleto modificado es el "peptoide" de
N-metilglicina (Zuckermann et al., J. Amer.
Chem. Soc., 114: 10646-10647 (1992)).
Las expresiones "péptido que penetra en
células" o "péptidos que penetran en células" (CPP) se
definen como un péptido vehículo que es capaz de atravesar una
membrana biológica o una membrana fisiológica. Los péptidos que
penetran en células también se denominan péptidos permeables a
células, dominios de transducción de proteínas (PTD) o secuencias
de translocación de membrana (MTS). Los CPP tienen la capacidad de
translocar in vitro y/o in vivo las membranas de
células de mamífero y entrar en las células, y dirigen un compuesto
conjugado de interés, tal como un fármaco o un marcador, a un
destino celular deseado, por ejemplo hacia el citoplasma (citosol,
retículo endoplásmico, aparato de Golgi, etc.) o al núcleo. Por
consiguiente, los CPP pueden dirigir o facilitar la penetración de
un compuesto de interés a través de una membrana fosfolipídica,
mitocondrial, endosómica o nuclear. Los CPP también pueden dirigir
un compuesto de interés desde el exterior de la célula a través de
la membrana plasmática y hacia el citoplasma, o hacia un
emplazamiento deseado dentro de la célula, por ejemplo el núcleo,
un ribosoma, una mitocondria, el retículo endoplásmico, un lisosoma
o un peroxisoma. Como alternativa o además, los CPP pueden dirigir
un compuesto de interés a través de la barrera hematoencefálica,
transmucósica, hematorretiniana, de la piel, gastrointestinal y/o
pulmonar.
La penetración a través de una membrana
biológica o una barrera fisiológica puede determinarse mediante
diversos procesos, por ejemplo mediante un ensayo de penetración
celular que tenga una primera etapa de incubación para el CPP
conjugado con un marcador en presencia de células cultivadas,
seguido de una etapa de fijación, y después un revelado de la
presencia del péptido marcado dentro de la célula. En otra
realización, la etapa de revelado puede realizarse con una
incubación del CPP en presencia de anticuerpos marcados y dirigidos
contra el CPP, seguido de una detección en el citoplasma o en la
proximidad inmediata del núcleo celular, o incluso dentro de él, de
la reacción inmunológica entre la secuencia de aminoácidos del CPP y
los anticuerpos marcados. El revelado también puede realizarse
marcando una secuencia de aminoácidos en el CPP y detectando la
presencia del marcaje en los compartimentos celulares. Los ensayos
de penetración celular son muy conocidos por los expertos en la
técnica. Sin embargo, se describe un ensayo de penetración celular,
por ejemplo, en la solicitud de patente nº WO 97/02840.
Se ha descubierto que varias proteínas y sus
derivados peptídicos poseen propiedades de internalización en
células que incluyen, pero no se limitan a la proteína Tat del virus
de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (VIH-1)
(Ruben et al., J. Virol. 63, 1-8 (1989)), la
proteína VP22 del tegumento del herpes virus (Elliott y O'Hare,
Cell, 88, 223-233 (1997)), la porción homeótica de
Antennapedia de Drosophila melanogaster (el CPP se denomina
penetratina) (Derossi et al., J. Biol. Chem., 271,
18188-18193 (1996)), el péptido antimicrobiano de
protegrina 1 (PG-1) SynB (Kokryakov et al.,
FEBS Lett., 327, 231-236 (1993)), y el factor del
crecimiento de fibroblastos básico (Jans, Faseb J., 8,
841-847 (1994)). Se ha descubierto que otra serie de
proteínas distintas y sus derivados peptídicos poseen propiedades
de internalización en células similares. Los péptidos vehículo que
se han derivado de estas proteínas muestran poca homología de
secuencia entre sí, pero todos son muy catiónicos y richos en
arginina o lisina. En efecto, se ha demostrado que los péptidos de
poliarginina sintéticos se internalizan con un alto nivel de
eficacia (Futaki et al., J. Mol. Recognit., 16,
260-264 (2003); Suzuki et al., J. Biol. Chem.
(2001)).
Los CPP pueden tener cualquier longitud. Por
ejemplo, un CPP tiene una longitud menor o igual a 500, 250, 150,
100, 50, 25, 10, 6 ó 4 aminoácidos. Por ejemplo, un CPP tiene una
longitud mayor o igual a 4, 5, 6, 10, 25, 50, 100, 150 ó 250
aminoácidos. Los expertos en la técnica pueden determinar con
facilidad la longitud y el diseño adecuados del CPP. Como
referencias generales sobre los CPP, pueden citarse: PÉPTIDO QUE
PENETRA EN CÉLULASS: PROCESSES AND APPLICATIONS, editado por Ulo
Langel (2002); o Advanced Drug Delivery Reviews,
57:489-660 (2005); o Dietz y Bähr, Moll Cell.
Neurosci., 27: 85-131 (2004).
En realizaciones preferidas, el CPP tiene una
longitud de 4, 5, 6, 7, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos.
Los péptidos que penetran en células según la
invención pueden ser, pero no se limitan a los descritos a
continuación o sus variantes. Un "variante" es al menos
aproximadamente 50%, preferiblemente al menos aproximadamente 70%,
más preferiblemente al menos aproximadamente 80%-85%,
preferiblemente al menos aproximadamente 90% y lo más
preferiblemente al menos aproximadamente 95%-99% idéntico a éstos.
Por ejemplo, los péptidos pueden tener sustituciones en 1, 2, 3, 4
o más restos. El CPP puede utilizarse en su forma natural (tal como
se describió anteriormente) o en su forma polimérica (dímero,
trímero, etc.)
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Si es necesario, los expertos en la técnica
pueden utilizar varias estrategias químicas muy conocidas para
transformar un CPP en un candidato a fármaco con mayor estabilidad
in vivo, biodisponibilidad y/o actividad biológica, tales
como:
- modificaciones en el N- y
C-terminal para evitar la degradación por
exopeptidasas: la amidación C-terminal o la
acetilación N-terminal aumenta la lipofilicidad del
péptido;
- una ciclación formando un puente
disulfuro;
- una alquilación del nitrógeno de amida para
evitar la degradación por endopeptidasas;
- la introducción de aminoácidos no naturales
para modificar el sitio de reconocimiento de la endopeptidasa
(2-metilalanina, glicina
alfa-dialquilada, oligocarbamato, oligourea,
esqueletos guanidino o amidino ...);
- la incorporación de aminoácidos no codificados
genéticamente (metilación, halogenación o cloración de glicina o
fenilalanina) en la secuencia de aminoácidos del CPP;
- la sustitución de algunos o de todos los
L-aminoácidos por sus correspondientes análogos de
D-aminoácidos o beta-aminoácidos.
Estos péptidos pueden sintetizarse como formas "inversas" o
"retroinversas", es decir, sustituyendo los
L-aminoácidos de la secuencia por
D-aminoácidos, o invirtiendo la secuencia de los
aminoácidos y sustituyendo los L-aminoácidos por
D-aminoácidos. Desde el punto de vista estructural,
el péptido retroinverso es mucho más similar al péptido original que
el D-análogo simple. Los D-péptidos
son sustancialmente más resistentes a las peptidasas y, por tanto,
son más estables en suero y tejidos comparados con sus homólogos de
L-péptidos. En una realización preferida, a los CPP
que contienen L-aminoácidos se les introduce un
casquete de un único D-aminoácido para inhibir la
destrucción por exopeptidasas;
- la síntesis de un oligocarbamato derivado de
CPP; el esqueleto de oligocarbamato consiste en un esqueleto de
etileno quiral unido a través de grupos carbamato relativamente
rígidos (Cho et al., Science, 261: 1303-1305
(1993)).
En otra realización, el CPP contiene aminoácidos
o análogos de aminoácidos básicos contiguos o no contiguos, en
particular restos guanidilo o amidinilo. Los términos
"guanidilo" y "guanidina" se emplean de modo
intercambiable para referirse a un resto que tiene la fórmula
-HN=C(NH_{2})NH (forma no protonada), por ejemplo,
una arginina que contiene un resto guanidilo (guanidino), que
también se denomina ácido
2-amino-5-guanidinovalérico
o ácido
a-amino-6-guanidinovalérico.
Los términos "amidinilo" y "amidino" se emplean de forma
intercambiable, y se refieren a un resto que tiene la fórmula
-C(=NH)(NH2). Un "aminoácido o análogo de aminoácido básico"
tiene un pKa de la cadena lateral mayor que 10. Los aminoácidos muy
básicos preferidos son la histidina, la arginina y/o la lisina.
En una realización preferida, el CPP según la
invención comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
aminoácidos o análogos de aminoácidos básicos, en particular lisina
o arginina.
Según una realización más preferida, el CPP se
caracteriza además por su capacidad para reaccionar o para unirse
con glicosaminoglicanos (GAG) (moléculas largas sin ramificar que
contienen unidades repetidas de disacáridos) o, de modo específico,
con ácido hialurónico, heparina, sulfato de heparano, sulfato de
dermatano, sulfato de queratina o sulfato de condroitina y sus
derivados. Los "derivados de heparina, sulfato de heparano o
sulfato de condroitina" o "glicosaminoglicanos" significan
cualquier producto o subproducto según se define en las
publicaciones citadas en las referencias (Cardin y Weintraub,
Arteriosclerosis, 9: 21 (1989); Merton et al., Annu. Rev.
Cell Biol., 8: 365 (1992); David, FASEB J., 7: 1023 (1993)).
La capacidad de los CPP para reaccionar o para
unirse con glicosaminoglicanos (GAG) puede determinarse mediante
ensayos de unión a glicosaminoglicanos directos o indirectos
conocidos en la técnica, tales como el ensayo de coelectroforesis
de afinidad (ACE) para la unión de glicosaminoglicanos a péptidos,
descrito en la solicitud de patente PCT WO 00/45831. Están
disponibles otros métodos muy conocidos en la técnica para analizar
las interacciones de GAG-péptidos, por ejemplo el
método descrito en la solicitud de patente PCT WO 01/64738, o por
Weisgraber y Rall (J. Biol. Chem., 262(33):
11097-11103) (un ejemplo específico es la
apolipoproteína B-100); o mediante un ensayo ELISA
modificado: se revisten placas de 96 pocillos con GAG específicos
(sulfato de condroitina A, B y C, heparina, sulfato de heparano,
ácido hialurónico, sulfato de queratano, sindecano), entonces se
añade un péptido conjugado con un marcador durante un periodo de
tiempo definido; después de un lavado a fondo, se determina la unión
al péptido utilizando un análisis específico relacionado con el
marcador.
Los CPP capaces de reaccionar in vitro
y/o in vivo con glicosaminoglicanos se describen en las
solicitudes de patente nº WO 01/64738 y nº WO 05/016960, y por De
Coupade et al. (Biochem J., 390: 407-418
(2005)). Estos péptidos son secuencias de aminoácidos que se
originan de proteínas de unión a heparina humanas y/o anticuerpos
anti-ADN seleccionados del grupo que comprende
lipoproteínas, tales como apolipoproteína B o E humanas (Cardin
et al., Biochem. Biosphys. Res. Com., 154: 741 (1988)), la
agrina (Campanelli et al., Development. 122:
1663-1672 (1996)), la proteína de unión al factor
del crecimiento de insulina (Fowlkes et al., Endocrinol.,
138: 2280-2285 (1997)), el factor del crecimiento
derivado de plaquetas humano (Maher et al., Mol. Cell. Biol.,
9: 2251-2253 (1989)), la superóxido dismutasa
extracelular humana (EC-SOD) (Inoue et al.,
FEBS, 269: 89-92 (1990)), el factor del crecimiento
de tipo factor del crecimiento epidérmico de unión a heparina humano
(HB-EGF) (Arkonac et al., J. Biol. Chem.,
273: 4400-4405 (1998)), el factor del crecimiento de
fibroblastos ácido (aFGF) (Fromm et al., Arch. Biochem.
