KR20140108308A - 다양한 질병의 치료를 위한 신규의 jnk 억제자 분자 - Google Patents

다양한 질병의 치료를 위한 신규의 jnk 억제자 분자 Download PDF

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KR20140108308A
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diseases
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쟝-마크 콩베트
카트린 델로체
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자이겐 인플라메이션 리미티드
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Abstract

본 발명은 신규의 JNK 억제자 분자의 이용 및 테라피에 의한 인체 또는 동물 몸체의 치료 방법에 그들의 이용에 관한 것이다.

Description

다양한 질병의 치료를 위한 신규의 JNK 억제자 분자{Novel JNK inhibitor molecules for treatment of various diseases}
본 발명은 효소 억제의 분야, 특히 c-Jun 아미노 말단 키나아제(JNK)의 (폴리-)펩티드 억제자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다양한 질병의 치료에 이들 JNK 억제자의 이용에 관한 것이다.
c-Jun 아미노 말단 키나아제(JNK)는 미토겐 활성 단백질(MAP) 키나아제의 스트레스 활성 그룹의 멤버이다. 이들 키나아제는 세포 생장 및 분화의 조절, 및 보다 일반적으로 환경 자극에 대한 세포의 반응에 관여한다. JNK 신호 전달 경로는 환경 스트레스에 반응 및 세포 표면 수용체의 몇몇 종류의 결합(engagement)에 의해 활성화된다. 이들 수용체는 사이토카인 수용체, 세르펜틴(serpentine) 수용체 및 수용체 티로신 키나아제를 포함한다. 포유류 세포에서, JNK는 종양 형성의 전환(oncogenic transformation) 및 환경 스트레스에 대한 적응 반응을 중재하는 생물학적 과정에 관여한다. JNK는 또한 면역 세포의 성숙 및 분화뿐만 아니라, 면역 체계에 의한 파괴를 위해 선별된 세포에서 예정된 세포 사멸을 달성하는 것을 포함하는 면역 반응의 조절과 관련된다. 이러한 고유의 특성은 JNK 신호전달을 약학적 개입의 발달을 위한 유망한 타겟으로 만든다. 몇몇 신경 장애(neurological disorders) 가운데, JNK 신호전달은 특히 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke) 및 파킨슨병(Parkinson's disease)뿐만 아니라, 하기 언급된 다른 질병에도 관여한다. 게다가, 미토겐 활성 단백질 키나아제(MAPK) p38α(p38alpha)는 JNK-c-Jun-경로를 길항(antagonizing)하여 세포 생장을 부정적으로 조절하는 것으로 보였다. 따라서 미토겐 활성 단백질 키나아제(MAPK) p38α는 정상 및 암 세포 생장의 억제에 활성화되는 것으로 나타났고, 나아가 암 질환에 JNK의 참여를 설명한다(예를 들어 Hui et al., Nature Genetics, Vol 39, No. 6, June 2007 참조). 또한 c-Jun N-말단 키나아제(JNK)는 척추 신경 결찰(spinal nerve ligation, SNL)에 의해 생성된 신경성 동통에 참여하며, 상기 SNL은 JNK, 특히 JNK1의 느리고 지속적인 활성화를 유도하는 반면, p38 미토겐 활성 단백질 키나아제 활성화는 SNL 후 척추 소교 세포(spinal microglia)에서 발견되었으며, 21일에 기저 수준 근처로 감소함을 보였다(Zhuang et al., The Journal of Neuroscience, March 29, 2006, 26(13):3551-3560)). 2007년(Biochemica et Biophysica Acta, pp. 1341-1348), Johnson et al.은 c-Jun 키나아제/스트레스 활성 경로 리뷰에서, 해마 신경 세포(hippocampal neurons)의 흥분성독성(excitotoxicity)에 참여, 간 허혈(liver ischemia), 재관류(reperfusion), 신경변성질환(neurodegenerative diseases), 청력감소(hearing loss), 난청(deafness), 신경관 선천성 결손(neural tube birth defects), 암, 만성 염증성 질환, 비만, 당뇨, 특히 인슐린 저항성 당뇨와 같은 질병에 JNK 신호전달의 참여를 논의했으며, 선택적 JNK 억제자는 높은 정도의 특이성 및 독성의 부족으로 다양한 질병의 치료에 필요한 것으로 보인다는 것을 제시한다.
따라서 JNK 신호전달 경로의 억제 또는 방해는 JNK 신호전달에 강력하게 관련된 장애를 해결(combating)하는데 유망한 접근 방법(approach)이다. 그러나, 지금까지 알려진 JNK 신호전달 경로의 오직 몇몇 억제자가 있다.
선행기술에서 이미 알려진 JNK 신호전달 경로의 억제자는 예를 들어 업스트림 키나아제 억제자(예를 들어, CEP-1347), 예를 들어 단백질 키나아제의 ATP-결합 자리에 경쟁함으로써 키나아제 활성에 직접적으로 영향을 주는, JNK의 작은 화학적 억제자(SP600125 및 AS601245), 및 JNK 및 이의 기질들 사이의 상호작용의 펩타이드 억제자를 포함한다(예를 들어 Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, February 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67; WO 2007/031280 참조; 모든 참조에 의해 원용됨). WO 2007/031280는 HIV-TAT 단백질의 기초(basic) 수송(trafficking) 서열 및 IB1의 아미노산 억제자 서열로부터 유래된 소위 TAT 수송체(transporter) 서열을 포함하는 세포 투과성 융합 펩타이드를 개시한다.
WO 2007/031280는 특히 두 특정 서열, L-TAT-IB1 (GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD, 본 발명에서 SEQ ID NO: 196) 및 D-TAT-IB1 (dqsrpvqpflnlttprkprpprrrqrrkkrg; 본 발명에서 SEQ ID NO: 197), 후자는 L-TAT-IB1의 레트로-인버소 서열인 것을 개시한다. HIV TAT 유래된 수송체 서열에 의해, 이들 융합 펩타이드는 보다 효과적으로 목표 세포에 이송되며, 이들은 단백질 가수분해가 있을 때까지 효과적으로 남는다.
JNK의 ATP 비의존적 펩타이드 억제자는 보통 보다 특정한 억제자들이므로, 만약 JNK 억제에 올 경우 그들은 흔히 첫번째 선택이다. 그러나, 심지어 WO 2007/031280에 개시된 펩타이드 억제자도 모든 목적에 최적은 아니다. 예를 들어, L 아미노산 만으로 이루어진 화합물 L-TAT-IB1(본 발명에서 SEQ ID NO: 196)는 단백질 가수분해로 빠르게 분해된다. 이러한 문제를 극복하기 위해 WO 2007/031280의 발명자들은 또한 D 아미노산을 포함하는 D-TAT-IB1 (본 발명에서 SEQ ID NO: 197)를 제안하였다. 보다 정확하게는, D-TAT-IB1는 L-TAT-IB1의 레트로-인버소 서열을 보인다. D-아미노산의 합성은 입체 화학이 기능의 상실을 유도할 수 있도록 변화한다는 사실에 의해 어렵게 제조된다. 레트로-인버소 접근 방법은, 오직 D-아미노산의 용도 ii) 그러나 역 펩타이드 서열은 본래 서열에 하나 또는 그 이상의 D-아미노산을 합성하기 보다는 본래 펩타이드에 허용가능한 형태적 유사체(conformational analogue)를 생산할 수 있기 때문에, 상기 위험을 감소시키기 위해 수행될 수 있다. WO 2007/031280의 경우에 그럼에도 불구하고 이러한 접근 방법은 L-TAT-IB1(도 4 참조)와의 비교에서 억제 용량의 현저한 감소를 초래하였다. 추가적으로, 레트로-인버소 펩타이드는 통제된 소화, 예를 들어 시간 민감성 실험에서 도저히 있을 수 없는 결과로 단백질 가수분해 소화에 대해 극히 안정하다.
JNK 억제자는 다양한 질병 상태의 치료와 같은 기술에서 논의, 제안되고 성공적으로 실험되었다. 이미 1997년, Dickens et al.은 c-Jun 아미노 말단 키나아제 억제자 JIP-1을 설명하였고 예를 들어 만성 골수 백혈병(chronic myeloid leukaemia)의, 특히, 전B세포(pre-B-cells)의 전환을 유발하는 Bcr-Abl의 맥락에서, 치료(treatment)를 위한 치료 전략(therapeutic strategies)을 위한 후보 화합물로 JIP-1을 제안하였다(Science; 1997; 277(5326):693-696).
2001년에, 보니(Bonny) 및 그의 동료들은 JNK의 세포 투과성 펩타이드 억제자는 IL-1β-유도 세포자멸로부터 췌장 β-세포에 장기간 보호를 보여주고, 따라서 당뇨의 과정에 자가면역 파괴에서 β-세포를 보존할 수 있음을 공개하였다(Diabetes, 50, 2001, p. 77 - 82).
Bonny et al.(Neurosciences, 2005, p. 57 - 67내 리뷰)는 또한 JNK 억제자 D-JNKI-1의 억제 활성 및 흥분성독성(excitotoxicity), 신경세포사멸(neuronal cell death), 저산소증(hypoxia), 국소 빈혈(ischemia), 외상성 뇌 손상(traumatic brain damage), 간질(epilepsy), 신경변성질환(neurodegenerative diseases), 뉴런의 세포자멸 및 내이 감각 청세포(inner ear sensory auditory cells) 등의 맥락에서 다른 JNK 억제자를 논의하였다.
WO 98/49188에서 JIP-1 유래된 JNK 억제자 신호전달은 파킨슨병 또는 알츠하이머병과 같은 신경변성질환; 기억 상실과 관련된 뇌졸중, 관절염과 같은 자가면역 질환; 염증이 특징인 다른 조건; 백혈병, 예를 들어 만성 골수성 백혈병(CML)과 같은 악성종양; 간 및 신장과 같은 조직에 산화 손상; 심장 질환; 및 이식 거부의 치료를 위해 제안되었다.
Borsello et al. (Nat Med, 2003, (9), p. 1180 - 1186)는 흥분성독성 및 뇌 허혈증을 방어하는 c-Jun-N-말단 키나아제의 펩타이드 억제자를 공개하였다.
Assi et al.는 종양 괴사 인자-α생산 및 급성 뮤린 대장염에 상피 세포 자멸을 목표로하는 다른 특정 JNK 억제자, SP600125를 공개하였다. 저자는 JNK의 억제는 인체 염증성 장 질환 치료에 가치가 있음을 결론내렸다(Immunology; 2006, 118(1):112-121).
Kennedy et al. (Cell Cycle, 2003, 2(3), p. 199 - 201)에서, 종양 발달에 JNK 신호전달의 역할은 보다 상세하게 논의되었다.
Lee Yong Hee et al. (J Biol Chem 2003, 278(5), P. 2896 - 2902)은 c-Jun N-말단 키나아제(JNK)가 인슐린 신호전달 연쇄반응의 피드백 억제를 조절함을 보였고 JNK 신호전달의 억제는 당뇨병 환자의 인슐린 저항성을 감소시키는 치료적 접근 방법에 양호함을 제안하였다.
Milano et al. (Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007; 192(4): H1828 - H1835)는 c-Jun NH2-말단 키나아제의 펩타이드 억제자가 심근 허혈(myocardial ischemia)-허혈재관류 손상(reperfusion injury) 및 체내 경색 범위를 감소시키는 것을 발견하였다. 상기 연구의 저자들은 펩타이드 억제자, D-JNKI-I, 세포내 전위를 조절하는 인체 면역 결핍 바이러스 TAT 단백질의 10 아미노산 TAT 서열과 연결된, islet-brain-1/JNK-상호작용 단백질-1(JNK-interacting protein-1)의 최소 JNK-결합 도메인의 20 아미노산 서열을 포함하는 두 도메인 펩타이드를 사용하였다. 저자들은 JNK 활성의 감소 및 인산화는 상기 억제자의 존재때문에 국소 빈혈 및 세포 자멸의 단계에 랫(rat)의 심기능의 보존에 중요하다고 결론내렸다.
또 다른 그룹은 JNKs의 작은 펩타이드 억제자가 JNK-신호전달 경로를 억제함으로써 MPTP-유도 흑질 도파민 상처를 보호함을 공개하였다(Pan et al., Laboratory investigation, 2010, 90, 156 - 167). 저자들은 TAT 펩타이드에 융합된 뮤린 JIP-1의 153 -163 잔기를 포함하는 펩타이드가 JNK 신호전달 경로를 억제함으로써 MPTP 상처에 대한 신경 보호를 제의하며 파킨슨병에 대한 치료적 접근 방법을 제공한다.
청력 손실에 대하여, Pirvola et al. (The Journal of Neuroscience, 2000, 20(1); 43 - 50)는 CEP-1347/KT7515, c-Jun-N-말단 키나아제 억제자의 활성화에 의한 청력, 청각유모세포 및 뉴런의 구제를 설명하였다. 저자들은 일반적으로 JNK 신호전달 연쇄반응에서 치료적 개입은 내이(inner ear) 상처의 치료를 위한 기회를 제의할 수 있음을 제안하였다. JNK 억제자 펩타이드 투여의 수단에 의한 청력 감소의 치료는 또한 WO　03/103698에서 예시로 개시되었다.
망막 질환 및 연령과 관련된 황반 변성(macula degeneration), 특히 Roduit et al. (Apoptosis, 2008, 13(3), p. 343 - 353)는 치료적 접근 방법으로 JNK 억제의 사용을 비슷하게 제안하였다. JNK 억제에 의존하는 유사한 고려사항들은 연령과 관련된 시력 감토(age-related macular degeneration), 당뇨병성 황반 부종(diabetic macular edema), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 중앙 삼출성 맥락망막질환(central exudative chorioretinopathy), 망막색조선조(angioid streaks), 망막 색소 상피 분리(retinal pigment epithelium detachment), 다소성 맥락막염(multifocal choroiditis), 신생혈관 황반증(neovascular maculopathy), 미숙아 망막증(retinopathy of prematurity), 색소성 망막염(retinitis pigmentosa), 레버병(Leber's disease), 망막 동맥 폐색(retinal artery occlusion), 망막 정맥 폐색(retinal vein occlusion), 중심성 장액성 맥락망막병증(central serous chorioretinopathy), 망막 거대혈관류(retinal macroaneurysm), 망막 박리(retinal detachment), 증식성 망막병증(proliferative vitreoretinopathy), 스타르가르트병(Stargardt's disease), 맥락막 경화증(choroidal sclerosis), 맥락막 결여(chorioderemia), 바이텔리폼 황반 영양실조(vitelliform macular dystrophy), 오구치병(Oguchi's disease), 백색점상안저(fundus albipunctatus), 백점상 망막염(retinitis punctata albescens), 및 맥락막 및 망막의 우곡상위축(gyrate atrophy)의 치료를 위하여 WO 2010/113753에서 예를 들어 개시되었다.
Zoukhri et al. (Journal of Neurochemistry, 2006, 96, 126 - 135)는 c-Jun NH2-말단 키나아제가 누선 분비(lacrimal gland secretion)의 인터루킨-1 β-유도 억제를 중재하는 것을 밝혔다. 그들은 JNK가 누선 분비의 IL-1 β-중재 억제 및 지속적인 안구 건조에 중추 역할을 한다고 결론내렸다.
포도막염(uveitis)을 위하여, Touchard et al. (Invest Ophthalmol Vis Sci, 2010, 51(9); 4683 - 4693)는 효과적인 치료로 D-JNK1의 사용을 제안하였다.
IBD (염증성 장 질환(inflammatory bowel disease))을 위하여, Roy et al. (World J Gastroenterol 2008, 14(2), 200 - 202)는 그 안에 JNK 신호 전달 경로의 역할을 강조하였고 상기 질병 상태의 치료를 위해 펩티드 JNK 억제자의 사용을 제안하였다.
Beckham et al (J Virol. 2007 Jul;81(13):6984-6992)은 JNK 억제자 D-JNKI-1이 바이러스성 뇌염으로부터 랫을 보호하는데 효과적임을 보였고, 따라서 JNK 억제자는 바이러스성 뇌염의 유망하고 신규한 치료 전략으로 제안하였다.
Palin et al. (Psychopharmacology (Berl). 2008 May;197(4):629-635)은 동일한 JNK 억제자, D-JNKI-1을 사용하였고, D-JNKI-1(10 ng/mouse)으로 전처리, 단 D-TAT가 아닌, 중심 TNFα(TNFalpha)에 의해 유도된 질병의 모든 세가지 지표를 현저하게 억제함을 발견하였고 사이토카인 유도 질병 양상(behaviour)의 배경을 발달하는 주요 우울 장애를 치료하기 위한 수단으로 JNK 억제를 제안하였다.
WO 2010/151638에서 JNK 억제의 방법에 의한 신경퇴행성 질병 척수성 근위축의 치료가 제안되었다.
상기 구절(passage)은 일부 선택된 공개물(publications) 다양한 질병의 치료에 JNK 억제자의 유용성에 기초하여 이미 강조한다. 따라서, 인체(및 동물) 질환의 치료에 사용되는 JNK 억제자에 대한 기술이 지속적으로 필요하다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 JNK의 추가적인 (펩타이드) 억제자들을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 하기에 설명되는 대상 및 첨부된 청구 범위에 의해 발명자에 의해 해결된다.
JNK 억제자
본 발명의 일 측면은, 테라피(therapy)에 의한 인체 또는 동물 몸체의 치료(treatment) 방법에 이용을 위한, 하기 일반식에 따른 억제 (폴리-)펩타이드 서열을 포함하는 JNK 억제자에 관련된다:
X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8 (SEQ ID NO: 1),
상기 X1은 아미노산 R, P, Q 및 r로부터 선택된 아미노산,
상기 X2는 아미노산 R, P, G 및 r로부터 선택된 아미노산,
상기 X3는 아미노산 K, R, k 및 r로부터 선택된 아미노산,
상기 X4는 아미노산 P 및 K로부터 선택된 아미노산,
상기 X5는 아미노산 T, a, s, q, k로부터 선택된 아미노산이거나 부재(absent),
상기 X6는 아미노산 T, D 및 A로부터 선택된 아미노산,
상기 X7는 아미노산 N, n, r 및 K로부터 선택된 아미노산; 및
상기 X8은 F, f 및 w로부터 선택된 아미노산, 및
단, X1, X2, X3, X5, X7 및 X8로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산의 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋, 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 여섯은 D-아미노산(들), 바람직하게는 단 X3, X5, X7 및 X8로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산의 적어도 하나, 적어도 둘, 적어도 셋 또는 넷은 D-아미노산(들)임.
본 발명에 따른 JNK 억제자의 억제 (폴리-)펩타이드 서열은 L-아미노산 및 대부분 실시예에서 D-아미노산을 포함한다. 달리 지정하지 않으면, L-아미노산 잔기는 본 발명에서 대문자로 표시되는 반면, D 아미노산 잔기는 소문자로 표시된다. 글리신은 대문자 또는 소문자로 표시될 수 있다(D- 또는 L-글리신이 없기 때문). 본 발명에 개시된 아미노산 서열은 달리 지정하지 않으면, 항상 N- 에서 C-말단 (왼쪽에서 오른쪽)으로 주어진다. 주어진 아미노산 서열은 C- 및/또는 N-말단에서 변형, 예를 들어 C-말단에서 아세틸화 및/또는 N-말단에서 시스테아미드(cysteamide)로 아미드화 또는 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 명확성을 위해 본 발명에서 개시된 아미노산 서열의 C- 및/또는 N-말단에서 이렇게 가능하지만 전체적으로 선택적인 변형은 명확성을 위해 구체적으로 표시되지 않았다.
본 발명의 JNK 억제자는 c-Jun N-말단 키나아제(JNK)의 (폴리-)펩타이드 억제자이다. 상기 억제자들은 c-Jun N-말단 키나아제 (JNK)의 인산화 활성을 억제한다, 즉 c-Jun, ATF2 및/또는 Elk-1과 같은 JNK 기질의 인산화의 정도를 방해 또는 감소한다. 통상의 기술자는 본 발명에서 사용된, c-Jun N-말단 키나아제 (JNK) 분자 및/또는 키나아제 활성을 비가역적으로 파괴하는 화합물을 포함하지 않는 "억제자" 용어를 이해할 것이다. 게다가 본 발명에서 사용된 용어 "JNK 활성의 억제"는 c-Jun N-말단 키나아제 (JNK)의 키나아제 활성의 억제를 말한다.
게다가, 본 발명에서 사용된 JNK 억제자는 아미노산의 폴리머, 즉 (폴리-)펩타이드 서열의 적어도 하나의 기능적 단위를 포함한다. 나아가, 이러한 아미노산의 적어도 하나의 기능적 폴리머는 JNK 활성의 억제를 제공한다. 상기 억제 (폴리-)펩타이드 서열의 아미노산 모노머는 보통 펩타이드 결합을 통해 서로 연결되나, 상기 펩타이드 결합(들) 또는 곁사슬 잔기의 (화학적) 변형은 용인(tolerable)될 수 있으며, 억제 활성(JNK 활성의 억제)은 완전히 상실되지 않는다, 즉 생산된 화학적 독립체(entity)는 여전히 기능적으로 본 발명에서 정의된 JNK 억제자의 자격을 갖는다. 용어 "(폴리-)펩타이드"는 (폴리-)펩타이드 단위의 길이를 제한하는 것으로 해석되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 JNK 억제자의 억제 (폴리-)펩타이드 서열은 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 또는 12 미만 아미노산 길이 미만이다. 바람직하게는, 억제 (폴리-)펩타이드 서열은 10 아미노산 잔기 미만, 더욱 바람직하게는 11 아미노산 잔기 미만을 갖지 않는다.
게다가 본 발명의 "JNK 억제자"는, 예를 들어 하기의 c-Jun 기질 (SEQ ID NO: 198) IC 50 값의 인간 JNK 중재된 인산화의 억제에 관하여 나타내는, JNK 활성을 억제한다:
a) 인간 JNK1의 억제에 관하여 3000 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2000 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 1000 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 500 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 250 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 200 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 150 nM 미만, 가장 바람직하게는 100 nM 미만,
b) 인간 JNK2의 억제에 관하여 3000 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2000 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 1000 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 500 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 250 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 200 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 150 nM 미만, 가장 바람직하게는 100 nM 미만, 및/또는
c) 인간 JNK3의 억제에 관하여 3000 nM 미만, 더욱 바람직하게는 2000 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 1000 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 500 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 250 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 200 nM 미만, 더욱 더 바람직하게는 150 nM 미만, 가장 바람직하게는 100 nM 미만.
일부 출원에서는 억제자가 상기 정의에 따른 인간 JNK2 및/또는 인간 JNK3를 억제하는 것이 바람직하지만, 상기 정의에 따른 JNK1은 아니다.
JNK 활성이 억제되는지 아닌지는 통상의 기술자에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 기술분야에서 몇몇 방법들이 알려져있다. 일 실시예는 방사성 키나아제 분석 또는 비방사성 키나아제 분석 (예를 들어 알파스크린 테스트; 예를 들어 Guenat et al. J Biomol Screen, 2006; 11: pages 1015-1026 참조).
따라서 본 발명에 따르는 JNK 억제자는 예를 들어 SEQ ID NOs: 2 내지 27 (표 1 참조)의 어느 것에 따르는 억제 (폴리-)펩타이드 서열을 포함할 수 있다.
표 1: 본 발명에 따른 JNK 억제자의 억제 (폴리-)펩타이드 서열의 예시
아미노산 서열 SEQ ID NO:
rPKRPTTLNLF 2
RPkRPTTLNLF 3
RPKRPaTLNLF 4
RPKRPTTLnLF 5
RPKRPTTLrLF 6
RPKRPTTLNLf 7
RPkRPaTLNLf 8
RPkRPTTLNLf 9
RPkRPTTLrLf 10
RRrRPTTLNLf 11
QRrRPTTLNLf 12
RPkRPTTLNLw 13
RPkRPTDLNLf 14
RRrRPTTLrLw 15
QRrRPTTLrLw 16
RRrRPTDLrLw 17
QRrRPTDLrLw 18
RRrRPaTLNLf 19
QRrRPaTLNLf 20
RrKRPaTLNLf 21
RPkRPsTLNLf 22
RPkRPqTLNLf 23
RPkRPkTLNLf 24
rGKRKALKLf 25
rGKRKALrLf 26
RRrRKALrLf 27
본 발명에 따른 JNK 억제자는 또한 SEQ ID NOs: 1-27로부터 선택된 서열, 특히 SEQ ID NO: 8과 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 55%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 65%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 가장 바람직하게는 적어도 90% 서열 상동성(identity)을 공유하는 억제 (폴리-)펩타이드 서열을 포함하는 JNK 억제자 (변이체(variant))일 수 있다,
단 서열 상동성을 공유하는 억제 (폴리-)펩타이드 서열과 같은, SEQ ID NOs: 1-27로부터 선택된 각각의 서열에 관하여,
a) 위치 4에서 L-아르기닌 (R) 잔기를 유지,
b) 위치 8 및 10(SEQ ID NOs: 25-27에 관해서는 위치 7 및 9)에 두개의 L-류신 (L) 잔기를 유지,
c) SEQ ID NO: 1의 X1, X2, X3, X5, X7 및 X8로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산에 대응하는 각각의 위치 및 SEQ ID NOs: 2-27에 각각 위치에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 D-아미노산(들)을 보이며, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 1의 X3, X5, X7 및 X8로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산에 대응하는 각각의 위치 및 SEQ ID NOs: 2-27에 각각 위치에 1, 2, 3 또는 4 D-아미노산(들)을 보임, 및
d) 여전히 JNK 활성을 보임(즉 본 발명에 정의된 JNK 억제자임).
확실히, 본 발명에서 개시된 변이체는(특히 SEQ ID NOs: 1-27로부터 선택된 서열과 특정 정도의 서열 상동성을 공유하는 - 상기 정의 내 - 억제 (폴리-)펩타이드 서열을 포함하는 JNK 억제자 변이체), 바람직하게는 각각 참조 서열(reference sequence)에 100% 미만의 서열 상동성을 공유한다.
상기 정의의 관점 및 명확성을 위해 SEQ ID NOs: 1-27을 포함하는 JNK 억제자의 변이체에서 변하지 않을 수 있는 잔기들은 (상기 정의 내 a) 및 b) 참조) 표 1에 밑줄을 쳤다.
비 동일한 아미노산은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환의 결과이다.
본 발명에서 사용된, 보존적 아미노산 치환은 분자의 생물학적 활성을 보존할 수 있는 그룹의 멤버들 사이의 치환에 의해, 충분히 유사한 물리화학적 특성을 갖는 그룹 내에 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어 Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864 참조). 특히, 보존적 아미노산 치환은 바람직하게는 동일한 부류(class)의 아미노산으로부터 유래된 아미노산의 치환이다(예를 들어 염기성 아미노산, 산성 아미노산, 극성 아미노산, 지방족 곁사슬을 갖는 아미노산, 양전하 또는 음전하를 띤 곁사슬을 갖는 아미노산, 곁사슬에 방향족 그룹을 갖는 아미노산, 수소 브릿지로 들어갈 수 있는 아미노산 곁사슬, 예를 들어 수산기 기능을 갖는 곁사슬, 등). 보존적 치환은 예를 들어 염기성 아미노산 잔기(Lys, Arg, His)를 다른 염기성 아미노산 잔기(Lys, Arg, His)로 치환, 지방족 아미노산 잔기(Gly, Ala, Val, Leu, Ile)를 다른 지방족 아미노산 잔기로 치환, 방향족 아미노산 잔기(Phe, Tyr, Trp)를 다른 방향족 아미노산 잔기로 치환, 트레오닌을 세린으로 또는 류신을 이소류신으로 치환하는 본 경우이다. 추가적인 보존적 아미노산 교체는 통상의 기술자에게 알려져 있다. 이성질체 형태는 바람직하게는 유지되어야 하며, 예를 들어 K는 바람직하게는 R 또는 H로 치환되는 반면, k는 바람직하게는 r 및 h로 치환된다.
JNK 억제자 변이체에 상기 정의 내 추가적으로 가능한 치환은 예를 들어 만약:
a) SEQ ID NO: 1의 X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7 및/또는 X8의 1, 2 또는 그 이상 또는 SEQ ID NOs: 2-27로부터 선택된 각각의 서열 내 대응하는 위치는 A 또는 a로 치환,
b) SEQ ID NO: 1의 X1 또는 X8 또는 SEQ ID NOs: 2-27로부터 선택된 각각의 서열 내 대응되는 위치는 삭제;
c) SEQ ID NO: 1의 X5 또는 SEQ ID NOs: 2-27로부터 선택된 각각의 서열 내 대응하는 위치는 E, Y, L, V, F 또는 K;
d) SEQ ID NO: 1의 X5 또는 SEQ ID NOs: 2-27로부터 선택된 각각의 서열 내 대응하는 위치는 E, L, V, F 또는 K; 또는
e) SEQ ID NO: 1의 X1, X2, X3의 1, 2 또는 3 또는 SEQ ID NOs: 2-27로부터 선택된 각각의 서열 내 대응하는 위치는 중성 아미노산.
본 발명에 사용된 것처럼, 용어 "% 서열 상동성"은 하기와 같이 이해된다: 비교되는 두 서열은 서열간 최대 연관성(maximum correlation)을 위해 정렬된다. 이는 정렬의 정도를 향상시키기 위해 하나 또는 양쪽 서열에 "갭"의 삽입을 포함할 수 있다. % 상동성은 이후, 특히 동일 또는 유사 길이에 적합한, 비교되는 각 서열의 전체 길이에 따라(소위 글로벌 정렬(global alignment)), 또는 동일하지 않은 길이의 서열에 보다 적합한, 짧고, 정의된 길이에 따라(소위 로컬 정렬(local alignment)) 결정된다. 상기 단락에서, 예를 들어 쿼리 아미노산 서열에 적어도 95%의 "서열 상동성"을 갖는 아미노산 서열은, 대상 아미노산 서열은 쿼리 아미노산 서열의 각 100 아미노산 당 5개까지 아미노산 변경(alterations)을 포함할 수 있는 것을 제외하고, 대상 아미노산 서열의 서열이 쿼리 서열에 동일한 것을 의미하려는 의도이다. 다시 말해, 쿼리 아미노산 서열에 적어도 95% 상동성의 서열을 갖는 아미노산 서열을 얻기 위해, 대상 서열 내 아미노산 잔기의 5% (100 중 5)까지 다른 아미노산으로 삽입 또는 치환 또는 결실될 수 있다. 서열 상동성 결정의 목표를 위해, L-아미노산을 D-아미노산으로 치환(및 그 역으로)은 매우 동일한 아미노산의 단지 D- (또는 L-이성질체)일지라도, 동일하지 않은 잔기를 생성하는 것으로 여겨진다.
2 또는 그 이상 서열의 상동성 및 유사성(homology)을 비교하는 방법은 기술분야에서 잘 알려져 있다. 두 서열이 동일한 백분율은 예를 들어 수학적 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게, 이에 제한되지 않고, 사용될 수 있는 수학적 알고리즘의 예시는 Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 프로그램, 예를 들어 BLAST 또는 NBLAST 프로그램(또한 Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 or Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402 참조), 월드 와이드 웹 사이트 ncbi.nlm.nih.gov의 홈페이지를 통해 접속가능한) 및 FASTA(Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.)의 BLAST 패밀리에 통합된다. 특정한 규모의 다른 서열과 상동성 있는 서열은 이들 프로그램을 통해 확인될 수 있다. 나아가 위스콘신 서열 분석 패키지(Wisconsin Sequence Analysis Package), 버전 9.1 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395)에서 사용가능한 프로그램, 예를 들어 BESTFIT 및 GAP 프로그램은 두 폴리펩타이드 서열 사이 % 상동성을 결정하는데 사용될 수 있다. BESTFIT은 (Smith and Waterman (1981), J. Mol. Biol. 147, 195-197.)의 "로컬 유사성(local homology)" 알고리즘을 사용하고 두 서열 사이에 유사성(similarity)의 최적의 단일 부위(region)를 찾는다.
