ES2784551T3 - Nuevas moléculas inhibidoras de JNK para el tratamiento de varias enfermedades - Google Patents

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Jean-Marc Combette
Catherine Deloche
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Abstract

Inhibidor de JNK que comprende una secuencia (poli)peptídica inhibidora según la siguiente fórmula general X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8 (SEQ ID NO: 1), donde X1 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P y Q, donde X2 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P y G, donde X3 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos K, R, k y r, donde X4 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos P y K, donde X5 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, a, s, q, k o está ausente, donde X6 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, D y A, donde X7 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos N, n, r y K; y donde X8 es un aminoácido seleccionado de F, f y w, y donde un residuo de aminoácido dado en letras mayúsculas indica un L-aminoácido, mientras que un residuo de aminoácido dado en letras minúsculas indica un residuo de D aminoácido, con la condición de que al menos uno de los aminoácidos seleccionado del grupo consistente en X3, X5, X7 y X8 sean D aminoácidos para su uso en método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevas moléculas inhibidoras de JNK para el tratamiento de varias enfermedades
La presente invención se refiere al campo de inhibición enzimática, en particular a inhibidores (poli)-péptidos de la quinasa amino terminal c-Jun (JNK). En particular, la presente invención se refiere al uso de estos inhibidores de JNK en el tratamiento de varias enfermedades.
La quinasa amino terminal c-Jun (JNK) es un miembro del grupo activado por estrés de las quinasas de proteína activadas por mitógeno (MAP). Estas quinasas están implicadas en el control del crecimiento y la diferenciación celular y, más generalmente, en la respuesta de las células a estímulos ambientales. La vía de transducción de las señales de JNK es activada en respuesta al estrés ambiental y por el acoplamiento de varias clases de receptores de la superficie celular. Estos receptores pueden incluir receptores de citoquina, receptores de serpentina y tirosina-quinasas receptoras. En células de mamífero, la JNK está implicada en procesos biológicos tales como la transformación oncogénica y la mediación de respuestas adaptivas al estrés ambiental. La JNK también se ha asociado a la modulación de la respuesta inmune, incluyendo la maduración y diferenciación de células inmunes, así como efectuando la muerte celular programada de células identificadas para su destrucción por el sistema inmune. Se ha demostrado que la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) p38alfa regula negativamente la proliferación celular al antagonizar la vía JNK-c-Jun. Por tanto, la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) p38alfa parece estar activa en la supresión de la proliferación de células normales y cancerosas (véase, por ejemplo, Hui et al., Nature Genetics, vol. 39, No. 6, Junio de 2007). También se ha demostrado que la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) está implicada en el dolor neuropático producido por ligación del nervio espinal (SNL), donde la SNL indujo una activación baja y persistente de JNK, en particular JNK1, mientras que se encontró una activación de la proteína quinasa activada por mitógeno p38 en la microglia espinal después de la SNL, la cual había caído casi al nivel basal en 21 días (Zhuang et al., The Journal of Neuroscience, Marzo 29, 2006, 26(13):3551-3560)). En 2007 (Biochemica et Biophysica Acta, pp.
1341-1348), Johnson et al. discutieron en una revisión la ruta de la c-Jun quinasa/activada por estrés, la participación de la señalización JNK en enfermedades, tales como la participación en la excitotoxicidad de las neuronas del hipocampo, isquemia hepática, reperfusión, enfermedades neurodegenerativas, pérdida de audición, sordera, defectos de nacimiento del tubo neural, cáncer, enfermedades inflamatorias crónicas, obesidad, diabetes, en particular diabetes resistente a la insulina, y propusieron que es probable que se necesiten inhibidores selectivos de JNK para el tratamiento de diversas enfermedades con un alto grado de especificidad y falta de toxicidad.
Por tanto, la inhibición o la interrupción de la ruta de señalización de JNK es un enfoque prometedor para combatir trastornos fuertemente relacionados a la señalización de JNK. Sin embargo, hasta ahora solo se conocen unos pocos inhibidores de la vía de señalización de JNK.
Como es sabido en la técnica anterior, en particular los inhibidores de la vía de señalización de JNK incluyen, por ejemplo, inhibidores de quinasa aguas arriba (por ejemplo CEP-1347), inhibidores químicos pequeños de JNK (SP600125 y AS601245), que afectan directamente a la actividad quinasa, por ejemplo compitiendo con el sitio de unión a ATP de la proteína quinasa, e inhibidores péptidos de la interacción entre JNK y sus sustratos (véase, por ejemplo, Kuan et al., Current Drug Targets - c Ns & Neurological Disorders, Febrero de 2005, vol.
4, No. 1, pág. 63-67; WO 2007/031280). La WO 2007/031280 describe péptidos de fusión permeables de células pequeñas que comprenden la también llamada secuencia transportadora TAT derivada de la secuencia de tráfico básica de la proteína HIV-TAT y una secuencia inhibidora de aminoácidos de IB1.
La WO 2007/031280 describe en particular dos secuencias específicas, L-TAT-IB1 (GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD, aquí SEQ ID NO: 196) y D-TAT-IB1 (dqsrpvqpflnlttprkprpprrrqrrkkrg; aquí SEQ ID NO: 197); ésta última es la secuencia retro-inversa de L-TAT-IB1. Debido a la secuencia transportadora derivada de HIV TAT, estos péptidos de fusión son transportados más eficientemente a las células diana, donde permanecen efectivos hasta la degradación proteolítica.
Dado que los inhibidores péptidos independientes de ATP de JNK normalmente son inhibidores más específicos, con frecuencia son la primera elección si se trata de inhibir JNK. Sin embargo, incluso los inhibidores péptidos descritos en la WO 2007/031280 no son óptimos para todos los fines. Por ejemplo, el compuesto L-TAT-IB1 (aquí SEQ ID NO: 196), que consiste en L-aminoácidos únicamente, es degradado proteolíticamente de forma rápida. Para superar este problema, los inventores de la WO 2007/031280 también sugirieron D-TAT-IB1 (aquí SEQ ID NO: 197), que comprende D-aminoácidos. Para ser más precisos, D-TAT-IB1 presenta la secuencia retroinversa de L-TAT-IB1. La incorporación de D-aminoácidos se hace difícil por el hecho de que el cambio en la estereoquímica puede llevar a una pérdida de función. El enfoque retroinverso puede emplearse para reducir el riesgo porque el uso de i) sólo D-aminoácidos, ii) pero en la secuencia de péptidos inversa puede más probablemente producir un análogo de conformación aceptable al péptido original que incorporar uno o más D-aminoácidos en la secuencia original. Sin embargo, en el caso de la WO 2007/031280 este enfoque se tradujo en una reducción significativa de la capacidad inhibidora en comparación con LTAT-IB1 (véase figura 4). Además, el péptido retroinverso es extremadamente estable a la digestión proteolítica, con la consecuencia de que digestiones controladas, por ejemplo en experimentos sensibles al tiempo, son difícilmente posibles.
Los inhibidores de JNK se han discutido, propuesto y probado con éxito en la técnica como tratamiento para diversos estados de enfermedad. Ya en 1997, Dickens et al. describieron el inhibidor de la quinasa amino terminal c-Jun JIP-1 y propuso JIP-1 como compuesto candidato para estrategias terapéuticas de tratamiento de, por ejemplo, leucemia mieloide crónica, en particular, en el contexto de la transformación causada por Bcr-Abl de pre-células B (Science; 1997; 277 (5326): 693-696).
En 2001, Bonny y colaboradores publicaron que los inhibidores peptídicos de JNK permeables a las células confirman la protección a largo plazo de las células pancreáticas p a la apoptosis inducida por IL-1p y, así, pueden preservar las células p de la destrucción autoinmune en el curso de la diabetes (Diabetes, 50, 2001, p.
77 - 82).
Bonny y col. (Reviews in Neurosciences, 2005, p. 57-67) también han discutido la acción inhibidora del inhibidor JNK D-JNKI-1 y otros inhibidores JNK en el contexto de excitotoxicidad, muerte celular neuronal, hipoxia, isquemia, daño cerebral traumático, epilepsia, enfermedades neurodegenerativas, apoptosis de neuronas y células auditivas sensoriales del oído interno, etc.
En la WO 98/49188 se proponen inhibidores derivados de JIP-1 de la señalización de JNK para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular y pérdida de memoria asociada, enfermedades autoinmunes como la artritis, otras condiciones caracterizadas por inflamación, tumores malignos, como leucemias, por ejemplo leucemia mielógena crónica (LMC), daño oxidativo a órganos como el hígado y el riñón, enfermedades cardíaca y rechazo a trasplantes.
Borsello y col. (Nat Med, 2003, (9), p. 1180-1186) publicó que un inhibidor peptídico de la c-Jun-N-terminal quinasa protege frente a la excitotoxicidad y la isquemia cerebral.
Assi et al. han publicado que otro inhibidor específico de JNK, SP600125, se dirige a la producción del factor de necrosis tumoral a y a la apoptosis de células epiteliales en la colitis murina aguda. Los autores concluyeron que la inhibición de JNK es valiosa en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal humana (Immunology; 2006, 118(1): 112-121).
En Kennedy et al. (Cell Cycle, 2003, 2 (3), p. 199-201), se discute en detalle el papel de la señalización de JNK en el desarrollo del tumor.
Lee Yong Hee y col. (J Biol Chem 2003, 278 (5), p. 2896 - 2902) demostraron que la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) media la inhibición de la retroalimentación de la cascada de señalización de insulina y han propuesto que la inhibición de la señalización de JNK es un buen enfoque terapéutico para reducir la resistencia a la insulina en pacientes diabéticos.
Milano y col. (Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007; 192 (4): H1828 - H1835) descubrieron que un inhibidor peptídico de la quinasa NH2-terminal c-Jun reduce la lesión miocárdica por isquemia-reperfusión y el tamaño del infarto in vivo. Los autores de dicho estudio utilizaron un inhibidor peptídico, D-JNKI-I, un péptido de dos dominios que contiene una secuencia de 20 aminoácidos del dominio mínimo de unión a JNK de la proteína-1 que interactúa con el islote-cerebro-1/JNK, unida a una secuencia TAT de 10 aminoácidos de la proteína TAT del virus de inmunodeficiencia humana que media en la translocación intracelular. Los autores han concluido que una reducción de la actividad de JNK y la fosforilación debido a la presencia de dicho inhibidor es importante en la preservación de la función cardíaca en ratas en fase de isquemia y apoptosis.
Otro grupo ha publicado que los pequeños inhibidores peptídicos de JNK protegen contra la lesión dopaminérgica nigral inducida por MPTP inhibiendo la vía de señalización de j Nk (Pan et al., Laboratory research, 2010, 90, 156 - 167). Los autores concluyeron que un péptido que comprende los residuos 153 -163 de JIP-1 murino fusionado con el péptido TAT ofrece neuroprotección contra la lesión por MPTP inhibiendo la vía de señalización de JNK y proporciona un enfoque terapéutico para la enfermedad de Parkinson.
Para el daño auditivo, Pirvola et al. (The Journal of Neuroscience, 2000, 20(1): 43-50) describieron el rescate de la audición, de células ciliadas auditivas y neuronas por CEP-1347/KT7515, un inhibidor de la activación de la quinasa c-Jun N-terminal. En general, los autores sugieren que la intervención terapéutica en la cascada de señalización de JNK puede ofrecer oportunidades para tratar lesiones del oído interno. El tratamiento de la pérdida auditiva mediante la administración de péptidos inhibidores de JNK también se describe en, por ejemplo, laWO 03/103698.
En particular para las enfermedades de la retina y la degeneración macular relacionada con la edad, Roduit et al. (Apoptosis, 2008, 13 (3), p. 343 - 353) también han sugerido el uso de la inhibición de JNK como enfoque terapéutico. Consideraciones similares que dependen de la inhibición de JNK se describen, por ejemplo, en la WO 2010/113753 para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, retinopatía diabética, coriorretinopatía exudativa central, vetas angioides, desprendimiento del epitelio pigmentario retiniano, coroiditis multifocal, maculopatía neovascular, retinopatía del prematuro, retinitis pigmentosa, enfermedad de Leber, oclusión de la arteria retiniana, oclusión de la vena retiniana, coriorretinopatía serosa central, macroaneurisma retiniano, desprendimiento de retina, vitreoretinopatía proliferativa, enfermedad de Stargardt, esclerosis coroidea, corioderemia, distrofia macular viteliforme, enfermedad de Oguchi, fundus albipunctatus, retinitis punctata albescens y atrofia girada de coroides y retina.
Zoukhri y col. (Journal of Neurochemistry, 2006, 96, 126 -135) identificaron que la quinasa c-Jun NH2-terminal media la inhibición de la secreción de la glándula lacrimal inducida por la interleucina-1p. Llegaron a la conclusión de que JNK desempeña un papel fundamental en la inhibición de la secreción de la glándula lacrimal mediada por IL-1 y el consecuente ojo seco.
Para la uveítis, Touchard et al. (Invest Ophthalmol Vis Sci, 2010, 51 (9):4683 - 4693) han sugerido el uso de DJNKI 1 como tratamiento efectivo.
Para la IBD (enfermedad inflamatoria intestinal), Roy et al. (World J Gastroenterol 2008, 14(2), 200 - 202) han destacado el papel de la vía de transducción de las señales JNK en la misma y han propuesto el uso de inhibidores peptídicos JNK para el tratamiento de dicho estado de enfermedad.
Beckham et al (J Virol. 2007 Jul; 81(13): 6984-6992) demostraron que el inhibidor de JNK D-JNKI-1 es eficaz para proteger a los ratones de la encefalitis viral y sugieren que la inhibición de JNK es una estrategia de tratamiento prometedora y novedosa para la encefalitis viral.
Palin y col. (Psychopharmacology (Berl). Mayo de 2008; 197 (4): 629-635) usaron el mismo inhibidor de JNK, D-JNKI-1, y descubrieron que el pretratamiento con D-JNKI-1 (10 ng/ratón), pero no con D-TAT, inhibía significativamente los tres índices de enfermedad inducidos por TNFalfa central y sugirieron la inhibición de JNK como medio para tratar los trastornos depresivos mayores que se desarrollan en un contexto de comportamiento de enfermedad inducida por citoquinas.
En la WO 2010/151638 se propuso el tratamiento de la enfermedad neurodegenerativa atrofia muscular espinal mediante la inhibición de JNK.
La WO 2009/143865 describe el uso de diversos péptidos inhibidores de JNK para el tratamiento de varias enfermedades. Los péptidos pueden estar compuestos de D-aminoácidos, L-aminoácidos o una combinación de ambos. En particular, la WO 2009/143865 describe el uso de los inhibidores de JNK descritos en el documento WO 2007/031280, como se discutió anteriormente, péptidos para el tratamiento de diversas enfermedades.
En el párrafo anterior ya se destaca, en base a solo algunas publicaciones seleccionadas, la utilidad de los inhibidores de JNK en el tratamiento de diversas enfermedades. Por tanto, existe una necesidad constante en la técnica de inhibidores de JNK para su uso en el tratamiento de enfermedades humanas (y animales).
Así, el problema a resolver por la presente invención era proporcionar otros inhibidores (péptidos) de JNK. El objetivo de la presente invención es resuelto por el inventor mediante el objeto de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de las figuras
A continuación se describen brevemente las figuras adjuntas. Las figuras tienen el propósito de ilustrar la presente invención con mayor detalle.
Fig. 1: Ilustración de la eficacia inhibidora de varios inhibidores de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención (SEQ ID NO 2, 3, 5, 6 y 7) y no según la presente invención (SEQ ID NO: 193), que se investigó mediante el ensayo AlphaScreen in vitro (Ensayo de Tamiz Homogéneo de Proximidad por Luminiscencia Amplificada).
Fig. 1A: Inhibición de JNK1 por las SEQ ID NO: 193, 2, 3, 5, 6 y 7.
Fig. 1B: Inhibición de JNK2
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por las SEQ ID NO: 193, 2, 3, 5, 6 y 7.
Fig. 1C: Inhibición de JNK3 por las SEQ ID NO: 193, 2, 3, 5, 6 y 7. Fig. 2: Tabla que ilustra la eficacia inhibidora de varios inhibidores de JNK (SEQ ID NO: 193, 2, 3, 5, 6 y 7) para su uso de acuerdo con la presente invención (SEQ ID NO 2, 3, 5, 6 y 7) y no según la presente invención (SEQ ID NO: 193). Se dan los valores IC50 en el rango nM, el error estándar de la media respectivo y el número de experimentos llevados a cabo (n).
Fig. 3: Ilustración de la eficacia inhibidora de varios inhibidores de JNK para su de acuerdo con la presente invención (SEQ ID NO 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181), que son proteínas de fusión de una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de JNK y una secuencia transportadora, en comparación con péptidos no según la invención (SEQ ID NO 194, 195, 200, 46, 197). La eficacia inhibidora se determinó mediante un ensayo AlphaScreen in vitro (Ensayo de Tamiz Homogéneo de Proximidad por Luminiscencia Amplificada).
Fig. 3A: Inhibición de JNK1 por las SEQ ID NO: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 y 197.
Fig. 3B: Inhibición de JNK2 por las SEQ ID NO: 194, 195, 172, 46, 173, 174, 175, 176, 177 178, 179, 180, 181 y 197.
Fig. 3C: Inhibición de JNK3 por las SEQ ID NO: 194, 195, 172, 46, 173, 174, 175, 176, 177 178, 179, 180, 181 y 197.
Fig. 3D: Inhibición de JNK1 por las SEQ ID NO: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186.
187, 188, 189, 190 y 197.
Fig. 3E: Inhibición de JNK2 por las SEQ ID NO: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186.
187, 188, 189, 190 y 197.
Fig. 3F: Inhibición de JNK3 por las SEQ ID NO: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186.
187, 188, 189, 190 y 197.
Fig. 4: Tabla que ilustra la eficacia inhibidora de varios inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invención (SEQ ID NO: 172 -183, 185 -187 y 190), que son proteínas de fusión de una secuencia de (poli)-péptidos inhibidora de JNK y una secuencia transportadora, en comparación con péptidos no según la invención (SEQ ID NO 46, 194 - 197 y 200). Se dan los valores IC50 en el rango nM, el error de la media estándar (SEM) respectivo y el número de experimentos llevado a cabo (n).
Fig. 5: Estabilidad de los inhibidores de JNK de SEQ ID NO: 172, 196 y 197 en 50% de suero humano.
El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 196 fue totalmente degradado en residuos aminoácidos en 6 horas (A). El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 fue completamente degradado sólo después de 14 días (B). El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 197 era estable al menos hasta 30 días (B). Fig. 6: Muestra experimentos de internalización usando constructos transportadores derivados de TAT con un patrón de D-aminoácidos/L-aminoácidos como se indica en la SEQ ID NO: 30. Las secuencias transportadoras analizadas corresponden a las SEQ ID NO: 52-94 más las SEQ ID NO: 45, 47, 46, 43 y 99 (Fig. 6a) y las SEQ ID NO: 100-147 (Fig. 6b). Como puede verse, todos los transportadores con la secuencia consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31) mostraron una capacidad de internalización más alta que el transportador de L-TAT (SEQ ID NO: 43). Células Hela fueron incubadas 24 horas en placas de 96 pocillos con 10 mM de los transportadores respectivos. Las células fueron después lavadas dos veces con un tampón de pH ácido (0,2M glicina, 0,15M NaCl, pH 3,0) y dos veces con PBS. Las células se lisaron por la adición del tampón de lisis RIPA. La cantidad relativa de péptido internalizado se determinó después leyendo la intensidad de fluorescencia (lector de placa Fusion Alpha, PerkinElmer) de cada extracto seguida por la resta del fondo.
Fig. 7: El inhibidor de JNK de secuencia SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de citoquinas y quimioquinas inducida por LPS en macrófagos diferenciados por THP1-PMA. Fig. 7A: Liberación de TNF (THP1pma 6h 3 ng/ml LPS); Fig. 7B: Liberación de TNFa (THP1pma 6h 10 ng/ml LPS); Fig. 7C: Liberación de IL 6 (THP1pma 6h 10 ng/ml LPS); Fig. 7D: Liberación de MCP1 (THP1pma 6h 3 ng/ml LPS).
Fig. 8: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de IL6 inducida por LPS en macrófagos diferenciados con THP1 con más alta potencia que D-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 197), dTAT (SEQ ID NO: 45) y SP 600125. Se añadió LPS durante 6 horas (10 ng/ml).
Fig. 9: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de TNFa inducida por LPS en macrófagos diferenciados con THP1 con más alta potencia que D-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 197), dTAT (SEQ ID NO: 45) y SP 600125. Se añadió LPS durante 6 horas (10 ng/ml).
Fig. 10: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de IL-6 inducida por LPS en macrófagos diferenciados con PMA con más alta potencia que D-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 197) y L-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 196). Se añadió LPS durante 6 horas.
Fig. 11: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de TNFa inducida por LPS en macrófagos diferenciados con PMA con más alta potencia que D-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 197) y L-TATIB1 (SEQ ID NO: 196).
Fig. 12: El inhibidor de JNK de Se Q ID NO: 172 bloquea la liberación de TNFa inducida por LPS en células primarias de sangre entera de rata a 3 ng/ml. Se dan los resultados para el control, 1 pM de SEQ ID NO: 172, 3 pM de SEQ ID NO: 172 y 10 pM de SEQ ID NO: 172 a diferentes niveles de LPS (ng/ml).
Fig. 13: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la secreción de IL2 por células T humanas primarias en respuesta a PMA/lonomicina.
Fig. 14: El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 bloquea la secreción de IL2 por células T humanas primarias en respuesta a la estimulación con CD3/CD28. Los inhibidores de JNK usados se indican por su s Eq ID NO: 172 y 197.
Fig. 15: Inhibición dosis-dependiente por el inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 de la liberación de IL-2 inducida por CD3/CD28 en células T primarias purificadas de nódulos linfáticos de rata. Ratas de control fueron sacrificadas y se recogieron los nódulos linfáticos. Las células T fueron purificadas (usando selección negativa magnética) y colocadas en placas de 96 pocillos a 200.000 células/pocillo. Las células fueron tratadas con anticuerpos anti-CD3 de rata y anti-CD28 de rata (2 pg/ml). El inhibidor de JNK de SEQ ID NO:172 se añadió a los cultivos 1 hora antes del tratamiento con CD3/CD28 y la liberación de IL-2 se evaluó en el sobrenadante 24 horas después del tratamiento.
Fig. 16: Inhibición dosis-dependiente de la liberación de IL-2 inducida por CD3/CD28 en células T primarias purificadas de nódulos linfáticos de rata: Comparación de varios inhibidores de JNK, en particular las SEQ ID NO: 172, 197 y SP600125.
Fig. 17: Inhibición dosis-dependiente de la liberación de IL-2 en sangre entera de rata estimulada con PMA ionomicina. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1, 3 y 10 j M, 1 hora antes de la estimulación con PMA ionomicina. Tres dosis de activadores fueron añadidas (25/500 ng/ml, 50/750 ng/ml y 50/1.000 ng/ml) durante 4 horas. La liberación de IL-2 se evaluó en el sobrenadante. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 a 10 j M redujo eficientemente la liberación de IL-2 inducida por PMA-iono a las tres concentraciones de activador probadas.
Fig. 18: Inhibición de JNK y liberación de IL-6 en sangre entera humana. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1, 3 y 10 j M, 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con LPS (0,02 ng/ml) durante 4 horas. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 redujo la liberación de IL-6 inducida por LPS de una manera dosis-dependiente. Fig. 19: Inhibición de JNK y liberación de IL-2 en sangre entera humana. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1, 3 y 10 j M, 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PMA+ionomicina (25/700 ng/ml, 50/800 ng/ml y 50/1.000 ng/ml) durante 4 horas. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 redujo la liberación de IL-2 inducida por PMA+ionomicina de forma dosis- dependiente.