Bioph., 343: 92 (1997)), el factor del crecimiento de fibroblastos
básico (bFGF) (Yayon et al., Cell, 64:
841-848 (1991)), la secuencia de mucina
intestinal-2 humana (Xu et al., Glyconjug J.,
13: 81-90 (1996)), el
gamma-interferón humano
(Lortat-Jacob y Grimaud, FEBS, 280:
152-154 (1991)), la subunidad p40 de la
interleuquina-12 humana (Hasan et al., J.
Immunol., 162: 1064-1070 (1999)), el factor
1-alfa derivado de células estromáticas (Amara
et al., J. Biol. Chem., 272: 200-204 (1999)),
la "proteína de unión a heparina" derivada de neutrófilos
humanos (CAP 37/azurocidina) (Pohl et al., FEBS, 272:
200-204 (1990)), una molécula de inmunoglobulina,
tal como las regiones CDR2 y/o CDR3 del anticuerpo monoclonal murino
anti-ADN F4.1 (Avrameas et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., 95: 5601 (1998)), la región hipervariable CDR3 del
anticuerpo monoclonal anti-ADN humano RTT79
(Stevenson et al., J. Autoimmunity, 6: 809 (1993)), el área
hipervariable CDR2 y/o CDR3 del anticuerpo monoclonal
anti-ADN humano NE-1 (Hirabayashi
et al., Scand. J. Immunol., 37: 533 (1993)), el área
hipervariable CDR3 del anticuerpo monoclonal
anti-ADN humano RT72 (Kalsi et al., Lupus, 4:
375 (1995)).
Según una realización más preferida, el CPP
comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que
consiste en a) (XBBBXXBX)n; b) (XBBXBX)n; c)
(BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e) (BXBB)n; y f) un
fragmento de anticuerpo, en el que cada B es independientemente un
aminoácido básico, preferiblemente lisina o arginina; cada X es
independientemente un aminoácido no básico, preferiblemente un
aminoácido hidrófobo, tal como alanina, isoleucina, leucina,
metionina, fenilalanina, triptófano, valina, tirosina o citrulina;
cada m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada
n es independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p
es independientemente un número entero entre cero y cinco. En
ciertas realizaciones, n puede ser 2 ó 3, y X puede ser un
aminoácido hidrófobo. Un fragmento de anticuerpo pretende incluir un
polipéptido de inmunoglobulina más pequeño que su longitud
completa, por ejemplo una cadena pesada, una cadena ligera, un Fab,
Fab'2, Fv o Fc. El anticuerpo puede ser, por ejemplo, humano o
murino. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo
anti-ADN. Preferiblemente, el fragmento de
anticuerpo contiene toda o parte de la región CDR2 de un anticuerpo,
en particular al menos una porción con una longitud de al menos 6 ó
10 aminoácidos de una región CDR2 de un anticuerpo
anti-ADN. Como alternativa, el anticuerpo contiene
toda o parte de la región CDR3 de un anticuerpo, en particular al
menos una porción con una longitud de al menos 6 ó 12 aminoácidos de
una región CDR3 de un anticuerpo anti-ADN. De forma
más específica, el fragmento de anticuerpo contiene al menos una
región CDR3 de un anticuerpo anti-ADN humano, tal
como RTT79, NE-1 y RT72. Estos fragmentos de
anticuerpos se han descrito en la solicitud de patente PCT nº WO
99/07414.
Preferiblemente, el CPP según la invención se
caracteriza también porque se origina a partir de proteínas humanas
(es decir, proteínas que son expresadas en la naturaleza por células
humanas). Por tanto, la característica de los CPP derivados de
proteínas humanas, comparados con los CPP derivados de proteínas no
humanas, es de interés principal en el uso previsto de estos CPP,
puesto que se evita o disminuye su inmunogenicidad. Además, De
Coupade et al. (Biochem J., 390: 407-418
(2005)) han demostrado que los péptidos derivados de seres humanos
tienen unos perfiles de toxicidad in vivo bajos, coherentes
con su uso como sistemas de transporte terapéuticos, a diferencia
de los péptidos vehículo existentes, tales como los péptidos Tat
(Trehin y Merkle, Eur. J. Pharm. Biopharm., 58,
209-223 (2004)).
Entre los CPP descritos anteriormente, se
prefieren los que son capaces de penetrar de modo específico en el
citoplasma. La penetración de un CPP en el citoplasma puede ser
determinada mediante diversos procesos in vitro conocidos
por los expertos en la técnica, por ejemplo, incubando el CPP con
células; después, las células se incuban en presencia de
anticuerpos marcados anti-CPP específicos y
anticuerpos marcados anti-proteínas citoplásmicas
específicos, seguido de la detección en el citoplasma de la reacción
inmunológica entre el CPP y los anticuerpos marcados. Otro método
es conjugar el CPP a oro coloidal e incubar el conjugado con las
células. Las células entonces se tratan como es habitual para
utilizar un microscopio electrónico para visualizar la localización
intracelular.
Por consiguiente, los CPP preferidos, derivados
de la proteína de unión a heparina humana y capaces de penetrar de
modo específico en el citoplasma de una célula diana, se seleccionan
del grupo que comprende:
- DPV6 (SEQ ID NO:3): CPP que reacciona con
heparina y derivado de la secuencia de aminoácidos de la parte
C-terminal de la cadena A del factor del crecimiento
derivado de plaquetas humano (Maher et al., Mol. Cell. Biol.,
9: 2251-2253 (1989)). Comprende una secuencia de
aminoácidos de fórmula c) (BBXmBBXp)n, en la que m = 0, p =
0, y n = 1;
- DPV7 (SEQ ID NO:4) y DPV7b (SEQ ID NO:5): CPP
que reaccionan con la heparina y se derivan de la parte
C-terminal de la secuencia del factor del
crecimiento de tipo factor del crecimiento epidérmico de unión a
heparina humano (HB-EGF) (Arkonac et al., J.
Biol. Chem., 273: 4400-4405 (1998)). Ambos CPP
comprenden una secuencia de aminoácidos de fórmula c)
(BBXmBBXp)n, en la que m = 0, p = 0, y n = 1;
- DPV10 (SEQ ID NO:10): CPP que reacciona con la
heparina y se corresponde con la parte C-terminal de
la secuencia de mucina intestinal-2 humana (Xu et
al., Glyconjug. J., 13: 81-90 (1996)). Comprende
una secuencia de aminoácidos de fórmula e) (BXBB)n, en la que
n = 1;
- DVP3/10 (SEQ ID NO:6): CPP que reacciona con
la heparina y se deriva de la parte C-terminal de la
secuencia de la superóxido dismutasa extracelular humana
(EC-SOD) (véase anteriormente), y de la parte
C-terminal de la secuencia de mucina
intestinal-2 humana (véase anteriormente). Comprende
una secuencia de aminoácidos de fórmula c) (BBXmBBXp)n, en la
que m = 1, p = 2, y n = 1;
- DVP10/6 (SEQ ID NO:7): CPP que reacciona con
la heparina y se deriva de la parte C-terminal de la
secuencia de mucina intestinal-2 humana (véase
anteriormente), y de la parte C-terminal de la
cadena A del factor del crecimiento derivado de plaquetas (véase
anteriormente). Comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula c)
(BBXmBBXp)n, en la que m = 1, p = 2, y n = 1;
- DVP1470 (SEQ ID NO:8): CPP que reacciona con
la heparina derivada de la secuencia de aminoácidos
(3358-3372) de la lipoproteína B humana (Cardin
et al., Biochem. Biosphys. Res. Com., 154: 741 (1988)), y de
la secuencia del péptido que se corresponde con el área
hipervariable CDR3 del anticuerpo monoclonal
anti-ADN humano NE-1 (Hirabayashi
et al., Scand. J. Immunol., 37: 533 (1993)). Comprende una
secuencia de aminoácidos de fórmula d) (XBBXXBX)n, en la que
n = 1, y un fragmento de anticuerpo o una secuencia de aminoácidos
de fórmula b) (XBBXBX)n, en la que n = 1;
- DPV15b (SEQ ID NO:11): CPP que reacciona con
la heparina y que contiene parte de la secuencia de la "proteína
de unión a la heparina" (CAP 37). Comprende una secuencia de
aminoácidos de fórmula d) (XBBXXBX) repetida dos veces.
Un CPP más preferido es DPV3 (SEQ ID NO:2): CPP
que reacciona con la heparina y es un dímero de un péptido derivado
de la parte C-terminal de la secuencia de la
superóxido dismutasa extracelular humana (EC-SOD)
(Inoue et al., FEBS, 269: 89-92 (1990)).
Comprende una secuencia de aminoácidos de fórmula c)
(BBXmBBXp)n, en la que m = 0, p = 0 y n = 1. DPV3 contiene
la secuencia de aminoácidos BBBBBBXXBBBBBBXX.
Una "proteína RAS-p12" o
"proteína RAS" se define como una proteína codificada por el
gen ras. La familia del gen ras se encuentra en una
amplia variedad de células de mamífero nucleadas y participa en la
función celular normal. Consiste en tres genes funcionales,
H-ras, N-ras y K-ras. Los genes ras
codifican proteínas de 21 kDa (denominadas p21), que están
asociadas con la membrana plasmática interna (H-RAS,
N-RAS, y K-RAS A y
K-RAS B, estas dos últimas con un corte y empalme
alternativo). Mientras que H-RAS,
N-RAS y K-RAS B se expresan de
forma ubicua, K-RAS A es inducida durante la
diferenciación de células pluripotenciales embrionarias in
vitro (Pells et al., Oncogene, 15,
1781-1786 (1997)).
Una "proteína RAS activada" o "RAS
activada" se define como la forma de la proteína RAS que es capaz
de inducir a las células a que pierdan su control del crecimiento
normal. Tal como se emplea en la presente, la expresión "proteína
RAS activada" es sinónimo de "proteína RAS oncogénica". Se
ha demostrado que las proteínas RAS activadas con frecuencia
contienen mutaciones puntuales (una sustitución de un aminoácido) en
la posición 12, 13 ó 61 (Reddy et al., Nature, 300,
149-152 (1982); Tabin et al., Nature, 300,
143-149 (1982); y Bos, Cancer Res., 49,
4682-4689 (1989)).
4682-4689 (1989)).
Un "anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada, su fragmento o su derivado" se
define como un anticuerpo neutralizante, su fragmento o su
derivado, que se une de modo específico a un epitopo sobre las
proteínas RAS activadas, pero que no se une a un epitopo de la
proteína RAS normal no activada. La expresión "unión específica a
un epitopo sobre una proteína RAS activada" significa que,
dentro de una mezcla de reactivos que comprenden RAS activada
además de otros antígenos alternativos, sólo se une la RAS activada.
Preferiblemente, la unión específica de un anticuerpo según la
presente invención a la RAS activada es de alta afinidad, por
ejemplo, entre aproximadamente 10^{-11} y aproximadamente
10^{-10} molar. Las mediciones de afinidad pueden realizarse
utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica,
incluyendo el método de la diálisis en equilibrio.
Un "anticuerpo neutralizante, su fragmento o
su derivado" significa un anticuerpo, su fragmento o su
derivado, cuya unión a una proteína RAS activada produce la
inhibición de la actividad biológica (por ejemplo, la función) de
dicha proteína RAS activada. Esta inhibición de la actividad
biológica puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la
actividad biológica de la proteína RAS activada, tal como la
reacción de intercambio de nucleótidos entre nucleótidos de guanina
unidos a p21 y exógenos, la entrada en la fase S de la síntesis de
ADN, y la replicación celular (Hattori et al., Mol. Cell.
