MX2014007566A - Moleculas inhibidoras jnk novedosas para tratamiento de varias enfermedades. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de moléculas inhibidoras JNK novedosas y su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal para terapia.

Description

MOLECULAS INHIBIDORAS JNK NOVEDOSAS PARA TRATAMIENTO DE VARIAS ENFERMEDADES CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al campo de inhibición de enzima, en particular a inhibidores de (poli- ) péptido de cinasa de terminal amino c-Jun (JNK, por sus siglas en inglés). En particular, la presente invención se refiere para usar estos inhibidores JNK en el tratamiento de varias enfermedades.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La cinasa de terminal amino c-Jun (JNK, por sus s*iglas en inglés) es un miembro del grupo activado por tensión de proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAP, por sus siglas en inglés). Estas cinasas se han implicado en el control de diferenciación y crecimiento celular, y, más generalmente, en la respuesta de células a estímulo ambiental. La trayectoria de tránsducción de señal JNK está activada en respuesta a tensión ambiental por la interacción de varias clases de receptores de superficie celular. Estos receptores pueden incluir receptores de citoguina, receptores de serpentina y tirosina cinasas del receptor. En células mamíferas, JNK se ha implicado en procesos biológicos, tales como transformación oncogénica y respuestas adaptivas mediadas para tensión ambiental. La JNK también sé ha asociado con respuestas inmunitarias moduladas, incluyendo maduración y diferenciación de células inmunitarias, asi como efectuar muerte celular programada en células identificadas para destrucción por el sistema i munitaria. Esta propiedad única hace la señalización JNK un. objetivo prometedor para desarrollar intervención farmacológica. Entre los diversos trastornos neurológicos, la señalización JNK se implica particularmente en apoplejía isquémica y mal de Parkinson, pero también en otras enfermedades como se menciona además a continuación. Adicionalmente, la proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK, por sus siglas en inglés) p38alfa se mostró que regula negativamente la proliferación celular al antagonizar la trayectoria JNK-c-Jun. La proteína cinasa activada por mitógeno (MAPK) p38alfa por lo tanto parece estar activa en supresión de proliferación de célula de cáncer y normal y, como una más, demuestra el involucramiento de JNK en enfermedades de cáncer (ver por ejemplo Hui et al., Nature Genetics, Vol 39, No. 6 de Junio de 2007). También se mostró, que la cinasa de terminal N c-Jun (JNK) está involucrada en el dolor neuropático producido por la ligación del nervio espinal (SNL, por sus siglas en inglés), en donde la SNL induce una activación persistente y lenta de JNK, en particular JNK1, mientras que la activación de la proteina cinasa activada por mitógeno p38 se encontró en la microglia espinal después de la SNL, que ha caído cerca del nivel basal por 21 días (Zhuang et al., The Journal of Neuroscience, 29 de Marzo de 2006., 26 (13) : 3551-3560) ) . En 2007 (Biochemica et Biophysica Acta, pp. 1341-1348), Johnson et al. discute en una revisión la trayectoria activada por tensión/cinasa c-Jun, el involucramiento de señalización JNK en enfermedades tales como el involucramiento de. excitotoxicidad de neuronas del hipocampo, isquemia hepática, reperfusión, enfermedades neurodegenerativas, pérdida de audición, sordera, defectos congénitos del tubo neural, cáncer, enfermedades inflamatorias crónicas, obesidad, diabetes, en particular diabetes resistente a la insulina, y propone que es probable que los inhibidores JNK selectivos sean necesarios para tratamiento de varias enfermedades con un grado alto de especificidad y carencia de toxicidad.

La inhibición o interrupción de la trayectoria de señalización JNK es de esta manera un enfoque prometedor al combinar trastornos fuertemente relacionados con i señalización JNK. Sin embargo, sólo existen unos pocos inhibidores de la trayectoria de señalización JNK conocidos hasta ahora.

Los inhibidores de la trayectoria de señalización JNK como ya se conocen en el arte previo incluyen por ejemplo inhibidores de cinasa corriente arriba (por ejemplo, CEP-1347), inhibidores químicos pequeños de JNK (SP600125 y AS601245), que directamente afectan la actividad de cinasa por ejemplo al competir con el sitio enlazado a ATP de la proteína cinasa, e inhibidores de péptido de la interacción entre JNK y sus sustratos (ver por ejemplo Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, Febrero 2005, vol. 4, no. 1, pp. 63-67; WO 2007/031280; todas incorporadas en presente como referencia). La WO 2007/031230 describe péptidos de fusión permeables de célula pequeña, que comprenden una secuencia transportadora TAT así nombrada derivada de la secuencia de tráfico básica de la proteína HIV-TAT y una secuencia inhibidora de aminoácidos de IB1.

La WO 2007/031280¦ describe en particular dos secuencias específicas, L-TAT-IB1 (GRKKRRQRRRPPRPKRPTTLNLFPQVPRSQD, en la presente SEQ ID NO: 196) y D-TAT-IB1 (dqsrpvqpfInlttprkprpprrrqrrkkrg; en la presente SEQ ID NO: 197), la última siendo la secuencia retro-inversa de L-TAT-IB1. Debido a la secuencia transportadora derivada de HIV TAT, estos péptidos de fusión son más eficientemente transportados en las células objetivo, donde permanecen efectivas hasta la degradación proteolítica .

Ya que los inhibidores de péptido independientes ATP de JNK son usualmente inhibidores más específicos, son frecuentemente la primera elección si llega a inhibir JNK. Sin embargo, aún los inhibidores de péptido descritos en la WO 2007/031280 no son óptimos para todos los propósitos. Por ejemplo, el compuesto L-TAT-IB1 (en la presente SEQ ID NO: 196) que consiste de aminoácidos L únicamente, se degrada proteolíticamente de manera rápida. Con objeto de superar este problema, los inventores de la WO 2007/031280 también sugieren D-T7AT-IB1 (en la presente SEQ ID NO: 197), que comprende aminoácidos . D. Para ser más precisos, D-TAT-IBl exhibe la secuencia retro-inversa de L-TAT-IB1. La incorporación de los aminoácidos se hace difícil por el hecho de que el cambio en estereoquímica puede llevar a una pérdida de función. El enfoque retro-inverso puede emplearse para reducir el riesgo debido al uso de i) únicamente aminoácidos D ii) pero en la secuencia de péptido inverso puede proporcionar más probablemente un análogo conformacional aceptable al péptido original que incorporar uno o más aminoácidos D en la secuencia original. En el caso de la WO 2007/031280 este enfoque resulta sin embargo en una disminución importante en capacidad inhibidora en comparación con L-TAT-IB1 (ver Fig. 4). Adicionalmente, el péptido retro-inverso es extremadamente estable hacia la digestión proteolítica con la consecuencia de que las digestiones controladas, por ejemplo' al momento de los experimentos sensibles, son difícilmente posibles.

Se han discutido, propuesto y probado exitosamente los inhibidores JNK en el arte como tratamiento para una variedad de estados de la enfermedad. Ya en 1997, Dickens et al. describe el inhibidor JIP-1 de cinasa de terminal amino c-Jun y propone JIP-1 como compuestos candidato para estrategias terapéuticas para el tratamiento de por ejemplo leucemia mieloide crónica, en particular, en el contexto de transformación provocada por Bcr-Abl de pre-células B (Science; 1997; 277 (5326) :'693-696) .

En 2001, Bonny y compañeros de trabajo publicaron que los inhibidores de péptido permeables celulares de JNK confirman protección de larga duración para células ß pancreáticas de apoptosis inducida por IL-?ß y puede, de esta manera, conservar células ß en la destrucción autoinmunitaria en el curso de diabetes (Diabetes, 50, 2001, p. 77 - 82) .

Bonny et al. (Reviews in Neurosciences , 2005, p. 57 -67) discute también la acción inhibidora del inhibidor JNK D-JNKI-1 y otros inhibidores JNK en el contexto de excitotoxicidad, muerte celular neuronal, hipoxia, isquemia, daño cerebral traumático, epilepsia, enfermedades neurodegenerativas, apoptosis de neuronas y células auditivas sensoriales del oído interno etc.

En la WO 98/49188 los inhibidores derivados de JIP-1 de señalización JNK se proponen · para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como mal de Parkinson o enfermedad de Alzheimer; apoplejía y pérdida de memoria asociada, enfermedades autoinmunitarias tales como artritis; otras afecciones caracterizadas por inflamación; malignidades, tales como leucemias, por ejemp]o leucemia mielógena crónica (CML, por sus siglas en inglés); daño oxidativo a órganos tales como el hígado y riñon; enfermedades cardiacas; y rechazos del trasplante.

Borsello et al. (Nat Med, 2003, (9), p. 1180 - 1186) publica que un inhibidor péptido- de cinasa de terminal N c-Jun se protege contra la excitotoxicidad e isquemia cerebral.

Assi et al. ha' publicado que otro inhibidor JNK específico, SP600125, dirige la producción del factor-a de necrosis del tumor y apoptosis de célula epitelial en colitis de murino agudo. Los autores concluyen que la inhibición de JNK es de valor en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria del intestino humano (Immunology; 2006, 118 (1) : 112-121) .

En Kennedy et al. (Cell Cycle, 2003, 2(3), p. 199 -201), el papel de la señalización JNK en el desarrollo del tumor se discute en más detalle.

Lee Yong Hee et al. (J Biol Chem 2003, 278(5), P. 2896 - 2902) muestra que la cinasa de terminal N c-Jun (JNK) media la inhibición de retroalimentación de la cascada de señalización de insulina y há propuesto que la inhibición de señalización JNK es un buen enfoque terapéutico para reducir la resistencia de insulina en pacientes diabéticos.

Milano et al. (Am J Physiol Heart Circ Physiol 2007 ; 192(4): H1828 - H1835) descubre que un inhibidor de péptido de cinasa de terminal NH2 c-Jun reduce la lesión de reperfusión de isquemia al miocardio y el tamaño del infarto in vivo. Los autores del estudio usan un inhibidor de péptido, D-JNKI-I, un péptido de dos dominios que contiene una secuencia de 20 aminoácidos del dominio enlazado a JNK mínimo de proteína 1 que interactua con JNK/isleta-cerebro-1 , ligada a una secuencia TAT de 10 aminoácidos de la proteína TAT del virus de inmunpdeficiencia humano que media la transubicación intracelular . Los autores han concluido que una reducción en la fosforilación y actividad JNK debido a la presencia del inhibidor es importante en la conservación de la función cardiaca en ratas en la fase de isquemia y apoptosis.

Un grupo adicional ha publicado que los inhibidores de péptido pequeños de JNKs protegen contra la lesión dopaminérgica nigral inducida por MPTP por medio de inhibición de la trayectoria de señalización JNK (Pan et al., Laboratory investigation, 2010, 90, 156 - 167) . Los autores concluyen que un péptido comprende 153 - 163 residuos de JIP-1 de murino fusionados al péptido TAT ofrece neuroprotección contra la lesión MPTP por medio de inhibición de la trayectoria de señalización JNK y proporciona un enfoque terapéutico para el mal de Parkinson.

Para daño a la audición, Pi rvola et al. (The Journal of Neuroscience, 2000, 20(1); 43 - 50) describe el rescate de audición, células vellosas auditivas y neuronas por CEP-1347./KT7515, un inhibidor de la activación de cinasa de terminal N c-Jun. Los autores sugieren en general que la intervención terapéutica en la cascada de señalización JNK puede ofrecer oportunidades para tratar lesiones del oído interno. El tratamiento de pérdida auditiva por medio de la administración de péptidos inhibidores JNK también se describe por ejemplo en WO 03/103698.