Fig. 20: Inhibición de JNK y liberación de IFN-y en sangre entera humana. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1, 3 y 10 j M, 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PMA+ionomicina (25/700 ng/ml, 50/800 ng/ml y 50/1.000 ng/ml) durante 4 horas. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 redujo la liberación de IFN-y inducida por PMA+ionomicina de forma dosis-dependiente.
Fig. 21: Inhibición de JNK y liberación de TNF-a en sangre entera humana. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1, 3 y 10 j M, 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PMA+ionomicina (25/700 ng/ml, 50/800 ng/ml y 50/1.000 ng/ml) durante 4 horas. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 redujo la liberación de TNF-a inducida por PMA+ionomicina de forma dosis-dependiente.
Fig. 22: Inhibición de JNK y liberación de TNF-a en sangre entera humana. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1, 3 y 10 j M, 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PHA-L (5 jg/m l) durante 3 días. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 redujo la liberación de TNF-a inducida por PHA-L de forma dosis-dependiente. Fig. 23: Inhibición de JNK y liberación de IL-2 en sangre entera humana. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1, 3 y 10 j M, 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con PHA-L (5 jg/m l) durante 3 días. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 redujo la liberación de IL-2 inducida por PHA-L de forma dosis-dependiente.
Fig. 24: Inhibición de JNK y liberación de TNF-a en sangre entera humana. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se añadió a tres concentraciones diferentes, en particular 1, 3 y 10 j M, 1 hora antes de la estimulación de sangre entera con anticuerpos de CD3 /- CD28 (2 jg/m l) durante 3 días. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 redujo la liberación de TNF-a inducida por CD3/CD28 de forma dosis-dependiente.
Fig. 25: Ilustración fotográfica de las propiedades antiinflamatorias in vivo de los inhibidores de JNK de SEQ ID NO: 197 (10 jg/kg) y SEQ ID NO: 172 (10 jg/kg) después de inflamación en la pata inducida por CFA (adyuvante completo de Freund). La inflamación de la pata se indujo en la pata trasera izquierda, la pata trasera derecha no se trató.
Fig. 26: Representación gráfica de las propiedades antiinflamatorias in vivo de los inhibidores de JNK de SEQ ID NO: 197 (10 jg/kg, n = 4) y SEQ ID NO: 172 (10 jg/kg, n = 3) después de inducir hichazón en la pata con CFA (adyuvante completo de Freund). Se indica la circunferencia medida de la pata trasera izquierda después del tratamiento.
Fig. 27: Representación gráfica de las propiedades antiinflamatorias in vivo de los inhibidores de JNK de SEQ ID NO: 197 (10 jg/kg) y Se Q ID NO: 172 (10 jg/kg) después de la inflamación de la pata inducida por CFA (adyuvante completo de Freund). Se indica la liberación de citoquinas in vivo medida una hora después de la inflamación de la pata inducida por CFA.
Fig. 28: Evaluación clínica de la administración de diferentes cantidades del inhibidor JNK de acuerdo con la SEQ ID NO: 172 en ratas albinas después de la administración intravenosa (modelo de uveítis inducida por endotoxinas). De izquierda a derecha: vehículo, 0,015 mg/kg (i.v.) de SEQ ID NO: 172; 0,18 mg/kg (i.v.) de SEQ ID NO: 172; 1,8 mg/kg (i.v.) de SEQ ID NO: 172, 2 mg/kg (i.v.) de SEQ ID NO: 197 y 20 jg de dexametasona (administrada directamente por inyección subconjuntival en el ojo). Se indica la puntuación clínica (media y SEM).
Fig. 29: Efectos de respuesta del inhibidor JNK de SEQ ID NO: 172 después de la administración intravenosa diaria en artritis de colágeno tipo II crónica establecida en ratas de 14 días (RTTC / SOL-1). Se muestra el cambio de peso corporal del día 0 al día 14. De izquierda a derecha: Estela normal Vehículo (NaCl), Control de Enfermedad Vehículo (NaCl), 5 mg/kg (i.v.) de SEQ ID NO: 172; 1 mg/kg (i.v.) de SEQ ID NO: 172; 0,1 mg/kg (i.v.) de SEQ ID NO: 172, 0,01 mg/kg (i.v.) de SEQ ID NO: 172, 0,05 mg/kg (i.v.) de dexametasona. Se indica la puntuación clínica (media y SEM). n = 4 / grupo normal, n = 8 / grupo de tratamiento; * p <0,05 ANOVA de 1 vía para el Control de enfermedad Vehículo (NaCl)
Fig. 30: Efectos de respuesta del inhibidor JNK de SEQ ID NO: 172 después de la administración intravenosa diaria en artritis de colágeno de tipo II crónica establecida en ratas de 14 días (RTTC / SOL-1). Se muestra el diámetro del tobillo (en) con el tiempo. n = 4 / grupo normal, n = 8 / grupo de tratamiento; * p <0,05 ANOVA RM de 2 vías para el Control de Enfermedad Vehículo (NaCl).
Fig. 31: Efectos de respuesta del inhibidor JNK de SEQ ID NO: 172 después de la administración intravenosa diaria en artritis de colágeno tipo II crónica establecida en ratas de 14 días (RTTC / SOL-1). Se ilustran las puntuaciones de histopatología del tobillo con respecto a la inflamación, el pannus, el daño del cartílago y la resorción ósea. n = 8 en el grupo de tratamiento. * p <0,05 Prueba U de Mann-Whitney para el Control de enfermedad Vehículo (NaCl).
Fig. 32: Efectos de respuesta del inhibidor JNK de SEQ ID NO: 172 después de la administración intravenosa diaria en artritis de colágeno de tipo II crónica establecida en ratas de 14 días (RTTC / SOL-1). Se ilustran las puntuaciones de histopatología de la rodilla con respecto a la inflamación, el pannus, el daño del cartílago y la resorción ósea. n = 8 en el grupo de tratamiento. * p <0,05 Prueba U de Mann-Whitney para el Control de enfermedad Vehículo (NaCl).
Fig. 33: Puntuación clínica mediante lámpara de hendidura 24 horas después de la inducción de EIU y la administración del inhibidor JNK de acuerdo con la SEC ID NO: 172 (1 mg/kg i.v.) en diferentes momentos antes de la inducción de EIU. De izquierda a derecha: vehículo (0 horas); SEQ ID NO: 1724 semanas antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 1722 semanas antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 172 1 semana antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 17248 horas antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 17224 horas antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 1720 horas antes de la inducción de EIU; Dexametasona (2 mg/kg i.v.) 0 horas antes de la inducción de EIU. Media ± SEM. * p <0,05 versus vehículo, ** p <0,01 versus vehículo.
Fig. 34: Número de células PMN por sección cuantificadas 24 horas después de la inducción de EIU y la administración del inhibidor de JNK de acuerdo con la SEQ ID NO: 172 (1 mg/kg i.v.) en diferentes momentos antes de la inducción de EIU. De izquierda a derecha: vehículo (0 horas); SEQ ID NO: 1724 semanas antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 1722 semanas antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 172 1 semana antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 17248 horas antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 17224 horas antes de la inducción de EIU; SEQ ID NO: 1720 horas antes de la inducción de EIU; Dexametasona (2 mg/kg i.v.) 0 horas antes de la inducción de EIU. Media ± SEM. * p <0,05 versus vehículo, ** p <0,01 versus vehículo.
Fig. 35: Muestra los valores medios calculados del AUC de TBUT para animales con síndrome de ojo seco inducido por escopolamina. Se muestran los resultados para animales tratados con vehículo, 3 concentraciones diferentes de un (poli)péptido inhibidor de JNK todo-D-retro-inverso de secuencia de SEQ ID NO: 197, 3 concentraciones diferentes de un (poli)péptido inhibidor de JNK de secuencia SEQ ID NO: 172 y los resultados para animales tratados con ciclosporina. Fig. 36: Muestra los valores medios calculados del AUC de PRTT para animales con ojo seco inducido por escopolamina (días 7-21). Se muestran los resultados para animales tratados con vehículo, 3 concentraciones diferentes de un (poli)péptido inhibidor de JNK todo-D-retro-inverso de secuencia SEQ ID NO: 197, 3 concentraciones diferentes de un (poli)péptido inhibidor de JNK de secuencia SEQ ID NO: 172 y los resultados para animales tratados con ciclosporina.
Fig. 37: Muestra la puntuación histológica media de lesión de córnea para animales con síndrome de ojo seco inducido por escopolamina. Se muestran los resultados para animales tratados con vehículo, 3 concentraciones diferentes de un (poli)péptido inhibidor de JNK todo-D-retro-inverso de secuencia SEQ ID NO: 197, 3 concentraciones diferentes de un (poli)péptido inhibidor de JNK de secuencia SEQ ID NO: 172 y los resultados para animales tratados con ciclosporina.
Inhibidores de JNK
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un inhibidor de JNK que comprende una secuencia de (poli)péptidos inhibidora de acuerdo con la siguiente fórmula general:
X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8 (SEQ ID NO: 1),
donde X1 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P y Q,
donde X2 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P y G,
donde X3 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos K, R, k y r,
donde X4 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos P y K,
donde X5 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, a, s, q, k o está ausente,
donde X6 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, D y A,
donde X7 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos N, n, r y K; y
donde X8 es un aminoácido seleccionado de F, f y w,
donde los residuos aminoácidos en letras mayúsculas indican L-aminoácidos, mientras que los residuos aminácidos en letras minúsculas indican residuos aminoácidos D,
con la condición de que al menos uno de los aminoácidos seleccionados del grupo consistente en X3, X5, X7 y X8 sea/sean D-aminoácidos, preferentemente con la condición de que al menos tres o cuatro de los aminoácidos seleccionados del grupo consistente en X3, X5, X7 y X8 sea D-aminoácidos, para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
En general, la presente descripción que comprende la presente invención se refiere a un inhibidor de JNK que comprende una secuencia inhibidora (poli)peptídica de acuerdo con la siguiente fórmula general:
X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7 -L-X8 (SEQ ID NO: 1),
donde X1 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, Q y r,
donde X2 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, G y r,
donde X3 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos K, R, k y r,
donde X4 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos P y K,
donde X5 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, a, s, q, k o está ausente,
donde X6 es un aminoácido seleccionado de loa aminoácidos T, D y A,
donde X7 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos N, n, r y K; y
donde X8 es un aminoácido seleccionado de F, f y w,
con la condición de que al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o seis de los aminoácidos seleccionados del grupo consistente en X1, X2, X3, X5, X7 y X8 es/son D-aminoácido(s), preferiblemente con la condición de que al menos uno, al menos dos, al menos tres o cuatro de los aminoácidos seleccionados del grupo consistente en X3, X5, X7 y X8 es/son D-aminoácido(s),
para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
La secuencia de (poli)péptidos inhibidora del inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención comprende L-aminoácidos y D-aminoácidos. A menos que se especifique lo contrario, los residuos de L-aminoácidos son indicados aquí en letras mayúsculas, mientras que los residuos de D-aminoácidos se indican en letras minúsculas. La glicina puede indicarse en letras mayúsculas o minúsculas (ya que no hay D- o L-glicina). Las secuencias de aminoácidos descritas aquí siempre se dan del extremo N al C (izquierda a derecha) a menos que se especifique lo contrario. La secuencia de aminoácidos dada puede estar o no modificada en el extremo C y/o N, por ejemplo acetilación en el extremo C y/o amidación o modificación con cisteamida en el extremo N. Por motivos de claridad, estas modificaciones posibles pero totalmente opcionales en el extremo C y/o N de las secuencias de aminoácidos aquí descritas, por motivos de claridad, no se indican específicamente.
Los inhibidores de JNK para su uso según la presente invención son (poli)péptidos inhibidores de la quinasa N-terminal c-Jun (JNK). Dichos inhibidores inhiben la actividad quinasa de la quinasa N-terminal c-Jun (JNK), es decir, impiden o reducen el grado de fosforilación de los sustratos de JNK tales como c-Jun, ATF2 y/o Elk-1. El experto en la técnica entenderá que el término “inhibidor”, tal como se usa aquí, no comprende compuestos que destruyen irreversiblemente la molécula quinasa N-terminal c-Jun (JNK) y/o la actividad quinasa. Además, el término “actividad inhibidora de JNK” según se usa aquí se refiere a la inhibición de la actividad quinasa de la quinasa N-terminal c-Jun (JNK).
Además, tal como se usa aquí, un inhibidor de JNK comprende al menos una unidad funcional de un polímero de aminoácidos, es decir una secuencia de (poli)péptidos. Además, este al menos un polímero funcional de aminoácidos proporciona la inhibición de la actividad JNK. Los monómeros aminoácidos de esta secuencia de (poli)péptidos inhibidora normalmente están unidos unos a otros por enlaces peptídicos, pero modificaciones (químicas) de los enlaces peptídicos o de los residuos de cadena lateral pueden ser tolerables, siempre y cuando la actividad inhibidora (inhibición de la actividad JNK) no se pierda totalmente, es decir, la entidad química resultante se califique aún como inhibidor de JNK como se define funcionalmente aquí. El término “(poli)péptido” no deberá considerarse como limitativo de la longitud de la unidad (poli)péptido. Preferentemente, la secuencia de (poli)péptidos inhibidora de los inhibidores de JNK para su uso según la presente invención es menor de 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, o menor de 12 aminoácidos de longitud. La secuencia de (poli)péptidos inhibidora no tiene menos de 11 residuos aminoácidos.
Además, un “inhibidor de JNK” para su uso según la presente invención inhibe la actividad JNK, por ejemplo, con respecto a la inhibición de la fosforilación mediada por JNK humana de un sustrato c-Jun (SEQ ID NO: 198), tiene un valor IC50 de:
a) menos de 3.000 nM, muy preferiblemente menos de 2.000 nM, todavía más preferiblemente menos de 1.000 nM, incluso más preferiblemente menos de 500 nM, aún más preferiblemente menos de 250 nM, todavía más preferiblemente menos de 200 nM, incluso muy preferiblemente menos de 150 nM, más preferiblemente menos de 100 nM, con respecto a la inhibición de JNK1 humano,
b) menos de 3.000 nM, muy preferiblemente menos de 2.000 nM, todavía más preferiblemente menos de 1.000 nM, incluso más preferiblemente menos de 500 nM, aún más preferiblemente menos de 250 nM, todavía más preferiblemente menos de 200 nM, incluso muy preferiblemente menos de 150 nM, más preferiblemente menos de 100 nM, con respecto a la inhibición de JNK2 humano,
c) menos de 3.000 nM, muy preferiblemente menos de 2.000 nM, todavía más preferiblemente menos de 1.000 nM, incluso más preferiblemente menos de 500 nM, aún más preferiblemente menos de 250 nM, todavía más preferiblemente menos de 200 nM, incluso muy preferiblemente menos de 150 nM, más preferiblemente menos de 100 nM, con respecto a la inhibición de JNK3 humano.
Para algunas aplicaciones se prefiere que el inhibidor inhiba la JNK2 humana y/o la JNK3 humana de acuerdo con la definición anterior, pero no JNK1 de acuerdo con la definición anterior.
Si la actividad JNK es inhibida o no, esto se puede ser fácilmente evaluado por el experto en la técnica. Son conocidos diversos métodos en la técnica. Un ejemplo es un ensayo de quinasa radioactiva o un ensayo de quinasa no radioactiva (por ejemplo, prueba Alpha Screen, véase por ejemplo Guenat et al., J. Biomol Screen, 2006; 11: páginas 1015-1026).
Un inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención puede así, por ejemplo, comprender una secuencia de (poli)péptidos inhibidora de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NO: 3 a 20, 22 a 24 y 27 (véase la tabla 1).
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El inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención también puede ser un inhibidor de JNK (variante) que comprende una secuencia de (poli)péptidos inhibidora que comparte al menos el 80%, muy preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 3-20, 22-24 y 27, en particular con la SEQ ID NO: 8, con la condición de que, con respecto a la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NO: 3-20, 22-24 y 27, tal secuencia de (poli)péptidos inhibidora que comparte identidad de secuencia:
a) mantiene el residuo L-arginina (R) en la posición 4,
b) mantiene los dos residuos L-leucina (L) en la posición 8 y 10 (posiciones 7 y 9 con respecto a la SEQ ID NO: 27),
c) tiene uno, dos, tres o cuatro D-aminoácidos en las posiciones respectivas que corresponden a los aminoácidos seleccionados del grupo consistente en X3, X5, X7 y X8 de SEQ ID NO: 1 y posiciones respectivas en las SEQ ID NO: 3-20, 22-24 y 27 y
d) aún inhibe la actividad de JNK (es decir, es un inhibidor de JNK como se define aquí).
Ciertamente, las variantes aquí descritas (en particular variantes inhibidoras de JNK que comprenden una secuencia de (poli)péptidos inhibidora que comparte - dentro la definición anterior - cierto grado de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 1-27), preferentemente comparten menos del 100% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia respectiva.
En vista de dicha definición y por motivos de claridad, los residuos que no pueden ser cambiados en las variantes de inhibidores de JNK que comprenden las SEQ ID NO: 1-27 (véase a) y b) en la definición anterior) están subrayados en la tabla 1.
Preferentemente, los aminoácidos no idénticos son el resultado de sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Las sustituciones de aminoácidos conservadoras, tal como se usan aquí, pueden incluir residuos de aminoácidos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoquímicas lo suficientemente similares para que una sustitución entre miembros del grupo conserve la actividad biológica de la molécula (véase, por ejemplo, Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864). En particular, las sustituciones de aminoácidos conservadoras son preferentemente sustituciones donde los aminoácidos proceden de la misma clase de aminoácidos (por ejemplo aminoácidos básicos, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos con cadenas laterales alifáticas, aminoácidos con cadenas laterales cargadas positiva o negativamente, aminoácidos con grupos aromáticos en las cadenas laterales, aminoácidos cuyas cadenas laterales puedan participar en puentes de hidrógeno, por ejemplo cadenas laterales que tienen una función hidroxilo, etc.). Las sustituciones conservadoras se consiguen en este caso, por ejemplo, sustituyendo un residuo aminoácido básico (Lys, Arg, His) por otro residuo aminoácido básico (Lys, Arg, His), sustituyendo un residuo aminoácido alifático (Gly, Ala, Val, Leu, Ile) por otro residuo aminoácido alifático, sustituyendo un residuo aminoácido aromático (Phe, Tyr, Trp) por otro residuo aminoácido aromático, sustituyendo treonina por serina o leucina por isoleucina. Intercambios de aminoácidos conservadores adicionales son conocidos por el experto en la técnica. Preferentemente, la forma isomérica debe mantenerse, por ejemplo K preferentemente se sustituye por R o H, mientras k preferentemente se sustituye por r y h.
Otras sustituciones posibles dentro de la definición anterior para variantes del inhibidor de JNK son, por ejemplo, si:
a) uno, dos o más de X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y/o X8 de SEQ ID NO: 1 o las posiciones correspondientes dentro de las secuencias respectivas seleccionadas de las SEQ ID NO: 2-27 se sustituyen por A o a,
b) X1 o X8 de SEQ ID NO: 1 o la posición correspondiente dentro de la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NO: 2-27 se elimina;
c) X5 de SEQ ID NO: 1 o la posición correspondiente dentro de la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NO: 2-27 es E, Y, L, V, F o K;
d) X5 de SEQ ID NO: 1 o la posición correspondiente dentro de la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NO: 2-27 es E, L, V, F o k; o
e) uno, dos o tres de X1, X2, X3 de SEQ ID NO: 1 o las posiciones correspondientes dentro de las secuencias respectivas seleccionadas de las SEQ ID NO: 2-27 son aminoácidos neutros.
Tal como se usa aquí, el término “% de identidad de secuencia” se debe entender como sigue: dos secuencias a comparar se alinean para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir insertar “espacios” en cualesquiera de una o ambas secuencias, para incrementar el grado de alineación. Entonces puede determinarse un % de identidad sobre la longitud completa de cada una de las secuencias que se están comparando (la llamada alineación global), esto es particularmente adecuado para secuencias de la misma o similar longitud, o sobre longitudes más cortas y definidas (la llamada alineación local), que es más adecuada para secuencias de longitud desigual. En el contexto anterior, una secuencia de aminoácidos que tiene una “identidad de secuencia” de al menos, por ejemplo, un 95% con una secuencia de aminoácidos de consulta, significa que la secuencia de la secuencia de aminoácidos objetivo es idéntica a la secuencia de consulta excepto que la secuencia de aminoácidos objetivo puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácido por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. En otras palabras, para obtener una secuencia de aminoácidos que tenga una secuencia con al menos un 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta 5% (5 de 100) de los residuos de aminoácido en la secuencia objetivo pueden insertarse o sustituirse con otro aminoácido o eliminarse. Para determinar la identidad de secuencia, la sustitución de un L-aminoácido por un D-aminoácido (y viceversa) se considera que produce un residuo no idéntico, incluso si es simplemente el isómero D (o el isómero L) del propio aminoácido.
Los métodos para comparar la identidad y homología de dos o más secuencias son bien conocidos en la técnica. El porcentaje al cual dos secuencias son idénticas puede por ejemplo determinarse usando un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido pero no limitativo de algoritmo matemático que se puede usar es el algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Este algoritmo está integrado en la familia BLAST de programas, por ejemplo, programa BLAST o NBLAST (véase también Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 o Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402), accesible a través de la página de inicio de la NCBI en el sitio web ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson y Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 85, 2444-2448). Las secuencias que son idénticas a otras secuencias hasta cierto grado pueden ser identificadas por estos programas. Además, los programas disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395), por ejemplo los programas b Es TFIT y GAP, se pueden usar para determinar el % de identidad entre dos secuencias de (poli)-péptidos. BESTFIT usa el algoritmo de “homología local” de (Smith y Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197) y encuentra la mejor región individual de similitud entre dos secuencias.
Ciertamente, el inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención puede comprender - aparte de la secuencia de (poli)péptidos inhibidora mencionada arriba - secuencias, dominios, marcadores (por ejemplo, marcadores fluorescentes o radioactivos), epítopos adicionales, etc., siempre y cuando la capacidad para inhibir la actividad JNK como se define aquí no se pierda. Por ejemplo, el inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención puede comprender también una secuencia transportadora. Una “secuencia transportadora” tal como se usa aquí es una secuencia de (poli)péptidos que proporciona la translocación de la molécula a la que está unida a través de membranas biológicas. En consecuencia, un inhibidor de JNK de acuerdo con la presente invención que comprende una secuencia transportadora preferentemente es capaz de translocar a través de membranas biológicas. Así, este inhibidor de JNK para su uso según la presente invención puede entrar más fácilmente en una célula, un subcompartimiento celular y/o en el núcleo de una célula.
La secuencia transportadora puede unirse por ejemplo (por ejemplo directamente) de forma N-terminal o (por ejemplo, directamente) de forma C-terminal a la secuencia de (poli)péptidos inhibidora del inhibidor de JNK. La secuencia transportadora y la secuencia de (poli)péptidos inhibidora también puede estar separada, por ejemplo, puede estar separada por secuencias intermedias. Se contempla también que la secuencia transportadora pueda disponerse por completo en cualquier lado de la molécula inhibidora de JNK que la secuencia de (poli)-péptidos inhibidora, en particular si el inhibidor de JNK es una molécula más compleja (por ejemplo que comprende varios dominios, sea un conjugado multimérico, etc.). También se contempla que la secuencia transportadora y la secuencia de (poli)péptidos inhibidora puedan superponerse, siempre y cuando la actividad inhibidora de JNK se mantenga. Ejemplos de esta superposición se dan posteriormente.