Biol., 7, 1999-2002 (1987)). El término
"inhibición" significa que la capacidad transformadora de
células de la RAS activada es inhibida comparada con un control
adecuado, en el que las células control no se tratan con un
anticuerpo de la presente invención. De forma ventajosa, la
capacidad transformadora de células de la RAS activada es inhibida
en 20% comparada con un control adecuado. De forma más ventajosa,
es inhibida en 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%. En una
realización más preferida de este aspecto de la invención, la
capacidad transformadora de células de la RAS activada es inhibida
en 100% comparada con un control adecuado. Tal como se emplea en la
presente, la expresión "capacidad transformadora" (de la RAS
activada) se refiere a la capacidad de la RAS activada para inducir
a las células a perder su control del crecimiento normal. Por
ejemplo, las "células transformadas" muestran una replicación
sin fin y una pérdida de la inhibición por contacto.
El término "anticuerpo" según la presente
invención se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a porciones
inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir,
moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une de
modo inmunoespecífico a una proteína RAS activada. Las moléculas de
inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier tipo (por
ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de moléculas de
inmunoglobulina. Preferiblemente, los anticuerpos son humanos,
murinos (por ejemplo, de ratón y de rata), de burro, oveja, conejo,
cabra, cobaya, camélido, caballo o pollo. Las moléculas de
inmunoglobulina de la invención pueden ser anticuerpos policlonales
o monoclonales, preferiblemente monoclonales.
Tal como se emplea en la presente, los
anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la
secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana, e incluyen
anticuerpos aislados a partir de bancos de inmunoglobulinas
humanas, a partir de células B, o a partir de animales transgénicos
para una o más inmunoglobulinas humanas, como se describe, por
ejemplo, en la patente de EEUU nº 5.939.598.
La expresión "fragmento de anticuerpo"
según la presente invención se refiere a anticuerpos que son
fragmentos de anticuerpos neutralizantes anti-RAS
activada e incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab' y
F(ab')2, Fd, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos
monocatenarios, Fv unidos mediante disulfuro (sdFv) y fragmentos que
comprenden un dominio VL o VH. Los fragmentos de anticuerpos
neutralizantes anti-RAS activada, incluyendo los
anticuerpos monocatenarios, pueden comprender la región o regiones
variables solas o en combinación con la totalidad o con una porción
de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 y CL.
También se incluyen en la invención los fragmentos de anticuerpos
neutralizantes anti-RAS activada que comprenden
cualquier combinación de una región o regiones variables con una
región bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 y CL.
\newpage
El término "derivados" según la invención
se refiere a anticuerpos o sus fragmentos (cualquiera de los
anteriores fragmentos de unión a la proteína RAS activada) que
tengan una coincidencia de más de 60% con un anticuerpo o sus
fragmentos según se definió anteriormente, preferiblemente más del
70% de coincidencia, como ejemplo más de 80% de coincidencia o más
del 90% de coincidencia, y lo más preferiblemente más del 95% de
coincidencia con un anticuerpo o sus fragmentos según se definió
anteriormente.
Preferiblemente, dichos derivados se
corresponden con anticuerpos humanizados o sus fragmentos.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
generarse mediante cualquier método adecuado conocido en la
técnica. Pueden producirse anticuerpos policlonales contra una
proteína RAS activada mediante diversos procedimientos muy
conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede administrarse una
proteína RAS activada a diversos animales hospedantes que incluyen,
pero no se limitan a conejos, ratones, ratas, etc., para inducir la
producción de suero que contenga anticuerpos policlonales
específicos para la proteína. Pueden emplearse diversos adyuvantes
para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie
hospedante, que incluyen, pero no se limitan a adyuvante de Freund
(completo e incompleto), geles minerales, tales como hidróxido de
aluminio, sustancias tensioactivas, tales como lisolecitina,
polianiones de polioles 5 plurónicos, péptidos, emulsiones de
aceite, hemocianina de lapa, dinitrofenol y adyuvantes humanos
potencialmente útiles, tales como BCG (bacilo de
Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.
Estos adyuvantes también son muy conocidos en la técnica.
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales
utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica,
incluyendo el uso de la tecnología de hibridomas, recombinante y de
presentación de fagos, o sus combinaciones. Por ejemplo, pueden
producirse anticuerpos monoclonales utilizando técnicas de hibridoma
que incluyen las conocidas en la técnica y que se indican, por
ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed., 1988); Hammerling,
et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell
Hybridomas, 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (dichas
referencias se incorporan como referencia en su totalidad). La
expresión "anticuerpo monoclonal", tal como se emplea en la
presente, no se limita a anticuerpos producidos a través de la
tecnología de hibridomas. La expresión "anticuerpo monoclonal"
se refiere a un anticuerpo que se deriva de un único clon,
incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago, y no
indica el método mediante el cual ha sido producido. Los métodos
para producir y seleccionar anticuerpos específicos empleando la
tecnología de hibridomas son habituales y muy conocidos en la
técnica.
Los métodos para fabricar un "anticuerpo
humanizado" son muy conocidos en la técnica. Esta es una técnica
para reconstruir el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo no
humano (por ejemplo, un anticuerpo de roedor) sobre un anticuerpo
humano (Jones, P.T. et al., Nature, 321,
5225-5525 (1986); Verhoeyen, M. et al.,
Science, 239, 1534-1536 (1988); Riechmann, L. et
al., Nature, 332, 323-327 (1988)). En general,
el anticuerpo humanizado o su fragmento comprende sustancialmente
al menos uno y más preferiblemente dos dominios variables (Fab,
Fab', F(ab')2, Fabc, Fv) en los que todas o sustancialmente
todas las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) se
corresponden con las de una inmunoglobulina no humana, y todas o
sustancialmente todas las regiones marco (FR) son las de una
secuencia consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo
humanizado, de forma óptima, también comprende al menos una porción
de una región constante de inmunoglobulina (Fc), de forma típica la
de una inmunoglobulina humana. Normalmente, el anticuerpo contiene
la cadena ligera y también al menos el dominio variable de una
cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CH1,
bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo
humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de
inmunoglobulinas, incluyen IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y de cualquier
isotipo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Normalmente, la región
constante es un dominio constante de fijación del complemento, en el
que se desea que el anticuerpo humanizado muestre actividad
citotóxica, y la clase es, de forma típica, IgG y preferiblemente
IgG1. Cuando dicha actividad citotóxica no sea deseable, el dominio
constante puede ser de la clase IgG2. El anticuerpo humanizado
puede comprender secuencias procedentes de más de una clase o
isotipo, y la selección de los dominios constantes concretos para
optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de la
técnica. No es necesario que las regiones FR y CDR del anticuerpo
humanizado se correspondan exactamente con las secuencias de origen,
por ejemplo, la CDR de importación o la FR consenso pueden
mutagenizarse mediante sustitución, inserción o deleción de uno o
más restos, de modo que el resto de la CDR o FR en ese sitio no se
corresponda al consenso o al anticuerpo de importación. Sin
embargo, estas mutaciones no serán extensas y no afectarán
notablemente a la unión del anticuerpo a la diana de unión. La
expresión "anticuerpo humanizado" también incluye anticuerpos
híbridos y recombinantes, y polipéptidos producidos mediante el
corte y empalme de una región variable o de una o más CDR de una
anticuerpo anti-AF-20 con cualquier
proteína o proteínas heterólogas, independientemente de la especie
de origen, tipo de proteína, denominación de clase o subclase de
inmunoglobulina, con la condición de que los polipéptidos y
anticuerpos híbridos y recombinantes muestren la actividad biológica
deseada. La expresión "anticuerpo humanizado" también incluye
anticuerpos y polipéptidos que se han hechos no inmunogénicos, o
que tengan una inmunogenicidad reducida con relación al anticuerpo
nativo, para un ser humano mediante el método de determinar al
menos parte de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o
polipéptido (preferiblemente la parte que no tiene origen humano,
tal como la región VH o VK de un anticuerpo no humano), identificar
en la secuencia de aminoácidos uno o más epitopos potenciales para
células T humanas, y modificar la secuencia o secuencias de
aminoácidos de este epitopo o epitopos para eliminar al menos uno de
los epitopos de células T identificado para eliminar o reducir la
inmunogenicidad de la proteína o sus porciones cuando se exponen al
sistema inmunológico humano. En la creación de una anticuerpo
humanizado, preferiblemente aproximadamente 75%, más
preferiblemente aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente más de
aproximadamente 95% de los restos del anticuerpo humanizado se
corresponderán con los de las secuencias FR y CDR de origen.
Los fragmentos de anticuerpos que reconocen
epitopos específicos sobre la proteína RAS activada pueden generarse
mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, los fragmentos Fab y
F(ab')2 de la invención pueden producirse mediante ruptura
proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, utilizando enzimas
tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para
producir fragmentos F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2
contienen la región variable, la región constante de cadena ligera,
y el dominio CH1 de cadena pesada.
En una realización específica, el anticuerpo es
el anticuerpo monoclonal neutralizante de rata Y13259 o su derivado
(Furth et al., J. Virol., 43, 294-304 (1982);
Kung et al., Exp. Cell Res., 162, 363-371
(1986); Hattori et al., Mol. Cell Biol., 7,
1999-2002 (1987); Hamer et al., Hybridoma, 9,
573-587 (1990)). El término "derivado"
pretende incluir cualquier forma del anticuerpo Y13259 según se
definió anteriormente, en el que uno o más de los aminoácidos
dentro de la cadena polipeptídica se ha sustituido por un aminoácido
alternativo y/o en el que uno o más de los aminoácidos han sido
delecionados, o en el que uno o más de aminoácidos adicionales han
sido añadidos a la cadena polipeptídica o a las secuencias de
aminoácidos del anticuerpo Y13259, que todavía mantiene al menos
una función del anticuerpo Y13259 nativo, es decir, que sigue siendo
un anticuerpo neutralizante anti-RAS activada. Un
derivado de Y13259 muestra al menos aproximadamente 50%,
preferiblemente al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente
al menos aproximadamente 80%-85%, preferiblemente al menos
aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente al menos
aproximadamente 95%-99% de homología de la secuencia de aminoácidos
frente al anticuerpo Y13259 nativo definido. En la técnica se
conocen en general muchos programas informáticos adecuados para
calcular la "homología" entre dos secuencias de aminoácidos,
tales como el programa BLAST (http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/)
eligiendo la matriz de puntuación BLOSUM62.
En una realización específica, el anticuerpo
monoclonal neutralizante de rata Y13259 es producido por el clon de
hibridoma denominado Y13259 que se origina de ATCC, nº
CRL-1742.
El CPP y el anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada pueden conjugarse (es decir,
acoplarse mediante acoplamiento químico) de cualquier manera
adecuada conocida en la técnica. Muchos métodos de entrecruzamiento
químico no son específicos, es decir, no dirigen el punto de
acoplamiento a algún sitio concreto sobre el CPP o el anticuerpo
neutralizante anti-RAS activada adecuado. Como
resultado, el uso de reactivos de entrecruzamiento no específicos
puede atacar a los sitios funcionales o bloquear estéricamente los
sitios activos, produciendo proteínas conjugadas biológicamente
inactivas. El anticuerpo neutralizante anti-RAS
activada puede acoplarse directamente al CPP en uno de los extremos
terminales (N- o C-terminal) o en una cadena lateral
de uno de los aminoácidos. El anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada también puede acoplarse de modo
indirecto a través de un brazo conector a uno de los extremos
terminales de los péptidos o a una cadena lateral de uno de los
aminoácidos.
Una manera para aumentar la especificidad de
acoplamiento es mediante un acoplamiento químico directo con un
grupo funcional que aparezca sólo una o unas pocas veces en uno o
ambos polipéptidos que se van a entrecruzar. Por ejemplo, en muchas
proteínas, la cisteína, que es el único aminoácido de proteínas que
contiene un grupo tiol, aparece sólo unas pocas veces. Además, por
ejemplo, si un polipéptido no contiene restos lisina, un reactivo
de entrecruzamiento específico para aminas primarias será selectivo
para el amino terminal de este polipéptido. La utilización
satisfactoria de esta estrategia para aumentar la especificidad del
acoplamiento requiere que el polipéptido tenga los restos reactivos
y raros adecuados en áreas de la molécula que puedan alterarse sin
la pérdida de la actividad biológica de la molécula.