확실히, 본 발명에 따른 JNK 억제자는 본 발명에 정의된 JNK 활성을 억제하기 위한 능력이 상실되지 않을만큼, - 상기 언급된 억제 (폴리-)펩타이드 서열의 일면(aside) - 추가적 서열, 도메인, 라벨(labels) (예를 들어 형광성 또는 방사성 라벨), 항원결정기(epitopes) 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 JNK 억제자는 또한 수송체(transporter) 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용된 "수송체 서열"은 생체 막을 가로질러 부착된 분자의 전좌(translocation)를 제공하는 (폴리-)펩타이드 서열이다. 그에 따라, 수송체 서열을 포함하는 본 발명에 따른 JNK 억제자는 바람직하게는 생체막을 가로질러 전좌할 수 있다. 따라서, 본 발명의 이러한 JNK 억제자는 보다 쉽게 세포, 세포의 서브컴파트먼트(subcompartment) 및/또는 세포의 핵 내로 들어갈 수 있다.
상기 수송체 서열은 JNK 억제자의 억제 (폴리-)펩타이드 서열에 예를 들어(예를 들어 직접) N-말단적으로 또는 (예를 들어 직접) C-말단적으로 결합될 수 있다. 수송체 서열 및 억제 (폴리-)펩타이드 서열은 또한 이격될 수 있으며, 예를 들어 중재 서열(intermediate sequences)에 의해 분리될 수 있다. 또한 수송체 서열은 특히 JNK 억제자가 보다 복잡한 분자일 경우(예를 들어 몇몇 도메인을 포함하는, 다중결합(multimeric) 컨쥬게이트 등이다), 억제 (폴리-)펩타이드 서열보다 JNK 억제자 분자에 전체적으로 다른 곳에 위치할 수 있다. 또한 수송체 서열 및 억제 (폴리-)펩타이드 서열은 JNK 활성이 유지되는 한 겹칠수(overlap) 있는 것으로 여겨진다. 이러한 겹침의 예시는 하기에 더 주어진다.
본 발명의 JNK 억제자로 사용을 위한 수송체 서열은, 이에 한정되지 않고, HIV TAT(HIV), 예를 들어 TAT 단백질과 같은 예를 들어 생단백질(native proteins)(예를 들어 미국특허번호 5,804,604 및 5,674,980에서 설명된 것과 같이, 이들 참조 각각은 참조로써 본 발명에 병합됨), HSV VP22 (Herpes simplex) (예를 들어 WO 97/05265에서 설명됨; Elliott and O'Hare, Cell 88 : 223-233 (1997)), 비 바이러스성 단백질 (Jackson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 10691-10695 (1992)), 안테나페디아(Antennapedia)로부터, 특히 드로소필라 안테나페디아(Drosophila antennapedia)로부터 유래된 수송체 서열(예를 들어 이의 안테나페디아 수송 서열), FGF, 락토페린 등으로부터 유래된, 또는 예를 들어 5 내지 15 아미노산의 길이를 갖는 펩타이드, 바람직하게는 10 내지 12 아미노산 및 예를 들어 아르기닌, 리신 및/또는 히스티딘과 같이, 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 85% 또는 90% 염기성 아미노산을 포함하는, 염기성 펩타이드로부터 유래된, 또는 예를 들어 RRRRRRRRR (R9; SEQ ID NO: 152), RRRRRRRR (R8; SEQ ID NO: 153), RRRRRRR (R7; SEQ ID NO: 154), RRRRRR (R6, SEQ ID NO: 155), RRRRR (R5, SEQ ID NO: 156) 등과 같이, 아르기닌 풍부 펩타이드 서열로부터 선택될 수 있는 수송체 서열로부터, VP22로부터, PTD-4 단백질 또는 펩타이드로부터, RGD-K16로부터, PEPT1/2 또는 PEPT1/2 단백질 또는 펩타이드로부터, SynB3 또는 SynB3 단백질 또는 펩타이드로부터, PC 억제자로부터, P21 유래된 단백질 또는 펩타이드로부터, 또는 JNKI 단백질 또는 펩타이드로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제자에 사용을 위한 수송체 서열의 예시는 특히 HIV-1 TAT 단백질로부터 유래된 염기성 수송체 서열이나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 HIV-1 TAT 단백질의 염기성 수송체 서열은 인체 면역결핍 바이러스 HIV-1 TAT 단백질로부터 서열을 포함할 수 있다, 예를 들어 미국특허번호 5,804,604 및 5,674,980에서 예를 들어 설명된 것처럼, 각각은 참조로써 본 발명에 병합된다. 이러한 맥락에서, HIV-1 TAT 단백질의 총 길이는 HIV TAT 유전자의 두 엑손에 의해 코딩되는 86 아미노산 잔기를 갖는다. TAT 아미노산 1-72는 엑손 1에 의해 코딩되는 반면, 아미노산 73-86은 엑손 2에으 의해 코딩된다. 총-길이 TAT 단백질은 2개 리신 및 6개 아르기닌을 포함하는 염기성 부위(아미노산 49-57) 및 7개 시스테인 잔기를 포함하는 시스테인 풍부 부위(아미노산 22-37)인 것이 특징이다. 염기성 부위(즉 아미노산 49-57)은 핵 국재화(nuclear localization)에 중요한 것으로 생각된다. Ruben, S. et al., J. Virol. 63: 1-8 (1989); Hauber, J. et al., J. Virol. 63 1181-1187 (1989). 시스테인 풍부 부위는 체외 금속 결합된 이합체의 형성을 중재하고(Frankel, A. D. et al, Science 240: 70-73 (1988); Frankel, A. D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 6297-6300 (1988)) 전사활성자로써 이의 활성에 필수적이다(Garcia, J. A. et al., EMBO J. 7: 3143 (1988); Sadaie, M. R. et al., J. Virol. 63:1 (1989)). 다른 조절 단백질에서처럼, N-말단 부위는 세포 내 단백질분해효소에 대한 방어에 포함될 수 있다(Bachmair, A. et al., Cell 56: 1019-1032 (1989)). 본 발명의 JNK 억제자에 사용을 위한 바람직한 TAT 수송체 서열은 바람직하게는 TAT 염기성 부위 아미노산 서열(자연 발생 TAT 단백질의 아미노산 49-57)의 존재; TAT 시스테인 풍부 부위 아미노산 서열(자연 발생 TAT 단백질의 아미노산 22-36)의 부재 및 TAT 엑손 2 코딩 카르복시 말단 도메인(자연 발생 TAT 단백질의 아미노산 73-86)의 부재가 특징이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 JNK 억제자에서 수송체 서열은 TAT 잔기 48-57 또는 49 내지 57 또는 이의 변이체를 포함하는 아미노산 서열로부터 선택될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 주어진 JNK 억제자 내 수송체 서열은 예를 들어 단백질분해효소에 대한 안정성을 향상시키기 위해, 또한 D-아미노산을 전시한다. 특히 바람직하게는 D- 및 L- 아미노산이 교차하는(alternating) 특정한 순서를 보이는 수송체 서열이다. D- 및 L-아미노산 (모티프) 교차의 이러한 순서는 -이에 한정되지 않고- SEQ ID NOs: 28-30의 어느 하나의 패턴에 따를 수 있다:
dlLLLxdmLLLydn (SEQ ID NO: 28);
dLLLd(LLLd)a (SEQ ID NO: 29); 및/또는
dLLLdLLLd (SEQ ID NO: 30);
상기: d는 D-아미노산;
L은 L-아미노산;
a는 0 - 3, 바람직하게는 0-2, 더욱 바람직하게는 0, 1, 2 또는 3, 더욱 더 바람직하게는 0, 1, 또는 2 및 가장 바람직하게는 1;
l, m 및 n은 서로 독립적으로 1 또는 2, 바람직하게는 1;
x 및 y는 서로 독립적으로 0, 1 또는 2, 바람직하게는 1.
상기 D- 및 L-아미노산(모티프)의 순서는 수송체 서열이 합성될 때 관련된다, 즉 아미노산 서열(즉 곁사슬 잔기의 타입)이 변하지 않는 동안, 각각 이성질체는 교대된다(alternate). 예를 들어, HIV TAT로부터 유래된 알려진 수송체 서열은 RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 43)이다. 그것에 SEQ ID NO: 30의 D-/L 아미노산 순서를 적용하는 것은 rKKRrQRRr (SEQ ID NO: 46)을 생산할 수 있다.
특정한 실시예에서 본 발명의 JNK 억제자의 수송체 서열은 rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31)에 따른 적어도 하나의 서열을 포함할 수 있다, 상기:
r은 D-거울상이성질 아르기닌을 나타냄;
X는 어떤 L-아미노산(글리신 포함)임;
그리고 상기 각 X는 SEQ ID NO: 31 내 어느 다른 X의 개별적 및 독립적으로 선택될 수 있다. 바람직하게는 SEQ ID NO: 31 내 상기 6 X L-아미노산의 밖으로 적어도 4는 K 또는 R이다. 다른 실시예에서 본 발명에 따른 JNK 억제자는 rX1X2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO: 32) 수송체 서열을 포함하며, 상기 X1은 K, X2는 K, X3는 R 및 X4, X5, 및 X6은 서로 독립적으로 선택된 어느 L-아미노산(글리신 포함)이다. 유사하게, 본 발명에 따른 JNK 억제자의 수송체 서열은 서열 rX1X2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO: 33)을 포함할 수 있으며, 상기 X4는 Q, X5는 R, X6는 R 및 X1, X2, 및 X3는 서로 독립적으로 선택된 어느 L-아미노산(글리신 포함)이다. 독창적인 JNK 억제자는 또한 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 X 아미노산 잔기는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된: X1은 K, X2는 K, X3는 R, X4는 Q, X5는 R, X6는 R, 서열 rX1X2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO: 34)을 포함할 수 있는 반면, 상기 그룹으로부터 선택되지 않은 남아있는 X 아미노산 잔기는 어느 L-아미노산(글리신 포함)일 수 있으며 서로 독립적으로 선택된다. X1은 이후 바람직하게는 Y 및/또는 X4는 바람직하게는 K 또는 R이다.
독창적인 JNK 억제자 분자를 사용하기 위한 수송체 서열의 예시는 하기 표 2에 주어진 서열로부터, (SEQ ID NOs: 31-170) 또는 어느 절편 또는 이의 변이체 또는 화학적으로 변형된 유도체(바람직하게는 생체막을 가로지르는 전좌의 기능을 갖는)로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
표 2:
본 발명에 따른 JNK 억제자를 사용하기 위한 수송체 (폴리-)펩타이드 서열을 위한 예시
서열/펩타이드 명칭 SEQ ID NO AA 서열
r3 (제네릭) 31 9 rXXXrXXXr
r3 (제네릭; 오른쪽 절반) 32 9 rKKRrX4X5X6r
r3 (제네릭; 왼쪽 절반) 33 9 rX1X2X3rQRRr
r3 (제네릭; 개별) 34 9 rX1X2X3rX4X5X6r
TAT (1-86) 35 86 MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT ACTNCYCKKC CFHCQVCFIT KALGISYGRK KRRQRRRPPQ GSQTHQVSLS KQPTSQSRGD PTGPKE
TAT (37-72) 36 36 CFITKALGIS YGRKKRRQRR RPPQGSQTHQ VSLSKQ
TAT (37-58) 37 22 CFITKALGIS YGRKKRRQRR RP
TAT (38-58)GGC 38 24 FITKALGISY GRKKRRQRRR PGGC
TAT CGG(47-58) 39 15 CGGYGRKKRR QRRRP
TAT (47-58)GGC 40 15 YGRKKRRQRR RPGGC
TAT (1-72) Mut Cys/Ala 72 41 56 MEPVDPRLEP WKHPGSQPKT AFITKALGIS YGRKKRRQRR RPPQGSQTHQ VSLSKQ
L-TAT (s1a) 42 10 GRKKRRQRRR
(NH2-GRKKRRQRRR-COOH)
L-TAT (s1b) 43 9 RKKRRQRRR
(NH2-GRKKRRQRRR-COOH)
L-TAT (s1c) 44 11 YDRKKRRQRRR
D-TAT 45 9 rrrqrrkkr
r3-L-TAT 46 9 rKKRrQRRr
r3-L-TATi 47 9 rRRQrRKKr
βA-r3-L-TAT 48 9 βA-rKKRrQRRr (βA: 베타 알라닌)
βA-r3-L-TATi 49 9 βA-rRRQrRKKr (βA: 베타 알라닌)
FITC-βA-r3-L-TAT 50 9 FITC-βA-rKKRrQRRr (βA: 베타 알라닌)
FITC-βA-r3-L-TATi 51 9 FITC-βA-rRRQrRKKr (βA: 베타 알라닌)
TAT(s2-1) 52 9 rAKRrQRRr
TAT(s2-2) 53 9 rKARrQRRr
TAT(s2-3) 54 9 rKKArQRRr
TAT(s2-4) 55 9 rKKRrARRr
TAT(s2-5) 56 9 rKKRrQARr
TAT(s2-6) 57 9 rKKRrQRAr
TAT(s2-7) 58 9 rDKRrQRRr
TAT(s2-8) 59 9 rKDRrQRRr
TAT(s2-9) 60 9 rKKDrQRRr
TAT(s2-10) 61 9 rKKRrDRRr
TAT(s2-11) 62 9 rKKRrQDRr
TAT(s2-12) 63 9 rKKRrQRDr
TAT(s2-13) 64 9 rEKRrQRRr
TAT(s2-14) 65 9 rKERrQRRr
TAT(s2-15) 66 9 rKKErQRRr
TAT(s2-16) 67 9 rKKRrERRr
TAT(s2-17) 68 9 rKKRrQERr
TAT(s2-18) 69 9 rKKRrQREr
TAT(s2-19) 70 9 rFKRrQRRr
TAT(s2-20) 71 9 rKFRrQRRr
TAT(s2-21) 72 9 rKKFrQRRr
TAT(s2-22) 73 9 rKKRrFRRr
TAT(s2-23) 74 9 rKKRrQFRr
TAT(s2-24) 75 9 rKKRrQRFr
TAT(s2-25) 76 9 rRKRrQRRr
TAT(s2-26) 77 9 rKRRrQRRr
TAT(s2-27) 78 9 rKKKrQRRr
TAT(s2-28) 79 9 rKKRrRRRr
TAT(s2-29) 80 9 rKKRrQKRr
TAT(s2-30) 81 9 rKKRrQRKr
TAT(s2-31) 82 9 rHKRrQRRr
TAT(s2-32) 83 9 rKHRrQRRr
TAT(s2-33) 84 9 rKKHrQRRr
TAT(s2-34) 85 9 rKKRrHRRr
TAT(s2-35) 86 9 rKKRrQHRr
TAT(s2-36) 87 9 rKKRrQRHr
TAT(s2-37) 88 9 rIKRrQRRr
TAT(s2-38) 89 9 rKIRrQRRr
TAT(s2-39) 90 9 rKKIrQRRr
TAT(s2-40) 91 9 rKKRrIRRr
TAT(s2-41) 92 9 rKKRrQIRr
TAT(s2-42) 93 9 rKKRrQRIr
TAT(s2-43) 94 9 rLKRrQRRr
TAT(s2-44) 95 9 rKLRrQRRr
TAT(s2-45) 96 9 rKKLrQRRr
TAT(s2-46) 97 9 rKKRrLRRr
TAT(s2-47) 98 9 rKKRrQLRr
TAT(s2-48) 99 9 rKKRrQRLr
TAT(s2-49) 100 9 rMKRrQRRr
TAT(s2-50) 101 9 rKMRrQRRr
TAT(s2-51) 102 9 rKKMrQRRr
TAT(s2-52) 103 9 rKKRrMRRr
TAT(s2-53) 104 9 rKKRrQMRr
TAT(s2-54) 105 9 rKKRrQRMr
TAT(s2-55) 106 9 rNKRrQRRr
TAT(s2-56) 107 9 rKNRrQRRr
TAT(s2-57) 108 9 rKKNrQRRr
TAT(s2-58) 109 9 rKKRrNRRr
TAT(s2-59) 110 9 rKKRrQNRr
TAT(s2-60) 111 9 rKKRrQRNr
TAT(s2-61) 112 9 rQKRrQRRr
TAT(s2-62) 113 9 rKQRrQRRr
TAT(s2-63) 114 9 rKKQrQRRr
TAT(s2-64) 115 9 rKKRrKRRr
TAT(s2-65) 116 9 rKKRrQQRr
TAT(s2-66) 117 9 rKKRrQRQr
TAT(s2-67) 118 9 rSKRrQRRr
TAT(s2-68) 119 9 rKSRrQRRr
TAT(s2-69) 120 9 rKKSrQRRr
TAT(s2-70) 121 9 rKKRrSRRr
TAT(s2-71) 122 9 rKKRrQSRr
TAT(s2-72) 123 9 rKKRrQRSr
TAT(s2-73) 124 9 rTKRrQRRr
TAT(s2-74) 125 9 rKTRrQRRr
TAT(s2-75) 126 9 rKKTrQRRr
TAT(s2-76) 127 9 rKKRrTRRr
TAT(s2-77) 128 9 rKKRrQTRr
TAT(s2-78) 129 9 rKKRrQRTr
TAT(s2-79) 130 9 rVKRrQRRr
TAT(s2-80) 131 9 rKVRrQRRr
TAT(s2-81) 132 9 rKKVrQRRr
TAT(s2-82) 133 9 rKKRrVRRr
TAT(s2-83) 134 9 rKKRrQVRr
TAT(s2-84) 135 9 rKKRrQRVr
TAT(s2-85) 136 9 rWKRrQRRr
TAT(s2-86) 137 9 rKWRrQRRr
TAT(s2-87) 138 9 rKKWrQRRr
TAT(s2-88) 139 9 rKKRrWRRr
TAT(s2-89) 140 9 rKKRrQWRr
TAT(s2-90) 141 9 rKKRrQRWr
TAT(s2-91) 142 9 rYKRrQRRr
TAT(s2-92) 143 9 rKYRrQRRr
TAT(s2-93) 144 9 rKKYrQRRr
TAT(s2-94) 145 9 rKKRrYRRr
TAT(s2-95) 146 9 rKKRrQYRr
TAT(s2-96) 147 9 rKKRrQRYr
TAT(s2-97) 148 8 rKKRrQRr
TAT(s2-98) 149 9 rKKRrQRrK
TAT(s2-99) 150 9 rKKRrQRrR
r3R6 151 9 rRRRrRRRr
L-R9 152 9 RRRRRRRRR
L-R8 153 8 RRRRRRRR
L-R7 154 7 RRRRRRR
L-R6 155 6 RRRRRR
L-R5 156 5 RRRRR
r9 157 9 rrrrrrrrr
r5R4 (D/L) 158 9 rRrRrRrRr
r5R4 (DD/LL) 159 9 rrRRrrRRr
PTD-4 160 11 YARAAARQARA
PTD-4 (변이체 1) 161 11 WARAAARQARA
PTD-4 (변이체 2) 162 11 waraqraaara
L-P1 페네트라틴(Penetratin) 163 16 RQVKVWFQNRRMKWKK
D-P1 페네트라틴 164 16 KKWKMRRNQFWVKVQR
JNKI, 베스트핏(bestfit) 165 17 WKRAAARKARAMSLNLF
JNKI, 베스트핏 (변이체 1) 166 17 WKRAAARAARAMSLNLF
MDCK 통과세포외배출(transcytose) 서열 167 9 RYRGDLGRR
YKGL 168 4 YKGL
P1 169 4 RRTK
P66 170 4 RRPK
상기 언급한 것처럼, 수송체 서열은 또한 표 2의 상기 서열의 절편 또는 변이체로부터 선택될 수 있다(단 이러한 절편 또는 변이체는 바람직하게는 생체막을 가로지르는 전좌를 제공하는 기능을 보유함). 이러한 특정한 맥락에서, 그들 수송체 서열의 변이체 및/또는 절편은 바람직하게는 표 2에 정의된 이러한 수송체 서열의 서열의 전체길이에 대해 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 및 가장 바람직하게는 적어도 99% 서열 상동성을 공유하는 펩타이드 서열을 포함한다. 이러한 특정한 맥락에서, 표 2에 정의된 수송체 서열의 "절편"은 바람직하게는 이의 끝이 잘린(truncated) 서열, 즉 원래 서열의 아미노산 서열에 비해 N-말단적으로, C-말단적으로 및/또는 내부 순차적으로(intrasequentially) 끝이 절단된 아미노산 서열로 이해된다.
나아가, 상기 정의된 수송체 서열의 "변이체" 또는 이의 절편은, 바람직하게는 1 또는 그 이상 치환된, (또는 만약 필요에따라 삽입 및/또는 결실) 아미노산(들)처럼, 하나 또는 그 이상 변이(들)에 본 발명에서 정의된 원래의 수송체 서열 또는 이의 절편과 다른 변이체의 아미노산 서열인 서열로 이해된다. 바람직하게는 상기 정의된 이러한 수송체 서열의 변이체는, 즉, 예를 들어 세포 또는 핵 내로 수송을 제공하는, 각각의 본래 서열에 비해 동일한 생물학적 기능 또는 특정한 활성을 갖는다. 이러한 맥락에서, 상기 정의된 이러한 수송체 서열의 변이체는 예를 들어 약 1 내지 50, 1 내지 20, 보다 바람직하게는 1 내지 10 및 가장 바람직하게는 1 내지 5, 4, 3, 2 또는 1 아미노산 변경(alterations)을 포함할 수 있다. 상기 정의된 이러한 수송체 서열의 변이체는 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환의 개념은 기술분야에서 알려져 있으며 JNK 억제 (폴리-)펩타이드 서열을 위해 상기에 이미 준비되었으며 그에 따라 여기에 적용한다.
본 발명의 JNK 억제자에 병합되는 수송체 서열의 길이는 다양할 수 있다. 일부 실시예에서 본 발명에 따른 JNK 억제자의 수송체 서열은 아미노산 길이가 150 미만, 140 미만, 130 미만, 120 미만, 110 미만, 100 미만, 90 미만, 80 미만, 70 미만, 60 미만, 50 미만, 40 미만, 30 미만, 20 미만, 및/또는 10 미만으로 고려된다.
특정한 수송체 서열이 본 발명에 따른 JNK 억제자의 맥락에서 여전히 기능적인지는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 수송체 도메인을 포함하는 JNK 억제자는 라벨, 예를 들어 세포 내 쉽게 검출될 수 있는 GFP와 같은 형광성 단백질, 방사성 라벨, 효소, 형광단(fluorophore), 항원결정기 등에 융합될 수 있다. 이후, 수송체 서열 및 라벨을 포함하는 JNK 억제자는 세포에 감염(transfected)되거나 배양 상청액에 첨가되고 세포막의 투과는 생물 물리학 및 생화학적 표준 방법을 사용하여 감시될 수 있다(예를 들어 유동 세포 분석법(flow cytometry), (면역)형광성 현미경 관찰 등).
수송체 서열을 포함하는 본 발명에 따른 JNK 억제자의 특정한 예시가 표 3에 주어진다.
표 3: 제 (폴리-)펩타이드 서열 및 수송체 서열을 포함하는 JNK 억제자의 예시
아미노산 서열 AA SEQ ID NO:
rKKRrQRRrRPkRPTTLNLf 20 171
rKKRrQRRrRPkRPaTLNLf 20 172
rKKRrQRRrRPkRPTTLrLf 20 173
rKKRrQRRrRPTTLNLf 17 174
rKKRrQRrRPTTLNLf 16 175
rKKRrQRRrRPkRPTTLNLw 20 176
rKKRrQRRrRPkRPTDLNLf 20 177
rKKRrQRRrRPTTLrLw 17 178
rKKRrQRrRPTTLrLw 16 179
rKKRrQRRrRPTDLrLw 17 180
rKKRrQRrRPTDLrLw 16 181
rKKRrQRRrRPaTLNLf 17 182
rKKRrQRrRPaTLNLf 16 183
rKKRrQRrKRPaTLNLf 17 184
rKKRrQRRrRPkRPsTLNLf 20 185
rKKRrQRRrRPkRPqTLNLf 20 186
rKKRrQRRrRPkRPkTLNLf 20 187
rKKRrQRRrGKRKALKLf 18 188
rKKRrQRRrGKRKALrLf 18 189
rKKRrQRRrRKALrLf 16 190
상기 언급된 것처럼, 본 발명의 특별한 실시예에서 수송체 서열 및 억제 (폴리-)펩타이드 서열은 겹칠 수 있다. 다시 말해, 수송체 서열의 N-말단은 억제 (폴리-)펩타이드 서열의 C-말단에 겹칠 수 있거나 수송체 서열의 C-말단은 억제 (폴리-)펩타이드 서열의 N-말단에 겹칠 수 있다. 후자의 실시에는 특히 선호된다. 바람직하게는 억제 (폴리-)펩타이드 서열과 1, 2 또는 3 아미노산 잔기에 의해 겹친다. 이러한 시나리오에서 주어진 수송체 서열은 SEQ ID NO:1 또는 위치 1(X1), 위치 1 및 2(X1, X2), 위치 1, 2 및 3(X1, X2, X3)에 이들 각각의 변이체와 겹칠수 있다.
SEQ ID NOs: 174, 175, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 188, 189 및 190은, 수송체 서열 및 억제 (폴리-)펩타이드 서열은 겹치며, 예를 들어 rKKRrQ RRr RPTTLNLf (SEQ ID NO: 174)은 SEQ ID NO: 46 (밑줄) 및 SEQ ID NO: 11 (이탤릭)의 겹침인 본 발명에 따른 JNK 억제자의 좋은 예시이다.
확실하게 본 발명에 따른 JNK 억제자는 또한 SEQ ID NOs: 171-190에 따른 JNK 억제자의 어느 하나의 변이체인 JNK 억제자로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는 이러한 변이체는 SEQ ID NOs: 171-190, 특히 SEQ ID NO: 172의 서열과 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 55%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 65%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 서열 상동성을 공유한다.
단 서열 상동성을 공유하는 이러한 서열 SEQ ID NOs: 171-190(SEQ ID NO: 1의 억제 (폴리-)펩타이드 서열 및 SEQ ID NOs: 2-27의 특정 예시들을 참조)의 상기 서열 내 억제 (폴리-)펩타이드 서열에 관하여
a) 억제 (폴리-)펩타이드 서열 내 위치 4에 L-아르기닌 (R) 잔기를 유지,
b) 억제 (폴리-)펩타이드 서열 내 위치 8 및 10(SEQ ID NOs: 25-27에 관하여 위치 7 및 9)에 2개 L-류신 (L) 잔기를 유지,
c) SEQ ID NO: 1의 X1, X2, X3, X5, X7 및 또는 X8 및 SEQ ID NOs: 2-27내 각각의 위치로 이루어진 그룹에서 선택된 아미노산에 대응하는 각각의 위치에 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5 또는 6 D-아미노산(들)을 전시, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NO: 1 의 X3, X5, X7 및 X8 및 SEQ ID NOs: 2-27의 각각의 위치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산에 대응하는 위치에 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3 또는 4 D-아미노산(들)을 전시, 및
d)여전히 JNK 활성을 억제 (즉 본 발명에 정의된 JNK 억제자임).
상기 정의의 관점 및 명확성을 위해 SEQ ID NOs: 171-190(상기 정의 내 a) 및 b) 참조) 포함하는 JNK 억제자의 변이체에서 변하지 않을 수 있는 잔기는 표 3에 밑줄을 쳤다.
SEQ ID NOs: 171-190 포함하는 JNK 억제자의 변이체에서 비동일한 아미노산은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환(상기 참조)의 결과이다. 확실하게, 상기 언급된 추가적으로 가능한 치환은 또한 SEQ ID NOs: 171-190 포함하는 JNK 억제자의 변이체에 고려된다. 마찬가지로, 본 발명은 확실하게 또한 억제 (폴리-)펩타이드 서열에 없거나 독점적이지 않은 본래 서열로부터 벗어난, 그러나 수송체 서열 내 변이체 잔기를 전시하는, SEQ ID NOs: 171-190에 따르는 JNK 억제자들의 어느 하나의 변이체를 고려한다. 수송체 서열의 변이체 및 절편에 대해서는 특히 상기 각각의 개시를 참조.
앞서 언급한바와 같이, 본 발명에 따른 JNK 억제자의 수송체 서열 및 JNK 억제 (폴리)펩타이드 서열은 반드시 서로 직접적으로 결합될 필요는 없다. 그들은 또한 예를 들어 (폴리-)펩타이드 서열의 중재에 의해, 서로 떨어질 수 있다. 억제 (폴리-)펩타이드 서열 및 수송체 서열과 같이 다른 (기능적) 서열을 분리하는 바람직한 중재 서열은 헥사머(hexaamer), 펜타머(pentamer), 테트라머(tetramer), 트리펩타이드(tripeptide) 또는 단지 디펩타이드(dipeptide) 또는 단일 아미노산 잔기처럼 아미노산 길이가 10 미만인 짧은 펩타이드 서열로 이루어진다. 특히 바람직한 중재 서열은 모두가 오직 L-아미노산 형태에서, 또는 오직 D-아미노산 형태에서, 또는 D- 및 L-아미노산이 혼합으로 디-프롤린, 디-글리신, 디-아르기닌 및/또는 디-리신의 1, 2 또는 그 이상의 복제(copies)이다. 물론, 다른 공지된 펩타이드 스페이서 서열도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 JNK 억제자는 SEQ ID NO: 8 (또는 상기에 정의된 범위 및 한계 내에서 SEQ ID NO: 8과 서열 상동성을 공유하는 서열) 및 수송체 서열을 포함한다. 수송체 서열은 바람직하게는 SEQ ID Nos: 31-170의 어느 하나 또는 본 발명에서 정의된 이의 변이체로부터, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NOs: 31-34 및 46-151의 어느 하나로부터 선택된다. 본 발명에 따른 JNK 억제자의 특히 바람직한 실시예는 SEQ ID NO: 8 및 SEQ ID NO: 46을 포함하는 JNK 억제자이다(또는 상기 정의된 범위 및 한계 내에서 이의 각각 서열 상동성을 공유하는 서열). 바람직한 실시예는 본 발명에서 정의된 SEQ ID NO: 172의 서열 또는 수송체 서열 및/또는 억제 (폴리-)펩타이드 서열에 따라 다양한 이의 각각 변이체를 포함하는 JNK 억제자이다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 하기를 포함하는 JNK 억제자에 관련된다
a) RPTTLNLF (SEQ ID NO: 191), KRPTTLNLF (SEQ ID NO: 192), RRPTTLNLF 및/또는 RPKRPTTLNLF (SEQ ID NO: 193)로 이루어진 서열의 그룹으로부터 서열을 포함하는 억제 (폴리-)펩타이드, 및
b) 수송체 서열, 바람직하게는 표 2에서 개시된 수송체 서열 또는 이의 변이체/절편으로부터 선택된, 더욱 바람직하게는 SEQ ID NOs: 31-34 및 46-151 또는 이의 각각 변이체 또는 절편으로부터 선택된 수송체 서열.
수송체 서열 및 억제 (폴리-)펩타이드 서열은 겹칠 수 있다. 발명의 상기 실시예에 바람직한 수송체 서열은 특히, 바람직하게는 억제 (폴리-)펩타이드 서열의 N-말단에 결합된(예를 들어 직접), SEQ ID NO: 46의 수송체 서열이다.
본 발명의 JNK 억제자는 또한 서열 GRKKRRQRRRPPKRPTTLNLFPQVPRSQD (SEQ ID NO: 194), 또는 서열 GRKKRRQRRRPTTLNLFPQVPRSQD (SEQ ID NO: 195)을 포함하거나 이루어진 JNK 억제자일 수 있다.
또 다른 측면에 있어서 본 발명은 rKKRrQRr (SEQ ID NO: 148), rKKRrQRrK (SEQ ID NO: 149), 및/또는 rKKRrQRrR (SEQ ID NO: 150)로 이루어진 서열의 그룹으로부터 선택된 수송체 서열을 포함하는 (폴리-)펩타이드에 관련된다.
본 발명에 사용된, 특정 서열 또는 특정 SEQ ID NO:를 포함하는 것은 보통 상기 서열의 (적어도) 하나의 복제가 존재함을 내포한다, 예를 들어 JNK 억제자 분자. 예를 들어, 하나의 억제 (폴리-)펩타이드 서열은 보통 JNK 활성의 충분한 억제를 달성하는데 충분할 것이다. 그러나, 발명자는 확실하게 각각의 서열의 둘 또는 그 이상의 복제의 용도(예를 들어 다르거나 동일한 형태의 억제 (폴리-)펩타이드 서열의 둘 또는 그 이상의 복제 및/또는 다르거나 동일한 형태의 수송체 서열의 둘 또는 그 이상의 복제)는 또한 JNK 활성을 억제하는 결과(resulting) 분자의 종합적인 능력이 폐지되지 않는 한(즉 각각의 분자는 여전히 본 발명에 정의된 JNK 분자임) 수행될 수 있는 것을 고려한다.