Para enfermedades de la retina y degeneración de la mácula relacionada con la edad en particular, Roduit et al. (Apoptosis, 2008, 13(3), p. 343 - 353) ha sugerido asimismo usar inhibición JNK ¦ como enfoque terapéutico. Las consideraciones similares que dependen de la inhibición JNK se describen por ejemplo en la WO 2010/113753 para el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad, edema macular diabético, retinopatia diabética, coriorretinopatía exudativa central, estrias angioides, desprendimiento del epitelio del pigmento retinal, coróiditis multifocal , maculopatia neovascular, retinopatia del prematuro, retinitis pigmentosa, enfermedad de Leber, oclusión de la arteria retinal, oclusión de la vena retinal, coriorretinopatía serosa central, macroaneurisma retinal, desprendimiento retinal, vitreoretinopatía proliferativa , enfermedad de Stargardt, esclerosis coroidal, corioderemia , distrofia macular viteliforme, enfermedad de Oguchi, albipunctatus fundus, retinitis punctata albescens, y atrofia girada de coroide y retina.

Zoukhri et al. (Journal of Neurochemistry, 2006, 96, 126 - 135) identifica que la cinasa de. terminal N¾ c-Jun media la inhibición inducida por ß de interleucina-1 de secreción de la glándula lagrimal. Llegó a la conclusión de que JNK juega un papel fundamental en la inhibición mediada por ß IL-1 de la secreción de la glándula lagrimal y ojo seco posterior.

Para uveitis, Touchard et al. (Invest Ophthalmol Vis Sci, 2010, 51(9); 4683 - 4.693) ha sugerido usar D-JNKI 1 como tratamiento efectivo.

Para IBD (enfermedad inflamatoria del intestino) Roy et al. (World J Gastroenterol 2008, 14(2), 200 - 202) ha resaltado el papel, de la trayectoria de transduccion de señal JNK en esto y ha propuesto usar inhibidores JNK peptidicos para el tratamiento del estado de la enfermedad.

Beckham et al ( J Virol. Julio 2007; 81 (13) : 6984-6992 ) muestra que el inhibidor JNK D-JNKI-1 es efectivo al proteger ratones de encefalitis vírica, y sugiere de esta manera inhibición JNK como estrategia de tratamiento novedosa y prometedora para encefalitis vírica.

Palin et al. ( Psychopharmacology (Berl) . Mayo 2008; 197 (4) : 629-635) usa el mismo inhibidor JNK, D-JNKI-1, y encuentra que el pre-tratamiento con D-JNKI-1 (10 ng/ratón), pero no D-TAT, inhibe significativamente los tres índices de enfermedad inducidos por TNFalfa central y sugiere que la inhibición JNK como medio para tratar trastornos depresivos principales que se desarrollan en un antecedente de comportamiento de la enfermedad inducida por citoquina.

En la WO 2010/15163.8 se propuso el tratamiento de la atrofia muscular espinal de la enfermedad neurodegenerativa por medio de inhibición' JNK.

El pasaje anterior resalta ya en base de únicamente algunas publicaciones seleccionadas la utilidad de inhibidor JNK en el tratamiento de varias enfermedades. De esta manera, existe una necesidad Constante en la técnica para inhibidores JNK para uso en el tratamiento dé enfermedades humanas (y animales) .

De esta manera, el problema a resolverse por la presente invención fue proporcionar inhibidores adicionales (péptido) de JNK.

El objetivo de la presente invención se resuelve por el inventor por medio de la material objeto establecida a continuación y en las reivindicaciones anexas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS En lo siguiente se dará una breve descripción de las figuras anexas. Las figuras se pretenden para ilustrar la presente invención en más detalle. Sin embargo, no se pretenden para limitar la material objeto de la invención de ninguna manera.

Figs. 1A, IB y 1C: Ilustración de la eficacia inhibidora de diversos inhibidores JNK de acuerdo con la presente invención, la cual se investigó por ensayo AlphaScreen in vitro (Ensayo de Selección Homogénea de Proximidad de Luminiscencia Amplificada) .

Fig.lA: Inhibición de JNK1 por las SEQ ID NOs: 193, 2, 3, 5, 6, y 7.

Fig.lB: Inhibición de JNK2 por las SEQ ID NOs: 193, 2, 3, 5, 6, y 7.

Fig.lC: Inhibición de JNK3 por las SEQ ID NOs: 193, 2, 3, 5, 6, y 7.

Fig. 2: Tabla que ilustra la eficacia inhibidora de diversos inhibidores JNK (SEQ ID NOs : 193, 2, 3, 5, 6, y 7) de acuerdo con la presente invención. Se dan los valores IC50 en el intervalo nM, el error estándar respectivo de la media y el número de experimentos realizados (n) .

Figs. 3A, 3B, 3C, 3D, 3E y 3F: Ilustración de la eficacia inhibidora de diversos inhibidores JNK de acuerdo con la presente invención, que son proteínas de fusión de un secuencia de (poli-) péptido del inhibidor JNK y una secuencia transportadora. La eficacia inhibidora se determinó por medio de ensayo AlphaScreen in vitro (Ensayo de Selección Homogénea de Proximidad de Luminiscencia Amplificada) .

Fig.3A: Inhibición de JNK1 por las SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 y 197.

Fig.3B: Inhibición de JNK2 por las SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174, 175,. 176, 177, 178, 179, 180, 181 y 197.

Fig.3C: Inhibición de JNK3 por las SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 173, 174-, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181 y 197.

Fig.3D: Inhibición de JNK1 por las SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 y 197.

Fig.3E: Inhibición de. JNK2 por las SEQ ID NOs : 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 y 197.

Fig.3F: Inhibición de JNK3 por las SEQ ID NOs: 194, 195, 172, 200, 46, 182, 183., 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 y 197.

Fig. 4: Tabla que ilustra la eficacia inhibidora de diversos inhibidores JNK de acuerdo con la presente invención, que son proteínas de fusión de una secuencia de (poli- ) péptido del inhibidor' JNK y una secuencia transportadora. Se dan los valores IC50 en el intervalo nM, el error estándar respectivo de la media (SEM) y el número de experimentos realizados (n) .

Figs. 5A y 5B : . Estabilidad de los '. inhibidores JNK con las SEQ ID NOs: 172, 196 y 197 en suero humano al 50%. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 196 se degradó totalmente en los residuos de aminoácidos dentro de 6 horas (Figura 5A) . El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se degradó completamente únicamente después de 14 días (Figura 5B) . El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 197 fue' estable al menos hasta 30 días (Figura 5B) .

Figs. 6A y 6B: muestra experimentos de internalizacior.es usando constructos del transportador derivados de TAT con patrón de aminoácido D/aminoácido L como se denota en la SEQ ID NO: 30. Las secuencias transportadoras analizadas corresponden a las SEQ ID NOs : 52-94 más SEQ ID NOs : 45, 47, 46, 43 y 99 (Fig 6a) y SEQ ID NOs: 100-147 (Fig. 6b). Como puede apreciarse, todos los transportadores con la secuencia de consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31) muestran una capacidad de internalización superior que el transportador L-TAT (SSQ ID NO: 43) . Las células Hela se incubaron 24 horas en placa de 96 pozos con lOmM de los transportadores respectivos. Las células luego se lavaron dos veces con una solución amortiguadora ácida . (Glicina 0.2M, NaCl 0.15M, pH 3.0) y dos veces con PBS. Las células se rompieron por la adición de solución amortiguadora de lisis RIPA. La cantidad relativa de péptido internalizado luego se determinó al leer la intensidad de fluorescencia (lector de placa Fusión Alpha; PerkinElmer) de cada extracto seguido por sustracción de fondo.

Figs. 7A, 7B, 7C y. 7D El inhibidor JNK con la secuencia de la SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de quimiocina y citoquina inducida por LPS en raacrófagos diferenciados por THPl- PMA. Fig. 7A: liberación de TNF (THPlpma 6h 3ng/ml LPS); Fig. 7B: liberación de TNFa (THPlpma 6h 10ng/ml LPS); Fig. 7C: liberación de IL 6 (THPlpma 6h 10ng/ml LPS) ; Fig. 7D: liberación de MCP1 (THPlpma 6h 3ng/mi LPS) .

Fig. 8 El inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación IL6 inducida por LPS en macrófagos diferenciados THP1 con potencia superior que D-TAT-IBl (SEQ ID NO: 197), dTAT (SEQ ID NO: 45) y SP 600125. LPS se agregó durante 6h (10 ng/ml) .

Fig. 9 El inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación de TNFa inducida por LPS en macrófagos diferenciados por THPl con potencia superior que D-TAT-IBl (SEQ ID NO: 197), dTAT (SEQ ID NO: 45) y SP 600125. LPS se agregó durante 6h (10 ng/ml) .

Fig. 10 El inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación IL-6 inducida por LPS en macrófagos diferenciados PMA con potencia superior que D-TAT-IBl (SEQ ID NO: 197) y L-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 196). LPS se agregó durante 6h.

Fig. 11 El inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación TNFa . inducida por LPS en macrófagos diferenciados PMA con potencia superior que D-TAT-IBl (SEQ ID NO: 197) y L-TAT-IB1 (SEQ ID NO: 196).

Fig. 12 El inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 bloquea la liberación TNFa inducida por LPS en Glóbulos Enteros de Rata Primarios en 3 ng/ml. Se dan los resultados para el control, 1 µ? de la SEQ ID NO: 172, 3 µ? de la SEQ ID NO: 172, y 10 µ? de la SEQ ID NO: 172 en diferentes niveles de LPS (ng/ml) .

Fig. 13 El inhib.idor JNK de la SEQ ID NO: 172 bloquea la secreción IL2 por células T humanas primarias en respuesta a PMA/Ionomicina .

Fig. 14 El inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 bloquea la secreción IL2 por células T humanas primarias en respuesta a la estimulación CD3/CD28. Los inhibidores JNK usados se indican por su SEQ ID NO: 172 y 197.

Fig. 15 Inhibición dependiente de la dosis por el inhibido JNK con la SEQ ID NO: 172 de la liberación IL-2 inducida por CD3/CD28 en células T primarias purificadas de ganglios linfáticos de rata. Las ratas de control se sacrificaron y los ganglios linfáticos se cosecharon. Las células T además se purificaron (usando selección negativa magnética) y colocaron en placa en placas de 96 pozos en 200.000 células/pozo. Las células se trataron con anticuerpos CD3 anti-rata y CD28 anti-rata (2'ug/mL) . El inhibidor JNK con SEQ ID NO: 172 se agregó a los cultivos lh antes del tratamiento CD3/CD28 y la liberación IL-2 se evaluó en el sobrenadante 24h después del tratamiento.

Fig. 16 La inhibición dependiente de la dosis de la liberación IL-2 inducida por CD3/CD28 en células T purificadas de ganglios linfáticos de rata primarias: Comparación de diversos inhibidores JNK, particularmente SEQ ID NOs: 172, 197 y SP600125.

Fig. 17 Inhibición dependiente de dosis de la liberación IL-2 en sangre entera de rata estimulada con P A + ionomicina. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se agregó en tres concentraciones diferentes, particularmente 1, 3 y 10 µ? lh antes de la estimulación con PMA + ionomicina. Tres dosis de activadores se agregaron (25/500 ng/mL, 50/750 ng/mL y 50/1000 ng/mL) durante 4h. La liberación IL-2 se evaluó en el sobrenadante. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 en 10µ? reduce eficientemente la liberación IL-2 inducida por PMA-iono en las tres concentraciones activadoras probadas.

Fig. 18 Inhibición JNK y liberación IL-6 en sangre entera humana. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se agregó en tres diferentes concentraciones, particularmente 1, 3 y 10µ? lh antes de la estimulación de sangre entera con LPS (0.02ng/mL) durante 4 horas. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 reduce la liberación IL-6 inducida por LPS en una manera dependiente de la dosis.

Fig. 19 Inhibición JNK y liberación IL-2 en sangre entera humana. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se agregó en tres diferentes concentraciones, particularmente 1, 3 y ??µ? lh antes de la estimulación de sangre entera con PMA+ionomicina (25/700ng/mL, 50/800ng/ml y 50/1000ng/mL) durante 4 horas. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 reduce la liberación IL-2 inducida por PMA+ionomicina en una manera dependiente de la dosis.

Fig. 20 Inhibición JNK y liberación I FN-? en sangre entera humana. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se agregó en tres diferentes concentraciones, particularmente 1, 3 y ??µ? lh antes de - la estimulación de sangre entera con PMA+ionomicina (25/700ng/mL, 50/8'00ng/ml y 50/1000ng/mL) durante 4 horas. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO : 172 reduce la liberación I FN-? inducida por PMA+ionomicina en una manera dependiente de la dosis.