Los restos cisteína pueden sustituirse cuando
aparezcan en partes de la secuencia polipeptídica en las que su
participación en una reacción de entrecruzamiento probablemente
pueda interferir de otro modo con la actividad biológica. Cuando se
sustituye un resto cisteína, de forma típica resulta deseable
minimizar los cambios resultantes en el plegamiento del
polipéptido. Los cambios en el plegamiento del polipéptido se
minimizan cuando la sustitución es química y estéricamente similar
a la cisteína. Por estas razones, se prefiere la serina como
sustitución para la cisteína. Tal como se demuestra en los ejemplos
que aparecen a continuación, un resto cisteína puede introducirse
en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para objetivos de
entrecruzamiento. Cuando se introduce un resto cisteína, se
prefiere la introducción en el amino o carboxi terminal o cerca de
éstos. Están disponibles métodos convencionales para estas
modificaciones de la secuencia de aminoácidos, tanto si el
polipéptido de interés es producido mediante síntesis química como
mediante expresión de ADN recombinante.
El acoplamiento de los dos constituyentes puede
realizarse a través de un agente de entrecruzamiento. Existen
varios reactivos de entrecruzamiento intermolecular que pueden
utilizarse; véase, por ejemplo, Means y Feeney, CHEMICAL
MODIFICATION OF PROTEINS, Holden-Day, 1974, pp.
39-43. Entre estos reactivos se encuentran, por
ejemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de
N-succinimidilo (SPDP) o
N,N'-(1,3-fenilen)bismaleimida (ambos son muy
específicos para grupos sulfhidrilo y forman enlaces
irreversibles);
N,N'-etilen-bis(yodoacetamida)
u otro reactivo parecido que tenga de 6 a 11 puentes de carbono
metileno (que son relativamente específicos para grupos
sulhidrilo); y
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno
(que forma enlaces irreversibles con grupos amino y tirosina).
Otros reactivos de entrecruzamiento útiles para este objetivo
incluyen:
p,p'-difluoro-N,N'-dinitrodifenilsulfona
(que forma enlaces cruzados irreversibles con grupos amino y
fenólicos); adipimidato de dimetilo (que es específico para grupos
amino); cloruro de
fenol-1,4-disulfonilo (que reacciona
principalmente con grupos amino); hexametilendiisocianato o
diisotiocianato, o
azofenil-p-diisocianato (que
reaccionan principalmente con grupos amino); glutaraldehído (que
reacción con varias cadenas laterales diferentes); y
disdiazobenzidina (que reacciona principalmente con tirosina
e
histidina).
histidina).
Los reactivos de entrecruzamiento pueden ser
homobifuncionales, es decir, tienen dos grupos funcionales (es
decir, grupos reactivos) que sufren la misma reacción. Un ejemplo de
un reactivo de entrecruzamiento homobifuncional es
bismaleimidohexano ("BMH"). El BMH contiene dos grupos
funcionales maleimida, que reaccionan de modo específico con
compuestos que contienen sulfhidrilo bajo condiciones suaves (pH
6,5-7,7). Los dos grupos maleimida están conectados
por una cadena hidrocarbonada. Por tanto, el BMH es útil para el
entrecruzamiento irreversible de polipéptidos que contengan restos
cisteína.
Los reactivos de entrecruzamiento también pueden
ser heterobifuncionales. Los reactivos de entrecruzamiento
heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por
ejemplo, un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol,
que entrecruzarán dos proteínas que tengan aminas y tioles libres,
respectivamente. Los reactivos de entrecruzamiento
heterobifuncionales preferidos son
4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato
de succinimidilo ("SMCC"), éster de
N-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
("MBS"), y 4-(p-maleimidofenil)butirato
de succinimida ("SMPB"), un análogo de cadena extendida de MBS.
El grupo succinimidilo de estos reactivos de entrecruzamiento
reacciona con una amina primaria para forma un enlace amida, y la
maleimida reactiva con tiol forma un enlace tioéter covalente con el
tiol de un resto cisteína.
Los reactivos de entrecruzamiento a menudo
tienen una baja solubilidad en agua. Puede añadirse un resto
hidrófilo, tal como un grupo sulfonato, al reactivo de
entrecruzamiento para mejorar su solubilidad en agua. El
sulfo-MBS y el sulfo-SMCC son
ejemplos de reactivos de entrecruzamiento modificados para su
solubilidad en agua.
Muchos reactivos de entrecruzamiento producen un
conjugado que fundamentalmente no puede romperse bajo condiciones
celulares. Sin embargo, algunos reactivos de entrecruzamiento
contienen un enlace covalente, tal como un disulfuro, que puede
romperse bajo condiciones celulares. Por ejemplo, el reactivo de
Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) ("DSP"), y
3-(2-piridiltio)propionato de
N-succinimidilo ("SPDP") son reactivos de
entrecruzamiento que pueden romperse muy conocidos. Otro ejemplo
son los derivados de hidrazina, tal como hidrazida del ácido
4-(4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH),
4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilhidrazida
(M_{2}C_{2}H), o
3-(2-piridiltio)propionil hidrazida (PDPH).
El uso de un reactivo de entrecruzamiento que puede romperse permite
a la enzima lisosómica separar al CPP después de su transporte a la
célula diana. También puede ser útil un enlace disulfuro
directo.
directo.
En el mercado están disponibles numerosos
reactivos de entrecruzamiento, incluyendo los analizados
anteriormente. Las instrucciones detalladas para su uso pueden
adquirirse con facilidad a partir de suministradores comerciales.
Una referencia general sobre entrecruzamiento de proteínas y
preparación de conjugados es: Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION
AND CROSS-LINKING, CRC Press (1991).
El entrecruzamiento químico puede incluir el uso
de brazos espaciadores. Los brazos espaciadores proporcionan
flexibilidad intramolecular o ajustan las distancias
intramoleculares entre los dominios conjugados y, con ello, pueden
ayudar a conservar la actividad biológica. Un brazo espaciador puede
estar en forma de un dominio polipeptídico que incluya aminoácidos
espaciadores, por ejemplo, prolina. Como alternativa, un brazo
espaciador puede ser parte del reactivo de entrecruzamiento, tal
como en "SPDP de cadena larga" (Pierce Chem. Co., Rockford,
IL., nº de catálogo 21651 H).
En una realización de la invención, el CPP se
acopla al anticuerpo neutralizante anti-RAS activada
mediante al menos una molécula (denominada "molécula de
anclaje") que tienen una fuerte afinidad natural por el
anticuerpo neutralizante anti-RAS activada. La
afinidad natural de la molécula de anclaje por el anticuerpo
neutralizante anti-RAS activada permite que el CPP
interaccione de modo no covalente con el anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada y, por tanto, que lo porte a
través del recorrido intracelular. Otra ventaja especialmente
interesante de este tipo de acoplamiento consiste en el hecho de
que, debido a la afinidad natural de la molécula de anclaje por el
anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, estos
dos elementos se acoplan de una manera totalmente natural, sin
interacción química ni bioquímica.
Como alternativa, el polipéptido quimérico puede
producirse mediante modificación genética, en forma de un
polipéptido de fusión que incluye el CPP y la secuencia del
anticuerpo neutralizante anti-RAS activada adecuada
que puede expresarse de modo conveniente en células hospedantes
adecuadas conocidas. Los polipéptidos de fusión, tal como se
describen en la presente, pueden formarse y utilizarse de forma
análoga a las técnicas de ADN recombinante convencionales o
adaptarse con facilidad a partir de éstas. Por consiguiente, la
presente invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos y
vectores de expresión que comprenden una secuencia de ácido nucleico
que codifica un anticuerpo neutralizante anti-RAS
activada y un CPP de la invención. Existen abundantes vectores de
expresión disponibles y los expertos en la técnica pueden
seleccionar con facilidad un vector apropiado. Además, los manuales
de laboratorio convencionales sobre ingeniería genética proporcionan
métodos de ADN recombinante y métodos para fabricar y utilizar
vectores de expresión.
Si se desea, pueden insertarse además uno o más
aminoácidos entre el primer dominio peptídico que comprende el CPP,
y el segundo dominio peptídico que comprende el anticuerpo
neutralizante anti-RAS activada adecuado. En algunas
realizaciones, el primer o el segundo dominio incluye una secuencia
que facilita la asociación del CPP con el anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada.
\newpage
La invención también proporciona un método para
tratar o prevenir un cáncer mediante la administración a un sujeto
en el que se desea dicho tratamiento o prevención de una composición
que comprende un conjugado de anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada-CPP de la
invención, en una cantidad suficiente para tratar o prevenir la
enfermedad en el sujeto. En una realización específica, el cáncer es
un carcinoma que comprende, pero no se limita a un adenocarcinoma
de páncreas, de colon o de pulmón. Cualquier composición puede
comprender una cantidad eficaz de un polipéptido quimérico de la
invención del 0,1% al 99%, preferiblemente del 1% al 70% de la
composición. Como ejemplo, las dosificaciones del polipéptido
quimérico de la invención, cuando se emplean para los efectos
indicados, estarán entre aproximadamente 0,05 y 1.000 mg, y
preferiblemente 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0,
250,0, 500,0 mg por composición. La eficacia del tratamiento se
determina en asociación con cualquier método conocido para
diagnosticar o tratar cánceres. El sujeto puede ser cualquier
mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate, un ratón, una
rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo, un cerdo.
Los conjugados de anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada-CPP o las
moléculas de ácido nucleico que codifican estos conjugados (también
denominados en la presente "productos terapéuticos" o
"compuestos activos") de la invención, y sus derivados,
fragmentos, análogos y homólogos, pueden incorporarse en
composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración; estas
composiciones comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la invención se refiere al tratamiento del
cáncer con asociaciones de al menos un conjugado de anticuerpo
neutralizante anti-RAS activada-CPP
según la invención y al menos otro agente antitumoral, tal como
antraciclinas (tales como doxorrubicina) y los
vinca-alcaloides o agentes antitumorales que tengan
efectos antiinflamatorios, tales como metotrexato, y el uso de
dichas asociaciones para un tratamiento mejorado.
Tal como se emplea en la presente, un
"vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir
cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión,
revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes
isotónicos y de retraso en la absorción, y similares, compatibles
con la administración farmacéutica. Los vehículos adecuados se
describen en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical
Sciences, un texto de referencia convencional en el campo, que se
incorpora en la presente como referencia. Los ejemplos preferidos
de estos vehículos o diluyentes incluyen, pero no se limitan a agua,
disolución salina, disoluciones de Finger, disolución de dextrosa,
y albúmina de suero humana al 5%. También pueden utilizarse
liposomas y vehículos no acuosos, tales como aceites no volátiles.
El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente
activas es muy conocido en la técnica. Excepto en el caso de que
cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el
compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones. Otros
compuestos activos también pueden incorporarse en las
composiciones.
Una composición farmacéutica de la invención se
formula para que sea compatible con su vía de administración
prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen la vía
parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea,
transdérmica (es decir, tópica) y transmucósica, u oral (por
ejemplo, inhalación), administración rectal. Las disoluciones o
suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica
o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un
diluyente estéril, tal como agua para inyección, disolución salina,
aceites no volátiles, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol
u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos, tales como
alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes, tales como ácido
ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes, tales como ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones, tales como acetatos,
citratos o fosfatos; y agentes para ajustar la tonicidad, tales como
cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o
bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La
preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas
desechables o viales de dosis múltiple fabricados de vidrio o
plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para un uso
inyectable incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles
(cuando sean solubles en agua) y polvos estériles para la
preparación improvisada de disoluciones o dispersiones inyectables
estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos
adecuados incluyen disolución salina fisiológica, agua
bacteriostática, Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ), glucosa o
disolución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos,
la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de
que sea puede inyectarse con facilidad. Debe ser estable bajo las
condiciones de fabricación y conservación, y debe protegerse frente
a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y
hongos. El vehículo debe ser un disolvente o un medio de dispersión
que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo,
glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y
sus mezclas adecuadas.
