ES2949982T3 - Inhibidores peptídicos permeables en células de la ruta de transducción de señales de JNK para el tratamiento de la cistitis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de inhibidores de la proteína quinasa y más específicamente al uso de inhibidores de la proteína quinasa c-Jun amino terminal quinasa, secuencias inhibidoras de JNK, péptidos quiméricos o de ácidos nucleicos que codifican los mismos, así como a composiciones farmacéuticas que los contienen. , para el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos fuertemente relacionados con la señalización JNK. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores peptídicos permeables en células de la ruta de transducción de señales de JNK para el tratamiento de la cistitis

La presente invención se refiere a inhibidores de proteína cinasa y más específicamente a los inhibidores de la proteína cinasa amino terminal C-Jun, a péptidos quiméricos para su uso en el tratamiento de diversas enfermedades o trastornos novedosos fuertemente relacionados con la señalización de JNK, en los que la enfermedad o el trastorno es cistitis.

La cinasa amino terminal C-Jun (JNK) es un miembro del grupo de proteína cinasas activadas por mitógeno (MAP) activado por estrés. Se ha implicado a estas cinasas en el control del crecimiento y la diferenciación celulares y, más generalmente, en la respuesta de células a estímulos ambientales. La ruta de transducción de señales de JNK se activa en respuesta a estrés ambiental y por la implicación de varias clases de receptores de superficie celular. Estos receptores pueden incluir receptores de citocinas, receptores de serpentina y tirosina cinasas receptoras. En células de mamífero, se ha implicado a JNK en procesos biológicos tales como transformación oncogénica y mediación de respuestas adaptativas al estrés ambiental. También se ha asociado JNK con la modulación de respuestas inmunitarias, incluidas la maturación y diferenciación de células inmunitarias, así como con la realización de muerte celular programada en células identificadas para su destrucción por el sistema inmunitario. Esta propiedad única hace que la señalización de JNK sea una diana prometedora para desarrollar intervenciones farmacológicas. Entre varios trastornos neurológicos, la señalización de JNK está particularmente implicada en accidente cerebrovascular isquémico y enfermedad de Parkinson, pero también en otras enfermedades tal como se menciona adicionalmente a continuación. Además, se demostró que la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) p38alfa regula negativamente la proliferación celular antagonizando la ruta de JNK-cJun. La proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) p38alfa, por tanto, parece ser activa en la supresión de la proliferación de células normales y cancerosas y, además, demuestra la implicación de JNK en enfermedades de cáncer (véase, por ejemplo, Hui et al., Nature Genetics, vol. 39, n.° 6, junio de 2007). También se demostró que cinasa N-terminal c-Jun (JNK) está implicada en el dolor neuropático producido por ligadura del nervio espinal (SNL), en la que la SNL indujo una activación lenta y persistente de JNK, en particular JNK1, mientras que se encontró activación de la proteína cinasa activada por mitógeno p38 en la microglía espinal después de la SNL, que había caído hasta un nivel casi basal a los 21 días (Zhuang et al., The Journal of Neuroscience, 29 de marzo de 2006, 26(13):3551-3560)).

La inhibición o interrupción de la ruta de señalización de JNK, particularmente la provisión de inhibidores de la ruta de señalización de JNK, parece por tanto ser un enfoque prometedor para combatir trastornos fuertemente relacionados con la señalización de JNK. Sin embargo, hasta la fecha solo se conocen unos pocos inhibidores de la ruta de señalización de JNK.

Los inhibidores de la ruta de señalización de JNK ya conocidos en la técnica anterior incluyen particularmente, por ejemplo, inhibidores de cinasas aguas arriba (por ejemplo, CEP-1347), inhibidores químicos pequeños de JNK (SP600125 y AS601245), que afectan directamente a la actividad cinasa, por ejemplo, compitiendo con el sitio de unión a ATP de la proteína cinasa, e inhibidores peptídicos de la interacción entre JNK y sus sustratos (D-JNKI e I-JIP) (véase, por ejemplo, Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, febrero de 2005, vol. 4, n.° 1, págs. 63-67(5)).

El inhibidor de cinasa aguas arriba CEP-1347 (KT7515) es un inhibidor semisintético de la familia de cinasas de linaje mixto. CEP-1347 (KT7515) promueve la supervivencia neuronal a dosificaciones que inhiben la activación de las cinasas amino terminal c-Jun (JNK) en cultivos embrionarios primarios y células PC12 diferenciadas después de la retirada trófica y en ratones tratados con 1 -metil-4-feniltetrahidropiridina. Además, CEP-1347 (KT7515) puede promover la supervivencia a largo plazo de neuronas embrionarias de pollo motoras, ciliares, simpáticas y del ganglio de la raíz dorsal cultivadas (véase, por ejemplo, Borasio et al., Neuroreport. 9(7): 1435-1439, 11 de mayo de 1998).

Se encontró que el inhibidor químico pequeño de JNK SP600125 reduce los niveles de fosforilación de c-Jun, protegiendo las neuronas dopaminérgicas de la apoptosis, y restaurando parcialmente el nivel de dopamina en EP inducida por MPTP en ratones C57BL/6N (Wang et al., Neurosci Res. Febrero de 2004; 48(2); 195-202). Estos resultados indican además que la ruta de JNK es el principal mediador de los efectos neurotóxicos de MPTP in vivo y la inhibición de la actividad de JNK puede representar una estrategia nueva y eficaz para tratar la EP.

Un ejemplo adicional de inhibidores químicos pequeños es el inhibidor de JNK anteriormente mencionado AS601245. AS601245 inhibe la ruta de señalización de JNK y promueve la supervivencia celular después de la isquemia cerebral. In vivo, AS601245 proporcionó una protección significativa frente a la pérdida retardada de neuronas CA1 del hipocampo en un modelo de jerbo de isquemia global transitoria. Este efecto está mediada por la inhibición de JNK y, por tanto, por la expresión y fosforilación de c-Jun (véase, por ejemplo, Carboni et al., J Pharmacol Exp Ther. Julio de 2004; 310(1):25-32. Epub 26 de febrero de 2004).

Una tercera clase de inhibidores de la ruta de señalización de JNK representan inhibidores peptídicos de la interacción entre JNK y sus sustratos, tal como se mencionó anteriormente. Como punto de partida para la construcción de tales inhibidores peptídicos de JNK, puede usarse una alineación de secuencias de proteínas JNK que se producen de manera natural. Normalmente, estas proteínas comprenden dominios de unión a JNK (JBD) y aparecen en diversas proteínas de unión a insulina (IB), tales como IB1 o IB2. Los resultados de una alineación de secuencias a modo de ejemplo de este tipo son, por ejemplo, una alineación de secuencias entre los dominios de unión a JNK de IB1 [SEQ ID NO: 13], IB2 [SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] y ATF2 [SEQ ID NO: 16] (véanse, por ejemplo, las figuras 1A-1C). Una alineación de este tipo revela una secuencia de 8 aminoácidos parcialmente conservada (véase, por ejemplo, la figura 1A). Una comparación de los JBD de IB1 e IB2 revela además dos bloques de siete y tres aminoácidos que están sumamente conservados entre las dos secuencias.

Se dan a conocer secuencias construida basándose en una alineación de este tipo, por ejemplo, en el documento WO 01/27268 o en el documento WO 2007/031280. Los documentos WO 2007/031280 y WO 01/27268 dan a conocer péptidos de fusión permeables de molécula pequeña, que comprenden una denominada secuencia de permeación celular TAT derivada de la secuencia de tráfico básica de la proteína TAT de VIH y una secuencia inhibidora de 20 aminoácidos mínima de IB1. Ambos componentes se unen covalentemente entre sí. Inhibidores a modo de ejemplo (y, en la actualidad, los únicos) de la ruta de señalización de MAPK-JNK dados a conocer en ambos documentos WO 2007/031280 y WO 01/27268 son, por ejemplo, L-JNKI1 (péptido inhibidor de JNK compuesto por L aminoácidos) o los péptidos D-JNKI1 resistentes a proteasas (péptido inhibidor de JNK compuesto por D aminoácidos no nativos). Estos péptidos inhibidores de JNK (JNKI) son específicos para JNK (JNK1, JNK₂ y JNK3). En contraposición a los inhibidores de compuestos pequeños comentados anteriormente, las secuencias inhibidoras en el documento WO 2007/031280 o WO 01/27268, por ejemplo JNKI1, más bien inhiben la interacción entre JNK y su sustrato. Mediante su secuencia de tráfico derivada de TAT, el péptido de fusión se transporta eficazmente al interior de las células. Debido a las propiedades novedosas obtenidas por el componente de tráfico, los péptidos de fusión se transportan de manera activa al interior de las células, donde siguen siendo eficaces hasta la degradación proteolítica.

Sin embargo, los péptidos según el documento WO 2007/031280 o WO 01/27268 solo han demostrado ser activos en un número particularmente limitado de enfermedades, particularmente enfermedades de proliferación celular no malignas o relacionadas con el sistema inmunológico.

Por tanto, un objeto de la presente invención es identificar enfermedades adicionales, que puedan combatirse con péptidos inhibidores de JNK. Otro objeto de la presente invención es proporcionar nuevos péptidos inhibidores de JNK y derivados de los mismos para su uso en el tratamiento y/o la prevención de esas enfermedades y de enfermedades que aún no o que ya se sabe que están fuertemente relacionadas con la señalización de JNK.

Este objeto se soluciona mediante un péptido quimérico inhibidor de JNK que comprende al menos un primer dominio y al menos un segundo dominio unidos por un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico, y comprendiendo el segundo dominio una secuencia inhibidora de JNK tal como se define en SEQ ID NO: 11, para su uso en el tratamiento y/o la prevención de diversas enfermedades inflamatorias o no inflamatorias fuertemente relacionadas con la señalización de JNK en un sujeto mediante administración intravesical, en el que las enfermedades o trastornos se seleccionan de:

cistitis en general, en particular cistitis intersticial.

Las cinasas N-terminales C-Jun (JNK) son serina-treonina proteína cinasas, codificadas por tres genes JNK1, JNK₂ y JNK3, expresadas como diez isoformas diferentes por corte y empalme alternativo de ARNm, expresándose cada isoforma como una forma corta (46 kDa) y una forma larga (54 kDa) (Davis, 2000, Cell 103: 239-52). Mientras que JNK1 y JNK₂ son ubicuas, JNK3 se expresa principalmente en el cerebro (Kyriakis y Avruch, 2001, Physiol Rev 81: 807-69). Las JNK se activan por fosforilación (pJNK) a través de la activación de MAPcinasa por estímulos extracelulares, tales como estrés ultravioleta, citocinas y péptidos AB y tienen múltiples funciones que incluyen regulación de la expresión génica, proliferación celular y apoptosis (Dhanasekaran y Reddy, 2008, Oncogene 27: 6245-51).

La presente invención es adecuada para su uso en el tratamiento de enfermedades que dan como resultado pérdida de la función de la vejiga. Tales enfermedades se seleccionan de cistitis en general, en particular cistitis intersticial. Normalmente, una secuencia inhibidora de JNK tal como se definió anteriormente puede derivarse de una secuencia de IB1 humana o de rata, preferiblemente de una secuencia de aminoácidos tal como se define o se codifica por cualquiera de las secuencias según SEQ ID NO: 102 (representa la secuencia de ADNc de IB1 de rata y su secuencia de aminoácidos predicha), SEQ ID NO: 103 (representa la secuencia de proteína IB1 de rata codificada por el límite exón-intrón del donador de corte y empalme del gen RIB1), SEQ ID NO: 104 (representa la secuencia de proteína IB1 de Homo sapiens) o SEQ ID NO: 105 (representa la secuencia de ADNc de ⁱB1 de Homo sapiens), más preferiblemente de una secuencia de aminoácidos tal como se define o se codifica por cualquiera de las secuencias según SEQ ID NO: 104 (representa la secuencia de proteína IB1 de Homo sapiens), o SEQ ID NO: 105 (representa la secuencia de ADNc de lB1 de Homo sapiens), o de cualquier fragmento o variante de las mismas. En otras palabras, la secuencia inhibidora de JNK comprende un fragmento, variante o variante de tal fragmento de una secuencia de IB1 humana o de rata. Las secuencias de IB humanas o de rata se definen o se codifican, respectivamente, por las secuencias según SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104 o SEQ ID NO: 105.

Según una realización particular, una secuencia inhibidora de JNK tal como se usa en el presente documento normalmente se une a JNK y/o inhibe la activación de al menos un factor de transcripción activado por JNK, por ejemplo c-Jun o ATF2 (véanse, por ejemplo, SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente) o Elk1.

La secuencia inhibidora de JNK tal como se usa en el presente documento comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2.