Fig. 21 Inhibición JNK y liberación TNF-a en sangre entera humana. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO : 172 se agregó en tres diferentes concentraciones, particularmente 1, 3 y ??µ? lh antes de la estimulación de sangre entera con PMA+ionomicina (25/700ng/mL, 50/800ng/ml y 50/1000ng/mL) durante 4 horas. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO : 172 reduce la liberación TNF-a inducida por PMA+ionomicina en una manera dependiente de la dosis.

Fig. 22 Inhibición JNK y liberación TN F-OÍ en sangre entera humana. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO : 172 se agregó en tres diferentes concentraciones, particularmente 1, 3 y ??µ? lh antes de la estimulación de sangre entera con PHA-L (5ug/mL) durante 3 dias. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 reduce la liberación TNF-OÍ inducida por PHA-L en una manera dependiente.de la dosis.

Fig. 23 Inhibición JNK y liberación IL-2 en sangre entera humana. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se agregó en tres diferentes concentraciones, particularmente 1, 3 y ??µ? lh antes de la estimulación de sangre entera con PHA-L ¡5ug/mL) durante 3 días. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 reduce la liberación IL-2 inducida por PHA-L en una manera dependiente de la dosis.

Fig. 24 Inhibición JNK y liberación TNF-a en sangre entera humana. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se agregó en tres diferentes concentraciones, particularmente 1, 3 y ??µ? lh antes de la estimulación de sangre entera con anticuerpos CD3 +/- CD28 (2ug/mL) durante 3 días. El inhibidor JNK con la SEQ ÍD NO: 172 reduce la liberación TNF-a inducida por CD3/CD28 en una manera dependiente de la dosis.

Fig. 25 Ilustración fotográfica de propiedades antiinflamatorias in vivo 'de los inhibidores JNK con la SEQ ID NO: 197 (10 pg/kg) y SEQ ID NO: 172 (10 g/kg) después de la hinchazón de la pata inducida por CFA (adyuvante de Freund complete) . La hinchazón de la pata se indujo en la pata trasera izquierda, la pata trasera derecha no se trató.

Fig. 26 Representación gráfica de propiedades antiinflamatorias in vivo de los inhibidores JNK con la SEQ ID NO: 197 (10 ?/?^, · n=4) y SEQ ID NO: 172 (10 g/kg, n=3) después de la hinchazón de la pata inducida con CFA (adyuvante de Freund completo) . Se indica la circunferencia medida de la pata trasera izquierda después del tratamiento.

Fig. 27 Representación gráfica de las propiedades anti-inflamatorias in vivo de los inhibidores JNK con la SEQ ID NO: 197 (10 g/kg) y SEQ ID NO: 172 (10 pg/kg) después de la hinchazón de la pata inducida con CFA (adyuvante de Freund completo) . Se indica la liberación de citoquina in vivo medida una hora después de la hinchazón de la pata inducida con CFA.

Fig. 28 Evaluación clínica de la administración de diferentes cantidades del inhibidor JNK de acuerdo con la SEQ ID NO: 172 en ratas albinas después de la administración intravenosa (modelo de uveitis inducido por endotoxinas) . Formulación de izquierda hasta derecha: vehículo, 0.015 mg/kg (i.v.) de la SEQ ID NO: 172; 0.18 mg/kg (i.v.) de la SEQ ID NO: 172; 1.8 mg/kg (i.v.) de la SEQ ID NO: 172, 2 mg/kg (i.v.) de la SEQ ID NO: 197 y 20 de. dexametasona (administrada directamente por inyección subcon untival al ojo). Se indica en el registro clínico (media y la SE ) .

Fig. 29 Efectos receptivos del inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 después de la administración intravenosa diaria en artritis de colágeno Tipo II establecida crónica en ratas de 14 días (RTTC/SOL-1) . Se muestra el cambio de peso corporal del día 0 hasta el día 14. Desde izquierda a derecha: Estela normal + vehículo (NaCl) , Control de enfermedad + vehículo (NaCl), 5 mg/kg (i.v.) de la SEQ ID NO: 172; 1 mg/kg (i.v.) de la SEQ ID NO: 172; 0.1 mg/kg (i.v.) de la SEQ ID NO: 172, 0.01 mg/kg (i.v.) de la SEQ ID NO':. 172, 0.05 mg/kg (i.v.) de dexametasona . Se indica el registro clínico (media y la SEM) . n= 4/grupo normal, n=8/g^po de tratamiento; *p <0.05 ANOVA de 1 vía para el control de la enfermedad + vehículo (NaCl) Fig.30 Efectos receptivos del inhibidor JNK.de la SEQ ID NO: 172 después de la administración intravenosa diaria en artritis de colágeno Tipo II establecida crónica en ratas de 14 días (RTTC/SOL-1) . Se muestra el diámetro del tobillo (in) con el paso del tiempo. n= 4/grupo normal, n=8/grupo de tratamiento; *p <0.05 RM ANOVA de 2 vías para el control do la enfermedad + vehículo (NaCl) .

Fig. 31 Efectos receptivos' del inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 después de la administración intravenosa diaria en artritis de colágeno Tipo II establecida en ratas de 14 días (RTTC/SOL-1) . Se ilustran los registros de histopatología del tobillo con respecto a la inflamación, queratitis vascular, daño al cartílago y resorción del hueso. n=8 en el grupo de tratamiento. *p <0.05 prueba U Mann-Whitney para el control de la enfermedad + vehículo (NaCl) .

Fig. 32 Efectos receptivos del inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 después de la administración intravenosa diaria en artritis de colágeno tipo II establecida crónica en ratas de 14 días (RTTC/SOL-1) . Se ilustran los registros histopatológicos de la rodilla con respecto a la inflamación, queratitis vascular, daño del cartílago y resorción del hueso. n=8 en el grupo de tratamiento. *p <0.05 prueba U Mann-Whitney para control de la enfermedad + vehículo (NaCl) .

Fig. 33 Registro clínico por lámpara de hendidura 24 horas después de la inducción de EIU y administración del inhibidor JNK de acuerdo con la SEQ ID NO: 172 (1 mg/kg i.v.) en diferentes tiempos antes de la inducción EIU. De izquierda a derecha: vehículo (0 horas); SEQ ID NO: 172 4 semanas antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 2 semanas antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 1 semana antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 48 horas antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 24 horas antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 0 horas antes de la inducción EIU; Dexametasona (2 mg/kg i.v.) 0 horas antes de la inducción EIU. Media + SEM. *p<0.05 contra vehículo, **p<0.01 contra vehículo.

Fig. 34 Número de células PMN por sección cuantificadas 24 horas después de la inducción de EIU y la administración del inhibidor JNK de acuerdo con la SEQ ID NO: 172 (1 mg/kg i.v.) en diferentes tiempos antes de la inducción EIU. De izquierda a derecha: vehículo (0 horas); SEQ ID NO: 172 4 semanas antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 2 semanas antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 1 semana antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 48 horas antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 24 horas antes de la inducción EIU; SEQ ID NO: 172 0 horas antes de la inducción EIU; Dexametasona (2 mg/kg i.v.) 0 horas antes de la inducción EIU. Media ± SEM. *p<0.05 contra vehículo, **p<0.01 contra vehículo.

Fig. 35 muestra los valores TBUT AUC calculados medios para animales con síndrome . ojo seco inducido por escopolamina . Se muestran los resultados para animales tratados con el vehículo, 3 diferentes concentraciones de un (poli- ) péptido inhibidor JNK D-retro-inverso complete con la secuencia de la SEQ ID NO: 197, 3 diferentes concentraciones de un (poli- ) péptido del inhibidor JNK con la secuencia de la SEQ ID NO: 172, y los resultados para animales tratados con ciclosporina .

Fig. 36 muestra los PRTT AUCs calculados medios para animales con ojo seco inducido por escopolamina (Día 7-21). Se muestran los resultados para animales tratados con vehículo, 3 diferentes concentraciones de un (poli-) péptido del inhibidor JNK D-retro-inverso completo con la secuencia de la SEQ ID NO: 197, 3 diferentes concentraciones de un (poli- ) péptido del inhibidor JNK con la secuencia de la SEQ ID NO: 172, y los resultados para animales tratados con ciclosporina .

Fig. 37 muestra los Registros de la Lesión de la córnea histológicos para animales con síndrome del ojo seco inducido por escopolamina . Se muestran los resultados para animales tratados con vehículo, 3 diferentes concentraciones de un (poli- ) péptido del inhibidor JNK D-retro-inverso complete con la secuencia de la SEQ ID NO: 197, 3 diferentes concentraciones de un (poli- ) péptido del inhibidor JNK con la secuencia de la SEQ ID NO: 172, y los resultados para animales tratados con ciclosporina.

Inhibidores JNK En un primer aspecto . la presente invención se refiere a un inhibidor JNK, qué comprende una secuencia de (poli-) péptido inhibidora de acuerdo con la siguiente fórmula general: X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8 (SEQ ID NO: 1), en donde XI es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, Q y r, en donde X2 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, G y r, en donde X3 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos K, R, k y r, en donde X4 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos P y K, en donde X5 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, a, s, q, k o está ausente, en donde X6 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, D y A, en donde X7 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos N, n, r y K; y en donde X8 es un aminoácido seleccionado de F, f y w, con la condición de que al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o seis de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de XI, X2, X3, X5, X7 y X8 son los aminoácidos D, preferiblemente con la condición de que al menos uno, al menos dos, al menos tres o cuatro de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de X3, X5, X7 y X8 son los aminoácidos D, para uso en un método para tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia.

La secuencia de (poli-) éptido inhibidora del inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención comprende aminoácidos L y en la mayoría de las modalidades aminoácidos D. A menos que se especifique de otra manera, los residuos de aminoácidos L se indican en la presente en letras mayúsculas, mientras que los residuos de aminoácidos D se indican en letras minúsculas. La glicina puede indicarse en letras mayúsculas o minúsculas (ya que no existe D o L-glicina) . Las secuencias de aminoácidos descritas en la presente siempre se dan de la terminal N hasta C (izquierda a derecha) a menos que se especifique -de otra manera. La secuencia de aminoácidos dada puede modificarse o no modificarse en la terminal C y/o N, por ejemplo acetilación en la terminal C y/o amidación o modificación con cisteamida en la terminal N. En beneficio de claridad tales modificaciones posibles pero completamente opcionales en la terminal C y/o N de las secuencias de aminoácidos descritas en la presente son para beneficio de claridad sin indicarse específicamente.

Los inhibidores JNK de la presente invención son inhibidores de (poli- ) péptido de la cinasa de terminal N c-Jun (JNK) . Los inhibidores inhiben la actividad cinasa de cinasa de terminal N c-Jun (JNK), esto es prevenir o reducir la extensión de fosforilación de los sustratos JNK tales como c-Jun, ATF2 y/o Elk-1. Una persona experimentada en la técnica entenderá que el término "inhibidor", como se usa en la presente, no comprende compuestos que destruyen irreversiblemente la molécula de cinasa de terminal N c-Jun (JNK) y/o actividad de cinasa. Adicionalmente, el término "inhibir la actividad JNK" como se usa en la presente, se refiere a la inhibición de la actividad cinasa de cinasa do terminal N c-Jun (JNK) .

Adicionalmente, como se usa en la presente, un inhibidor JNK comprende al menos una unidad funcional de un polímero de aminoácidos, esto es uria secuencia de (poli- ) péptido . Además, esto al menos un polímero funcional de aminoácidos se proporciona para inhibición de la actividad JNK. Los monómeros de aminoácidos de la secuencia de (poli-) péptido inhibidora se ligan usualmente una con la otra por medio de enlaces de péptido, pero modificaciones (químicas) de los enlaces de péptido o de los residuos de cadena lateral pueden ser tolerables, proporcionando la actividad inhibidora (inhibición de la actividad JNK) no se pierde totalmente, esto es la entidad química resultante todavía cumple como inhibidor JNK como furicionalmente se define en la presente. El término " (poli-) péptido" no deberá construirse como que limita la longitud de la unidad; de (poli- ) péptico . Preferiblemente, la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora do los inhibidores JNK de la presente invención es menor que 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 4-4, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30', 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, o menos de 12 aminoácidos de longitud. Preferiblemente, la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora no tiene menos de 10 residuos de aminoácidos, más preferiblemente no menos de 11 residuos de aminoácidos.