독창적인 JNK 억제자는 기술분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)) 전략을 사용하는 고체상 펩타이드 합성을 통한 화학적 합성에 의해, 즉 연이은 Fmoc 탈보호 라운드(rounds) 및 Fmoc 아미노산 짝지음 사이클에 의해 획득되거나 생산될 수 있다. 이러한 펩타이드 합성을 제공하는 상업적 서비스는 많은 회사들, 예를 들어 회사 PolyPeptide (Straβbourg, France)에 의해 제공된다.
본 발명에 따른 이용을 위한 JNK 억제자는 선택적으로 나아가, 특히 억제 (폴리-펩타이드) 서열의 아미노산 잔기에 변형될 수 있다. 가능한 변형은 예를 들어 하기로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다:
(i) 방사성 라벨, 즉 방사성 인산화 또는 황, 수소, 탄소, 질소 등으로 방사성 라벨.
(ii) 색 염료 (예를 들어 디곡시게닌(digoxygenin), 등);
(iii) 형광성 그룹 (예를 들어 플루오레세인(fluorescein), 등);
(iv) 화학발광(chemoluminescent) 그룹;
(v) 고체상 고정(immobilization) 그룹 (예를 들어, 히스-택(His-tag), 비오틴(biotin), 스트렙-택(strep-tag), 플랙-택(flag-tag), 항체, 항원결정기, 등);
(vi) 페길화(pegylation),
(vii) 글리코실화(glycosylation),
(viii) 헤실화(hesylation),
(ix) 단백질분해효소 절단 자리 (예를 들어 JNK 억제자의 통제된 방출을 위하여)
(x) 펩타이드 골격(backbone) 변형 (예를 들어 (ΨCH2-NH) 결합)
(xi) 아미노산 곁사슬 잔기의 보호,
(xii) N- 및/또는 C-말단의 보호 (예를 들어 N-말단 아미드화 또는 C-말단 아세틸화)
(xiii) (i) 내지 (xii) 하에서 언급된 요소의 둘 또는 그 이상의 요소들의 조합.
특히 바람직하게는 (i) 내지 (xi)로부터 및 (i) 내지 (xi) 하에서 언급된 요소들의 둘 또는 그 이상의 요소의 조합으로부터 선택된 변형이다. 이러한 맥락에서 본 발명은 나아가 (i) 내지 (xi)로부터 선택된 변형으로 변형된 또는 (i) 내지 (xi) 하에서 언급된 요소들의 둘 또는 그 이상의 조합으로 변형된, 본 발명에서 개시된 JNK 억제자의 측면 및 이러한 변형된 JNK 억제자를 포함하는 약학적 조성물(하기 참조)과 관련된다.
약학적 조성물
발명에 따라 정의된 JNK 억제자는 본 발명에 정의된 어느 질환의 예방 또는 치료에 적용될 수 있는, 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에 따라 사용된 이러한 약학적 조성물은 유효 성분으로 본 발명에서 정의된 JNK 억제자, 특히 본 발명에서 정의된 SEQ ID NO: 1에 따른 억제 (폴리-)펩타이드 서열을 포함 또는 이루어진 JNK 억제자를 포함한다. 바람직하게는, 유효 화합물(active compound)은 SEQ ID NOs: 2-27의 어느 하나에 따라; 또는, 수송체 서열이 결합되는 경우에는 SEQ ID NOs: 171-190의 어느 하나에 따라 억제 (폴리-)펩타이드 서열을 포함 또는 이루어진 JNK 억제자이다.
본 발명의 발명자들은 추가적으로, 본 발명에서 정의된 JNK 억제자들, 특히 수송체 서열에 융합될 경우; 본 발명의 질환에 포함되는 세포 내로 특히 양호한 흡수 속도를 보임을 발견하였다. 따라서, 대상에 투여되는 약학적 조성물 내에 JNK 억제자 억제자의 양은 매우 낮은 투여량(dose)을 - 이에 한정되지 않음- 가질 수 있다. 따라서, 투여량은 DTS-108과 같이 (Florence Meyer-Losic et al., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53), 기술 분야에서 알려진 펩타이드 약물보다 훨씬 낮을 수 있다. 이것은 몇몇 긍정적 측면, 예를 들어 잠재적 부작용의 감소 및 비용의 감소를 가진다.
바람직하게는, 투여량 (체중 kg 당)은 약 10 mmol/kg 까지, 바람직하게는 약 1 mmol/kg 까지, 더욱 바람직하게는 약 100 μmol/kg 까지, 더욱 더 바람직하게는 약 10 μmol/kg 까지, 더욱 더 바람직하게는 약 1 μmol/kg 까지, 더욱 더 바람직하게는 약 100 nmol/kg 까지, 가장 바람직하게는 약 50 nmol/kg 까지의 범위이다.
따라서, 투여량 범위는 바람직하게는 약 1 pmol/kg 내지 약 1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,1 mmol/kg, 약 10 pmol/kg 내지 약 0,01 mmol/kg, 약 50 pmol/kg 내지 약 1 μmol/kg, 약 100 pmol/kg 내지 약 500 nmol/kg, 약 200 pmol/kg 내지 약 300 nmol/kg, 약 300 pmol/kg 내지 약 100 nmol/kg, 약 500 pmol/kg 내지 약 50 nmol/kg, 약 750 pmol/kg 내지 약 30 nmol/kg, 약 250 pmol/kg 내지 약 5 nmol/kg, 약 1 nmol/kg 내지 약 10 nmol/kg, 또는 상기 값의 어느 둘의 조합일 수 있다.
이러한 맥락에서, 치료의 처방, 예를 들어 투여량(dosage)의 결정 등은 상기 약학적 조성물을 사용할 때 전형적으로 일반적인 전문가(practitioners) 및 다른 의료 의사의 책임 내이며, 그리고 치료되는 장애, 개별 환자의 상태, 전달 위치, 투여 방법 및 전문가에 알려진 다른 요소를 전형적으로 고려한다. 상기 언급된 기술 및 프로토콜(protocols)의 예시는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 16th edition, Osol, A. (ed), 1980에서 찾을 수 있다. 그에 따라, 본 발명에 따라 사용된 약학적 조성물의 구성요소에 "안전하고 효과적인 양"은, 본 발명에서 정의된 JNK 신호전달과 강하게 관련된 질환 또는 장애의 긍정적인 변화를 현저하게 유도하기에 충분한, 이들 구성요소 각각 또는 모두의 양을 의미한다. 동시에, 그러나 "안전하고 효과적인 양"은 심각한 부작용을 피하기에 충분히 작고, 그것은 장점 및 위험 사이의 합리적(sensible) 관계의 허용을 말한다. 이들 한계의 결정은 전형적으로 합리적인 의학적 판단의 범위 내에 내재한다. 이러한 구성요소의 "안전하고 효과적인 양"은 치료될 특정 조건 및 또한 치료될 환자의 연령 및 신체적 조건과의 관련성, 조건의 심각성, 치료의 기간, 병행 테라피의, 사용된 특정한 약학적으로 허용가능한 담체의 본성(nature), 및 유사한 요소, 동반(accompanying) 의사의 지식 및 경험 내에서 다양할 수 있다. 발명에 따른 약학적 조성물은 인간 및 또한 수의 의료(veterinary medical) 목적을 위해 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명에 따라 사용된 약학적 조성물은 게다가, JNK 억제자의 하나 또는 그 이상에 추가하여, 통상의 기술자에게 잘 알려진 (호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 담체, 첨가제(excipient), 버퍼, 안정화제(stabilizer) 또는 다른 물질을 포함할 수 있다.
이러한 맥락에서, "(호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 담체" 표현은 바람직하게는 조성물의 액체 또는 비액체 기반(basis)을 포함한다. 용어 "호환성 있는"은 본 발명에 사용된 약학적 조성물의 성분(constituents)이 상기 정의된 약학적 유효성분 및 일반적 사용 조건 하에서 조성물의 약학적 효과를 상당히 감소시킬 수 있는 상호 작용이 일어나지 않는 이러한 환경 내에 하나의 다른 구성 성분과 혼합될 수 있는 것을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 담체는 반드시, 물론, 충분히 높은 순도 및 그들을 치료될 사람에 투여에 적합하게 만드는 충분히 낮은 독성을 갖는다.
본 발명에 사용된 약학적 조성물이 액체 형태로 제공되면, 약학적으로 허용가능한 담체는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 (호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 액체 담체를 포함할 것이다. 조성물은 (호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 액체 담체로서 예를 들어 피로겐(pyrogen) 없는 물; 등장성 식염수 또는 버퍼 (수성) 용액, 예를 들어 인산염, 시트르산염 등 버퍼 용액, 예를 들어 땅콩 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마(theobroma)로부터 오일과 같은 식물성 오일; 예를 들어 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 아르기닌 산 등을 포함할 수 있다. 특히 본 발명에 사용된 약학적 조성물의 주사를 위해, 버퍼, 바람직하게는 수용성 버퍼가 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용된 약학적 조성물이 고체형태인 경우, 약학적으로 허용가능한 담체는 전형적으로 하나 또는 그 이상의 (호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 고체 담체를 포함할 것이다. 조성물은 (호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 고체 담체로서 예를 들어 하나 또는 그 이상의 호환성 있는 고체 또는 액체 필러 또는 희석액(diluents)을 포함할 수 있거나 사람에 투여를 위해 적합한, 캡슐화(encapsulating) 화합물도 사용될 수 있다. 이러한 (호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 고체 담체의 일부 예시는 예를 들어, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 설탕; 예를 들어 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 전분; 예를 들어 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; 트라가칸스(tragacanth) 분말; 몰트; 젤라틴; 수지(tallow); 예를 들어 스테아르산, 마그네슘 스테아르산염과 같은 고체 활택제(glidants); 황산 칼슘 등이다.
(호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 담체 또는 다른 물질의 정확한 본성은 투여 경로에 의존할 수 있다. (호환성 있는) 약학적으로 허용가능한 담체의 선택은 따라서 발명에 따라 사용된 약학적 조성물이 투여된 방식(manner)에 의해 원칙적으로 결정될 수 있다. 발명에 따라 사용된 약학적 조성물은, 예를 들어 온 몸에(systemically) 투여될 수 있다. 투여 경로는, 예를 들어 정맥내(intravenous), 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 또는 경피(transdermal) 경로 등과 같은 비경구 경로(예를 들어 주사를 통해), 경구 또는 직장(rectal) 경로 등과 같은 장내(enteral) 경로, 비강(nasal) 또는 비강내(intranasal) 경로 등과 같은 국소(topical) 경로, 또는 표피(epidermal) 경로 또는 패치 전달과 같은 다른 경로를 포함한다. 또한 고려된 것(특히 안구 관련 질환을 위해)은 점적(instillation), 초자체내(intravitreal), 및 결막하(subconjunctival) 투여이다. 마찬가지로 투여는, 예를 들어 귀와 관련된 질병이 치료될 경우 고막내(intratympanical)로 일어날 수 있다.
사용될 약학적 조성물의 적절한 양은 동물 모델로 통상(routine) 실험에 의해 결정될 수 있다. 이러한 모델은, 어떠한 제한도 없이, 토끼, 양, 쥐, 랫, 개 및 비인간 영장류 모델을 포함한다. 주사를 위한 바람직한 단위 투여량 형태는 멸균수, 생리 식염수 또는 이의 혼합물을 포함한다. 각 용액의 pH는 약 7.4로 조절되어야 한다. 주사를 위해 적절한 담체는 수소, 통제된 또는 지연된 방출을 위한 장치, 폴리락트산 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 국소적 처리를 위해 적절한 약학적으로 허용가능한 담체는 로션, 크림, 겔 등의 사용에 적절한 그들을 포함한다. 화합물이 경구로 투여되는 경우, 정제, 캡슐 등은 바람직한 단위 투여량 형태이다. 경구 투여를 위해 사용될 수 있는, 단위 투여량 형태의 제조를 위해 약학적으로 허용가능한 담체는 선행 기술에서 잘 알려져있다. 이의 선택은 본 발명의 목적에 치명적이지 않은, 맛, 비용 및 저장성과 같은 2차적 고려에 의존할 수 있으며, 통상의 기술자에 의해 어려움 없이 만들어질 수 있다.
경구 투여를 위한 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 젤라틴과 같이 상기 정의된 고체 담체, 및 선택적으로 어쥬번트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 경구 투여를 위한 액체 약학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물성 또는 식물성 오일, 광물 오일 또는 합성 오일과 같이, 상기 정의된 액체 담체를 포함할 수 있다. 생리 식염수 용액, 덱스트로스 또는 다른 당류(saccharide) 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다.
정맥내, 피부(cutaneous) 또는 피하 주사, 또는 고통(affliction) 부위에 주사를 위해, 유효 성분은 피로겐이 없으며 적절한 pH, 등장도 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수성 용액의 형태일 수 있다. 기술 분야에서 관련된 기술들은 예를 들어, 염화나트륨 주사(Sodium Chloride Injection), 링거 주사(Ringer's Injection), 락테이티드 링거 주사(Lactated Ringer's Injection)와 같이 등장성 대조군(vehicles)을 사용하는 적절한 용액을 잘 준비할 수 있다. 방부제, 안정화제, 버퍼, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다. 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 핵산 분자인지에 따라, 본 발명에 따른 다른 약학적으로 유용한 화합물은 개인에게 주어지며, 투여는 바람직하게는 이는 개인에게 유익함을 보이기에 충분한, "병을 예방하기에(prophylactically) 효과적인 양 또는 "치료상(therapeutically) 효과적인 양" (경우가 있을 수 있음)이다. 실제 투여되는 양, 및 투여 속도 및 시간 코스는, 치료되는 것의 본성 및 심각성에 의존할 수 있다.
본 발명에서 정의된 질환의 치료는 전형적으로 상기 정의된 약학적 조성물의 투여를 포함한다. 본 발명의 JNK 억제자는 대상 내 JNK 활성을 조절할 것이다. 용어 "조절(modulate)"은 특히 상기 질환의 어느 것에 예를 들어 세포 내 천연 c-jun, ATF2 및 NFAT4 결합 자리의 경쟁적 억제자로서, 추가적인 수송체 서열을 잠재적으로 포함하는, SEQ ID NOs: 2 내지 27의 어느 서열에 따른 억제 (폴리)펩타이드 서열을 포함 또는 이루어진 적어도 하나의 JNK 억제자의 사용에 의해 c-jun, ATF2 또는 NFAT4의 인산화의 억제를 포함한다. 용어 "조절"은 또한 예를 들어, 이에 제한되지 않고, c-jun, AFT2 및 c-fos로 구성된 AP-1 복합체와 같이 c-jun, AFT2, 또는 NFAT4 및 그들의 관련된 파트너로 구성된 전사 인자의 이종-(hetero-) 및 동종(homomeric) 복합체의 억제를 포함한다.
상기 개시된 약학적 조성물로 대상의 치료는 전형적으로 대상에 상기 약학적 조성물의 ("치료적으로 효과적인") 양을 투여(체내)함으로써 수행될 수 있으며, 상기 대상은 예를 들어 인간 대상 또는 동물일 수 있다. 동물은 바람직하게는 비 인간 포유류, 예를 들어, 비 인간 영장류, 쥐, 랫, 개, 고양이, 젖소, 말 또는 돼지이다. 용어 "치료적으로 효과적인"은 약학적 조성물의 유효성분이 본 발명에 논의된 질환 및 장애를 개선(ameliorate)하기에 충분한 양이다.
질환(Diseases) 및 장애(disorders)
본 발명의 요지는 테라피(therapy)에 의한 인체 또는 동물 몸체, 특히 인체의 치료 방법에의 상기 개시된 JNK 억제자 및 약학적 조성물을 사용하는 것이다. 상기 언급된 JNK 신호전달은 다양한 질병 상태 및 장애의 다수에 관계되며 상기 신호전달의 억제는 이들 다수를 위해 제안되고 성공적으로 실험되었다. 본 발명의 발명자들은 본 발명에서 개시된 JNK 억제자들은 효과적인 JNK 억제자이며 따라서 기술분야에서 개시된 질환의 치료에 동일하게 적합함을 발견하였다.
본 발명에서 사용된, 테라피에 의한 인체 또는 동물 몸체의 치료는, 각각의 대상의 치료법(therapeutic treatment)의 어느 유형(kind)을 말한다. 이는 예를 들어 질환의 시작의 예방 또는 증상(예방(prophylaxis))을, 즉 전형적으로 환자 내 질환의 징후(manifestation) 이전에, 포함한다. 용어는 또한 주어진 질병의 증상의 "단지" 치료를 포함한다, 즉 치료는 질환 및 증상의 근본적인 원인을 필수적으로 치료하지 않고, 질환과 관련된 증상의 감소에 의해 발병(pathogenesis)을 개선할 것이다. 물론, 질환의 근본적인 원인의 치료는 또한 용어에 의해 포함된다. 용어는 또한 각각의 질환의 진행을 지연 또는 중단하는 치료를 포함한다.
일 실시예에서 본 발명에 따른 JNK 억제자는 예상가능한 장애의 잠재적 시작 전에, 예를 들어 계획된 외과 수술(surgical intervention) 또는 계획된 스트레스성 자극에 노출 전, 예를 들어 병을 예방하여 투여될 수 있다. 외과 수술은 예를 들어 각각 상처 또는 이웃한 조직의 의 염증의 위험을 질 수 있다(예를 들어 외과적 안구 치료 이후 안구 건조증, 치과 임플란트 치료 이후 임플란트 주위염(peri-implantitis), 이식 수술 이후 이식 거부 등). 방사선과 같은 스트레스성 자극에 노출은 영향을 받은 조직 및 세포의 세포 자멸을 일으킬 수 있다. 이러한 시나리오에서 본 발명에 따른 JNK 억제자는 예를 들어 미리 적어도 약 4주에 한번 투여될 수 있다. JNK 억제자는 예를 들어 적어도 24시간, 적어도 48시간, 적어도 1주, 적어도 2주 또는 4주 미리 투여될 수 있다.
본 발명에 개시된 JNK 억제자로 치료되는 질환 및 장애는 급성 또는 만성일 수 있다.
병적인(pathological) 조건의 방대한 다양성에서 JNK 신호전달의 관여에 의해, 본 발명의 JNK 억제자는 예를 들어, 안 질환(diseases of the eye), 골 질환(diseases of the bone), 신경 질환(neural diseases), 신경 단위의 질환(neuronal diseases), 신경병성 질환(neurodegenerative diseases), 피부 질환(diseases of the skin), 면역 및/또는 자가면역 질환, 안 질환(diseases of the eye), 구강 질환(diseases of the mouth), 염증 질환, 대사성 질환(metabolic diseases), 심혈관 질환(cardiovascular diseases), 증식성 질환(proliferative diseases)(특히 암 및 종양), 귀 질환(diseases of the ear), 장 질환(diseases of the intestine), 호흡기 시스템 질환(diseases of the respiratory system)(예를 들어 폐 질환), 감염성 질환, 및 다양한 다른 질환과 같은, 다양한 기관의 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제자는 예를 들어, 예를 들어 급성 염증뿐만 아니라 만성 염증을 포함하는 염증성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 JNK 억제자는 예를 들어 안 염증, 구강 염증, 특히 폐를 포함하는 호흡기 시스템 염증, 피부 염증, 심혈관 시스템 내 염증, 뇌 염증, 귀 내 염증 등, 조직 염증의 어떠한 형태를 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 염증성 질병 상태의 일부 비제한적 예시는 점막염(mucositis), 구내염(stomatitis), 임플란트 주위염(peri-implantitis), 망막염(retinitis), 맥락막염(chorioiditis), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca), 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD), 포도막염(uveitis) (예를 들어 전방 포도막염(anterior uveitis), 중간 포도막염(intermediate uveitis), 후방 포도막염(posterior uveitis)), 치주염(periodontitis), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 천식(asthma), 치수염(pulpitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 크론병(Crohn's disease), 건선 관절염(psoriatic arthritis), 혈관염(vasculitis), 간질성 방광염(interstitial cystitis); 감염 또는 상처의 자리에 급성 염증, 수막염(meningitis), 뇌염(encephalitis), 폐렴(pneumonia), 인두염(pharyngitis), 편도염(tonsillitis), 이염(otitis) (중이염(otitis media) 포함), 맥관염(vasculitis), 활액막염(synovitis), 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 이식편 거부(graft rejection) 등이다.
본 발명에서 개시된 JNK 억제자는 예를 들어 귀 질환(특히 내이(inner ear) 질환), 청력 감소(hearing loss)(특히 급성 청력 감소), 손상된 유모 세포 부동섬모(stereocilia), 유모 세포 자멸(apoptosis), 소음 외상(noise trauma), 이염(otitis), 중이염(otitis media) 등의 치료 방법에 사용될 수 있다. 청력 감소 및 관련된 유모 세포 자멸은 JNK 억제가 스트레스 반응을 조절할 수 있고 예를 들어 세포 자멸을 봉쇄하는 세포를 위한 스트레스 환경으로부터 생성된 장애에 대한 비제한적 예시이다.
본 발명의 JNK 억제자는 또한 대사성 장애의 치료를 위해, 예를 들어 당뇨(제 1형 또는 제2형, 특히 제1형), 파브리병(Fabry disease), 고셰병(Gaucher disease), 저체온증(hypothermia), 이상 고열(hyperthermia), 저산소증(hypoxia), 지질 조직구증(lipid histiocytosis), 지방증(lipidoses), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 뮤코다당침착(mucopolysaccharidosis), 니만피크병(Niemann Pick disease), 비만(obesity), 및 울만병(Wolman's disease)의 치료를 위해 사용될 수 있다.
마찬가지로, 본 발명의 JNK 억제자는 신경, 신경 단위 및/또는 신경퇴행성 질환, 각각의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 질환의 예시는 예를 들어 알렉산더병(Alexander disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 뇌졸중(apoplexy), 모세혈관확장성운동실조증(Ataxia Telangiectasia), 잘리거나 분쇄된 엑손(axons), 축색절단(axotomy), 뇌병변장애(brain lesions), 샤르코마리투드병(Charcot-Marie-Tooth, CMT), 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration), 치매(dementia), 신경계통의 질환 또는 장애, 긴장 이상(dystonia), 간질(epilepsy), 파아버 증후군(Farber's disease), 프리드리히 운동실조증(Friedreich ataxia, SCA), 갱글리오사이드 축적증(gangliosidoses), 기엥 바레 증후군(Guillain-Barr'e syndrome), 유전성 강직성 하반신마비(hereditary spastic paraplegia), 히르슈슈프룽병(Hirschsprung's disease), 인체 면역결핍 파이러스 치매(human immunodeficiency virus dementia), 헌팅턴병(Huntington's disease), 뇌경색증(infarct of the brain), 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke), 크레베병(Krabbe disease), 레녹스가스토증후군(Lennox Gastaut Syndrome), 뇌회결손(lissencephaly), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes), 골수증(myelopathy), 에이즈 관련 신경퇴행성 질환(AIDS-related neurodegenerative diseases), 제2형 신경섬유종(neurofibromatosis type 2, NF-2), 뉴롤라디리즘(neurolatyerism), 신경세포 자가사멸(neuronal apoptosis), 신경세포사(neuronal death), 신경성 동통(neuropathic pain), 신경장애(neuropathy), 화학요법 유도 신경병증(chemotherapy induced neuropathy), 당뇨병 유도 신경병증(diabetes induced neuropathy), NMDA-유도 신경독증(NMDA-induced neurotoxicity), 통증, 파킨슨병(Parkinson's disease), 파킨슨증후군(parkinsonism), 픽병(Pick's Disease), 다발성신경장애(polyneuropathy), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy), 샌드호프병(Sandhoff disease), 척추뼈 갈림증(spina bifida), 발작, 테아삭병(Tay Sachs), TBI (광범위 축삭 상해(diffuse axonal injury)), 예를 들어 염증성 통증에 의해 유도된 어두운 뉴런의 치료, 웨스트 증후군(West Syndrome), 척추성 근위축증(spinal muscular atrophy) 등이다.
자가 면역 장애에 관하여, 본 발명의 JNK 억제자 펩타이드는 예를 들어 CNS의 자가면역질환, 자가염증성(auto-inflammatory)질환, 셀리악병(Celiac disease); 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome) 및 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus) 등의 치료 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제자로 치료될 수 있는 골 질환의 예시는 예를 들어 관절염(arthritis), 추간판 탈출증(disc herniation), 진행성 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressive, FOP), 골관절염(osteoarthritis), 골석화증(osteopetrosis), 골다공증(osteoporosis), 특히 당뇨 유도 골다공증(diabetes induced osteoporosis), 파제트병(Paget's Disease), 류마티스성 관절염 등이다.
본 발명의 JNK 억제자로 치료될 수 있는 피부 질환의 예시는 예를 들어 건선(psoriasis) 및 홍반성 낭창(lupus erythematosus)이다.
본 발명의 JNK 억제자로 치료될 수 있는 안구 질환은 예를 들어 연령과 관련된 황반 퇴화(age-related macular degeneration, AMD); 망막색소선조(angioid streaks); 전방허혈성시신경병증(anterior ischemic optic neuropathy); 전방포도막염(anterior uveitis); 백내장(cataract), 특히 연령과 관련된 백내장; 중심성 삼출성 맥락망막병증(central exudative chorioretinopathy); 중심성 장액성 맥락망막병증(central serous chorioretinopathy); 선립종안검맥립종(chalazion); 맥락막 결여(chorioderemia); 맥락막염(chorioiditis); 맥락막 경화증(choroidal sclerosis); 결막염(conjunctivitis); 모양체염(cyclitis); 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy); 안구 건조증(dry eye syndrome); 내안구염(endophthalmitis); 상공막염(episcleritis); 안구 감염(eye infection); 백색점상안저(fundus albipunctatus); 맥락막 및 망막의 우곡상위축(gyrate atrophy); 맥립종(hordeolum); 블레파라(blephara)의 염증성 질환; 맥락막의 염증성 질환; 모양체(ciliary body)의 염증성 질환; 결막(conjunctiva)의 염증성 질환; 각막의 염증성 질환; 홍채(iris)의 염증성 질환; 누선(lacrimal gland)의 염증성 질환; 안와골(orbital bone)의 염증성 질환; 공막(sclera)의 염증성 질환; 유리체(vitreous body)의 염증성 질환; 포도막(uvea)의 염증성 질환; 망막(retina)의 염증성 질환; 중간 포도막염(intermediate uveitis); 홍채염(irititis); 각막염(keratitis); 레베르병(Leber's disease); 다소성 맥락막염(multifocal choroiditis); 안 근육의 근염(myositis); 신생혈관 황반증(neovascular maculopathy) (예를 들어, 고도 근시(high myopia), 근시, 경사 디스크 증후군(tilted disc syndrome), 맥락막 골종(choroidal osteoma) 등에 의해 유발된); NMDA 유도 망막독성(retinotoxicity); 비 만성 또는 만성 염증성 안 질환(non-chronic or chronic inflammatory eye diseases); 오구치병(Oguchi's disease); 시신경 질환(optic nerve disease); 안와 봉와직염(orbital phlegmon); 전안구염(panophtalmitis); 전포도막염(panuveitis); 포스트 캡슐 혼탁(post caspule opacification); 후낭 혼탁(posterior capsule opacification, PCO) (백내장 수술 후 합병증); 후방 포도막염(posterior uveitis); 증식성 망막병증(proliferative vitreoretinopathy); 망막 동맥 폐색(retinal artery occlusion); 망막 박리(retinal detachment), 망막 질환(retinal diseases); 망막 상해(retinal injuries); 망막 거대혈관류(retinal macroaneurysm); 망막 색소 상피 분리(retinal pigment epithelium detachment); 망막 정맥 폐색(retinal vein occlusion); 망막염(retinitis); 색소성 망막염(retinitis pigmentosa); 백점상 망막염(retinitis punctata albescens); 망막병증(retinopathy), 특히 미숙(prematurity)의 망막병증(retinopathy) 및 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy); 공막염(scleritis); 스타르가르트병(Stargardt's disease); 염증이 생긴 안구 상처(inflamed ocular wounds) 및/또는 안구 상처 가장자리의 치료; 안구 수술 또는 외상 후 안내 염증(intraocular inflammation)의 치료; 포도막염(uveitis); 및 바이텔리폼 황반 영양실조(vitelliform macular dystrophy); 등을 포함한다.
본 발명에 개시된 JNK 억제자로 치료될 수 있는 구강 질환의 예시는 치주염(periodontitis), 특히 만성 치주염; 점막염(mucositis), 구강 박리성 장애(oral desquamative disorders), 구강 편평태선(oral liquen planus), 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 치수염(pulpitis); 구내염(stomatitis); 악관절 장애(temporomandibular joint disorder), 임플란트 주위염(peri-implantitis) 등이다.
마찬가지로 본 발명의 JNK 억제자는 - 다른 JNK 억제자를 위해 이미 앞서 제안됨 - 아쿠스티쿠스 신경초종 폐 암종(acusticus neurinoma lung carcinomas); 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia) (L1, L2, L3); 급성 림프성의 백혈병(acute lymphoid leukaemia, ALL); 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia, AML); 선암(adenocarcinomas); 항문암(anal carcinoma); 기관지암(bronchial carcinoma); 경부암(cervix carcinoma); 자궁경부암(cervical cancer); 성상 세포종(astrocytoma); 기저세포종(basalioma); Bcr-Abl 변환(transformation) 암; 방광암(bladder cancer); 아세포종(blastomas); 골암(bone cancer); 뇌 전이(brain metastases); 뇌 종양(brain tumours); 유방암(breast cancer); 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma); 암양종(carcinoids); 자궁경부암; 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia, CLL); 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukaemia, CML); 대장암(colon cancer); 결장암(colon carcinoma); 자궁체부암(corpus carcinoma); 두개인두종(craniopharyngeomas); CUP 증후군; 바이러스 유도 종양; EBV-유도 B 세포 림프종; 자궁내막암(endometrium carcinoma); 적백혈병(erytholeukemia) (M6); 식도암(esophagus cancer); 담낭암(gallbladder cancer); 위장암(gastrointestinal cancer); 위장관 간질종양(gastrointestinal stromal tumors); 위장 종양(gastrointestinal tumours); 비뇨생식기암(genitourinary cancer); 녹내장(glaucoma); 교아종(glioblastoma); 신경교종(gliomas); 머리/목 종양(head/neck tumours); B형 간염(hepatitis)-유도 종양; 간세포암(hepatocell carcinomas); 간종양(hepatomas); 헤르페스 바이러스(herpes virus) 유도 종양; 호즈킨 증후군(Hodgkin's syndrome); HTLV-1-유도 림프종(lymphomas); HTLV-2-유도 림프종; 인슐린종(insulinomas); 장암(intestinal cancer); 카포시 육종(Kaposi's sarcoma); 신장암(kidney cancer); 신장 암종(kidney carcinomas); 후두암(laryngeal cancer); 백혈병; 리드 종양(lid tumour); 간암(liver cancer); 간전이(liver metastases); 폐암(lung cancer); 림프암(lymphoid cancer); 림프종(lymphomas); 악성 흑색종(malignant melanomas); 유방암(mammary carcinomas); 외투세포림프종(mantle cell lymphoma); 수모세포종(medulloblastoma); 거핵아세포 백혈병(megakaryoblastic leukemia) (M7); 흑색종, 특히 악정 흑색종; 수막종(meningioma); 중피종(mesothelioma); 단구성 백혈병(monocytic leukemia) (MS); 다발성 골수종(multiple myeloma); 균상식육종(mycosis fungoides); 골수아구세포성백혈병(myeloblastic leukemia) (M1); 골수아구세포성백혈병 (M2); 골수단구성백혈병(myelomonocytic leukemia) (M4); 신경초종(neurinoma); 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas); 비-소세포암(non-small cell carcinoma); 폐의 비-소세포암; 식도암(oesophageal cancer); 식도 암종(oesophageal carcinoma); 희돌기교종(oligodendroglioma); 난소암(ovarian cancer); 난소 암종(ovarian carcinoma); 췌장암(pancreatic cancer); 췌장 암종(pancreatic carcinoma); 유두종 바이러스(papilloma virus)-유도 암종; 음경암(penis cancer); 점액 종양(pituitary tumour); 플라스마세포종(plasmocytoma); 전골수구성백혈병(promyelocytic leukemia) (M3); 전립선암(prostate cancer); 전립성 종양(prostate tumours); 직장 종양(rectal tumours); 직장 암종(rectum carcinoma); 신세포암(renal-cell carcinoma); 망막아종(retinoblastoma); 육종(sarcomas); 스크니버거병(Schneeberger's disease); 폐소세포암종(small cell lung carcinomas); 소장암(small intestine cancer); 소장 종양(small intestine tumours); 연성 조직 종양(soft tissue tumours); 척수종(spinalioma); 편평상피암(squamous cell carcinoma); 위암(stomach cancer); 고환암(testicular cancer); 인후암(throat cancer); 흉선종(thymoma); 갑상선암(thyroid cancer); 갑상선 암종(thyroid carcinoma); 설암(tongue cancer); 비분화된 AML (MO); 요도암(urethral cancer); 자궁암(uterine cancer); 질암(vaginal cancer); 폰 힙펠 린다우병(Von Hippel Linda disease); 외음암(vulval cancer); 윌름즈 종양(Wilms' Tumor); 및 색소성 건피증(Xeroderma pigmentosum); 등과 같은 암 및 종양 질환과 같은 증식성 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
JNK 신호전달은 또한 많은 심혈관 질환 및 장애에 관여하기 때문에, 이러한 질환의 치료에 JNK 억제자의 이용은 이미 과거에 제안되었다. 본 발명의 억제자는 따라서, 예를 들어 동맥성 고혈압(arterial hypertension); 동맥 경화증(arteriosclerosis); 동맥경화성 병변(arteriosclerotic lesions); 베체트 증후군(Behcet's syndrome); 혈관의 분기(bifurcations of blood vessels); 심장비대(cardiac hypertrophy); 심혈관비대(cardiavascular hypertrophy); 심근증(cardiomyopathies), 특히 화학적 방법으로 유도된 심근증; 뇌 빈혈(cerebral ischemia); 관상동맥성 심장 질환(coronary heart diseases); 복부대동맥(abdominal aorta)의 팽창(dilatation); 국소 뇌 허혈(focal cerebral ischemia); 전뇌 허혈(global cerebral ischemia); 심장 비대증(heart hypertrophy); 신장하부 동맥 고혈압(infrarenal aneurism hypertension); 국소빈혈(ischemia); 심근 경색(myocardial infarct), 특히 급성 심근 경색; 심근염(myocarditis); 래퍼퓨전(reperfusion); 재발협착증(restenosis); 맥관염(vasculitis); 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis); 등과 같은 심혈관 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제자는 심혈관 질환의 맥락에서 또한 관상 동맥 우회 수술 (CABG 수술); 경피적 경혈관 관상동맥 형성술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA); 및/또는 스텐트(stent) 치료에 보완하여, 예를 들어 상기 (외과적) 치료로부터 발생하는 내막 과증식(intimal hyperplasia)을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.