Las secuencias inhibidoras de JNK tal como se usan en el presente documento se componen en parte o exclusivamente por D-aminoácidos tal como se definió anteriormente. Más preferiblemente, estas secuencias inhibidoras de ^j N^k compuestas por D-aminoácidos son secuencias retroinversas D no nativas de las secuencias inhibidoras de JNK anteriores (nativas). El término “secuencias retroinversas” se refiere a un isómero de una secuencia peptídica lineal en la que la dirección de la secuencia se revierte y la quiralidad de cada residuo de aminoácido se invierte (véase, por ejemplo, Jameson et al., Nature, 368,744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994)). La ventaja de combinar enantiómeros D y síntesis inversa es que las posiciones de los grupos carbonilo y amino en cada enlace amida se intercambian, mientras que la posición de los grupos de cadena lateral en cada carbono alfa se conserva. A menos que se establezca específicamente lo contrario, se supone que cualquier secuencia de L-aminoácidos dada o péptido descrito puede convertirse en un péptido o secuencia retroinversa D sintetizando un inverso de la secuencia o péptido para el péptido o secuencia de L-aminoácidos nativa correspondiente.

Las secuencias retroinversas D tal como se usan en el presente documento y tal como se definieron anteriormente tienen una variedad de propiedades útiles. Por ejemplo, las secuencias retroinversas D tal como se usan en el presente documento entran en las células tan eficazmente como las secuencias de L-aminoácidos usadas en el presente documento, mientras que las secuencias retroinversas D usadas en el presente documento son más estables que las correspondientes secuencias de L-aminoácidos.

Por consiguiente, las secuencias inhibidoras de JNK tal como se usan en el presente documento comprenden una secuencia retroinversa D según la secuencia de aminoácidos NH²-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH (D-IB1(s)) [SEQ ID NO: 2].

La secuencia inhibidora de JNK tal como se usa en el presente documento (SEQ ID NO: 2) y las secuencias inhibidoras de JNK dadas a conocer anteriormente (SEQ ⁱD NO: 1, 3-4, 13-20 y 33-100) se presentan en la tabla 1. La tabla presenta el nombre las secuencias inhibidoras de JNK, así como su número de identificador de secuencia, su longitud y secuencia de aminoácidos. Además, la tabla 1 muestra secuencias así como sus fórmulas genéricas, por ejemplo para SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 9 y 11 (según la invención) y SEQ ID NO: 3, 4, 7, 8, 10 y 12, respectivamente. La tabla 1 además da a conocer las secuencias quiméricas SEQ ID NO: 9-12 y 23-32 (véase a continuación), las secuencias de L-IB1 SEQ ID NO: 33 a 66 y las secuencias de D-IB1 SEQ ID NO: 67 a 100.

Tabla 1

En el contexto anterior, una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia “que comparte una identidad de secuencia” de al menos, por ejemplo, el 95 % con una secuencia de aminoácidos de consulta de la presente invención, pretende significar que la secuencia de la secuencia de aminoácidos sujeto es idéntica a la secuencia de consulta excepto porque la secuencia de aminoácidos sujeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. En otras palabras, para obtener una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de al menos el 95 % de identidad con una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta el 5 % (5 de 100) de los residuos de aminoácido en la secuencia sujeto pueden insertarse o sustituirse por otro aminoácido o delecionarse.

Para secuencias sin correspondencia exacta, un “% de identidad” de una primera secuencia puede determinarse con respecto a una segunda secuencia. En general, estas dos secuencias que van a compararse se alinean para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir insertar “huecos” en o bien una o bien ambas secuencias, para potenciar el grado de alineación. Entonces puede determinarse un % de identidad a lo largo de la longitud completa de cada una de las secuencias que están comparándose (denominada alineación global), que es particularmente adecuado para secuencias de la misma o similar longitud, o a lo largo de longitudes definidas más cortas (denominada alineación local), que es más adecuadas para secuencias de longitud desigual.

En la técnica se conocen bien métodos para comparar la identidad y homología de dos o más secuencias, particularmente tal como se describe en el presente documento. Por tanto, por ejemplo, pueden usarse los programas disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res. 12, 387-395), por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, para determinar el % de identidad entre dos polinucleótidos y el % de identidad y el % de homología entre dos secuencias de polipéptido. BESTFIT usa el algoritmo de “homología local” de (Smith y Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197) y encuentra la mejor región individual de similitud entre dos secuencias. También se conocen en la técnica otros programas para determinar la identidad y/o similitud entre secuencias, por ejemplo la familia BLAST de programas (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410), accesible a través de la página de inicio del NCBI en el sitio web ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson y Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444­ 2448.).

Las secuencias inhibidoras de JNK tal como se usan según la presente invención y tal como se definieron anteriormente pueden obtenerse o producirse mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante síntesis química o mediante métodos de ingeniería genética comentados a continuación. Por ejemplo, un péptido correspondiente a una porción de una secuencia inhibidora de JNK tal como se usa en el presente documento que incluye una región deseada de dicha secuencia inhibidora de JNK, o que media en la actividad deseada in vitro o in vivo, puede sintetizarse mediante el uso de un sintetizador de péptidos.

La secuencia inhibidora de JNK tal como se usa en el presente documento y tal como se definió anteriormente, puede modificarse además mediante una secuencia de tráfico, que permite que la secuencia inhibidora de JNK tal como se usa en el presente documento y tal como se definió anteriormente se transporte eficazmente al interior de las células. Tal secuencia inhibidora de JNK modificada se proporciona y se usa preferiblemente como secuencias quiméricas.

La presente invención, por tanto, proporciona un péptido quimérico que incluye al menos un primer dominio y al menos un segundo dominio, para su uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos fuertemente relacionados con la señalización de JNK tal como se definió anteriormente en un sujeto, en el que el primer dominio del péptido quimérico comprende una secuencia de tráfico, mientras que el segundo dominio del péptido quimérico comprende una secuencia inhibidora de JNK según SEQ ID NO: 2.

Como primer dominio, el péptido quimérico tal como se usa en el presente documento comprende una secuencia de tráfico, que normalmente se selecciona de cualquier secuencia de aminoácidos que dirige un péptido (en el que está presente) a un destino celular deseado. Por tanto, la secuencia de tráfico, tal como se usa en el presente documento, normalmente dirige el péptido a través de la membrana plásmática, por ejemplo desde el exterior de la célula, a través de la membrana plásmática y dentro del citoplasma. Alternativamente, o además, la secuencia de tráfico puede dirigir el péptido a una ubicación deseada dentro de la célula, por ejemplo el núcleo, el ribosoma, el retículo endoplasmático (ER), un lisosoma o peroxisoma, por ejemplo, combinando dos componentes (por ejemplo, un componente para la permeabilidad celular y un componente para la ubicación nuclear) o mediante un solo componente que tiene, por ejemplo, propiedades de transporte por la membrana celular y dirigido, por ejemplo, al transporte intranuclear. La secuencia de tráfico puede comprender adicionalmente otro componente, que es capaz de unirse a un componente citoplasmático o cualquier otro componente o compartimento de la célula (por ejemplo, retículo endoplasmático, mitocondrias, aparato de oscuridad, vesículas lisosómicas). Por consiguiente, por ejemplo la secuencia de tráfico del primer dominio y la secuencia inhibidora de JNK del segundo dominio pueden estar localizadas en el citoplasma o cualquier otro compartimento de la célula. Esto permite determinar la localización de del péptido quimérico en la célula tras la captación.

La secuencia de tráfico del péptido quimérico tal como se usa en el presente documento puede estar compuesta exclusivamente por D-aminoácidos. Más preferiblemente, la secuencia de tráfico del péptido quimérico tal como se usa en el presente documento puede comprender un péptido retroinverso D de las secuencias tal como se presentó anteriormente.

La secuencia de tráfico del primer dominio del péptido quimérico tal como se describe en el presente documento puede obtenerse de fuentes que se producen de manera natural o puede producirse usando técnicas de ingeniería genética o síntesis química (véase, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual. 2a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Pueden emplearse fuentes para la secuencia de tráfico del primer dominio que incluyen, por ejemplo proteínas nativas tales como por ejemplo la proteína TAT (por ejemplo tal como se describe en las patentes estadounidenses n.^os 5.804.604 y 5.674.980, incorporándose cada una de estas referencias en el presente documento por referencia), VP22 (descrita en, por ejemplo, el documento WO 97/05265; Elliott y O'Hare, Cell 88: 223-233 (1997)), proteínas no virales (Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10691-10695 (1992)), secuencias de tráfico derivadas de Antennapedia (por ejemplo, la secuencia portadora de antennapedia) o de péptidos básicos, por ejemplo péptidos que tienen una longitud de 5 a 15 aminoácidos, preferiblemente de 10 a 12 aminoácidos y que comprenden al menos el 80 %, más preferiblemente el 85 % o incluso el 90 % de aminoácidos básicos, tales como por ejemplo arginina, lisina y/o histidina. Además, se dan a conocer con el presente documento variantes, fragmentos y derivados de una de las proteínas nativas usadas como secuencias de tráfico. Con respecto a variantes, fragmentos y derivados, se hace referencia a la definición proporcionada anteriormente para secuencias inhibidoras de JNK tal como se describe en el presente documento. Se definen correspondientemente variantes, fragmentos así como derivados tal como se expuso anteriormente para secuencias inhibidoras de JNK tal como se describe en el presente documento. Particularmente, en el contexto de la secuencia de tráfico, una variante o fragmento o derivado puede definirse como una secuencia que comparte una identidad de secuencia con una de las proteínas nativas usadas como secuencias de tráfico tal como se definió anteriormente de al menos aproximadamente el 30 %, el 50 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 95 %, el 98 % o incluso el 99 %.

En un péptido quimérico tal como se describe en el presente documento, la secuencia de tráfico del primer dominio comprende o consiste en una secuencia derivada de la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 1, particularmente algunos o todos los 86 aminoácidos que constituyen la proteína TAT.

Para una secuencia de tráfico (que se incluye en el primer dominio del péptido quimérico tal como se usa en el presente documento), pueden usarse secuencias parciales de la proteína TAT de longitud completa formando un fragmento funcionalmente eficaz de una proteína TAT, es decir un péptido de TAT que incluye la región que media en la entrada y captación dentro de las células. En cuanto a si una secuencia de este tipo es un fragmento funcionalmente eficaz de la proteína TAT, puede determinarse usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86: 7397-7401 (1989)). Por tanto, la secuencia de tráfico en el primer dominio del péptido quimérico tal como se usa en el presente documento puede derivarse de un fragmento o porción funcionalmente eficaz de una secuencia de proteína TAT que comprende menos de 86 aminoácidos, y que presenta captación dentro de las células, y opcionalmente captación dentro del núcleo celular. Más preferiblemente, se pretende que las secuencias parciales (fragmentos) de TAT que van a usarse como portador para mediar en la permeación del péptido quimérico a través de la membrana celular comprendan la región básica (aminoácidos 48 a 57 o 49 a 57) de ^tA^t de longitud completa.

La secuencia de tráfico tal como se usa en el presente documento comprende la secuencia retroinversa D NH²-RRRQRRKKRG-COOH (D-TAT) [SEQ ID NO: 6].

Como segundo dominio, el péptido quimérico tal como se describe en el presente documento normalmente comprende una secuencia inhibidora de JNK, seleccionada de cualquiera de las secuencias inhibidoras de JNK tal como se definieron anteriormente, incluidos variantes, fragmentos y/o derivados de estas secuencias inhibidoras de JNK.

Ambos dominios, es decir, los dominios primero y segundo, del péptido quimérico tal como se usa en el presente documento, pueden unirse tal como para formar una unidad funcional. Puede aplicarse cualquier método para unir los dominios primero y segundo tal como se conoce generalmente en la técnica.

Los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se usa en el presente documento se unen mediante un enlace covalente. Un enlace covalente, tal como se define en el presente documento, puede ser, por ejemplo, un enlace peptídico, que puede obtenerse expresando el péptido quimérico tal como se definió anteriormente como una proteína de fusión. Las proteínas de fusión, tal como se describe en el presente documento, pueden formarse y usarse de modos análogos a o fácilmente adaptables a partir de técnicas de ADN recombinante convencionales, tal como se describe a continuación. Sin embargo, ambos dominios pueden unirse también por medio de cadenas laterales o pueden unirse mediante un resto ligador químico.

Los dominios primero y segundo pueden unirse entre sí por medio de una secuencia de ligador que comprende de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 5 aminoácidos. Los aminoácidos que forman la secuencia de ligador se seleccionan preferiblemente de glicina o prolina como residuos de aminoácido. Más preferiblemente, los dominios primero y segundo pueden estar separados entre sí por una bisagra de dos, tres o más residuos de prolina entre los dominios primero y segundo.

El péptido quimérico tal como se usa en el presente documento consiste en péptidos quiméricos de D-aminoácidos según el péptido TAT-IB1 NH²-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH (D-TAT-IB1(s)) [SEQ ID NO: 11].

Los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se definió anteriormente pueden unirse entre sí mediante acoplamiento químico o bioquímico llevado a cabo de cualquier manera adecuada conocida en la técnica, por ejemplo, estableciendo un enlace peptídico entre los dominios primero y segundo, por ejemplo, expresando los dominios primero y segundo como una proteína de fusión, o por ejemplo reticulando los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se definió anteriormente.