Adicionalmente, un ."inhibidor JNK" de la presente invención inhibe la actividad JNK, por ejemplo se exhibe con respecto a la inhibición de fosforilación mediada por JNK humana de un sustrato c-Jun (SEQ ID NO: 198) un valor IC50 de: . . . a) menos de 3000 nM, más preferiblemente menos de 2000 nM, aún más preferiblemente menos de 1000 nM, aún más preferiblemente menos de 500 nM, aún más preferiblemente menos de 250 nM, aún más preferiblemente menos de 200 nM, aún más preferiblemente menos de 150 nM, lo más preferiblemente menos de 100 nM con respecto a la inhibición de JNK1 humano, b) menos de 3000 nM, más preferiblemente menos de 2000 nM, aún más preferiblemente menos de 1000 nM, aún más preferiblemente menos de 500 nM, aúa más preferiblemente menos de 250 nM, aún más preferiblemente menos de 200 nM, aún más preferiblemente menos de 150 nM, lo más preferiblemente menos de 100 nM con respecto a la inhibición de JNK2 humano, y/o c) menos de 3000 nM, más preferiblemente menos de 2000 nM, aún más preferiblemente menos de 1000 nM, aún más preferiblemente menos de 500 nM, aún más preferiblemente menos de 250 nM, aún más preferiblemente menos de 200 nM, aún más preferiblemente . menos de 15 ' nM, l o - >.; pret t - r i ld uniente menos de 100 nM con respecto a la inhibición de JNK3 humano.

Para algunas aplicaciones se prefiere que el inhibidor inhiba el JNK2 humano y/o JNK3 humano de acuerdo con la definición de arriba, pero sin JNK1 de acuerdo con la definición de arriba.

Si la actividad JNK se inhibe o no, puede fácilmente evaluarse por una persona experimentada en la técnica. Existen diversos métodos conocidos en la técnica. Un ejemplo es un ensayo de cinasa radioactiva o 'in ensayo de ci nasa no radioactiva (por ejemplo pi ueba de I .; ( :. ' ¡ : i Alí. i ; ver por ejemplo Guenat et al. J Biomol Screen, 2006; 11: páginas 1015-1026) .

Un inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención puede de esta manera por ejemplo comprender una secuencia de (poli- ) péptido inhibidora de acuerdo con cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 hasta 2 (ver tabla 1) .

El inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención también puede ser un inhibidor JNK (variante) que comprende una secuencia de (poli-) péptido inhibidora que comparte al menos 50%, más preferiblemente al menos 55%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, lo más preferiblemente al menos 90% de identidad de secuencia c< n una sec-i'i!i - i .·» ¦<· l<>< :c i opada de las SEQ ID NOs : 1-27, en parúculai con la SEQ ID NO: 8, con la condición de que con respecto a la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NOs: 1-27, tal secuencia de (poli-) péptido inhibidora que comparte la identidad de secuencia a) mantener el residuo de L-arginina (R) en la posición 4, b) mantener los dos residuos de L-leucina (L) en la posición 8 y 10 (posiciones 7 y 9 con respecto a las SEQ ID NOs: 25-27), c) exhibir uno, dos, tr.es, cuaL.ro, cinco o seis aminoácidos D en las posiciones respectivas correspondientes a los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de XI, X2, X3, X5, X7 y X8 de la SEQ ID NO: 1 y posiciones respectivas en las SEQ ID NOs: 2-27, «iás preferiblemente exhibe uno, dos, tres o cuatro aminoácidos D en las posiciones correspondientes a los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de X3, X5, X7 y X8 de la SEQ ID NO: 1 y posiciones respectivas en las SEQ II) NO; : . · ; ' , y d¡ todavía inhibe la actividad JNK (esto es, es un inhibidor JNK como se define en la presente) .

Ciertamente, las variantes descritas en la presente (en particular variantes del inhibidor JNK que comprenden una secuencia de (poli-) péptido inhibidora que comparte - dentro de la definición de arriba - un cierto grado de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOs: 1-27), comparten preferiblemente menos de 100% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia respectiva.

En vista de la definición y para b-?r¡(· t : i :> io <·],» rielad los residuos que no pueden cambiarse en variantes de inhibidores JNK que comprenden SEQ ID NOs: 1-27 (ver a) y b) en la definición de arriba) se subrayan en la tabla 1.

Los aminoácidos no idénticos son preferiblemente el resultado de sustituciones de aminoácidos conservadas.

Las sustituciones' de aminoácidos conservadas, como se usa en la presente, pueden incluir residuos de aminoácidos dentro de un grupo que tiene propiedades fisicoquímicas suficientemente similares, así que una sustitución entre los miembros del grupo conservarán la act -v: :l <i biol jicj ..lo- la molécula (ver por ejemplo Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864). Particularmente, las sustituciones de aminoácidos conservadas son preferiblemente sustituciones en las cuales los aminoácidos se originan de la misma clase de aminoácidos (por ejemplo aminoácidos básicos, aminoácidos ácidos, aminoácidos polares, aminoácidos con cadenas laterales alifáticas, aminoácidos con cadenas laterales cargadas positivamente c negativamente, ami n i i¦ l< - n grupos aromáticos en las cadenas laterales, aminoácidos de cadenas laterales de los cuales pueden entrar en los puentes de hidrógeno, por ejemplo cadenas laterales que tienen una función hidroxilo, etc.) . Las sustituciones conservadoras están en el caso presente por ejemplo sustituir un residuo de aminoácido básico (Lys, Arg, His) para otro residuo de aminoácido básico (Lys, Arg, His), sustituir un residuo de aminoácido alifático (Gly, Ala, Val, Leu, lie) para otro residuo de aminoácido alifático, sustituir un residuo de aminoácido arom tico · (Phe, Tyr, Irp) p.¡r n >t -c re.<'L<!u:) de aminoácido aromático, sustituir treonina por serina o leucina por isoleucina. Los intercambios de aminoácido conservadores adicionales se conocerán para la persona experimentada en la técnica. La forma de isómero deberá preferiblemente mantenerse, por ejemplo K preferiblemente se sustituye por R o H, mientras que "k preferiblemente se sustituye por r y h.

Las sustituciones posibles adicionales dentro de la definición de arriba para variantes del inhibidor JNK son por ej emplo si : a] uno, dos o más de XI, X2, X3, X4, X5, X6, X7 y/o X8 de la SEQ ID NO: 1 o las posiciones correspondientes dentro de la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NOs : 2-27 están sustituidos para A o a, b) XI o X8 de la SEQ ID NO: 1 o la posición correspondiente dentro de la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NO:?: :'-27 Í ·; :t¡ ; \ ¡a ; c) X5 de la SEQ ID NO: 1 o la posición correspondiente dentro de la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NOs: 2-27 es E, Y, L, V, F o K; d) X5 de la SEQ ID. NO: 1 o la posición correspondiente dentro de la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NOs: 2-27 es E, L, V, F o K; o e) uno, dos o tres de XI, X2, X3 de la SEQ ID NO: 1 o las posiciones correspondientes dentro de la secuencia respectiva seleccionada de las SEQ ID NOs: 2-27 son aminoácidos neutrales.

Como se usa en la presente, él término "% de identidad de secuencia", tiene que entenderse como sigue: dos secuencias para compararse se alinean para dar una correlación máxima entre.. las secuencias. Esto puede incluir insertar "espacios" en ya sea una o ambas secuencias, para aumentar el grado de 'alineación. Un % de identidad luego puede determinarse sobre la longitud completa de cada una de las secuencias que se comparan (alineación global asi llamada) , que es particularmente adecuada para secuencia de la misma o similar longitud, o en más corta, longitudes definidas (alineación local asi llamada) , que es más adecuada para secuencias de longitud desigual. En el contexto de arriba, una secuencia de aminoácidos que tiene una "identidad de secuencia" de al menos, por ejemplo, 95% para una secuencia de aminoácidos de consulta, se pretende significar que la secuencia de la secuencia de ani i noác_,. os objeto es idéntica a la secuencia de consulta excepto que la secuencia de aminoácidos objeto puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de consulta. En otras palabras, para obtener una secuencia de aminoácidos que tiene una secuencia de al menos 95% de identidad con una secuencia de aminoácidos de consulta, hasta 5% (5 de 100) de los residuos de aminoácidos en la secuencia objeto puede insertarse o sustituirse con otro aminoácido o eliminarse. Para propósitos de determinar la identidad de secuencia, ..a sustitución de un aminoácido L para un aminoácido D (y viceversa) se considera para proporcionar un residuo no idéntico, aún si es meramente el D (o L-isómero) del mismo aminoácido.

Los métodos para comparar la identidad y homología de dos o más secuencias son bien conocidos en la técnica. El porcentaje al cual dos secuencias sor, idénticas pueden por ejemplo determinarse al usar un algoritmo matemático. Un ejemplo preferido, pero no limitante, de un algoritmo matemático que puede usarse es el algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS EUA, 90:5873-5877. Tal algoritmo se integra en la familia BLAST de programas, por ejemplo programa BLAST o NBLAST (ver también Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 o Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402), accesible a través de la página de inicio del NCBI en el sitio de red amplia mundial ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson (1990), Methods Enzymol. 183, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85, 2444-2448.) . Las secuencias que son. idénticas a otras secuencias para una cierta extensión pueden identificarse por estos programas. Adicionalmente, los programas disponibles en el Wisconsin Sequen.ce Analysis Package, versión 9.1 (Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Res., 387-395), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, pueden usarse para determinar el % de identidad entre dos secuencias de polipéptido. BESTFIT usa el algoritmo de "homología local" de (S ilh nd Wa*\erman (198]), J. Mol. Biol. 147, 195-197.) y. encuentra la mayor región sencilla de similitud entre dos secuencias.

Ciertamente, el inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención puede comprender - dentro de la secuencia de (poli- )péptido inhibidora mencionada arriba - secuencias adicionales, dominios, etiquetas (p DI: o i»mpl< o* i <uift as fluorescentes o radioactivas), ' epitopos etc., siempre y cuando la capacidad de inhibir la actividad JNK como se define en la presente no se pierda. Por ejemplo, el inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención también puede comprender una secuencia transportadora. Una "secuencia transportadora" como se usa en la presente, es una secuencia de (poli- ) éptido proporcionada para transubicación de la molécula se une para cruzar las membranas biológicas. En consecuencia, un inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención que comprende una sec ion :¦ i a M I nsp< >r t. ado ra preferiblemente es capaz de transubicarse a través de membranas biológicas. De esta manera, tal inhibidor JNK de la presente invención puede más fácilmente ingresar una célula, un subcompartimiento celular y/o en el núcleo de una célula.

La secuencia transportadora puede unirse por ejemplo (por ejemplo directamente) N-terminalmente o (por ejemplo directamente) C-terminalmente a la secuencia de (poli-) péptido inhibidora del inhibidor JNK. La secuencia transportadora y la secuencia de (poli-) péptido inhibidora también puede espaciarse aparte, p:>r ·= j<;ij lo pue-ie :5··?a rarse por secuencias intermediarios. También se contempla que la secuencia transportadora puede posicionarse completamente en otra parte en la molécula inhibidora JNK que la secuencia de (poli-) péptido inhibidora, en particular si el inhibidor JNK es una molécula más compleja (por ejemplo que comprende diversos dominios, es un cor jugado mu 11 irr i 'io :> >'t '.). También se contempla que la secuencia transportadora y la. secuencia de (poli-) péptido inhibidora puede traslaparse siempre y cuando la actividad inhibidora JNK se mantiene. Los ejemplos para tal traslape se dan además a continuación.