호흡기 시스템의 질환 및 특히 본 발명의 JNK 억제자로 효과적으로 치료될 수 있는 폐 질환은 예를 들어 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS); 천식(asthma); 호흡기 시스템과 관련된 만성 질병; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD); 낭포성 섬유증(cystic fibrosis); 염증성 폐 질환; 폐렴; 폐섬유증(pulmonary fibrosis); 등일 수 있다.
선행기술 내 억제자처럼 본 발명의 억제자는 또한 장관 질환, 예를 들어 대장염(colitis)(예를 들어 비전형적 대장염(atypical colitis), 화학적 대장염(chemical colitis); 교원성 대장염(collagenous colitis), 말단 대장염(distal colitis), 전환성 대장염(diversion colitis); 전격성 대장염(fulminant colitis), 부정성 대장염(indeterminate colitis), 전염성 대장염(infectious colitis), 허혈성 대장염(ischemic colitis), 림프구성 장염(lymphocytic colitis), 또는 미세 장염(microscopic colitis)), 크론병(Crohn's disease), 위장염(gastroenteritis), 히르슈슈프룽병(Hirschsprung's disease), 염증성 소화 질환(inflammatory digestive diseases); 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 몰버스 크론(Morbus Crohn), 비-만성 또는 만성 소화 질환, 비-만성 또는 만성 염증성 소화 질환; 지방성 장염(regional enteritis); 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 등의 치료를 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 JNK 억제자는 또한 예를 들어 박테리아 또는 바이러스 감염으로부터 발생하는 감염성 질환의 치료를 위한 치료적 제제(therapeutic agent)로서 제공될 수 있다. 본 발명에 개시된 JNK 억제자는 예를 들어 상기 감염에 의해 야기되는 염증성 반응을 예방 또는 개선할 수 있다. 이러한 질병 상태의 예시는, 이에 제한되는 것으로 여겨지지 않는, 바이러스성 뇌염; 바이러스 유도 암(예를 들어 상기 언급된), 인체 면역 결핍 바이러스 치매(human immunodeficiency virus dementia), 수막염(meningitis), 수막뇌염(meningoencephalitis), 뇌척수염(encephalomyelitis), 편도선염(tonsillitis) 등이다.
치료에 사용될 수 있는 본 발명의 JNK 억제자를 위한 많은 다른 질환, 질병 상태 및 장애, 예를 들어 알스코그 증후군(Aarskog syndrome), 아세트아미노펜 간독성(hepatotoxicity); 알더-레일리의 이상(Alder-Reilly anomaly); 원형 탈모증(alopecia areata); 알파-1-항트립신 결핍증(alpha-1-antitrypsin deficiency); 과민증(anaphylaxis); 세포자멸(apoptosis); 세포자멸성 세포 치사(apoptotic cell death); 비전형적 용혈성 요독성 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome); 바소페니아(basopenia); 호염기구증가(basophilia); 양극성 정동장애(bipolar disorders); 화상(burns); 세포의 전단 응력(cellular shear stress); 체디아크-히가시 증후군(Chedial-Higashi syndrome); 화학요법 약물(chemotherapeutic drugs)에 의한 DNA 손상; 담즙울체(cholestasis); 염색체 11, 부분 단염색체(Partial Monosomy) 11q; 염색체 22, 삼염색체 모자이크(Trisomy Mosaic); 만성육아종증(chronic granulomatous disease); 만성 또는 전격성 간염과 같은 간염; 임상 우울증(clinical depression); 공통 가변성의 저감마글로불린 혈증(common variable hypogammaglobulinemia); 선천성 C3 결핍(congenital C3 deficiency); 활성화 유도 세포 사멸(activation-induced cell death, AICD)로부터 CTL 보호; 난청(deafness); 우울증 및 우울증 장애(특히 우울증 장애의 예방은 사이토카인-유도 병 작용(sickness behaviour)의 배경에 발달한다), 흉선무형성(DiGeorge's syndrome); 결함이 있는 세포자멸에 의해 유발된 질환; 간 질환; 척추 질환; 자궁 질환; DNA 손상 물질(DNA damaging agents) 및/또는 이온화 방사선(ionizing radiation)에 노출 및 세포 스트레스 발생에 의한 질병 상태 및 증상; 다운 증후군; 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy); 외배엽 이형성증(ectodermal dysplasias); 자궁내막증(endometriosis); 호산구 감소증(eosinopenia); 호산 백혈구 증가증(eosinophilia); 흥분독성 세포 사멸(exocitoxic cell death); 태아기 알코올 증후군(fetal alcohol syndrome); 섬유증(fibrosis); 섬유증 질환(fibrotic disease); 섬유증 조직의 형성; 자유 라디칼 (세포 스트레스를 주도); 이식편 거부; 이식편대숙주 질환(Graft versus host Disease); 탈모(hair loss); 용혈성 요독성 증후군(hemolytic uremic syndrome); 간독성(hepatotoxicity); 당뇨 유도 통각 과민증과 같은 통각 과민증(hyperalgesia); 이상 고열(hyperthermia); 저혈당(hypoglycaemia); 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism); 특발성 과호산구성 증후군(idiopathic hypereosinophilic syndrome); IgA 신장해(nephropathy); 유아 성-연관 무감마글로불린혈증(agammaglobulinemia); 염증성 통증(inflammatory pain); 신장하부 동맥류(infrarenal aneyrism); 섬 재생(islet regeneration); 섬 이식(islet transplantation); 잡 증후군(Job's syndrome) (과도한(hyper)-lgE); 레이지 백혈구 증후군(lazy leukocyte syndrome); 백혈구 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 결핍증(leukocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency); 백질이영양증(leukodystrophy); 백혈구 감소증(leukopenia); 림프성 백혈구 증가증(lymphocytic leucocytosis); 림프구 감소증(lymphocytopenia); 림프구 증가증(lymphocytosis); 주우울증(major depression); 조증(mania); 조울증(maniac depression); 마르판 증후군(Marfan syndrome); 비만 세포증(mastocytosis); 메이 헤이글린 이상(May Hegglin Anomaly); 제2형 막성증식성 사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis Type II); 단구감소증(monocytopenia); 단구증가증(monocytosis); 미엘로퍼옥시다아제 결핍증-양성(myeloperoxidase deficiency-benign); 근질환(myopathies); 호중구 감소증(neutropenia); 호중구 증가증(neutrophilia); 네젤로프 증후군(Nezelof's syndrome); 장기 이식(organ transplantation); 산화 스트레스 상처(oxidative stress injuries); 펠거-호이트 이상(Pelger-Huet anomaly); 다낭 신증(polycystic kidney diseases); 후기-투석 증후군(post-dialysis syndrome); 방사선 증후군(radiation syndromes); 방사선 치료(radiotherapy); 신장병(renal diseases); 신장 부전증(renal failure); 활성화 유도 세포 사멸로부터 CTL 구제; 심한 결합 면역결핍 질환; 이식 거부(transplant rejection); 이식(transplantation); 삼염색체성(trisomy); 단극성 우울증(unipolar depression); UV-유도 상처; 비스코트 올드리치 증후군(Wiskott Aldrich syndrome); 상처 치료; 등이 있다.
본 발명의 발명자들은, 본 발명의 JNK 억제자로 치료에 특히 유용한, 측두하악관절장애(temporomandibular joint disorder), 점막염(mucositis), 구내염(stomatitis), 구강 편평태선(oral liquen planus) (박리성(desquamative) 장애), 심상성천포장(Pemphigus vulgaris) (박리성 장애), 치주염(periodontitis), 만성 치주염(chronic periodontitis), 치수염(pulpitis), 임플란트 주위염(peri-implantitis), 포도막염(uveitis) (전방 포도막염(anterior uveitis), 중간 포도막염(intermediate uveitis), 후방 포도막염(posterior uveitis)), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca) (안구 건조증), 관상동맥 우회수술(coronary artery bypass graft surgery, CABG surgery), 급성 심근 경색(acute myocardial infarction), 경피적 경혈관 관상동맥 형성술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)에 따른 내막 과증식(intimal hyperplasia)의 예방, 스텐트 교체에 따른 내막 과증식의 예방, 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis), COPD, 천식(asthma), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 크론병(Crohn's disease), 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 건선(psoriasis), 당뇨(diabetes), 뇌졸중(stroke), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 및 맥관염(vasculitis), 특히 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis)을 고려한다.
통상의 기술자는 상기 언급된 질병 상태 및 장애는 상기 언급된 질환 종류(classes)의 하나 이상에 속할 수 있음을 용이하게 알 것이다. 예를 들어, 기관지암(bronchial carcinoma)은 물론 증식성 질환뿐만 아니라 또한 폐 질환을 포함하는 호흡기 시스템의 질환의 그룹에 속할 수 있다. 따라서, 개인 질환의 상기 언급된 분류(classification)는 제한되거나 판단(concluding)되지 않으며, 단지 예시적 본성으로 고려된다. 한 종류에 재인용된 개인의 질병 상태는 사실상 또한 다른 종류의 질병 상태의 치료로 본 발명의 JNK 억제자의 처리를 위한 적절한 예시인 것을 배제하지 않는다. 통상의 기술자는 분류를 일치시키기 위해 다른 질병 상태 및 장애를 용이하게 할당(assigning)할 수 있다.
최종적으로, 상기 언급된, 본 발명은 다양한 질병 상태 및 장애의 치료를 위해 본 발명에서 정의된 JNK 억제자의 이용을 고려한다. 본 발명은 비인간 동물의 면역을 위해, 예를 들어 단일클론 항체의 생산을 위해 본 발명에서 정의된 JNK 억제자의 이용을 고려하지 않는다. 이러한 방법은 본 발명에서 테라피에 의한 동물 몸체의 치료 방법에 고려되지 않는다.
본 발명에 인용된 모든 참조는 참조로써 본 발명에 병합된다.
본 발명의 신규의 JNK 억제자 분자의 이용 및 테라피(therapy)는 인체 또는 동물 몸체의 치료 방법에 사용될 수 있다.
하기에 첨부된 도면의 간단한 설명이 주어진다. 도면들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 의도이다. 그러나, 그들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 대상을 제한하는 것은 아니다.
도 1: 체외 알파스크린 분석(AlphaScreen assay, Amplified Luminescence Proximity Homogeneous-Screen Assay)에 의해 조사된, 본 발명에 따르는 몇몇 JNK 억제자들의 억제 효율의 설명.
도 1A: SEQ ID NOs: 193, 2, 3, 5, 6, 및 7에 의한 JNK1의 억제.
도 1B: SEQ ID NOs: 193, 2, 3, 5, 6, 및 7에 의한 JNK2의 억제.
도 1C: SEQ ID NOs: 193, 2, 3, 5, 6, 및 7에 의한 JNK3의 억제.
도 2: 본 발명에 따르는 몇몇 JNK 억제자(SEQ ID NOs: 193, 2, 3, 5, 6, 및 7)의 억제 효율을 설명하는 표. nM의 범위에서 IC50 값, 각각 평균의 표준 오차 및 수행된 실험의 횟수(n)가 주어짐.
도 3: JNK 억제자 (폴리-)펩타이드 서열 및 수송체 서열의 융합 단백질인, 본 발명에 따르는 몇몇 JNK 억제자들의 억제 효율의 설명. 억제 효율은 체외 알파스크린 분석(Amplified Luminescence Proximity Homogeneous-Screen Assay)으로 결정되었다.
도 3A: SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 및 197에 의한 JNK1의 억제.
도 3B: SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 및 197에 의한 JNK2의 억제.
도 3C: SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 및 197에 의한 JNK3의 억제.
도 3D: SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 및 197에 의한 JNK1의 억제.
도 3E: SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 및 197에 의한 JNK2의 억제.
도 3F: SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 및 197에 의한 JNK3의 억제.
도 4: JNK 억제 (폴리-)펩타이드 서열 및 수송체 서열의 융합 단백질인, 본 발명에 따르는 몇몇 JNK 억제자들의 억제 효율을 설명하는 표. nM의 범위에서 IC50 값, 각각 평균의 표준 오차(SEM) 및 수행된 실험의 횟수(n)가 주어짐.
도 5: 50% 인간 혈청에서 SEQ ID NOs: 172, 196 및 197의 JNK 억제자 안정성. SEQ ID NO: 196의 JNK 억제자는 6시간 내에 아미노산 잔기들로 완전히 분해됨 (A). SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 14일 후에 완전히 분해됨 (B). SEQ ID NO: 197의 JNK 억제자는 적어도 30일까지 안정함 (B).
도 6: SEQ ID NO: 30에서 나타나는 것처럼 D-아미노산/L-아미노산 패턴으로 구성된 TAT 유래된 수송체를 사용한 내재화 실험을 보임. 수송체 서열은 SEQ ID NOs: 52-94 더하여 SEQ ID NOs: 45, 47, 46, 43 및 99 (도 6a) 및 SEQ ID NOs: 100-147 (도 6b)에 대응하여 분석되었다. 보이는 바와 같이, 공통 서열 rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31)의 모든 수송체는 L-TAT 수송체 (SEQ ID NO: 43)보다 높은 내재화 능력을 보였다. 헬라 세포(Hela cells)는 각각 수송체의 10mM로 96웰 플레이트에서 24시간 배양되었다. 세포는 이후 산성 버퍼 (0.2M 글리신, 0.1M NaCl, pH 3.0)으로 두번 및 PBS로 두번 세척되었다. 세포는 RIPA 용해 버퍼의 첨가로 부서졌다. 내재화된 펩타이드의 상대적인 양은 이후 배경 제거(background subtraction)에 따른 각 추출물의 형광 강도(Fusion Alpha plate reader; PerkinElmer)를 읽음으로써 결정되었다.
도 7 SEQ ID NO: 172의 서열의 JNK 억제자는 LPS 유도 사이토카인 및 THP1-PMA-분화된 대식세포에서 방출된 케모카인을 봉쇄하였다. 도 7A: TNF 방출 (THP1pma 6h 3ng/ml LPS); 도 7B: TNFα 방출 (THP1pma 6h 10ng/ml LPS); Fig. 7C: IL 6 방출 (THP1pma 6h 10ng/ml LPS); Fig. 7D: MCP1 방출 (THP1pma 6h 3ng/ml LPS).
도 8 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 D-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 197), dTAT (SEQ ID NO: 45) 및 SP　600125 보다 높은 능력을 갖는 THP1 분화된 대식세포에서 LPS 유도 IL6 방출을 봉쇄한다. LPS는 6시간 (10 ng/ml) 동안 첨가되었다.
도 9 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 D-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 197), dTAT (SEQ ID NO: 45) 및 SP　600125 보다 높은 능력을 갖는 THP1 분화된 대식세포에서 LPS 유도 TNFα방출을 봉쇄한다. LPS는 6시간 (10 ng/ml) 동안 첨가되었다.
도 10 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 D-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 197) 및 L-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 196) 보다 높은 능력을 갖는 PMA 분화된 대식세포에서 LPS 유도 IL-6 방출을 봉쇄한다. LPS는 6시간 동안 첨가되었다.
도 11 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 D-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 197) 및 L-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 196) 보다 높은 능력을 갖는 PMA 분화된 대식세포에서 LPS 유도 TNFα방출을 봉쇄한다. LPS는 6시간 동안 첨가되었다.
도 12 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 3 ng/ml에서 일차 랫 전체 혈액 세포(Primary Rat Whole Blood Cells)에 LPS 유도 TNFα방출을 봉쇄하였다. 다른 LPS (ng/ml) 수준에서 대조군, 1 μM의 SEQ ID NO: 172, 3 μM의 SEQ ID NO: 172, 및 10 μM의 SEQ ID NO: 172에 대한 결과가 주어진다.
도 13 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 PMA/이오노마이신(Ionomycin)에 반응하여 일차 인간 T-세포에 의한 IL2 분비를 봉쇄한다.
도 14 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 CD3/CD28 자극에 반응하여 일차 인간 T-세포에 의한 IL2 분비를 봉쇄한다. 사용된 JNK 억제자는 그들의 SEQ ID NO: 172 및 197에 의해 표시된다.
도 15 일차 랫(primary rat) 림프절 정제된 T 세포에서 방출된 CD3/CD28 유도 IL-2의 SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자에 의한 투여량(dose)-의존적 억제. 대조군 랫은 희생되어 림프절이 수득되었다. T 세포는 나아가 정제되고(자기 음성 선택을 사용) 200.000 cells/well로 96-웰 플레이트에 플레이트 되었다(plated). 세포는 안티-랫 CD3 및 안티-랫 CD28 항체(2μg/mL)로 처리되었다. SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 CD3/CD28 처리 1시간 전에 배지에 첨가되었고, IL-2 방출은 처리 24시간 후 상청액(supernatant)에서 측정되었다.
도 16 일차 랫 림프절 정제된 T 세포에서 방출된 CD3/CD28 유도 IL-2의 투여량-의존적 억제: 몇몇 JNK 억제자, 즉 SEQ ID NOs: 172, 197 및 SP600125의 비교.
도 17 PMA + 이오노마이신으로 자극된 랫 전체 혈액에서 IL2-방출의 투여량 의존적 억제. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 PMA + 아이오노마이신으로 자극 1시간 전 세가지 다른 농도, 즉 1, 3 및 10 μM에서 첨가되었다. 활성물의 세가지 투여량이 4시간 동안 첨가되었다(25/500 ng/mL, 50/750 ng/mL 및 50/1000 ng/mL). IL-2 방출은 상청액에서 측정되었다. 10μM에서 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 세가지 실험된 활성물 농도에서 PMA-아이오노 유도 IL-2 방출을 효율적으로 감소시켰다.
도 18 인간 전체 혈액에서 JNK 억제 및 IL-6 방출. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 4시간 동안 LPS (0.02ng/mL)으로 전체 혈액 자극 1시간 전에 세가지 다른 농도, 즉 1, 3 및 10 μM에서 첨가되었다. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 투여량 의존적 방식에서 LPS 유도 IL-6 방출을 감소시켰다.
도 19 인간 전체 혈액에서 JNK 억제 및 IL-2 방출. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 4시간 동안 PMA+아이오노마이신 (25/700ng/mL, 50/800ng/ml 및 50/1000ng/mL)으로 전체 혈액 자극 1시간 전에 세가지 다른 농도, 즉 1, 3 및 10 μM에서 첨가되었다. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 투여량 의존적 방식에서 PMA+아이오노마이신 유도 IL-2 방출을 감소시켰다.
도 20 인간 전체 혈액에서 JNK 억제 및 IFN-γ 방출. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 4시간 동안 PMA+아이오노마이신 (25/700ng/mL, 50/800ng/ml 및 50/1000ng/mL)으로 전체 혈액 자극 1시간 전에 세가지 다른 농도, 즉 1, 3 및 10 μM에서 첨가되었다. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 투여량 의존적 방식에서 PMA+아이오노마이신 유도 IFN-γ 방출을 감소시켰다.
도 21 인간 전체 혈액에서 JNK 억제 및 TNF-α방출. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 4시간 동안 PMA+아이오노마이신 (25/700ng/mL, 50/800ng/ml 및 50/1000ng/mL)으로 전체 혈액 자극 1시간 전에 세가지 다른 농도, 즉 1, 3 및 10 μM에서 첨가되었다. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 투여량 의존적 방식에서 PMA+아이오노마이신 유도 TNF-α방출을 감소시켰다.
도 22 인간 전체 혈액에서 JNK 억제 및 TNF-α방출. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 3일 동안 PHA-L (5μg/mL)으로 전체 혈액 자극 1시간 전에 세가지 다른 농도, 즉 1, 3 및 10 μM에서 첨가되었다. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 투여량 의존적 방식에서 PHA-L-유도 TNF-α방출을 감소시켰다.
도 23 인간 전체 혈액에서 JNK 억제 및 IL-2 방출. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 3일 동안 PHA-L (5μg/mL)으로 전체 혈액 자극 1시간 전에 세가지 다른 농도, 즉 1, 3 및 10 μM에서 첨가되었다. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 투여량 의존적 방식에서 PHA-L-유도 IL-2 방출을 감소시켰다.
도 24 인간 전체 혈액에서 JNK 억제 및 TNF-α방출. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 3일 동안 CD3 +/- CD28 항체 (2μg/mL)로 전체 혈액 자극 1시간 전에 세가지 다른 농도, 즉 1, 3 및 10 μM에서 첨가되었다. SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 투여량 의존적 방식에서 CD3/CD28 유도 TNF-α방출을 감소시켰다.
도 25 CFA(complete Freund's adjuvant(완전 프로이드 어주번트)) 유도 발 붓기(paw swelling) 이후 SEQ ID NO: 197 (10 μg/kg) 및 SEQ ID NO: 172 (10 μg/kg)인 JNK 억제자의 체내 항염증 특성의 사진 도해(Photograhic illustration). 발 붓기는 왼쪽 뒷발에 유도되었고, 오른쪽 뒷발은 처리되지 않았다.
도 26 CFA (완전 프로이드 어주번트) 유도 발 붓기 이후 SEQ ID NO: 197 (10 μg/kg, n=4) 및 SEQ ID NO: 172 (10 μg/kg, n=3)인 JNK 억제자의 체내 항염증 특성을 그래프로 표현. 나타낸 것은 처리 이후 왼쪽 뒷발의 둘레를 측정한 것이다.
도 27 CFA (완전 프로이드 어주번트) 유도 발 붓기 이후 SEQ ID NO: 197 (10 μg/kg) 및 SEQ ID NO: 172 (10 μg/kg) 인 JNK 억제자의 체내 항염증 특성을 그래프로 표현. 나타낸 것은 CFA 유도 발 붓기 한시간 이후 체내 사이토카인 방출을 측정한 것이다.
도 28 정맥내 투여 이후 알비노(albino) 랫(내독소 유도 포도막염 모델)에 SEQ ID NO: 172에 따른 JNK 억제자의 다른 투여량의 임상 평가. 왼쪽에서 오른쪽으로: 대조군(Vehicle), 0.015 mg/kg (i.v.) 의 SEQ ID NO: 172; 0.18 mg/kg (i.v.) 의 SEQ ID NO: 172; 1.8 mg/kg (i.v.) 의 SEQ ID NO: 172, 2 mg/kg (i.v.) 의 SEQ ID NO: 197 및 20 μg 덱사메타손(dexamethasone)(안구에 결막하 주사로 직접 투여). 나타낸 것은 임상적 점수이다(평균 및 SEM).
도 29 랫 만성 설립된(established) 제2형 교원성 관절염(Type II collagen arthritis) (RTTC/SOL-1)에서 14일내 매일 정맥내 투여한 이후 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자의 반응 효과. 보여진 것은 0일부터 14일까지 체중의 변화이다. 왼쪽에서 오른쪽으로: 일반 콘트레일(contrail) + 대조군(vehicle) (Nacl), 질병 대조군 + 대조군(vehicle) (NaCl), 5 mg/kg (i.v.) 의 SEQ ID NO: 172; 1 mg/kg (i.v.) 의 SEQ ID NO: 172; 0.1 mg/kg (i.v.) 의 SEQ ID NO: 172, 0.01 mg/kg (i.v.) 의 SEQ ID NO: 172, 0.05 mg/kg (i.v.) 의 덱사메타손. 나타낸 것은 임상적 점수(평균 및 SEM)이다. n= 4/일반 그룹, n=8/처리 그룹; 질병 대조군에 *p ≤0.05 일원 분산분석(1-way ANOVA) + 대조군(vehicle) (NaCl)
도 30 랫 만성 설립된 제2형 교원성 관절염(Type II collagen arthritis) (RTTC/SOL-1)에서 14일내 매일 정맥내 투여한 이후 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자의 반응 효과. 나타낸 것은 시간이 지남(내)에 발목 직경이다. n= 4/일반 그룹, n=8/처리 그룹; 질병 대조군에 *p ≤0.05 이원반복측정 분산분석(2-way RM ANOVA) + 대조군(vehicle) (NaCl).
도 31 랫 만성 설립된 제2형 교원성 관절염(Type II collagen arthritis) (RTTC/SOL-1)에서 14일내 매일 정맥내 투여한 이후 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자의 반응 효과. 그림으로 나타낸 것은 염증, 파누스(pannus), 연골 손상(cartilage damage) 및 골 흡수에 관한 발목 조직병리학적 점수이다. 처리군 내 n=8. 질병 대조군에 *p ≤0.05 만-휘트니 U 검증(Mann-Whitney U test) + 대조군(vehicle) (NaCl).
도 32 랫 만성 설립된 제2형 교원성 관절염(Type II collagen arthritis) (RTTC/SOL-1)에서 14일내 매일 정맥내 투여한 이후 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자의 반응 효과. 그림으로 나타낸 것은 염증, 파누스(pannus), 연골 손상(cartilage damage) 및 골 흡수에 관한 무릎 조직병리학적 점수이다. 처리군 내 n=8. 질병 대조군에 *p ≤0.05 만-휘트니 U 검증(Mann-Whitney U test) + 대조군(vehicle) (NaCl).
도 33 EIU 유도 및 EIU 유도 전 다른 시간에 SEQ ID NO: 172에 따른 JNK 억제자의 투여(1 mg/kg i.v.) 24시간 이후 슬릿 램프에 의한 임상적 점수화. 왼쪽에서 오른쪽으로: 대조군(vehicle) (0 시간); EIU 유도 4주 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 2주 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 1주 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 48시간 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 24시간 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 0시간 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 0시간 전 덱사메타손 (2 mg/kg i.v.). 평균 ± SEM. *p<0.05 대(versus) 대조군(vehicle), **p<0.01 대 대조군(vehicle).
도 34 구획 당 PMN 세포의 개수는 EIU 유도 및 EIU 유도 전 다른 시간에 SEQ ID NO: 172에 따른 JNK 억제자의 투여(1 mg/kg i.v.) 24시간 이후 정량되었다. 왼쪽에서 오른쪽으로: 대조군(vehicle) (0 시간); EIU 유도 4주 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 2주 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 1주 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 48시간 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 24시간 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 0시간 전 SEQ ID NO: 172; EIU 유도 0시간 전 덱사메타손 (2 mg/kg i.v.). 평균 ± SEM. *p<0.05 대(versus) 대조군(vehicle), **p<0.01 대 대조군(vehicle).
도 35 스코폴라민 유도 안구 건조증인 동물에 대한 TBUT AUC 값이 계산된 평균을 보임. 나타낸 것은 대조군(vehicle), SEQ ID NO: 197의 서열로 모든 D-레트로 인버소 JNK 억제자 (폴리-) 펩타이드의 3 다른 농도, SEQ ID NO: 172의 서열인 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 3 다른 농도로 처리된 동물에 대한 결과, 및 사이클로스포린으로 처리된 동물에 대한 결과이다.
도 36 스코폴라민 유도 안구 건조인 동물에 대한 계산된 PRTT AUCs 평균을 보임(7~21일). 나타낸 것은 대조군(vehicle), SEQ ID NO: 197의 서열로 모든 D-레트로 인버소 JNK 억제자 (폴리-) 펩타이드의 3 다른 농도, SEQ ID NO: 172의 서열인 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 3 다른 농도로 처리된 동물에 대한 결과, 및 사이클로스포린으로 처리된 동물에 대한 결과이다.
도 37 스코폴라민 유도 안구 건조증인 동물에 대한 조직학적 각막 병변 점수(Cornea Lesion Scores) 평균을 보임. 나타낸 것은 대조군(vehicle), SEQ ID NO: 197의 서열로 모든 D-레트로 인버소 JNK 억제자 (폴리-) 펩타이드의 3 다른 농도, SEQ ID NO: 172의 서열인 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 3 다른 농도로 처리된 동물에 대한 결과, 및 사이클로스포린으로 처리된 동물에 대한 결과이다.
실시예
하기에, 다양한 구현예(embodiments) 및 발명의 측면(aspects)를 설명하는(illustrating) 특정한 실시예가 존재한다. 그러나, 본 발명은 본 발명에 설명된 특정한 구현예에 의해 범위가 제한되는 것은 아니다. 실제로, 본 발명에 설명된 그들에 추가하여 발명의 다양한 변형은 앞서 말한 설명, 첨부 도면 및 하기 실시예로부터 통상의 기술자에게 용이하게 명백하게 될 것이다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 속한다.
실시예 1: JNK 억제자 SEQ ID NO: 172의 합성
설명에 도움이 되는 실시예로, SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자의 합성이 하기에 나타난다. 통상의 기술자는 상기 합성은 또한 본 발명에 따른 어느 다른 JNK 억제자의 합성에 사용되고 용이하게 적용될 수 있다는 것을 알 것이다.
SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 Fmoc(9-플루오레닐메틸옥시카보닐(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)) 전략을 사용하는 고체상 펩타이드 합성에 의해 제조되었다. 펩타이드 및 수지(resin) 사이의 링커(linker)는 링크 아미드 링커(Rink amide linker) (p-[Fmoc-2,3-디메톡시벤질]-페녹시아세트산(p-[Fmoc-2,3-dimethoxybenzyl]-phenoxyacetic acid))이다. 펩타이드는 연이은 Fmoc 탈보호 및 Fmoc-아미노산 짝지음 사이클에 의해 합성되었다. 합성의 마지막에, 완성된 펩타이드는 예비 역상 HPLC(preparative reverse phase HPLC)에 의해 정제된 이후, 직접적으로 조(crude) C-말단 아미드를 생산하기 위해 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)에 의해 쪼개졌다(cleaved). 정제된 분획은 이의 아세테이트 염을 얻기 위해 이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리된, 동종의 집단(homogeneous batch)에 모아졌다. 펩타이드는 이후 동결 건조되었다.