Muchos métodos conocidos adecuados para la reticulación química de los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se definió anteriormente no son específicos, es decir, no dirigen el punto de acoplamiento a ningún sitio particular en el polipéptido de transporte o la macromolécula de carga. Como resultado, el uso de agentes de reticulación no específicos puede atacar sitios funcionales o bloquear estéricamente sitios activos, haciendo que las proteínas conjugadas sean biológicamente inactivas. Por tanto, preferiblemente, se usan métodos de reticulación tales que permitan un acoplamiento más específico de los dominios primero y segundo.

En este contexto, un modo de aumentar la especificidad de acoplamiento es un acoplamiento químico directo a un grupo funcional presente solo una vez o unas pocas veces en uno o ambos de los dominios primero y segundo que van a reticularse. Por ejemplo, la cisteína, que es el único aminoácido proteico que contiene un grupo tiol, aparece en muchas proteínas solo unas pocas veces. Además, por ejemplo, si un polipéptido no contiene residuos de lisina, un reactivo de reticulación específico para aminas primarias será selectivo para el extremo amino terminal de ese polipéptido. La utilización satisfactoria de este enfoque para aumentar la especificidad de acoplamiento requiere que el polipéptido tenga los residuos reactivos y poco comunes en zonas de la molécula que pueden alterarse sin pérdida de la actividad biológica de la molécula. Los residuos de cisteína residuos pueden reemplazarse cuando aparecen en partes de una secuencia de polipéptido donde su participación en una reacción de reticulación interferiría probablemente por lo demás con la actividad biológica.

Cuando se reemplaza un residuo de cisteína, normalmente es deseable minimizar los cambios resultantes en el plagamiento del polipéptido. Los cambios en el plegamiento del polipéptido se minimizan cuando el reemplazo es química y estéricamente similar a la cisteína. Por estos motivos, se prefiere serina como reemplazo para la cisteína. Tal como se demuestra en los ejemplos más adelante, puede introducirse un residuo de cisteína en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para fines de reticulación. Cuando se introduce un residuo de cisteína, se prefiere la introducción en o cerca del extremo amino o carboxilo terminal. Están disponibles métodos convencionales para tales modificaciones de secuencias de aminoácidos, en los que el polipéptido de interés se produce mediante síntesis química o por medio de expresión de ADN recombinante.

El acoplamiento de los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se definió anteriormente y se usa en el presente documento puede lograrse también por medio de un agente de acoplamiento o conjugación. Hay varios reactivos de reticulación intermolecular que pueden utilizarse (véase, por ejemplo, Means y Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day, 1974, págs. 39-43). Entre estos reactivos se encuentran, por ejemplo, 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) o N,N'-(1,3-fenilen)bismaleimida (ambos de los cuales son altamente específicos para grupos sulfhidrilo y forman uniones irreversibles); N,N'-etilen-bis-(yodoacetamida) u otros reactivo de este tipo que tenga puentes de metileno de 6 a 11 carbonos (que son relativamente específicos para grupos sulfhidrilo); y 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno (que forma uniones irreversibles con grupos amino y tirosina). Otros reactivos de reticulación útiles para este fin incluyen: p,p'-difluoro-m,m'-dinitrodifenilsulfona que forma reticulaciones irreversibles con grupos amino y fenólicos); adipimidato de dimetilo (que es específico para grupos amino); fenol-1,4-disulfonilcloride (que reacciona principalmente con grupos amino); hexametilendiisocianato o diisotiocianato, o azofenil-p-diisocianate (que reacciona principalmente con grupos amino); glutaraldehído (que reacciona con varias cadenas laterales diferentes) y disdiazobencidina (que reacciona principalmente con tirosina e histidina).

Los reactivos de reticulación usados para reticular los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se definió anteriormente pueden ser homobifuncionales, es decir, tener dos grupos funcionales que experimentan la misma reacción. Un reactivo de reticulación homobifuncional preferido es bismaleimidohexano (“BMH”). BMH contiene dos grupos funcionales maleimida, que reaccionan específicamente con compuestos que contiene sulfhidrilo en condiciones suaves (pH 6,5-7,7). Los dos grupos maleimida están conectados por una cadena de hidrocarburo. Por tanto, BMH es útil para la reticulación irreversible de polipéptidos que contienen residuos de cisteína.

Los reactivos de reticulación usados para reticular los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se definió anteriormente pueden ser también heterobifuncionales. Los agentes de reticulación heterobifuncionales tienen dos grupos funcionales diferentes, por ejemplo un grupo reactivo con amina y un grupo reactivo con tiol, que reticularán dos proteínas que tienen aminas y tioles libres, respectivamente. Ejemplos de agentes de reticulación heterobifuncionales son 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (“SMCC”), éster de mmaleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (“MBS”) y 4-(p-maleimidofenil)butirato de succinimida (“SMPB”), un análogo de cadena extendida de MBS. El grupo succinimidilo de estos agentes de reticulación reacciona con una amina primaria, y la maleimida reactiva con tiol forma un enlace covalente con el tiol de un residuo de cisteína.

Los reactivos de reticulación adecuados para reticular los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se definió anteriormente tienen una baja solubilidad en agua. Por tanto, puede añadirse un resto hidrófilo, tal como un grupo sulfonato, al reactivo de reticulación para mejorar su solubilidad en agua. En este sentido, sulfo-MBS y sulfo-SMCC son ejemplos de reactivos de reticulación modificados para la solubilidad en agua, que pueden usarse según la presente invención.

Asimismo, muchos reactivos de reticulación producen un conjugado que es esencialmente no escindible en condiciones celulares. Sin embargo, algunos reactivos de reticulación particularmente adecuados para reticular los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se definió anteriormente contienen un enlace covalente, tal como un disulfuro, que es escindible en condiciones celulares. Por ejemplo, reactivo de Traut, ditiobis(succinimidilpropionato) (“DSP”) y 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (“SPDP”) son agentes de reticulación escindibles bien conocidos. El uso de un reactivo de reticulación escindible permite que el resto de carga se separe del polipéptido de transporte tras su suministro a la célula diana. Un enlace disulfuro directo puede ser también útil.

Numerosos reactivos de reticulación, incluidos los comentados anteriormente, están comercialmente disponibles. Están fácilmente disponibles instrucciones detalladas para su uso de los proveedores comerciales. Una referencia general sobre la reticulación de proteínas y la preparación de conjugados es: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press (1991).

La reticulación química de los dominios primero y segundo del péptido quimérico tal como se definió anteriormente puede incluir el uso de brazos espaciadores. Los brazos espaciadores proporcionan flexibilidad intramolecular o ajustan las distancias intramoleculares entre restos conjugados y, de ese modo, pueden ayudar a conservar la actividad biológica. Un brazo espaciador puede estar en forma de un resto de polipéptido que incluye aminoácidos espaciadores, por ejemplo prolina. Alternativamente, un brazo espaciador puede formar parte del reactivo de reticulación, tal como en “SPDP de cadena larga” (Pierce Chem. Co., Rockford, IL., n.° de cat. 21651 H).

Cualquiera de los péptidos dados a conocer en el presente documento, en particular el inhibidor de JNK, la secuencia de tráfico y el péptido quimérico tal como se dan a conocer en el presente documento, preferiblemente el inhibidor de JNK según SEQ ID NO: 11, puede tener una modificación en uno o ambos de sus extremos terminales, es decir, o bien en el extremo C-terminal o bien en el extremo N-terminal o en ambos. El extremo C-terminal puede modificarse preferiblemente mediante una modificación de amida, mientras que el extremo N-terminal puede modificarse mediante cualquier grupo de protección de NH₂ adecuado, tal como por ejemplo acilación. Más preferiblemente, el inhibidor de ^j N^k y el péptido quimérico tal como se dan en el presente documento, preferiblemente el inhibidor de JNK según SEQ ID NO: 11, se modifica mediante una modificación de amida en el extremo C-terminal.

Cualquiera de los péptidos dados a conocer en el presente documento, en particular el inhibidor de JNK, la secuencia de tráfico (por ejemplo, del péptido quimérico) y el péptido quimérico tal como se dan a conocer en el presente documento, preferiblemente el inhibidor de JNK según s Eq ID NO: 11, pueden delecionarse en su extremo N- y/o C-terminal en 1, 2 o 3 aminoácidos. Por ejemplo, en un péptido quimérico, cada dominio, es decir el dominio de inhibidor de JNK y la secuencia de tráfico, puede delecionarse en su extremo N- y/o C-terminal en 1, 2 o 3 aminoácidos y/o el péptido quimérico puede delecionarse en su extremo N- y/o C-terminal en 1, 2 o 3 aminoácidos. De nuevo, cuanto más cortos son los péptidos, menor es su toxicidad celular (inespecífica). Sin embargo, los péptidos deben conservar su función biológica, es decir, su permeabilidad por la membrana celular (primer dominio) y su función inhibidora de JNK (segundo dominio).

Además, en el presente documento se describen variantes, fragmentos o derivados de uno de los péptidos quiméricos dados a conocer anteriormente. Con respecto a los fragmentos y variantes, se hace referencia generalmente a la definición dada anteriormente para secuencias inhibidoras de JNK.

Particularmente, una “variante de un péptido quimérico” es preferiblemente una secuencia derivada de cualquiera de las secuencias según SEQ ID NO: 9 a 12 y 23 a 32, en la que la variante quimérica comprende alteraciones de aminoácidos de los péptidos quiméricos según SEQ ID NO: 9 a 12 y 23 a 32 tal como se usa en el presente documento. Tales alteraciones normalmente comprenden de 1 a 20, preferiblemente de 1 a 10 y más preferiblemente de 1 a 5 sustituciones, adiciones y/o deleciones (que conducen a fragmentos) de aminoácidos según SEQ ID NO: 9 a 12 y 23 a 32, en las que el péptido quimérico alterado tal como se describe en el presente documento presenta una identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias según SEQ ID NO: 9-12 y 23 a 32 de al menos aproximadamente el 30 %, el 50 %, el 70 %, el 80 % o el 95 %, el 98 % o incluso el 99 %. Preferiblemente, están variantes conservan la actividad biológica del primer y el segundo dominio contenidos en el péptido quimérico, es decir, la actividad de tráfico del primer dominio tal como se dio a conocer anteriormente y la actividad del segundo dominio para unirse a JNK y/o inhibir la activación de al menos un factor de transcripción activado por JNK.

Por tanto, en el contexto de la presente invención, un “fragmento del péptido quimérico” es preferiblemente una secuencia derivada de cualquiera de las secuencias según SEQ ID NO: 9 a 12 y 23 a 32, en el que el fragmento comprende al menos 4 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO: 9 a 12 y 23 a 32. Este fragmento comprende preferiblemente una longitud que es suficiente para permitir el reconocimiento específico de un epítopo de cualquiera de estas secuencias y para transportar la secuencia al interior de las células, el núcleo o una ubicación preferida adicional. Incluso más preferiblemente, el fragmento comprende de 4 a 18, de 4 a 15, o lo más preferiblemente de 4 a 10 aminoácidos contiguos de cualquiera de SEQ ID NO: 9 a 12 y 23 a 32. Los fragmentos del péptido quimérico tal como se describe en el presente documento pueden definirse además como una secuencia que comparte una identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias según cualquiera de SEQ ID NO: 9 a 12 y 23 a 32 de al menos aproximadamente el 30 %, el 50 %, el 70 %, el 80 % o el 95 %, el 98 % o incluso el 99 %.

Los péptidos quiméricos tal como se definen según la invención pueden formularse en una composición farmacéutica, que puede aplicarse en la prevención o el tratamiento de cualquiera de las enfermedades definidas en el presente documento, particularmente en la prevención o el tratamiento de enfermedades o trastornos fuertemente relacionados con la señalización de JNK tal como se define en el presente documento. Una composición farmacéutica de este tipo usada según la presente invención incluye como componente activo (i) péptidos quiméricos según SEQ ID NO: 11 según la invención.

Según una realización preferida, una composición farmacéutica de este tipo según la presente invención comprende normalmente una cantidad segura y eficaz de un componente según la invención, de al menos un péptido quimérico según SEQ ID NO: 11. Una composición farmacéutica según la presente invención comprende como componente activo un péptido quimérico que consiste en la secuencia según ^s E^q ID NO: 11.

Además, la composición farmacéutica tal como se usa según la presente invención puede comprender también adicionalmente, es decir, además de uno cualquiera o más de los péptidos quiméricos según la invención, opcionalmente un “componente activo” adicional, que también es útil en la respectiva enfermedad. En este contexto, la composición farmacéutica según la presente invención puede combinarse también en la terapia de las enfermedades según la presente invención con una composición farmacéutica adicional que comprende un “componente activo” adicional. En el caso de una terapia de combinación, se prefieren composiciones farmacéuticas separadas para los componentes activos que van a combinarse para una mejor dosificación individual, sin embargo, por conveniencia, también puede concebirse una única composición farmacéutica que comprende los componentes activos que van a combinarse. En el caso de composiciones farmacéuticas separadas para los componentes activos que van a combinarse, la administración del inhibidor de JNK según la presente invención puede ser antes, durante (administración concomitante o solapante) o después de la administración del otro componente activo comprendido en una composición farmacéutica separada. La administración “antes” de la administración del inhibidor de JNK significa preferiblemente en el plazo de 24 h, más preferiblemente en el plazo de 12 h, incluso más preferiblemente en el plazo de 3 h, de manera particularmente preferible en el plazo de 1 h y lo más preferiblemente en el plazo de 30 min antes de que comience la administración del inhibidor de JNK. La administración “después” de la administración del inhibidor de JNK significa preferiblemente en el plazo de 24 h, más preferiblemente en el plazo de 12 h, incluso más preferiblemente en el plazo de 3 h, de manera particularmente preferible en el plazo de 1 h y lo más preferiblemente en el plazo de 30 min después de que termine la administración del inhibidor de JNK.