Las secuencias transportadoras para su uso con el inhibidor de JNK para su uso según la presente invención se pueden seleccionar de, sin limitarse a, secuencias transportadoras derivadas de HIV TAT (HIV), por ejemplo proteínas nativas tales como la proteína TAT (por ejemplo como la descrita en la patente US N° 5.804.604, col.
2, l.64 - col. 118, l. 25, en particular col. 3, l. 23 - 38 y en la US N° 5.674.980, col. 2, l.64 - col. 116, l. 36, en particular col. 3, l. 23 - 38), HSV VP22 (Herpes simplex) (descrita por ejemplo en WO 97/05265; Elliott y O'Hare, Cell 88:223-233 (1997)), proteínas no virales (Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. US 89:10691-10695 (1992)), secuencias transportadoras derivadas de Antennapedia, particularmente de Drosophila antennapedia (por ejemplo, la secuencia portadora de antennapedia de la misma), FGF, lactoferrina, etc., o derivados de péptidos básicos, por ejemplo péptidos que tienen una longitud de 5 a 15 aminoácidos, de preferencia 10 a 12 aminoácidos y que comprendan al menos 80%, muy preferiblemente 85% o incluso 90% aminoácidos básicos, tales como arginina, lisina y/o histidina, o se pueden seleccionar de, por ejemplo, secuencias de péptidos ricas en arginina, tales como RRRRRRRRR (Rg; SEQ ID NO: 152), RRRRRRRR (Re; SEQ ID NO: 153), RRRRRRR (Ry; SEQ ID NO: 154), RRRRRR (R6, SEQ ID NO: 155), RRRRR (R5, SEQ ID NO: 156), etc., de VP22, de proteínas o péptidos PTD-4, de RGD-K16, de proteínas o péptidos PEPT1/2 o PEPT1/2, de proteínas o péptidos SynB3 o SynB3, de inhibidores de PC, de proteínas o péptidos derivados de P21 o de proteínas o péptidos JNKl.
Ejemplos de secuencias transportadoras para su uso en el inhibidor de JNK para su uso según la presente invención son en particular, sin limitarse a las mismas, secuencias transportadoras básicas derivadas de la proteína HIV-1 TAT. Preferentemente, la secuencia transportadora básica de la proteína TAT de VIH-1 puede incluir secuencias de la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana VIH-1, por ejemplo, como se describe en, por ejemplo, patentes US N° 5.804.604 y 5.674.980. En este contexto, la proteína HIV-1 TAT de longitud completa tiene 86 residuos de aminoácido codificados por dos exones del gen HIV TAT. Los aminoácidos de TAT 1-72 son codificados por el exón 1, mientras que los aminoácidos 73-86 son codificados por el exón 2. La proteína TAT de longitud completa se caracteriza por una región básica que contiene dos lisinas y seis argininas (aminoácidos 49-57) y una región rica en cisteína que contiene siete residuos de cisteína (aminoácidos 22-37). La región básica (es decir, aminoácidos 49-57) se creía que era importante para la localización nuclear (Ruben, S. et al., J. Virol. 63: 1-8 (1989); Hauber, J. et al., J. Virol. 63 1181-1187 (1989). La región rica en cisteína media la formación de dímeros enlazados a metal in vitro (Frankel, A. D. et al., Science 240: 70-73 (1988); Frankel, A. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci US. 85: 6297-6300 (1988)) y es esencial para su actividad como un transactivador (García, J. A. et al., EMBO J. 7:3143 (1988); Sadaie, M. R. et al., J. Virol. 63:1 (1989)). Al igual que en otras proteínas reguladoras, la región N-terminal puede estar implicada en la protección frente a proteasas intracelulares (Bachmair, A. et al., Cell 56: 1019-1032 (1989)). Las secuencias transportadoras TAT a emplear preferentemente en el inhibidor de JNK para su uso según la presente invención se caracterizan por la presencia de la secuencia de aminoácidos de la región básica de TAT (aminoácidos 49­ 57 de la proteína TAT de origen natural); la ausencia de la secuencia de aminoácidos de la región rica en cisteína de TAT (aminoácidos 22-36 de la proteína TAT de origen natural) y la ausencia del dominio carboxiterminal codificado por el exón 2 de TAT (aminoácidos 73-86 de la proteína TAT de origen natural). Muy preferiblemente, la secuencia transportadora en el inhibidor de JNK para su uso según la presente invención se puede seleccionar de una secuencia de aminoácidos que contenga los residuos 48-57 ó 49 a 57 de TAT o variantes de los mismos.
Preferentemente, la secuencia transportadora en un inhibidor de JNK dado para su uso según la presente invención tiene también D-aminoácidos, por ejemplo para mejorar la estabilidad frente a proteasas. Se prefieren en particular las secuencias transportadoras que presentan un orden específico de D- y L-aminoácidos alternantes. Este orden de D- y L-aminoácidos alternantes (el motivo) puede seguir - sin estar limitado a - el patrón de cualquiera de las SEQ ID NO: 28-30:
d|LLLxdmLLLydn (SEQ ID NO: 28);
cíL.Ldíl__ eE ¡SEQ ID NO: 29:: ;y/o
dLLLdLLLd (SEQ ID NO: 30);
donde:
d es un D-aminoácido;
L es un L-aminoácido;
a es 0-3, de preferencia 0-2, muy preferiblemente 0, 1, 2 ó 3, todavía más preferiblemente 0, 1, ó 2 y muy preferiblemente 1;
l, m y n son independientemente unos de otros 1 ó 2, de preferencia 1;
x e y son independientemente entre sí 0, 1 ó 2, de preferencia 1.
Este orden de D- y L-aminoácidos (motivo) se hace relevante cuando la secuencia transportadora es sintetizada, es decir, mientras la secuencia de aminoácidos (es decir el tipo de residuos de cadena lateral) permanece sin alterar, los isómeros respectivos se alternan. Por ejemplo, una secuencia transportadora conocida derivada de HIV TAT es RKKr Rq RRR (SEQ ID NO: 43). Aplicar el orden de D-/L-aminoácidos de SEQ ID NO: 30 a la misma produciría rKKRrQRRr (SEQ ID NO: 46).
En una realización particular, la secuencia transportadora del inhibidor de JNK para su uso según la presente invención puede comprender al menos una secuencia de acuerdo con rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31), donde: r representa una arginina D-enantiomérica;
X es cualquier L-aminoácido (incluyendo glicina);
y donde cada X puede seleccionarse individual e independientemente de cualquier otra X dentro de la SEQ ID NO: 31. De preferencia, al menos 4 de dichos 6 X L-aminoácidos dentro de la SEQ ID NO: 31 son K o R. En otra realización, el inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención comprende la secuencia transportadora rX1X2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO: 32), donde X1 es K, X2 es K, X3 es R y X4, X5 y X6 son cualquier L-aminoácido (incluyendo glicina) seleccionado independientemente entre sí. De forma similar, la secuencia transportadora del inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención puede comprender la secuencia rX1X2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO: 33), donde X4 es Q, X5 es R, X 6 es R y X1, X2 y X3 son cualquier L-aminoácido (incluyendo glicina) seleccionado independientemente entre sí. El inhibidor de JNK también puede comprender la secuencia rX1X2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO: 34), donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis residuos de X-aminoácido se seleccionan del grupo consistente en: X1 es K, X2 es K, X3 es R, X4 es Q, X5 es R, X6 es R, mientras que los restantes residuos de aminoácido X no seleccionados del grupo anterior pueden ser cualquier L-aminoácido (incluyendo glicina) y se seleccionan independientemente entre sí. Preferentemente, X1 es entonces Y y/o X4 es K o R.
Ejemplos de secuencias transportadoras para su uso en la molécula inhibidora de JNK pueden seleccionarse de las secuencias dadas en la siguiente tabla 2 (SEQ ID NO: 31-170) o de cualquier fragmento o variante o derivado químicamente modificado de las mismas (de preferencia conservando la función de translocar a través de una membrana biológica).
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Como se mencionó arriba, las secuencias transportadoras también se pueden seleccionar de fragmentos o variantes de las secuencias anteriores de la tabla 2 (con la condición de que este fragmento o variante preferentemente conserve la función para proporcionar translocación a través de membranas biológicas). En este contexto específico, variantes y/o fragmentos de esas secuencias transportadoras comprenden preferentemente una secuencia de péptidos que comparte al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 85%, de preferencia al menos 90%, muy preferiblemente al menos 95% y más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia sobre la longitud completa de la secuencia de esta secuencia transportadora como la definida en la tabla 2. En este contexto específico, un “fragmento” de una secuencia transportadora como la definida en la tabla 2, se debe entender preferiblemente como una secuencia truncada de la misma, es decir, una secuencia de aminoácidos, que está truncada en el extremo N, extremo C y/o intrasecuencialmente en comparación con la secuencia de aminoácidos de la secuencia original.
Además, preferentemente, una “variante” de una secuencia transportadora o su fragmento como se definió arriba se debe entender como una secuencia en la que la secuencia de aminoácidos de la variante difiere de la secuencia transportadora original o de un fragmento de la misma como se define aquí en una o más mutaciones, tales como uno o más aminoácidos sustituidos (o, si es necesario, insertados y/o suprimidos). De preferencia, las variantes de esta secuencia transportadora como la definida arriba tienen la misma función biológica o actividad específica en comparación con la secuencia original respectiva, es decir, proporciona transporte, por ejemplo dentro de células o al núcleo. En este contexto, una variante de esta secuencia transportadora como la definida arriba puede por ejemplo comprender aproximadamente 1 a 50, 1 a 20, muy preferiblemente 1 a 10 y más preferiblemente 1 a 5, 4, 3, 2 ó 1 alteraciones de aminoácido. Las variantes de esta secuencia transportadora como la definida arriba pueden comprender preferentemente sustituciones de aminoácido conservadoras. El concepto de sustituciones de aminoácido conservadoras se conoce en la técnica y ya ha sido establecido antes para la secuencia de polipéptidos inhibidora de JNK y aplica aquí en consecuencia.
La longitud de una secuencia transportadora incorporada en el inhibidor de JNK para su uso según la presente invención puede variar. Se contempla que en algunas realizaciones de la secuencia transportadora del inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención tenga una longitud de menos de 150, menos de 140, menos de 130, menos de 120, menos de 110, menos de 100, menos de 90, menos de 80, menos de 70, menos de 60, menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20 y/o menos de 10 aminoácidos.
Si una secuencia transportadora específica aún es funcional en el contexto del inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención se puede determinar fácilmente por el experto en la técnica. Por ejemplo, el inhibidor de JNK que comprende un dominio transportador puede fusionarse a un marcador, por ejemplo una proteína fluorescente tal como GFP, un marcador radioactivo, una enzima, un fluoróforo, un epítopo, etc., que se puede detectar fácilmente en una célula. Después, el inhibidor de JNK que comprende la secuencia transportadora y el marcador es transfectado en una célula o añadido a un sobrenadante de cultivo y la permeación de las membranas celulares puede monitorearse usando métodos estándares biofísicos y bioquímicos (por ejemplo citometría de flujo, microscopía por inmunofluorescencia, etc.).
Ejemplos específicos de inhibidores de JNK que comprenden una secuencia transportadora se muestran en la tabla 3:
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Como se mencionó arriba, en una realización particular de la presente invención, la secuencia transportadora y la secuencia de (poli)péptidos inhibidora se pueden superponer. En otras palabras, el extremo N de la secuencia transportadora se puede superponer con el extremo C de la secuencia de (poli)péptidos inhibidora o el extremo C de la secuencia transportadora puede superponerse con el extremo N de la secuencia de (poli)péptidos inhibidora. La segunda realización es particularmente preferente. De preferencia, la secuencia transportadora se superpone en uno, dos o tres residuos aminoácidos con la secuencia de (poli)péptidos inhibidora. En este escenario, una secuencia transportadora dada puede superponerse con la SEQ ID NO: 1 o las variantes respectivas de la misma en la posición 1 (X1), posición 1 y 2 (X1, X2), posiciones 1,2 y 3 (X1, X2, X3).
Las SEQ ID NO: 174, 175, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 188, 189 y 190 son buenos ejemplos de inhibidores de JNK donde una secuencia transportadora y la secuencia de (poli)péptidos inhibidora se superponen, por ejemplo rKKRrQRRr RPTTLNLf (SEQ ID NO: 174) es una superposición de la SEQ ID NO: 46 (subrayada) y la SEQ ID NO: 11 (cursivas).
Ciertamente el inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención se puede seleccionar también de inhibidores de JNK que son una variante de cualesquiera de los inhibidores de j Nk de acuerdo con las SEQ ID NO: 171-183, 185-187 o 190. De preferencia, esta variante comparte al menos un 50%, muy preferiblemente al menos 55%, más preferiblemente al menos 60%, muy preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, muy preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, muy preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, muy preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 171-183, 185-187 o 190, en particular con la SEQ ID NO: 172, con la condición de que, con respecto a la secuencia de (poli)péptidos inhibidora dentro de las secuencias SEQ ID NO: 171-183, 185-187 o 190 (véase para referencia la secuencia de (poli)péptidos inhibidora de SEQ ID NO: 1 y ejemplos específicos de SEQ ID NO: 3-20, 22-24 y 27), esta secuencia que comparte identidad de secuencia:
a) mantiene el residuo L-arginina (R) en la posición 4 dentro de la secuencia de (poli)péptidos inhibidora, b) mantiene los dos residuos L-leucina (L) en la posición 8 y 10 (posiciones 7 y 9 con respecto a la SEQ ID NO: 27) dentro de la secuencia de (poli)péptidos inhibidora,
c) tiene al menos uno, al menos dos, al menos tres o al menos cuatro D-aminoácidos en las posiciones respectivas que correspondan a los aminoácidos seleccionados del grupo consistente en X3, X5, X7 y X8 de SEQ ID NO: 1 y posiciones respectivas en las SEQ ID NO: 3-20, 22-24 y 27, y
d) aún inhibe la actividad JNK (es decir, es un inhibidor de JNK como se define aquí).
En vista de dicha definición y para efectos de claridad, los residuos que no pueden ser cambiados en las variantes de los inhibidores de JNK que comprenden las SEQ ID NO: 171-190 (véase a) y b) en la definición anterior) están subrayados en la tabla 3.
Preferentemente, los aminoácidos no idénticos en las variantes de los inhibidores de JNK que comprenden las SEQ ID NO: 171-190 son el resultado de sustituciones de aminoácidos conservadoras (véase arriba). Ciertamente, las otras sustituciones posibles mencionadas arriba también se contemplan para variantes de inhibidores de JNK que comprenden las SEQ ID NO: 171-190. Asimismo, la presente invención contempla también variantes de cualesquiera de los inhibidores de JNK de acuerdo con las SEQ ID NO: 171-190 que se desvían de la secuencia original no exclusivamente en la secuencia de (poli)péptidos inhibidora, sino que tienen residuos variantes en la secuencia transportadora. Para variantes y fragmentos de secuencias transportadoras véase en particular la descripción anterior.
Como se mencionó previamente, la secuencia transportadora y la secuencia de (poli)péptidos inhibidora de JNK de los inhibidores de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención no necesariamente tienen que estar unidas directamente entre sí. También pueden estar separadas, por ejemplo, por secuencias de (poli)péptidos intermedias. Las secuencias intermedias preferentes que separan las secuencias de (poli)péptidos inhibidoras y otras secuencias (funcionales), tales como secuencias transportadoras, consisten en secuencias peptídicas cortas, de menos de 10 aminoácidos de longitud, tales como un hexámero, un pentámero, un tetrámero, un tripéptido o incluso únicamente un dipéptido o un solo residuo aminoácido. La secuencia intermedia particularmente preferente es una, dos o más copias de di-prolina, di-glicina, di-arginina y/o di-lisina, todas ellas en forma de L-aminoácido únicamente o en forma de D-aminoácido únicamente o con D- y L-aminoácidos mixtos. Ciertamente, también pueden emplearse otras secuencias separadoras de péptidos.
Un inhibidor de JNK particularmente preferente para su uso de acuerdo con la presente invención comprende la SEQ ID NO: 8 (o una secuencia que comparte una identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8 con el alcance y limitaciones definidos más arriba) y una secuencia transportadora. Preferentemente, la secuencia transportadora se selecciona de cualquiera de las SEQ ID NO: 31-170 o variantes de la misma como las definidas aquí, aún más preferiblemente de cualesquiera SEQ ID NO: 31-34 y 46-151. Una realización particularmente preferente de un inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención es un inhibidor de JNK que comprende la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 46 (o secuencias que comparten una identidad de secuencia respectiva con las mismas dentro del alcance y limitaciones definidos más arriba). Un ejemplo preferente es un inhibidor de JNK que comprende la secuencia SEQ ID NO: 172 o variantes respectivas de la misma, que varían en la secuencia transportadora y/o la secuencia de (poli)péptidos inhibidora como se definen aquí.
Tal como se usa aquí, que comprende cierta secuencia o cierta SEQ ID NO: normalmente implica que (al menos) una copia de la secuencia está presente, por ejemplo en la molécula inhibidora de JNK. Por ejemplo, una secuencia de (poli)péptidos inhibidora normalmente será suficiente para lograr la inhibición suficiente de la actividad JNK. Sin embargo, el inventor también contempla que el uso de dos o más copias de la secuencia respectiva (por ejemplo, dos o más copias de una secuencia de (poli)péptidos inhibidora de diferente o del mismo tipo y/o dos o más copias de una secuencia transportadora de diferente o del mismo tipo) también se puede emplear, siempre y cuando la capacidad general de la molécula resultante para inhibir la actividad JNK no se elimine (es decir, la molécula respectiva aún es un inhibidor de JNK como se define aquí).
Los inhibidores de JNK pueden obtenerse o producirse por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante síntesis química por medio de síntesis de péptidos en fase sólida usando la estrategia Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo), es decir, mediante rondas sucesivas de desprotección con Fmoc y ciclos de acoplamiento de Fmoc-aminoácidos. Un servicio comercial que ofrece esta síntesis de péptidos es provisto por muchas compañías, por ejemplo la compañía PolyPeptide (Strapbourg, Francia).
Opcionalmente, los inhibidores de JNK para su uso según la presente invención pueden modificarse, en particular en los residuos aminoácidos de la secuencia inhibidora (polipéptido). Las posibles modificaciones pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo consistente en:
i) etiquetas radiactivas, es decir, fosforilación radiactiva o una etiqueta radiactiva con azufre, hidrógeno, carbono, nitrógeno, etc.;
ii) tintes colorantes (por ejemplo digoxigena, etc.);
iii) grupos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, etc.);
iv) grupos quimioluminiscentes;
v) grupos para la inmovilización en fase sólida (por ejemplo, etiqueta His, biotina, etiqueta strep, etiqueta flag, anticuerpos, epítopos, etc.);
vi) pegilación;
vii) glicosilación;
viii) hesilación;
ix) sitios de escisión de proteasa (por ejemplo para la liberación controlada del inhibidor de JNK); x) modificaciones del esqueleto peptídico (por ejemplo enlaces (^C H 2-NH);
xi) protección de los residuos de la cadena lateral de aminoácidos;
xii) protección del terminal N- y/o C (por ejemplo, amidación N-terminal o acetilación C-terminal); xiii) una combinación de elementos de dos o más de los elementos mencionados en (i) a (xii).
Son particularmente preferentes las modificaciones seleccionadas de i) a xi) y las combinaciones de dos o más de los elementos mencionados en los puntos i) a xi). En este contexto, la presente invención se refiere en otro aspecto a un inhibidor JNK tal como se describe aquí modificado con las modificaciones seleccionadas de (i) a xi) o modificado con una combinación de dos o más de los elementos mencionados en (i) a xi), y a una composición farmacéutica (véase más adelante) que comprende dicho inhibidor de JNK modificado.
Composiciones farmacéuticas
Los inhibidores de JNK tal como se definen aquí, en particular para su uso según la presente invención, se pueden formular en una composición farmacéutica, que puede ser aplicada en la preveción o el tratamiento de cualquiera de las enfermedaddes aquí definidas. Típicamente, tal composición farmacéutica utilizada de acuerdo con la presente invención incluye, como un componente activo, un inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención tal como se define aquí. Preferentemente, el componente activo es un inhibidor de JNK que comprende o consiste en una secuencia (poli)peptídica inhibidora según cualquiera de las SEQ ID NO: 3-20, 22-24 y 27; o, si lleva unida una secuencia transportadora, según cualquiera de las SEq ID NO: 171-183-185-187 y l9o. De acuerdo con kla invención, la composición farmacéutica es para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
Los inventores de esta invención han encontrado además que los inhibidores de JNK como se definen aquí, en particular cuando están fusionados con una molécula transportadora, tienen una tasa de entrada en las células implicadas en las enfermedades de la presente invención particularmente alta. Por tanto, la cantidad de un inhibidor de un inhibidor de JNK en la composición farmacéutica a administrar a un sujeto puede tener una dosis muy baja. Así, la dosis puede ser mucho menor que la de fármacos peptídicos conocidos en la técnica, tales como DTS-108 (Florence Meyer-Losic y col., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53). Esto tiene varios aspectos positivos, por ejemplo una reducción de las reacciones secundarias potenciales y una reducción de los costes.
Preferentemente, la dosis (por kg de peso corporal) oscila en el intervalo hasta 10 mmol/kg, preferiblemente hasta 1 mmol/kg, de forma más preferente hasta 100 pmol/kg, de forma incluso más preferente hasta 10 pmol/kg, de forma todavía más preferente hasta 1 pmol/kg, de forma particularmente preferente hasta 100 nmol/kg, y de forma totalmente preferente hasta 50 nmol/kg.
Por tanto, el intervalo de dosis puede oscilar preferentemente entre aproximadamente 1 pmol/kg y aproximadamente 1 mmol/kg, entre aproximadamente 10 pmol/kg y aproximadamente 0,1 mmol/kg, entre aproximadamente 10 pmol/kg y aproximadamente 0,01 mmol/kg, entre aproximadamente 50 pmol/kg y aproximadamente 1 pmol/kg, entre aproximadamente 100 pmol/kg y aproximadamente 500 nmol/kg, entre aproximadamente 200 pmol/kg y aproximadamente 300 nmol/kg, entre aproximadamente 300 pmol/kg y aproximadamente 100 nmol/kg, entre aproximadamente 500 pmol/kg y aproximadamente 50 nmol/kg, entre aproximadamente 750 pmol/kg y aproximadamente 30 nmol/kg, entre aproximadamente 250 pmol/kg y aproximadamente 5 nmol/kg, entre aproximadamente 1 nmol/kg y aproximadamente 10 nmol/kg, o una combinación de dos cualesquiera de estos valores.
En este contexto, la prescripción de un tratamiento, por ejemplo las decisiones sobre la dosificación, etc. cuando se utiliza la composición farmacéutica arriba descrita forma parte típicamente de la responsabilidad de los facultativos generales y otros doctores médicos, y normalmente tiene en cuenta la afección a tratar, el estado del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los facultativos. En REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, edición 16, Osol, A. (ed), 1980 se pueden encontrar ejemplos de las técnicas y protocolos arriba mencionados. Así, una "cantidad segura y efectiva" para los componentes de las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención significa una cantidad de cada uno de estos componentes, o de todos ellos, que es suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de una enfermedad o trastorno fuertemente relacionada con la señalización de JNK como se define aquí. Sin embargo, al mismo tiempo, una "cantidad segura y efectiva" es suficientemente pequeña para evitar efectos secundarios serios, es decir, para posibilitar una relación prudente entre ventaja y riesgo. La determinación de estos límites está normalmente dentro del alcance de un juicio médico sensato. Una "cantidad segura y efectiva" de tal componente variará en relación con la condición particular a tratar y también con la edad y el estado físico del paciente a tratar, la gravedad de la condición, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concomitante, del vehículo farmacéuticamente aceptable particular utilizado y de factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del médico. Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención se pueden utilizar de acuerdo con la invención para humanos y también con fines médicos veterinarios.