Las secuencias transportadoras para uso con el inhibidor JNK de la presente invención pueden seleccionarse de, sin limitarse a esto, 'las secuencias transportadoras derivadas de HIV TAT (HIV) , por ejemplo proteínas nativas tales como por ejemplo la proteína TAT (por ejemplo como se describe en las Patentes de E.U.A. Nos. 5,??04, 604 y ! , 6 '' 4 , ') - , :ada un de estas referencias se incorporan en la presente como referencia) , HSV VP22 {H'erpes simplex) (descrito en por ejemplo WO 97/05265; Elliott and O'Hare, Cell 88 : 223-233 (1997)), proteínas no víricas (Jackson et al, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:10691-10695 (1992)), secuencias transportadoras .derivadas de Antennapedia, particularmente de Drosophila antennapedia (por ejemplo la secuencia portadora de antennapedia de la misma), FGF, lactoferrina , etc. o derivado de péptidos básicos, por ejemplo péptidos que tienen una longitud de 5 hasta 15 aminoaci d )s , pi < -fe r ; b lerr ente 10 hasta 12 aminoácidos y que comprenden al menos 80%, más preferiblemente 85% o aún 90% aminoácidos básicos, tales como por ejemplo arginina, lisina e/o histidina, o pueden seleccionarse de por ejemplo secuencias de péptido ricas en arginina, tales como RRRRRRRRR (R5; SEQ ID NO: 152), RRRRRRRR (R8; SEQ ID NO: 153), RRRRKR R (R7; l:2 ? ' ) NO: , :;4), HRKKKR ( R6 , SEQ ID NO: 155), RRRRR ( R5 , SEQ ID NO: 156) etc., de VP22, de péptidos o proteínas PTD-4, de RGD-Ki6, de péptidos o proteínas PEPT1/2 o PE.PT1/2, de péptidos o proteínas SynB3 o SynB3, de inhibidores PC, de péptidos o proteínas derivadas de P21, o de péptidos o proteínas JNKI.

Los ejemplos de secuencia transportadoras para uso en el inhibidor JNK de la presente invención son en particular, sin limitarse a esto, secuencias transportadoras básicas derivadas de la proteína HIV-1 ??? . Preferiblemente, la secuencia transportadora básica de ]a proteín H I /- ] TAT puede incluir secuencias de la proteína HIV-1 TAT del virus de inmunodeficiencia humana, por ejemplo como se describe en, por ejemplo, Patentes de E.U. A. Nos. 5,804,604 y 5,674,980, cada una incorporada en la presente como referencia. En este contexto, la proteina HIV-1 TAT de longitud completa tiene 86 residuos de aminoácidos codificados por dos exones del gen HIV TAT. Los aminoácidos TAT 1-72 se codifican por el exón 1, mientras que los aminoácidos 73-86 se codifican por el exón 2. La proteína TAT de longitud completa se caracteriza por una región básica que contiene dos Usinas y seis argininas (aminoácidos 49-57) y una región rica en cisteína que contiene siete residuos de cisteína (aminoácidos 22-37). La región básica (esto es, aminoácidos 49-57) se pensó que son importantes para localización nuclear. Rubén, S. et al., J. Virol. 63: 1-8 (1989); Hauber, J. et al., J. V ro!. 63 1181-1187 (1989). La región rica en cisteína . udia la tormación de dímeros ligados al metal in vitro (Frankel, A. D. et al, Science 240: 70-73 (1988); Frankel, A. D. et al., Proc. Nati. Acad. Sci EUA 85: 6297-6300 (1988)) y es esencial para su actividad como un transactivador (García, J. A. et al., EMBO J. 7: 3143 (1988); Sadaie, M. R. et al., J. Virol. 63:1 (1989)). Como en otras proteínas reguladoras, la región terminal N puede involucrarse en protección contra proteasas intracelulares (Bachmair, A. et al., Cell 56: 1019-1032 (1989)). Las secuencias transportado as TAT preferidas para uso en el inhibidor JNK de la presento invención se caracterizan preferiblemente por la presencia de la secuencia de aminoácidos de región básica TAT (aminoácidos 49-57 de proteír.a TAT que se presenta naturalmente) ; la ausencia de la secuencia de aminoácidos de región rica en cisteína TAT (aminoácidos 22-36 de proteína TAT que se presenta naturalmente) y ausencia del dominio de terminal carboxi 2 A?. codificado de exón TAT (aminoácidos 73-86 de proteína TAT que se presenta naturalmente) . Más preferiblemente, la secuencia transportadora en el inhibidor JNK de la presente invención puede seleccionarse de una secuencia de aminoácidos que contienen residuos TAT .48-57 o 49 hasta 57 o variantes de los mismos.

Preferiblemente, la secuencia transportadora en un inhibidor JNK dado de la presente invención también exhibe aminoácidos D, por ejemplo con objeto de mejorar la estabilidad hacia las prot asas. Particularmente preferidas son secuencias transportadoras que exhiben un orden específico para alterar aminoácidos D y L. Tal orden para alterar aminoácidos D y L (la porción) puede seguir sin limitarse a esto el patrón de cualquiera de una de las SEQ ID NOs: 28-30: diLLLxdmLLLydn (SEQ ID NO: 28); dLLLd (LLLd) a (SEQ ID NO: 29); y/o dLLLdLLLd (SEQ ID NO: 30); en donde : d es un aminoácido D; L es un aminoácido L; a es · 0 - 3, preferiblemente 0-2, más preferiblemente 0, 1, 2 o 3, aún más preferiblemente 0, 1, o 2 y lo más preferiblemente 1; 1, m y n son independientemente uno del o\ro 1 o 2, preferiblemente 1; x e y son independientemente uno del otro 0, 1 o 2, preferiblemente 1.' El orden de los aminoácidos D y L (porción) se vuelve relevante cuando la secuencia transportadora se sintetiza, esto es mientras que la secuencia de aminoácidos (esto es el tipo de residuos de cadena lateral) permanece no alterada, los isómeros respectivos alternados. Por ejemplo, una secuencia transportadora conocida derivada de HIV TAT es RKKRRQRRR (SEQ ID NO: 43) . Aplicar- el orden de aninoncidc D-/L de la SEQ ID NO: 30 ai mismo debería proporcionar rKKRrQRRr (SEQ ID NO: 46) ..

En una modalidad particular la secuencia transportadera del inhibidor JNK de la presente invención puede comprender al menos una secuencia de acuerdo con rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31 ) , en donde : r representa una arginina enantiomérica D; X es cualquier aminoácido L (incluyendo glicina) ; y en donde cada X pued seleccionarse? ind.. v . dua ment e e independientemente de cualquier otra X dentro de la SEQ ID NO: 31. Preferiblemente ¦ al menos 4 fuera de los 6 X aminoácidos L dentro de la SEQ ID NO: 31 son K o R. En otra modalidad el inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención comprende .la secuencia transportadora rXiX2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO: 32), en donde X± es K, X2 e ; K, X3 ¦¦> y X.„, X·,, y ?d son cualquier aminoácido' L (incluyendo glicina) seleccionado independientemente uno del otro. Similarmente , la secuencia transportadora del inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención puede comprender la secuencia rXiX2X3rX4X5 6r (SEQ ID NO: 33), en donde X4 es Q, X5 es R, X6 es R y Xi, X2, y X3 son cualquier aminoácido L (incluyendo glicina) seleccionado independientemente uno del otro. El inhibidor JNK inventivo también puede comprender la secuencia rXiX2X3rX4X5X6r (SEQ ID NO: 34), en donde uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis X residuos de amino cidos .son elegidos del grupo que consiste de: Xi es K, X" es K, X3 es R, X4 es Q, X5 es R, X es R, mientras que los residuos de aminoácidos X restantes no seleccionados del grupo de arriba pueden ser cualquier aminoácido L (incluyendo glicina) y se seleccionan independientemente uno del otro. Xx luego es preferiblemente Y y/o X4 es preferiblemente K o R.

Los ejemplos de secuencias transportadoras para uso en la molécula inhibidora JNK inventiva pueden seleccionarse, sin limitarse a esto, de secuencias como se dan en la tabla 2 a continuación, (SEQ ID NOs : 33 -170) o de cu lquier, fragmento o variante o derivado químicamente modificado del mismo (preferiblemente mantiene la función transubicarse a través de una membrana biológica) . 43 Como se menciona arriba, las secuencias transportadoras también pueden seleccionarse de fragmentos o variantes de las secuencias de arriba de la tabla 2 (con la condición de que tal fragmento o variante mantiene preferiblemente la función para proporcionar la transubicación a 1 ravés d l¾s membranas biológicas). En este contexto especifico, las variantes y/o fragmentos de aquellas secuencias transportadoras preferiblemente comprenden una secuencia de péptido que comparte al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o al menos 85%., preferiblemente al menos 9.0%, más preferiblemente al menos 95% y lo más preferiblemente al menos 99% de identidad de secuencia sobre la longitud completa de la secuencia de tal secuencia transportadora como se define en la Tabla 2. En este contexto específico, un "fragmento" de una secuencia transportadora como se define en la Tabla 2, es preferiblemente para entenderse como una secuencia truncada de la misma, esto es una secuencia de aminoácidos, que es N-terminalmente , C-terminalmente y/o intrasecuencialmente truncada comparada con la secuencia de aminoácidos de la secuencia original .

Adicionalmente, una "variante" de una secuencia transportadora o sus fragmentos como se define arriba, es preferiblemente para entenderse como una secuencia en donde la secuencia de aminoácidos de la variante difiere de la secuencia transportadora original o un fragmento de la misma como se define en la presente en una o más mutaciones, tales como uno o más aminoácidos sustituidos, (o, si es necesario, insertarse y/o eliminarse) . Preferiblemente, las variantes de tal secuencia transportadora como se define arriba tiene la misma función biológica o actividad especifica comparada con la secuencia original respectiva, esto se proporciona para transporte, por ejemplo en células o el núcleo. En este contexto, una variante de tal secuencia transportadora como se define arriba puede por ejemplo comprender alrededor de 1 hasta 50, 1 hasta 20, más preferiblemente 1 hasta 10 y lo más preferiblemente 1 hasta 5, 4, 3, 2 o 1 alteraciones de aminoácidos. Las variantes de tal secuencia transportadora como se define arriba pueden preferiblemente comprender sustituciones de aminoácidos conservadas. El concepto de sustituciones de aminoácidos conservadas se conoce en la técnica y ya se ha establecido arriba para la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora JNK y aplica aquí en consecuencia.

La longitud de una secuencia transportadora incorporada en el inhibidor JNK de la presente invención puede variar. Se contempla que en algunas modalidades la secuencia transportadora del inhibidor JNK de a uerdo ccn la presente invención es menor que 150, menos de 140, menos de 130, menos de 120, menos de 110, menos de 100, menos de 90, menos de 80, menos de 70, menos de 60, menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20, y/o menos de 10 aminoácidos de longitud.

Si una secuencia transportadora especifica todavía es funcional en el contexto del inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención puede fácilmente determinarse por una persona experimentada en la técnica. Por ejemplo, el inhibidor JNK que comprende un dominio transportador puede fusionarse a una etiqueta, por ojeniplo ur.a proteína fluorescente tal como GFP, una etiqueta radioactiva, una enzima, un fluoróforo, un epítopo etc. que puede fácilmente detectarse en una célula. Luego, el inhibidor JNK que comprende la secuencia . transportadora y la etiqueta se transfecta en una célula o agregarse a un sobrenadante de cultivo y permeación de membranas celulares puede monitorearse al usar métodos estándares biofísicos y bioquímicos (por ejemplo citometría de flujo, microscopía de (inmuno) fluorescencia etc.).