La fluidez apropiada puede mantenerse, por
ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina,
mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el
caso de una dispersión, y mediante el uso de tensioactivos. La
prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse
mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por
ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal
y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes
isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como
manitol, sorbitol, cloruro de sodio, en la composición. Puede
lograrse una absorción prolongada de las composiciones inyectables
incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por
ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las composiciones orales contienen, en general,
un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en
cápsulas de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el objetivo
de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede
incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos,
trociscos o cápsulas. También pueden prepararse composiciones
orales utilizando un vehículo fluido, para su uso como colutorio,
en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral,
se enjuaga dentro de la boca y se expectora o se traga. Pueden
incluirse agentes ligantes y/o materiales adyuvantes
farmacéuticamente compatibles como parte de la composición. Los
comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden
contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de
una naturaleza similar: un ligante, tal como celulosa
microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente, tal
como almidón o lactosa; un agente disgregante, tal como ácido
algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante, tal como
estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante, tal como dióxido
de silicio coloidal; un agente edulcorante, tal como sacarosa o
sacarina; o un agente aromatizante, tal como menta, salicilato de
metilo o aroma de naranja. Para la administración mediante
inhalación, los compuestos se administran en forma de un pulverizado
en aerosol a partir de un recipiente o dispensador presurizado que
contenga un propelente adecuado, por ejemplo, un gas, tal como
dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede
realizarse por medios transmucósicos o transdérmicos. Para la
administración transmucósica o transdérmica se emplean en la
formulación penetrantes apropiados para la barrera que se va a
permear. Estos penetrantes son conocidos en general en la técnica e
incluyen, por ejemplo, para la administración transmucósica,
detergentes, sales biliares, y derivados del ácido fusídico. La
administración transmucósica puede lograrse mediante el uso de
pulverizados nasales o supositorios. Para la administración
transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos,
pomadas, geles o cremas, como se conoce en general en la
técnica.
Las composiciones también pueden prepararse en
forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios
convencionales, tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o
enemas de retención para la administración rectal.
En una realización, los compuestos activos se
preparan con vehículos que protegen al compuesto frente a la
eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de
liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de
administración microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros
biodegradables y biocompatibles, tales como
etileno-acetato de vinilo, polianhídridos,
poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido
láctico). Los métodos para la preparación de dichas formulaciones
serán evidentes para los expertos en la técnica.
En algunas realizaciones se formulan
composiciones orales o parenterales en forma de dosificaciones
unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de la
dosificación. Una forma de dosificación unitaria, tal como se
emplea en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas
adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a
tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del
compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico
deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La
especificación para las formas de dosificación unitarias de la
invención viene dictada y depende directamente de las
características exclusivas del compuesto activo y del efecto
terapéutico particular que se va a lograr, y de las limitaciones
inherentes en la técnica de formación de compuestos con este tipo de
compuestos activos para el tratamiento de individuos.
Si se desea pueden prepararse preparaciones de
liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de
liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros
hidrófobos sólidos que contienen el compuesto activo, estando
dichas matrices en forma de artículos con forma, por ejemplo,
películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación
sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o
poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EEUU nº
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
L-glutamato de etilo,
etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros
de ácido láctico-ácido glicólico degradables, tales como LUPRON
DEPOT (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido
láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida), y poli(ácido
D-(-)-3-hidroxibutírico).
Como ejemplos, las dosificaciones orales de los
polipéptidos quiméricos de la invención, cuando se usan para los
efectos indicados, estarán entre aproximadamente 0,05 y 1.000 mg/día
por la vía oral, y preferiblemente estarán en forma de comprimidos
que contienen 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0,
250,0, 500,0 y 1.000 mg de ingrediente activo. Los niveles
plasmáticos eficaces de los vectores o transportadores cargados con
al menos una sustancia de interés variarán de 0,002 mg a 50 mg por
kilogramo de peso corporal y por día.
Los polipéptidos quiméricos o los ácidos
nucleicos que codifican los polipéptidos quiméricos de la invención
pueden administrarse en forma de dosis diarias únicas, o la dosis
diaria total puede administrarse en dos, tres o cuatro dosis
diarias.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse
en un recipiente, un kit, un paquete o un dispensador, junto con
instrucciones para su administración.
Las moléculas de ácidos nucleicos de la
invención pueden insertarse en vectores y utilizarse como vectores
de terapia génica. Los vectores de terapia génica pueden
administrarse a un sujeto, por ejemplo mediante inyección
intravenosa, administración local (véase, por ejemplo, la patente de
EEUU nº 5.328.470) o mediante inyección estereotáctica (véase, por
ejemplo, Chen, et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91
:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector
de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un
diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación
lenta en la que se embebe el vehículo de transporte de genes. Como
alternativa, cuando el vector de transporte de genes completo pueda
producirse intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo,
vectores retrovíricos, la preparación farmacéutica puede incluir una
o más células que produzcan el sistema de transporte de genes.
Por consiguiente, otro aspecto de la invención
se refiere a vectores, preferiblemente vectores de expresión, que
contengan un ácido nucleico que codifique un polipéptido condensado
de la invención, o sus derivados, fragmentos, análogos u homólogos.
Tal como se emplea en la presente, el término "vector" se
refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro
ácido nucleico al cual se ha unido. Un tipo de vector es un
"plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario lineal
o circular en el que pueden acoplarse otros segmentos de ADN. Otro
tipo de vector es un vector vírico, en el que pueden acoplarse otros
segmentos de ADN o ARN en el genoma vírico. Ciertos vectores son
capaces de una replicación autónoma en una célula hospedante en la
que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tengan un
origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episómicos;
vectores de levadura). Otros vectores (por ejemplo, vectores de
mamífero no episómicos) se integran en el genoma de una célula
hospedante tras su introducción en la célula hospedante y, por
tanto, se replican junto con el genoma del hospedante.
Además, ciertos vectores son capaces de dirigir
la expresión de genes a los cuales están operativamente unidos.
Estos vectores se denominan en la presente "vectores de
expresión". En general, los vectores de expresión útiles en las
técnicas de ADN recombinante a menudo tienen forma de plásmidos. En
la presente solicitud, "plásmido" y "vector" pueden
utilizarse de modo intercambiable, puesto que el plásmido es la
forma de vector que se emplea más habitualmente. Sin embargo, la
invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión,
tales como vectores víricos (por ejemplo, retrovirus con
replicación defectuosa, adenovirus y virus adenoasociados), que
tengan funciones equivalentes. Además, algunos vectores víricos son
capaces de dirigirse a un tipo celular particular de modo específico
o no específico.
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma
adecuada para la expresión del ácido nucleico en la célula
hospedante, lo cual significa que los vectores de expresión
recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras,
seleccionadas basándose en las células hospedantes que se van a
utilizar para la expresión, que está unido operablemente a la
secuencia de ácido nucleico que se va a expresar. Dentro de un
vector de expresión recombinante, "unido operablemente"
significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a
la secuencia o secuencias reguladoras de una manera que permita la
expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema
de transcripción/traducción in vitro o en una célula
hospedante cuando el vector se introduce en la célula hospedante).
La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir
promotores, potenciadores y otros elementos de control de la
expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Estas
secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, GENE
EXPRESSION TECHNOLOGY:
METHODS IN ENZYMOLOGY, 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedantes y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células hospedantes (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores, tales como la elección de la célula hospedante que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedantes para producir con ello proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por los ácidos nucleicos descritos en la presente (por ejemplo, polipéptidos quiméricos, formas mutantes del polipéptido quimérico, proteínas de fusión, etc.).
METHODS IN ENZYMOLOGY, 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedantes y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células hospedantes (por ejemplo, secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores, tales como la elección de la célula hospedante que se va a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseado, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedantes para producir con ello proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por los ácidos nucleicos descritos en la presente (por ejemplo, polipéptidos quiméricos, formas mutantes del polipéptido quimérico, proteínas de fusión, etc.).
Los vectores de expresión recombinantes de la
invención pueden diseñarse para la expresión del polipéptido
quimérico en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los
polipéptidos quiméricos pueden expresarse en células bacterianas,
tales como E. coli, células de insecto (utilizando vectores
de expresión de baculovirus), células de levadura, células
vegetales o células de mamífero. Las células hospedantes adecuadas
se analizan más a fondo en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY:
METHODS IN ENZYMOLOGY, 185, Academic Press, San Diego, Calif.
(1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede
transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo, utilizando
las secuencias reguladoras del promotor T7 y la T7 polimerasa. La
expresión de proteínas en procariotas a menudo se realiza en E.
coli con vectores que contienen promotores constitutivos o
inducibles que dirigen la expresión de las proteínas de fusión o de
no fusión. Los vectores de fusión añaden una serie de aminoácidos a
una proteína codificada en ellos, normalmente en el amino terminal
de la proteína recombinante. Estos vectores de fusión de forma
típica cumplen tres propósitos: (1) aumentar la expresión de la
proteína recombinante; (2) aumentar la solubilidad de la proteína
recombinante; y (3) ayudar a la purificación de la proteína
recombinante actuando como ligando en una purificación por afinidad.
A menudo, en vectores de expresión de fusión, se introduce un sitio
de ruptura proteolítica en la unión del dominio de fusión y la
proteína recombinante para permitir la separación de la proteína
recombinante del dominio de fusión después de la purificación de la
proteína de fusión. Estas enzimas y sus secuencias de reconocimiento
cognadas incluyen el factor Xa, la trombina y la enteroquinasa. Los
vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia
Biotech Inc.; Smith y Johnson, Gene, 67: 31-40
(1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5
(Pharmacia, Piscataway, N.J.), que condensan la glutatión
S-transferasa (GST), la proteína de unión a maltosa
E, o la proteína A, respectivamente, con la proteína recombinante
diana.
Los ejemplos de vectores de expresión de E.
coli de no fusión inducibles adecuados incluyen pTrc (Amrann
et al., Gene, 69: 301-315 (1988)) y pET 1ld
(Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN
ENZYMOLOGY, 185, Academic Press, San Diego, Calif.
60-89 (1990)).
Una estrategia para maximizar la expresión de
proteínas recombinantes en E. coli es expresar la proteína
en una bacteria hospedante con una capacidad deteriorada para romper
proteolíticamente la proteína recombinante. Véase, Gottesman, GENE
EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY, 185, Academic Press,
San Diego, Calif. (1990), 119-128. Otra estrategia
es alterar la secuencia del ácido nucleico que se va a insertar en
un vector de expresión, de modo que los codones individuales para
cada aminoácido son los que se emplean de manera preferente en
E. coli (Wada et al., Nucleic Acids Res., 20:
2111-2118 (1992)). Esta alteración de secuencias de
ácidos nucleicos de la invención puede realizarse mediante técnicas
de síntesis de ADN convencionales.
En otra realización, el vector de expresión de
polipéptidos quiméricos es un vector de expresión de levaduras. Los
ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S.
cerevisiae son muy conocidos en la técnica.
Como alternativa, el polipéptido quimérico puede
expresarse en células de insecto utilizando vectores de expresión de
baculovirus.
En otra realización, un ácido nucleico de la
invención se expresa en células de mamífero utilizando un vector de
expresión de mamíferos. Cuando se emplea en células de mamífero, las
funciones de control del vector de expresión a menudo son
proporcionados por elementos reguladores víricos. Por ejemplo, los
promotores que se emplean habitualmente derivan de polioma,
adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros
sistemas de expresión adecuados para células procariotas y
eucariotas, véase, por ejemplo, los capítulos 16 y 17 de Sambrook
et al.,
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
En otra realización, el vector de expresión de
mamífero recombinante es capaz de dirigir la expresión del ácido
nucleico de manera preferente en un tipo celular particular (por
ejemplo, se emplean elementos reguladores específicos de tejido
para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores
específicos de tejido son conocidos en la
técnica.
técnica.