Los inventores de la presente invención encontraron adicionalmente que el péptido quimérico, tal como se define en el presente documento, presenta una buena tasa de captación particular en las células implicadas en las enfermedades de la presente invención. Por tanto, la cantidad de un péptido quimérico, en la composición farmacéutica que va a administrarse a un sujeto, puede tener, sin limitarse a la misma, una dosis muy baja. Por tanto, la dosis puede ser mucho más baja que para fármacos peptídicos conocidos en la técnica, tales como DTS-108 (Florence Meyer-Losic et al., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53). Esto tiene varios aspectos positivos, por ejemplo una reducción de posibles reacciones secundarias y una reducción de costes.

Preferiblemente, la dosis (por kg de peso corporal) está en el intervalo de hasta 10 mmol/kg, preferiblemente hasta 1 mmol/kg, más preferiblemente hasta 100 μmol/kg, incluso más preferiblemente hasta 10 μmol/kg, incluso más preferiblemente hasta 1 μmol/kg, incluso más preferiblemente hasta 100 nmol/kg, lo más preferiblemente hasta 50 nmol/kg.

Por tanto, el intervalo de dosis puede ser preferiblemente de desde aproximadamente 0,01 μmol/kg hasta aproximadamente 1 mmol/kg, desde aproximadamente 0,1 μmol/kg hasta aproximadamente 0,1 mmol/kg, desde aproximadamente 1,0 μmol/kg hasta aproximadamente 0,01 mmol/kg, desde aproximadamente 10 μmol/kg hasta aproximadamente 1 μmol/kg, desde aproximadamente 50 μmol/kg hasta aproximadamente 500 nmol/kg, desde aproximadamente 100 μmol/kg hasta aproximadamente 300 nmol/kg, desde aproximadamente 200 μmol/kg hasta aproximadamente 100 nmol/kg, desde aproximadamente 300 μmol/kg hasta aproximadamente 50 nmol/kg, desde aproximadamente 500 μmol/kg hasta aproximadamente 30 nmol/kg, desde aproximadamente 250 μmol/kg hasta aproximadamente 5 nmol/kg, desde aproximadamente 750 μmol/kg hasta aproximadamente 10 nmol/kg, desde aproximadamente 1 nmol/kg hasta aproximadamente 50 nmol/kg, o una combinación de dos cualesquiera de dichos valores.

En este contexto, la prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación, etc., cuando se usa la composición farmacéutica anterior, normalmente son responsabilidad de los profesionales médicos generales y otros doctores en medicina, y normalmente tienen en cuenta el trastorno que va a tratarse, el estado del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los profesionales sanitarios. En Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. (ed), 1980, pueden encontrarse ejemplos de las técnicas y los protocolos mencionados anteriormente. Por consiguiente, una “cantidad segura y eficaz” tal como se definió anteriormente para componentes de las composiciones farmacéuticas tal como se usan según la presente invención significa una cantidad de cada uno o todos estos componentes, que es suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de enfermedades o trastornos fuertemente relacionados con la señalización de JNK tal como se define en el presente documento. Al mismo tiempo, sin embargo, una “cantidad segura y eficaz” es lo suficientemente pequeña como para evitar efectos secundarios graves, es decir, para permitir una relación sensata entre ventaja y riesgo. La determinación de estos límites normalmente se encuentra dentro del alcance del juicio médico sensato. Una “cantidad segura y eficaz” de un componente de este tipo variará en relación con la afección particular que va a tratarse y también con la edad y la condición física del paciente que va a tratarse, la gravedad de la afección, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia acompañante, del portador farmacéuticamente aceptable particular usado y factores similares, dentro del conocimiento y la experiencia del médico acompañante. Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden usarse según la invención para fines médicos humanos y también veterinarios.

La composición farmacéutica según la presente invención puede comprender además, además de una de estas sustancias, un portador, excipiente, tampón, estabilizador u otros materiales farmacéuticamente aceptables (compatibles) bien conocidos por los expertos en la materia.

En este contexto, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable (compatible)” incluye preferiblemente la base líquida o no líquida de la composición. El término “compatible” significa que los constituyentes de la composición farmacéutica tal como se usan en el presente documento pueden mezclarse con el componente farmacéuticamente activo tal como se definió anteriormente y con otro componente de tal manera que no se produce ninguna interacción que reduzca sustancialmente la eficacia farmacéutica de la composición en las condiciones habituales de uso. Los portadores farmacéuticamente aceptables, por supuesto, deben tener una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja para que sean adecuados para la administración a una persona que va a tratarse.

Si la composición farmacéutica tal como se usa en el presente documento se proporciona en forma líquida, el portador farmacéuticamente aceptable normalmente comprenderá uno o más portadores líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles). La composición puede comprender como portadores líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo, agua libre de pirógenos; solución salina isotónica, es decir, una disolución de NaCl al 0,9 %, o disoluciones tamponadas (acuosas), por ejemplo, disoluciones tamponadas de fosfato, citrato, etc., aceites vegetales tales como, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles, tales como, por ejemplo, polipropilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico, etc. Particularmente para la inyección y/o infusión de la composición farmacéutica tal como se usa en el presente documento, puede usarse un tampón, preferiblemente un tampón acuoso, y/o NaCl al 0,9 %.

Si la composición farmacéutica tal como se usa en el presente documento se proporciona en forma sólida, el portador farmacéuticamente aceptable normalmente comprenderá uno o más portadores sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles). La composición puede comprender como portadores sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo, una o más cargas sólidas o líquidas compatibles o pueden usarse también diluyentes o compuesto de encapsulación, que son adecuados para la administración a una persona. Algunos ejemplos de tales portadores sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles) son, por ejemplo, azúcares, tales como, por ejemplo, lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como, por ejemplo, almidón de maíz o almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; sebo; deslizantes sólidos, tales como, por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio; sulfato de calcio, etc.

La naturaleza precisa del portador u otro material farmacéuticamente aceptable (compatible) puede depender de la vía de administración. La elección de un portador farmacéuticamente aceptable (compatible) puede, por tanto, estar determinada en principio por la manera en que se administra la composición farmacéutica tal como se usa según la invención. Se enumeran varias vías de administración posibles en la lista “Vía de administración” de la FDA (véase FDA: Data Standards Manual - Drug Nomenclature Monographs - Número de monografía: C-DRG-00301; número de versión 004), que se incorpora por referencia en el presente documento. Puede encontrar más orientación para seleccionar una vía de administración adecuada, en particular para animales no humanos, en Turner PV et al. (2011) Journal of the American Association for Laboratory Animal Science, vol. 50, n.° 5, pág. 600 - 613, que también se incorpora en el presente documento por referencia. Los ejemplos preferidos de vías de administración incluyen vías parenterales (por ejemplo, mediante inyección), tales como vías intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica o transdérmica, etc., vías enterales, tales como vías oral o rectal, etc., vías tópicas, tales como como vías nasal, intranasal, etc., u otras vías, tales como vías epidérmicas o administración con parches. También se contemplan (en particular para enfermedades relacionadas con los ojos) instilación, administración intravítrea y subconjuntival. Asimismo, la administración puede producirse de manera intratimpánica, por ejemplo, siempre que se traten enfermedades relacionadas con el αdo.

La vía de administración del inhibidor de JNK según la presente invención, que normalmente se elige según la enfermedad que va a prevenirse y/o tratarse y la respectiva farmacocinética, es administración intravesical (es decir, en la vejiga urinaria), por ejemplo para enfermedades del sistema urinario, en particular la vejiga urinaria.

En general, el método de administración depende de varios factores, tal como se mencionó anteriormente, por ejemplo, el portador farmacéutico seleccionado y la naturaleza de la preparación farmacéutica (por ejemplo, como líquido, comprimido, etc.), así como la vía de administración. Por ejemplo, la composición farmacéutica que comprende el inhibidor de JNK según la invención puede prepararse como un líquido, por ejemplo, como una disolución del péptido quimérico según una secuencia de SEQ ID NO. 11, en NaCl al 0,9 %. En consecuencia, para la administración pueden usarse diferentes dispositivos, por ejemplo, una jeringa (incluida una jeringa precargada); un dispositivo de inyección (por ejemplo, el dispositivo iNj ECT-EASET™ y GENJECTT™); una bomba de infusión (tal como, por ejemplo, Accu-Chek™); una pluma inyectora (tal como la GENPENT™); un dispositivo sin aguja (por ejemplo, MEDDECTOR™ y BIOYECTOR™); o un autoinyector.

La cantidad adecuada de la composición farmacéutica que va a usarse puede determinarse mediante experimentos de rutina con modelos animales. Tales modelos incluyen, sin que ello implique limitación alguna, por ejemplo, modelos de conejo, oveja, ratón, rata, jerbo, perro, cerdo y primates no humanos. Las formas de dosis unitaria preferidas para la administración incluyen disoluciones estériles de agua, solución salina fisiológica o mezclas de las mismas. El pH de tales disoluciones debe ajustarse a aproximadamente 7,4. Los portadores adecuados para la administración incluyen hidrogeles, dispositivos para la liberación controlada o retardada, matrices de colágeno y poli(ácido láctico).

Para inyección y/o infusión en el sitio de la aflicción, es decir, inyección/infusión local, el principio activo estará en forma de una disolución acuosa aceptable por vía parenteral que esté libre de pirógenos y tiene un pH, isotonicidad y estabilidad adecuados. Los expertos relevantes en la técnica son capaces de preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro sódico, en particular NaCl al 0,9 %, inyección de Ringer, inyección de Ringer con lactato. Pueden incluirse conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. La administración es preferiblemente en una “cantidad profilácticamente eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” (según sea el caso), siendo esta suficiente para mostrar el beneficio para el individuo. La cantidad real administrada, y la velocidad y curso temporal de la administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que esté tratándose.

La invención se refiere al péptido quimérico que tiene una secuencia según SEQ ID NO. 11, en particular, en una composición farmacéutica tal como se define en el presente documento, para uso en la prevención y/o el tratamiento de las siguientes enfermedades/trastornos:

(i) enfermedades y/o trastornos del sistema urinario, es decir, cistitis en general, en particular cistitis intersticial, úlcera de Hunner, trigonitis y/o cistitis hemorrágica; en el que el inhibidor de JNK se aplica por vía intravesical, más preferiblemente mediante infusión intravesical, preferiblemente a una concentración de 10 |ig/ml - 1000 mg/ml, más preferiblemente 50 |ig/ml - 500 mg/ml, incluso más preferiblemente 100 |ig/ml - 100 mg/ml, y de manera particularmente preferible 0,5 mg/ml - 50 mg/ml, preferiblemente en dosis individuales de 0,1 - 1000 mg, más preferiblemente 0,5 - 500 mg, incluso más preferiblemente 1 - 100 mg, y de manera particularmente preferible 2 -10 mg, preferiblemente administrado en una sola dosis, sin embargo, si es aplicable, también preferiblemente administrado repetidamente, por ejemplo diariamente, cada 2 o 3 días o semanalmente, durante varias, por ejemplo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, semanas.

La prevención y/o el tratamiento de la cistitis tal como se define en el presente documento normalmente incluye la administración de una composición farmacéutica tal como se define anteriormente. El término “modular” incluye la supresión de la expresión de JNK cuando se sobreexpresa en la enfermedad anterior. También incluye la supresión de la fosforilación de c-jun, ATF2 o NFAT4 en la enfermedad anterior por al menos un péptido quimérico según SEQ ID NO: 11 como inhibidor competitivo del sitio de unión natural de c-jun, ATF2 y NFAt4 en una célula. El término “modular” también incluye la supresión de complejos hetero y homoméricos de factores de transcripción constituidos por, sin limitarse a los mismos, c-jun, ATF2 o NFAT4 y sus compañeros relacionados, tales como, por ejemplo, el complejo AP-1 que está constituido por c-jun, AFT2 y c-fos. Cuando una enfermedad o trastorno fuertemente relacionado con la señalización de JNK tal como se definió anteriormente está asociado con sobreexpresión de JNK, tales secuencias inhibidoras de JNK supresoras pueden introducirse en una célula. En algunos casos, “modular” puede incluir entonces el aumento de la expresión de JNK, por ejemplo, mediante un anticuerpo específico de péptido IB que bloquea la unión de un péptido IB a JNK, impidiendo así la inhibición de JNK por parte del péptido relacionado con IB.

La prevención y/o el tratamiento de un sujeto con la composición farmacéutica tal como se dio a conocer anteriormente puede lograrse normalmente administrando (en vivo) una cantidad (“terapéuticamente eficaz”) de dicha composición farmacéutica a un sujeto, en la que el sujeto puede ser, por ejemplo, cualquier mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo o un cerdo, prefiriéndose particularmente un ser humano. El término “terapéuticamente eficaz” significa que el componente activo de la composición farmacéutica está en cantidad suficiente para mejorar la enfermedad o trastorno fuertemente relacionado con la señalización de JNK tal como se definió anteriormente.