Los ejemplos específicos de inhibidores JNK de acuerdo con la presente invención que comprenden una secuencia transportadora se dan en la tabla 3: Como se menciona arriba, en una modalidad particular de la presente invención la secuencia transportadora y la secuencia de (poli-) péptido inhibidora puede traslaparse. En otras palabras, la terminal N de la secuencia transportadora puede traslaparse con la terminal C de la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora o la terminal C de la secuencia transportadora puede traslaparse con la terminal N de la secuencia de (poli-) péptido inhibidora. La última modalidad se prefiere particularmente. Preferiblemente, la secuencia transportadora se traslapa por uno, dos o tres residuos de aminoácidos con la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora. En tal escenario una secuencia transpo tadora dada puede traslaparse con la SEQ ID N0:1 o las variantes respectivas de las mismas en la posición 1 (XI), posición 1 y 2 (XI, X2 ) , posiciones 1, 2 y 3 (XI, X2, X3) .

Las SEQ ID NOs : 174,. 175, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 188, 189 y 190 son buenos ejemlos para inhibidores JNK de acuerdo con la presente invención, en donde la secuencia transportadora y el traslape de secuencia de (poli- ) péptido inhibidora, por ejemplo rKKRrQRRrRPTTLNLf (SEQ ID NO: 174) es un traslape de la SEQ ID NO: 46 (subrayado) y SEQ ID NO: 11 (cursiva) .

Ciertamente el inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención también puede seleccionarse de inhibidores JNK, que son una variante de cualquiera de uno de los inhibidores JNK de acuerdo con las SEQ ID NOs : 171-190. Preferiblemente, tal variante comparte al menos 50%, más preferiblemente al menos 55%, más preferiblemente al menos 60%, má pref riblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos .70%, más preferiblemente al menos '75%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, lo más preferiblemente al menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NOs: 171-190, en particular con la SEQ ID NO: 172, con la condición de que con respecto a la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora dentro de las secuencias de las SEQ ID NOs: 171-190 (ver para referencia secuencia de (poli- ) péptido inhibidora de la SEQ ID NO: 1 y ejemplos específicos de las SEQ ID NOs: 2-27) ) tal secuencia que comparte la identidad de secuencia a) mantener el residuo L-arginina (R) en la posición 4 dentro de la secuencia de (poli-) péptido inhibidora, b) mantener los dos residuos de L-leucina (L) en la posición 8 y 10 (posiciones 7 y 9 con respecto a las SEQ ID NOs: 25-27) dentro -de la secuencia de (poli- ) éptido inhibidora, c) exhibir al menos uno, al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco o seis aminoácidos D en las posiciones respectivas correspondientes a los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de XI, X2, X3, X5, X7 y/o X8 de la SEQ ID NO: 1 y posiciones respectivas en las SEQ ID NOs: 2-27, más preferiblemente exhibe al menos uno, al menos dos, al menos tres o cuatro am noácidos D en las posiciones correspondientes a los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de X , X5, X7 y X3 de la SEQ I D NO : 1 y posiciones respectivas en las SEQ ID NOs: 2-27, y d) todavía inhibe la actividad JNK (esto es, es un inhibidor JNK como se define en la presente) .

En vista de la definición y para beneficio de claridad los residuos que no pueden cambiarse en variantes de inhibidores JNK que comprenden SEQ ID NOs: 171-190 (ver a) y b) en la definición de arriba) se subrayan en la tabla 3.

Los aminoácidos no idénticos en las variantes de los inhibidores JNK que comprenden SEQ ID NOs: 171-190 son preferiblemente el resultado de sustituciones de aminoácidos conservadas (ver arriba) . Ciertamente, las sustituciones posibles adicionales mencionadas arriba también se contemplan para variantes de inhibidores JNK que comprenden SEQ ID NOs: 171-190. Igualmente, la presente invención ciertamente también contempla variantes de cualquiera de uno de los inhibidores JNK de acuerdo con las SEQ ID NOs: 171-190, que se desvian de la secuencia original sin o sin exclusivamente en la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora, pero exhibe residuos variantes en la secuencia transportadora. Para variantes y fragmentos de las secuencias transportadoras ver en particular descripción respectiva arriba.

Como se menciona previamente, la secuencia transportadora y la secuencia de (poli ) -péptido inhibidora JNK de los inhibidores JNK de acuerdo con la presente invención no necesitan unirse directamente uno a otro necesariamente. También pueden espaciarse aparte, por ejemplo por secuencias de (poli-) péptido intermedias. Las secuencias intermedias preferidas, que separan la secuencia de (poli-) péptido inhibidoras y otras secuencias (funcionales) tales como secuencias transportadoras consisten de secuencias de péptido cortas menos de 10 aminoácidos de longitud similar a hexámero, un pentámero, un tetrámero, un tripéptido o aun únicamente un dipéptido o un residuo de aminoácido sencillo. Las secuencias intermediarias particularmente preferidas son una, dos o más copias de di-prolina, di-glicina, di-arginina y/o di-lisina, todas ya sea en forma de aminoácido L únicamente, o en forma de aminoácido D únicamente, o con aminoácidos D y L mezclados. Ciertamente, otras secuencias espaciadoras de péptido conocidas pueden emplearse también.

Un inhibidor JNK particularmente preferido de acuerdo con la presente invención comprende SEQ ID NO: 8 (o una secuencia que comparte la identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8 con el alcance y limitaciones definidas arriba adicionales) y una secuencia transportadora. La secuencia transportadora preferiblemente se selecciona de cualquiera de una de las SEQ ID Nos: 31-170 o variantes de las mismas como se define en la presente, aún más preferiblemente de cualquiera de una de las SEQ ID NOs : 31-34 y 46-151. Una modalidad particularmente preferida de un inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención es un inhibidor JNK que comprende la SEQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 46 (o secuencias que comparten identidad de secuencia respectiva a esto dentro del alcance y limitaciones definidas arriba adicionales) . Un ejemplo preferido es ' un inhibidor JNK que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 172 o variantes respectivas de las mismas que varían en la secuencia transportadora y/o la secuencia' de (poli- ) péptido inhibidora como se define en la presente.

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a un inhibidor JNK que comprende a) un (poli- ) péptido inhibidor que comprende una secuencia del qrupo de secuencias que consisten de RPTTLNLF (SEQ ID NO: 191), KRPTTLNLF (SEQ ID NO: 192), RRPTTLNLF y/o RPKRPTTLNLF (SEQ ID NO: 193), y b¡ una secuencia transportadora, preferiblemente una secuencia transportadora seleccionada de las secuencias transportadoras descritas ' en. la tabla 2 o variantes/fragmentos de los mismos, aún más preferiblemente seleccionados de SEQ ID NOs : 31-34 y -46-151 o variantes respectivas o fragmentos de los mismos.

La secuencia transportadora y la secuencia de (poli-)péptido inhibidora puede traslaparse. Las secuencias transportadoras preferidas para la modalidad de la invención son particularmente la secuencia transportadora de la SEQ ID NO: 46, preferiblemente unida (por ejemplo directamente) a la terminal N de la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora.

Un inhibidor JNK de la presente invención también puede ser un inhibidor JNK que comprende o que consiste de la secuencia GRKKRRQRRRPPKRPTTLNLFPQVPRSQD (SEQ ID NO: 194) , o la secuencia GRKKRRQRRRPTTLNLFPOVPRSQD (SEQ ID NO: 195) .

En un aspecto adicional la presente invención se refiere a un (poli- ) péptido que comprende una secuencia transportadora seleccionada del grupo de secuencias que consisten de rKKRrQRr (SEQ ID NO: 148), rKKRrQRrK (SEQ ID NO: 149), y/o rKKRrQRrR (SEQ ID NO: 150).

Como se usa en la presente, que comprende una cierta secuencia o una cierta SEQ ID NO: usualmente implica que (al menos) una copia de la secuencia está presente, por ejemplo en la molécula inhibidora JNK. Por ejemplo, una secuencia de (poli- ) éptido inhibidora usualmente será suficiente para lograr suficiente inhibición de la actividad JNK. Sin embargo, el inventor ciertamente contempla que el uso de dos o más copias de la secuencia respectiva (por ejemplo dos o más copias de una secuencia de (poli- ) péptido inhibidora de diferente o mismo tipo y/o dos o más copias de una secuencia transportadora de diferente o el mismo tipo) también puede emplearse siempre y cuando la capacidad general de la molécula resultante que inhibe la actividad JNK no sea abolida (esto es la · molécula respectiva todavía es un inhibidor JNK como se define en la presente) .

Los inhibidores JNK inventivos pueden obtenerse o producirse por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo por síntesis química por medio de síntesis de péptido de fase sólida usando estrategia de Fmoc (9-fluorenilmetiloxicarbonilo) , esto es por rondas sucesivas de desprotección Fmoc y ciclos de acoplamiento de Fmoc-aminoácido. Un servicio comercial que ofrece tal síntesis de péptido se proporciona por muchas compañías, por ejemplo la' compañía PolyPeptide (Estrasburgo, Francia) .

Los inhibidores JNK para uso de acuerdo con la presente invención pueden opcionalmente modificarse además, en particular en los residuos de aminoácidos de la secuencia de (poli-péptido) inhibidora. Las modificaciones posibles pueden por ejemplo seleccionarse del grupo que consiste de: (i) etiquetas radioactivas, esto es fosforilación radioactiva o una etiqueta radioactiva con azufre, hidrógeno, carbono, nitrógeno, etc.; (ii) pigmentos de colores (por ejemplo digoxi gen i na , etc. ) ; (iii) grupos fluorescentes (por ejemplo fluoresceina , etc . ) ; (iv) grupos quimioluminiscentes ; (v) grupos para inmovilización en una fase sólida (por ejemplo etiqueta His, biotina, etiqueta estrep, etiqueta flag, anticuerpos, epitopos, etc.); (vi) pegilación, (vii) glicosilación, (viii) hesilación, (ix) sitios, de desdoblamiento de proteasa (por ejemplo para liberación controlada del inhibidor JNK) (x) modificaciones de fondo de péptido (por ejemplo enlaces (???2-??) ) (xi) protección de residuos de cadena lateral de aminoácido, (xii) protección de terminal N y/o C (por ejemplo amidación de terminal N o acetilación de terminal C) (xiii) una combinación de elementos de dos o más de los elementos mencionados bajo (i) hasta (xii) .

Particularmente preferidas son las modificaciones seleccionadas de (i) hasta (xi) y combinaciones de elementos de dos o más de los elementos mencionados bajo (i) hasta (xi) . En este contexto la presente invención se refiere en un aspecto adicional a un inhibidor JNK como se describe en la presente modificado con modificaciones seleccionadas de (i) hasta (xi) o modificarse con una combinación de dos o más de los elementos mencionados bajo (i) hasta (xi), y una composición farmacéutica (ver a continuación) que comprende tal inhibidor JNK modificado.

Composiciones farmacéuticas Los inhibidores JNK como se define de acuerdo con la invención pueden formularse en una composición farmacéutica, que pueden aplicarse en la prevención o tratamiento de cualquiera de las enfermedades como se define en la presente. Típicamente, tal composición farmacéutica usada de acuerdo con la presente invención incluye como un componente activo un inhibidor JNK como se define en la presente, en particular un inhibidor JNK que comprende o que consiste de una secuencia de (poli-) péptido inhibidora de acuerdo con la SEQ ID NO: 1, como se define en la presente. Preferiblemente, el compuesto active es un inhibidor JNK que comprende o que consiste de una secuencia de (poli- ) péptido inhibidora de acuerdo con cualquiera.de una de las SEQ ID NOs: 2-27; o, si una secuencia transportadora se une, de acuerdo con cualquiera de una de las SEQ ID NOs: 171-190.

Los inventores de la presente invención adicionalmente encuentran, que los inhibidores JNK como se definen en la presente, en particular si se fusionan a una secuencia transportadora; exhiben una tasa de absorción de pozo particular en células involucradas en las enfermedades de la presente invención. Por lo tanto, la cantidad de un inhibidor JNK en la composición farmacéutica para administrarse a un sujeto, puede - sin limitarse a esto - tiene una dosis muy baja. De esta manera, la dosis puede ser mucho inferior que para los fármacos de péptido conocidos en la técnica, tales como DTS-108 (Florence Meyer-Losic et al., Clin Cáncer Res., 2008, 2145-53) . Esto tiene diversos aspectos positivos, por ejemplo una reducción de reacciones laterales potenciales y una reducción en costos.