La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención también puede comprender, además de uno o más inhibidores de JNK, un vehículo farmacéuticamente aceptable (compatible). La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la presente invención también puede comprender, además de uno o más inhibidores de JNK, un excipiente, tampón o estabilizador (compatible).
En este contexto, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable (compatible)" incluye preferentemente la base líquida o no líquida de la composición. El término "compatible" significa que los constituyentes de la composición farmacéutica tal como se utiliza aquí se pueden mezclarse con el componente farmacéuticamente activo tal como se define más arriba y con otro componente de modo que no se produce ninguna interacción que pueda reducir esencialmente la eficacia farmacéutica de la composición bajo las condiciones de uso habituales. Evidentemente, los vehículos farmacéuticamente aceptables deben tener una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja para que sean adecuados para ser administrados a una persona a tratar.
Si la composición farmacéutica tal como se utiliza aquí se suministra en forma líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable incluirá típicamente uno o más vehículos líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles). La composición puede comprender como vehículos líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo, agua libre de pirógenos; solución salina isotónica o soluciones (acuosas) tamponadas, por ejemplo soluciones tamponadas fosfato, citrato, etc., aceites vegetales tales, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles, por ejemplo polipropilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico, etc. En particular para la inyección de la composición farmacéutica tal como se utiliza aquí se puede emplear un tampón, preferentemente un tampón acuoso.
Si la composición farmacéutica tal como se utiliza aquí se suministra en forma sólida, el vehículo farmacéuticamente aceptable incluirá normalmente uno o más vehículos sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles). La composición puede comprender como vehículos sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo, uno o más materiales de carga o diluyentes sólidos o líquidos, o también se pueden utilizar compuestos de encapsulación que sean adecuados para ser administrados a una persona. Algunos ejemplos de estos vehículos sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles) son azúcares, como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, como almidón de maíz o almidón de patata; celulosa y sus derivados, como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; sebo; lubricantes sólidos, como ácido esteárico, estearato de magnesio; sulfato de calcio, etc.
La naturaleza concreta del vehículo farmacéuticamente aceptable (compatible) u otro material puede depender de la vía de administración. Por consiguiente, la selección de un vehículo farmacéuticamente aceptable (compatible) se puede determinar en principio de acuerdo con el modo de administración de la composición farmacéutica tal como se utiliza de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica tal como se utiliza de acuerdo con la invención se puede administrar, por ejemplo, de forma sistémica. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, vías parenterales (por ejemplo por inyección) tales como las vías intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica o transdérmica, etc.; vías enterales tales como la vía oral, o vías rectales, etc.; vías tópicas tales como la vía nasal o intranasal, etc.; u otras vías tales como vías epidérmicas o administración con parches. También se contempla aquí (en particular para tratar enfermedades relacionadas con el ojo) la administración por instilación, intravítrea y subconjuntival. De igual forma, la administración puede ser intratímpano, por ejemplo si se tratan enfermedades relacionadas con el oído.
La cantidad adecuada de la composición farmacéutica a utilizar se puede determinar mediante experimentos rutinarios con modelos animales. Estos modelos incluyen, sin que esto implique ninguna limitación, los modelos de conejo, oveja, ratón, rata, perro y primates no humanos. Las formas de dosificación unitaria preferentes para inyección incluyen soluciones estériles de agua, solución salina fisiológica o mezclas de las mismas. El pH de estas soluciones se debería ajustar a un valor de aproximadamente 7,4. Los vehículos adecuados para inyección incluyen hidrogeles, dispositivos para la liberación controlada o retrasada, ácido poliláctico y matrices de colágeno. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la aplicación tópica incluyen aquellos que son adecuados para ser utilizados en lociones, cremas, geles y similares. Si los compuestos se deben administrar vía peroral, las pastillas, cápsulas y similares son la forma de dosificación unitaria preferente. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para la preparación de formas de dosificación unitaria que pueden ser utilizadas para la administración oral son bien conocidos en el estado anterior de la técnica. La selección de los mismos dependerá de consideraciones secundarias tales como sabor, coste y aptitud para almacenamiento, que no son críticas para los objetivos de la presente invención, y puede ser realizada sin dificultad por una persona con experiencia en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas para la administración oral se pueden encontrar en forma de pastillas, cápsulas, en polvo o en forma líquida. Una pastilla puede incluir un vehículo sólido tal como se define más arriba, como gelatina, y opcionalmente un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas para la administración oral pueden incluir en general un vehículo líquido tal como se define más arriba, como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. También pueden incluir solución salina fisiológica, dextrosa u otras soluciones de sacáridos o glicoles, tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.
Para la inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o en el lugar de la dolencia, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa parenteral aceptable libre de pirógenos y con un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Las personas con un conocimiento técnico relevante pueden preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como Inyección de Cloruro de Sodio, Inyección de Ringer, Inyección de Ringer Lactato. También se pueden incluir conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Independientemente de que se trate de un polipéptido, péptido o molécula de ácido nucleico, u otro compuesto farmacéuticamente útil de acuerdo con la presente descripción que comprende la presente invención que deba ser administrado a un individuo, la administración se lleva a cabo en una “cantidad profilácticamente eficaz” o una “cantidad terapéuticamente eficaz” (según sea aplicable), siendo ésta suficiente para beneficiar al individuo. La cantidad exacta administrada y la velocidad y la evolución temporal de la administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de la enfermedad tratada.
El tratamiento de una enfermedad tal como se define aquí incluye típicamente la administración de una composición farmacéutica tal como se define arriba. Los inhibidores de JNK aquí descritos modularán la actividad JNK en un sujeto. En particular, el término “modular” incluye la supresión de la fosforilación de c-jun, ATF2 o NFAT4 en cualquiera de las enfermedades arriba indicadas, por ejemplo empleando al menos un inhibidor de JNK que comprende o consiste en una secuencia de (poli)péptidos inhibidora de acuerdo con cualquiera de las secuencias de las SEQ ID NO: 2 a 27, potencialmente comprendiendo una secuencia trasnsportadora adicional, como un inhibidor competitivo del sitio de unión natural de c-jun, ATF2 o NFAT4 en una célula. El término “modular” también incluye la supresión de complejos heteroméricos y homoméricos de factores de transcripción formados por c-jun, ATF2 o NFAT4 y sus compañeros relacionados, por ejemplo el complejo AP-1, que está formado por c-jun, AFT2 y c-fos.
El tratamiento de un sujeto con la composición farmacéutica tal como se describe más arriba se puede llevar a cabo típicamente administrando (in vivo) una cantidad (“terapéuticamente eficaz”) de dicha composición farmacéutica a un sujeto, pudiendo ser este sujeto por ejemplo un sujeto humano o animal. Preferentemente, el animal es un mamífero no humano, esto es un primate no humano, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo o cerdo. El concepto “terapéuticamente eficaz” significa que la cantidad del componente activo de la composición farmacéutica es suficiente para mejorar las enfermedades o trastornos discutidos aquí.
Enfermedades y trastornos
La presente invención se refiere al uso de los inhibidores JNK anteriormente descritos para su uso de acuerdo con la invención y a composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la invención en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia, en particular del cuerpo humano. Como se mencionó anteriormente, la señalización de JNK está involucrada en muy diversos estados de enfermedades y trastornos y se ha propuesto y probado la inhibición de dicha señalización con éxito en muchos de éstos. Los inventores de la presente invención han constatado que los inhibidores de JNK aquí descritos son inhibidores eficaces de JNK y, por tanto, son también adecuados para el tratamiento de las enfermedades que se describen en la técnica.
El tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia, tal como se utiliza aquí, se refiere a cualquier tipo de tratamiento terapéutico de un sujeto respectivo. Incluye, por ejemplo, la prevención de la aparición de la enfermedad o los síntomas (profilaxis), es decir, típicamente antes de la manifestación de la enfermedad en el paciente. El término también incluye el “mero” tratamiento de los síntomas de una enfermedad dada, es decir, el tratamiento aliviará la patogénesis reduciendo los síntomas asociados a la enfermedad, sin curar necesariamente su causa subyacente y síntomas. Ciertamente, curar la causa subyacente de la enfermedad también está englobado en el término. El término también abarca un tratamiento que retrasa o incluso detiene la progresión de la enfermedad respectiva.
En una realización, los inhibidores JNK para su uso según la presente invención pueden administrarse, por ejemplo, profilácticamente antes de la aparición potencial de un trastorno previsible, por ejemplo antes de una intervención quirúrgica planificada o de una exposición planificada a estímulos estresantes. Una intervención quirúrgica podría, por ejemplo, tener el riesgo de inflamación de la herida respectiva o del tejido vecino (por ejemplo síndrome del ojo seco después del tratamiento quirúrgico ocular, periimplantitis después del tratamiento de implantación dental, rechazo del injerto después del trasplante, etc.). La exposición a estímulos estresantes, como la radiación, podría conducir a la apoptosis del tejido y de las células afectadas. En tales situaciones, los inhibidores de JNK para su uso según la presente invención pueden administrarse, por ejemplo, al menos una vez con aproximadamente 4 semanas de antelación. Los inhibidores de JNK pueden administrarse, por ejemplo, al menos con 24 horas, al menos con 48 horas, al menos con 1 semana, al menos con 2 semanas o con 4 semanas de antelación.
Las enfermedades y trastornos a tratar con los inhibidores de JNK aquí descritos pueden ser agudos o crónicos.
Debido a la participación de la señalización JNK en una gran diversidad de condiciones patológicas, pueden utilizarse inhibidores de JNK, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades de diversos órganos, como enfermedades del ojo, del hueso, enfermedades neurales, enfermedades neuronales, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades de la piel, enfermedades inmunitarias y/o autoinmunes, enfermedades del ojo, de la boca, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades proliferativas (en particular cánceres y tumores), enfermedades del oído, enfermedades del intestino, enfermedades del sistema respiratorio (por ejemplo, enfermedades pulmonares), enfermedades infecciosas y diversas otras enfermedades.
Los inhibidores de JNK para su uso según la presente invención pueden utilizarse, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, tales como inflamación aguda e inflamación crónica. Los inhibidores de JNK de la presente invención pueden utilizarse para tratar cualquier tipo de inflamación tisular, por ejemplo inflamación ocular, bucal, inflamación del sistema respiratorio, incluyendo en particular del pulmón, inflamación de la piel, inflamación en el sistema cardiovascular, inflamación del cerebro, inflamación del oído, etc. Ejemplos no limitantivos de tales estados de enfermedad inflamatoria son mucositis, estomatitis, periimplantitis, retinitis, corioiditis, queratoconjuntivitis sicca, enfermedades inflamatorias intestinales (EII), uveítis (por ejemplo uveítis anterior, intermedia, posterior), periodontitis, EPOC, asma, pulpitis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica, vasculitis, cistitis intersticial, inflamación aguda en un lugar de infección o herida, meningitis, encefalitis, neumonía, faringitis, amigdalitis, otitis (incluyendo otitis media), vasculitis, sinovitis, enteritis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, rechazo de injertos, etc.
Los inhibidores de JNK aquí descritos pueden utilizarse, por ejemplo, en métodos de tratamiento de enfermedades del oído (en particular enfermedades del oído interno), pérdida de audición (en particular, pérdida auditiva aguda), estereocilia de células pilosas dañadas, apoptosis de células pilosas, traumatismo por ruido, otitis, otitis media, etc. La pérdida auditiva y la apoptosis de células pilosas asociadas son ejemplos no limitativos de trastornos resultantes de situaciones de estrés para las células en las que la inhibición de JNK puede modular la respuesta al estrés y, por ejemplo, bloquear la apoptosis.
Los inhibidores JNK también pueden utilizarse para el tratamiento de trastornos metabólicos, por ejemplo para el tratamiento de la diabetes (tipo 1 o tipo 2, en particular tipo 1), enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher, hipotermia, hipoxia por hipertermia, histiocitosis lipídica, lipidosis, leucodistrofia metacromática, mucopolisacaridosis, enfermedad de Niemann Pick, obesidad y enfermedad de Wolman. La hipotermia, la hipertermia y la hipoxia son de nuevo ejemplos no limitantes de situaciones de estrés celular en las que la inhibición de JNK puede modular la respuesta al estrés y, por ejemplo, bloquear la apoptosis.
Del mismo modo, los inhibidores de JNK pueden utilizarse para el tratamiento de enfermedades neurales, neuronales y/o neurodegenerativas, respectivamente. Ejemplos de estas enfermedades son, por ejemplo, enfermedad de Alexander, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), apoplejía, Ataxia Telangiectasia, axones cortados o alterados de otro modo, axotomía, lesiones cerebrales, CMT (Charcot-Marie-Tooth), degeneración corticobasal, demencia, enfermedades o trastornos del sistema nervioso, distoma, epilepsia, enfermedad de Farber, ataxia de Friedreich (SCA), gangliosidosis, síndrome de Guillain-Barré, paraplejia espástica hereditaria, enfermedad de Hirschsprung, demencia por virus de la inmunodeficiencia humana, enfermedad de Huntington, infarto cerebral, accidente cerebrovascular isquémico, enfermedad de Krabbe, síndrome de Lennox Gastaut, lissencefalia, esclerosis múltiple, síndromes mielodisplásicos, mielopatía, enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el SIDA, neurofibromatosis tipo 2 (NF-2), neurolatierismo, apoptosis neuronal, muerte neuronal, dolor neuropático, neuropatía, neuropatía inducida por quimioterapia, neuropatía inducida por diabetes, neurotoxicidad inducida por NMDA, dolor, enfermedad de Parkinson, parkinsonismo, enfermedad de Pick, polineuropatía, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Sandhoff, espina bífida, accidente cerebrovascular, Tay Sachs, TBI (lesión axonal difusa), tratamiento de la neurona oscura inducida por ejemplo por dolor inflamatorio, síndrome de West, atrofia muscular espinal, etc.
Con respecto a trastornos autoinmunes, los péptidos inhibidores de JNK pueden emplearse, por ejemplo, en un método de tratamiento de enfermedades autoinmunes del SNC, enfermedades auto-inflamatorias, enfermedad celiaca, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico, etc.
Ejemplos de enfermedades óseas que pueden tratarse con los inhibidores de JNK son, por ejemplo, artritis, hernia discal, fibrodisplasia osificante progressiva (FOP), osteoartritis, osteopetrosis, osteoporosis, en particular osteoporosis inducida por diabetes, enfermedad de Paget, artritis reumatoide, etc.
Ejemplos de enfermedades de la piel que pueden tratarse con los inhibidores de JNK son, por ejemplo, psoriasis y lupus eritematoso.
Enfermedades oculares que pueden tratarse con los inhibidores de JNK se refieren, por ejemplo, a degeneración macular relacionada con la edad (AMD), líneas angioides, neuropatía óptica isquémica anterior, uveítis anterior, cataratas, en particular cataratas relacionadas con la edad, corioretinopatía exudativa central, corioretinopatía serosa central, chalazión, corioderemia, corioiditis, esclerosis coroidal, conjuntivitis, ciclitis, retinopatía diabética, síndrome del ojo seco, endoftalmitis, episcleritis, infección ocular; fundus albipunctatus; atrofia girata de la coroides y la retina; hordeolum; enfermedades inflamatorias del párpado; enfermedades inflamatorias de la coroides; enfermedades inflamatorias del cuerpo ciliar; enfermedades inflamatorias de la conjuntiva; enfermedades inflamatorias de la córnea; enfermedades inflamatorias del iris; enfermedades inflamatorias de la glándula lagrimal; enfermedades inflamatorias del hueso orbital; enfermedades inflamatorias de la esclerótica; enfermedades inflamatorias del cuerpo vítreo; enfermedades inflamatorias de la uvea; enfermedades inflamatorias de la retina; uveítis intermedia; iritis; queratitis; enfermedad de Leber; coroiditis multifocal; miositis del músculo ocular; maculopatía neovascular (por ejemplo causada por miopía alta, síndrome de disco inclinado u osteoma coroidal); retinotoxicidad inducida por NMDA; enfermedades oculares inflamatorias no crónicas o crónicas; enfermedad de Oguchi; enfermedad del nervio óptico; flemón orbital; panoftalmitis; panuveítis; opacificación post-caspula; opacificación posterior de la cápsula (PCO) (una complicación de las cataratas después de la cirugía); uveítis posterior; vitreoretinopatía proliferativa; oclusión de la arteria retiniana; desprendimiento de retina, enfermedades de la retina; lesiones de la retina; macroaneurisma de la retina; desprendimiento de epitelio pigmentario de la retina; oclusión de la vena de la retina; retinitis; retinitis pigmentosa; retinitis punctata albescens; retinopatía, en particular retinopatía de la prematuridad y retinopatía diabética; escleritis; enfermedad de Stargardt; tratamiento de heridas oculares inflamadas y/o bordes de heridas oculares; tratamiento de la inflamación intraocular después de cirugía ocular o traumatismo; uveítis; distrofia macular vitelliforme; etc.
Enfermedades bucales ilustrativas que pueden tratarse con los inhibidores de JNK quí descritos son periodontitis, en particular periodontitis crónica, mucositis, trastornos descamativos orales, liquen plano oral, pemphigus vulgaris, pulpitis, estomatitis, trastorno de la articulación temporomandibular, peri-implantitis, etc.
Del mismo modo, los inhibidores de JNK pueden utilizarse - como ya se ha propuesto anteriormente para otros inhibidores de JNK - para el tratamiento de enfermedades proliferativas como el cáncer y enfermedades tumorales, tales como carcinomas pulmonares acusticus neurinoma, leucemia linfocítica aguda (L1, L2, L3), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (LMA), adenocarcinomas, carcinoma anal, carcinoma bronquial, carcinoma de cuello uterino, cáncer de cuello uterino, astrocitoma, basalioma, cáncer con transformación Bcr-Abl, cáncer de vejiga, blastomas, cáncer de huesos, metástasis cerebrales, tumores cerebrales, cáncer de mama, linfoma de Burkitt, carcinoides, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica (LLC), leucemia mieloide crónica (LMC), cáncer de colon, carcinoma de colon, carcinoma corpus; craneofaringeomas, síndrome de CUP, tumores inducidos por virus, linfoma de células B inducido por EBV; carcinoma de endometrio, eritoleucemia (M6), cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer gastrointestinal, tumores estromales gastrointestinales, tumores gastrointestinales, cáncer genitourinario, glaucoma, glioblastoma, gliomas, tumores de cabeza/cuello, tumores inducidos por hepatitis B, carcinomas hepatocelulares, hepatomas, tumores inducidos por virus del herpes, síndrome de Hodgkin, linfomas inducidos por HTLV-1, linfomas inducidos por HTLV-2, insulinomas, cáncer intestinal, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, carcinomas renales, cáncer laríngeo, leucemia, tumor de párpados, cáncer de hígado, metástasis hepáticas, cáncer de pulmón, cáncer linfoide, linfomas, melanomas malignos, carcinomas mamarios, linterna de células del manto, meduloblastoma, leucemia megacarioblástica (M7), melanoma, en particular melanoma maligno, meningioma, mesotelioma, leucemia monocítica (SM), mieloma múltiple, micosis fungoides, leucemia mieloblástica (M1), leucemia mieloblástica (M2), leucemia mielomonocítica (M4), neurinoma, linfomas no Hodgkin, carcinoma de células no pequeñas, carcinoma de pulmón de células no pequeñas, cáncer de esófago, carcinoma esofágico, oligodendroglioma, cáncer de ovario, carcinoma ovárico, cáncer de páncreas, carcinoma pancreático, carcinomas inducidos por el virus del papiloma, cáncer de pene, tumor pituitario, plasmocitoma, leucemia promielocítica (M3), cáncer de próstata, tumores de próstata, tumores rectales, carcinoma de recto, carcinoma de células renales, retinoblastoma, sarcomas, enfermedad de Schneeberger, carcinomas de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, tumores del intestino delgado, tumores de tejidos blandos, espinalioma, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma, cáncer de tiroides, carcinoma de tiroides, cáncer de lengua, LMA indiferenciada (MO), cáncer uretral, cáncer uterino, cáncer vaginal, enfermedad de von Hippel Lindau, cáncer vulvar, tumor de Wilms, Xeroderma pigmentosum, etc.
Dado que la señalización JNK también está implicada en muchas enfermedades y trastornos cardiovasculares, ya ha sido sugerido en el pasado el uso de inhibidores de JNK en el tratamiento de dichas enfermedades. AsÍ, los inhibidores aquí descritos pueden utilizarse, por ejemplo, para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares tales como hipertensión arterial, arteriosclerosis, lesiones arterioscleróticas, síndrome de Behcet, bifurcaciones de los vasos sanguíneos, hipertrofia cardíaca, hipertrofia cardiovascular, cardiomiopatías, en particular cardiomiopatías inducidas por quimioterapia, isquemia cerebral, enfermedades coronarias del corazón, dilatación de la aorta abdominal, isquemia cerebral focal, isquemia cerebral global, hipertrofia cardíaca, hipertensión del aneurisma infrarrenal, isquemia, infarto de miocardio, en particular infarto agudo de miocardio, miocarditis, reperfusión, restenosis, vasculitis, granulomatosis de Wegener, etc.
En el contexto de las enfermedades cardiovasculares, los inhibidores de JNK pueden utilizarse de forma complementaria a la cirugía de injerto de bypass de arteria coronaria (cirugía CABG), angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) y/o tratamiento con stents, por ejemplo para prevenir o tratar la hiperplasia intimal resultante de dicho tratamiento (quirúrgico).
Enfermedades del sistema respiratorio y, en particular, enfermedades pulmonares que pueden tratarse eficazmente con los inhibidores de JNK son, por ejemplo, el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDR), asma, enfermedades crónicas que involucran el sistema respiratorio, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis quística, enfermedades pulmonares inflamatorias, neumonía, fibrosis pulmonar, etc.
Al igual que los inhibidores del estado de la técnica, los inhibidores como se describen aquí también se pueden utilizar para tratar enfermedades del tracto intestinal, por ejemplo colitis (por ejemplo colitis atípica, colitis química, colitis colagenosa, colitis distal, colitis por desviación, colitis fulminante, colitis indeterminada, colitis infecciosa, colitis isquémica, colitis linfocítica o colitis microscópica, enfermedad de Crohn, gastroenteritis, enfermedad de Hirschsprung, enfermedad digestiva inflamatoria, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), enfermedad de Crohn, enfermedades digestivas no crónicas o crónicas, enfermedades digestivas inflamatorias no crónicas o crónicas, enteritis regional, colitis ulcerosa, etc.
Los inhibidores de JNK también pueden servir como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades infecciosas resultantes, por ejemplo, de infecciones bacterianas o virales. Los inhibidores de JNK como se describen aquí pueden, por ejemplo, prevenir o mejorar las reacciones inflamatorias causadas por dichas infecciones. Ejemplos de tales enfermedades, que no se consideran limitativos, son encefalitis viral, cánceres inducidos virales (por ejemplo, como se mencionó anteriormente), demencia por virus de l inmunodeficiencia humana, meningitis, meningoencefalitis, encefalomielitis, amigdalitis, etc.