Por consiguiente, la invención se refiere al péptido quimérico según SEQ ID NO: 11, para su uso en el tratamiento de enfermedades o trastornos fuertemente relacionados con la señalización de JNK tal como se definió anteriormente, por ejemplo, mediante la modulación de rutas de señalización de JNK activadas.

Los péptidos quiméricos según SEQ ID NO: 11 pueden usarse en ensayos (in vitro) (por ejemplo, inmunoensayos) para detectar, pronosticar, diagnosticar o monitorizar diversas afecciones y estados patológicos seleccionados de enfermedades o trastornos fuertemente relacionados con la señalización de JNK tal como se definió anteriormente, o monitorizar el tratamiento de los mismos. Los inmunoensayos que pueden utilizarse incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo competitivos y no competitivos que usan técnicas tales como inmunotransferencia de tipo Western, radioinmunoensayos (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayos de tipo “sándwich”, ensayos de inmunoprecipitación, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusión en gel, ensayos de inmunodifusión, ensayos de aglutinación, inmunoensayos fluorescentes, ensayos de fijación del complemento, ensayos inmunorradiométricos e inmunoensayos de proteína A, etc. Alternativamente, pueden realizarse ensayos (in vitro) administrando péptidos quiméricos, tal como se definió anteriormente, a células diana normalmente seleccionadas de, por ejemplo, células animales, células humanas o microorganismos cultivados, y para monitorizar la respuesta celular mediante métodos biofísicos normalmente conocidos por un experto en la técnica. Las células diana que se usan normalmente en los mismos pueden ser células cultivadas (in vitro) o células in vivo, es decir, células que componen órganos o tejidos de animales o seres humanos vivos, o microorganismos que se encuentran en animales o seres humanos vivos.

Adicionalmente, se describe el uso de kits con fines diagnósticos o terapéuticos, en particular para el tratamiento, la prevención o la monitorización de enfermedades o trastornos fuertemente relacionados con la señalización de JNK tal como se definió anteriormente, en el que el kit incluye uno o más recipientes que contienen secuencias inhibidoras de JNK. El kit, opcionalmente, puede comprender además una cantidad predeterminada de una secuencia inhibidora de JNK purificada tal como se definió anteriormente, un péptido quimérico tal como se definió anteriormente, o ácidos nucleicos que los codifican, para su uso como diagnóstico, patrón o control en los ensayos para los fines anteriores.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o las pruebas de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. En caso de conflicto, prevalecerá la presente especificación, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.

Descripción de las figuras

La figura 1 son diagramas que muestran alineaciones de regiones de dominios JBD conservadas en los factores de transcripción indicados. Se identificaron secuencias inhibidoras de JNK usadas en el presente documento llevando a cabo alineaciones de secuencias. Los resultados de esta alineación se muestran a modo de ejemplo en las figuras 1A-1C. La figura 1A representa la región de mayor homología entre los JBD de IB1, IB2, c-Jun y ATF2. El panel B representa la secuencia de aminoácidos de los JBD de L-IB1(s) y L-IB1 por motivos comparativos. Los residuos completamente conservados se indican mediante asteriscos, mientras que los residuos cambiados a Ala en el vector GFP-JBD23Mut se indican mediante círculos blancos. La figura 1C muestra las secuencias de aminoácidos de proteínas quiméricas que incluyen una secuencia inhibidora de JNK y una secuencia de tráfico. En el ejemplo mostrado, la secuencia de tráfico se deriva del polipéptido TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y la secuencia inhibidora de JNK se deriva de un polipéptido IB1(s). Las secuencias humanas, de ratón y de rata son idénticas en los paneles B y C.

La figura 2 es un diagrama que muestra secuencias de péptidos de fusión TAT-IB genéricos de ser humano, ratón y rata.

La figura 3 representa los resultados de la inhibición de la actividad de JNK endógena en células HepG2 usando péptidos de fusión según SEQ ID NO: 9 y 11 en un enfoque de un pocillo. Tal como puede observarse a partir de la figura 3, particularmente el panel d de la figura 3, D-TAT-IB1(s) según SEQ ID NO: 11 (en el presente documento abreviado como D-JNKI) inhibe eficazmente la actividad de JNK, incluso mejor que L-TAT-IB1(s) según SEQ ID NO: 9 (en el presente documento abreviado como L-JNKI).

La figura 4 muestra para el ejemplo 11 el diseño del estudio (A) y el método de AUC para evaluar la alodinia e hiperalgesia (B).

La figura 5 muestra para el ejemplo 11 el efecto de los tratamientos con XG-102 (50 mg/ml, i.v.) e ibuprofeno (50 mg/ml, i.v.) sobre los parámetros nociceptivos 24 h tras la inyección de CYP. Umbral nociceptivo (A), puntuaciones nociceptivas (B), AUC 1-8 g (C) o AUC 8-60 g (D) 24 h tras la inyección de CYP. Los resultados se , , , p<0,05, p<0,01, p<0,001 frente al grupo tratado con vehículo, prueba de Mann Whitney (A y C), ANOVA RM bidireccional (B) y prueba de la t desapareada y prueba de Mann Whitney (D).

La figura 6 muestra para el ejemplo 11 el efecto de los tratamientos con XG-102 (50 mg/ml, i.v.) e ibuprofeno (50 mg/ml, i.v.) sobre el grosor de las paredes de la vejiga urinaria así como las puntuaciones de hemorragia 24 h tras la inyección de CYP. Grosor de las paredes de la vejiga urinaria (A) o puntuaciones de hemorragia (B) 24 h tras . . . , . . . pcO,01, p<0,001 frente al grupo tratado con vehículo, prueba de Mann Whitney y prueba de la t desapareada (A) o prueba de Mann Whitney (B).

La figura 7 muestra para el ejemplo 12 el efecto de los tratamientos con de XG-102 (2 mg/kg, i.v.) e ibuprofeno (10mg/kg, i.v.) sobre los parámetros nociceptivos 24 h tras la inyección de CYP. Umbral nociceptivo (A), puntuaciones nociceptivas (B), AUC 1-8 g (C) o AUC 8-60 g (D) 24 h tras la inyección de CYP. Los resultados se expresan como media ± eem (n=10). * * p<0,01, * * * p<0,001 frente al grupo tratado con vehículo, prueba de Mann Whitney (A), ANOVA RM bidireccional (B), prueba de Mann Whitney y prueba de la t desapareada (C) y prueba de la t desapareada (D).

La figura 8 muestra para el ejemplo 13 el diseño del estudio (A) y los parámetros cistométricos analizados (B).

La figura 9 muestra para el ejemplo 13 los efectos del vehículo (i.v.) sobre los parámetros cistométricos en ratas hembra conscientes tratadas con CYP. No significativo frente a los valores basales con una ANOVA unidireccional con mediciones repetidas, seguido por una prueba a posteriori de Dunnett.

La figura 10 muestra para el ejemplo 13 los efectos de XG-102 (2 mg/kg, i.v.) sobre los parámetros cistométricos en ratas hembra conscientes tratadas con CYP. * * P< 0,01 frente a los valores básales con una ANOVA unidireccional con medidas repetidas, seguido por una prueba a posteriori de Dunnett.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de secuencias inhibidoras de JNK

Se identificaron secuencias de aminoácidos importantes para una interacción eficaz con JNK mediante alineaciones de secuencias entre JBD de dominios de unión a JNK conocidos. Una comparación de secuencias entre los JBD de IB1 [SEQ ID NO: 13], IB2 [SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] y ATF2 [SEQ ID NO: 16] definió una secuencia de 8 aminoácidos débilmente conservada (véase la figura 1A). Puesto que los JBD de IB1 e IB2 son aproximadamente 100 veces más eficaces que c-Jun o ATF2 en la unión a JNK (Dickens et al. Science 277: 693 (1997), se razonó que los residuos conservados entre IB1 e IB2 deben ser importantes para conferir una unión máxima. La comparación entre los JBD de IB1 e IB2 definió dos bloques de siete y tres aminoácidos que están altamente conservados entre las dos secuencias.

Estos dos bloques están contenidos dentro de una secuencia peptídica de 19 aminoácidos en L-IB1(s) [SEQ ID NO: 1] y también se muestran por motivos comparativos en una secuencia peptídica de 23 aa derivada de IB1 [SEQ ID NO: 17]. Estas secuencias se muestran en la figura 1B, los guiones en la secuencia de L-IB1 indican un hueco en la secuencia con el fin de alinear los residuos conservados con L-IB1(s).

Ejemplo 2: Preparación de proteínas de fusión inhibidoras de JNK

Se sintetizaron proteínas de fusión inhibidoras de JNK según SEQ ID NO: 9 uniendo covalentemente el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 1 a un péptido potador de 10 aminoácidos de longitud N-terminal derivado de VIH-TAT4g 57 (Vives et al., J Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) según SEQ ID NO: 5 por medio de un ligador que consiste en dos residuos de prolina. Este ligador se usó para permitir una flexibilidad máxima e impedir cambios en la estructura secundaria no deseados. Los constructos básicos también se prepararon y se designaron L-IB1(s) (SEQ ID NO: 1) y L-TAT [SEQ ID NO: 5], respectivamente.

Por consiguiente, se sintetizaron péptidos retroinversos todo-D según SEQ ID NO: 11. Los constructos básicos también se prepararon y se designaron D-IB1(s) [SEQ ID NO: 2] y D-TAT [SEQ ID NO: 6], respectivamente.

Se produjeron péptidos de fusión todo D y L según SEQ ID NO: 9, 10, 11 y 12 mediante síntesis de Fmock clásica y se analizaron adicionalmente por espectrometría de masas. Finalmente se purificaron por HPLC. Para determinar los efectos del ligador de prolina, se produjeron dos tipos de péptido TAT, uno con y otro sin dos prolinas. La adición de las dos prolinas no parecía modificar la entrada o la localización del péptido TAT dentro de las células. En la figura 2 se proporcionan péptidos genéricos que muestran los residuos de aminoácido conservados.

Ejemplo 3: Inhibición de la muerte celular por JBD 19

Se estudiaron los efectos de la secuencia de JBD de 19 aa de longitud de IB1(s) sobre las actividades biológicas de JNK. La secuencia de 19 aa se unió de manera N-terminal a la proteína fluorescente verde (constructo de GFP JBD19), y se evaluó el efecto de este constructo sobre la apoptosis de células beta pacreáticaszi inducida por IL1. se mostró previamente que este modo de apoptosis se bloqueaba por transfección con JBD1-280, mientras que los inhibidores específicos de ERK1/2 o p38 conocidos en la técnica no protegían.

Se sintetizaron oligonucleótidos correspondientes a JBD19 y que comprenden una secuencia conservada de 19 aminoácidos así como una secuencia mutada en las regiones completamente conservadas y se insertaron direccionalmente en los sitios EcoRI y SalI del vector pEGFP-N1 que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP) (de Clontech). Se cultivaron células ziTC-3 productoras de insulina en medio RPMI 1640 suplementado con suero de ternero fetal al 10 %, estreptomicina 100 |ig/ml, penicilina 100 unidades/ml y glutamina 2 mM. Las células cTC-3 productoras de insulina se transfectaron con los vectores indicados y se añadió IL-1c (10 ng/ml) al medio de cultivo celular. Se contó el número de células apoptóticas a las 48 horas tras la adición de IL-1zi usando un microscopio de fluorescencia invertido. Las células apoptóticas se discriminaron de las células normales por la “vesiculación” del citoplasma y se contaron después de dos días.

GFP es un vector de expresión de proteína fluorescente verde usado como control; JBD19 es el vector que expresa una GFP quimérica unida a la secuencia de 19 aa derivada del JBD de IB1; JBD19Mut es el mismo vector que GFP-JBD19, pero con un JBD mutado en cuatro residuos conservados mostrados como figura 1B; y JBD1-280 es el vector GFP unido a todo el JBD (aa 1-280). El constructo de expresión GFP-JBD19 impidió la apoptosis de células pancreáticas zic inducida por IL-1cc tan eficazmente como todo el JBD1-280.

Como controles adicionales, las secuencias mutadas en residuos de IB1(s) completamente conservados tenían una capacidad enormemente disminuida para impedir la apoptosis.

Ejemplo 4: Importación celular de péptidos TAT-IB1(s)

Se evaluó la capacidad de las formas enantioméricas L y D de los péptidos TAT y TAT-IB1(s) (“péptidos TAT-IB”) para entrar en las células. Los péptidos L-TAT, D-TAT, L-TAT-IB1(s) y D-TAT-IB1(s) [SEQ ID NO: 5, 6, 9 y 12, respectivamente] se marcaron mediante la adición N-terminal de un residuo de glicina conjugado con fluoresceína. Los péptidos marcados (1 |iM) se añadieron a cultivos de células cTC-3, que se mantuvieron tal como se describió en el ejemplo 3. A tiempos predeterminados, se lavaron las células con PBS y se fijaron durante cinco minutos en metanol-acetona (1:1) enfriado con hielo antes de examinarse bajo un microscopio de fluorescencia. Se usó BSA marcada con fluoresceína (1 |iM, BSA 12 moles/mol) como control. Los resultados demostraron que todos los péptidos marcados con fluoresceína anteriores habían entrado eficaz y rápidamente (menos de cinco minutos) en las células una vez añadidos al medio de cultivo. A la inversa, la albúmina sérica bovina marcada con fluoresceína (BSA 1 |iM, 12 moles de fluoresceína/mol de BSA) no entró en las células.