1.1 펩타이드의 고체상 합성
언급된 경우를 제외하고, 제조는 공기 여과된 환경에서 실온(22℃ ± 7℃)에서 일어났다. 합성의 규모는 수지에 약 1g의 정제된 펩타이드의 예상되는 생산을 위해 시작 아미노산의 0.7 mmoles 이다. 합성은 기계적 섞음(stirring) 및/또는 질소 버블링(bubbling)으로 프릿 디스크(fritted disk)가 장착된 30-50mL 반응기에 수동으로 수행되었다.
1.2 수지의 준비
p-메틸벤즈하이드릴아미드(p-methylbenzhydrylamide) 수지(MBHA-수지)는 우선 질소하에 디클로로메탄/디메틸포름아미드/디아이소프로필에틸아민으로 세척되었다. 세척된 수지는 이후 Fmoc-Rink 아미드 BMHA 수지를 생산하기 위해 PyBOB(벤조트리아졸-1-릴-옥시-트리스-피롤리디노-포스포니움 헥사플루오로포스페이트(benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium hexafluorophosphate))/ 디이소프로필-에틸아민/1-하이드록시벤조트리아졸(diisopropyl-ethylamine/1-hydroxybenzotriazole)에 링크 아미드 링커 (p-[Fmox-2,4-디메톡시벤질]-페녹시아세트산)와 짝지어졌다.
1.3 아미노산의 짝지음
아미노산은 하기 사이클을 사용하여 수지에 짝지어졌다:
Fmoc-Rink 아미드-MBHA 수지는 디메틸포름아미드 이후에, 35% (v/v) 피페리딘/디메틸포름아미드 내에 세척되어 탈보호되었다. 탈보호 반응은 대략 16분 걸렸다. Fmoc-보호된 아미노산 (예를 들어, 2 eq의 아미노산 및 디메틸포름아미드/디클로로메탄 (50/50) 내 HOBt (1-하이드록시벤조트리아졸(1-hydroxybenzotriazole)은 2 eq의 짝지음 제제 디이소프로필카보디이미드(diisopropylcarbodiimide, DIC)의 첨가 후에 수지에 첨가되었다. 짝지음 반응은 첨가되는 각각의 아미노산에 의존하여 1시간에서 하룻밤까지 걸렸다. 부피는 0.5 mL/100mg의 펩타이드-수지의 기본에 계산되었고 각 사이클 후에 조정되었다. 짝지음 이후, 수지는 DMF로 3회 세척되었다. 짝지음 완성도는 일차 아민에 닌하이드린 시험(ninhydrin test) (또는 카이져 시험 1(Kaiser test 1)) 및 2차 아민에 클로라닐 시험 2(chloranyl test 2)에 의해 실험되었다. 일부 경우에, 클로라닐 시험은 보안 통제(security control)로 닌하이드린 시험과 관련될 수 있다. 반응의 불완전성을 가리키는 짝지음 실험의 경우에, 짝지음은 디메틸포름아미드/디클로로메탄 및 디이소프로필에틸아민 내 아미노산, PYBOP, HOBT의 낮은 과잉 (0.5-1 eq)로 반복되었다. 수지의 기능성이, 수지의 본래 로딩(loading)에 의존하여 측정되었고 일반적으로 0.6-0.2 meq/g이다. 마지막 아미노산이 짝지어진 후에, 펩타이드 수지는 보통처럼 탈보호되고 이후 30℃ 진공하에 오븐 내 건조 전 DCM으로 5회 세척되었다. 펩타이드 수지가 건조된 이후, 고체상 합성의 양은 수지의 초기 로딩으로부터 계산된 이론적 무게 증가에 대해 펩타이드 수지의 무게 증가의 비율로 계산되었다. 수율(yield)은 100%에 가까울 수 있다.
1.4 분해(Cleavage) 및 탈보호(Deprotection)
펩타이드는 실온에서 4시간 동안, 또한 TFA/K 제제(agent)로 불리는, 트리플루오로아세트산/1,2-에탄디티올(1,2-ethanedthiol)/티오아니솔/물/페놀 (88/2.2/4.4/4.4/7 v/v)의 혼합물 내 수지로부터 분해되었다. 반응 부피는 펩타이드 수지의 1mL/100mg 였다. 반응물에 수지를 첨가하는 동안, 혼합 온도는 30℃ 이하로 유지되게 조절되었다.
1.5 수지로부터 펩타이드의 추출:
펩타이드는 플릿 디스크를 통해 여과에 의해 수지로부터 추출되었다. 이의 1/3 부피에 진공회전 농축(rotavapor) 상 농도 이후, 펩타이드는 차가운 t-부틸 메틸 에터에 의해 침전되고 여과되었다. 조단백질은 이후 30℃에서 진공하에 건조되었다.
1.6 조제용(Preparative) HPLC 정제:
조단백질은 이후 =95% 순도에 역상(reverse-phase) HPLC에 의해 정제되었다. 정제된 분획은 진공회전농축기(rotavaporator)에 농축되고 동결 건조되었다.
1.7 이온 교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography)
SEQ ID NO: 172의 서열로 정제된 펩타이드의 농축된 동결 건조된 풀(pools)은 물에 용해되고 Dowex 아세테이트, 50-500 메쉬(mesh) 수지 상 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
합성에 필요한 시작 반응물은 하기와 같다:
Figure pct00001
본 발명의 다른 JNK 억제자는 유사한 방법으로 준비될 수 있다.
실시예 2: 본 발명에 따른 선택된 JNK 억제자의 억제 효율
하기에 표준 수행 절차(operating procedure)가 본 발명에 따른 JNK 억제자의 억제 효율이 어떻게 측정되는지 설명하는 것이 제시될 것이다. 상기 방법은 비방사성 표준화된 분석 내, JNK에 의한 c-Jun 특이 기질의 인산화를 감소시키기 위한 후보 화합물의 능력을 체외 측정하는 것을 허용한다. 게다가, 이는 억제 효과 (IC50) 및 JNK에 선택된 화합물의 Ki를 어떻게 결정하는지 설명될 것이다. 상기 방법은 후보 화합물이 JNK 활성을 억제 또는 억제하지 않는지 검증하기에 적합하다. 그리고 통상의 기술자는 물론 그의 특정한 목적 및 필요를 위해 하기 방법을 어떻게 조정하는지 이해할 것이다.
2.1 재료
알파스크린(AlphaScreen) 반응물 및 플레이트(plate):
- His-JNK1 (ref 14-327, Upstate, 100 μl 내 10 μg: 농도: 2.2 μM) 5nM 최종
- His-JNK2 (ref 14-329, Upstate, 100 μl 내 10 μgl: 농도: 2 μM) 5nM 최종
- His-JNK3 (ref 14-501, Upstate, 100 μl 내 10 μg: 농도: 1.88 μM) 5nM 최종
- 안티-포스포-cJun(Anti-Phospho-cJun) (ref 06-828, Upstate, lot DAM1503356, 농도: 44.5 μM) 10nM 최종
- 비오틴-cJun(Biotin-cJun) (29-67):
서열: 비오틴 - SNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVG (SEQ ID NO: 198), lot 100509 (mw　4382.11, P 99.28%) H2O에 용해된, 농도: 10 mM) 30nM 최종
- ATP (ref AS001A, Invitrogen, lot 50860B, 농도 100 mM)) 5 μM 최종
- SAD 비드(beads) (ref 6760617M, PerkinElmer, lot 540-460-A, 농도 5mg/ml) 20 μg/ml 최종
- AprotA 비드 (ref 6760617M, PerkinElmer, lot 540-460-A, 농도 5mg/ml) 20 μg/ml 최종
- 옵티플레이트(Optiplate) 384웰 흰색 플레이트(white plate) (ref 6007299, PerkinElmer, lot 654280/2008)
- 펩타이드 희석을 위한 96웰 플레이트(ref 82.1581, Sarstedt)
- 탑씰-A(TopSeals-A) (ref 6005185, Perkin Elmer, Lot 65673)
- 생물발광(Bioluminescent) 에너지 전달 해독
- 생물발광 에너지 전달은 퓨전 알파 플레이트 리더(Fusion Alpha Plate reader) (Perkin Elmer) 상에 해독되었다.
피펫:
-전자 EDP3 피펫 20-300 (Ref 17007243; Rainin)은 효소-항체 혼합(Enzme-Antibody mix), 기질-ATP 혼합(the Subtrate-ATP mix) 및 비즈(Beads)로 플레이트를 채우기 위해 사용되었다.
-피펫맨®(PIPETMAN®) 울트라 멀티채널(Ultra multichannel) 8X20 (Ref 21040; Gilson)은 억제 화합물로 플레이트를 채우기 위해 사용되었다.
버퍼 및 용액
- 키나아제 버퍼: 20mM Tris-base pH 7.4, 10mM MgCl2, 1mM DTT, 100μM Na3VO4, 0.01% Tween, (1% DMSO)
- 정지 버퍼: 20mM Tris-base pH 7.4, 200mM NaCl, 80mM EDTA-K (NaOH 대신 KOH로 pH de 8), 0.3% BSA
- JNK 희석 키나아제 버퍼: 50mM Tris-base pH 7.4, 150mM NaCl, 0.1mM EGTA, 0.03% Brij-35, 270mM 수크로스, 0.1% β-메캅토에탄올.
2.2 방법
펩타이드의 억제 효과를 측정하기 위하여, 표준 알파스크린 분석(예를 들어 Guenat et al. J Biomol Screen, 2006; 11: pages 1015-1026 참조)이 수행되었다. 다른 구성요소들이 준비되었고 표시된 것처럼 지속적으로 혼합되었다. 플레이트들은 봉해졌고 하기에 따라 배양되었다:
5 μl JNK + 항체
5 μl TP 키나아제 + / - 억제자 전-배양 30 분
5 μl 비오틴-cJun + ATP 24℃에서 60분 배양
10 μl 비즈(Beads) SAD + A protA 24℃에서 어둡게 60분 배양
오염을 피하기 위해 혼합들은 웰의 다른 구석에 피펫으로 첨가되었다. 각 혼합으로 플레이트를 채운 후, 플레이트는 혼합이 웰의 벽 아래로 가도록 가볍게 두드려졌다(한쪽은 고정하고 다른 쪽은 테이블을 두드림).
생물발광 에너지 전달은 퓨전 알파 플레이트 리더 (Perkin Elmer) 상에 해독되었다.
모든 화합물은 JNK의 각 동종체(isoform)를 위한 3개 독립적 실험 내 적어도 세번 실험되어야 한다. 실험되는 화합물의 가능한 농도는 0, 0.03 nM, 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 μM, 3 μM, 10 μM, 30 μM, 및 100 μM이다. 대조군은 JNK가 없거나 기질(c-Jun)이 없는 샘플이다.
혼합 제조
JNK1, JNK2 및 JNK3 5nM
비오틴(Biotin)-cJun 30 nM
ATP 5μM; 항 포스포-cJun(Anti phospho-cJun) (S63) 10nM
Bille SAD/AprotA 20μg/ml
항체 [최종] = 10nM (항 포스포 cJun (S63))
검출 부분　: [믹스] X5 (25 μl의 최종 부피 내 5 μl)
[스톡(Stock)] = 44.5 μM (ref 06-828, Upstate, Lot DAM1503356)
10 nM → 키나아제 버퍼 내 50nM
JNK1, JNK2 및 JNK3 [최종] = 5nM
반응 부분　: [믹스] X3 (15 μl의 최종 부피 내 5 μl)
[스톡] = JNK1에 2.2 μM (ref 14-327, Upstate, lot D7KN022CU)
JNK2에 2.0 μM (ref 14-329, Upstate, lot 33221CU)
JNK3에 1.88 μM (ref 14-501, Upstate, lot D7CN041CU)
5 nM → 항체 버퍼 내 15nM
억제자:
반응 부분　: [믹스] X3 (15 μl의 최종 부피 내 5 μl)
[스톡] = 10 mM
100μM → 키나아제 버퍼 내 300 μM
30 μM → 키나아제 버퍼 내 90 μM
10 μM → 키나아제 버퍼 내 30 μM
...
0.03 nM → 키나아제 버퍼 내 0.09 nM
및 0 nM → 키나아제 버퍼
10회 연속적 희석의 두가지 시리즈는, 300 μM 내지 0 nM으로 시작하는 하나, 90 μM 내지 0.03 nM 두번째, 96 웰 플레이트에서 수행되었다. 펩타이드는 8 채널 멀티 피펫 (ref F14401, Gilson, 8X20)으로 384 플레이트에 첨가되었다.
ATP [최종] = 5 μM
반응 부분　: [믹스] X3 (15 μl의 최종 부피 내 5 μl)
[스톡] = 100 mM (ref AS001A, Invitrogen, lot 50860B)
5 μM → 키나아제 버퍼 내 15 μM
비오틴 c-Jun [최종] = 30nM
반응 부분: [믹스] X3 (15 μl의 최종 부피 내 5 μl)
[스톡] = 10 mM
30 nM → ATP 버퍼 내 30nM
비즈 SAD / A ProtA [최종] = 20 μg/ml (광 반응성)
검출 부분: [믹스] X 2.5 (25 μl의 최종 부피 내 10 μl)
[스톡] = 5 mg/ml → 20μg/ml 정지 버퍼 내 50μg/ml
암실(녹색 빛) 또는 어둠에서 혼합.
IC50 곡선의 분석:
분석은 하기 방정식으로 그래프패드 프리즘4(GraphPad Prism4) 소프트웨어를 통해 수행되었다:S자 모양의(Sigmoidal) 투여량-반응(제한 없음).
Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+10^((LogEC50-X)))
이상치(outliers) 데이터는 그루그 실험을 사용하여 회피되었다.
IC50의 비교:
분석은 하기 실험으로 그래프패드 프리즘4 소프트웨어를 통해 수행되었다: 투키 다중 비교 검정(Tukey's Multiple Comparison Test) 이후 일원(One way) ANOVA 실험. P<0.05은 현저하게 고려되었다.
JNK에 ATP의 Km 및 비오틴-cJun 특정 펩타이드의 Km은 알파스크린 표준화 분석 보고에서 결정되었다.
Ki 및 IC50 사이(Ki = IC50 / (1 + ([기질] / 기질의 Km))의 수학적 관계는 Ki 값을 계산하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 3: 내부화(Internalization) 실험 및 분석
3.1 흡수(uptake) 실험을 위한 재료 및 방법
a) 세포 라인(Cell line):
본 실험에서 사용된 세포 라인은 HL-60 (Ref CCL-240, ATCC, Lot 116523)이다
b) 배양 배지 및 플레이트
하기와 함께 05.05.2008에 보완된(complemented) RPMI (Ref 21875-091, Invitrogen, Lot 8296) 또는 DMEM (Ref 41965, Invitrogen, Lot 13481):
10% FBS (Ref A64906-0098, PAA, Lot A15-151): 04.04.2008에, 56℃에서, 30분 탈보완됨(decomplemented)
1mM 소듐 피루베이트(Sodium Pyruvate) (Ref S8636, Sigma, Lot 56K2386)
페니실린 (100 unit/ml)/스트렙토마이신 (100μg/ml) (Ref P4333, Sigma, Lot 106K2321)
PBS 10X (Ref 70011, Invitrogen, Lot 8277): 멸균 H2O로 1X로 희석
트립신-0.05% EDTA (Ref L-11660, PAA, Lot L66007-1194)
6 웰 배양 플레이트 (Ref 140675, Nunc, Lot 102613)
24 웰 배양 플레이트 (Ref 142475, Nunc, Lot 095849)
96 웰 배양 플레이트 (Ref 167008, Nunc, Lot 083310)
단백질 투여(dose)를 위한 96 웰 플레이트 (Ref 82.1581, Sarstedt)
형광 측정을 위한 96 웰 플레이트 (Ref 6005279, Perkin Elmer)
c) 용액
폴리-D-라이신 코팅 용액 (Sigma P9011 Lot 095K5104): PBS 1x 내 최종 희석된 25μg/ml
산성 세척 버퍼: 0.2M 글리신, 0.15M NaCl, pH 3.0
리파(Ripa) 용해 버퍼: 10mM NaH2PO4 pH 7.2, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mM EDTA pH 8.0, 200μM Na3VO2, 0.1% SDS, 1X 단백질 분해효소 억제자 칵테일(cocktail) (Ref 11873580001, Roche, Lot 13732700)
d) 현미경 및 형광 플레이트 리더
세포는 도립 현미경(inverted microscope) (Axiovert 40 CFL; Zeiss; 20X)을 사용하여 관찰되고 세어졌다. 형광은 퓨전 알파 플레이트 리더 (Perkin Elmer)로 해독되었다.
e) 방법
FITC 표시된 펩타이드 내부화는 현탁 세포에서 연구되었다. 세포는 1 x 106 cells/ml의 농도에서 폴리-DL-라이신 코팅된 접시로 플레이트 되었다. 플레이트는 이후 펩타이드의 알려진 농도의 첨가 전에, 37 ℃, 5 % CO2 및 100% 상대적인 습도에서 24시간 배양되었다. 펩타이드 첨가 이후, 세포는 37 ℃ , 5% CO2 및 100% 상대 습도에서 30분, 1, 6 또는 24시간 배양되었다. 세포들은 이후 세포 표면 흡수된 펩타이드를 제거하기 위해 산성 버퍼 (글리신 0.2 M, NaCl 0.15 M, pH 3.0)로 두번 세척되었다(Kameyama et al., (2007), Biopolymers, 88, 98-107 참조). 산성 버퍼는 종종 내부화 펩타이드의 과대 평가(overestimation)를 일으키는, 세포 표면에 강하게 흡착하는 염기성 아미노산이 풍부한 펩타이드로 사용되었다. 산성 버퍼를 사용한 세포 세척은 따라서 세포 표면 흡착된 펩타이드의 제거를 위해 수행될 수 있다. 산성 세척은 두가지 PBS 세척 이후에, Fab/세포 투과성 펩타이드 결합체의 세포성 흡수를 결정하는데 수행되었다. 세포는 RIPA 용해 버퍼의 첨가에 의해 부서졌다. 내부화 펩타이드의 상대적인 양은 이후 배경 제거(background subtraction) 및 단백질 함량 정상화(content normalization) 이후에 형광으로 결정되었다.
단계들은 따라서: 1. 세포 배양
2. 산성 세척 및 세포성 추출물
3. 형광 플레이트 리더로 펩타이드 내부화 분석
f) 세포 배양 및 펩타이드 처리(treatment)
6개 웰 배양 플레이트는 3ml의 Poly-D-Lys (PBS 내 Sigma P9011; 25 μg/ml), 600 μl로 24 웰 플레이트 및 125 μl로 96 웰 플레이트와 함께 코팅되고 37℃, CO2 5 % 및 100% 상대 습도로 4시간 동안 배양되었다.
4시간 이후 접시들은 각각 3.5ml PBS, 6, 24 또는 96 웰 플레이트에 700 μl 또는 150 μl PBS로 두번 세척되었다.
세포는 현탁 세포에 대해 1'000'000 cells/ml의 식재 밀도(plating densities)에 2.4 ml 배지(RPMI) 내 접시에 플레이트 되었다. 접종(inoculation) 이후, 플레이트는 펩타이드의 첨가 전에 24시간 동안 37℃, 5 % CO2 및 100% 상대 습도에서 배양되었다. 유착 세포(Adherent cell)는 처리한 날 90-95%의 농도여야 하고 DMEM에 플레이트 되었다:
Figure pct00002
세포는 FITC 표지된 펩타이드의 원하는 농도로 처리되었다(H2O 내 10 mM의 농도에 스톡 용액).
펩타이드를 첨가한 다음, 세포는 37 ℃, CO2 5 % 및 100% 상대 습도에서 0 내지 24 시간 (예를 들어 30분, 1, 6 또는 24시간) 배양되었다.
산성 세척 및 세포 추출물:
추출물은 얼음으로 냉각되었다.
현탁 세포(또는 접시에 웰에 부착되지 않은(which don attach well to the dish) 세포):
세포를 ≪팔콘(Falcon) 15 ml≫ 내로 이송. 세포의 최대를 회복하기 위해 1 ml의 PBS로 접시를 세척. 최대 2400 rpm에서 2분 세포를 수득.
1 ml 차가운 PBS에서 세포를 보류(Suspend).
코팅된 "에펜도프 튜브(Eppendorf tube)"(4시간 동안 1ml 폴리 D-Lys로 코팅되고 1ml PBS로 두번 세척된)로 세포를 이송.
1ml의 차가운 산성 세척 버퍼로 세번 세척 및 최대 2400 rpm으로 2분 원심분리. "에펜도프" 내 세포의 확산에 주의.
중성화를 위해 1ml 차가운 PBS로 두번 세척.
용해 RIPA 버퍼의 50 μl 첨가.
교반과 함께 얼음에 30분-1시간 배양.
유착 세포:
차가운 산성 세척 버퍼의 3 ml, 1 ml 또는 200 μl (각각 6, 24 또는 96 웰 플레이트)로 세번 세척. 접시로부터 분리되는 세포를 주의.
중성화를 위해 1ml 차가운 PBS (각각 6, 24 또는 96 웰 플레이트)로 두번 세척.
용해 RIPA 버퍼 50 μl 첨가.
교반과 함께 얼음에 30분-1시간 배양.
차가운 스크래퍼(scrapper)로 세포를 스크랩(scrap). 24 및 96 웰 플레이트는 세포 파편(cellular debris)을 제거하기 위해 15분 동안 4℃에서 4000rpm으로 직접 원심분리되었다. 이후 상청액(supernatant)(24 또는 96 웰 플레이트에 각각 100 또는 50ml)은 어두운 96 웰 플레이트에 직접 이송되었다. 플레이트는 형광 플레이트 리더 (퓨전 알파, Perkin Elmer)에 의해 해독되었다.
코팅된 "에펜도프"(4시간 동안 1ml의 폴리 D-Lys로 코팅되고 1ml PBS로 두번 세척) 내 용해물(lysate) 이송
용해된 세포들은 이후 세포 파편을 제거하기 위해 4 ℃에서 10000 g에서 30분 원심분리되었다.
상청액 제거 및 코팅된 "에펜도프 튜브" (4시간 동안 1ml의 폴리 D-Lys로 코팅되고 1 ml PBS로 두번 세척됨) 내 -80 ℃에서 이를 저장.
형광 플레이트 리더로 펩타이드 내부화의 분석:
각 단백질 추출물의 양은 제조자의 지시 이후에 표준 BCA 분석(Kit N°3225, Pierce)에 의해 결정된다.
각 샘플의 상대적인 형광은 형광 플레이트 리더(Fusion Alpha, Perkin Elmer) 내 10 μl의 각 샘플을 해독, 배경 제거 및 단백질 농도에 의한 일반화한 이후 결정되었다.
3.2 흡수 실험
HL-60 세포 라인의 세포 내로 FITC-표지된 TAT 유래된 수송체 구성물의 시간 의존적 내부화(흡수)는 SEQ ID NOs: 52-96, 43, 및 45-47의 서열 수송체 펩타이드를 사용하여 상기 설명된 것처럼 수행되었다. 이들 서열은 표 4 내 아래 나타냈다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
상기 표에서 D 아미노산은 각각 아미노산 잔기 전에 소문자 "d"에 의해 표시된다(예를 들어 dR=D-Arg).
몇몇 서열 합성은 불행히도 기술적인 이유로 인해 첫번째 접근 방법에서 실패하였다. 이들 서열은 표 6에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 43, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 85, 86, 87, 88, 89, 및 90로 축약되었다. 그러나, 잔여 서열은 내부화 실험에서 사용되었다.
결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 배양 24시간 이후, 공통 서열 rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31)인 모든 수송체는 L-TAT 수송체 (SEQ ID NO: 43).에 비해 높은 내부화 능력을 보였다. 헬라 세포(Hela cells)는 10mM의 r3-L-TAT-유래된 수송체로 96 웰 플레이트에서 24시간 배양되었다. 세포는 이후 산성 버퍼 (0.2M 글리신, 0.15M NaCl, pH 3.0)으로 두번 및 PBS로 두번 세척되었다. 세포는 RIPA 용해 버퍼의 첨가에 의해 부서졌다. 내부화된 펩타이드의 상대적인 양은 그다음 배경 제거 이후 각 추출의 형광 감도(Fusion Alpha plate reader; PerkinElmer)를 해독함으로써 결정되었다.
도 6에 나타나는 바와 같이, 한 위치는 가장 높은 수송체 활성 및 수송체 활성의 향상된 속도(kinetics)에 중요한 것으로 보인다: 위치 2 내 Y (SEQ ID NO: 142에 대응하는 펩타이드 N°1).
본 실험의 결론은 다음과 같다:
·배양 24시간 이후, 공통 서열 rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31) (가능한 서열의 선택을 위해 표 2 참조)인 모든 수송체는 L-TAT 수송체 (SEQ ID NO: 43) (도 6)에 비해 높은 내부화 능력을 보였다. 그들 결과는 완전히 공통 서열 rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31)을 입증하였다(validate).
·한 위치는 가장 높은 수송체 활성에 중요하며 (도 6): 위치 2 내 Y (SEQ ID NO: 142에 대응하는 서열 91)
따라서, 표 4에서 나타난 이러한 TAT 유래된 서열은 위치 2 내 Y를 보이며, 특히 서열이 9 aa를 전시 및 공통 서열 rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31)을 가질 때, 바람직하다.
실시예 4: 사이토카인 및 케모카인 방출의 측정
하기 절차는 인체 세포 (혈액, WBC, PBMC, 정제된 일차 림프구(primary lymphocytes), 세포 라인, ...)로부터 리간드 유도 분비 이후 몇몇 인체 사이토카인의 방출된 양을 어떻게 측정하는지에 대한 설명이 제시될 것이다.
사용된 기술은 항체의 두 층 사이의 항원의 양을 측정하는 (즉 항원을 포획 및 검출) 샌드위치 ELISA(Sandwich ELISA)이다. 측정되는 항원은 적어도 두개의 항체가 샌드위치에서 활동하기 때문에, 반드시 항체에 결합할 수 있는 적어도 두개 항원 자리를 포함해야 한다. 단일클론성 또는 폴리클론성 항체는 샌드위치 ELISA 시스템에서 항체를 포획 및 검출하는데 사용될 수 있다. 단일클론성 항체는 항원의 세밀한 검출 및 작은 차이를 정량하는 하나의 항원 결정기를 인지한다. 폴리클론성은 종종 가능한 많은 항원을 허물기(pull down)위한 항체 포획으로 사용된다. 샌드위치 ELISA의 장점은 샘플이 분석 전에 정제될 필요가 없으며, 분석이 매우 민감할 수 있는 것이다 (직접 또는 간접 보다 2 내지 5배 더욱 민감한).
상기 방법은 체외/세포 배양에서 본 발명의 JNK 억제자의 효과를 결정하는데 사용될 수 있다. 비독성 투여량에서, 화합물 효율은 비 처리된 샘플에 비해 사이토카인 수준의 감소에 의해 표시되고 (광학 농도의 변화 (450 nm에서 흡수)), ELISA에 의해 감시된다. 결과는 ng/ml로 나타난다.
4.1 재료
· 96 웰 플레이트:
상청액 수집에 대해 (Ref 82.1581, Sarstedt)
ELISA에 대해 (F96 maxisorp, Ref 442404, Nunc)
· 탑씰-A: 96웰 마이크로플레이트 씰 (Ref 600585, PerkinElmer).
ELISA 시약
코팅 버퍼 ELISA: 0.1M Na카보네이트(NaCarbonate) pH 9.5 (= 7.13g NaHCO3 (ref 71627, Fluka) + 1.59g Na2CO3 (ref 71345, Fluka) 1리터 H2O 내, 농축된 NaOH로 pH 9.5까지)
세척 버퍼 ELISA: PBS 1X + 0.01% Tween20. 1 리터 PBS 1X (PBS10X: ref 70011, GIBCO) 준비 및 자기 교반기(magnetic agitator)로 혼합하는 동안 100ul 의 Tween20 (ref P1379, Sigma) 천천히 첨가)
분석 희석용액(Assay diluent): PBS 1X + 10% FBS (Ref A15-151, PAA, 30분, 56℃에서 탈보완됨).
DAKO TMB (ref S1599, DAKO): 상업상의 기질 용액
정지 용액: 1M H3PO4 (→ 200ml에 대해 = 177ml H2O + 23ml H3PO4 85% (ref 345245, Aldrich).
· ELISA 키트 (20 플레이트에 대한 시약)
IFN-γ: Human IFN-γ ELISA 세트, BD OptEIA™ (ref 555142, DB).
IL-1β: Human IL-1β ELISA 세트 II, BD OptEIA™ (ref 557953, BD)
IL-10　: Human IL-10 ELISA 세트 II, BD OptEIA™ (ref 555157, DB).
IL-12　: Human IL-12 (p70) ELISA 세트, BD OptEIA™ (ref 555183, DB).
IL-15　: Human IL-15 ELISA 세트, BD OptEIA™ (ref 559268, DB).
IL-2: Human IL-2 ELISA 세트, BD OptEIA™ (ref 555190, DB).
IL-4　: Human IL-4 ELISA 세트, BD OptEIA™ (ref 555194, DB).
IL-5　: Human IL-5 ELISA 세트, BD OptEIA™ (ref 555202, DB).
IL-6: Human IL-6 ELISA 세트I, BD OptEIA™ (ref 555220, DB).
IL-8: Human IL-8 ELISA 세트, BD OptEIA™ (ref 555244, DB).
MCP-1: Human MCP-1 ELISA 세트, BD OptEIA™ (ref 555179, BD)
TNF-α: Kit human TNF ELISA 세트, BD OptEIA™ (ref 555212, DB).
· 흡수 해독(Absorbance reading): 흡수는 퓨전 알파 플레이트 리더 (Perkin Elmer)로 해독됨.
· 피펫, 디지털 피펫 또는 멀티채널 피펫의 반복.
4.2 방법
샘플의 준비
샘플은 배양된 인체 세포 (전형적으로 전혈, WBC, PBMC, 정제된 WBC의 서브타입, 암 세포 라인)로부터 배양 배지 상청액이다. 원심분리에 의해(400g 5분 4℃) 어느 미립자 물질을 제거 및 즉시 분석 또는 ≤ -20℃에 샘플을 저장. 반복된 냉동-해동 사이클을 회피.
사용 1시간 전, 얼음에 샘플을 해동하고 그들을 원심분리함. 11 단계에서, 직접 플레이트 내로 분석 희석용액(assay diluent) 내 샘플을 희석 (우선 분석 희석용액, 이후 샘플 첨가 및 위 및 아래로 피펫):
표준(standard)의 준비
실온에 냉동 건조된 표준을 따듯하게 한 후, 재료의 손실을 피하기 위해 조심스럽게 바이알을 오픈. 스톡 표준을 생산하기 위해 탈이온화된 물의 제안된 부피로 냉동 건조된 표준을 재구성(Reconstitute). 희석액을 만들기 전에 적어도 15분 동안 평형을 위해 표준을 허용함. 혼합을 위해 부드럽게 볼텍스(Vortex). 재구성 이후, 즉시 부분 표본(aliquot) 표준은 바이알 당 50 μl에 폴리프로필렌 바이알에 저장 및 6개월 동안 -20℃에서 동결. 만약 필요하다면, 부분 표본화(aliquotting)/동결 전 8시간 동안 2-8℃에 저장. 실온에 재구성된 표준을 남겨두지 않음.
사용 전 즉시, 시약 희석용액 내 2배 계열 희석(serial dilutions)을 사용하여 10 점 표준 곡선을 준비. 4000 pg/ml의 높은 표준이 추천됨.
검출자 혼합(Mix)의 준비
비오틴/SAv 시약의 일단계 배양. 분석 희석액에 검출 항체의 요구되는 부피 첨가. 사용하기 전 15분 이내, 효소 시약(Enzyme Reagent)의 요구되는 양을 첨가, 볼텍스 또는 잘 혼합. 추천되는 희석액에 대해, 많은 특정한 지시(Instruction)/분석 증명서(Certificate)를 참조. 사용 후 남아있는 작업 검출자(Working Detector)를 폐기.