Hay muchas otras enfermedades, estados de enfermedad y trastornos donde se pueden utilizar inhibidores de JNK como tratamiento, por ejemplo síndrome de Aarskog, hepatotoxicidad por paracetamol, anomalía Alder-Reilly, alopecia areata, deficiencia de alfa-1-antitripsina, anafilaxia, apoptosis, muerte celular apoptótica, síndrome urémico hemolítico atípico, basopenia, basofilia, trastornos bipolares, quemaduras, estrés de cizallamiento celular, síndrome de Chedial-Higashi, daño al ADN debido a medicamentos quimioterápicos, colestasis, cromosoma 11, monosomía parcial 11q, cromosoma 22, mosaico trisomio, enfermedad granulomatosa crónica, hepatitis, como hepatitis crónica ohepatitis fulminante, depresión clínica, hipogammaglobulinemia variable común, deficiencia congénita de C3, protección CTL contra la muerte celular inducida por activación (AICD), sordera, depresión y trastornos depresivos (en particular prevención de trastornos depresivos desarrollados en un contexto de comportamiento de enfermedad inducido por citoquinas), síndrome de DiGeorge, enfermedades causadas por apoptosis defectuosa, enfermedades hepáticas, enfermedades de la columna vertebral, enfermedades del útero, enfermedades y síntomas por exposición a agentes dañinos del ADN y/o radiación ionizante y estrés celular resultante, síndrome de Down, distrofia muscular de Duchenne, displasias ectodérmicas, endometriosis, eosinopenia, eosinofilia, muerte celular exocitóxica, síndrome alcohólico fetal, fibrosis, enfermedad fibrosa, formación de tejido fibroso, radicales libres (que conducen a estrés celular), rechazo al injerto, enfermedad injerto versus huésped, pérdida de cabello, síndrome urémico hemolítico, hepatotoxicidad, hiperalgesia, como hiperalgesia inducida por diabetes, hipertermia, hipoglucemia, hipotiroidismo, síndrome hipereosinofílico idiopático, nefropatía por IgA, agammaglobulinemia infantil relacionada con el sexo, dolor inflamatorio, acomorismo infrarrenal, regeneración de islotes, trasplante de islotes, síndrome de Job (hiper-IgE), síndrome de leucocitos perezosos, deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, leucodistrofia, leucopenia, leucocitosis linfocítica, linfocitopenia, linfocitosis, depresión mayor, manía, depresión maníaca, síndrome de Marfan, mastocitosis, anomalía May Hegglin, glomerulonefritis membranoproliferativa Tipo II, monocitopenia, monocitosis, deficiencia de mieloperoxidasabenigna, miopatías, neutropenia, neutrofilia, síndrome de Nezelof, trasplante de órganos, lesiones por estrés oxidativo, anomalía de Pelger-Huet, enfermedades renales poliquísticas, síndrome post-diálisis, síndromes de radiación, radioterapia, enfermedades renales, insuficiencia renal, rescate de CTL de la muerte celular inducida por la activación, enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave, rechazo de trasplantes, trasplante, trisomía, depresión unipolar, lesiones inducidas por rayos UV, síndrome de Wiskott Aldrich, cicatrización de heridas, etc.
Se consideran particularmente adecuados para el tratamiento con los inhibidores de JNK como se describen aquí el trastorno de la articulación temporomandibular, mucositis, estomatitis, liquen plano oral (trastorno descamativo), pénfigo vulgaris (trastorno descamativo), periodontitis, periodontitis crónica, pulpitis, periimplantitis, uveítis (uveítis anterior, uveítis intermedia, uveítis posterior), queratoconjuntivitis sicca (síndrome del ojo seco), cirugía de bypass de arteria coronaria (cirugía CABG), infarto agudo de miocardio, prevención de la hiperplasia intimal después de la angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA), prevención de la hiperplasia intimal después de colocación de stent, aterosclerosis, EPOC, asma, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal (EII), psoriasis, diabetes, accidente cerebrovascular, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, lupus eritematoso sistémico y vasculitis, en particular granulomatosis de Wegener.
Finalmente, como se mencionó anteriormente, la presente invención contempla el uso de un inhibidor JNK para su uso de acuerdo con la invención en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos. La presente invención no contempla el uso de los inhibidores JNK tal como se definen aquí para inmunizar animales no humanos, por ejemplo para producir anticuerpos monoclonales. Estos métodos no se consideran métodos para el tratamiento del cuerpo animal mediante terapia.
Ejemplos
A continuación se muestran ejemplos particulares que ilustran varias realizaciones y aspectos de la invención.
Ejemplo 1: Síntesis del inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172
Como ejemplo ilustrativo, se muestra a continuación la síntesis del inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172. El experto en la técnica sabrá que dicha síntesis también se puede usar y adaptarse fácilmente a la síntesis de cualquier otro inhibidor de JNK para su uso de acuerdo con la presente invención.
El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se fabricó mediante síntesis de péptidos en fase sólida usando la estrategia de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo). El enlazador entre el péptido y la resina fue el enlazador de amida Rink (ácido p-[Fmoc-2,3-dimetoxibencil]fenoxiacético). El péptido se sintetizó mediante ciclos sucesivos de acoplamiento de Fmoc-aminoácidos y desprotección con Fmoc. Al final de la síntesis, el péptido completado fue cortado con ácido trifluoroacético (TFA) directamente para producir la amida C-terminal cruda, la cual se purificó después mediante HPLC de fase inversa preparativa. Las fracciones purificadas se agruparon en un lote homogéneo, que se trató mediante cromatografía de intercambio iónico para obtener su sal acetato. El péptido fue después liofilizado.
1.1 Síntesis en fase sólida del péptido
Excepto cuando se indique, la fabricación tuvo lugar a temperatura ambiente (22°C±7°C) en un ambiente de aire filtrado. La escala de síntesis fue 0,7 mmol del aminoácido de partida en la resina para un rendimiento esperado de aproximadamente 1 g de péptido purificado. La síntesis se llevó a cabo manualmente en un reactor de 30-50 ml equipado con una frita, con agitación mecánica y/o burbujeo de nitrógeno.
1.2 Preparación de la resina
La resina de p-metilbenzhidrilamida (resina MBHA) se lavó primero con diclorometano/dimetilformamida/ diisopropiletilamina bajo nitrógeno. La resina lavada se acopló después al enlazador de amida Rink (ácido p-[Fmox-2,4-dimetoxibencil]fenoxiacético) en hexafluorofosfato de PyBOB (benzotriazol-1 -il-oxi-tris-pirrolidinfosfonio/diisopropiletilamina/1-hidroxibenzotriazol) para producir resina de amida-MBHA Fmoc-Rink.
1.3 Acoplamiento de aminoácidos
Los aminoácidos fueron acoplados a la resina usando el siguiente ciclo: la resina Fmoc-Rink amida-MBHA se desprotegió lavándola en un 35% (v/v) de piperidina/dimetilformamida, seguida por dimetilformamida. La reacción de desprotección tardó aproximadamente 16 minutos. Aminoácidos protegidos con Fmoc (por ejemplo, 2 equivalentes de aminoácido y HOBt (1-hidroxibenzotriazol) en dimetilformamida/diclorometano (50/50) se añadieron a la resina, seguido por la adición de 2 equivalentes del agente de acoplamiento diisopropilcarbodiimida (DIC). La reacción de acoplamiento tardó de una hora a toda la noche, dependiendo del aminoácido respectivo que se estuviera añadiendo. Los volúmenes se calcularon en base a 0,5 ml/100 mg de péptido-resina y se ajustaron después de cada ciclo. Después del acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con DMF. La conclusión del acoplamiento se probó mediante la prueba de ninhidrina (o prueba Kaiser 1) en aminas primarias y la prueba 2 de cloranilo en aminas secundarias. En algunas ocasiones, la prueba de cloranilo puede ser asociada con una prueba de ninhidrina como control de seguridad. En caso de que la prueba de acoplamiento indicara que la reacción todavía no se había completado, el acoplamiento se repitió con un exceso menor (0,5-1 eq) de aminoácido, PYBOP, HOBT en dimetilformamida/diclorometano y diisopropiletilamina. La funcionalidad de la resina se midió y generalmente 0,6-0,2 meq/g, dependiendo de la carga original de la resina. Después de que el último aminoácido se ha acoplado, el péptido-resina se desprotegió de forma habitual y después se lavó 5 veces con DCM antes de secar en un horno al vacío a 30°C. Una vez que el péptido-resina se hubo secado, el rendimiento de la síntesis en fase sólida se calculó como la relación del incremento de peso de la resina de péptidos en comparación con el incremento en el peso teórico calculado a partir de la carga inicial de la resina. El rendimiento puede estar cerca del 100%.
1.4 Corte y desprotección
El péptido se cortó de la resina en una mezcla de ácido trifluoroacético/1,2-etanoditiol/tioanisol/agua/fenol (88/2,2/4,4/4,4/7 v/v), también llamado reactivo TFA/K, durante 4 horas a temperatura ambiente. El volumen de la reacción era de 1 ml/100 mg de resina de péptidos. Durante la adición de la resina al reactivo, la temperatura de la mezcla se reguló por debajo de 30°C.
1.5 Extracción del péptido de la resina
El péptido se extrajo de la resina por filtración a través de una frita. Después de concentración en un evaporador giratorio hasta 1/3 de su volumen, el péptido se precipitó con t-butil metil éter frío y se filtró. El péptido crudo se secó después al vacío a 30°C.
1.6 Purificación por HPLC preparativa
El péptido crudo se purificó después mediante HPLC de fase inversa hasta una > 95%. Las fracciones purificadas se concentraron en un evaporador giratorio y se liofilizaron.
1.7 Cromatografía de intercambio iónico
Los fondos liofilizados y concentrados de péptido purificado con la secuencia SEQ ID NO: 172 se disolvieron en agua y se purificaron mediante cromatografía de intercambio iónico en acetato Dowex, 50-100 mallas de resina. Los reactivos de partida requeridos para la síntesis fueron:
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Otros inhibidores de JNK de la presente invención se pueden preparar de manera similar.
Ejemplo 2: Eficacia inhibidora de inhibidores de JNK seleccionados
A continuación se describe el procedimiento operativo estándar detallando cómo se midió la eficacia inhibidora de los inhibidores de JNK de acuerdo con la presente invención. El método permite medir in vitro, en un ensayo estandarizado no radioactivo, la capacidad de un compuesto candidato para reducir la fosforilación del sustrato específico de c-Jun por JNK. Más aún, se ilustra cómo determinar el efecto inhibidor (IC50) y la Ki de un compuesto seleccionado para JNK. El método es adecuado para verificar si un compuesto candidato inhibe o no la actividad JNK y el experto en la técnica ciertamente entenderá cómo adaptar los siguientes métodos para sus propósitos y necesidades específicos.
2.1 Material
Reactivo AlphaScreen y placa:
- His-JNK1 (ref 14-327, Upstate, 10 |jg en 100 jl: concentración: 2,2 jM ) 5 nM final
- His-JNK2 (ref 14-329, Upstate, 10 jg en 100 jl: concentración: 2 jM ) 5 nM final
- His-JNK3 (ref 14-501, Upstate, 10 jg en 100 jl: concentración: 1,88 jM ) 5 nM final
- Anti-Fosfo-cJun (ref 06-828, Upstate, lote DAM1503356, concentración: 44,5 jM ) 10 nM final
- Biotina-cJun (29-67):
secuencia: Biotina SNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVG (SEQ ID NO: 198), lote 100509 (pm 4382,11, P 99,28%) disuelta en H2O, concentración: 10 mM) 30 nM final
- ATP (ref AS001A, Invitrogen, lote 50860B, concentración 100 mM)) 5 jM final
- esferas SAD (ref 6760617M, PerkinElmer, lote 540-460-A, concentración 5 mg/ml) 20 jg/m l final - esferas AprotA (ref 6760617M, PerkinElmer, lote 540-460-A, concentración 5 mg/ml) 20 jg/m l final - placa blanca de 384 pocillos Optiplate (ref 6007299, PerkinElmer, lote 654280/2008)
- placa de 96 pocillos para dilución de péptidos (ref 82.1581, Sarstedt)
- TopSeals-A (ref 6005185, Perkin Elmer, Lote 65673)
- Lector de transferencia por energía bioluminiscente
- La transferencia de energía bioluminiscente se leyó en el lector de Placa Fusion Alpha (Perkin Elmer).
Pipeta:
- Una pipeta EDP3 electrónica 20-300 (Ref 17007243; Rainin) se usó para llenar en la placa la mezcla de enzimas-anticuerpos, la mezcla de sustrato-ATP y las esferas.
- Una PIPETMAN® Ultra de varios canales 8X20 (Ref 21040, Gilson) se usó para llenar en la placa los compuestos inhibitorios.
Tampones y soluciones:
- Tampón de quinasa: 20 mM de Tris-base pH 7,4, 10 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 100 jM de Na3VO4, 0,01% de Tween, (1% de DMSO).
- Tampón de paro: 20 mM de Tris-Base pH 7,4, 200 mM de NaCl, 80 mM de EDTA-K (pH de 8 con KOH en lugar de NaOH), 0,3% de BSA.
- Tampón de dilución de quinasa de JNK: 50 mM de Tris-Base pH 7,4, 150 mM de NaCl, 0,1 mM de EGTA, 0,03% de Brij-35, 270 mM de sucrosa, 0,1% de p-mercaptoetanol.
2.2 Método
Para evaluar el efecto inhibidor de los péptidos, se llevó a cabo un ensayo AlphaScreen estándar (véase por ejemplo Guenat et al. J Biomol Screen, 2006; 11: páginas 1015-1026). Los diferentes componentes se prepararon y se mezclaron posteriormente como se indica. Las placas fueron selladas e incubadas como sigue:
5 j l de JNK anticuerpo
5 j l de TP quinasa /- inhibidor Pre-incubación 30 min
5 j l de biotina-cJun ATP Incubación 60 min a 24°C
10 j l de esferas SAD A protA incubación 60 min en oscuridad a 24°C
Para evitar la contaminación, las mezclas se añadieron con la pipeta en diferentes esquinas del pocillo. Después del llenado de la placa con cada mezcla, la placa se inclinó (se mantuvo un lado fijo y se dejó el lado opuesto inclinarse sobre la mesa) para dejar que la mezcla bajara por las paredes de los pocillos.
La transferencia de energía bioluminiscente se leyó en el lector de placa Fusion Alpha (Perkin Elmer).
Todos los compuestos deben ensayarse al menos por triplicado en 3 experimentos independientes para cada isoforma de JNK. Posiblemente las concentraciones de los compuestos que a ensayar eran 0, 0,03 nM, 0,1 nM, 0,3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 jM , 3 jM , 10 jM , 30 jM , y 100 jM . Los controles fueron muestras ya sea sin JNK o sin sustrato (c-jun).
Preparación de la mezcla:
JNK1, JNK2 y JNK3 5 nM
Biotina-cJun 30 nM
ATP 5 jM ; anti fosfo-cJun (563) 10 nM
Bille SAD/AprotA 20 jg/m l
Anticuerpo [final] = 10 nM (anti fosfo cJun (S63))
Parte de detección: [Mezcla] X5 (5 |jl en volumen final de 25 |jl)
[Solución] = 44,5 jM (ref 06-828, Upstate, Lote DAM1503356)
10 nM ^ 50 nM en tampón quinasa
JNK1, JNK2 y JNK3 [final] = 5 nM
Parte de reacción: [mezcla] X3 (5 j l en volumen final de 15 j l)
[Solución] = 2,2 jM para JNK1 (ref 14-327, Upstate, lote D7KN022CU)
2,0 jM para JNK2 (ref 14-329, Upstate, lote 3321CU)
1.88 jM para JNK3 (ref 14-501, Upstate, lote D7CN041CU) 5 nM ^ 15 nM en tampón de anticuerpo
Inhibidor:
Parte de reacción: [mezcla] X3 (5 j l en volumen final de 15 j l)
[Solución] = 10 mM
100 jM ^ 300 jM en tampón quinasa
30 jM ^ 90 jM en tampón quinasa
10 jM ^ 30 jM en tampón quinasa
0,03 nM ^ 0,09 nM en tampón quinasa
y 0 nM ^ tampón quinasa
Dos series de diluciones en serie de 10 veces se llevaron a cabo en una placa de 96 pocillos, una empezando con 300 jM a 0 nM, la segunda con 90 jM a 0,03 nM. Los péptidos se añadieron a las placas de 384 pocillos con una multipipeta de 8 canales (ref F14401, Gilson, 8X20).
ATP [final] = 5 jM
Parte de reacción: [mezcla] X3 (5 j l en volumen final de 15 j l)
[Solución] 100 mM (ref AS001A, Invitrogen, lote 50860B)
5 jM ^ 15 jM en tampón quinasa
Biotina c-Jun [final] = 30 nM
Parte de reacción: [mezcla] X3 (5 j l en volumen final de 15 j l)
[solución] = 10 mM
30 nM ^ 30 nM en tampón ATP
Esferas SAD/A ProtA [final] = 20 jg/m l (sensible a luz)
Parte de detección: [mezcla] X 2,5 (10 j l en volumen final de 25 j l)
[solución] = 5 mg/ml ^ 20 jg/m l 50 jg/m l en tampón de paro
Mezclar en habitación oscura (luz verde) o en oscuridad
Análisis de las curvas IC50:
El análisis se llevó a cabo por el software GraphPad Prism4 con la siguiente ecuación: Respuesta de dosis sigmoidal (sin restricción).
Y = Fondo (parte superior- fondo)/(1 10A((LogEC50-X))
Los datos extremos se evitaron usando la prueba de Grugg.
Comparación de la IC50:
El análisis se llevó a cabo por el software GraphPad Prism4 con la siguiente prueba: Prueba ANOVA de una vía seguida por una Prueba de Comparación Múltiple de Tukey. P<0,05 se consideró como significativo. La Km del ATP para JNK y la Km de péptido específico de biotina-cJun se determinaron en el informe del ensayo de estandarización AlphaScreen.
La relación matemática entre Ki e IC50 (Ki = IC50/(1 ([sustrato]/Km del sustrato)) puede usarse para calcular los valores Ki.
Ejemplo 3: Experimentos de intemalización y análisis
3.1 Materiales y métodos para experimentos de absorción
a) Línea celular: La línea celular usada para este experimento fue HL-60 (Ref CCL-240, ATCC, lote 116523) b) Medio de cultivo y placas:
RPMI (Ref 21875-091, Invitrogen, lote 8296) o DMEM (Ref 41965, Invitrogen, lote 13481), complementado en 05.05.2008 con:
10% de FBS (Ref A64906-0098, PAA, lote A15-151): descomplementado a 56°C, 30 min, el 04.04.2008.
1 mM de piruvato de sodio (ref S8636, Sigma, lote 56K2386)
Penicilina (100 unidades/ml)/estreptomicina (100 jg/m l) (ref P4333, Sigma, lote 106K2321).
PBS 10X (ref 70011, Invitrogen, lote 8277): diluido a 1x con H2O estéril
Tripsina-0,05% de EDTA (ref L-11660, PAA, lote L66007-1194)
Placas de cultivo de 6 pocillos (ref 140675, Nunc, lote 102613)
Placas de cultivo de 24 pocillos (ref 14475, Nunc, lote 095849)
Placas de cultivo de 96 pocillos (ref 167008, Nunc, lote 083310)
Placas de 96 pocillos para dosificación de proteínas (ref 82.1581, Sarsted)
Placas de 96 pocilios para medida de fluorescencia (ref6005279, Perkin Elmer)
c) Soluciones
Solución de recubrimiento de poli-D-lisina (Sigma P9011 lote 095K5104): 25 pg/ml finales diluidos en PBS 1x Tampón de lavado ácido: Glicina 0,2 M, NaCl 0,15 M, pH 3,0
Tampón de lisis Ripa: 10 mM de NaH2PO4, pH 7,2, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 1 mM de EDTA, pH 8.0, 200 pM de Na3VO2, 0,1% de SDS, 1X de coctel inhibidor de proteasa (ref 11873580001, Roche, lote 13732700)
d) Microscopía y lector de placa de fluorescencia
Las células se observaron y se contaron usando un microscopio invertido (Axiovert 40 CFL; Zeiss; 20X). La fluorescencia se leyó con el lector Alfa Plate Fusion (Perkin Elmer).
e) Método
La internalización de péptidos marcados con FITC se estudió en células en suspensión. Las células se pusieron en cajas recubiertas con poli-Dl-lisina a una concentración de 1106 células/ml. Las placas se incubaron después durante 24 horas a 37C, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa antes de la adición de una concentración conocida de péptido. Después de la adición del péptido, las células se incubaron 30 minutos, 1, 6 ó 24 horas a 37°C, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa. Las células se lavaron después dos veces con un tampón ácido (glicina 0,2 M, NaCl 0,15 M, pH 3,0) para eliminar el péptido adsorbido a la superficie celular (véase Kameyama et al., (2007), Biopolymers, 8 8 , 98-107). El tampón ácido se usó porque los péptidos ricos en aminoácidos básicos se adsorben fuertemente en la superficie de las células, lo cual comúnmente se traduce en sobreestimación del péptido internalizado. El lavado de las células usando un tampón ácido se emplea entonces para eliminar los péptidos absorbidos en la superficie celular. El lavado con ácido se llevó a cabo para determinar la absorción celular de conjugados de péptidos de permeabilidad Fab/célula, seguido por dos lavados con PBS. Las células se lisaron mediante la adición del tampón de lisis RIPA. La cantidad relativa de péptido internalizado se determinó entonces por fluorescencia después de una sustracción de fondo y normalización del contenido de proteínas.
Las etapas son entonces:
1. Cultivo de células.
2. Lavado con ácido y extractos celulares
3. Análisis de la internalización del péptido con un lector de placa de fluorescencia.
f) Cultivo de células y tratamiento de péptidos
Las placas de cultivo de 6 pocillos se recubren con 3 ml de Poly-D-Lys (Sigma P9011; 25 pg/ml en PBS), las placas de 24 pocillos con 600 pl y las placas de 96 pocillos con 125 pl y se incuban durante 4 horas a 37°C, CO25% y 100% de humedad relativa.
Después de 4 horas, las placas se lavaron dos veces con 3,5 ml de PBS, 700 pl o 150 pl de PBS para las placas de 6 , 24 ó 96 pocillos, respectivamente.
Las células en placa se colocaron en bandejas en 2,4 ml de medio (RPMI) a densidades de colocación de 1.000. 000 de células/ml para células en suspensión. Después de la inoculación, las placas se incubaron a 37°C, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa durante 24 horas antes de la adición del péptido. Las células adherentes deben estar a una densidad de 90-95% el día del tratamiento y se colocaron en DMEM:
Figure imgf000033_0001
Las células se trataron con la concentración deseada de péptido marcado con FITC (solución de abastecimiento a una concentración de 10 mM en H2O).
Después de la adición de péptidos, las células se incubaron de 0 a 24 horas (por ejemplo, 30 minutos, 1, 6 ó 24 horas) a 37°C, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa.
Lavado ácido y extractos celulares:
Los extractos se enfriaron en hielo.
Las células en suspensión (o células que no se fijan bien a la bandeja):
Se transfieren las células en <Falcon 15 ml>. Para recuperar el máximo de células, se lava la bandeja con 1 ml de PBS.
Se cosechan las células 2 minutos a 2.400 rpm máximas.
Se suspenden las células en 1 ml de PBS frío.
Se transfieren las células a un “tubo Eppendorf” recubierto (recubierto con 1 ml de poly D-Lys durante 4 horas y lavado dos veces con 1 ml de p Bs ).