Otro aspecto de la invención se refiere a
células hospedante en las que se ha introducido un vector de
expresión recombinante de la invención. Las expresiones "célula
hospedante" y "célula hospedante recombinante" se emplean
de modo intercambiable en la presente. Se entiende que estos
términos se refieren no sólo a la célula sujeto particular sino
también a la progenie o a la progenie potencial de dicha célula.
Debido a que pueden producirse ciertas
modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutaciones o a
influencias del entorno, esta progenie puede de hecho no ser
idéntica a la célula de origen, pero se incluye en el alcance del
término tal como se emplea en la presente. Además, las células
hospedantes pueden modularse una vez que expresen el polipéptido
quimérico, y pueden mantener o perder sus características
originales.
Una célula hospedante puede ser cualquier célula
procariota o eucariota. Por ejemplo, el polipéptido quimérico puede
expresarse en células bacterianas, tales como E. coli,
células de insecto, células de levadura o de mamífero (tales como
células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Como
alternativa, una célula hospedante puede ser una célula de mamífero
prematura, es decir, una célula pluripotencial. Una célula
hospedante también puede derivarse de otro tejido humano. Otras
células hospedantes adecuadas son conocidas en la técnica.
El ADN del vector puede introducirse en células
procariotas o eucariotas a través de técnicas de transformación,
transducción, infección o transfección convencionales. Tal como se
emplean en la presente, los términos "transformación",
"transducción", "infección" y "transfección"
pretenden indicar una diversidad de técnicas reconocidas en la
técnica para introducir un ácido nucleico extraño (por ejemplo, ADN)
en una célula hospedante, incluyendo la coprecipitación de fosfato
de calcio o cloruro de calcio, la transfección mediada por
DEAE-dextrano, la lipofección o la electroporación.
Además, la transfección puede ser mediada por un agente de
transfección. Un "agente de transfección" pretende incluir
cualquier compuesto que medie en la incorporación de ADN en la
célula hospedante, por ejemplo, un liposoma. Los métodos adecuados
para transformar o transfectar células hospedantes pueden
encontrarse en Sambrook et al. (MOLECULAR CLONING: A
LABORATORY MANUAL, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), y
otros manuales de laboratorio.
La transfección puede ser "estable" (es
decir, la integración del ADN extraño en el genoma del hospedante) o
"transitoria" (es decir, el ADN se expresa episómicamente en
las células hospedantes).
Para la transfección estable de células de
mamífero se sabe que, dependiendo del vector de expresión y de la
técnica de transfección utilizados, sólo una pequeña fracción de
células puede integrar el ADN extraño en su genoma, quedando el
resto del ADN episómico. Para identificar y seleccionar estos
integrantes, en general se introduce un gen que codifica un
marcador seleccionable (por ejemplo, la resistencia a antibióticos)
en las células hospedantes, junto con el gen de interés. Diversos
marcadores seleccionables incluyen los que confieren resistencia a
fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. El ácido
nucleico que codifica un marcador seleccionable puede introducirse
en una célula hospedante sobre el mismo vector que el ácido nucleico
codificador, o puede introducirse sobre un vector distinto. Las
células transfectadas de modo estable con el ácido nucleico
introducido pueden identificarse mediante selección de fármacos (por
ejemplo, las células que tengan incorporado el gen del marcador
seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células
morirán).
La figura 1 muestra la inmunodetección de la
proteína RAS-p21 en extractos celulares
MCF7-RAS utilizando el anticuerpo Y13259,
DPV3-Y13259 o un anticuerpo IgG de rata no
específico, como anticuerpos primarios, y un anticuerpo
anti-rata-HRP como anticuerpo
secundario para la inmunodetección. Los datos mostrados son
representativos de tres experimentos independientes.
\newpage
La figura 2 muestra el transporte intracelular
de Y13259 solo o conjugado con DPV3 o DPV15b. Se incubaron células
de cáncer humano HCT 116 con 50 \mug/ml del anticuerpo
DPV3-Y13259, DPV15b-Y13259 o Y13259
durante 4 horas a 37ºC y después se fijaron en metanol/acetona antes
de la tinción de inmunofluorescencia. La inmunotinción del
anticuerpo Y13259 se realizó utilizando un anticuerpo
anti-rata-TRITC. (a) Células no
tratadas (como control negativo), (b) células tratadas con Y13259,
(c) con DPV3-Y13259 o (d) con
DPV15b-Y13259; una tinción DAPI (e, f, g, h) muestra
núcleos para cada una de las citadas condiciones.
La figura 3 muestra experimentos de
inmunoprecipitación realizados en células MCF7-RAS
que demuestran el transporte intracelular del anticuerpo Y13259
activo por DPV3. Las células se incubaron con 50 \mug/ml de IgG de
rata como anticuerpo no específico, Y13259 o
DPV3-Y13259 durante 4 horas a 37ºC. Los lisados de
proteína totales se inmunoprecipitaron con proteína
G-Sepharose, se cargaron en una
SDS-PAGE y se inmunotranfirieron con el anticuerpo
pan RAS. Los datos mostrados son representativos de tres
experimentos independientes.
La figura 4 muestra el efecto inhibidor de
DPV3-Y13259 sobre la proliferación de células HCT
116 K-RAS^{mt}. Las células se incubaron durante 120 horas
con el anticuerpo solo (Y13259, 700 nM) o con el conjugado de
DPV3-Y13259 (700 nM), con
DPV3-maleimida como control interno
(DPV3-mal, 700 nM). Se emplearon inmunoglobulinas
anti-peroxidasa IgG1 no relevantes (IgG PO, 700 nM)
y un inhibidor de la RAS farnesiltransferasa
(FTI-276, 100 nM) como controles internos. Los
resultados se expresan como la media \pm EEM de tres experimentos
independientes realizados por duplicado. * p < 0,05 frente a
células no tratadas.
La figura 5 muestra la carencia de efecto de
DPV3-Y13259 sobre la proliferación de células
HT-29 RAS de tipo salvaje. Las células se incubaron
durante 72 horas con el anticuerpo solo (Y13259, 700 nM) o conjugado
con DPV3 (conjugado de DPV3-Y13259, 700 nM), con
DPV3-maleimida como control interno (700 nM). Los
resultados se expresan como la media \pm EEM de dos experimentos
independientes realizados por duplicado.
La figura 6 demuestra que
DVP3-Y13259 puede potenciar la apoptosis inducida
por Taxol® en células HCT 116 (RAS activada) pero no en células
HT-29 (RAS de tipo salvaje). Las células se
expusieron a concentraciones crecientes de Taxol® durante 4 horas,
seguido de la retirada del medio y de una incubación durante 72
horas más; el DPV3-Y13259 se combinó con Taxol®
siguiendo diferentes protocolos. (A) Las células HCT 116 se
incubaron con Taxol® durante 4 horas antes de añadir
DPV3-Y13259 durante 72 horas más. (B) Se añadió
DPV3-Y13259 a las células HCT 116 cultivadas 24
horas antes de una corta incubación con Taxol® (4 horas). El medio
se retiró y las células se volvieron a incubar con
DPV3-Y13259. No se observó efecto cuando HCT 116 se
incubaron con DPV3-Y13259 y Taxol® durante 4 horas
(C), así como cuando las células HT-29 RAS de tipo
salvaje se trataron con Taxol® durante 4 horas, seguido de la
retirada del medio y de una incubación durante 72 horas más (D). Los
datos muestran la media \pm EEM de 3 experimentos
independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Otras ventajas y características de la invención
surgirán de los siguientes ejemplos que hacen referencia a las
anteriores figuras. Los ejemplos se ofrecen para ilustrar la
invención pero no limitan el alcance de las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
- Y13259: el anticuerpo monoclonal de rata
anti-RAS (isotipo IgG1; Hamer et al.,
Hybridoma, 9, 573-587 (1990)) se obtuvo a partir de
la producción de clones de hibridoma Y13259 (Serotec) (linfocitos B;
ATCC nº CRL-1742). PM = 150 kDa.
- IgG de rata normal (Santa Cruz, nº
sc-2026): se emplea como control negativo para
aplicaciones de transferencia Western e inmunoprecipitación.
- Péptidos que penetran en células:
- \bullet
- DPV3 (SEQ ID NO:2) que contiene además una cisteína (Cys) en la posición C-terminal de la secuencia de aminoácidos,
- \bullet
- DPV15b (SEQ ID NO:12) que contiene además una cisteína (Cys) en la posición N-terminal de la secuencia de aminoácidos.
- DPV3-Y13259 y
DPV15b-Y13259: las conjugaciones del péptido que
penetra en células DPV3 o del péptido que penetra en células DPV15b
a Y13259 se realizaron de modo químico (véase el ejemplo
I-3-a). Se unieron entre dos y tres
péptidos que penetran en células por IgG. PM = 150 kDa.
- DPV3-maleimida y
DPV15b-maleimida: un grupo maleimida se ha conjugado
con la cisteína terminal de DPV3 y DPV15b.
- FTI-276 (Calbiochem, nº
344550): un peptidomimético selectivo y muy potente del carboxilo
terminal de proteínas RAS. Inhibidor de la farnesiltransferasa
(FTasa) in vitro (PM = 433,6). Se ha demostrado que bloquea
el crecimiento de un carcinoma de pulmón humano que expresa
K-RAS en ratones atímicos.
- Anticuerpo pan RAS IgG2b monoclonal de ratón
(clon F132 de Santa Cruz, nº sc-32): reconoce todas
las formas de RAS mutadas. Se emplea para el estudio de
inmunoprecipitación.
- IgG anti-rata de burro
purificado por afinidad conjugado con rodamina (TRITC) (TEBU, nº
712-025-150): se emplea para la
inmunocitoquímica.
- IgG anti-rata purificado por
afinidad conjugado con peroxidasa (TEBU, nº
612-1302): utilizado para la inmunodetección
mediante transferencia Western y como control negativo para los
ensayos de viabilidad celular.
- Proteína G-Sepharose
(Amersham, nº 17061801): para aplicaciones de
inmunoprecipitación.
- Taxol®/paclitaxel
(Hauser-Lab): PM = 853,92 g/mol. Disolución madre en
Cremophore al 20%, conservado a temperatura ambiente.
- HCT 116: células epiteliales de carcinoma de
colon humano, expresan Ki-RAS mutada. Origen: ATCC,
nº CRL-247. Las células se cultivaron en medio 5a de
Mc Coy + L-glutamina 1,5 mM + FCS al 10%.
- MCF7-RAS: células epiteliales
de carcinoma de mama humano, transfectadas con
v-H-RAS. Origen: G. Perret (Bobigny,
Francia). Las células se cultivaron en DMEM + FCS al 10% +
L-glutamina 1,5 mM.
- HT-29: células epiteliales
humanas de adenocarcinoma de colon humano, expresan RAS de tipo
salvaje. Origen: ATCC, nº HTB-38. Las células se
cultivaron en medio 5a de Mc Coy + FCS al 10% +
L-glutamina 1,5 mM.
\vskip1.000000\baselineskip
Se empleó una estrategia de conjugación en dos
etapas para la conjugación química de un CPP (por ejemplo, DPV3 y
DPV15b) a un anticuerpo. La primera etapa fue la activación del
anticuerpo con el reactivo de entrecruzamiento heterobifuncional
4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato
de succinimidilo (SMCC). Este conector heterobifuncional reacciona
con la amina de la lisina disponibles del anticuerpo. Después de la
eliminación del exceso de reactivo de entrecruzamiento mediante
diafiltración (Visapin®, límite de exclusión 3000 daltons) se añadió
entonces el CPP, y su función tiol (cisteína N- o
C-terminal) reacciona con el resto maleimida del
SMCC. Los conjugados entrecruzados se analizaron mediante
SDS-PAGE (al 12%)-tinción con azul
de Coomassie R-250 y MALDI-TOF.