포획 항체로 코팅(Coating with Capture Antibody)
1. 코팅 버퍼 내 희석된 포획 항체의 웰 당 100 μL로 PVC 마이크로티터 플레이트(microtiter plate)의 웰을 덮어 씌움. 추천되는 항체 코팅 희석액은, 많은 특정한 지시/분석 증명서를 참조.
2. 접착성 플라스틱으로 플레이트를 덮어 씌우고 4℃에서 하룻밤 배양.
3. 코팅 용액의 제거 및 150μl 세척 버퍼로 웰을 채움으로써 플레이트를 세척.
4. 용액 또는 세척은 싱크에(sink) 플레이트를 가볍게 침으로써 제거되었다.
5. 총 세번 세척을 위해 절차를 2회 반복.
6. 마지막 세척 후, 종이 타월에 플레이트를 톡톡 가볍게 침으로써 남은 세척 버퍼를 제거.
봉쇄(Blocking)
7. 웰 당 100μl 시약 희석액을 첨가함으로써 코팅된 웰 내 남은 단백질 결합 자리를 봉쇄.
8. 접착성 플라스틱으로 플레이트를 덮어 씌우고 실온에서 1시간 배양.
9. 배양 동안 표준을 준비하기 시작.
샘플의 첨가
10. 150μl의 세척 버퍼로 단계 3에서처럼 한번 세척함. 플레이트는 샘플 첨가를 위해 이제 준비.
11. 각 웰에 분석 희석액 내 50 μl 의 적절하게 희석된 샘플을 첨가. 정확한 정량 결과를 위해, 항상 표준 곡선의 그들에 대항하여 알려지지 않은 샘플의 신호를 비교. 표준 (3배) 및 블랭크(blank)는 정확성을 보증하기 위해 반드시 각 사이토카인으로 실행되어야 한다.
12. 접착성 플라스틱으로 플레이트를 코팅하고 실온에서 2시간 배양.
검출 항체 및 2차 항체와 배양
13. 단계 3과 같이 150 μl 세척 버퍼로 네번 플레이트를 세척.
14. 추천되는 희석액에서 (많은 특정한 지시/분석 증명서를 참조) 각 웰에 50 μl의 검출자 MIX (항체 검출 + 분석 희석액 내 2차 스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP 항체) 첨가.
15. 접착성 플라스틱으로 플레이트를 코팅하고 광 보호(light protect) 실온에서 1시간 동안 배양.
16. 3단계에서처럼 150 μl 세척 버퍼로 플레이트를 여섯번 세척.
17. 각 웰에 50 μl DAKO TMB 용액을 첨가, 어둠 속에, 봉하지 않고, 실온에서 15-20 분 동안 배양.
18. 각 웰에 50 μl 의 정지 용액을 첨가. 혼합을 통해 보장을 위해 플레이트를 가볍게 두드림.
19. 플레이트 믹서에 500rpm에서 5분 플레이트를 혼합.
20. 450 nm에서 광학 밀도를 해독. (프로그램: 퓨전 알파 플레이트 리더에 사이토카인_ELISA)
데이터 분석
각 표준 대조군 및 각 샘플에 대해 평균 세번(triplicate)의 해독. 평균 제로 표준 광학 밀도 (O.D) 차감(subtract). 사이토카인 농도의 log 대(versus) O.D의 로그를 구성하는(plotting) 표준 곡선을 생성 및 베스트 핏 라인은 회귀 분석으로 결정될 수 있음. 만약 샘플이 희석될 경우, 표준 곡선으로부터 농도 해독은 희석 요소에 의해 반드시 곱해져야 된다. 표준 곡선은 분석된 샘플의 각 세트를 위해 생성되어야 한다. 이상치 데이터는 그룩 실험(Grugg's test)을 사용하여 회피되어야 한다. 이후 두번 SD의 간격에 없는 데이터는 폐기되었다. 만약 양성 대조군(control)이 앞서 관찰된 데이터를 보이는 경우 독립적인 실험이 고려된다. 독립적 실험들은 모아졌다(pooled) (N > 3).
데이터는 억제자 처리없이 유도된 조건에 비해, pg/ml의 사이토카인 방출 또는 % 내에 나타난다.
실시예 5: THP1 분화 - 사이토카인 방출을 위한 자극
하기 절차는 자극 유도 사이토카인 방출을 감소시키기 위해, 6시간 동안 LPS에 의해 장애가 있는(challenged) 인간 PMA 분화된 THP1 세포로부터 사이토카인의 생산이, 본 발명의 JNK 억제자, 특히 SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자의 능력을 실험하기 위해 어떻게 유도되는지 설명하는 것을 제시할 것이다. THP1 세포는 사이토카인 방출의 판독(readout)을 위해 다른 리간드에 의해 생체 밖에서 자극되었다. 비독성 투여량에서, JNK 억제자 효율은 비 처리된 샘플과 비교하여 사이토카인 수준의 감소에 의해 표시되며 ELISA에 의해 감시된다. 화합물의 독성은 보라색을 내는, 포르마잔(formazan)에 트레타졸리움 염(tretazolium salt, MTS)의 감소에 의해 평가된다.
절차:
a. 재료
· 세포 라인: THP-1 (Ref TIB-202, ATCC, lot 57731475)
· 배양 배지, 시약 및 플레이트
하기로 보완된 RPMI (Ref 21875-091, Invitrogen):
10% FBS (Ref A15-151, PAA): 56℃에서, 30 분 탈보완됨.
10mM Hepes (Ref H0887, Sigma)
50μM β-메캅토에탄올(mercaptoethanol) (Ref 63690, Fluka　: stock at 14.3M): -20℃에서 PBS 스톡 내 50mM 부분 표본의 560 l 첨가)
1mM 소듐 피루베이트(Sodium Pyruvate) (Ref S8636, Sigma)
페니실린 (100unit/ml) / 스트렙토마이신 (100μg/ml) (Ref P4333, Sigma)
RPMI 배지는 이후 0.22 M 필터로 여과됨 (Ref SCGPU05RE, Millipore).
PBS 10X (Ref 70011, Invitrogen): 멸균 H2O로 1X로 희석됨
DMSO: Ref 41444, Fluka
PMA (포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate), Ref P1585, Sigma, -20℃에서 DMSO 내 농도 1mM = 616.8ug/ml). RPMI (10ml 배지 내 1ul) 내 100nM의 최종 농도에 직접 사용.
LPS 울트라퓨어(ultrapure) (리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide), Ref tlrl-eklps, Invivogen, 농도 5mg/ml): LPS의 스톡 용액: 4℃에서 PBS 내 3 g/ml. RPMI 배지 내 40ng/ml의 4X 농축된 용액(최소 1800 l/플레이트; 5 플레이트에: 125 l의 LPS 3g/ml + 9250 l RPMI)을 준비하기 위해 직접 사용.
96 웰 플레이트:
유착 세포 배양을 위해 (Ref 167008, Nunc)
상청액 수집을 위해 (Ref 82.1581, Sarstedt)
ELISA를 위해 (F96 maxisorp, Ref 442404, Nunc)
코팅 용액: 폴리-D-라이신 (Ref P9011, Sigma): PBS 1x 내 최종 희석된 25 g/ml.
· ELISA 시약 및 키트
코팅 버퍼 ELISA: 0.1M Na카보네이트(NaCarbonate) pH 9.5 (= 7.13g NaHCO3 (ref 71627, Fluka) + 1.59g Na2CO3 (ref 71345, Fluka) 1리터 H2O 내, 농축된 NaOH로 pH 9.5)
세척 버퍼 ELISA: PBS 1X + 0.01% Tween20 (ref P1379, Sigma, lot 094K0052)(= 1 리터 PBS 1X의 준비 및 자기 교반기로 혼합하는 동안 천천히 100ul의 Tween20 첨가)
분석 희석액: PBS 1X + 10% FBS (Ref A15-151, PAA, 56℃에서, 30 분 탈보완됨).
DAKO TMB (ref S1599, DAKO): 상업상의 기질 용액
정지 용액: 1M H3PO4 (→ 200ml에 대해 = 177ml H2O + 23ml H3PO4 85% (ref 345245, Aldrich).
TNF- : 키트 인간 TNF ELISA 세트, BD OptEIA (ref 555212, DB).
· 세포 독성 측정: CellTiter 96 시약 (ref G3581, Promega)
· 대조군 화합물: SP600125 (ref ALX-270-339-M025, Alexis, 농도: 20mM DMSO)
· 흡수 해독: 흡수는 퓨전 알파 플레이트 리더 (Perkin Elmer) 상에 해독됨.
· 피펫, 디지털 피펫 또는 멀티채널 피펫을 반복.
· 탑씰-A: 96웰 마이크로플레이트 씰 (Ref 600585, PerkinElmer).
b. 방법
웰 코팅
플레이트는 200 l의 폴리 D-라이신 (1x)으로 코팅되었고 37℃, CO2 5% 및 100% 상대 습도에서 2시간 배양되었다.
세포 플레이팅(plating)
2시간 이후 웰은 200 l PBS 1X로 두번 세척되었다(즉시 사용 또는 37℃에서 200 l의 PBS 1X와 사용까지 남김, 단 3일 이하).
세포는 세어졌다. 바람직한 세포의 수가 얻어졌고 1'000'000 cells/ml의 희석액을 얻기에 필수적인 배지(media)의 양에 재현탁되었다. 100nM의 PMA는 현탁 단핵구로부터 유착 대식세포까지 THP1의 분화를 유도하기 위해 첨가되었다. 세포는 100'000세포/웰의 플레이팅 농도에 100 l 배지 내 웰로 플레이트 되었다. 접종 이후, 플레이트들은 그들을 분화시키기 위해 실험 약물의 첨가 전에, 37℃, 5% CO2및 100% 상대 습도에서 3일 배양되었다.
세포 처리
3일 후, 유착 세포들은 현미경으로 관찰되었다. PMA를 포함하는 배지는 흡기되고(aspirated) PMA 없이(PBS 1X로 세척하는 단계 없이) 100 l의 신선한 RPMI로 교체되었다.
실험 약물은 H2O 또는 DMSO내 10 mM의 농도로 준비되었으며 -80℃에서 저장되었다. 매일 사용 전, JNK 억제자의 하나의 부분 표본은 RPMI 배지 내 4X 농축된 용액 (120 M)에, 이후 RPMI 내 원하는 농도에 도달하기 위해 해동 및 희석되었다. SP600125는 RPMI 배지 내 4X 농축된 용액 (40 M)에, 이후 0.8% DMSO를 포함하는 RPMI 내 원하는 농도에 도달하기 위해 희석되었다.
플레이트는 50 l의 배지 또는 4X 최종 원하는 약물 농도의 용액으로 처리되었다(JNK 화합물에 대해 최종 0, 100nM, 1, 3, 10 or 30 M 또는 SP600125 양성 대조군에 대해 최종 0, 10, 100nM, 1, 3 또는 10 M). 약물 첨가 이후, 플레이트는 37℃, 5% CO2 및 100% 상대 습도에서 추가적으로 1시간 동안 배양되었다.
1시간 이후, TNF의 방출은 LPS 울트라퓨어(ultrapure)의 4X 농축된 희석액(최종 3ng/ml)의 50 l의 첨가에 의해 유도되었다.
분석
6시간 이후, 100 l의 상청액은 새로운 96 웰 플레이트로 이송되었다. 이들 플레이트는 밀봉되고 사이토카인의 방출의 ELISA (예를 들어 실시예 4 참조)에 의해 분석될 때까지 -20℃에서 저장되었다.
화합물의 세포독성 효과는 MTS 흡수에 의해 측정되었고 (예를 들어 실시예 4 참조) 세포는 도립 현미경을 사용하여 관찰되었다 (Axiovert 40 CFL; Zeiss; 10X).
데이터 분석
데이터의 분석은 ELISA에 나타낸 바와 같이 수행된다(실시예 4 참조). 간단히, ELISA에 대해: 각 표준 대조군 및 각 샘플에 대해 평균 세번 해독. 평균 제로 표준 광학 밀도 (O.D) 차감(subtract). 사이토카인 농도의 log 대(versus) O.D의 로그를 구성하는(plotting) 표준 곡선을 생성 및 베스트 핏 라인은 회귀 분석으로 결정될 수 있음. 만약 샘플이 희석될 경우, 표준 곡선으로부터 농도 해독은 희석 요소에 의해 반드시 곱해져야 된다. 표준 곡선은 분석된 샘플의 각 세트를 위해 생성되어야 한다. 이상치 데이터는 그룩 실험(Grugg's test)을 사용하여 회피되어야 한다. 이후 두번 SD의 간격에 없는 데이터는 폐기되었다. 만약 양성 대조군(control)이 앞서 관찰된 데이터를 보이는 경우 독립적인 실험이 고려된다. 독립적 실험들은 모아졌다(pooled) (N > 3).
세포독성 효과 측정에 대해: 사이토카인 방출 실험 분석에 고려된 각 독립적 실험의 각 플레이트에, 배지 단독의 흡수의 평균은 배경으로 고려되고 각 흡수 값에 차감되었다. 각 화합물의 비 처리된 세포의 세번의 평균은 100% 실행가능성(viability)으로 고려된다. 각 화합물의 세번의 평균은 이의 100%에 의해 일반화되었다. 이상치 데이터는 그룩 실험을 사용하여 회피되었다. 이후 두번의 SD의 간격에 없는 데이터는 폐기되었다. 독립적인 실험들은 모아졌다 (N>3).
조건들의 모든 통계적인 비교는 하기 실험과 함께 그래프패드 프리즘4 소프트웨어를 통해 수행되었다: 투키 다중비교검정 이후 일원 ANOVA 실험. P<0.05는 현저하게 고려되었다..
실시예 6: SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자 및 1차 랫(rat) 또는 인간 전체 혈액 세포 내 TNFα방출
전체 혈액은 소듐 시트르산염을 포함하는 미리 표지된 진공 튜브와 연결된 정맥 천자(venipuncture)를 사용하여 마취된 랫 또는 건강한 인간 지원자로부터 수집되었다. 튜브는 7-8회 뒤집어 부드럽게 혼합되었으며; 이후 자극이 있을 때까지 RT에서 보관되었다. SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자는 PBS 내 6회 농축되어 준비되었고 30 μl/웰의 혼합은 96-웰 플레이트에 첨가되었다. 전체 혈액은 PBS 내 1:2에 의해 희석되고 120 μl의 희석된 혈액은 PBS 단독 또는 SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자가 이전에 첨가된 각각 웰에 첨가되었다. 전체 혈액은 37℃에서 배양되고; 60분 동안 85 rpm (Stuart Orbital incubator SI500). 활성자(LPS)는 준비되고, 30μl/well의 LPS, 6회 농축되었다. 60분 배양 이후, LPS는 혈액에 첨가, 혈액은 위 및 아래로 피펫팅에 의해 혼합되고, 이후 교반 (85rpm) 하에 37℃ 에서 4시간 동안 보관되었다. 4시간 배양 이후, 플레이트는 미리-냉각된 원심분리기 내 15분 동안 4℃ 약 770g에서 원심분리되었다. 상청액은 최종적으로 수집되고 사이토카인 측정까지 -20℃에서 보관되었다. 사이토카인 (IL-6, IL-2, IFNγ 및 TNFα)은 이후 표준 Elisa 키트를 사용하여 측정되었다 (예를 들어 R&D Systems: DuoSet Elisas;로부터 또는 BD Biosciences: BD Opteia Set Elisa로부터). 결과는 측정된 사이토카인의 상청액의 pg/ml로 나타난다.
유사한 실험은 활성자/촉진제로서 LPS 대신 PMA+이오노마이신으로 수행되었다.
실시예 7: 본 발명에 개시된 특정한 JNK 억제자의 반감기
SEQ ID NOs: 196, 197, 및 172 (최종 농도 0.1mM)의 서열인 JNK 억제자는 인체 혈청(PBS 1x 내 10 및 50%) 내 소화되었다. 실험은 Tugyi et al. (Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 413-418)에 의해 설명된 바와 같이 수행되었다. 남은 온전한 펩타이드는 UPLC-MS에 의해 정량되었다. 안정성은 동일하게 단 두가지 분리된 분석으로 SEQ ID NOs: 196, 197, 및 172에 대하여 측정되었다. SEQ ID NO: 196인 JNK 억제자는 6시간 내 아미노산 잔기로 완전히 분해되는 반면, SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자는 오직 14일 후에 완전히 분해되었다. SEQ ID NO: 197인 JNK 억제자는 30일 이후에도 여전히 안정하였다.
실시예 8: 랫 일차 T 세포 내 방출 CD3/CD28 유도 IL-2의 SEQ ID NO: 172의 서열인 JNK 억제자의 투여량 의존적 억제
대조군 동물이 희생되었고, 림프절(LN)은 수확되고 완전 RPMI 배지 내 보관되었다. LN은 5ml 피스톤을 사용하여 70μm 필터 상 완전 RPMI로 격돌(smashed)되었다. 몇 방울의 배지가 여과기(strainer) 습윤을 유지하기 위해 첨가되었다. 세포는 450g 및 4℃에서 7분 동안 원심분리 되었다. 펠렛은 5 ml 신선 배지에 재현탁되었다. 세포는 세포 여과기를 통해 다시 통과되었다. 세포의 부분 표본이 세어지는 동안, 세포는 1400 rpm 및 4℃에서 10분 다시 원심분리되었다. 세포는 MACS 버퍼에서 재현탁되었다 (107 세포당 80μl의 MACS 버퍼). 10μl의 안티-랫 MHC 마이크로비드는 1000만 세포 당 첨가되었고, 세포들은 4℃-8℃에서 15분 동안 배양되었다. 세포들은 15ml MACS 버퍼로 세척되고 700g 및 4℃에서 7분 동안 원심분리했다. 펠렛은 108 세포당 500μl MACS 버퍼 내 재현탁되었다. 하나의 LS 칼럼은 동물 당 MACS 분리기(separator)의 자기 필드에 위치하였다. 칼럼은 3ml의 MACS 버퍼로 우선 린스(rinsed)되었다. 하나의 튜브는 세포를 수집하기 위해 얼음 내 칼럼 아래 위치하였다 = T 세포 (용출된 것을 수집하기 위한 음성 선택(selection)). 세포 현탁이 추가되고 용출은 얼음 상에 수집되었다. 칼럼은 3ml MACS 버퍼로 3회 세척되었다. 용출된 T 세포는 700g 및 4℃에서 7분 동안 원심분리 되었다. 재현탁된 세포는 세어졌고 100μl의 완전 배지 내 200000 세포/웰의 농도에 플레이트 되었다. 플레이트는 2μg/mL의 CD3 항체로 실험 하루 전에 미리 코팅(precoated)되었고, 실험날 플레이트는 PBS로 세번 3회 세척되었다. 세포들은 100μl의 (폴리-)펩타이드 JNK 억제자 (SEQ ID NO: 172)로 처리되었고, 리간드 활성화 1시간 전에 두번 농축되었다. (폴리-)펩타이드 JNK 억제자 (SEQ ID NO: 172)로 전처리 한시간 이후, 세포들은 그 다음 24시간 동안 2μg/mL의 항 CD28 항체로 자극되었다. 자극 24시간 이후, 상청액은 수집되었고 분석때까지 -20℃에서 저장되었다. 사이토카인은 이후 표준 엘리사 키트(Elisa kits)를 사용하여 측정되었다. 결과는 측정된 사이토카인의 상청액의 pg/ml로 나타내었다.
추가적인 실험에서, 상기 제시된 것처럼 근본적으로 동일한 절차가 사용되었고, 단 SEQ ID NO: 172인 (폴리-)펩타이드 JNK 억제자에 더하여, SEQ ID NO: 197의 서열인 JNK 억제자 및 약물 분자 SP600125는 또한 CD3/CD28 유도 IL-2 방출의 억제에 이들 억제자들의 효과를 비교하기 위해 실험되었다.
실시예 9: 인체 전체 혈액 내 JNK 억제자 및 TNFα/IL-2 방출:
인간 건강한 지원자로부터 전체 혈액은 소듐 시트르산염을 포함하는 미리 표지된 진공 튜브와 연결된 정맥 천자(venipuncture)를 사용하여 수집되었다. 튜브는 7-8회 뒤집어 부드럽게 혼합되었고; 이후 자극까지 RT에서 보관되었다. 350μl의 RPMI + P/S는 1,2ml-96-웰플레이트로 첨가되었다. SEQ ID NO: 172의 10회 농축은 RPMI+P/S(웰 당 50μl) 내 준비되었다. 50μl는 1.2ml-96 웰 플레이트 내 첨가되었다. 50μl의 전체 혈액은 이후 배지 단독 또는 JNK 억제자가 이미 첨가된 각 웰에 첨가되었다. 전체 혈액은 37℃, 5% CO2에서 60분동안 배양되었다. 최종 희석액 10배 농축에 대응하는 RPMI+P/S 내 희석된 50μl /well 의 리간드가 준비되었다. 60분 배양 후, 리간드가 첨가되었다; 웰은 이후 혈액을 위 및 아래로 피펫팅하여 혼합되었다. 전체 혈액은 37℃에서 3일 동안 배양되었다 (웰은 매일 한번 위 및 아래로 각 웰을 피펫팅함으로써 혼합되었다). 배양의 마지막에, 플레이트는 혼합되었고 이후 전냉각된 원심분리기 내 15분 동안 2500rpm, 4℃에서 원심분리되었다. 사이토카인은 이후 표준 엘리사 키트를 사용하여 측정되었다. 결과는 측정된 사이토카인의 상청액의 pg/ml로 나타내었다.
유사한 실험이 약간의 변화와 함께 수행되었다. CD3/CD8 자극의 경우에는, CD3 항체가 4℃에서 하룻밤동안 PBS 내 2μg/mL로 코팅되었다. 실험 날, 웰은 PBS로 세번 세척되고 37℃에서 사용할때까지 PBS에 남겨졌다. CD28 항체는 2μg/mL의 최종 농도에서 SEQ ID NO: 172 1시간 이후 첨가되었다; 상청액은 자극 3일 이후 수집되었다.
실시예 10: 내독소 유도 포도막염(endotoxins induced uveitis, EIU)의 랫 모델 내 항염증 잠재력
SEQ ID NO: 172인 JNK 억제자의 항염증 잠재력은 정맥내 투여 (EIU/LPS 모델) 다음 알비노 랫에서 실험되었다. 본 연구의 목적은 내독소 유도 포도막염 알비노 랫 모델 내 항염증 반응에 SEQ ID NO: 172 (0.015, 0.18, 및 1.80 mg/kg)의 일회 정맥내 주사의 효과를 결정하고 SEQ ID NO: 197 (2 mg/kg)인 선행 기술 JNK 억제자로 얻어진 그들의 효과를 비교하는 것이다. 나아가 대조군은 인산염 나트륨이 있는 덱사메타손(phosphate sodic dexamethasone)을 제공한다.
60 수컷 루이스(Lewis) 랫은 각 10 마리의 6 그룹으로 임의적으로 나뉘었다. EIC는 리포다당류(lipopolysaccharide) (LPS, 1mg/kg)의 발바닥(footpad) 주사에 의해 유도되었다. NaCl (0.9%), 2 mg/kg에서 SEQ ID NO: 197 및 세 농도 (1.80 mg/kg, 0.18 mg/kg 및 0.015 mg/kg)에서 SEQ ID NO: 172는 정맥내 주사를 통해 투여되었다. 인산염 나트륨이 있는 덱사메타손 (20 μg/eye)은 양쪽 눈에 결막하 주사를 통해 투여되었다. LPS 주사 24시간 이후, 염증 반응은 임상적 점수화(scoring)를 통해 평가되었다.
임상적 안구 염증의 강도는 각 눈에 0 내지 4의 규모로 점수가 매겨졌다:
0 등급 비 염증
1 등급 경미한 홍채 및 결막의 혈관확장(vasodilation)
2 등급 플레어(flare)와 함께 보통의 홍채 및 결막의 혈관확장
3 등급 플레어와 함께 극심한 홍채 및 결막의 혈관확장
4 등급 극심한 염증성 반응
(+1) 피브린(fibrin) 형성 및 눈동자(pupils)의 은둔
LPS 유도 24시간 이후, 수송체 처리된 랫에 대한 임상적 점수는 4의 중간값(범위, 2-5)으로 3.6 ± 0.2 (평균 ± SEM, n = 20)였다. 대조군(vehicle) 그룹 내 관찰된 점수와 비교하여 EIC 점수의 40% 감소에 대응하는, 안구 염증의 심각성에 현저한 감소 (p < 0.001)는 유도 및 SEQ ID NO: 197 (2 mg/kg) (평균 점수: 2.2 ± 0.3, 중간: 2)로 정맥내 처리 24시간 이후 검출되었다. 대략적으로 동일한 투여량 (1.80 mg/kg)에서, SEQ ID NO: 172로 정맥내 처리는 42%의 안구 염증의 심각성을 또한 현저하게 감소시켰다 (평균 점수: 2.1 ± 0.3, 중간값: 2, p = 0.001). 낮은 투여량 (0.18 및 0.015 mg/kg)은 각각 33% (평균 점수: 2.4 ± 0.3, 중간값: 2) 및 36% (평균 점수: 2.3 ± 0.3, 중간값: 2) 염증을 감소시켰다. 감소는 p < 0.001로 현저했다.
양성 대조군 약물로 사용된, 덱사메타손(20 μg/eye)으로 결막하 처리는 또한 79%로 임상적 점수를 현저하게 감소시켰다 (평균 점수: 0.8 ± 0.2, 중간값: 0.5, p < 0.001).
이들 실험적 조건 하에서, 2 mg/kg에서 SEQ ID NO: 197의 일회 정맥내 투여는 전방(anterior chamber) 내 관찰된 내독소 유도 염증을 부분적으로 예방하는 것으로 언급될 수 있다. 이에 비해, 0.015, 0.18, 1.80 mg/kg에서 정맥내 주사된 SEQ ID NO: 172는 또한 전방 내 내독소 유도 염증을 감소시켰다.
실시예 11: 만성으로 자리잡은(chronic established) 제2형 교원성 관절염의 랫 모델 내 JNK 억제자의 정맥내 투여한 다음 14일 후 투여량 반응 효과
랫 교원성 관절염은 전임상 또는 임상적 조사 하에 또는 본 질환 내 현재 치료법으로 사용된 수많은 항관절염 제제의 전임상 실험을 위해 광범위하게 사용된 다발 관절염(polyarthritis)의 실험적 모델이다. 본 모델의 특징(hallmarks)은 건강함(robust)의 발현(onset) 및 진행을 신뢰할 수 있으며, 다관절 염증의 용이한 측정, 파누스(pannus) 형성과 관련된 뚜렷한 연골의 파괴, 및 보통의 골 재흡수 및 골막성 골 증식에 약하다.
랫 내 자리잡은 제2형 교원성 관절염에서 발생하는 염증(발 붓기)의 억제, 연골 파괴, 및 골 재흡수의 억제를 위해 14일 동안 (관절염 1-14일) 매일 투여된 (QD) SEQ ID NO: 172의 JNK 억제자의 정맥내 투여 (IV) 효율은 상기 실험 모델에서 결정되었다.
동물(8/관절염 그룹)은 0 및 6일에 꼬리의 베이스(base) 및 등에 두 곳에 아이소플루레인(Isoflurane)으로 마취 및 2 mg/ml 소의(bovine) 제2형 콜라겐(Elastin Products, Owensville, Missouri)을 포함하는 프로이드 불완전 어주번트(Freund's Incomplete Adjuvant) (Difco, Detroit, MI)의 300 μl로 주사되었다. 연구 10일에 (관절염 0일) 관절염의 발현이 발생하였고 랫은 처리 그룹으로 임의 추출되었다. 각 그룹으로 임의 추출은 관절 발목 붓기가 적어도 한쪽 뒷발에 명백하게 자리잡은 이후 수행되었다.
제2형 교원성 관절염이 자리잡은 암컷 루이스 랫은 대조군(vehicle) (NaCl), SEQ ID NO: 172 (0.01, 0.1, 1, 또는 5 mg/kg), 또는 참조 화합물 덱사메타손 (Dex, 0.05 mg/kg)으로 정맥내 (IV) 경로에 의해 1-14일 관절염에 매일 처리(QD) 되었다. 동물은 관절염 14일에 종결되었다. 효율 평가는 선별된 그룹의 동물 체중, 매일 발목 캘리퍼(caliper) 측정, 곡선(AUC) 하에 부위와 같이 나타난 발목 직경, 말단 뒷발 중량, 및 발목 및 무릎의 조직 병리학적 평가에 기초하였다.
교원성 관절염 발목 및 무릎 관절의 점수화는 하기 기준에 따라 염증, 파누스 형성 및 골 재흡수에 대해 0-5의 점수로 주어졌다:
무릎 및/또는 발목 염증
0 정상
0.5 최소의 국소(focal) 염증
1 활막(synovium)/관절주위(periarticular) 조직 내 염증 세포의 최소의 침입
2 보통의 침입
3 보통의 부종(edema)과 함께 보통의 침입
4 뚜렷한 부종과 함께 뚜렷한 침입
5 심각한 부종과 함께 심각한 침입
발목 파누스(Pannus)
0 정상
0.5 연골 및 연골하골 내 파누스의 최소의 침입, 미미한 부위(marginal zone)에 영향을 미치고 단지 몇몇 관절에 영향을 미침.
1 연골 및 연골하골 내 파누스의 최소의 침입, 미미한 부위에 주로 영향을 미침.
2 약한 침입 (미미한 부위에 경골(tibia) 또는 발목뼈(tarsals)의 <1/4)
3 보통의 침입 (미미한 부위에 영향을 미친 경골 또는 발목뼈의 1/4 내지 1/3)
4 뚜렷한 침입 (미미한 부위에 영향을 미친 경골 또는 발목뼈의 1/2 내지 3/4)
5 심각한 침입 (미미한 부위에 영향을 미친 경골 또는 발목 뼈의 >3/4, 전체 구조의 심각한 염좌(distortion))
무릎 파누스
0 정상
0.5 연골 및 연골하골 내 파누스의 최소의 침입, 오직 미미한 부위에 영향을 미치며 오직 몇몇 관절에 영향을 미침
1 연골 및 연골하골 내 파누스의 최소의 침입, 대략 1-10%의 연골 표면 또는 연골하골에 영향을 미침
2 약한 침입 (경골 또는 대퇴골(femur)의 표면 또는 연골하 부위의 1/4에 걸쳐 확장), 대략 11-25%의 연골 표면 또는 연골하골에 영향을 미침
3 보통의 침입 (경골 또는 대퇴골의 표면 또는 연골하 부위의 >1/4 단 < 1/2에 걸쳐 확장), 대략 26-50%의 연골 표면 또는 연골하골에 영향을 미침
4 뚜렷한 침입 (경골 또는 대퇴부 표면의 1/2 내지 3/4에 걸쳐 확장) 대략 51-75%의 연골 표면 또는 연골하골에 영향을 미침
5 심각한 침입 대략 76-100%의 연골 표면 또는 연골하골에 영향을 미침
발목 연골 손상 (작은 발목뼈에 중점)
0 정상
0.5 T 블루 염색에서 최소의 감소, 오직 미미한 부위에 영향 및 오직 몇몇 관절에 영향을 미침
1 최소 = 명확한 연골세포 손실 또는 콜라겐 붕괴 없이 톨루이딘(toluidine) 블루 염색의 최소 내지 보통의 손실
2 약함 = 국소적인 약한(깊이 없는) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 블루 염색의 약한 손실
3 보통 = 다초점의 보통의 (중간 구역의 깊이) 연골 세포 손실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 보통의 손실, 보다 작은 발목뼈는 총 두께 감소의 드문 부위에 1/2 내지 3/4 깊이에 영향을 미침
4 뚜렷함 = 다초점의 뚜렷한(깊은 구역의 깊이) 연골 세포 손실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 뚜렷한 감소, 1 또는 2 작은 발목뼈 표면은 연골의 총 두께 감소를 가짐
5 심각함 = 다초점의 심각한 (타이드 마크(tide mark)의 깊이) 연골 세포 손실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 심각한 감소, 2 이상의 연골 표면에 영향을 줌.