Se lava tres veces con 1 ml de tampón de lavado ácido frío y se centrifuga 2 minutos a 2.400 rpm max. Se tiene cuidado de la dispersión de las células en el “eppendorf”.
Se lava dos veces con 1 ml de PBS frío para neutralizar.
Se añaden 50 pl de tampón de lisis RIPA.
Se incuba 30 min-1h en hielo con agitación.
Células adherentes:
Se lava tres veces con 3 ml, 1 ml o 200 pl (para placas de 6 , 24 ó 96 pocillos, respectivamente) de tampón de lavado ácido frío. Se tiene cuidado de que las células se desprendan de la bandeja.
Se lava dos veces con 1 ml de PBS frío (para placas de 6 , 24 ó 96 pocillos, respectivamente) para neutralizar.
Se añaden 50 pl de tampón de lisis RIPA.
Se incuba 30 min-1h en hielo con agitación.
Se raspan las células con un raspador frío. Las placas de 24 y 96 pocillos se centrifugaron directamente a 4.000 rpm a 4°C durante 15 minutos para eliminar el resto celular. Después los sobrenadantes (100 ó 50 ml respectivamente para las placas de 24 ó 96 pocillos) se transfirieron directamente a una placa de 96 pocillos oscura. Las placas se leyeron con un lector de placas de fluorescencia (Fusion Alpha, Perkin Elmer).
Se transfiere el lisado en un “eppendorf” recubierto (recubierto con 1 ml de poly D-Lys durante 4 horas y se lava dos veces con 1 ml de PBS).
Las células lisadas se centrifugaron después 30 minutos a 10.000 g a 4°C para eliminar los restos celulares. Se retira el sobrenadante y se almacena a -80°C en un “tubo Eppendorf’ recubierto (recubierto con 1 ml de poly D-Lys durante 4 horas y lavado dos veces con 1 ml de PBS).
Análisis de internación de péptidos con un lector de placa de fluorescencia:
El contenido de cada extracto de proteína se determinó mediante un ensayo BCA estándar (Kit N° 23225, Pierce), siguiendo las instrucciones del fabricante.
La fluorescencia relativa de cada muestra se determina después de leer 10 pl de cada muestra en un lector de placa de fluorescencia (Fusion Alpha, Perkin Elmer), sustracción de fondo y normalización por concentración de proteína.
3.2 Experimentos de absorción
La internalización dependiente de tiempo (absorción) para los constructos transportadores derivadas de TAT marcados con FITC en células de la línea celular h L-60 se llevó a cabo como se describió arriba usando péptidos transportadores de secuencias de las SEQ ID NO: 52-96, 43 y 45-47. Estas secuencias se citan a continuación en la tabla 4.
Figure imgf000035_0001
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
En la anterior tabla los D-aminoácidos se indican con una “d” antes del residuo de aminoácido respectivo (por ejemplo, dR=D-Arg).
Para unas pocas secuencias desafortunadamente la síntesis falló en el primer enfoque debido a razones técnicas. Estas secuencias se abrevian en la figura 6 como 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 43, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 85, 8 6 , 87, 88 , 89 y 90. Sin embargo, las secuencias restantes fueron usadas en los experimentos de internalización.
Los resultados se muestran en la figura 6.
Como se puede ver en la figura 6 , después de 24 horas de incubación, todos los transportadores con la secuencia consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31) mostraron una capacidad de internalización más alta que el transportador L-TAT (SEQ ID NO: 43). Células Hela se incubaron 24 horas en una placa de 96 pocillos con 10 mM de los transportadores derivados de r3-L-TAT. Las células se lavaron después dos veces con tampón ácido (0,2 M de glicina, 0,15 M de NaCl, pH 3,0) y dos veces con PBS. Las células fueron lisadas mediante la adición del tampón de lisis RIPA. La cantidad relativa de péptido internalizado se determinó después leyendo la intensidad de fluorescencia (lector de placa Fusion Alpha; PerkinElmer) de cada extracto seguida por la sustracción de fondo.
Como se puede ver en la figura 6 , una posición parece ser crítica para la actividad de transportador más alta y para la cinética mejorada de la actividad de transporte: Y en posición 2 (péptido N° 91 que corresponde a la SEQ ID NO: 142).
La conclusión de este experimento es la siguiente:
• Después de 24 horas de incubación, todos los transportadores con la secuencia consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31) (véase tabla 2 para una selección de secuencias posibles) mostraron una capacidad de internalización más alta que el transportador L-TAT (SEQ ID NO: 43) (figura 6 ). Esos resultados validan completamente la secuencia de consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31).
• Una posición es crítica para la actividad de transportador más alta y (figura 6 ): Y en posición 2 (secuencia 91 que corresponde a la SEQ ID NO: 142).
En consecuencia, estas secuencias derivadas de TAT como las mostradas en la tabla 4, teniendo una Y en posición 2, son preferentes, particularmente cuando la secuencia tiene 9 aminoácidos y tiene la secuencia consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31).
Ejemplo 4: Medición de liberación de citoquinas y quimioquinas
A continuación se describirá el procedimiento que describe cómo se midió la cantidad liberada de varias citoquinas humanas después de la secreción inducida por ligando de células humanas (sangre, WBC, PBMC, linfocitos primarios purificados, líneas celulares, ...).
La técnica usada es un ELISA sándwich, que permite medir la cantidad de antígeno entre dos capas de anticuerpos (es decir, anticuerpo de captura y detección). El antígeno a medir debe contener al menos dos sitios antigénicos capaces de unirse al anticuerpo, ya que al menos dos anticuerpos actúan en el sándwich. Pueden usarse ya sea anticuerpos monoclonales o policlonales como anticuerpos de captura y detección en los sistemas ELISA sándwich. Los anticuerpos monoclonales reconocen un solo epítopo que permite la detección y cuantificación fina de pequeñas diferencias en antígeno. Comúnmente se usa un anticuerpo policlonal como anticuerpo de captura para empujar tanto antígeno como sea posible. La ventaja del ELISA sándwich es que la muestra no tiene que purificarse antes del análisis y el ensayo puede ser muy sensible (hasta 2 a 5 veces más sensible que directo o indirecto).
El método puede usarse para determinar el efecto de los inhibidores de JNK de la presente invención en cultivos celulares//'n vitro. A dosis no tóxicas, la eficacia del compuesto se indica por la reducción de los niveles de citoquina (la variación de densidad óptica (absorbancia a 450 nm) en comparación con las muestras no tratadas y se monitorea por ELISA. Los resultados se expresan en ng/ml.
4.1 Material
• Placa de 96 pocillos:
Para recoger los sobrenadantes (ref 82.1581, Sarstedt)
Para ELISA (F96 maxisorp, ref 442404, Nunc)
• TopSeal-A: sellos de microplaca de 96 pocillos (ref 600585, PerkinElmer).
• Reactivo ELISA
Tampón de recubrimiento ELISA: 0,1 M de NaCarbonate, pH 9,5 (=7,13 g de NaHCO3 (ref 71627, Fluka) 1,59 g de Na2CO3 (ref 71345, Fluka) en 1 litro de H2O, pH a 9,5 con NaOH concentrada) Tampón de lavado ELISA: PBS 1X 0,01% de Tween 20. Preparar 1 litro de PBS 1X (PBS10X: ref 70011, GIBCO) y añadir 100 pl de Tween 20 (ref P1379, Sigma) lentamente mientras se mezcla con agitador magnético).
Diluyente de ensayo: PBS 1X 10% de FBS (ref A15-1 51, PAA, descomplementado a 56°C, 30 min). Da Ko TMB (ref s 1599, DAKO): Solución de sustrato comercial
Solución de paro: 1 M de H3PO4 ( ^ para 200 ml = 177 ml de H2O 23 ml de H3PO4, 85% (ref 345245, Aldrich).
• Kit de ELISA (reactivo para 20 placas)
IFNy: Conjunto de ELISA de IFN humana, BD OptEIA™ (ref 555142, DB). IL-10: Conjunto de ELISA de IL-1 humana, BD OptEIA™ (ref 557953, BD).IL-10: Conjunto de ELISA de IL-10 humana, BD OptEIA™ (ref 555157, DB).
IL-12: Conjunto de ELISA de IL-12 humana (p70), BD OptEIA™ (ref 555183, DB).
IL-15: Conjunto de ELISA de IL-15 humana, BD OptEIA™ (ref 559268, DB). IL-2: Conjunto de ELISA de IL-2 humana, BD OptEIA™ (ref 555190, DB). IL-4: Conjunto de ELISA de IL-4 humana, BD OptEIA™ (ref 555194, DB).
IL-5: Conjunto de ELISA de IL-5 humana, BD OptEIA™ (ref 555202, DB). IL-6 : Conjunto de ELISA de IL- 6 humana, BD OptEIA™ (ref 555220, DB). IL-8 : Conjunto de ELISA de IL- 8 humana, BD OptEIA™ (ref 555244, DB).
MCP-1: Conjunto de ELISA de MCP humana, BD OptEIA™ (ref 555179, BD).
TNFa: Conjunto de ELISA de TNF humano, BD OptEIA™ (ref 555212, DB).
• Lectura de absorbancia: La absorbancia fue leída en el lector de placa Fusion Alpha (Perkin Elmer). • Pipetas de repetición, pipetas digitales o pipetas de varios canales.
4.2 Método
Preparación de las muestras
Las muestras son sobrenadantes del medio de cultivo de células humanas cultivadas (típicamente líneas de células de sangre entera, WBC, PBMC, subtipo purificado de WBC, líneas de células cancerosas). Se elimina cualquier material particulado por centrifugación (400 g, 5 minutos, 4°C) y se ensayan inmediatamente o se almacenan las muestras a 20 °C. Se evitan ciclos de congelación-descongelación repetidos.
Una hora antes de usar, se descongelan las muestras en hielo y se centrifugan. En la etapa 11, se diluyen las muestras en diluyente de ensayo directamente en la placa (se añade primero diluyente de ensayo, luego las muestras y la pipeta hacia arriba y hacia abajo):
Preparación del estándar
Después de calentar el estándar liofilizado a temperatura ambiente, se abre cuidadosamente el frasco para evitar pérdida de material. Se reconstituye el estándar liofilizado con el volumen propuesto de agua desionizada para producir un estándar de abastecimiento. Se permite que el estándar se equilibre durante al menos 15 minutos antes de hacer diluciones. Se centrifuga suavemente para mezclar. Después de la reconstitución, inmediatamente la solución de estándar se divide en alícuotas en frascos de polipropileno a 50 pl por frasco y se congela a -20°C hasta 6 meses. Si es necesario, se almacena a 2-8°C hasta 8 horas antes de la formación del alícuota/congelación. No se deja estándar reconstituido a temperatura ambiente.
Inmediatamente antes de usar, se prepara una curva estándar de diez puntos usando diluciones en serie 2 veces en el reactivo diluyente. Se recomienda un alto estándar de 4.000 pg/ml.
Preparación de la mezcla detectora
Incubación de una etapa de los reactivos de Biotina/SAv. Se añade el volumen requerido de anticuerpo de detección al diluyente del ensayo. 15 minutos antes de usar, se añade la cantidad requerida de reactivo de enzima, se centrifuga o se mezcla bien. Para diluciones recomendadas, véase el Certificado de Instrucción/Análisis específico de lote. Se descarta cualquier resto después de usar.
Recubrimiento con anticuerpo de captura
1. Se recubren los pocillos de una placa de microtitulación de PVC con 100 j l por pocillo de anticuerpo de captura diluido en tampón de recubrimiento. Para la dilución de recubrimiento de anticuerpo recomendada, véase el Certificado de Instrucción/Análisis específico de lote.
2. La placa se cubre con un plástico adhesivo y se incuba durante la noche a 4°C.
3. Se retira la solución de recubrimiento y se lava la placa al llenar los pocillos con 150 j l de tampón de lavado.
4. Las soluciones o lavados se retiran volteando la placa sobre un fregadero.
5. Se repite el proceso dos veces para un total de tres lavados.
6. Después del último lavado, se elimina cualquier tampón de lavado residual secando la placa con una toalla de papel.
Bloqueo
7. Se bloquean los sitios de unión a proteínas restantes en los pocillos recubiertos añadiendo 100 j l de diluyente reactivo por pocillo.
8. Se cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
9. Durante la incubación, se inicia la preparación del estándar.
Adición de muestras
10. Se hace un lavado como en la etapa 3 con 150 j l de tampón de lavado. Las placas están ahora listas para la adición de muestras.
11. Se añaden 50 j l de muestras diluidas adecuadamente en diluyente de ensayo a cada pocillo. Para resultados cuantitativos precisos, se compara siempre la señal de muestras desconocidas contra aquellas de una curva estándar. Estándares (triplicados) y blanco deben ejecutarse con cada citoquina para asegurar la precisión.
12. Se cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.
Incubación con anticuerpo de detección y anticuerpo secundario
13. Se lava la placa cuatro veces con 150 j l de tampón de lavado al igual que en la etapa 3.
14. Se añaden 50 j l de mezcla de detector (anticuerpo de detección anticuerpo de estreptavidina-HRP secundario en diluyente de ensayo) a cada pocillo a las diluciones recomendadas (véase Certificado de Instrucción/Análisis específico de lote).
15. Se cubre la placa con un plástico adhesivo y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente protegido de la luz.
16. Se lava la placa seis veces con 150 j l de tampón de lavado como en la etapa 3.
17. Se añaden 50 j l de solución DAKO TMB a cada pocillo, se incuba durante 15-20 minutos a temperatura ambiente, en oscuridad, sin sellar.
18. Se añaden 50 j l de solución de paro a cada pocillo. Se inclina suavemente la tapa para asegurar una mezcla cuidadosa.
19. Se mezcla la placa 5 minutos a 500 rpm en un mezclador de placa.
20. Se lee la densidad óptica a 450 nm. (Programa: citoquina_ELISA en lector de placa Fusion Alpha).
Análisis de los datos
Se promedian las lecturas triplicadas para cada control estándar y cada muestra. Se resta la densidad óptica estándar cero promedio (O.D.). Se crea una curva estándar dibujando el logaritmo de la concentración de citoquinas frente al logaritmo de O.D. y la línea de mejor ajuste puede determinarse por análisis de regresión. Si las muestran se han diluido, la concentración leída de la curva estándar debe multiplicarse por el factor de dilución. Debe obtenerse una curva estándar para cada conjunto de muestras ensayadas. Los datos extremos se eliminan usando la prueba de Grugg. Luego, los datos que no estuvieron en el intervalo de dos veces la SD se descartaron. Los experimentos independientes se toman en cuenta si el control positivo mostró datos como se observó previamente. Los experimentos independientes son agrupados (N > 3).
Los datos se presentan en pg/ml de liberación de citoquina o en %, en comparación con la condición inducida sin tratamiento con inhibidor.
Ejemplo 5: Diferenciación-estimulación de THP1 para liberación de citoquinas
A continuación se mostrará el procedimiento que describe cómo se indujo la producción de citoquinas a partir de células THP1 diferenciadas con PMA atacadas por LPS durante 6 horas para probar la capacidad de los inhibidores de JNK para su uso según la presente invención, en particular un inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172, para reducir la liberación de citoquinas inducida por estimulación. Las células THP1 fueron estimuladas ex vivo con diferentes ligandos para la lectura de la liberación de citoquinas. A dosis no tóxicas, la eficacia del inhibidor de JNK se indica por la reducción de los niveles de citoquinas en comparación con muestras no tratadas y se monitorea por ELISA. La toxicidad del compuesto se evalúa mediante la reducción de una sal tetrazolio (MTS) a formazan, dando un color púrpura.
Procedimiento:
a. Material
• Línea celular: THP-1 (ref TIB-202, ATCC, lote 57731475)
• Medio de cultivo, reactivo y placas
RPMI (ref 21875-091, Invitrogen) complementado con:
10% de FBS (ref A15-151, PAA): descomplementado a 56°C, 30 minutos
10 mM de Hepes (ref H0887, Sigma)
50 |jM de mercaptoetanol (ref 63690, Fluka: solución 14,3M): añadir 560 l de 50 mM de alícuotas en PBS almacenado a -20°C)
1 mM de piruvato de sodio (ref 58636, Sigma)
Penicilina (100 unidades/ml)/estreptomicina (100 g/ml) (ref P4333, Sigma)
El medio RPMI es luego filtrado con un filtro de 0,22 M (ref SCGPU05RE, Millipore).
PBS 10X (ref 70011, Invitrogen): diluido a 1X con H2O estéril
DMSO: Ref 41444, Fluka
PMA (12-miristato 13-acetato de forbol, ref P1585, Sigma, concentración 1 mM = 616,8 jg/m l en DMSO a -20°C). Usar directamente a una concentración final de 100 nM en RPMI (1 j l en 10 ml de medio).
LPS ultrapuro (lipopolisacárido, ref tlrl-eklps, Invitrogen, concentración 5 mg/ml): Solución de abastecimiento de LPS: 3 g/ml en PBS a 4°C. Usar directamente para preparar una solución concentrada 4X de 40 ng/ml en medio RPMI (min 1800 jl/placa; para 5 placas: 125 j l de LPS 3 g/ml 9250 j l de RPMI).
Placa de 96 pocillos:
Para cultivo de células adherentes (ref 167008, Nunc)
Para recoger los sobrenadantes (ref 82.1581, Sarstedt)
Para ELISA (F96 maxisorp, ref 442404, Nunc)
Soluciones de recubrimiento: poli-D-lisina (ref P9011, Sigma): 25 jg/m l finales diluidos en PBS 1x.
• Reactivo de ELISA y kits
Tampón de recubrimiento ELISA: 0,1 M de Nacarbonate, pH 9,5 (=7,13 g de NaHCO3 (ref 71627, Fluka)+1,59 g de Na2CO3 (ref 71345, Fluka) en 1 litro de H2O, pH a 9,5 con NaOH concentrado).
Tampón de lavado ELISA: PBS 1X+ 0,01% de Tween20 (ref P1379, Sigma, lote 094K0052)(=preparar 1 litro de PBS 1X y añadir 100 j l de Tween20 lentamente mientras se mezcla con agitador magnético). Diluyente de ensayo: PBS 1X 10% de FBS (ref A15-151, PAA, descomplementado a 56°C, 30 min). Da Ko TMB (ref s 1599, DAKO): solución de sustrato comercial.
Solución de paro: 1 M de H3PO4 ( ^ para 200 ml = 177 ml de H2O 23 ml de H3PO4, 85% (ref 345245, Aldrich).
TNF-: kit para conjunto de ELISA de TNF humano, BD OptEIA (ref 555212, DB).
Medición de citotoxicidad: Reactivo CellTiter 96 (ref G3581, Promega).
Compuesto de control: SP600125 (ref ALX-270-339-M025, Alexis, concentración: 20 mM de DMSO). Lectura de absorbancia: La absorbancia fue leída en el lector de placa Fusion Alpha (Perkin Elmer). Pipetas de repetición, pipetas digitales o pipetas de varios canales.
TopSeal-A: Sellos para microplaca de 96 pocillos (ref 600S85, Perkinelmer).
b. Método
Recubrimiento de pocillos
Las placas habían sido recubiertas con 200 j l de poli D-lisina (1x) e incubadas 2 horas a 37°C, 5% de CO2 y 100 % de humedad relativa.
Colocación de células
Después de 2 horas los pocillos fueron lavados dos veces con 200 j l de PBS 1X (usar inmediatamente o dejar con 200 j l de PBS 1X a 37°C hasta usar, pero no más de 3 días).
Las células se contaron. El número deseado de células se tomó y se resuspendió en la cantidad de medio necesaria para obtener una dilución de 1.000.000 de células/ml. 100 nM de PMA se añadieron para inducir la diferenciación del THP1 a partir de monocitos en suspensión a macrófagos adherentes. Las células se colocaron en los pocillos en 100 j l de medio a densidades de colocación de 100.000 células/pocillo. Después de la inoculación, las placas se incubaron a 37°C, 5% de CO2 y 100% de humedad relativa 3 días para su diferenciación antes de la adición de los fármacos experimentales.
Tratamiento de las células
Después de 3 días, las células adherentes se observaron con el microscopio. Los medios que contenían PMA fueron aspirados y reemplazados por 100 j l de medio RPMI fresco sin PMA (sin etapa de lavado con PBS 1X). Se prepararon fármacos experimentales a una concentración de 10 mM en H2O o DMSO y se almacenaron a -80°C. Antes de cada uso diario, se descongeló una alícuota de inhibidor de JNK y se diluyó para alcanzar una solución concentrada 4X (120 jM ) en medio RPMI y luego hasta la concentración deseada en RPMI. La SP600125 se diluyó para alcanzar una solución concentrada 4X (40 jM ) en medio RPMI y luego hasta la concentración deseada en RPMI que contenía 0,8% de DMSO.
Las placas fueron tratadas con 50 j l de medio o una solución de 4X la concentración de fármaco deseada final (0, 100 nM, 1, 3, 10 ó 30 jM para el compuesto JNK o a 0, 10, 100 nM, 1, 3 ó 10 jM final para el control positivo SP600125). Después de la adición de fármaco, las placas fueron incubadas durante 1 hora más a 37°C, 5% de CO2 y 100 % de humedad relativa.
Después de 1 hora, la secreción de TNF se indujo por la adición de 50 j l de una dilución concentrada 4X de LPS ultrapuro (3 ng/ml final).
Ensayo
Después de 6 horas, 100 j l del sobrenadante se transfirieron a placas de 96 pocillos nuevas. Esas placas fueron selladas y almacenadas a 20°C hasta el análisis por ELISA (por ejemplo, véase ejemplo 4) de la secreción de las citoquinas.
El efecto citotóxico de los compuestos fue evaluado por absorbancia MTS (por ejemplo, véase ejemplo 4) y las células fueron observadas usando un microscopio invertido (Axiovent 40 CFL; Zeiss; 10X).
Análisis de los datos
Los análisis de los datos se llevan a cabo como se indica en el ELISA (véase ejemplo 4). Brevemente, para ELISA: Promediar las lecturas triplicadas para cada control estándar y cada muestra; restar la densidad óptica (O.D) estándar cero promedio; crear una curva estándar del logaritmo de la concentración de citoquina frente al logaritmo de O.D y la línea de mejor ajuste puede determinarse mediante análisis de regresión. Si las muestras han sido diluidas, la concentración leída de la curva estándar debe multiplicarse por el factor de dilución. Debe obtenerse una curva estándar para cada conjunto de muestras ensayado. Los datos extremos fueron evitados usando la prueba de Grugg. Luego se descartaron los datos que no estaban en el intervalo de dos veces la SD. Los experimentos independientes se toman en cuenta si el control positivo mostró datos como se observó previamente. Los experimentos independientes son agrupados (N > 3).
Para la evaluación del efecto de toxicidad: En cada placa de cada experimento independiente tomado en cuenta para el análisis de la liberación de citoquina, el promedio de la absorbancia del medio sólo se consideró como fondo y se restó a cada valor de absorbancia. El promedio del triplicado de las células no tratadas de cada compuesto se consideró como el 100% de viabilidad. El promedio de triplicado de cada compuesto se normalizó por su 100%. Los datos extremos fueron evitados usando la prueba de Grugg. Luego los datos que no estaban en el intervalo de dos veces la SD fueron descartados. Los experimentos independientes se agrupan (N > 3). Todas las comparaciones estadísticas de las condiciones se llevaron a cabo con el software GraphPad con la siguiente prueba: Prueba ANOVA de una vía seguida por una Prueba de Comparación Múltiple de Tukey. P<0,05 se consideró como significativo.