Los ejemplos de acoplamiento entre un CPP y un
anticuerpo pueden encontrarse en las solicitudes de patente PCT nº
WO 01/64738 y WO 05/016960.
\vskip1.000000\baselineskip
Se empleó una estrategia de conjugación en una
etapa para la conjugación química de la maleimida al CPP, para
generar un CPP control (por ejemplo, DPV3-maleimida
y DPV15b-maleimida). Esta conjugación se realizó en
DMF con un exceso de maleimida y enmascara las funciones tiol
accesibles sobre el CPP. Después de 30 min de incubación, el exceso
de maleimida se retiró mediante 3 extracciones con
agua/diclorometano. El conjugado (en la capa acuosa) después se
liofilizó.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cargaron proteínas (50 \mug de los lisados
celulares totales en tampón RIPA suplementado con inhibidores de
proteasas) sobre una SDS-PAGE según Laemmli, y se
electrotransfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. Las
proteínas inmunorreactivas se detectaron después de una
inmunotransferencia con anticuerpos Y13259 o
DPV3-Y13259 (50 \mug/ml).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células se incubaron con 50 \mug/ml de IgG
de rata normal (control negativo) o Y13259 no conjugado, o
conjugado de DPV3-Y13259 durante 4 horas a 37ºC,
después se tripsinizó (para eliminar el material unido a la
superficie celular), se lisó, se incubó con proteína
G-Sepharose, se trasladó a una membrana de PVDF
(poli(difluoruro de vinilideno)) y se transfirió con
pan-RAS monoclonal de ratón.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células en medio de cultivo completo se
incubaron durante 4 horas a 37ºC con conjugados de
CPP-Y13259 o anticuerpo Y-13259 no
conjugado a 50 \mug/ml, después se enjuagó en tampón fosfato y se
fijó en metanol/acetona durante 5 min, y se permeabilizó en tampón
fosfato que contenía Triton X100 al 0,25% y BSA al 1%. Las células
se marcaron con anticuerpo
anti-rata-TRITC y se contratiñeron
con DAPI
(4',6-diamidino-2-fenilindol).
Las células se montaron en disolución anti-pérdida
de señal clara SlowFade con DAPI y se analizaron mediante
microscopía de fluorescencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron HCT 116 y HT-29 a 8
x 10^{3} células/pocillo (placas de 96 pocillos) en medio + FCS
(suero de ternera fetal) al 0,5% y al 10%, respectivamente. Al día
siguiente, las células se trataron con concentraciones crecientes
de compuestos de ensayo en medio completo (+ FCS al 10%), y las
células se contaron a lo largo del tiempo a las 24 h, 48 h, 72 h y
120 h utilizando el método WST-1, descrito a
continuación. El medio se retiró y se añadieron 100 \mul de medio
fresco sin FCS suplementado con disolución de WST-1
al 10% sobre las células durante 2 h a 37ºC, CO_{2} al 5%. Se
realizaron las mediciones de A_{450 nm}-A_{690 \
nm} (blanco = 0 células) para determinar los números celulares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron ensayos de viabilidad sobre
células adherentes como sigue: se sembraron células en placas de 96
pocillos 24 horas antes del tratamiento. Para definir el mejor
programa para la combinación de dos fármacos, se ensayó una
exposición simultánea o secuencial. Según los efectos biológicos
esperados y los datos de eficacia clínica, toxicidad y
farmacodinámica que ya estaban disponibles, se utilizó un tiempo de
exposición corto para Taxol® y un tiempo de exposición largo para
DVP3-Y13259, en 4 programas de combinación
diferentes, como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo nº 1: Programa secuencial
Las células se expusieron a Taxol® o vehículo
durante 4 h, se lavaron y posteriormente se incubaron en medio que
contenía DPV3-Y13259 durante 72 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo nº 2: Programa secuencial
inverso
Las células se trataron con
DPV3-Y13259 o vehículo durante 24 h. Después, las
células se expusieron a Taxol® durante 4 h y después se lavaron,
seguido de un tratamiento con DPV3-Y13259 continuado
hasta 72 h.
\vskip1.000000\baselineskip
Protocolo nº 3: Combinación continua, tiempo
corto
Las células se colocaron en un medio que
contenía Taxol® y DPV3-Y13259 o vehículo, y se
incubaron durante 4 h, exponiendo a las células a ambos agentes de
modo continuo.
Las células se trataron según los diferentes
protocolos. Entonces se analizó la viabilidad celular utilizando el
ensayo WST-1 y se estimaron los valores de IC_{50}
(concentración molar que inhibe 50% de la viabilidad celular) a
partir de la regresión sigmoidal, utilizando el programa informático
Graph Pad Prism 3.02.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos se muestran como la media \pm error
estándar de la media (EEM) de n observaciones diferenciadas. Las
comparaciones estadísticas se analizaron mediante ANOVA, seguido de
un ensayo post hoc de Tukey. En todos los casos, un valor
umbral de p < 0,05 se consideró como nivel mínimo de
significancia. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando
el programa informático Graph Pad Prism 3.02 y CalcuSyn para el
análisis del efecto de la dosis.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos sinergia y antagonismo se emplean
con frecuencia de diferentes maneras para describir el efecto de
combinar dos o más fármacos en distintas líneas celulares, ratones
que portan tumores o en una clínica. En experimentos de cultivos
celulares, la sinergia y el antagonismo se refieren a una inhibición
del crecimiento/citotoxicidad que es mayor o menor que la predicha
de una acción de un fármaco independiente, respectivamente. Esto
surge cuando un fármaco modula la actividad de un segundo fármaco,
por ejemplo, afectando a la captación del fármaco, el metabolismo,
la distribución de las fases del ciclo celular, la inhibición de la
diana/vía o cambiando el umbral para la apoptosis. La adición es el
resultado de dos o más fármacos que actúan independientemente,
contribuyendo ambos por igual a la actividad. Diversos modelos
matemáticos están disponibles, incluyendo isobologramas, modelos de
respuesta de superficie y el análisis del efecto de la mediana de
Chou y Talalay. Los efectos de un tratamiento con múltiples
fármacos sobre la viabilidad celular se analizan según el método por
ordenador de Chou y Talalay (Adv. Enzyme Regul., 22,
27-55 (1984)). El intervalo del índice de
combinación (CI) y los símbolos se definen a partir de los
descritos previamente por Chou. CI < 1, = 1 y > 1 indican
sinergia, efecto aditivo y antagonismo, respectivamente. Véase la
tabla 2 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio es internalizar el
anticuerpo anti-RAS Y13259 utilizando un péptido que
penetra en células para dirigir, de modo específico, la
señalización de la RAS mutada. Se trataron diferentes líneas
celulares con Y13259 unido químicamente a un CPP que permite la
penetración de la membrana celular para determinar si los
conjugados de CPP-anticuerpo
anti-RAS pueden bloquear de modo selectivo el
crecimiento de células de cáncer transformadas con RAS.
\vskip1.000000\baselineskip
Para comprobar que la conjugación de CPP no
modifica la afinidad de Y13259 por RAS se realizó un análisis de la
transferencia Western con extractos celulares totales procedentes de
MCF7-RAS. Se comparó la unión de
DPV3-Y13259 a RAS con la del anticuerpo libre. Tal
como se muestra en la figura 1, el conjugado de
DPV3-Y13259 es capaz de reconocer su RAS diana.
\vskip1.000000\baselineskip
Se incuban DPV3-Y13259 y
DPV15b-Y13259 en células HCT 116 durante 4 horas a
37ºC. Tal como se muestra en la figura 2, el DPV3 permite la
internalización de IgG en el citoplasma (figura 2c y 2g). Estudios
previos han indicado que DPV3 y DPV15b unidos a IgG
anti-peroxidasa se localizan en el citoplasma o en
el núcleo, respectivamente. Sin embargo, los conjugados de
DPV15b-Y13259 también se localizan en el citoplasma
(figura 2d y 2h). Estos datos demuestran que la afinidad del
anticuerpo anti-RAS por su diana citoplásmica es
determinante para el sitio de acumulación del conjugado de CPP.
\vskip1.000000\baselineskip
La internalización con Y13259,
DPV3-Y13259 e IgG de rata se realizó en células
MCF7-RAS durante 4 horas; las células se
recolectaron con tripsina (esta etapa retira el
CPP-anticuerpo unido a la superficie) y se lisa en
tampón RIPA para un análisis de RAS mediante transferencia Western.
Tal como se muestra en la figura 3, DPV3-Y13259 se
internaliza y es capaz de inmunoprecipitar la proteína RAS, mientras
que el Y13259 desnudo o la IgG no relevante no pueden, lo cual
sugiere que DPV3 permite el transporte intracelular de un anticuerpo
activo completo. La unión de DPV3-Y13259 a RAS
puede producirse durante la etapa de internalización (lo cual
demuestra que el conjugado se fue a la fracción del citosol).
\vskip1.000000\baselineskip
Los conjugados de CPP-Y13259 se
ensayaron en un ensayo de proliferación celular en líneas celulares
que expresan RAS mutada y RAS de tipo salvaje (HCT 116 y
HT-29, respectivamente). FTI-276, un
inhibidor de la farnesiltransferasa que inhibe la proliferación
celular mediada por RAS, constituye el control positivo. Para HCT
116, las células se trataron con concentraciones crecientes de
conjugados de CPP (hasta 700 nM) en medio completo (FCS al 10%) de 0
a 120 h.
Tal como se muestra en la figura 4,
FTI-276 inhibe la proliferación de células HCT 116;
su efecto dura al menos 120 horas. Tal como sugieren los estudios
de internalización e inmunoprecipitación, las IgG de ratas (Y13259
o anti-peroxidasa) no fueron capaces de atravesar la
membrana por sí mismas y no pudo detectarse un efecto inhibidor
sobre la velocidad de crecimiento. Y13259 y
CPP-maleimida no mostraron un efecto inhibidor
sobre la proliferación de células HCT 116, mientras que los
conjugados de CPP-Y13259 infrarregularon la
proliferación celular. Este efecto se observó a las 72 horas
después de la exposición al fármaco y duró al menos 120 horas
(tiempo máximo ensayado). De manera interesante, el conjugado de
Y13259 que está unido a un CP "citoplásmico" (DVP3) (De
Coupade et al., Biochem J. (2005)) produjo una mejor
inhibición que el unido a un CPP "nuclear" (DPV15b) (De
Coupade et al., Biochem J. (2005)) (figura 4). Las
concentraciones eficaces para DPV3-Y13259 variaron
de 85 a 700 nM, mientras que las concentraciones menores no
produjeron efecto (los datos no se muestran).
Se observó una falta de actividad de
DPV3-Y13259 en células que expresan RAS de tipo
salvaje después de 72 horas de exposición continua (figura 5). Este
resultado demuestra la especificidad de acción del anticuerpo
transportado. En este experimento no se ensayó DPV15b puesto que es
menos activo que DPV3 en el modelo de HCT 116.
\vskip1.000000\baselineskip
Este estudio demostró que un péptido que penetra
en células (por ejemplo, DPV3 o DPV15) puede transportar
intracelularmente un anticuerpo completo (150 kDa) sin alterar sus
propiedades bioquímicas (afinidad o localización celular). En
términos de actividad biológica, los conjugados de
CPP-Y13259 redujeron la velocidad de crecimiento
del cáncer de mamífero que implica a células RAS mutadas pero no a
sus homólogas (de tipo salvaje). Cuando se conjuga con Y13259, el
péptido DPV3, del cual se indica que es un péptido que penetra en
células muy eficaz para el transporte citoplásmico de un
cargamento, produjo un mayor efecto inhibidor que DPV15b.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio es investigar aún
más la influencia de dos entidades, DPV3-Y13259 y
Taxol®, por separado y en combinación, sobre la proliferación de
células de cáncer. La base para combinar dos o más agentes
terapéuticos es lograr dosis menores de fármaco, reducir la
toxicidad y minimizar o retrasar la aparición de resistencia por
las células diana, e identificar un efecto sinérgico potencial. El
objetivo fue investigar 1) el potencial de
DPV3-Y13259 para potenciar la citotoxicidad de
agentes antitumorales basados en Taxol®, y 2) cuáles son los mejores
programas de combinación posibles.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 6 presenta los resultados obtenidos
con diferentes concentraciones de DPV3-Y13259 en
combinación con Taxol®. Tal como se describe en la sección de
materiales y métodos, se ensayaron 3 protocolos.