Preferiblemente, la dosis (por kg de peso corporal) está en el intervalo de hasta alrededor de 10 mmol/kg, preferiblemente hasta alrededor de 1 mmol/kg, más preferiblemente hasta alrededor de 100 pmol/kg, aún más preferiblemente hasta alrededor de 10 mol/kg, aún más preferiblemente hasta alrededor de 1 mol/kg, aún más preferiblemente hasta alrededor de 100 nmol/kg, lo más preferiblemente hasta alrededor de 50 nmol/kg.

De esta manera, .el intervalo de dosis puede preferiblemente ser desde alrededor de 1 pmol/kg hasta alrededor de 1 mmol/kg, desde alrededor de 10 pmol/kg hasta alrededor de 0,1 mmol/kg, desde alrededor de 10 pmol/kg hasta alrededor de 0,01 mmol/kg, desde alrededor de 50 pmol/kg hasta alrededor de 1 pmol/kg, desde alrededor de 100 pmol/kg hasta alrededor de 500 nmol/kg, desde alrededor de 200 pmol/kg hasta alrededor de 300 nmol/kg, desde alrededor de 300 pmol/kg hasta alrededor de 100 nmol/kg, desde alrededor de 500 pmol/kg hasta alrededor de 50 nmol/kg, desde alrededor de 750 pmol/kg hasta alrededor de 30 nmol/kg, desde alrededor de 250 pmol/kg hasta alrededor de 5 nmol/kg, desde alrededor de 1 nmol/kg hasta alrededor de 10 nmol/kg, o una combinación de cualquiera de dos de los valores.

En este contexto,, la prescripción del tratamiento, por ejemplo decisiones en la dosificación etc. cuando se usa la composición farmacéutica de arriba típicamente está dentro de la responsabilidad de los practicantes generales y otros doctores médicos, y típicamente toma en cuenta el trastorno a tratarse, la afección del paciente individual, el sitio de suministro, el método, de administración y otros factores conocidos para los practicantes. Los ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados arriba pueden encontrarse en REMINGTON ' S PHARMACEU ICAL SCIENCES, 16a edición, Osol, A. (ed) , 1980. En consecuencia, una "cantidad- efectiva y segura" para componentes de las' composiciones farmacéuticas como se usan de acuerdo con la presente invención significa una cantidad de cada uno o todos de estos componentes, que es suficiente para inducir significativamente una modificación positive de enfermedades o trastornos fuertemente relacionadas con la señalización JNK como se define en la presente. Al mismo tiempo, sin embargo, una "cantidad efectiva y segura" es suficientemente pequeña para evitar efectos colaterales . serios, es decir, permitir una relación sensible entre ventaja y riesgo. La determinación de estos limites típicamente se encuentran dentro del alcance de juicio medico sensible. Una "cantidad efectiva y segura" de tal componente variará en conexión con la afección particular a tratarse y también con la edad y afección física del paciente a tratarse, la severidad de la afección, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia acompañada, del portador farmacéuticamente aceptable particular usado, y factores similares, dentro del conocimiento y experiencia del doctor acompañante. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden usarse de acuerdo con la invención para humano y también para propósitos médicos veterinarios.

La composición farmacéutica como se usa de acuerdo con la presente invención puede adicionalmente comprender, además uno o más de los inhibidores JNK, un portador farmacéuticamente aceptabLe (compatible) , excipiente, solución amortiguadora, estabilizador u otros materiales bien conocidos para aquellos experimentados en la técnica.

En este contexto, la expresión "portador farmacéuticamente aceptable (compatible)" preferiblemente incluye la base liquida o no liquida de la composición. El término "compatible" significa que los constituyentes de la composición farmacéutica como se usa en la presente son capaces de mezclarse con el componente farmacéuticamente active como se define arriba y con otro componente de tal manera que no ocurre interacción la cual debería sustancialmente reducir la eficacia farmacéutica de la composición bajo condiciones de uso usuales. Los portadores farmacéuticamente aceptables deben, por supuesto, tener pureza suficientemente alta y toxicidad suficientemente baja para hacerlos adecuados para administración a una persona a ser tratada .

Si la composición farmacéutica como se usa en la presente se proporciona en forma liquida, el portador farmacéuticamente aceptable típicamente comprenderá uno o más portadores líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles). La composición puede comprender como portadores líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles) por ejemplo agua libre de pirógeno; soluciones amortiguadoras o Salinas isotónicas (acuosas), por ejemplo fosfato, citrato etc. soluciones amortiguadoras, aceites vegetales, tales como, por ejemplo, aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de olivo, aceite de maíz y manteca de cacao; polioles, tales como, por ejemplo, polipropilen glicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilen glicol; ácido algínico, etc. Particularmente para inyección de la composición farmacéutica como se usa en la presente, una solución amortiguadora, preferiblemente una solución amortiguadora acuosa, puede usarse.

Si la composición farmacéutica como se; usa en la presente se proporciona en forma sólida, el portador farmacéuticamente aceptable típicamente comprenderá uno o más portadores sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles) . La composición puede comprender como portadores sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles) por ejemplo uno o más compuestos encapsulados o diluyentes o rellenadores líquidos o sólidos compatibles pueden usarse también, los cuales son adecuados para administración a una persona. Algunos ejemplos de tales portadores sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles) son por ejemplo azúcares, tales como, por ejemplo, lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como, por ejemplo, almidón de azúcar o almidón de papa; celulosa y sus derivados, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; sebo; deslizantes sólidos, tales como, por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio; sulfato de calicó, etc .

La naturaleza precisa del portador sólido farmacéuticamente aceptable (compatible) u otro material puede depender de la ruta de administración. La elección de un portador sólido farmacéuticamente aceptable (compatible) puede de esta manera determinarse en principio por la manera en la cual la composición farmacéutica como se usa de acuerdo con la invención se administra. La composición farmacéutica como se usa de acuerdo con la invención puede administrarse, por ejemplo, sistemáticamente. Las rutas para administración incluyen, por ejemplo, rutas parenterales (por ejemplo por medio de inyección), tales como rutas intravenosas, intramusculares, subcutáneas, intradérmicas , o transdérmicas , etc., rutas entéricas, tales como rutas orales, o rectales, etc., rutas tópicas, tales como rutas nasales, o intranasales, etc., u otras rutas, tales como rutas epidérmicas o suministro por parche. También se contemplan (en particular para enfermedades relacionadas con los ojos) instilación, administración intravitrea, y subcon untival . Igualmente la administración puede ocurrir intratimpánica, por ejemplo si se trátan enfermedades relacionadas con el oido.

La cantidad adecuada de la composición farmacéutica a usarse puede determinarse por experimentos de rutina con modelos animales. Tales modelos incluyen, sin implicar ninguna limitación, conejo, oveja, ratón, rata, perro y modelos primates o humanos. Las formas de dosis unitaria, preferidas, para inyección incluyen soluciones estériles de agua, solución salina fisiológica o mezclas de los mismos. El pH de tales soluciones debería ajustarse hasta alrededor de 7.4. Los portadores ' adecuados para inyección incluyen hidrogeles, dispositivos para liberación retardada o controlada, ácido poliláctico y matrices de colágeno. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para aplicación tópica incluyen aquellos, que son adecuados para uso en lociones, cremas, geles y similares. Si el compuesto es para administrarse oralmente, los comprimidos, cápsulas y similares son la forma de dosis unitaria preferida. Los portadores farmacéuticamente aceptables para la preparación de formas de dosis unitaria, que pueden usarse para administración oral son bien conocidos en la técnica previa. La elección de la misma dependerá de consideraciones secundarias tales como sabor, costos y capacidad de almacenamiento, que no son críticos para los propósitos de la presente invención, y pueden hacerse sin dificultad por una persona experimentada en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en comprimido, cápsula, polvo o forma líquida. Un comprimido puede incluir un portador sólido como se define arriba, tales como gelatina, y opcionalmente un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas para administración oral generalmente pueden incluir un portador líquido como se define arriba, tales como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. La solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido: .¦ o glicoles tales como etilen. glicol, propilen glicol o polietilen glicol pueden incluirse.

Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de aflicción, el ingrediente activo estará en la forma de una solución acuosa parentalmente aceptable que está libe de pirógeno y tiene solución acuosa aceptable que está libre de pirógeno y tiene pH adecuado, isotonicidad y estabilidad. Aquellos de experiencia relevante en la técnica son bien capaces de preparar soluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactáda. Los conservadores, estabilizadores, soluciones amortiguadoras, antioxidantes y/u otros aditivos pueden incluirse, como se requiera. Si es un polipéptido, péptido, o molécula de ácido nucleico, otro compuesto farmacéuticamente útil de acuerdo con la presente invención que es para dares a un individuo, la administración está preferiblemente en una "cantidad profilácticamente efectiva o una cantidad terapéuticamente efectiva" (como el caso pueda ser) , esto es suficiente para mostrar beneficio al individuo. La cantidad actual administrada, y tasa y curso de tiempo de administración, dependerá de la naturaleza y severidad de lo que se está tratando.

El tratamiento de una enfermedad como se define en la presente típicamente incluye administración de una composición farmacéutica como se define arriba. Los inhibidores JNK de .la presente invención modulará la actividad JNK en el sujeto. El término "modular" incluye en particular la supresión de fosforilación de c-jun, ATF2 o NFAT4 en cualquiera de las enfermedades de arriba, por ejemplo, al usar al menos un inhibidor JNK que comprende o que consiste de una secuencia de (poli ) péptido inhibidora de acuerdo con cualquiera 'de las secuencias de las SEQ ID NOs : 2 hasta 27, potencialmente que comprende una secuencia transportadora adicional, como un inhibidor competitivo del c-jun natural, sitio enlazado a ATF2 y NFAT4 en una célula. El término "modular" también incluye supresión de complejos hetero y homoméricos de factores de transcripción hechos fuera de, sin limitarse á esto, c-jun, ATF2, o NFAT4 y sus compañeros relacionados, tales como por ejemplo el complejo AP-1 que se hace fuera de c-jun, AFT2 y c-fos.

El tratamiento de un sujeto con la composición farmacéutica como se- describe arriba puede realizarse típicamente al administrar {in vivo) una cantidad ("terapéuticamente efectiva") de la composición farmacéutica a un sujeto, en donde el sujeto puede ser por ejemplo un sujeto humano o un animal. El animal es preferiblemente un mamífero no humano, por ejemplo, un primate no humano, ratón, rata, perro, qato, vaca, caballo o cerdo. El término "terapéuticamente efectivo" significa que el componente active de la composición farmacéutica es de. cantidad suficiente para aliviar las enfermedades y trastornos como se discute en la presente.' Enfermedades y trastornos La esencia de la presente invención es usar los inhibidores JNK y composiciones farmacéuticas, descritos arriba, en un método para tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia, en particular del cuerpo humano. Como se menciona arriba la señalización JNK está involucrada en una multitud de diversos estados de la enfermedad y trastorno e inhibición de la señalización se ha propuesto y exitosamente probado para muchos de estos. Los inventores de la presente invención encuentran que los inhibidores JNK descritos en la presente son inhibidores JNK efectivos y son de esta manera igualmente adecuados para el tratamiento de las enfermedades como se describe en la técnica.

El tratamiento de un, cuerpo humano o animal por terapia, como se usa en la presente, se refiere a cualquier tipo de tratamiento terapéutico de un sujeto respectivo. Esto incluye por ejemplo prevención del comienzo de la enfermedad o síntomas (profilaxis), esto es típicamente previo a la manifestación de la enfermedad en el paciente. El término también incluye el tratamiento "justo" de síntomas de una enfermedad dada, esto es el tratamiento aliviará la patogénesis al reducir los síntomas asociados con la enfermedad, sin necesariamente curar la causa subyacente de la enfermedad y síntomas. Ciertamente, curar la causa subyacente de la enfermedad también se abarca por el termino. El término también abarca un tratamiento el cual retrasa o aún detiene el progreso de la enfermedad respectiva.