Un estudio del curso temporal indicó que la intensidad de la señal fluorescente para los péptidos enantioméricos L disminuyó en un 70 % después de un periodo de 24 horas. Estaba presente poca o ninguna señal a las 48 horas. En cambio, D-TAT y D-TAT-IB1(s) eran extremadamente estables dentro de las células. Las señales fluorescentes a partir de estos péptidos retroinversos todo-D eran todavía muy fuertes 1 semana después, y la señal solo disminuyó ligeramente 2 semanas después del tratamiento.

Ejemplo 5: Inhibición in vitro de la fosforilación de c-JUN, ATF2 y Elk1

Los efectos de los péptidos sobre la fosforilación mediada por JNK de sus factores de transcripción diana se investigaron in vitro. Se produjeron JNK1, JNK₂ y JNK3 recombinantes y no activados usando un kit de lisado de reticulocitos de conejo de TRANSCRIPCIÓN Y TRADUCCIÓN (Promega) y usado en ensayos de cinasas en fase sólida con c-Jun, ATF2 y Elk1, o bien solos o bien fusionados glutatión-S-transferasa (GST), como sustratos. Se realizaron estudios de respuesta a la dosis en los que se mezclaron péptidos L-TAT o L-TAT-IB1(s) (0-25 |iM) con las cinasas JNK1, JNK₂ o JNK3 recombinantes en tampón de reacción (Tris-acetato 20 mM, EGTA 1 mM, pnitrofenil-fosfato (pNPP) 10 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, p-glicerofosfato 10 mM, ditiotreitol 1 mM) durante 20 minutos. Las reacciones de cinasas se iniciaron entonces mediante la adición de MgCh 10 mM y 33P-gamma-dATP 5 μCi y 1 |ig de o bien GST-Jun (aa 1-89), GST-AFT2 (aa 1-96) o bien GST-ELK1 (aa 307-428). Las proteínas de fusión de GST se adquirieron de Stratagene (La Jolla, CA).

También se añadieron diez |iL de perlas de glutatión-agarosa a la mezcla. Entonces se separaron los productos de reacción mediante SDS-PAGE sobre un gel de poliacrilamida al 10 % desnaturalizante. Los geles se secaron y posteriormente se expusieron a películas de rayos X (Kodak). Se observó una inhibición casi completa de la fosforilación de c-Jun, ATF2 y Elk1 por JNK a dosis de péptido TAT-IB(s) de tan solo 2,5 |iM. Sin embargo, una excepción notable fue la ausencia de inhibición por TAT-IB(s) de la fosforilación de Elk1 por JNK3. Globalmente, el péptido TAT-IB1(s) mostró efectos superiores en la inhibición de la fosforilación de la familia JNK de sus factores de transcripción diana. La capacidad de los péptidos D-TAT, D-TAT-IB1(s) y L-TAT-IB1(s) (estudio de dosificación de 0­ 250 |iM) para inhibir la fosforilación de GST-Jun (aa 1-73) por JNK1, JNK₂ y JNK3 recombinantes se analizó tal como se describió anteriormente. En general, el péptido D-TAT-IB1(s) disminuyó la fosforilación de c-Jun mediada por JNK, pero a niveles aproximadamente 10-20 veces menos eficientes que L-TAT-IB1(s).

Ejemplo 6: Inhibición in vivo de la fosforilación de c-JUN por péptidos TAT-IB(s) tal como se define en el presente documento

Para determinar si los péptidos permeables en células definidos en el presente documento podrían bloquear la señalización de JNK in vivo, se usó un sistema GAL4 heterólogo. Células HeLa, cultivadas tal como se describió anteriormente, se cotransfectaron con el vector indicador 5xGAL-LUC junto con el constructo de expresión GAL-Jun (Stratagene) que comprende el dominio de activación de c-Jun (aminoácidos 1-89) unido al dominio de unión a ADN GAL4. La activación de JNK se logró mediante la cotransfección de vectores que expresan las cinasas directamente aguas arriba MKK4 y MKK7 (véase Whitmarsh et al., Science 285: 1573 (1999)). En resumen, se transfectaron 3*105 células con los plásmidos en placas de 3,5 cm usando DOTAP (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para experimentos que implican GAL-Jun, se transfectaron 20 ng del plásmido con 1 |ig del plásmido indicador pFR-Luc (Stratagene) y 0,5 |ig de plásmidos de expresión de o bien MKK4 o bien MKK7. Tres horas tras la transfección, se cambiaron los medios celulares y se añadieron los péptidos TAT y TAT-IB1(s) (1 |iM). Se midieron las actividades luciferasa 16 horas después usando el “Dual Reporter System” de Promega después de la normalización al contenido de proteína. La adición del péptido TAT-IB1(s) bloqueó la activación de c-Jun tras la activación de JNK mediada por MKK4 y MKK7. Debido a que las células HeLa expresan las isoformas JNK1 y JNK₂ pero no JNK3, se transfectaron las células con JNK3. De nuevo, el péptido TAT-IB(s) inhibió la activación de c-Jun mediada por JNK₂.

Ejemplo 7: Síntesis de péptidos IB(s) retroinversos todo-D y variantes de los mismos

Los péptidos de la invención pueden ser péptidos de aminoácidos todo-D sintetizados de manera inversa para impedir la proteólisis natural (es decir, péptidos retroinversos todo-D). Un péptido retroinverso todo-D de la invención proporcionaría un péptido con propiedades funcionales similares al péptido nativo, en el que los grupos laterales de los aminoácidos componentes corresponderían a la alineación con el péptido nativo, pero conservarían una estructura principal resistente a proteasas.

Los péptidos retroinversos de la invención son análogos sintetizados usando D-aminoácidos uniendo los aminoácidos en una cadena peptídica de manera que la secuencia de aminoácidos en el análogo de péptido retroinverso es exactamente opuesta a la del péptido seleccionado que sirve como modelo. Como ilustración, si la proteína TAT que se produce de manera natural (formada por L-aminoácidos) tiene la secuencia GRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 5], el análogo de péptido retroinverso de este péptido (formado por D-aminoácidos) tendría la secuencia RRRQRRKKRG [SEQ ID NO: 6]. Los procedimientos para sintetizar una cadena de D-aminoácidos para formar los péptidos retroinversos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Jameson et al., Nature, 368, 744­ 746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994); Guichard et al., J. Med. Chem. 39, 2030-2039 (1996)). Específicamente, los retropéptidos según SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 11-12, 18, 20, 22 y 25-26 se produjeron mediante síntesis de F-mock clásica y se analizaron adicionalmente mediante espectrometría de masas. Finalmente, se purificaron por HPLC.

Puesto que un problema inherente de los péptidos nativos es la degradación por proteasas naturales y la inmunogenicidad inherente, los compuestos heterobivalente o heteromultivalentes de esta invención se prepararán para que incluyan el “isómero retroinverso” del péptido deseado. Por tanto, la protección del péptido frente a la proteólisis natural debe aumentar la eficacia del compuesto heterobivalente o heteromultivalente específico, tanto prolongando la semivida como disminuyendo el grado de la respuesta inmunitaria dirigida a destruir activamente los péptidos.

Ejemplo 8: Actividad biológica a largo plazo de péptidos IB(s) retroinversos todo-D y variantes de los mismos Se predice actividad biológica a largo plazo para el heteroconjugado peptídico retroinverso que contiene D-TAT-IB(s) (véanse las secuencias quiméricas anteriores) en comparación con el análogo de L-aminoácidos nativo debido a la protección del péptido D-TAT-IB(s) frente a la degradación por proteasas nativas, tal como se muestra en el ejemplo 5.

Se analizó la muerte de células beta pancreáticas inducida por IL-1cz por el péptido D-TAT-IB1(s). Se incubaron células cTC-3 tal como se describió anteriormente durante 30 minutos con una sola adición de los péptidos indicados (1 |iM), luego se añadió IL-1 (10 ng/ml).

Entonces se contaron las células apoptóticas después de dos días de incubación con IL-1znz mediante el uso de tinción nuclear con yoduro de propidio y Hoechst 33342. Se contaron un mínimo de 1.000 células para cada experimento. Se indica el error estándar de la media (EEM), n=5. El péptido D-TAT-IB1 disminuyó la apoptosis inducida por IL-1 en un grado similar al de los péptidos L-TAT-IB.

También se analizó la inhibición a largo plazo de la muerte celular inducida por IL-1P por el péptido D-TAT-IB1. Se incubaron células cTC-3 como anteriormente durante 30 minutos con una sola adición de los péptidos indicados (1 |iM), luego se añadió IL-1znz (10 ng/ml), seguido por la adición de la citocina cada dos días. Entonces se contaron las células apoptóticas después de 15 días de incubación con IL-1 mediante el uso de tinción nuclear con yoduro de propidio y Hoechst 33342. Obsérvese que una sola adición del péptido TAT-IB1 no confiere protección a largo plazo. Se contaron un mínimo de 1.000 células para cada experimento. Como resultado, D-TAT-IB1(s), pero no L-TAT-IB1(s), fue capaz de conferir protección a largo plazo (15 días).

Ejemplo 9: Inhibición de la actividad de JNK endógena en células HepG2 usando un enfoque de todo en un pocillo (véase la figura 3).

Se sembraron células HepG2 a 3.000 células/pocilla el día antes del experimento. Entonces, se añadieron concentraciones crecientes de o bien interleucina-1z [IL-1betazv)] o factor de necrosis tumoral z [TNFαlpha] (a) para activar JNK durante 30 minutos. Se lisaron las células en Hepes 20 mM, Tween al 0,5 % pH 7,4 y se procesaron para AlphaScreen JNK. (b) Z' para la actividad de JNK inducida por IL-1zi 10 ng/ml y medidas en 384 pocillos/placa (n=96). (c) Inhibición de la actividad de JNK endógena inducida por IL-1beta con inhibidores químicos de JNK [estaurosporina y SP600125]. (d) Efecto de los inhibidores peptídicos L-TAT-IB1(s) según SEQ ID NO: 9 [en el presente documento abreviado como L-JNKi (v)) y D-TAT-IB1(s) según SEQ ID NO: 11 (en el presente documento abreviado como D-JNKi) y JBD (corresponde a L-JNKI sin la secuencia TAT)] sobre la actividad de JNK dependiente de IL-1zi. Todos los paneles son representativos de tres experimentos independientes (n=3).

Métodos: Ensayo de cinasas Alphascreen

Principio: AlphaScreen es una tecnología basada en perlas no radiactivas que se usa para estudiar interacciones biomoleculares en un formato de microplacas. El acrónimo ALPHA significa ensayo homogéneo de proximidad de luminiscencia amplificada. Se trata de una interacción biológica que pone en estrecha proximidad unas perlas “donadoras” y “aceptoras”, luego actúa una cascada de reacciones químicas para producir una señal amplificada. Tras la excitación del láser a 680 nm, un fotosensibilizador (ftalocianina) en la perla “donadora” convierte el oxígeno ambiental a un estado de singlete excitado. En el plazo de su vida media de 4 |is, la molécula de oxígeno singlete puede difundir hasta aproximadamente 200 nm en disolución y si una perla aceptora está dentro de esa proximidad, el oxígeno singlete reacciona con un derivado de tioxeno en la perla “aceptora”, generando quimioluminiscencia a 370 nm que activa adicionalmente los fluoróforos contenidos en la misma perla “aceptora”. Los fluoróforos excitados posteriormente emiten luz a 520-620 nm. En ausencia de una perla aceptora, el oxígeno singlete cae al estado fundamental y no se produce ninguna señal.

Los reactivos de cinasa (B-GST-cJun, anticuerpo anti P-cJun y JNK3 activa) se diluyeron en primer lugar en tampón de cinasa (Tris-HCl 20 mM pH 7,6, MgCl 10 mM2, DTT 1 mM, Na3VO4100 |iM, Tween-20 al 0,01 %) y se añaden a los pocillos (15 |il). Entonces, las reacciones se incubaron en presencia de ATP 10 |iM durante 1 hora a 23 °C. La detección se realizó mediante la adición de 10 |il de mezcla de perlas (aceptor de proteína A 20 |ig/ml y donador de estreptavidina 20 |ig/ml), diluidas en tampón de detección (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 20 mM, EDTA 80 mM, BSA al 0,3 %), seguido por otra incubación de una hora a 23 °C en la oscuridad. Para la medición de la actividad endógena de JNK, se realizaron ensayos de cinasa tal como se describió anteriormente, excepto porque se reemplazó JNK3 activa por lisados celulares y se añadieron componentes de cinasa de reacción después de la lisis celular. Se usaron anticuerpos frente a B-GST-cjun y P-cJun a las mismas concentraciones, mientras que el ATP se usó a 50 |iM en lugar de 10 |iM. La señal de AlphaScreen se analizó directamente en el aparato Fusion o En Vision.