무릎 연골 손상
0 보통
0.5 T 블루 염색 내 최소의 감소, 오직 미미한 부위에 영향
1 최소 = 명확한 연골세포 손실 또는 콜라겐 붕괴 없이 톨루이딘 블루 염색의 최소 내지 보통의 손실
2 약함 = 국소적인 약한(깊이 없는) 연골세포 손실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 블루 염색의 약한 손실은, 영향을 미친 연골의 50% 깊이의 몇몇 작은 부위를 가질 수 있음
3 보통 = 보통의 (중간 구역의 깊이) 연골 세포 손실 및/또는 콜라겐 붕괴를 확산하는 다초점으로 톨루이딘 블루 염색의 보통의 손실은, 표면의 총 너비의 1/4 미만 및 모든 표면의 총 너비의 25% 미만에 영향을 주는 총 두께 손실의 1-2 작은 부위를 가질 수 있음
4 뚜렷함 = 뚜렷한(깊은 구역의 깊이) 연골 세포 손실 및/또는 콜라겐 붕괴를 확산하는 다초점으로 톨루이딘 블루 염색의 뚜렷한 손실 또는 총 손실 근처의 1 표면 및 다른 것에 부분 손실, 조합된 모든 표면의 50%의 너비 미만 총 전체 손실
5 심각함 = 양쪽 대퇴골 및/또는 경골에 다초점의 심각한 (타이드 마크(tide mark)의 깊이) 연골 세포 손실 및/또는 콜라겐 붕괴와 함께 톨루이딘 블루 염색의 심각한 감소, 모든 조합된 표면의 너비의 50% 이상 총 전체 손실
발목 뼈 재흡수
0 정상
0.5 최소의 재흡수는 오직 미미한 부위에 영향 및 오직 몇몇 관절에 영향을 미침
1 최소 = 작은 부분의 재흡수, 낮은 배율(magnification)에서 즉시 명확하지 않은, 드문 파골 세포(osteoclasts)
2 약함 = 보다 많은 부분의 재흡수, 낮은 배율에서 즉시 명확하지 않은, 보다 많은 파골 세포, 재흡수된 미미한 부위에 경골 또는 발목뼈의 < 1/4
3 보통 = 피질(cortex) 내 전체 두께 결함없이 수질(medullary) 소주(trabecular) 및 피질 골의 명백한 재흡수, 일부 수질 소주의 감소, 낮은 배율에 병변 출현, 보다 많은 파골 세포, 미미한 부위에 경골 또는 발목뼈의 1/4 내지 1/3 영향을 미침
4 뚜렷함 = 피질 골 내 총 두께 결함, 종종 잔여 피질 표면의 프로필(profile)의 염좌(distortion)와 함께, 골수골(medullary bone)의 현저한 감소, 많은 파골 세포, 미미한 부위에 경골 또는 발목뼈의 1/2 내지 3/4 영향을 미침
5 심각함 = 피질 골 내 총 두께 결함, 종종 잔여 피질 표면의 프로필의 염좌와 함께, 골수골의 현저한 감소, 많은 파골 세포, 미미한 부위에 경골 또는 발목뼈의 >3/4 영향을 미침, 전체적 구조의 심각한 염좌
무릎 뼈 재흡수
0 정상
0.5 오직 미미한 부위에 영향을 미친 최소의 흡수
1 최소 = 작은 부분의 재흡수, 낮은 배율에서 즉시 명확하지 않음, 영향을 미친 연골하골의 총 관절 너비의 대략 1-10%
2 약함 = 보다 많은 부분의 재흡수, 연골하골의 분명한 손실, 영향을 미친 연골하골의 총 관절 너비의 대략 11-25%
3 보통 = 연골하골의 명백한 재흡수 영향을 미친 연골하골의 총 관절 너비의 대략 26-50%
4 뚜렷함 = 연골하골의 명백한 재흡수 영향을 미친 연골하골의 총 관절 너비의 대략 51-75%
5 심각함 = 영향을 미친 연골하골의 총 관절 너비의 대략 76-100% 파괴로 인한 전체 관절의 염좌
결과:
질환 대조군에서 질환 심각성은 4-5일에 가장 큰 일일 증가를 갖는 1 내지 5 일로부터 증가하였다. 이후 증분(incremental) 증가는 7일에 피크보다 작았다. 그 시점에서, 급성 부종은 일반적으로 감소하였고 캘리퍼 측정은 감소하였다. 처리 그룹은 이러한 일반적 패턴을 잘 따랐다.
체중 감소는 모든 질환 그룹에서 관찰되는 반면 정상 대조군은 체중이 증가하였다. 체중 감소는 수송 수단 처리된 질환 대조군에 비해 5 mg/kg SEQ ID NO: 172로 처리된 랫에 대해 현저하게 (25%, p < 0.05 ANOVA에 의해) 억제되었다. 스튜던트 테스트(Student's t-test)를 사용하여 질환 대조군을 비교할 때, 체중 감소의 억제는 또한 1 mg/kg SEQ ID NO: 172 (21%, p < 0.05) 또는 Dex (21%, p < 0.05)으로 처리된 랫에 대해 현저하였다. SEQ ID NO: 172로 처리된 결과는 이러한 파라미터에 대해 투여량 반응적이다.
매일 발목 직경 측정은 질환 대조군에 비해 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (p < 0.05 4-12일) 또는 Dex (p < 0.05 3-14일)로 처리된 렛에 대해 정상으로 현저하게 (p < 0.05 by 2-way RM ANOVA) 감소되었다.
발목 직경 AUC는 질환 대조군에 비해 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (43% 감소), 1 mg/kg SEQ ID NO: 172 (27%), 또는 Dex (97%)로 처리된 랫에 대해 정상으로 현저하게 (p < 0.05 ANOVA에 의해) 감소되었다. SEQ ID NO: 172로 처리 결과는 이러한 파라미터에 대해 투여량 반응적이다.
최종 발 중량은 질환 대조군에 비해 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (26% 감소) 또는 Dex (114%)로 처리된 랫에 대해 정상으로 현저하게 (p < 0.05 ANOVA에 의해) 감소되었다. SEQ ID NO: 172로 처리의 결과는 이러한 파라미터에 투여량 반응적이다.
상대적인 간 중량은 질환 대조군에 비해 어떠한 치료 그룹에서도 랫에 대해 현저하게 (ANOVA에 의해) 영향을 미치지 않았다.
체중을 기준으로 비장 중량은 질환 대조군에 비해 Dex로 처리된 랫에 대해 현저하게 (p < 0.05 ANOVA에 의해) 감소되었다. Dex 처리된 랫에 대한 상대적인 비장 중량은 또한 정상 대조군에 비해 현저하게 감소되었다. 상대적인 비장 중량은 SEQ ID NO: 172로 처리된 랫에 대해 현저하게 영향을 미치지 않았다.
흉선 중량은 질환 대조군에 비해 Dex로 처리된 랫에 대해 현저하게 (p < 0.05 ANOVA에 의해) 감소되었다. Dex 처리된 랫에 대해 상대적인 흉선 중량은 또한 정상 대조군에 비해 현저하게 감소되었다. 상대적인 흉선 중량은 SEQ ID NO: 172로 처리된 랫에 대해 현저하게 영향을 미치지 않았다.
모든 발목 조직병리학적 파라미터는 질환 대조군에 비해 5 mg/kg SEQ ID NO: 172(합산된 점수의 25% 감소)로 처리된 랫에 대해 정상으로 현저하게 (만-휘트니 U 검증(Mann-Whitney U test)에 의해) 감소되었다.
모든 무릎 조직병리학적 파라미터는 질환 대조군에 비해 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (합산된 점수의 73% 감소)로 처리된 랫에 대해 정상으로 현저하게 (만-휘트니 U 검증에 의해) 감소되었다.
본 연구의 결과는 SEQ ID NO: 172 (5 mg/kg)로 매일 정맥내 처리는 랫 내 자리잡은 제2형 교원성 관절염과 관련된 임상적 및 조직병리학적 파라미터에 현저히 유익학 효과를 갖는다는 것을 가리킨다. SEQ ID NO: 172 (1 mg/kg)로 처리는 현저하게 감소된 발목 직경 AUC를 초래하였다. 발목 직경에 유익한 효과는 질환 대조군 동물에서 7일 후 부종의 감소에도 불구하고 12일까지 관찰되었다. SEQ ID NO: 172로 처리의 결과는 투여량 의존적이다.
SEQ ID NO: 172로 처리는 덱사메타손과 다르게 장기 중량에 역 효과(adverse effect)를 가지지 않았다.
실시예 12: 쥐의 스코폴라민 유도 안구 건조 모델 내 세가지 투여량에서 모든-D-레트로-인버소 SEQ　ID　NO: 197의 JNK-억제자 (폴리-)펩타이드 및 SEQ　ID　NO: 172의 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 효과
연구 개념
본 연구의 목적은 스코폴라민 유도 안구 건조의 쥐 모델 내 세가지 투여량 수준에서 두가지 다른 화합물, 모든 D-레트로-인버소 SEQ　ID　NO: 197인 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드 및 SEQ　ID　NO: 172인 JNK 억제자 (폴리-)펩타이드의 효과를 측정하는 것이다.
SEQ ID NO: 197 및 SEQ ID NO: 172인 펩타이드는 안구 건조의 이러한 쥣과 동물 모델 내 효과에 대해 실험되었다. 펩타이드는 낮은, 중간 및 높은 투여량에서 양쪽 모두 실험되었다. SEQ ID NO: 197의 펩타이드에 대해 낮은, 중간 및 높은 투여량 수준에 대해 제형 샘플 내 측정된 농도는 각각 0.06% (w/v), 0.25% (w/v) 및 0.6% (w/v)이었으며, SEQ ID NO: 172에 대해 낮은, 중간 및 높은 투여량 수준에 대해 제형 샘플 내 측정된 농도는 각각 0.05% (w/v), 0.2% (w/v) 및 0.6% (w/v)였다. 또한 음성 대조군으로 제공된 대조군(vehicle)은 주사 USP를 위한 0.9% 염화 나트륨이었다.
연구는 각 12 마리 쥐의 8개 그룹 및 4마리 쥐의 추가적인 그룹을 포함하는 암컷 C57BL/6 쥐의 총 9개 그룹으로 이루어졌다. 양쪽(Bilateral) 단기 안구 건조는 스코폴라민 하이드로브로마이드(scopolamine hydrobromide) (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) 주사 (피하 (SC), 매일 4회, 0.5 mg/dose, 0-21 일) 및 지속적인 송풍(air draft)의 건조 환경에 쥐를 노출시키는 것에 의한 조합으로 유도되었다. 시작 1일에, 그룹 1-8의 쥐는 대조군(vehicle) (0.9% 멸균 식염수; 음성 대조군 개체(article))의 양쪽 국소 안구 (양안(oculus uterque); OU) 투여 (5 μL/eye/dose)로; SEQ ID NO: 197 (0.06%, 0.25% 및 0.6%)의 펩타이드, SEQ ID NO: 172 (0.05%, 0.2% 및 0.6%)의 펩타이드; 또는 사이클로스포린 (0.05%; 양성 대조군, 면역 시스템의 활성화를 감소시키기 위해 사용된 면역 억제제(immunosuppressant) 약물)로 21일 동안 하루에 세번 (TID) 처리되었다. 그룹 9의 쥐들은 비-유도된, (비 안구 건조) 비처리 대조군으로 유지되었다.
살아있는 (치료) 기간 동안, 임상적 관찰은 하루에 한번 기록되었다; 각막 플루오레세인(fluorescein) 염색으로 세극등 검사 (slit-lamp examination, SLE), 누액층 파괴 시간 실험 (tear break-up time test, TBUT), 및 페놀 레드 실 실험 (phenol red thread test, PRTT)이 주당 3회 수행되었다. 부검은 22일에 수행되었다; 안구, 안검, 결막, 및 누선이 각 동물의 양쪽 안구로부터 수집되었다. 오른쪽 안구로부터 조직 (오른쪽 눈(oculus dexter), OD)은 고정되고 현미경으로 평가되었다. 왼쪽 안구로부터 조직 (왼쪽 눈(oculus sinister), OS)은 액체 질소에 급속 냉동되고 가능한 차후 분석을 위해 -80 ℃에서 냉동 보관되었다.
표 5: 실험적 설계
그룹 동물의 수 (암컷) 안구 건조의 유도
(QID, SC)
0 내지 21일		 처리
(TID, OU,
5 μL/눈)
1* 내지 21일
1 12 스코폴라민
(2.5 mg/mL sol.의 200 μL, 0.5 mg/dose)		 수송체
2 12 SEQ ID NO: 197
(0.06%)
3 12 SEQ ID NO: 197
(0.25%)
4 12 SEQ ID NO: 197
(0.6%)
5 12 SEQ ID NO: 172
(0.05%)
6 12 SEQ ID NO: 172
(0.2%)
7 12 SEQ ID NO: 172 (0.6%)
8 12 Restasis®*(0.05%)
9 4 안구 건조 유도되지 않음 비처리
* 사이클로스포린
실험 방법
1. 투여량 제조
SEQ ID NO: 197의 (폴리-)펩타이드는 건조 분말의 300.65 mg을 포함하는 1.5-mL 투명한 플라스틱 미세분리(microfuge) 유리병으로 폴리펩타이드 연구소(Polypeptide Laboratories, France)로부터 획득되었다.
SEQ ID NO: 172의 (폴리-)펩타이드는 건조 분말의 302.7 mg을 포함하는 1.5-mL 투명한 플라스틱 미세분리(microfuge) 유리병으로 폴리펩타이드 연구소(Polypeptide Laboratories, France)로부터 획득되었다.
연구의 시작 전에, SEQ　ID　NO: 172 및 SEQ ID NO: 197의 (폴리-)펩타이드는 멸균 식염수(대조군(vehicle)) 내에 생성되었다. 각 농도의 투여 용액은 0.2-μm 필터를 사용하여 멸균되었고, 다수의 미리-표지된 유리병에 배정되었고, -20℃에서 냉동되었다. SEQ ID NO: 197의 펩타이드에 대한 제형 샘플 내에 측정된 농도는 0.058%, 0.25% 및 0.624% 반올림하여 0.06%, 0.25% 및 0.6%이었다. SEQ ID NO: 172의 펩타이드에 대한 제형 샘플 내에 측정된 농도는 0.053%, 0.217% 및 0.562% 반올림하여 0.05%, 0.2% 및 0.6%이었다.
각각 투여하는 날에, 투여 용액의 한 세트는 해동되었고(thawed) 당일의 투여량 투여를 위해 사용되었다. 대조군(대조군(vehicle), 사이클로스포린)는 투여할 준비가 제공되었다; 투여량 제조는 필요하지 않다.
2. 세극등 실험(SLE)
연구에 들어가기 전에, 각 동물은 SLE 및 국소-적용된 플루오레세인을 사용한 간접적인 안과(ophthalmic) 실험을 수행하였다. 안구 연구결과는 드레이즈 스케일(Draize scale) 안구 점수를 사용하여 기록되었다. SLE 및 드레이즈 점수는 살아있는 기간 동안 일주일에 3회 반복되었다.
3. 누액층 파괴 시간(TBUT) 실험 및 후속 각막 실험
TBUT 실험은 각막에 플루오레세인의 적용 후에 완벽한 깜빡임 및 누액층에 첫번째 랜덤 건조 부위의 출현 사이에 몇초의 경과 시간을 측정하여 주당 3회 수행되었다. TBUT를 수행하기 위하여, 0.1% 액체 소듐 플루오레세인은 결막낭(conjunctival sac)으로 떨어뜨려졌고, 안검은 3회 수동으로 폐쇄되었고, 이후 각막을 덮은 연속 플루오레세인-포함 누액층을 나타내어 열어 놓았으며, 막 파괴(건조 부위 또는 스트릭(streak)의 출현)를 위해 요구되는 시간(몇초 내)이 기록되었다. 0.1% 플루오레세인의 다른 드롭(drop)이 각막에 재적용된 후, 적어도 90초 후에, 각막 상피 손상은 코발트 블루 필터로 세극등을 사용해 등급이 나뉘었다; 각막은 이후 드레이즈 안구 스케일로 점수화 되었다.
4. 페놀 레드 실 누액 실험(Phenol Red Thread Tear Test)(PRTT)
누액 생산은 PRTT 실험 스트립(strip)을 사용하여 양쪽 눈에 주당 3회 측정되었다(Zone-Quick; Menicon, Nagoya, Japan). 당일의 첫번째 처리 전에, 실은 세극등 생체현미경(biomicroscopy) 하에서 30초 동안 각 눈의 결막 원개(conjunctival fornix)의 측면 안객(lateral canthus)에 적용되었다. 실에까지 누액의 이송(migration)(즉, 습윤 면 실의 길이)는 밀리미터 스케일을 사용하여 측정되었다.
5. 부검(Necropsy) 및 병리(Pathology)
22일에 부검은, 안구, 눈물샘, 안검, 및 결막을 포함하는 각 동물의 양쪽 눈은 절단되었다. 오른쪽 눈 및 관련된 조직은 10% 중성 버퍼 포르말린(formalin)(NBF)으로 이송된 후에 변형된 데이비슨 용액(Davidson's solution)에 하룻밤 담그어져 고정되었다. 오른쪽 눈의 고정된 조직은 탈수되었고, 파라핀에 고정되었고, 3 내지 5-μm 두께로 나누어졌으며, 슬라이드에 고정된 조직은 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)(H&E)으로 염색되었다. 염색된 슬라이드는 광학 현미경을 통해 측정되었다. 자세하고 완전한 조직병리학적(histopathologic) 평가는, 각 오른쪽 눈에 대한 조직병리학적으로 실험된 적어도 두 섹션(section) 수준으로, 눈의 모든 부위에서 수행되었다. 특별한 주의가 눈물샘뿐만 아니라 각막, 결막 및 각막의 상피(술잔 세포(goblet cells) 포함), 가해졌다. 이들 조직은 0은 정상(normal), 1은 최소(minimal), 2는 가벼운(mild), 3은 중간(moderate), 4는 극심한(severe)으로, 0-4 규모에 기초한 상처에 대해 점수화 되었다. 각 각막에 대해, 점수는 각막 상피 두께, 및 각막 염증에 기초한다. 결막은 술잔 세포의 존재 또는 부재뿐만 아니라 부식 및 염증에 대해 점수화 되었다.
결과
암컷 C57BL/6 쥐에 안구 건조증이 유도된 스코폴라민(0.5mg/dose)의 매일 4회 SC 투여는 수성 누액 생산의 부피의 감소 및 눈을 효과적으로 윤활 및 보호할 수 있는 안정한 누액 층 유지를 덜 가능하게 하는 그들을 만드는 누액의 물리화학적 특성의 변화에 의해 특징화되었다.
1. 누액 파괴 시간 (TBUT) 실험 및 각막 실험
누액 파괴 시간 실험(TBUTs)는 안구 건조의 유도 전, 및 안구 건조 유도 후 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 및 21일에 다시 수행되었다. 스코폴라민 (안구 건조 유도)으로 투여 시작 후에 TBUT 평균 값은 모든 동물에서 감소하기 시작하였으나, 그룹 6 내 (SEQ ID NO: 172의 중간 투여량)에서 더욱 천천히 감소하는 것으로 나타났다. 유사한 수치(각각 6.6 ± 0.4, 6.7 ± 0.4, 6.7 ± 0.3, 및 6.4 ± 0.4 s)에 도달하는, 그룹 5, 6, 7 (SEQ ID NO: 172의 펩타이드의 낮은, 중간 및 높은 투여량) 및 그룹 8 (사이클로스포린)에 대한 TBUT 평균 최하점(nadir)은 7일에 발생하였다. 지속적으로, 이들 그룹의 TBUT 평균은 9일에 최고점(peak)으로 증가하였다. 그룹 6 및 7 (SEQ ID NO: 172 중간 및 높은 투여량 그룹) TBUT 평균은 그룹 8, 사이클로스포린 그룹 (8.5 ± 0.3 s)에 비해 높은 수치 (각각 10.0 ± 0.7 s 및 9.9 ± 0.8 s)로 상승한 반면, 그룹 5의 TBUT 평균의 최고점, SEQ ID NO: 172 (8.0 ± 0.4 s)의 낮은 투여량은 그룹 8 (사이클로스포린) 보다 약간 아래였다. SEQ ID NO: 197 처리된 동물들, 그룹 3 및 4의 중간 및 높은 투여량에 대한 TBUT 평균은 투여 시작 이후 감소하기 시작하는 반면, 낮은 투여량 그룹 2는 9일에 증가하였다. SEQ ID NO: 172 처리된 동물들의 낮은, 중간 및 높은 투여량 TBUT 평균(각각 그룹 2, 3 및 4)은 대조군(vehicle) 그룹 이상 및 일반적으로 SEQ ID NO: 172 처리된 동물의 낮은, 중간 및 높은 투여량 그룹 평균 이하였다.
7일 내지 21일 TBUT 수치에 대한 곡선 하 영역 (AUC)이 대조군(vehicle) 대조군, SEQ ID NO: 172의 중간, 낮은 및 높은 투여량(각각 0.05%, 0.2% 및 0.6%)으로 처리로 다양한 처리와 비교하기 위해 사용되었을 때, 그룹 5, 6 및 7뿐만 아니라 사이클로스포린 (0.05%)로 처리된 동물, 그룹 8은 TBUT AUC (Kruskal-Wallis 비모수의 (nonparametric) ANOVA)에서 현저한 증가를 보였다. SEQ ID NO: 172의 펩타이드는 종종 유사한 효과를 생산하는 중간 및 높은 투여량으로, TBUT에서 투여량-의존적 증가를 생산하는 것으로 나타났다. 나아가, 사이클로스포린 처리된 그룹, SEQ ID NO: 172의 세가지 투여량으로 처리된 그룹 및 비 유도된 그룹 (그룹 5, 6, 7, 8 및 9) 사이에 TBUT AUC에 현저한 차이가 없었다. 본 연구는 SEQ ID NO: 172의 펩타이드 및 사이클로스포린의 모든 세가지 투여량은 본 안구 건조 모델 내 TBUT 변화를 내재하는 안과학적(ophthalmological) 변화를 개선 또는 역전(reversing)에 대략적으로 동등하게 효과적임을 제시한다.
SEQ ID NO: 197의 펩타이드의 낮은, 중간 및 보통 투여량 수준으로 처리된 그룹(그룹 2-4)은 SEQ IN NO: 172 또는 사이클로스포린으로 처리된 동물에 비해 대략 2일 후 증가하기 시작하는 TBUT 내 일반적으로 경미한 투여량-의존적 증가를 보였다.
표 6. 계산된 TBUT AUC 수치 평균:
그룹 TBUT AUC
그룹 1 71.19
그룹 2 88.54
그룹 3 91.19
그룹 4 89.98
그룹 5 102.98
그룹 6 119.08
그룹 7 119.31
그룹 8 116.1
그룹 9 124.54
2. 페놀 레드 실 누액 테스트(PRTT)
PRTT는 안구 건조 유도되기 전, 및 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 및 21일에 다시 수행되었다. 당일 내지 4일의 PRTT 수치는 안구 건조가 유도된 모든 쥐에서 감소되었고, 스코폴라민의 투여 및 송풍기에 의해 생성된 증가된 통풍의 건조 환경에 노출 후에 누액 생산이 감소됨을 가리킨다. 대부분 그룹 내 PRTT의 최저점은 대략 7일에 발생하였다. PRTT는 14일에 최저점에 이르는 대조군(vehicle) 대조군 그룹 (그룹 1) 에서 감소가 지속되었다. 최저점 이후, 모든 안구 건조 그룹에서 증가가 있었다. 이러한 연구는 화합물 처리 시작에 비해 하루 이른 스코폴라민 처리의 시작은 안구 건조증과 관련된 안구를 생리학적으로 변화시키기 시작하는데 충분함을 가리킨다. 심지어 사이클로스포린 처리된 그룹은 대략 7일을 통해 다른 그룹과 유사한 PRTT 내 감소를 보였고, 경미한 감소 이후, 그 다음 11-14일에 최고점으로 증가하였다. 마지막 PRTT 실험 (21일) 사이클로스포린 (그룹 8), 및 그룹 6 및 7 모두에서 SEQ ID NO: 172 처리의 펩타이드의 중간 및 높은 투여량 처리 양쪽 모두는 본 쥣과 안구 건조 모델 내 수성 누액 생산을 증가시키는데 사이클로스포린과 유사한 치료적 효과를 갖는 것을 제안하는 유사한 PRTT 수치를 갖는다.
SEQ ID NO: 172의 펩타이드의 낮은, 중간 또는 높은 투여량 처리된 동물은 대조군(vehicle)-처리된 동물에 비해 보다 많은 수송 누액을 현저하게 생산하였다. 따라서, TBUT와 유사하게, SEQ ID NO: 172의 펩타이드는 본 모델 내 수성 누액의 생산에 일반적으로 투여량 의존적인 현저한 증가를 생산하였다.
SEQ ID NO: 197의 펩타이드의 낮은, 중간 및 높은 투여량 수준으로 처리된 그룹 (각각 0.06%, 0.25% 및 0.6%, 그룹 2, 3 및 4)은 PRTT 내 일반적으로 투여량 의존적 증가를 보였다.
표 7: 평균 PRTT AUC 수치
그룹 PRTT AUC
그룹 1 35.02
그룹 2 39.96
그룹 3 42.79
그룹 4 43.17
그룹 5 44.38
그룹 6 44.85
그룹 7 46.10
그룹 8 49.44
그룹 9 113.63
3. 조직병리학
본 연구에서 조직학적 변화는 일반적으로 각막에 국한된다. 각막에서 연구 결과는 각막 상피 표면의 증가된 케라틴화, 각막 상피의 두께의 증가, 각막 상피의 증가된 세포질, 증가된 상피 세포 회전율(turnover)에 따르는 기저 상피층의 유사분열의 약하게 증가된 빈도로 이루어진다. 이들 연구결과는 각막 건조 및 각막 상피 자극에 생리학적 적응 반응의 지표이다. 표면 궤양(Surface ulceration), 각막 기질 부종(corneal stromal edema) 및 각막내 염증 침윤(inflammatory infiltrate)은 본 연구에서 나타나지 않는다. 비처리된 그룹(정상 쥐, 스코폴라민 처리되지 않음), 그룹 9의 안구들은 정상 범위 내에 있다. 모든 그룹 전체에 산재된 안검의 몇몇 최소의 비화농성(nonsuppurative) 염증이 있으나, 결막, 망막, 눈물샘 및 눈의 다른 부분은 정상 범위 내에 있다. 술잔 세포는 모든 그룹의 범위 내에서 나타났다. 술잔 세포는 누액이 강한 보다 접착성있는 막을 형성하는 것을 돕는 뮤신의 일차적 생산자이다.
가벼운(mild) 내지 중간(moderate) 각막 변화는 비처리된 정상 안구 그룹 (그룹 9)를 제외한 모든 그룹에서 나타났고, 다른 처리 그룹에 비하여, 그룹 1, 대조군(vehicle) 처리된 그룹 및 그룹 2, SEQ ID NO: 197의 펩타이드의 낮은 투여량에서 조금 더 심각하였다. 이들 연구결과는 각막에 증가된 누액 생산의 긍정적인 유익한 효과와 일치한다.
다양한 처리 그룹의 조직병리학적 점수는 어느 다른 처리가 사이클로스포린과 "유사한 점수 감소"를 생산하는지 여부를 결정하기 위해 사이클로스포린 그룹 내 조직병리학적 점수와 비교되었고, 그룹 4, 6, 및 7은 사이클로스포린 그룹 점수보다 현저하게 다르지 않은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 세가지 처리, SEQ ID NO: 172의 펩타이드의 중간 및 높은 투여량 및 SEQ ID NO: 197의 펩타이드의 높은 투여량은 본 쥣과 안구 건조 모델과 관련된 각막 변화를 감소/개선하는데, 사이클로스포린 다음, 가장 효과적이었다.
SEQUENCE LISTING <110> Xigen S.A. <120> Novel JNK inhibitor molecules for treatment of various diseases <130> IMP142287 <150> PCT/EP2011/006481 <151> 2011-12-21 <160> 200 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Consensus new JNK inhibitors <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> X1 may be R, P, Q or D-enantiomeric r <220> <221> Variant <222> (2)..(2) <223> X2 may be R, P, G or D-enantiomeric r <220> <221> Variant <222> (3)..(3) <223> X3 may be K, R or D-enantionmeric k or r <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> X4 may be P or K <220> <221> Variant <222> (6)..(6) <223> X5 may be T, or D-enantiomeric a, s, q, k or absent <220> <221> Variant <222> (7)..(7) <223> X6 may be T, D or A <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> X7 may be N, K or D-enantiomeric n or r <220> <221> Variant <222> (11)..(11) <223> X8 may be F or D-enantiomeric f or w <400> 1 Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Leu Xaa 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial 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<400> 163 Arg Gln Val Lys Val Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 164 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trafficking sequence D-P1 (Penetratin) <400> 164 Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Val Lys Val Gln Arg 1 5 10 15 <210> 165 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trafficking sequence JNK1, bestfit <400> 165 Trp Lys Arg Ala Ala Ala Arg Lys Ala Arg Ala Met Ser Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe <210> 166 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trafficking sequence JNK1, bestfit (variant 1) <400> 166 Trp Lys Arg Ala Ala Ala Arg Ala Ala Arg Ala Met Ser Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trafficking sequence MDCK transcytose sequence <400> 167 Arg Tyr Arg Gly Asp Leu Gly Arg Arg 1 5 <210> 168 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> trafficking sequence YKGL <400> 168 Tyr Lys Gly Leu 1 <210> 169 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> trafficking sequence RRTK <400> 169 Arg Arg Thr Lys 1 <210> 170 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> trafficking sequence RRPK <400> 170 Arg Arg Pro Lys 1 <210> 171 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPTTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (20)..(20) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 171 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 172 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPaTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (15)..(15) <223> Ala is D-enantiomeric Ala <220> <221> Variant <222> (20)..(20) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 172 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Ala Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 173 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPTTLrLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (18)..(18) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (20)..(20) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 173 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Arg Leu Phe 20 <210> 174 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPTTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (17)..(17) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 174 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe <210> 175 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRrRPTTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (8)..(8) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (16)..(16) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 175 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 15 <210> 176 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPTTLNLw JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (20)..(20) <223> Trp is D-enantiomeric Trp <400> 176 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Trp 20 <210> 177 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPTDLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (20)..(20) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 177 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Thr Asp 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 178 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPTTLrLw JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (15)..(15) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (17)..(17) <223> Trp is D-enantiomeric Trp <400> 178 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Arg Leu 1 5 10 15 Trp <210> 179 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRrRPTTLrLw JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (8)..(8) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (14)..(14) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (16)..(16) <223> Trp is D-enantiomeric Trp <400> 179 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Arg Leu Trp 1 5 10 15 <210> 180 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPTDLrLw JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (15)..(15) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (17)..(17) <223> Trp is D-enantiomeric Trp <400> 180 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Thr Asp Leu Arg Leu 1 5 10 15 Trp <210> 181 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRrRPTDLrLw JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (8)..(8) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (14)..(14) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (16)..(16) <223> Trp is D-enantiomeric Trp <400> 181 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Asp Leu Arg Leu Trp 1 5 10 15 <210> 182 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPaTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Ala is D-enantiomeric Ala <220> <221> Variant <222> (17)..(17) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 182 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe <210> 183 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRrRPaTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (8)..(8) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (11)..(11) <223> Ala is D-enantiomeric Ala <220> <221> Variant <222> (16)..(16) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 183 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 15 <210> 184 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRrKRPaTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (8)..(8) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Ala is D-enantiomeric Ala <220> <221> Variant <222> (17)..(17) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 184 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Lys Arg Pro Ala Thr Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe <210> 185 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPsTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (15)..(15) <223> Ser is D-enantiomeric Ser <220> <221> Variant <222> (20)..(20) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 185 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Ser Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 186 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPqTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (15)..(15) <223> Gln is D-enantiomeric Gln <220> <221> Variant <222> (20)..(20) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 186 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Gln Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 187 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRPkRPkTLNLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (15)..(15) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (20)..(20) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 187 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Lys Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 188 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrGKRKALKLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (18)..(18) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 188 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Lys Arg Lys Ala Leu Lys 1 5 10 15 Leu Phe <210> 189 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrGKRKALrLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (16)..(16) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (18)..(18) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 189 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Lys Arg Lys Ala Leu Arg 1 5 10 15 Leu Phe <210> 190 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrRKALrLf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (14)..(14) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (16)..(16) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 190 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Lys Ala Leu Arg Leu Phe 1 5 10 15 <210> 191 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RPTTLNLF JNK inhibitor <400> 191 Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 <210> 192 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> KRPTTLNLF JNK inhibitor <400> 192 Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 <210> 193 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-IB1(s24) <400> 193 Arg Pro Lys Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe 1 5 10 <210> 194 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GRKKRRQRRRPPKRPTTLNLFPQVPRSQD JNK inhibitor <400> 194 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Lys Arg Pro Thr 1 5 10 15 Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 <210> 195 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GRKKRRQRRRPTTLNLFPQVPRSQD JNK inhibitor <400> 195 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Thr Thr Leu Asn Leu 1 5 10 15 Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 <210> 196 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> L-TAT-IB1 <400> 196 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Arg Pro Lys Arg 1 5 10 15 Pro Thr Thr Leu Asn Leu Phe Pro Gln Val Pro Arg Ser Gln Asp 20 25 30 <210> 197 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> D-TAT-IB1 <220> <221> Variant <222> (1)..(31) <223> All amino acids are D-enantiomeric amino acids <400> 197 Asp Gln Ser Arg Pro Val Gln Pro Phe Leu Asn Leu Thr Thr Pro Arg 1 5 10 15 Lys Pro Arg Pro Pro Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 198 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> cJun (29-67) <400> 198 Ser Asn Pro Lys Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp 1 5 10 15 Pro Val Gly Ser Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu 20 25 30 Leu Thr Ser Pro Asp Val Gly 35 <210> 199 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> RKKRRQRRRRPKRPATLNLF antibody negative control <400> 199 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Arg Pro Ala Thr 1 5 10 15 Leu Asn Leu Phe 20 <210> 200 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> rKKRrQRRrR PkAAaAANAf JNK inhibitor <220> <221> Variant <222> (1)..(1) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (5)..(5) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (9)..(9) <223> Arg is D-enantiomeric Arg <220> <221> Variant <222> (12)..(12) <223> Lys is D-enantiomeric Lys <220> <221> Variant <222> (15)..(15) <223> Ala is D-enantiomeric Ala <220> <221> Variant <222> (20)..(20) <223> Phe is D-enantiomeric Phe <400> 200 Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Pro Lys Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Asn Ala Phe 20

Claims (66)

  1. 테라피(therapy)에 의한 인체 또는 동물 몸체의 치료(treatment) 방법에 이용을 위한, 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된 JNK 억제자:
    a) 하기 일반식에 따른 억제 (폴리-)펩타이드 서열을 포함하는 JNK 억제자:
    X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8 (SEQ ID NO: 1),
    상기 X1은 아미노산 R, P, Q 및 r로부터 선택된 아미노산,
    상기 X2는 아미노산 R, P, G 및 r로부터 선택된 아미노산,
    상기 X3는 아미노산 K, R, k 및 r로부터 선택된 아미노산,
    상기 X4는 아미노산 P 및 K로부터 선택된 아미노산,
    상기 X5는 아미노산 T, a, s, q, k로부터 선택된 아미노산이거나 부재(absent),
    상기 X6는 아미노산 T, D 및 A로부터 선택된 아미노산,
    상기 X7는 아미노산 N, n, r 및 K로부터 선택된 아미노산; 및
    상기 X8은 F, f 및 w로부터 선택된 아미노산, 및
    상기 대문자로 기재된 아미노산 잔기는 L-아미노산을 가리키며, 반면 소문자로 기재된 아미노산 잔기는 D-아미노산 잔기를 가리킴,
    단, X1, X2, X3, X5, X7 및 X8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산이 D-아미노산(들)임, 및
    b) 상기 a)에서 정의된 SEQ ID NO: 1과 적어도 적어도 80% 서열 상동성(identity)을 공유하는 억제자 (폴리-)펩타이드 서열을 포함하는 JNK 억제자,
    단, SEQ ID NO: 1 에 대하여 이러한 SEQ ID NO: 1과 서열 상동성을 공유하는 억제자 (폴리-)펩타이드는 위치 4에서 SEQ ID NO: 1의 L-아르기닌(R) 잔기 및 위치 8 및 10에서 SEQ ID NO: 1의 두개의 L-류신(L) 잔기를 유지하고 SEQ ID NO: 1과 적어도 적어도 80% 서열 상동성을 공유하는 상기 서열 중에서 남아있는 아미노산의 적어도 하나는 D-아미노산임.