Los datos de viabilidad celular obtenidos en
presencia de Taxol® indican que un tratamiento combinado con
DPV3-Y13259 induce una disminución dependiente de la
dosis en la viabilidad de células HCT 116 para los protocolos 1 y 2
(figuras 6A y 6B). Se sabe que Taxol® rompe el equilibrio entre la
tubulina fresca y los microtúbulos, provocando la estabilización de
microtúbulos en el citoplasma. Por tanto, un tratamiento con Taxol®
antes de una incubación con DPV3-Y13259 puede
afectar a la endocitosis del conjugado de CPP. Sin embargo, no se
observaron diferencias significativas entre el protocolo 1 y 2. No
se observó efecto de DPV3-Y13259 sobre la
citotoxicidad de Taxol® para el protocolo 3 (figura 6C). Esta falta
de efecto puede ser debida al corto tiempo de incubación con
DPV3-Y13259.
Tal como se esperaba, no se observo efecto de
DPV3-Y13259 sobre la proliferación de células
HT-29, que expresan la proteína RAS de tipo salvaje,
con el protocolo 1 (figura 6D).
\vskip1.000000\baselineskip
Se empleó el análisis del efecto de múltiples
fármacos de Chou y Talalay, que se basa en el principio del efecto
de la mediana (Chou y Talalay, Adv. Enzyme Regul., 22: p.
27-55 (1984); Chou et al., J. Natl. Cancer
Inst., 86(20): p. 1517-1524 (1994)) para
estudiar la naturaleza de la interacción observada entre
DPV3-Y13259 y Taxol®. Para determinar si el efecto
aumentado sobre la viabilidad celular observado después de un
tratamiento combinatorio de células HCT 116 con
DPV3-Y13259 y Taxol®, en comparación con un
tratamiento separado, se corresponde con efectos aditivos o
sinérgicos, se realizó un análisis detallado de los efectos de
múltiples fármacos según el método de Chou y Talalay. Los
parámetros del efecto de la dosis CI calculados se ofrecen en la
tabla 3 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Según el análisis de Chou y Talalay,
DPV3-Y13259 y Taxol® sinergizan para inducir una
menor viabilidad celular en células HCT 116. El efecto sinérgico es
especialmente notable a dosificaciones bajas de Taxol®, y es
independiente del programa de tratamiento. El índice de combinación
es entre 0,1 y 0,85 para la concentración más baja de Taxol®. Para
la concentración más fuerte de Taxol®, mayor que 1,2 \muM, el
índice de combinación es mayor que 1 con el protocolo 2. El efecto
sinérgico es notable a una concentración menor de Taxol® (< 1,2
\muM), en especial con el protocolo 2.
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DPV3-Y13259 combinado con Taxol®
induce citotoxicidad de una manera sinérgica en células de cáncer de
colon. Transferido a los estudios in vivo, la combinación de
DPV3-Y13259 con Taxol® puede permitir una reducción
en la dosis de Taxol®. En resumen, estos datos demuestran que
DPV3-Y13259 puede combinarse de manera provechosa
con otros fármacos citotóxicos, tales como paclitaxel.
\vskip1.000000\baselineskip
El objetivo de este estudio propuesto es ensayar
la eficacia de DPV3-Y13259 en combinación con una
dosis subóptima de paclitaxel en el modelo de xenoinjerto de
carcinoma de colon HCT 116 en ratones atímicos. Los expertos en la
técnica pueden determinar con facilidad la dosis subóptima de
paclitaxel. El solicitante ha descubierto que era de 5 mg/kg tras un
programa de administración de Q7D1x3W (administración
intravenosa).
Agentes terapéuticos: Y13259,
DPVW-Y13259 y paclitaxel (PTX).
Animales: raza de ratones atímicos nu/nu
NMRI-nude.
Modelo tumoral: el modelo de carcinoma de colon
HCT 116 puede seleccionarse porque esta línea celular expresa una
forma activada constitutiva del oncogén ras:
K-ras.
Inducción del tumor: las células se descongelan
en un matraz de 75 cm^{2} y se amplifican. Después de la
amplificación, las células se suspenden en medio DMEM (1 x 10^{7}
células/100 \mul). Los tumores HCT 116 se establecen mediante la
inyección intradérmica de 100 \mul de la suspensión celular en el
flanco derecho de ratones utilizando jeringas Terumo de 1 ml con
agujas 26G1/2-0,45 x 12 mm (Polylabo) siguiendo el
procedimiento FD 31/10/01 V1.
Disoluciones de DPV3-Y13259,
Y13259 y paclitaxel: el conjugado de DPV3-Y13259 e
Y13259 solo se diluyen en PBS, NaCl 0,3 M, para administrar la dosis
adecuada. Se diluyó paclitaxel de calidad clínica en NaCl al 0,9%
para administrar la dosis adecuada.
Los ratones se trataron mediante una inyección
intravenosa en embolada, siguiendo un programa Q3D2x3W (2
inyecciones semanales durante 3 semanas) o Q7D1x3W (1 inyección
semanal durante 3 semanas). Las inyecciones se realizan cuando los
tumores alcanzan un tamaño de aproximadamente 100 mm^{3}. Las
dosis de DPV3-Y13259 se expresan en mg equivalentes
de Y13259 por kg. Los grupos son:
Se controla el peso corporal, el volumen tumoral
y los parámetros de supervivencia 3 veces a la semana. Los
volúmenes tumorales se determinan a partir de mediciones con
calibrador, [longitud x (anchura)^{2}/2]. Cada ratón
individual se sacrifica cuando su tumor alcanza aproximadamente 1500
mm^{3} o si el animal muestra señales de sentir dolor, tales como
encorvamiento, convulsiones, pérdida del 25% de peso corporal
durante 2 mediciones consecutivas, o pérdida del 30% de peso
corporal en una medición. Todos estos parámetros se indican. La
mortalidad de los animales se registra cada día excepto en fin de
semana.
El valor tratado/control (T/C) es la proporción
entre el volumen medio tumoral de los animales tratados y el volumen
medio tumoral de animales control, expresado como porcentaje.
El análisis estadístico del crecimiento tumoral
y los parámetros de supervivencia (ensayos de Dunnett y LogRank,
respectivamente) se evalúan cada semana utilizando el programa
informático GraphPad prism 3.02.
<110> DIATOS S.A.
\hskip1cmDE COUPADE, Catherine
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA
SUMINISTRAR ANTICUERPOS ANTI-RAS ACTIVADA
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 46408/PCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/IB2007/001546
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2007-06-08
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP 06290952.8
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2006-06-12
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido que penetra en células
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
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<210> 2
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<223> péptido que penetra en células
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<400> 44
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<210> 45
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> péptido que penetra en células
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<400> 45
\hskip1cm
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<210> 46
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> péptido que penetra en células
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<400> 46
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<210> 47
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<211> 34
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> péptido que penetra en células
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<400> 47
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<210> 48
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<211> 26
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> péptido que penetra en células
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<400> 48
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Claims (19)
1. Un polipéptido quimérico que se
caracteriza porque dicho polipéptido comprende un primer
dominio y un segundo dominio, en los que:
- el primer dominio comprende una secuencia de
aminoácidos que facilita el transporte activo a través de una
membrana biológica mediante la unión a un glicosaminoglicano que se
selecciona del grupo que consiste en a) (XBBBXXBX)n; b)
(XBBXBX)n; c) (BBXmBBXp)n; d) (XBBXXBX)n; e)
(BXmBB)n; f) (BmXX)n; o g) un fragmento de anticuerpo,
en el que cada B es independientemente un aminoácido básico,
preferiblemente lisina o arginina; cada X es independientemente un
aminoácido no básico, preferiblemente un aminoácido hidrófobo; cada
m es independientemente un número entero de cero a cinco; cada n es
independientemente un número entero entre uno y diez; y cada p es
independientemente un número entero entre cero y cinco; y
- el segundo dominio comprende un anticuerpo
neutralizante anti-RAS activada, su fragmento o su
derivado, que se une de modo específico a un epitopo sobre la
proteína RAS activada.
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2. El polipéptido quimérico según la
reivindicación 1, en el que el primer dominio comprende una
secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a través
de una membrana biológica, que tiene una longitud de más de 4
aminoácidos, preferiblemente más de 6 aminoácidos, y lo más
preferiblemente más de 13 aminoácidos.
3. El polipéptido quimérico según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el primer dominio comprende
una secuencia de aminoácidos que facilita el transporte activo a
través de una membrana biológica, que tiene una longitud menor que
500 aminoácidos, preferiblemente menor que 35 aminoácidos, y lo más
preferiblemente menor que 25 aminoácidos.
4. El polipéptido quimérico según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada X es
independientemente alanina, ácido glutámico, isoleucina, leucina,
metionina, fenilalanina, serina, triptófano, valina, tirosina o
citrulina.
5. El polipéptido quimérico según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el primer dominio comprende
una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende
SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ
ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ
ID NO:12.
6. El polipéptido quimérico según la
reivindicación 1, en el que el primer dominio comprende la secuencia
de aminoácidos (BmXX)n, en la que B es cualquier aminoácido
básico, X es cualquier aminoácido no básico, cada m es
independientemente un número entero entre 1 y 10, y cada n es
independientemente un número entero entre 1 y 4.
7. El polipéptido quimérico según la
reivindicación 6, en el que el primer dominio comprende la secuencia
de aminoácidos BBBBBBXXBBBBBBXX, en la que B es independientemente
un aminoácido básico, y X es independientemente un aminoácido no
básico.
8. El polipéptido quimérico según la
reivindicación 7, en el que X se selecciona del grupo que comprende
ácido glutámico y serina.
9. El polipéptido quimérico según la
reivindicación 8, en el que el primer dominio comprende SEQ ID
NO:2.
10. El polipéptido quimérico según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el
anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su
fragmento o su derivado tienen la capacidad de unirse a una proteína
RAS activada, dando como resultado la inhibición de la actividad
biológica de dicha proteína RAS activada.
11. El polipéptido quimérico según la
reivindicación 10, en el que el anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada, su fragmento o su derivado se
selecciona del grupo que comprende un anticuerpo monoclonal de rata
Y13259 (producido mediante el clon de hibridoma originado de ATCC,
nº CRL-1742), sus fragmentos y sus derivados.
12. El polipéptido quimérico según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína
RAS activada se selecciona del grupo que comprende
H-RAS, N-RAS, K-RAS
A y K-RAS B.
13. El polipéptido quimérico según una
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el
anticuerpo neutralizante anti-RAS activada, su
fragmento o su derivado se conjuga en el N- o
C-terminal del primer dominio.
14. El polipéptido quimérico según la
reivindicación 13, en el que el anticuerpo neutralizante
anti-RAS activada, su fragmento o su derivado se
conjuga con el primer dominio a través de un conector.
15. El polipéptido quimérico según la
reivindicación 14, en el que el conector es
4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1-carboxilato
de succinimidilo (SMCC) o N-maleimidobutilamina.
16. El polipéptido quimérico según una
cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que ambos dominios
se condensan mediante modificación genética.
17. Un polinucleótido que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido según la
reivindicación 16.
18. Una composición que comprende un polipéptido
quimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o un
polinucleótido según la reivindicación 17, y opcionalmente un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
19. Un uso de un polipéptido quimérico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o un polinucleótido según
la reivindicación 17, para la fabricación de un medicamento para
tratar el cáncer.
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