Ejemplo 10: Seguridad, tolerabilidad y farmacocinética de una sola infusión intravenosa de 10, 40 y 80 iig/kg de XG-102 (SEQ ID No.: 11) administrada a voluntarios masculinos sanos en un estudio de fase I aleatorizado, de doble enmascaramiento, controlado por placebo, con aumento de la dosis

El objetivo principal del estudio fue evaluar la seguridad y tolerabilidad de XG-102 después de la infusión intravenosa (iv) de dosis únicas crecientes de XG-102 a voluntarios masculinos sanos. El objetivo secundario del estudio fue evaluar la farmacocinética de XG-102 después de la infusión iv de dosis únicas crecientes de XG-102 a voluntarios masculinos sanos. Las dosis se administraron como una infusión iv de 60 minutos. Con fines de control, se administró una infusión iv de placebo a los sujetos de control.

Este fue un estudio de un solo centro, aleatorizado, de doble enmascaramiento, controlado con placebo, de dosis única ascendente, de grupos secuenciales. Se estudiaron tres niveles de dosis de XG-102 (10, 40 y 80 |ig/kg) en orden ascendente de dosis, dentro de cada grupo los sujetos se aleatorizaron de manera que 6 sujetos recibieron XG-102 y 2 sujetos recibieron placebo. La selección se realizó en el período de 3 semanas antes de la dosificación. La dosificación se produjo el día 0 para cada sujeto. El investigador verificó el bienestar de todos los sujetos antes de su alta de la CRU (24 horas después de la dosificación). Los sujetos regresaron a la CRU 8 ± 2 días y 28 ± 5 días después de la dosificación para las evaluaciones posteriores al estudio.

Un total de 24 sujetos (sujetos masculinos sanos de 18 a 45 años), en 3 grupos de 8. 24 sujetos ingresaron y completaron el estudio. Los datos de todos los sujetos se incluyeron en los análisis de seguridad; los datos de todos los sujetos que recibieron XG-102 se incluyeron en los análisis farmacocinéticos.

( g )

Los valores observados de t-i/2 fueron cortos. Tanto la exposición pico tal como se mide por Cmáx como la exposición acumulada tal como se mide por AUCü-último aumentó con la dosis. El aumento con la dosis de Cmáx parece ser más que linealmente proporcional basándose en los exámenes gráficos y de la media geométrica de sus valores normalizados de dosis que, después de la dosis más alta de 80 |ig/kg, están por encima de los intervalos de confianza del 90 % para las otras dosis. El aumento con la dosis de AUCü-último es claramente más que linealmente proporcional desde 40 hasta 80 |ig/kg ya que los intervalos de confianza del 90 % para su valor normalizado no se solapa con los de las otras dosis sometidas a prueba; mientras que cuando se comparan valores después de 10 y 40 |ig/kg, los intervalos de confianza del 90 % se solapan, pero su valor normalizado de dosis media geométrica después de la dosis de 10 |ig/kg es menor que todos los valores en el intervalo de confianza del 90 % correspondiente después de la dosis de 40 |ig/kg.

XG-102 era seguro y se toleraba bien cuando se administró como dosis iv individuales de 10, 40 u 80 |ig/kg a sujetos masculinos sanos. La incidencia de acontecimientos adversos en sujetos que recibieron XG-102 fue similar a la incidencia en sujetos que recibieron placebo. No hubo hallazgos clínicamente significativos en los datos de laboratorio clínico, signos vitales, ECG, exámenes físicos o exámenes oculares (fondo de ojo y PIO).

Después del final de la infusión intravenosa de XG-102, sus concentraciones plasmáticas disminuyeron rápidamente, conduciendo a valores por debajo del límite inferior de cuantificación como máximo 2 horas después del inicio de las infusiones iv de XG-102 10 |ig/kg, 3 horas después del inicio de las infusiones intravenosas de XG-10240 |ig/kg y como máximo 7 horas después del comienzo de las infusiones intravenosas de XG-102 80 |ig/kg. Los valores de t-i/2 y MRT medidos son cortos, oscilando los valores medios geométricos por nivel de dosis entre 0,36 y 0,65 horas y entre 0,76 y 1,02 horas, respectivamente.

La AUC0-últ¡mo de XG-102 aumenta en una proporción más que lineal con la dosis en el intervalo de dosis sometido a prueba, con intervalos de confianza del 90 % no solapantes para sus valores normalizados de dosis media geométrica entre la dosis de 40 |ig/kg y 80 |ig/kg y un solapamiento solo limitado entre los intervalos de confianza del 90 % para sus valores normalizados de dosis media geométrica entre 10 |ig/kg y 40 |ig/kg.

La Cmáx de XG-102 parece aumentar en una proporción más que lineal con dosis desde 40 hasta 80 |ig/kg. La Cmáx normalizada de dosis media geométrica en el grupo de dosis de 80 |ig/kg es mayor que y está fuera de los intervalos de confianza del 90 % para la Cmáx normalizada de dosis media geométrica en los otros grupos de dosis, pero los intervalos de confianza del 90 % para la Cmáx normalizada de dosis media geométrica se solapan entre todos los niveles de dosis.

La variabilidad entre sujetos de los parámetros farmacocinéticos de XG-102 fue moderada en sujetos tratados con dosis de 10 y 40 |ig/kg (CV% de la media geométrica para la mayoría de los parámetros aproximadamente en el intervalo del 15-30 %, la excepción fue t-i/2 y Vss total en el grupo de dosis de 10 |ig/kg), pero más alta en el grupo de dosis de 80 |ig/kg, en el intervalo de aproximadamente el 29-44 %, excepto para MRT (14,7 %). Esta mayor variabilidad puede ser o bien un efecto del bajo tamaño de la muestra o bien una consecuencia de las no linealidades observadas que son más claras a esta dosis.

Ejemplo 11: Efectos de XG-102 (SEQ ID No. 11) administrado por vía intravesical en un modelo de cistitis aguda inducida por ciclofosfamida en ratas conscientes: Evaluación del dolor visceral y la inflamación de la vejiga urinaria

El objetivo del presente estudio fue evaluar los efectos del tratamiento intravesical con XG-102 (50 mg/ml) sobre el dolor y la inflamación de la vejiga urinaria en cistitis aguda inducida por CYP en ratas Sprague-Dawley hembra. Este modelo preclínico se usa bien para someter a prueba enfoques terapéuticos para el tratamiento de cistitis intersticial/síndrome de vejiga dolorosa (IC/PBS).

Se usaron ratas Sprague-Dawley hembra adultas (Janvier Labs, Le Genest Saint Isle, Francia), con un peso de 215 ± 20 g al inicio de los experimentos. Los animales se aclimataron a las condiciones del laboratorio durante al menos 3 días antes del inicio de cualquier experimento. Los animales se asignaron a los siguientes cuatro grupos experimentales (n=10 animales por grupo):

p ( g )

Para inducir cistitis aguda, se realizó una sola inyección i.p. de CYP a una dosis de 150 mg/kg en un volumen final de 5 ml/kg. Las ratas de control recibieron solución salina fisiológica en las mismas condiciones experimentales que CYP (volumen final de 5 ml/kg, i.p.).

El día de cada experimento, se registró el peso de las ratas. Entonces, de una manera aleatoria, se infundieron por vía intravesical 500 |il de XG-102 (50 mg/ml), ibuprofeno (50 mg/ml) o vehículo durante 30 min bajo anestesia con isoflurano (2 % - 3 %).

Valoración del dolor visceral referido mediante filamentos de von Frey:

Se aplicaron condiciones estandarizadas que incluyen una hora fija del día (a.m. para minimizar las posibles variaciones circadianas en las respuestas de comportamiento) y pruebas por un solo experimentador de todos los animales para minimizar la variabilidad de las pruebas de dolor basadas en el comportamiento. Se evaluó el dolor visceral incluida la alodinia e hiperalgesia aplicando en la parte inferior del abdomen, cerca de la vejiga urinaria, un juego de 8 filamentos de von Frey calibrados de fuerzas crecientes (1,2, 4, 6, 8, 10, 26 y 60 g) con un intervalo entre estímulos de 5 segundos. Previamente a las pruebas, se rasuró el área abdominal designada para la estimulación mecánica de cada animal. Luego, los animales se colocaron sobre un suelo elevado de malla de alambre debajo de una caja de plexiglás transparente individual y se aclimataron durante al menos 30 minutos antes de comenzar la prueba de von Frey. Luego se aplicaron filamentos durante 1-2 segundos a través del suelo de malla con suficiente fuerza como para hacer que el filamento se doblara ligeramente. Cada filamento se sometió a prueba 3 veces. Se tuvo cuidado de estimular diferentes áreas dentro de la región abdominal inferior en las proximidades de la vejiga urinaria para evitar la desensibilización.

Se puntuaron los comportamientos nociceptivos para cada animal y cada filamento tal como sigue:

El diseño del estudio se muestra esquemáticamente en la figura 4 A. En resumen, se indujo cistitis aguda mediante inyección de CYP (i.p.) en D0 (tal como se describió anteriormente). Se administró XG-102, ibuprofeno o vehículo por vía intravesical una vez justo después de la inyección de CYP (tal como se describió anteriormente). La prueba de Von Frey se realizó sin enmascaramiento de la siguiente manera:

• En D-1, las ratas se aclimataron a la caja de plexiglás individual durante un mínimo de 30 min y a la aplicación de filamentos de von Frey, con el fin de disminuir el nivel de estrés debido al nuevo ambiente.

• En D0, se realizó la prueba de von Frey 15 min antes de la inyección de CYP o solución salina con el fin de obtener valores basales (D0, T=-15 min).

• En D1, se realizó la prueba de von Frey 24 horas después de la inyección de CYP o solución salina con el fin de analizar el efecto de los compuestos de prueba sobre el dolor visceral inducido por CYP (D1, T = 24 h).

• Justo después de la prueba de von Frey (+24 h), las ratas se anestesiaron para la recogida de muestras de sangre, luego se sacrificaron y se recogieron las vejigas urinarias tal como se describe a continuación. Al final del experimento, se sacrificaron las ratas mediante inyección de pentobarbital (54,7 mg/ml, 0,5 ml/rata, i.p.) seguido por dislocación cervical. Se recogieron rápidamente las vejigas urinarias y se limpiaron de tejido lipoide. Se pesaron las vejigas urinarias, se cortaron en el cuello de la vejiga y se realizó la puntuación de la hemorragia (véase la tabla a continuación). Finalmente, se midió el grosor de la pared usando un calibrador digital colocando la pared de la vejiga entre las dos mordazas exteriores. Las puntuaciones de hemorragia de la vejiga urinaria se adaptaron de los criterios de Gray (Gray et al., 1986) tal como sigue:

Los parámetros nociceptivos se expresan tal como sigue:

Las AUC se calcularon usando GraphPad Prism® (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.). El método de AUC para evaluar la alodinia e hiperalgesia se muestra esquemáticamente en la figura 4 B.

Los parámetros macroscópicos se expresan tal como sigue:

Resultados:

Antes de la inyección de CYP, no se observaron diferencias significativas en los parámetros nociceptivos entre los 3 grupos diferentes en los que se inyectó CYP. Con el fin de analizar el efecto de XG-102 sobre el dolor visceral inducido por CYP, se compararon los parámetros nociceptivos entre los grupos tratados con vehículo y XG-102. Veinticuatro horas después de la inyección de CYP, el umbral nociceptivo aumentó significativamente con el tratamiento con XG-102 en comparación con el vehículo (p<0,01, figura 5 A). El tratamiento con XG-102 también redujo significativamente las puntuaciones nociceptivas en ratas en las que se inyectó CYP en comparación con el vehículo (p<0,001, figura 5 B). Además, el AUC 1-8 g disminuyó significativamente con el tratamiento con XG-102 en comparación con el vehículo (p<0,001, figura 5 C). De manera similar, el AUC 8-60 g se redujo con el tratamiento con XG-102 en comparación con el vehículo (p<0,01, figura 5 D). Con el fin de analizar los efectos del ibuprofeno sobre el dolor visceral inducido por CYP, se compararon los parámetros nociceptivos entre los grupos tratados con vehículo y con ibuprofeno. El umbral nociceptivo aumentó significativamente con el tratamiento con ibuprofeno en comparación con el vehículo en ratas en las que se inyectó CYP (p<0,01, figura 5 A). De manera similar, en el grupo de ibuprofeno, se observó una disminución significativa de las puntuaciones nociceptivas en comparación con el vehículo (p<0,01, figura 5 B). Además, el AUC 1-8 g y el AUC 8-60 g se redujeron significativamente con el tratamiento con ibuprofeno en comparación con el vehículo (p<0,001 y p<0,05, figuras 5 C y 101 D, respectivamente).