Ejemplo 6: Inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 y liberación de TNFa en células de sangre entera humanas o de rata primarias
Se toma sangre entera de ratas anestesiadas o voluntarios humanos saludables usando una venipunción conectada a un tubo de vacío pre-etiquetado que contenía citrato de sodio. Los tubos se mezclan suavemente invirtiéndolos 7-8 veces; y luego se mantiene temperatura ambiente hasta la estimulación. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se prepara 6 veces concentrado en PBS, y 30 jl/pocillo de mezcla se añaden a una placa de 96 pocillos. Se diluye la sangre entera 1:2 en PBS y se añaden 120 j l de sangre diluida a cada pocillo, donde ya sea PBS solo o inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 ya se había añadido previamente. La sangre entera se incuba a 37°C; 85 rpm (incubadora Stuart Orbital SI500) durante 60 min. Se preparan entonces los activadores (LPS), 30 jl/pocillo de LPS, concentrado 6 veces. Después de incubación de 60 minutos, se añade LPS a la sangre, la sangre se mezcla pipeteando arriba y abajo, y luego se mantiene durante 4 horas bajo agitación (85 rpm), a 37°C. Después de la incubación de 4 horas, las placas se centrifugan a aproximadamente 770 g, 4°C durante 15 minutos en una centrífuga preenfriada. Los sobrenadantes son finalmente recogidos y mantenidos a 20°C hasta la medición de las citoquinas. Las citoquinas (IL-6 , IL-2, IFNy y TNFa) fueron luego medidas usando kits de ELISA estándar (por ejemplo, de R&D Systems: DuoSet Elisas; o de BD Biosciences: BD Opteia Set Elisa). Los resultados se expresan como pg/ml del sobrenadante de la citoquina medida. Un experimento similar se llevó a cabo con PMA+ionomicina en lugar de LPS como activador/estimulante.
Ejemplo 7: Vida media de inhibidores de JNK específicos aquí descritos
Los inhibidores de JNK de secuencias SEQ ID NO: 196, 197 y 172 (concentración final de 0,1 mM) fueron digeridos en suero humano (10 y 50% en PBS 1x). El experimento se llevó a cabo como se describe en Tugyi et al. (Proc Natl Acad Sci E.U.A., 2005, 413-418). El péptido intacto restante se cuantificó por UPLC-MS. La estabilidad se evaluó para las SEQ ID NO: 196, 197 y 172 idénticamente pero en dos ensayos separados. Mientras que el inhibidor de JNK de SEQ ID NO:196 se degradó totalmente en residuos de aminoácidos en 6 horas, el inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 172 se degradó completamente sólo después de 14 días. El inhibidor de JNK de SEQ ID NO: 197 aún era estable después de 30 días.
Ejemplo 8: Inhibición dosis-dependiente por el inhibidor de JNK de secuencia SEQ ID NO: 172 de la liberación de IL-2 inducida por CD3/CD28 en células T primarias de rata
Los animales de control fueron sacrificados, se cosecharon los nódulos linfáticos (LN) y se mantuvieron en medio RPMI completo. Los LN fueron triturados con RPMI completo en un filtro de 70 pm usando un pistón de 5 ml. Se añadieron algunas gotas de medio para mantener el colador húmedo. Las células fueron centrifugadas durante 7 minutos a 450g y 4°C. El sedimento se resuspendió en 5 ml de medio fresco. Las células se pasaron de nuevo a través del colador de células. Se contó una alícuota de células, mientras que las células fueron centrifugadas de nuevo 10 minutos a 1.400 rpm y 4°C. Las células fueron resuspendidas en tampón MACS (80 pl de tampón MACS por 107 células). Se añadieron 10 pl de microesferas MHC anti-rata por 10 millones de células, las células se incubaron durante 15 minutos a 4°C-8°C. Las células fueron lavadas con 15 ml de tampón MACS y centrifugadas durante 7 minutos a 700g y 4°C. El sedimento se resuspendió en 500 pl de tampón MACS por 10a células. Se dispuso una columna Ls en el campo magnético del separador MACS por cada animal. La columna se enjuagó primero con 3 ml de tampón MACS. Se puso un tubo con hielo debajo de la columna para recoger células = células T (selección negativa por lo que se recolectó lo que fue eluido). La suspensión de células se añadió y el eluato se recolectó en hielo. La columna se lavó 3 veces con 3 ml de tampón MACS. Las células T eluidas fueron centrifugadas durante 7 minutos a 700 g y 4°C. Las células resuspendidas fueron contadas y colocadas a una densidad de 200 .000 células/pocillo en 100 pl de medio completo. Las placas fueron pre-recubiertas el día antes del experimento con 2 pg/ml de anticuerpo CD3, y el día del experimento las placas fueron lavadas tres veces con PBS. Las células fueron tratadas con 100 pl de inhibidor de JNK (poli)-péptido (SEQ ID NO: 172), dos veces concentradas durante 1 hora antes de la activación de ligando. Después de 1 hora de pre-tratamiento con el inhibidor de JNK (poli)péptido (SEQ ID NO: 172), las células fueron luego estimuladas con 2 pg/ml de anticuerpo anti CD28 durante 24 horas. Después de 24 horas de estimulación, el sobrenadante se recogió y se almacenó a -20°C hasta el análisis. Las citoquinas fueron luego medidas usando kits de ELISA estándar. Los resultados se expresan como pg/ml de sobrenadante de la citoquina medida.
En un experimento adicional se empleó esencialmente el mismo protocolo que el mostrado arriba, pero además de los inhibidores de JNK (poli)péptidos de SEQ ID NO: 172, también se ensayaron inhibidores de JNK de la secuencia SEQ ID NO: 197 y la molécula de fármaco SP600125, permitiendo así comparar los efectos de estos inhibidores en la inhibición de liberación de IL-2 inducida por CD3/CD28.
Ejemplo 9: Liberación de inhibidor de JNK y TNFa/IL-2 en sangre entera humana
Se recogió sangre completa de voluntarios humanos saludables por venipunción conectada a un tubo de vacío pre-etiquetado que contenía citrato de sodio. Los tubos se mezclaron suavemente volteándolos 7-8 veces; y después se mantuvieron a temperatura ambiente hasta la estimulación. Se añadieron 350 pl de RPMI P/S en placa de 96 pocillos de 1,2 ml. La concentración de 10 veces de SEQ ID NO: 172 se preparó en RPMI+P/S (50 pl por pocillo). Se añadieron 50 pl a placas de 96 pocillos de 1,2 ml. Luego se añadieron 50 pl de sangre completa en cada pocillo, donde ya se había añadido medio solo o inhibidor de JNK previamente. La sangre completa se incubó a 37°C, 5% de CO2 durante 60 minutos. Se prepararon 50 pl/pocillo de ligandos diluidos en RPMI+P/S, que correspondían a la dilución final 10 veces concentrada. Después de 60 minutos de incubación, se añadió el ligando; los pocillos fueron luego mezclados por pipeteo hacia arriba y hacia abajo de la sangre. Se incubó la sangre completa durante 3 días a 37°C (los pocillos se mezclaron pipeteando cada pocillo hacia arriba y hacia abajo una vez al día). Al final de la incubación, las placas se mezclaron y luego se centrifugaron a 2.500 rpm, 4°C, durante 15 minutos en una centrifuga pre-enfriada. Las citoquinas fueron luego medidas usando kits de ELISA estándar. Los resultados se expresan como pg/ml de sobrenadante de la citoquina medida.
Se llevó a cabo un experimento similar con ligeras modificaciones. En el caso de la estimulación de CD3/CD8, anticuerpo CD3 fue recubierto a 2 pg/ml en PBS durante la noche a 4°C. El día del experimento, los pocillos fueron lavados tres veces con PBS y se mantuvieron en PBS hasta su uso a 37°C. Se añadió anticuerpo CD28 1 hora después de SEQ ID NO: 172 a una concentración final de 2 pg/ml; se recogieron los sobrenadantes después de 3 días de estimulación.
Ejemplo 10: Potencia antiinflamatoria en un modelo en la rata de uveítis inducida por endotoxinas (EIU) La potencia antiinflamatoria del inhibidor JNK de SEQ ID NO: 172 se probó en ratas albinas después de la administración intravenosa (modelo EIU/LPS). El objetivo de este estudio era determinar los efectos de inyecciones intravenosas únicas de SEQ ID NO: 172 (0,015, 0,18 y 1,80 mg/kg) en la respuesta inflamatoria en un modelo en rata albina de uveítis inducida por endotoxinas y comparar estos efectos con los obtenidos con el inhibidor JNK de la técnica anterior de SEQ ID NO: 197 (2 mg/kg). Como control adicional se empleó fosfato sódico dexametasona.
Sesenta (60) ratas Lewis macho fueron divididas aleatoriamente en seis (6 ) grupos de diez (10) animales cada uno. La EIU fue inducida por inyección de lipopolisacárido (LPS, 1 mg/kg) en la almohadilla de la pata. Se administraron NaCl (0,9%), SEQ ID NO: 197 a 2 mg/kg y Se Q ID NO: 172 a tres concentraciones (1,80 mg/kg, 0,18 mg/kg y 0,015 mg/kg) mediante inyección intravenosa. Se administró fosfato sódico dexametasona (20 |jg/ojo) mediante inyección subconjuntival en ambos ojos. 24 horas después de la inyección de LPS, la respuesta inflamatoria se evaluó mediante puntuación clínica.
La intensidad de la inflamación ocular clínica se calificó en una escala de 0 a 4 para cada ojo:
Grado 0 sin inflamación
Grado 1 leve iris y vasodilatación conjuntival
Grado 2 iris moderado y vasodilatación conjuntival con brote
Grado 3 iris intenso y vasodilatación conjuntival con brote
Grado 4 reacción inflamatoria intensa
(+1 ) formación de fibrina y seclusión de pupilas
Veinticuatro horas después de la inducción de LPS, las puntuaciones clínicas para las ratas tratadas con vehículo fueron 3,6 ± 0,2 (media ± SEM, n = 20) con una mediana de 4 (rango, 2-5). Se detectó una reducción significativa (p <0,001) en la gravedad de la inflamación ocular 24 horas después de la inducción y el tratamiento intravenoso con SEQ ID NO: 197 (2 mg/kg) (puntuación media: 2,2 ± 0,3, mediana: 2), correspondiente a una disminución del 40% de las puntuaciones de EIU en comparación con la puntuación observada en el grupo de vehículo. El tratamiento intravenoso con SEQ ID NO: 172 a aproximadamente la misma dosis (1,80 mg/kg) redujo también significativamente la gravedad de la inflamación ocular en un 42% (puntuación media: 2,1 ± 0,3, mediana: 2, p = 0,001). Las dosis más bajas (0,18 y 0,015 mg/kg) redujeron la inflamación en un 33% (puntuación media: 2,4 ± 0,3, mediana: 2) y 36% (puntuación media: 2,3 ± 0,3, mediana: 2), respectivamente. La reducción fue significativa, con p <0,001.
Un tratamiento subconjuntival con dexametasona (20 jg/ojo), utilizado como fármaco de control positivo, también redujo significativamente las puntuaciones clínicas en un 79% (puntuación media: 0,8 ± 0,2, mediana: 0,5, p <0,001).
En estas condiciones experimentales, se puede afirmar que una sola inyección intravenosa de SEQ ID NO: 197 a 2 mg/kg evitó parcialmente la inflamación inducida por endotoxina observada en la cámara anterior. En comparación, la SEQ ID NO: 172 inyectada vía intravenosa a 0,015, 0,18, 1,80 mg/kg también redujo la inflamación inducida por endotoxina en la cámara anterior.
Ejemplo 11: Efectos dosis-respuesta tras la administración intravenosa de inhibidor de JNK después de 14 días en un modelo en rata de artritis de colágeno tipo II crónica establecida
La artritis por colágeno en la rata es un modelo experimental de poliartritis que se ha utilizado ampliamente en ensayos preclínicas de numerosos agentes antiartríticos bajo investigación preclínica o clínica o que actualmente se usan como terapéuticos en esta enfermedad. Las características distintivas de este modelo son el inicio confiable y la progresión de una inflamación poliarticular robusta y fácil de medir, una destrucción marcada del cartílago en asociación con la formación de pannus y la resorción ósea leve a moderada y la proliferación ósea perióstica.
En este modelo experimental se determinó la eficacia intravenosa (iv) del inhibidor JNK de SEQ ID NO: 172 administrado diariamente (QD) durante 14 días (artritis d1-14) para la inhibición de la inflamación (hinchazón de la pata), destrucción del cartílago y resorción ósea que ocurre en el tipo establecido de artritis por colágeno II en ratas.
Los animales (8 /grupo para artritis) se anestesiaron con isoflurano y se les inyectaron 300 j l de adyuvante incompleto de Freund (Difco, Detroit, MI) que contenía 2 mg/ml de colágeno bovino tipo II (Elastin Products, Owensville, Missouri) en la base del cola y 2 sitios en la parte posterior en los días 0 y 6. El día 10 del estudio (artritis d0), se produjo el inicio de la artritis y las ratas se aleatorizaron en grupos de tratamiento. La aleatorización en cada grupo se realizó después de que la inflamación de la articulación del tobillo se estableció de forma obvia en al menos una pata trasera.
Las ratas Lewis hembra con artritis de colágeno tipo II establecida se trataron diariamente (QD) en los días de artritis 1-14 vía intravenosa (iv) con vehículo (NaCl), SEQ ID NO: 172 (0,01, 0,1, 1 o 5 mg/kg) o con el compuesto de referencia dexametasona (Dex, 0,05 mg/kg). Los animales se estudiaron el día 14 de artritis. La evaluación de la eficacia se basó en el peso corporal de los animales, las mediciones diarias de la pinza del tobillo, el diámetro del tobillo expresado como área bajo la curva (AUC), el peso terminal de las patas traseras y la evaluación histopatológica de tobillos y rodillas de grupos seleccionados.
La puntuación de las articulaciones artríticas por colágeno, tobillos y rodillas, reciben puntuaciones de 0-5 para inflamación, formación de pannus y resorción ósea de acuerdo con los siguientes criterios:
Inflamación de rodilla y/o tobillo
0 Normal
0,5 Inflamación focal mínima
1 Infiltración mínima de células inflamatorias en tejido sinovial/ periarticular
2 Infiltración leve
3 Infiltración moderada con edema moderado
4 Infiltración marcada con edema marcado
5 Infiltración severa con edema severo
Tobillo Pannus
0 Normal
0,5 Infiltración mínima de pannus en cartílago y hueso subcondral, afecta solo zonas marginales y solo a pocas articulaciones
1 Infiltración mínima de pannus en cartílago y hueso subcondral, afecta principalmente a zonas marginales
2 Infiltración leve (<1/4 de tibia o tarsos en zonas marginales) g
3 Infiltración moderada (1/4 a 1/3 de tibia o pequeños tarsos afectados en zonas marginales) 4 Infiltración marcada (1/2 a 3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales)
5 Infiltración severa (> 3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales, distorsión severa de la arquitectura general)
Rodilla Pannus
0 Normal
0,5 Infiltración mínima de pannus en cartílago y hueso subcondral, afecta solo a zonas marginales y afecta solo a algunas articulaciones
1 Infiltración mínima de pannus en cartílago y hueso subcondral, aproximadamente 1-10% de la superficie del cartílago o hueso subcondral afectado
2 Infiltración leve (se extiende hasta 1/4 de la superficie o área subcondral de tibia o fémur), aproximadamente 11-25% de la superficie del cartílago o hueso subcondral afectado
3 Infiltración moderada (se extiende sobre > 1/4 pero <1/2 de la superficie o área subcondral de tibia o fémur) aproximadamente 26-50% de la superficie del cartílago o hueso subcondral afectado 4 Infiltración marcada (se extiende entre 1/2 y 3/4 de la superficie tibial o femoral) aproximadamente 51-75% de la superficie del cartílago o hueso subcondral affetado
5 Infiltración severa aproximadamente 76-100% de la superficie del cartílago o hueso subcondral afectado
Daño del cartílago del tobillo (énfasis en tarsos pequeños)
0 Normal
0,5 Disminución mínima de T tinción azul, afecta solo a zonas marginales y afecta solo a unas pocas articulaciones
1 Mínima = pérdida mínima a leve de la tinción de azul de toluidina sin pérdida evidente de condrocitos o alteración del colágeno
2 Leve = pérdida leve de Tinción de azul de toluidina con pérdida focal leve (superficial) de condrocitos y / o disrupción de colágeno
3 Moderada = pérdida moderada de tinción de azul de toluidina con pérdida de condrocitos multifocal moderada (profundidad a zona media) y/o disrupción de colágeno, tarsos más pequeños afectando a 1/2 a 3/4 de profundidad con áreas raras de pérdida de espesor total
4 Marcado = pérdida marcada de tinción de azul de toluidina con pérdida de condrocitos marcada multifocal (profundidad a zona profunda) y/o disrupción de colágeno, 1 o 2 pequeñas superficies tarsianas tienen pérdida total de cartílago de espesor
5 Severa = pérdida difusa severa de la tinción de azul de toluidina con pérdida de condrocitos severa multifocal (marca de profundidad a marea) y/o disrupción de colágeno que afecta a más de 2 superficies de cartílago
Daño del cartílago de rodilla
0 Normal
0,5 Mínimo disminución de la tinción con azul T, afecta solo a las zonas marginales
1 Mínimo = pérdida mínima a leve de la tinción con azul de toluidina sin pérdida evidente de condrocitos o alteración del colágeno
2 Leve = pérdida leve de la tinción con azul de toluidina con pérdida focal leve (superficial) de condrocitos y/o disrupción del colágeno, puede tener pocas áreas pequeñas de 50% de profundidad del cartílago afectado
3 Moderado = pérdida moderada de la tinción de azul de toluidina con pérdida multifocal a difusa moderada (profundidad a media zona) de condrocitos y/o disrupción de colágeno, puede tener 1 - 2 áreas pequeñas de pérdida de espesor total que afectan menos de 1/4 del ancho total de una superficie y no más del 25% del ancho total de todas las superficies
4 Marcado = pérdida marcada de tinción de azul de toluidina con pérdida de condrocitos multifocal a difusa marcada (profundidad a zona profunda) y/o disrupción del colágeno o 1 superficie con pérdida casi total y pérdida parcial en otras, pérdida total total menor al 50% del ancho de todas las superficies combinadas
5 Severa = pérdida difusa severa de la tinción con azul de toluidina con pérdida de condrocitos severa multifocal (marca de profundidad a marea) y/o disrupción del colágeno en ambos fémures y/o tibias, pérdida total total mayor al 50% del ancho de todas las superficies combinadas
Resorción ósea del tobillo
0 Normal
0,5 La reabsorción mínima afecta solo a las zonas marginales y solo a unas pocas articulaciones 1 Mínima = pequeñas áreas de reabsorción, no evidentes bajo aumento, osteoclastos raros
2 Leve = áreas de reabsorción más numerosas, no aparentes fácilmente bajo aumento, osteoclastos más numerosos, <1/4 de tibia o tarsos en zonas marginales reabsorbidas
3 Moderada = reabsorción obvia del hueso medular trabecular y cortical sin defectos completos de grosor en la corteza, pérdida de algunas trabéculas medulares, lesión aparente bajo aumento, osteoclastos más numerosos, 1/4 a 1/3 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales
4 Marcada = defectos de espesor total en hueso cortical, a menudo con distorsión del perfil de la superficie cortical restante, pérdida marcada del hueso medular, numerosos osteoclastos, 1/2 a 3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales
5 Severa = defectos de espesor total en hueso cortical, a menudo con distorsión del perfil de la superficie cortical restante, pérdida marcada de hueso medular, numerosos osteoclastos, > 3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales, distorsión severa de la arquitectura general
Resorción ósea de rodilla
0 Normal
0,5 La reabsorción mínima afecta solo a las zonas marginales
1 Mínima = pequeñas áreas de reabsorción, que no se ven fácilmente bajo aumento, aproximadamente I - 10 % del ancho total de la articulación del hueso subcondral afectado
2 Leve = áreas de resorción más numerosas, pérdida definitiva de hueso subcondral, aproximadamente I I - 25% del ancho total de la articulación del hueso subcondral afectado
3 Moderada = reabsorción obvia del hueso subcondral aproximadamente 26-50% del ancho total de la articulación del hueso subcondral afectado
4 Marcada = reabsorción obvia del hueso subcondral aproximadamente 51-75% del ancho total de la articulación del hueso subcondral afectado
5 Severa = distorsión de toda la articulación debido a la destrucción aproximadamente del 76-100% del ancho total de la articulación del hueso subcondral afectado
Resultados:
La gravedad de la enfermedad en el grupo de control de la enfermedad aumentó de los días 1 a 5 y el día 4-5 tuvo el mayor aumento diario. Luego, los incrementos fueron más pequeños hasta el pico el día 7. A partir de ese momento, la hinchazón aguda generalmente disminuyó y las medidas de pinzas disminuyeron. Los grupos de tratamiento también siguieron este patrón general.
Se observó pérdida de peso corporal en todos los grupos de enfermedad, mientras que el grupo de control normal tuvo un aumento de peso. La pérdida de peso corporal se inhibió significativamente (25%, p <0,05 por ANOVA) para las ratas tratadas con 5 mg/kg de SEQ ID NO: 172 en comparación con los controles de enfermedad tratadas con vehículo. Cuando se comparó con los controles de enfermedad usando una prueba t de Student, la inhibición de la pérdida de peso corporal también fue significativa para las ratas tratadas con 1 mg/kg de SEQ ID NO: 172 (21%, p <0,05) o Dex (21%, p <0,05). Los resultados del tratamiento con SEQ ID NO: 172 fueron sensibles a la dosis para este parámetro.
Las medidas diarias del diámetro del tobillo se redujeron significativamente (p <0,05 por RM ANOVA de 2 vías) hacia la normalidad para las ratas tratadas con 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (p <0,05 días 4-12) o Dex (p <0,05 d 3 -14) en comparación con los controles de enfermedad.
El AUC del diámetro del tobillo se redujo significativamente (p <0,05 por ANOVA) hacia la normalidad en ratas tratadas con 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (reducción del 43%), 1 mg/kg SEQ ID NO: 172 (27%) o Dex (97%) en comparación con los controles de enfermedad. Los resultados del tratamiento con SEQ ID NO: 172 fueron sensibles a la dosis para este parámetro.
Los pesos finales de las patas se redujeron significativamente (p <0,05 por ANOVA) hacia la normalidad para las ratas tratadas con 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (reducción del 26%) o Dex (114%) en comparación con los controles de enfermedad. Los resultados del tratamiento con SEQ ID NO: 172 fueron sensibles a la dosis para este parámetro.
Los pesos relativos del hígado no se vieron afectados significativamente (por ANOVA) para las ratas en ningún grupo de tratamiento en comparación con los controles de la enfermedad.
Los pesos del bazo en relación con el peso corporal se redujeron significativamente (p <0,05 por ANOVA) para las ratas tratadas con Dex en comparación con los controles de la enfermedad.
Los pesos relativos del bazo para las ratas tratadas con Dex también se redujeron significativamente en comparación con los controles normales. Los pesos relativos del bazo no se vieron afectados significativamente para las ratas tratadas con SEQ ID NO: 172.
Los pesos del timo en relación con el peso corporal se redujeron significativamente (p <0,05 por ANOVA) para las ratas tratadas con Dex en comparación con los controles de la enfermedad. Los pesos relativos del timo para las ratas tratadas con Dex también se redujeron significativamente en comparación con los controles normales. Los pesos relativos del timo no se vieron afectados significativamente para las ratas tratadas con SEQ ID NO: 172.