  2. 제1항에 있어서, X3, X5, X7 및 X8로 이루어진 군에서 선택된 아미노산의 적어도 하나는 D-아미노산(들)인 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 SEQ ID NOs: 2-27 가운데 어느 하나로부터 선택된 서열과 적어도 80% 서열 상동성을 공유하는 억제자 (폴리-)펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제자 (폴리-)펩타이드 서열은 SEQ ID NOs: 2-27의 어느 하나로부터 선택된 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 SEQ ID NO: 8 또는 SEQ ID NO: 8과 적어도 80% 서열 상동성을 공유하는 억제자 (폴리-)펩타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 수송체 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 억제자 (폴리-)펩타이드 서열 및 수송체 서열은 겹치는(overlap) 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 수송체 서열은 SEQ ID NOs: 28-30의 어느 하나에 따른 D- 및 L-아미노산을 교대하는(alternating) 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수송체 서열은 SEQ ID NOs: 31-170의 어느 하나로부터 선택된 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수송체 서열은 SEQ ID NOs: 31-34, 46, 47 및 52-151의 어느 하나로부터 선택된 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수송체 서열은 억제자 (폴리-)펩타이드 서열의 직접적으로 N-말단 또는 직접적으로 C-말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자
    a) SEQ ID NOs: 171-190의 어느 하나에 따른 서열, 또는
    b) SEQ ID NOs: 171-190의 적어도 하나와 적어도 50% 서열 상동성을 공유하는 서열, 단 SEQ ID NOs: 171-190의 어느 하나와 서열 상동성을 공유하는 상기 서열은:
    i) SEQ ID NO: 1에 대응하는 이의 서열 스트레치(stretch) 내 위치4에 L-아르기닌 (R) 잔기를 유지,
    ii) SEQ ID NO: 1에 대응하는 이의 서열 스트레치 내에 두개의 L-류신 (L)을 유지, 및
    iii) SEQ ID NO: 1에 대응하는 이의 서열 스트레치 내에 X1, X2, X3, X5, X7 또는 X8 위치에 적어도 하나의 D-아미노산을 보임.
  13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자
    a) SEQ ID NO: 172의 서열 또는
    b) SEQ ID NO: 172와 50% 서열 상동성을 공유하는 서열, 단 SEQ ID NO: 172와 50% 서열 상동성을 공유하는 상기 서열은
    i) SEQ ID NO: 1에 대응하는 이의 서열 스트레치 내 위치 4에 L-아르기닌 (R) 잔기를 유지,
    ii) SEQ ID NO: 1에 대응하는 이의 서열 스트레치 내 두개의 L-류신 (L)을 유지, 및
    iii) SEQ ID NO: 1에 대응하는 이의 서열 스트레치 내 X1, X2, X3, X5, X7 또는 X8 위치에 적어도 하나의 D-아미노산을 보임.
  14. 테라피에 의한 인체 또는 동물 몸체의 치료 방법에 이용을 위한, 하기를 포함하는 JNK 억제자:
    a) RPTTLNLF (SEQ ID NO: 191), KRPTTLNLF (SEQ ID NO: 192), RRPTTLNLF 및/또는 RPKRPTTLNLF (SEQ ID NO: 193)로 이루어진 서열의 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 억제자 (폴리-)펩타이드, 및
    b) SEQ ID NOs: 31-34 및 46-151로부터 선택된 수송체 서열.
  15. 테라피에 의한 인체 또는 동물 몸체의 치료 방법에 이용을 위한 SEQ ID NO: 194 또는 195의 서열을 포함하는 JNK 억제자.
  16. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 테라피에 의한 인체의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  17. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 정맥내로(intravenously), 근육내로(intramuscularly), 피하로(subcutaneously), 피내로(intradermally), 경피로(transdermally), 장내로(enterally), 경구로(orally), 직장으로(rectally), 국소적으로(topically), 비강으로(nasally), 부분적으로(locally), 비강내로(intranasally), 표피로(epidermally), 패치(patch) 전달에 의해, 점적(instillation)에 의해, 초자체내로(intravitreally), 결막하로(subconjunctivally) 및/또는 고막내로(intratympanically) 투여되는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 염증성 질환(inflammatory diseases), 안 질환(diseases of the eye), 골 질환(diseases of the bone), 신경 질환(neural diseases), 신경 단위의 질환(neuronal diseases), 신경병성 질환(neurodegenerative diseases), 피부 질환(diseases of the skin), 면역 및/또는 자가면역 질환, 안 질환(diseases of the eye), 구강 질환(diseases of the mouth), 대사성 질환(metabolic diseases), 심혈관 질환(cardiovascular diseases), 증식성 질환(proliferative diseases), 귀 질환(diseases of the ear), 장 질환(diseases of the intestine), 및/또는 호흡기 시스템 질환(diseases of the respiratory system)으로부터 선택된 질환(diseases) 및/또는 장애(disorders)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 염증성 질환(inflammatory diseases), 급성 염증(acute inflammation), 만성 염증(chronic inflammation), 안 염증(inflammation in the eye), 구강 염증(inflammation in the mouth), 호흡기 시스템 염증(inflammation of the respiratory system), 폐 염증(inflammation of the lung), 피부 염증(inflammation of the skin), 심혈관 시스템 내 염증(inflammation within the cardiovascular system), 뇌 염증(inflammation of the brain), 귀 염증(inflammation in the ear), 점막염(mucositis), 구내염(stomatitis), 임플란트 주위염(peri-implantitis), 망막염(retinitis), 맥락막염(chorioiditis), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca), 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD), 포도막염(uveitis), 전방 포도막염(anterior uveitis), 중간 포도막염(intermediate uveitis), 후방 포도막염(posterior uveitis), 치주염(periodontitis), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 천식(asthma), 치수염(pulpitis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 크론병(Crohn's disease), 건선 관절염(psoriatic arthritis), 혈관염(vasculitis), 간질성 방광염(interstitial cystitis); 감염 또는 상처의 자리에 급성 염증, 수막염(meningitis), 뇌염(encephalitis), 폐렴(pneumonia), 인두염(pharyngitis), 편도염(tonsillitis), 이염(otitis), 중이염(otitis media), 맥관염(vasculitis), 활액막염(synovitis), 장염(enteritis), 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 이식편 거부(graft rejection)로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 위한 JNK 억제자.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 귀 질환, 내이(inner ear) 질환, 청력 감소(hearing loss), 급성 청력 감소(acute hearing loss), 손상된 유모 세포 부동섬모(stereocilia), 유모 세포 자멸(apoptosis), 소음 외상(noise trauma), 이염(otitis) 및 중이염(otitis media)으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 대사 장애(metabolic disorders), 당뇨병(diabetes), 제1형 당뇨병(diabetes type 1), 제2형 당뇨병(diabetes type 2), 파브리병(Fabry disease), 고셰병(Gaucher disease), 저체온증(hypothermia), 이상 고열(hyperthermia), 저산소증(hypoxia), 지질 조직구증(lipid histiocytosis), 지방증(lipidoses), 이염백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 뮤코다당침착(mucopolysaccharidosis), 니만피크병(Niemann Pick disease), 비만(obesity), 및 울만병(Wolman's disease)으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 알렉산더병(Alexander disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 뇌졸중(apoplexy), 모세혈관확장성운동실조증(Ataxia Telangiectasia), 잘리거나 분쇄된 엑손(axons), 축색절단(axotomy), 뇌병변장애(brain lesions), 샤르코마리투드병(Charcot-Marie-Tooth, CMT), 피질기저 퇴행(corticobasal degeneration), 치매(dementia), 신경계통의 질환 또는 장애, 긴장 이상(dystonia), 간질(epilepsy), 파아버 증후군(Farber's disease), 프리드리히 운동실조증(Friedreich ataxia, SCA), 갱글리오사이드 축적증(gangliosidoses), 기엥 바레 증후군(Guillain-Barr'e syndrome), 유전성 강직성 하반신마비(hereditary spastic paraplegia), 히르슈슈프룽병(Hirschsprung's disease), 인체 면역결핍 파이러스 치매(human immunodeficiency virus dementia), 헌팅턴병(Huntington's disease), 뇌경색증(infarct of the brain), 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke), 크레베병(Krabbe disease), 레녹스가스토증후군(Lennox Gastaut Syndrome), 뇌회결손(lissencephaly), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes), 골수증(myelopathy), 에이즈 관련 신경퇴행성 질환(AIDS-related neurodegenerative diseases), 제2형 신경섬유종(neurofibromatosis type 2, NF-2), 뉴롤라디리즘(neurolatyerism), 신경세포 자가사멸(neuronal apoptosis), 신경세포사(neuronal death), 신경성 동통(neuropathic pain), 신경장애(neuropathy), 화학요법 유도 신경병증(chemotherapy induced neuropathy), 당뇨병 유도 신경병증(diabetes induced neuropathy), NMDA-유도 신경독증(NMDA-induced neurotoxicity), 통증, 파킨슨병(Parkinson's disease), 파킨슨증후군(parkinsonism), 픽병(Pick's Disease), 다발성신경장애(polyneuropathy), 진행성핵상마비(progressive supranuclear palsy), 샌드호프병(Sandhoff disease), 척추뼈 갈림증(spina bifida), 발작, 테아삭병(Tay Sachs), TBI (광범위 축삭 상해(diffuse axonal injury)), 예를 들어 염증성 통증에 의해 유도된 어두운 뉴런의 치료, 웨스트 증후군(West Syndrome) 및 척추성 근위축증(spinal muscular atrophy)으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  23. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 CNS의 자가면역질환, 자가염증성(auto-inflammatory)질환, 셀리악병(Celiac disease); 쇼그렌증후군(Sjogren's syndrome) 및 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  24. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 관절염(arthritis), 추간판 탈출증(disc herniation), 진행성 골화성 섬유이형성증(fibrodysplasia ossificans progressive, FOP), 골관절염(osteoarthritis), 골석화증(osteopetrosis), 골다공증(osteoporosis), 당뇨 유도 골다공증(diabetes induced osteoporosis), 파제트병(Paget's Disease) 및 류마티스성 관절염으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 건선(psoriasis) 및 홍반성 낭창(lupus erythematosus)으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  26. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 연령과 관련된 황반 퇴화(age-related macular degeneration, AMD); 망막색소선조(angioid streaks); 전방허혈성시신경병증(anterior ischemic optic neuropathy); 전방포도막염(anterior uveitis); 백내장(cataract), 특히 연령과 관련된 백내장; 중심성 삼출성 맥락망막병증(central exudative chorioretinopathy); 중심성 장액성 맥락망막병증(central serous chorioretinopathy); 선립종안검맥립종(chalazion); 맥락막 결여(chorioderemia); 맥락막염(chorioiditis); 맥락막 경화증(choroidal sclerosis); 결막염(conjunctivitis); 모양체염(cyclitis); 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy); 안구 건조증(dry eye syndrome); 내안구염(endophthalmitis); 상공막염(episcleritis); 안구 감염(eye infection); 백색점상안저(fundus albipunctatus); 맥락막 및 망막의 우곡상위축(gyrate atrophy); 맥립종(hordeolum); 블레파라(blephara)의 염증성 질환; 맥락막의 염증성 질환; 모양체(ciliary body)의 염증성 질환; 결막(conjunctiva)의 염증성 질환; 각막의 염증성 질환; 홍채(iris)의 염증성 질환; 누선(lacrimal gland)의 염증성 질환; 안와골(orbital bone)의 염증성 질환; 공막(sclera)의 염증성 질환; 유리체(vitreous body)의 염증성 질환; 포도막(uvea)의 염증성 질환; 망막(retina)의 염증성 질환; 중간 포도막염(intermediate uveitis); 홍채염(irititis); 각막염(keratitis); 레베르병(Leber's disease); 다소성 맥락막염(multifocal choroiditis); 안 근육의 근염(myositis); 신생혈관 황반증(neovascular maculopathy) (예를 들어, 고도 근시(high myopia), 근시, 경사 디스크 증후군(tilted disc syndrome), 맥락막 골종(choroidal osteoma) 등에 의해 유발된); NMDA 유도 망막독성(retinotoxicity); 비 만성 또는 만성 염증성 안 질환(non-chronic or chronic inflammatory eye diseases); 오구치병(Oguchi's disease); 시신경 질환(optic nerve disease); 안와 봉와직염(orbital phlegmon); 전안구염(panophtalmitis); 전포도막염(panuveitis); 포스트 캡슐 혼탁(post caspule opacification); 후낭 혼탁(posterior capsule opacification, PCO) (백내장 수술 후 합병증); 후방 포도막염(posterior uveitis); 증식성 망막병증(proliferative vitreoretinopathy); 망막 동맥 폐색(retinal artery occlusion); 망막 박리(retinal detachment), 망막 질환(retinal diseases); 망막 상해(retinal injuries); 망막 거대혈관류(retinal macroaneurysm); 망막 색소 상피 분리(retinal pigment epithelium detachment); 망막 정맥 폐색(retinal vein occlusion); 망막염(retinitis); 색소성 망막염(retinitis pigmentosa); 백점상 망막염(retinitis punctata albescens); 망막병증(retinopathy), 특히 미숙(prematurity)의 망막병증(retinopathy) 및 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy); 공막염(scleritis); 스타르가르트병(Stargardt's disease); 염증이 생긴 안구 상처(inflamed ocular wounds) 및/또는 안구 상처 가장자리의 치료; 안구 수술 또는 외상 후 안내 염증(intraocular inflammation)의 치료; 포도막염(uveitis); 및 바이텔리폼 황반 영양실조(vitelliform macular dystrophy)로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  27. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 치주염(periodontitis), 특히 만성 치주염; 점막염(mucositis), 구강 박리성 장애(oral desquamative disorders), 구강 편평태선(oral liquen planus), 심상성천포창(pemphigus vulgaris), 임플란트 주위염(peri-implantitis), 치수염(pulpitis); 구내염(stomatitis); 및 악관절 장애(temporomandibular joint disorder)로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  28. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 암 및 종양 질환, 아쿠스티쿠스 신경초종 폐 암종(acusticus neurinoma lung carcinomas); 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia) (L1, L2, L3); 급성 림프성의 백혈병(acute lymphoid leukaemia, ALL); 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia, AML); 선암(adenocarcinomas); 항문암(anal carcinoma); 기관지암(bronchial carcinoma); 경부암(cervix carcinoma); 자궁경부암(cervical cancer); 성상 세포종(astrocytoma); 기저세포종(basalioma); Bcr-Abl 변환(transformation) 암; 방광암(bladder cancer); 아세포종(blastomas); 골암(bone cancer); 뇌 전이(brain metastases); 뇌 종양(brain tumours); 유방암(breast cancer); 버키트 림프종(Burkitt's lymphoma); 암양종(carcinoids); 자궁경부암; 만성 림프성 백혈병(chronic lymphocytic leukaemia, CLL); 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukaemia, CML); 대장암(colon cancer); 결장암(colon carcinoma); 자궁체부암(corpus carcinoma); 두개인두종(craniopharyngeomas); CUP 증후군; 바이러스 유도 종양; EBV-유도 B 세포 림프종; 자궁내막암(endometrium carcinoma); 적백혈병(erytholeukemia) (M6); 식도암(esophagus cancer); 담낭암(gallbladder cancer); 위장암(gastrointestinal cancer); 위장관 간질종양(gastrointestinal stromal tumors); 위장 종양(gastrointestinal tumours); 비뇨생식기암(genitourinary cancer); 녹내장(glaucoma); 교아종(glioblastoma); 신경교종(gliomas); 머리/목 종양(head/neck tumours); B형 간염(hepatitis)-유도 종양; 간세포암(hepatocell carcinomas); 간종양(hepatomas); 헤르페스 바이러스(herpes virus) 유도 종양; 호즈킨 증후군(Hodgkin's syndrome); HTLV-1-유도 림프종(lymphomas); HTLV-2-유도 림프종; 인슐린종(insulinomas); 장암(intestinal cancer); 카포시 육종(Kaposi's sarcoma); 신장암(kidney cancer); 신장 암종(kidney carcinomas); 후두암(laryngeal cancer); 백혈병; 리드 종양(lid tumour); 간암(liver cancer); 간전이(liver metastases); 폐암(lung cancer); 림프암(lymphoid cancer); 림프종(lymphomas); 악성 흑색종(malignant melanomas); 유방암(mammary carcinomas); 외투세포림프종(mantle cell lymphoma); 수모세포종(medulloblastoma); 거핵아세포 백혈병(megakaryoblastic leukemia) (M7); 흑색종, 특히 악정 흑색종; 수막종(meningioma); 중피종(mesothelioma); 단구성 백혈병(monocytic leukemia) (MS); 다발성 골수종(multiple myeloma); 균상식육종(mycosis fungoides); 골수아구세포성백혈병(myeloblastic leukemia) (M1); 골수아구세포성백혈병 (M2); 골수단구성백혈병(myelomonocytic leukemia) (M4); 신경초종(neurinoma); 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas); 비-소세포암(non-small cell carcinoma); 폐의 비-소세포암; 식도암(oesophageal cancer); 식도 암종(oesophageal carcinoma); 희돌기교종(oligodendroglioma); 난소암(ovarian cancer); 난소 암종(ovarian carcinoma); 췌장암(pancreatic cancer); 췌장 암종(pancreatic carcinoma); 유두종 바이러스(papilloma virus)-유도 암종; 음경암(penis cancer); 점액 종양(pituitary tumour); 플라스마세포종(plasmocytoma); 전골수구성백혈병(promyelocytic leukemia) (M3); 전립선암(prostate cancer); 전립성 종양(prostate tumours); 직장 종양(rectal tumours); 직장 암종(rectum carcinoma); 신세포암(renal-cell carcinoma); 망막아종(retinoblastoma); 육종(sarcomas); 스크니버거병(Schneeberger's disease); 폐소세포암종(small cell lung carcinomas); 소장암(small intestine cancer); 소장 종양(small intestine tumours); 연성 조직 종양(soft tissue tumours); 척수종(spinalioma); 편평상피암(squamous cell carcinoma); 위암(stomach cancer); 고환암(testicular cancer); 인후암(throat cancer); 흉선종(thymoma); 갑상선암(thyroid cancer); 갑상선 암종(thyroid carcinoma); 설암(tongue cancer); 비분화된 AML (MO); 요도암(urethral cancer); 자궁암(uterine cancer); 질암(vaginal cancer); 폰 힙펠 린다우병(Von Hippel Linda disease); 외음암(vulval cancer); 윌름즈 종양(Wilms' Tumor); 및 색소성 건피증(Xeroderma pigmentosum)으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  29. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 동맥성 고혈압(arterial hypertension); 동맥 경화증(arteriosclerosis); 동맥경화성 병변(arteriosclerotic lesions); 베체트 증후군(Behcet's syndrome); 혈관의 분기(bifurcations of blood vessels); 심장비대(cardiac hypertrophy); 심혈관비대(cardiavascular hypertrophy); 심근증(cardiomyopathies), 특히 화학적 방법으로 유도된 심근증; 뇌 빈혈(cerebral ischemia); 관상동맥성 심장 질환(coronary heart diseases); 복부대동맥(abdominal aorta)의 팽창(dilatation); 국소 뇌 허혈(focal cerebral ischemia); 전뇌 허혈(global cerebral ischemia); 심장 비대증(heart hypertrophy); 신장하부 동맥 고혈압(infrarenal aneurism hypertension); 국소빈혈(ischemia); 심근 경색(myocardial infarct), 특히 급성 심근 경색; 심근염(myocarditis); 래퍼퓨전(reperfusion); 재발협착증(restenosis); 맥관염(vasculitis); 및 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis)으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  30. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 관상 동맥 우회 수술 (CABG 수술); 경피적 경혈관 관상동맥 형성술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA); 및/또는 스텐트(stent) 치료에 보완하여 사용되는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  31. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 급성 호흡 곤란 증후군(acute respiratory distress syndrome, ARDS); 천식(asthma); 호흡기 시스템과 관련된 만성 질병; 만성 폐쇄성 폐 질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD); 낭포성 섬유증(cystic fibrosis); 폐 질환; 염증성 폐 질환; 폐렴; 폐섬유증(pulmonary fibrosis); 등으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  32. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 대장염(colitis), 비전형적 대장염(atypical colitis), 화학적 대장염(chemical colitis); 교원성 대장염(collagenous colitis), 말단 대장염(distal colitis), 전환성 대장염(diversion colitis); 전격성 대장염(fulminant colitis), 부정성 대장염(indeterminate colitis), 전염성 대장염(infectious colitis), 허혈성 대장염(ischemic colitis), 림프구성 장염(lymphocytic colitis), 미세 장염(microscopic colitis), 크론병(Crohn's disease), 위장염(gastroenteritis), 히르슈슈프룽병(Hirschsprung's disease), 염증성 소화 질환(inflammatory digestive diseases); 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD), 몰버스 크론(Morbus Crohn), 비-만성 또는 만성 소화 질환, 비-만성 또는 만성 염증성 소화 질환; 지방성 장염(regional enteritis) 및 궤양성 대장염(ulcerative colitis)으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  33. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 세균 감염성 질환, 바이러스 감염성 질환, 바이러스성 뇌염; 바이러스 유도 암 및 종양, 인체 면역 결핍 바이러스 치매(human immunodeficiency virus dementia), 수막염(meningitis), 수막뇌염(meningoencephalitis), 뇌척수염(encephalomyelitis) 및 편도선염(tonsillitis)으로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  34. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 알스코그 증후군(Aarskog syndrome), 아세트아미노펜 간독성(hepatotoxicity); 알더-레일리의 이상(Alder-Reilly anomaly); 원형 탈모증(alopecia areata); 알파-1-항트립신 결핍증(alpha-1-antitrypsin deficiency); 과민증(anaphylaxis); 세포자멸(apoptosis); 세포자멸성 세포 치사(apoptotic cell death); 비전형적 용혈성 요독성 증후군(atypical hemolytic uremic syndrome); 바소페니아(basopenia); 호염기구증가(basophilia); 양극성 정동장애(bipolar disorders); 화상(burns); 세포의 전단 응력(cellular shear stress); 체디아크-히가시 증후군(Chedial-Higashi syndrome); 화학요법 약물(chemotherapeutic drugs)에 의한 DNA 손상; 담즙울체(cholestasis); 염색체 11, 부분 단염색체(Partial Monosomy) 11q; 염색체 22, 삼염색체 모자이크(Trisomy Mosaic); 만성육아종증(chronic granulomatous disease); 만성 또는 전격성 간염과 같은 간염; 임상 우울증(clinical depression); 공통 가변성의 저감마글로불린 혈증(common variable hypogammaglobulinemia); 선천성 C3 결핍(congenital C3 deficiency); 활성화 유도 세포 사멸(activation-induced cell death, AICD)로부터 CTL 보호; 난청(deafness); 우울증 및 우울증 장애(특히 우울증 장애의 예방은 사이토카인-유도 병 작용(sickness behaviour)의 배경에 발달한다), 흉선무형성(DiGeorge's syndrome); 결함이 있는 세포자멸에 의해 유발된 질환; 간 질환; 척추 질환; 자궁 질환; DNA 손상 물질(DNA damaging agents) 및/또는 이온화 방사선(ionizing radiation)에 노출 및 세포 스트레스 발생에 의한 질병 상태 및 증상; 다운 증후군; 뒤센 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy); 외배엽 이형성증(ectodermal dysplasias); 자궁내막증(endometriosis); 호산구 감소증(eosinopenia); 호산 백혈구 증가증(eosinophilia); 흥분독성 세포 사멸(exocitoxic cell death); 태아기 알코올 증후군(fetal alcohol syndrome); 섬유증(fibrosis); 섬유증 질환(fibrotic disease); 섬유증 조직의 형성; 자유 라디칼 (세포 스트레스를 주도); 이식편 거부; 이식편대숙주 질환(graft versus host disease); 탈모(hair loss); 용혈성 요독성 증후군(hemolytic uremic syndrome); 간독성(hepatotoxicity); 당뇨 유도 통각 과민증과 같은 통각 과민증(hyperalgesia); 이상 고열(hyperthermia); 저혈당(hypoglycaemia); 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism); 특발성 과호산구성 증후군(idiopathic hypereosinophilic syndrome); IgA 신장해(nephropathy); 유아 성-연관 무감마글로불린혈증(agammaglobulinemia); 염증성 통증(inflammatory pain); 신장하부 동맥류(infrarenal aneyrism); 섬 재생(islet regeneration); 섬 이식(islet transplantation); 잡 증후군(Job's syndrome) (과도한(hyper)-lgE); 레이지 백혈구 증후군(lazy leukocyte syndrome); 백혈구 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 결핍증(leukocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency); 백질이영양증(leukodystrophy); 백혈구 감소증(leukopenia); 림프성 백혈구 증가증(lymphocytic leucocytosis); 림프구 감소증(lymphocytopenia); 림프구 증가증(lymphocytosis); 주우울증(major depression); 조증(mania); 조울증(maniac depression); 마르판 증후군(Marfan syndrome); 비만 세포증(mastocytosis); 메이 헤이글린 이상(May Hegglin Anomaly); 제2형 막성증식성 사구체신염(membranoproliferative glomerulonephritis Type II); 단구감소증(monocytopenia); 단구증가증(monocytosis); 미엘로퍼옥시다아제 결핍증-양성(myeloperoxidase deficiency-benign); 근질환(myopathies); 호중구 감소증(neutropenia); 호중구 증가증(neutrophilia); 네젤로프 증후군(Nezelof's syndrome); 장기 이식(organ transplantation); 산화 스트레스 상처(oxidative stress injuries); 펠거-호이트 이상(Pelger-Huet anomaly); 다낭 신증(polycystic kidney diseases); 후기-투석 증후군(post-dialysis syndrome); 방사선 증후군(radiation syndromes); 방사선 치료(radiotherapy); 신장병(renal diseases); 신장 부전증(renal failure); 활성화 유도 세포 사멸로부터 CTL 구제; 심한 결합 면역결핍 질환; 이식 거부(transplant rejection); 이식(transplantation); 삼염색체성(trisomy); 단극성 우울증(unipolar depression); UV-유도 상처; 비스코트 올드리치 증후군(Wiskott Aldrich syndrome) 및 상처 치료로부터 선택된 질환 및/또는 장애의 치료를 위한 JNK 억제자.
  35. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 측두하악관절장애(temporomandibular joint disorder)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  36. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 점막염(mucositis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  37. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 구내염(stomatitis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  38. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 임플란트 주위염(peri-implantitis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  39. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 구강 편평태선(oral liquen planus)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  40. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 심상성천포창(pemphigus vulgaris)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  41. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 치주염(periodontitis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  42. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 만성 치주염(chronic periodontitis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  43. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 치수염(pulpitis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  44. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 포도막염(uveitis), 특히 전방 포도막염(anterior uveitis), 중간 포도막염(intermediate uveitis) 및/또는 후방 포도막염(posterior uveitis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  45. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 안구 건조증(dry eye syndrome)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  46. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 관상 동맥 우회 수술(coronary artery bypass graft surgery)의 맥락에서 투여되는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  47. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 경피적 경혈관 관상동맥 형성술(percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)의 맥락에서 투여되는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  48. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 스텐트(stent) 교체의 맥락에서 투여되는 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  49. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 급성 심근 경색(acute myocardial infarction)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  50. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 아테롬성 동맥 경화증(atherosclerosis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  51. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 COPD의 치료를 위한 JNK 억제자.
  52. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 천식(asthma)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  53. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  54. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 골관절염(osteoarthritis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  55. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 크론병(Crohn's disease)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  56. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 염증성 장 질환(inflammatory bowel diseases, IBD)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  57. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 건선(psoriasis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  58. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 당뇨, 특히 제1형 당뇨(diabetes type 1)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  59. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 뇌졸중(stroke)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  60. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 파킨슨병(Parkinson's disease)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  61. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  62. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  63. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 맥관염(vasculitis), 특히 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  64. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 급성 난청(acute hearing loss)의 치료를 위한 JNK 억제자.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 JNK 억제자는 SEQ ID NO: 172의 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 JNK 억제자.
  66. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 정의된 JNK 억제자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
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