Además, el grosor de la pared urinaria disminuyó significativamente en las ratas tratadas con XG-102 (p<0,01, figura 6 A). Aunque el tratamiento con XG-102 también mostró una tendencia hacia la disminución de las puntuaciones de hemorragia, no alcanzó significación estadística (figura 6 B). Para el ibuprofeno, también se observó una disminución significativa en el grosor de la pared de la vejiga urinaria (p<0,001, figura 6 A). Sin embargo, no se observó ningún cambio significativo con respecto a las puntuaciones de hemorragia (p>0,05, figura 6 B) en el grupo tratado con ibuprofeno. Cabe señalar que se observó orina rojiza en algunos animales del grupo tratado con ibuprofeno.

En conjunto, el tratamiento intravesical de XG-102 (50 mg/ml) revirtió significativamente el dolor visceral inducido por CYP, 24 horas después de su inyección. XG-102 inhibió eficazmente tanto la alodinia como la hiperalgesia. En los parámetros inflamatorios analizados, XG-102 disminuyó la inflamación de la vejiga urinaria (grosor de la pared). En conclusión, administrado por vía intravesical, XG-102 mostró fuertes efectos antinociceptivos y propiedades antiinflamatorias significativas en un modelo experimental de IC/PBS.

Ejemplo 12: Efectos de XG-102 (SEQ ID No. 11) administrado por vía intravenosa en un modelo de cistitis aguda inducida por ciclofosfamida en ratas conscientes: Evaluación del dolor visceral (comparativo)

El objetivo del presente estudio fue evaluar los efectos del tratamiento intravenoso con XG-102 (2 mg/kg) sobre el dolor de la vejiga urinaria en cistitis aguda inducida por CYP en ratas Sprague-Dawley hembra. Este modelo preclínico se usa bien para someter a prueba enfoques terapéuticos para el tratamiento de cistitis intersticial/síndrome de vejiga dolorosa (IC/PBS).

Se usaron ratas Sprague-Dawley hembra adultas (Janvier Labs, Le Genest Saint Isle, Francia), con un peso de 215 ± 20 g al inicio de los experimentos. Los animales se aclimataron a las condiciones del laboratorio durante al menos 3 días antes del inicio de cualquier experimento. Los animales se asignaron a los siguientes cuatro grupos experimentales (n=10 animales por grupo):

(i.v.

g, i.

g, i.

g, i.

/kg,

Para inducir cistitis aguda, se realizó una sola inyección i.p. de CYP a una dosis de 150 mg/kg en un volumen final de 5 ml/kg. Las ratas de control recibieron solución salina fisiológica en las mismas condiciones experimentales que CYP (volumen final de 5 ml/kg, i.p.).

El día de cada experimento, se registró el peso de las ratas. Entonces, de una manera aleatoria, se administró por vía intravenosa ^x G-102 (2 mg/kg), ibuprofeno (10 mg/kg) o vehículo a un volumen de 1 ml/kg.

Valoración del dolor visceral referido mediante filamentos de von Frey:

Se aplicaron condiciones estandarizadas que incluyen una hora fija del día (a.m. para minimizar las posibles variaciones circadianas en las respuestas de comportamiento) y pruebas por un solo experimentador de todos los animales para minimizar la variabilidad de las pruebas de dolor basadas en el comportamiento. Se evaluó el dolor visceral incluida la alodinia e hiperalgesia aplicando en la parte inferior del abdomen, cerca de la vejiga urinaria, un juego de 8 filamentos de von Frey calibrados de fuerzas crecientes (1, 2, 4, 6, 8, 10, 26 y 60 g) con un intervalo entre estímulos de 5 segundos. Previamente a las pruebas, se rasuró el área abdominal designada para la estimulación mecánica de cada animal. Luego, los animales se colocaron sobre un suelo elevado de malla de alambre debajo de una caja de plexiglás transparente individual y se aclimataron durante al menos 30 minutos antes de comenzar la prueba de von Frey. Luego se aplicaron filamentos durante 1-2 segundos a través del suelo de malla con suficiente fuerza como para hacer que el filamento se doblara ligeramente. Cada filamento se sometió a prueba 3 veces. Se tuvo cuidado de estimular diferentes áreas dentro de la región abdominal inferior en las proximidades de la vejiga urinaria para evitar la desensibilización.

Se puntuaron los comportamientos nociceptivos para cada animal y cada filamento tal como sigue:

El diseño del estudio difiere de el del ejemplo 11 (véase la figura 4 A) solo en la vía de administración (por vía intravenosa en lugar de por vía intravesical) y las dosis especificadas anteriormente. En resumen, se indujo cistitis aguda mediante inyección de CYP (i.p.) en D0 (tal como se describió anteriormente). Se administró XG-102, ibuprofeno o vehículo por vía intravenosa una vez justo después de la inyección de CYP (tal como se describió anteriormente). La prueba de Von Frey se realizó sin enmascaramiento de la siguiente manera:

• En D-1, las ratas se aclimataron a la caja de plexiglás individual durante un mínimo de 30 min y a la aplicación de filamentos de von Frey, con el fin de disminuir el nivel de estrés debido al nuevo ambiente. • En D0, se realizó la prueba de von Frey 15 min antes de la inyección de CYP o solución salina con el fin de obtener valores basales (D0, T=-15 min).

• En D1, se realizó la prueba de von Frey 24 horas después de la inyección de CYP o solución salina con el fin de analizar el efecto de los compuestos de prueba sobre el dolor visceral inducido por CYP (D1, T = 24 h).

• Justo después de la prueba de von Frey (+24 h), las ratas se anestesiaron para la recogida de muestras de sangre, luego se sacrificaron y se recogieron las vejigas urinarias tal como se describe a continuación. Los parámetros nociceptivos se expresan tal como sigue:

Las AUC se calcularon usando GraphPad Prism® (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EE.UU.). El método de AUC para evaluar la alodinia e hiperalgesia se muestra esquemáticamente en la figura 4 B.

Resultados:

Antes de la inyección de CYP, no se observaron diferencias significativas en los parámetros nociceptivos entre los 3 grupos diferentes en los que se inyectó CYP. Con el fin de analizar el efecto de XG-102 sobre el dolor visceral inducido por CYP, se compararon los parámetros nociceptivos entre los grupos tratados con vehículo y XG-102 independientemente. Veinticuatro horas después de la inyección de CYP, el umbral nociceptivo aumentó significativamente con el tratamiento con XG-102 en comparación con el vehículo (p<0,01, figura 7 A). El tratamiento con XG-102 redujo significativamente las puntuaciones nociceptivas en ratas en las que se inyectó CYP en comparación con el vehículo (p<0,001, figura 7 B). Además, el AUC 1-8 g se redujo significativamente con el tratamiento con XG-102 en comparación con el vehículo (p<0,001, figura 7 C). De manera similar, el AUC 8-60 g se redujo significativamente con el tratamiento con XG-102 en comparación con el vehículo (p<0,001, figura 7 D). Con el fin de analizar el efecto del ibuprofeno sobre el dolor visceral inducido por CYP, se compararon los parámetros nociceptivos entre los grupos tratados con vehículo y con ibuprofeno. El umbral nociceptivo aumentó significativamente con el tratamiento con ibuprofeno en comparación con el vehículo en ratas en las que se inyectó CYP (p<0,01, figura 7 A). El tratamiento con ibuprofeno redujo significativamente las puntuaciones nociceptivas en comparación con el vehículo (p<0,001, figura 7 B).

Además, el AUC 1-8 g y el AUC 8-60 g se redujeron significativamente con el tratamiento con ibuprofeno en comparación con el vehículo (p<0,001, figuras 7 C y 7 D).

En conjunto, el tratamiento intravenoso de XG-102 (2 mg/kg) revirtió por tanto significativamente el dolor visceral inducido por CYP, 24 horas después de su inyección. XG-102 inhibió eficazmente tanto la alodinia como la hiperalgesia. Se observaron efectos similares con la administración intravenosa de ibuprofeno (10 mg/kg). En conclusión, en el modelo preclínico de cistitis experimental, XG-102 mostró propiedades antinociceptivas significativas.

Ejemplo 13: Efectos de XG-102 (SEQ ID No. 11) administrado por vía intravenosa sobre los parámetros cistométricos en ratas conscientes con cistitis aguda inducida por ciclofosfamida (comparativo)

El objetivo del presente estudio fue evaluar los efectos de la administración intravenosa (i.v.) de XG-102 (2 mg/kg) sobre los parámetros cistométricos en cistitis inducida por CYP en ratas Sprague-Dawley hembra conscientes. Este modelo preclínico se usa bien para someter a prueba enfoques terapéuticos para el tratamiento de cistitis intersticial/síndrome de vejiga dolorosa (IC/PBS).

Se usaron ratas Sprague-Dawley hembra (211 - 281 g) (Janvier Labs, Le Genest Saint Isle, Francia). Se entregaron al laboratorio al menos 5 días antes de los experimentos para su aclimatación a las condiciones del laboratorio. Los animales se distribuyeron en los siguientes tres grupos experimentales:

Se anestesiaron las ratas con isoflurano (1,5 - 3 %). Después de una laparotomía, se exteriorizó la vejiga y se implantó un catéter de polietileno (0,58 y 0,96 mm de diámetro interno y externo, respectivamente) en la vejiga a través de la cúpula y se exteriorizó a nivel escapular. También se implantó y exteriorizó a nivel escapular un catéter yugular de polietileno (0,58 y 0,96 mm de diámetro interno y externo, respectivamente) para las administraciones i.v. En D-1 (24 horas después de la cirugía), se administró una sola dosis de CYP a 150 mg/kg o su vehículo (solución salina fisiológica: NaCl al 0,9 %) i.p. a 5 ml/kg.

El método que evalúa los efectos de las sustancias de prueba sobre la función de las vías urinarias inferiores se ha descrito por Lluel P, Barras M, Palea S. Cholinergic and purinergic contribution to the micturition reflex in conscious rats with longterm bladder outlet obstruction. Neurourol Urodyn. 2002; 21: 142-153. Se realizaron investigaciones cistométricas en ratas conscientes 24 horas después de la inyección intraperitoneal de CYP o vehículo. El día del experimento, los animales se mantuvieron bajo restricción parcial en un dispositivo de restricción. El catéter de la vejiga se conectó por medio de un tubo en T a un transductor de presión para medir la presión intravesical y a una bomba de inyección para llenar la vejiga a una velocidad de 2 ml/h. Se registró la presión vesical de manera continua durante 120 min: un período basal de 60 min antes de la administración intravenosa y un período de 60 min después de la administración.

Se administró XG-102 o vehículo (1 ml en 5 min) por vía intravenosa después de 1 hora de período basal.

El diseño del estudio se muestra esquemáticamente en la figura 8A.

Se analizaron los siguientes parámetros cistométricos (véase la figura 8 B):

• Presión umbral (ThP, mmHg), presión justo antes de la micción,

• Amplitud de la micción (AM), es decir, presión entre la presión umbral (ThP) y la presión máxima de micción (MP) (mmHg),

• Intervalo entre contracciones (ICI), es decir, tiempo entre dos micciones posteriores (s), y

• Capacidad de la vejiga (BC), es decir, ICI x tasa de infusión (ml).

Resultados:

No se observaron efectos del vehículo (i.v.) sobre los parámetros cistométricos ICI, BC, ThP y AM en ratas conscientes tratadas con CYP, en comparación con los valores basales (figuras 9 A, B, C y D). Por el contrario, XG-102 (2 mg/kg, i.v.) aumentó significativamente ICI y BC 30-60 min después de la administración en ratas tratadas con CYP, en comparación con los valores basales (P<0,01, figuras 10 A y B). Este aumento estaba asociado con una disminución significativa de ThP en el mismo punto de tiempo (P<0,01, figura 10 C).

En conjunto, el tratamiento intravenoso de XG-102 (2 mg/kg) aumentó significativamente ICI y BC y disminuyó ThP durante el período de 30-60 minutos después de la administración.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Péptido quimérico que comprende al menos un primer dominio y al menos un segundo dominio unidos por un enlace covalente, comprendiendo el primer dominio una secuencia de tráfico, y comprendiendo el segundo dominio una secuencia inhibidora de JNK para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno fuertemente relacionado con la señalización de JNK en un sujeto mediante administración intravesical, en el que la enfermedad o trastorno fuertemente relacionado con la señalización de JNK en un sujeto es cistitis, en particular cistitis intersticial, y en el que el péptido quimérico consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.

2. El péptido quimérico para su uso según la reivindicación 1, en el que la secuencia inhibidora de JNK se une a la cinasa amino terminal c-jun (JNK).

3. El péptido quimérico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la secuencia inhibidora de JNK inhibe la activación de al menos un factor de transcripción seleccionado como diana por JNK cuando la secuencia inhibidora de JNK está presente en una célula que expresa JNK.

4. El péptido quimérico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el factor de transcripción seleccionado como diana por JNK se selecciona del grupo que consiste en c-Jun, ATF2 y Elkl.

5. El péptido quimérico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia inhibidora de JNK altera un efecto de JNK cuando el péptido está presente en una célula que expresa JNK.

6. El péptido quimérico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la secuencia de tráfico aumenta la captación celular del péptido.

7. El péptido quimérico para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la secuencia de tráfico dirige la localización nuclear del péptido.