Todos los parámetros histopatológicos del tobillo se redujeron significativamente (prueba U de Mann-Whitney) hacia la normalidad para las ratas tratadas con 5 mg/kg de SEQ ID NO: 172 (reducción del 25% de las puntuaciones sumadas) en comparación con los controles de la enfermedad.
Todos los parámetros histopatológicos de la rodilla se redujeron significativamente (prueba U de Mann-Whitney) hacia la normalidad para las ratas tratadas con 5 mg/kg de SEQ ID NO: 172 (reducción del 73% de las puntuaciones sumadas) en comparación con los controles de la enfermedad.
Los resultados de este estudio indicaron que el tratamiento intravenoso diario con SEQ ID NO: 172 (5 mg/kg) tuvo un efecto beneficioso significativo sobre los parámetros clínicos e histopatológicos asociados con la artritis de colágeno tipo II establecida en ratas.
El tratamiento con SEQ ID NO: 172 (1 mg/kg) dio como resultado una reducción significativa del AUC del diámetro del tobillo. El efecto beneficioso sobre el diámetro del tobillo se observó hasta el día 12 a pesar de la reducción de la inflamación después del día 7 en los animales de control de la enfermedad. Los resultados del tratamiento con SEQ ID NO: 172 fueron sensibles a la dosis.
El tratamiento con SEQ ID NO: 172 no tuvo ningún efecto adverso sobre el peso de los órganos, a diferencia de la dexametasona.
Ejemplo 12: Efecto del (poli)péptido inhibidor de JNK todo-D-retroinverso de SEQ ID NO: 197 y el (poli)péptido inhibidor de JNK de la SEQ ID NO: 172 a tres dosis en un modelo de ojo seco inducido por escopolamina en ratones
Concepto de estudio
El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de dos compuestos diferentes, el (poli)péptido inhibidor de JNK todo D-retroinverso de SEQ ID NO: 197 y el (poli)péptido inhibidor JNK de SEQ iD n O: 172 a tres niveles de dosis en un modelo de ojo seco en ratón inducido por escopolamina.
Los péptidos de SEQ ID NO: 197 y SEQ ID NO: 172 se probaron para determinar su eficacia en este modelo murino de ojo seco. Ambos péptidos se probaron a dosis baja, media y alta. Para el péptido de SEQ ID NO: 197, las concentraciones medidas en las muestras formuladas para niveles de dosis baja, media y alta fueron 0,06% (p/v), 0,25% (p/v) y 0,6% (p/v), respectivamente, y para la SEQ ID NO: 172 las concentraciones medidas en las muestras formuladas para los niveles de dosis baja, media y alta fueron 0,05% (p/v), 0,2% (p/v) y 0,6% (p/v), respectivamente. El vehículo, que también sirvió como control negativo, era cloruro de sodio al 0,9% para inyección USP.
El estudio consistió en un total de 9 grupos de ratones hembra C57BL/6, que comprenden 8 grupos de 12 ratones cada uno y un grupo adicional de 4 ratones. Se induho el ojo seco bilateral a corto plazo por una combinación de inyección de bromhidrato de escopolamina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) (subcutánea (sc) cuatro veces al día, 0,5 mg/dosis, días 0-21) y exponiendo a los ratones a un ambiente constante de aire seco. A partir del día 1, los ratones de los grupos 1-8 fueron tratados tres veces al día (TID) durante 21 días por la administración ocular tópica bilateral (oculus uterque; OU) (5 pl/ojo/dosis) del vehículo (solución salina estéril al 0,9%; control negativo), el péptido de SEQ ID NO: 197 (0 ,06 %, 0,25% y 0,6%), el péptido de SEQ ID NO: 172 (0,05%, 0,2% y 0,6%) o ciclosporina (0,05%; control positivo, un fármaco inmunosupresor utilizado para reducir la actividad del sistema inmune). Los ratones del Grupo 9 se mantuvieron como control no inducido (sin ojo seco) sin tratar.
Durante el período de vida (tratamiento), las observaciones clínicas se registraron una vez al día; el examen con lámpara de hendidura (LES) con tinción de fluoresceína corneal, la prueba de tiempo de ruptura de lágrima (TBUT) y la prueba de fibra de rojo de fenol (PRTT) se realizaron tres veces por semana. Las necropsias se realizaron el día 2 2 ; los ojos, los párpados, las conjuntivas y las glándulas lagrimales se recogieron de ambos ojos de cada animal. Se fijaron los tejidos de los ojos derechos (oculus dexter, OD) y luego se evaluaron microscópicamente. Los tejidos de los ojos izquierdos (oculus sinister; OS) se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron congelados a -80°C para posibles análisis posteriores.
Tabla 5: Diseño experimental
Figure imgf000047_0001
Métodos
1. Preparación de la dosis
El (poli)péptido de SEQ ID NO: 197 se obtuvo de Polypeptide Laboratories (Francia) como un vial de microcentrífuga de plástico transparente de 1,5 ml conteniendo 300,65 mg de polvo seco.
El (poli)péptido de SEQ ID NO: 172 se obtuvo de Polypeptide Laboratories (Francia) como un vial de microcentrífuga de plástico transparente de 1,5 ml conteniendo 302,7 mg de polvo seco.
Antes del comienzo del estudio, los (poli)péptidos de SEQ ID NO: 172 y SEQ ID NO: 197 se formularon en solución salina estéril (vehículo). Las soluciones de dosificación de cada concentración se esterilizaron usando filtros de 0,2 pm, se dividieron en alícuotas en múltiples viales preetiquetados y se congelaron a -20°C. Las concentraciones medidas en las muestras formuladas para el péptido de SEQ ID NO: 197 fueron 0,058%, 0,25% y 0,624%, redondeadas a 0,06%, 0,25% y 0,6%. Las concentraciones medidas en las muestras formuladas para el péptido de SEQ ID NO: 172 fueron 0,053%, 0,217% y 0,562%, redondeadas a 0,05%, 0,2% y 0 ,6 %.
Cada día de dosificación se descongeló un conjunto de soluciones de dosificación y se usó para las administraciones de dosis de ese día. Los controles (vehículo, ciclosporina) se proporcionaron listos para la dosis, no fue necesaria la preparación de la dosis.
2. Exámenes con lámpara de hendidura (LES)
Antes de ingresar al estudio, a cada animal se le realizó un LES y un examen oftálmico indirecto con fluoresceína aplicada tópicamente. Los hallazgos oculares se registraron utilizando la puntuación ocular de la escala Draize. La puntuación de SLE y Draize se repitió tres veces por semana durante el período de vida.
3. Prueba de tiempo de ruptura lagrimal (TBUT) y posterior examen corneal
La prueba TBUT se realizó tres veces por semana midiendo el tiempo transcurrido en segundos entre un parpadeo completo después de la aplicación de fluoresceína en la córnea y la aparición del primer punto seco aleatorio en la película lagrimal. Para realizar la TBUT, se colocó fluoresceína sódica líquida al 0,1% en el saco conjuntival, los párpados se cerraron manualmente tres veces y luego se mantuvieron abiertos, revelando una película lagrimal continua que contiene fluoresceína cubriendo la córnea, y se registró el tiempo (en segundos) requerido para la rotura de la película (aparición de una mancha seca o raya). Al menos noventa segundos después, el daño del epitelio corneal se calificó usando una lámpara de hendidura con un filtro azul cobalto después de que se volviera a aplicar otra gota de fluoresceína al 0 ,1 % a la córnea; se puntuó la córnea según la escala ocular de Draize.
4. Prueba de rotura de fibra de hilo rojo de fenol (PRTT)
La producción de lágrimas se midió tres veces por semana en ambos ojos usando tiras de prueba PRTT (Zone-Quick; Menicon, Nagoya, Japón). Antes del primer tratamiento del día, se aplicó una fibra al borde lateral del fórnix conjuntival de cada ojo durante 30 segundos con biomicroscopía con lámpara de hendidura. La migración de lágrimas hacia arriba de la fibra (es decir, la longitud del hilo de algodón humedecido) se midió usando una escala milimétrica.
5. Necropsia y Patología
En la necropsia del día 22, se extirparon ambos ojos de cada animal, incluidos los globos, las glándulas lagrimales, los párpados y las conjuntivas. El ojo derecho y los tejidos asociados se fijaron por inmersión durante la noche en solución de Davidson modificada, seguido de transferencia a formalina tamponada neutra al 10% (NBF). Los tejidos fijos del ojo derecho se deshidrataron, se embebieron en parafina, se seccionaron con espesores de 3 a 5 |jm y se tiñeron los tejidos montados en portaobjetos con hematoxilina y eosina (H & E). Los portaobjetos teñidos se evaluaron mediante microscopía óptica. Se realizó una evaluación histopatológica detallada y completa en todas las partes del ojo, examinándose histopatológicamente al menos dos niveles de sección para cada ojo derecho. Se prestó especial atención a la córnea, los epitelios (incluidas las células caliciformes) de la conjuntiva y la córnea, así como a la glándula lagrimal. Estos tejidos se calificaron para la lesión en función de una escala de 0-4, siendo 0 normal, 1 mínimo, 2 leve, 3 moderado y 4 severo. Para cada córnea, las puntuaciones se basaron en el grosor del epitelio corneal y la inflamación corneal. Las conjuntivas se puntuaron por erosión e inflamación, así como por la presencia o ausencia de células caliciformes.
Resultados
La administración SC cuatro veces al día de escopolamina (0,5 mg/dosis) indujo un síndrome de ojo seco en ratones hembra C57BL/6 caracterizado por una disminución del volumen de producción de lágrimas acuosas y cambios en las propiedades fisicoquímicas de las lágrimas, lo que las hace menos capaces de mantener una película lagrimal estable capaz de lubricar y proteger eficazmente el ojo.
1. Tiempo de ruptura de la lágrima (TBUT) Examen de la retina y la córnea
Las pruebas de tiempo de ruptura lagrimal (TBUT) se realizaron antes de inducir el ojo seco y nuevamente en los días 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 y 21 después de la inducción del ojo seco. Después del inicio de la dosificación con escopolamina (inducción del ojo seco), los valores medios de TBUT comenzaron a disminuir en todos los animales, pero parecieron disminuir más lentamente en el Grupo 6 (dosis media de SEQ ID NO: 172). El nadir medio de TBUT para los grupos 5, 6 , 7 (dosis baja, media y alta del péptido de SEQ ID NO: 172) y el grupo 8 (ciclosporina) ocurrieron el día 7, alcanzando valores similares (6 , 6 ± 0,4, 6,7 ± 0,4, 6,7 ± 0,3 y 6,4 ± 0,4 s, respectivamente). Posteriormente, la media TBUT de estos grupos aumentó a un pico el día 9. Las medias TBUT de los grupos 6 y 7 (SEQ ID NO: 172 grupos de dosis media y alta) aumentaron a valores más altos (10,0 ± 0,7 s y 9,9 ± 0,8 s, respectivamente) que en el Grupo 8 , el grupo de ciclosporina (8,5 ± 0,3 s), mientras que la media de TBUT pico del Grupo 5, la dosis baja de SEQ ID NO: 172 (8,0 ± 0,4 s), fue ligeramente inferior a la del Grupo 8 (ciclosporina). La media de TBUT para los animales tratados con la dosis media y alta de SEQ ID NO: 197, Grupos 3 y 4, continuó disminuyendo después del inicio de la dosificación, alcanzando un punto más bajo el Día 9, mientras que el Grupo 2 de dosis baja aumentó el Día 9. Las medias TBUT de los animales tratados con dosis baja, media y alta de SEQ ID NO: 172 (Grupos 2, 3 y 4, respectivamente) estaban por encima del grupo del vehículo y generalmente por debajo del grupo de los animales tratados con dosis baja, media y alta de SEQ ID NO: 172.
Cuando se usó el área bajo la curva (AUC) para los valores de TBUT del día 7 al día 21 para comparar los diversos tratamientos con el control del vehículo, el tratamiento con dosis media, baja y alta del péptido de SEQ ID NO: 172 (0,05 %, 0,2% y 0,6%, respectivamente), Grupos 5, 6 y 7, así como con los animales tratados con ciclosporina (0,05%), Grupo 8 , se demostró un aumento significativo del AUC TBUT (ANOVA no paramétrico de Kruskal-Wallis). El péptido de SEQ ID NO: 172 parecía producir un aumento dependiente de la dosis en TBUT, peroduciendo a menudo las dosis medias y altas efectos similares. Además, no hubo diferencias significativas en el UAUC TBUT entre el grupo tratado con ciclosporina, los grupos tratados con tres niveles de dosis de SEQ ID NO: 172 y el grupo no inducido (Grupos 5, 6 , 7, 8 y 9). Este hallazgo sugiere que las tres dosis del péptido de SEQ ID NO: 172 y la ciclosporina fueron más o menos igual de efectivas para mejorar o revertir los cambios oftalmológicos que subyacen a los cambios de TBUT en este modelo de ojo seco.
Los grupos tratados con niveles de dosis baja, media y alta del péptido de SEQ ID NO: 197 (Grupos 2-4) mostraron ligeros aumentos, generalmente dependientes de la dosis, de TBUT, que comenzaron a aumentar aproximadamente dos días después que los animales tratados con la SEQ ID NO: 172 o ciclosporina.
Tabla 6 : Valores medios calculados de AUC TBUT
Figure imgf000049_0001
2. Prueba de rotura de fibra rojo de fenol (PRTT)
Las pruebas PRTT se realizaron antes de la inducción del ojo seco y nuevamente los días 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 y 21. Los valores de PRTT desde el día 0 hasta el día 4 disminuyeron en todos los ratones a los que se les indujo el ojo seco, lo que indica una disminución en la producción de lágrimas después de la administración de escopolamina y la exposición a un ambiente de aire seco creado por sopladores. El nadir en PRTT en la mayoría de los grupos ocurrió aproximadamente el día 7. PRTT siguió disminuyendo en el grupo de control del vehículo (Grupo 1), alcanzando un punto más bajo el día 14. Después del nadir, hubo un aumento en todos los grupos de ojo seco. Estos hallazgos indican que el inicio del tratamiento con escopolamina un día antes que el inicio del tratamiento con el compuesto fue suficiente para iniciar cambios fisiológicos en el ojo asociados al síndrome del ojo seco. Incluso el grupo tratado con ciclosporina mostró una disminución en PRTT similar a otros grupos durante aproximadamente el día 7, luego aumentó a un pico los días 11-14, seguido de una ligera disminución. En la última prueba PRTT (Día 21), la ciclosporina (Grupo 8 ) y los Grupos 6 y 7 tuvieron valores de PRTT similares, lo que sugiere que tanto la dosis media como alta del péptido de SEQ ID NO: 172 tienen efectos terapéuticos similares a la ciclosporina, aumentarndo la producción de lágrimas acuosas en este modelo murino de ojo seco.
Los animales tratados con la dosis baja, media o alta del péptido de SEQ ID NO: 172 produjeron significativamente más lágrimas acuosas en comparación con los animales tratados con vehículo. Por tanto, de forma similar a TBUT, el péptido de SEQ ID NO: 172 en general produjo aumentos significativos relacionados con la dosis en la producción de lágrimas acuosas en este modelo.
Los grupos tratados con niveles de dosis baja, media y alta del péptido de SEQ ID NO: 197 (0,06%, 0,25% y 0,6%, Grupos 2, 3 y 4, respectivamente) mostraron aumentos generalmente dependientes de la dosis en PRTT.
Tabla 7: Valores medios calculados de AUC PRTT
Figure imgf000049_0002
3. Histopatología
En este estudio, en general los cambios histológicos se limitaron a la córnea. Los hallazgos en la córnea consistieron en un aumento de la queratinización de la superficie del epitelio corneal, un aumento del grosor del epitelio corneal, un aumento de la celularidad del epitelio corneal, una incidencia levemente mayor de mitosis de la capa epitelial basal consistente con un aumento de la renovación de las células epiteliales. Estos hallazgos son indicativos de una respuesta fisiológica adaptativa al secado corneal y a la irritación de la superficie corneal. La ulceración de la superficie, el edema del estroma corneal y el infiltrado inflamatorio en la córnea no se observaron en este estudio. Los ojos en el Grupo 9, el grupo no tratado (ratones normales, sin tratamiento con escopolamina), estaban dentro de los límites normales. Hubo una mínima inflamación no supurativa de los párpados dispersos en todos los grupos, pero la conjuntiva, la retina, las glándulas lagrimales y otras partes del ojo estaban dentro de los límites normales. Las células caliciformes parecían estar dentro de los límites en todos los grupos. Las células caliciformes son un productor principal de mucina que ayuda a las lágrimas a formar una película adhesiva más fuerte.
Se observaron cambios corneales leves a moderados en todos los grupos, excepto en el grupo de ojo normal no tratado (Grupo 9) y fueron ligeramente más graves en el Grupo 1, el grupo tratado con vehículo, y en el Grupo 2, dosis baja del péptido de SEQ ID NO: 197, en comparación con los otros grupos de tratamiento. Estos hallazgos fueron consistentes con los efectos beneficiosos positivos del aumento de la producción de lágrimas en la córnea.
Cuando se compararon las puntuaciones histológicas de los diversos grupos de tratamiento con aquellas del grupo de ciclosporina para determinar si algún otro tratamiento produjo "reducciones de puntuación similares" a la ciclosporina, se encontró que las puntuaciones de los Grupos 4, 6 y 7 no eran significativamente diferentes a la ciclosporina. Por tanto, estos tres tratamientos, la dosis media y alta del péptido de SEQ ID NO: 172 y la dosis alta del péptido de SEQ ID NO: 197, fueron los más efectivos después de la ciclosporina reduciendo/mejorando los cambios corneales asociados a este modelo de ojo seco murino.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Inhibidor de JNK que comprende una secuencia (poli)peptídica inhibidora según la siguiente fórmula general
    X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8 (SEQ ID NO: 1),
    donde X1 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P y Q,
    donde X2 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P y G,
    donde X3 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos K, R, k y r,
    donde X4 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos P y K,
    donde X5 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, a, s, q, k o está ausente, donde X6 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, D y A,
    donde X7 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos N, n, r y K; y
    donde X8 es un aminoácido seleccionado de F, f y w, y
    donde un residuo de aminoácido dado en letras mayúsculas indica un L-aminoácido, mientras que un residuo de aminoácido dado en letras minúsculas indica un residuo de D aminoácido,
    con la condición de que al menos uno de los aminoácidos seleccionado del grupo consistente en X3, X5, X7 y X8 sean D aminoácidos
    para su uso en método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
    2. Inhibidor de JNK para su uso según la reivindicación 1, donde al menos tres de los aminoácidos seleccionados del grupo consistente en X3, X5, X7 y X8 son D-aminoácidos.
    3. Inhibidor de JNK para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde el inhibidor de JNK comprende una secuencia de (poli)péptidos inhibidora que comparte al menos un 80% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera de las SEQ ID NO: 3-20, 22-24 y 27.
    4. Inhibidor de JNK para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el inhibidor de JNK comprende la SEQ ID NO: 8 o una secuencia de (poli)péptidos inhibidora que comparte al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8.
    5. Inhibidor de JNK para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el inhibidor de JNK comprende una secuencia transportadora, en particular donde la secuencia transportadora comprende una secuencia de aminoácidos D y L alternantes según cualquiera de las SEQ ID NO: 28­ 30.
    6. Inhibidor de JNK para su uso según la reivindicación 5, donde dicha secuencia transportadora se selecciona de cualquiera de las SEQ ID NO: 31-170, en particular donde dicha secuencia transportadora se selecciona de cualquiera de las SEQ ID NO: 31-34, 46, 47 y 52-151.
    7. Inhibidor de JNK para su uso según las reivindicaciones 5 o 6 , donde dicha secuencia transportadora está dispuesta directamente en el extremo N o directamente en el extremo C de la secuencia de (poli)péptidos inhibidora.
    8. Inhibidor de JNK para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde el inhibidor de JNK comprende:
    a) una secuencia según cualquiera de las SEQ ID NO: 171-183, 185-187 o 190, en particular según la SEQ ID NO: 172 o
    b) una secuencia que comparte al menos un 50% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NO: 171-183, 185-187 o 190, en particular con la SEQ ID NO: 172, con la condición de que dicha secuencia que comparte identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 171-183, 185-187 o 190:
    i) mantenga el residuo de L-arginina (R) en la posición 4 en su tramo de secuencia que corresponde a la SEQ ID NO:1,
    ii) mantenga los dos residuos de L-leucina (L) en su tramo de secuencia que corresponde a la SEQ ID NO: 1, y
    iii) tenga al menos un D-aminoácido en las posiciones X3, X5, X7 o X8 en su tramo de secuencia que corresponde a la SEQ ID NO: 1.
    9. Inhibidor de JNK para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , donde dicho inhibidor de JNK se administra vía intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, transdérmica, enteral, oral, rectal, tópica, nasal, local, intranasal, epidérmica, mediante administración de parches, por instilación, intravítreo, subconjuntival y/o intratimpánico.
    10. Inhibidor de JNK para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho método es para el tratamiento de enfermedades inflamatorias.
    11. Inhibidor de JNK para su uso según la reivindicación 10, donde dicho método es para el tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de: artritis, osteoartritis, artritis reumatoide; uveítis anterior; corioiditis; conjuntivitis; ciclitis síndrome del ojo seco; endoftalmitis; epiescleritis; enfermedades inflamatorias del páppado; enfermedades inflamatorias de la coroides; enfermedades inflamatorias del cuerpo ciliar; enfermedades inflamatorias de la conjuntiva; enfermedades inflamatorias de la córnea; enfermedades inflamatorias del iris; enfermedades inflamatorias de la glándula lagrimal; enfermedades inflamatorias del hueso orbital; enfermedades inflamatorias de la esclera; enfermedades inflamatorias del cuerpo vítreo; enfermedades inflamatorias de la úvea; enfermedades inflamatorias de la retina; uveítis intermedia; irititis; queratitis; coroiditis multifocal; miositis del músculo ocular; enfermedades oculares inflamatorias no crónicas o crónicas; panoftalmitis; panuveitis; uveítis posterior; retinitis; retinitis pigmentosa; retinitis punctata albescens; escleritis; tratamiento de heridas oculares inflamadas y/o bordes de heridas oculares; tratamiento de inflamación intraocular después de cirugía ocular o trauma; y uveítis
    12. Inhibidor de JNK para su uso según la reivindicación 10, donde dicho método es para el tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de inflamación aguda, inflamación crónica, inflamación ocular, inflamación bucal, inflamación del sistema respiratorio, inflamación del pulmón, inflamación de la piel, inflamación del sistema cardiovascular, inflamación del cerebro, inflamación del oído, mucositis, estomatitis, periimplantitis, retinitis, corioiditis, queratoconjuntivitis seca, enfermedades inflamatorias del intestino (EII), uveítis, uveítis anterior, uveítis intermedia, uveítis posterior, periodontitis, EPOC, asma, pulpitis, artritis reumatoide, osteoartritis, enfermedad de Crohn, artritis psoriásica, vasculitis, cistitis intersticial, inflamación aguda en un sitio de infección o herida, meningitis, encefalitis, neumonía, faringitis, amigdalitis, otitis, otitis media, vasculitis, sinovitis, enteritis, colitis ulcerosa y rechazo de injerto.
    13. Inhibidor de JNK para siu uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho método es para el tratamiento del síndrome del ojo seco.
    14. Inhibidor de JNK para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el inhibidor de JNK consiste en la secuencia SEQ ID NO: 172.
    15. Composición farmacéutica que comprende un inhibidor de JNK como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o 14 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
ES12809126T 2011-12-21 2012-12-21 Nuevas moléculas inhibidoras de JNK para el tratamiento de varias enfermedades Active ES2784551T3 (es)

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