En una modalidad los inhibidores JNK de acuerdo con la presente invención pueden administrarse por ejemplo profilácticamente antes del comienzo potencial de un trastorno previsible, por ejemplo antes de una intervención quirúrgica planificada o exposición planificada a estimulo estresante. Una intervención quirúrgica podría por ejemplo llevar el riesgo de inflamación de la herida respectiva o tejido vecino (por ejemplo síndrome del ojo seco después del tratamiento del quirúrgico del ojo, peri-implantitis después del tratamiento de implante dental, rechazo del injerto después del trasplante, etc.). Exposición a estímulo estresante tipo radiación podría llevar a apoptosis de células y tejido afectado. En tal escenario los inhibidores JNK de acuerdo con la presente invención pueden por ejemplo administrarse al menos una vez hasta alrededor de 4 semanas de avance. Los inhibidores JNK pueden por ejemplo administrarse al menos 24 horas, al menos 48 horas, al menos 1 semana, al menos 2 semanas o 4 semanas de avance.

Las enfermedades y trastornos a tratarse con los inhibidores JNK como se describen en la presente pueden ser agudos o crónicos.

Debido al involucramiento de señalización JNK en una vasta diversidad de afecciones patológicas, los inhibidores JNK de la presente invención pueden por ejemplo usarse para el tratamiento de enfermedades de varios órganos, tales como enfermedades de los ojos, enfermedades de los huesos, enfermedades neurales, . enfermedades neuronales, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades de la piel, enfermedades inmunitarias y/o autoiñmunitarias, enfermedades de los ojos, enfermedades de la boca, enfermedades inflamatorias, enfermedades metabólicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades proliferativas (en particular cánceres y tumores), enfermedades del oído, enfermedades del intestino, enfermedades del sistema respiratorio (por ejemplo enfermedades pulmonares), enfermedades infecciosas, y varias otras enfermedades.

Los inhibidores JNK de la presente invención pueden usarse por ejemplo para el tratamiento de enfermedades inflamatorias incluyendo por ejemplo inflamación aguda asi como inflamación crónica. Los inhibidores JNK de la presente invención pueden usarse para tratar cualquier tipo de inflamación de tejido,, por ejemplo inflamación en el ojo, inflamación en la boca, inflamación del sistema respiratorio incluyendo en particular el pulmón, inflamación de la piel, inflamación dentro .del sistema cardiovascular, inflamación del cerebro, inflamación del oído, etc. Algunos ejemplos no limitantes para tales estados de enfermedad inflamatoria son mucositis, estomatitis, peri-implantitis , retinitis, corioiditis, queratoconjuntivitis seca, enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), uveitis (por ejemplo uveitis anterior, uveitis intermedia, uveitis posterior) , periodontitis , COPD, asma, pulpitis, artritis reutnatoide, osteoartritis , enfermedad de Crohn, artritis psoriática, vasculitis, cistitis intersticial; inflamación aguda en un sitio de infección o herida, meningitis, encefalitis, neumonía, faringitis, amigdalitis, otitis media (incluyendo otitis media) , vasculitis, sinovitis, enteritis, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, rechazo de injertos, etc.

Los inhibidores JN como se describen en la presente pueden por ejemplo usarse en métodos de tratamiento para enfermedades del oído (en particular enfermedades del oído interno) , pérdida de la audición (en particular pérdida de la audición aguda), estereocilios de las células, vellosas dañadas, apoptosis de célula de pelo, trauma del ruido, otitis, otitis media etc. Pérdida de la audición y apoptosis de célula de pelo asociada son ejemplos no limitantes para trastornos que resultan de situaciones de tensión para células en las cuales' la inhibición JNK puede modular la respuesta de tensión y por ejemplo apoptosis por bloqueo.

Los inhibidores JNK ' de la presente invención también pueden usarse para el tratamiento de trastornos metabólicos, por ejemplo para el tratamiento de diabetes (tipo 1 o tipo 2, en particular tipo 1) , enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher, hipotermia, hipoxia de hipertermia, histiocitosis de lipido, lipidosis, leucodistrofia metacromática, mucopolisacaridosis , enfermedad de Niemann Pick, obesidad, y enfermedad de Wolman. La hipotermia, hipertermia e hipoxia son de nuevo ejemplos no limitantes para situaciones de tensión para células en las cuales la inhibición JNK puede modular la respuesta de tensión y por ejemplo apoptosis de bloqueo.

Igualmente, los inhibidores JNK de la presente invención pueden usarse para el tratamiento de enfermedades neural, neuronal y/o neurodegenerativas, respectivamente. Los ejemplos para tales enfermedades son por ejemplo enfermedad de Alexander, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , apoplejía, Ataxia Telangiectasia, corte o de otra manera axones interrumpidos, axotomia, lesiones cerebrales, CMT (Charcot-Marie-Tooth) , degradación corticobasal, demencia, enfermedades o trastornos del sistema nervioso, distonia, epilepsia, enfermedad de Farber, ataxia de Friedreich (SCA) , gangliosidosis , síndrome de Guillain-Barré, paraplejia espástica hereditaria, enfermedad de Hirschsprung, demencia por virus de inmunodeficiencia humana, enfermedad de Huntington, infarto cerebral, apoplejía isquémica, enfermedad de Krabbe, síndrome de Lennox Gastaut, lisencefalia, esclerosis múltiple, síndromes míelodisplásicos , mielopatía, enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el SIDA, neurofibromatosis tipo 2 (NF-2), neurolatierismo, apoptosis neuronal, muerte neuronal, dolor neuropático, neuropatía, neuropatía inducida por quimioterapia, neuropatía inducida por diabetes, neurotoxicidad inducida por NMDA, dolor, mal de Parkinson, parkinsonismo, enfermedad de Pick, polineuropatía, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Sandhoff, espina bifida, apoplejía, Tay Sachs, TBI (lesión axonal difusa), tratamiento de neurona oscura inducida por ejemplo por un dolor inflamatorio, síndrome de West, atrofia muscular espinal etc .

Con respecto a trastornos inmunitarios , los péptidos inhibidores JNK de la presente invención pueden por ejemplo usarse en un método de tratamiento de enfermedades autoinmunitarias del SNC, enfermedades auto-inflamatorias, enfermedad celíaca; . síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico etc.

Los ejemplos para enfermedades de los huesos que pueden tratarse con los inhibidores JNK de la presente invención son por ejemplo artritis, hernia de disco, fibrodisplasia osificante progresiva (FOP) , osteoartritis, osteopetrosis , osteoporosis , en particular osteoporosis inducida por diabetes, enfermedad de Page , artritis reumatoide, etc.

Los ejemplos para enfermedades de 'la piel que pueden tratarse con los inhibidores JNK de la presente invención son por ejemplo psoriasis y lupus eritematoso.

Las enfermedades de los ojos, que pueden tratarse con los inhibidores JNK de la presente invención involucran por ejemplo degeneración macula relacionada con la edad (AMD); estrias angioides; neuropatía óptica isquémica anterior; uveitis anterior; catarata, en particular catarata relacionada con la edad; coriorretinopatía exudativa central; coriorretinopatía seria central; chalazión; coroideremia ; corioiditis; esclerosis coroidal; conjuntivitis; ciclitis; retinopatía diabética; síndrome del ojo seco; endoftalmitis ; epiescleritis ; infección en los ojos; albipunctatus fundus; atrofia girada de la coroides y retina; orzuelo; enfermedades inflamatorias del blefara; enfermedades inflamatorias de la coroides; enfermedades inflamatorias del cuerpo ciliar; enfermedades inflamatorias de la conjuntiva; enfermedades inflamatorias de la córnea; enfermedades inflamatorias del iris; enfermedades inflamatorias de la glándula lagrimal; enfermedades inflamatorias del hueso orbital; enfermedades inflamatorias de la esclerótica; enfermedades inflamatorias del cuerpo vitreo; enfermedades inflamatorias de la úvea; enfermedades inflamatorias de la retina; uveitis intermedia; irititis; queratitis; síndrome de Leber; coroiditis multifocal; miositis del músculo ocular; maculopatía neovascular (por ejemplo causada por la miopía alta, síndrome de disco inclinado, osteoma. coroideo o similares); retinotoxicidad inducida por NMDA; enfermedades inflamatorias del ojo crónicas o no crónicas; enfermedad de Oguchi; enfermedad del nervio óptico; flemón orbitario; panoftalmitis ; panuveítis; opacificación de cápsula posterior; opacificación de la cápsula posterior (PCO) (una complicación después de la cirugía de cataratas); uveitis posterior; vitreorretinopatía proliferativa; oclusión retinal arterial; desprendimiento de retina, enfermedades retínales; lesiones retínales; macroanéurisma retina; desprendimiento del epitelio pigmentario retinal; oclusión venosa de la retina; retinitis; retinitis pigmentosa; retinitis albescens punctata; retinopatía-, en particular, retinopatía del prematuro y retinopatía diabética; escleritis; enfermedad de Stargardt; tratamiento de heridas inflamadas oculares y/o bordes de la herida oculares; tratamiento de inflamación infraocular después de la cirugía ocular o trauma; uveitis; distrofia macular viteliforme; etc.

Las enfermedades ejemplares de la boca que pueden tratarse con los inhibidores JNK como se describe en la presente son periodontitis , en particular periodontitis crónica; mucositis, trastornos descamativos orales, planus de liquen oral, pénfigo vulgar, pulpitis; estomatitis; trastorno de la articulación temporomandibular, peri-implantitis etc.

Igualmente los inhibidores JNK de la presente invención pueden - como ya se proponen previamente para otros inhibidores JNK - usarse para el' tratamiento de enfermedades proliferativas tipo enfermedades de tumor y cáncer, tales como carcinomas pulmonares de neurinoma acústico; leucemia linfocitico aguda (Ll, L2, L3) ; leucemia linfoide aguda (ALL) ; leucemia mielógena aguda (AML) ; adenocarcinomas ; carcinoma anal; carcinoma bronquial; carcinoma cervical; cáncer cervical; astrocitoma; basalioma; cáncer con transformación Bcr-Abl; cáncer de vejiga; blastomas; cáncer de hueso; metástasis cerebrales; tumores cerebrales; cáncer de mama; linfoma de Burkitt; carel.noides; cáncer de cuello uterino; leucemia linfocitica ' crónica (CCL) ; leucemia mieloide crónica (CML) ; cáncer de colon; carcinoma de colon; carcinoma corpus; craniofaringeomas ; síndrome de CUP; tumores inducidos por virus; EBV inducida por el linfoma de células B; carcinoma de endometrio; eritoleucemia (M6) ; cáncer de esófago; cáncer de vesícula biliar; cáncer gastrointestinal; tumores del estroma gastrointestinal; tumores gastrointestinales; cáncer genitourinario; glaucoma; glioblastoma; gliomas; tumores de cabeza / cuello; tumores inducidos por la hepatitis B; carcinomas hepatocelulares; hepatomas; tumores inducidos por virus del herpes; síndrome de Hodgkin; linfomas inducidos por HTLV-1; linfomas inducidos por HTLV-2; insulinomas; cáncer intestinal; sarcoma de Kaposi; cáncer del riñon; carcinomas renales; cáncer de la laringe; leucemia; tumor de párpados; cáncer de hígado; metástasis hepáticas; cáncer de pulmón; cáncer de linfoide; linfomas; melanomas malignos; carcinomas de mama; linfoma de células del manto; meduloblastoma ; leucemia megacarioblástica (M7); melanoma, en particular, el melanoma maligno; meningioma; mesotelioma; leucemia monocítica (MS) ; mieloma múltiple; micosis 'fu.ngo.ide; leucemia mieloblástica (Mi); leucemia mieloblástica (M2) ; leucemia mielomonocitica (M4); neurinoma; linfomas no de Hodgkin; carcinoma de células no pequeñas; carcinoma de célula de no pequeña del pulmón; cáncer de esófago; carcinoma de esófago; oligodendroglioma ; cáncer de ovario; carcinoma de ovario; cáncer de páncreas; carcinoma de páncreas; carcinomas inducidos por virus del papiloma; cáncer de pene; tumor de la hipófisis; plasmocitoma; leucemia promielocítica (M3); cáncer de próstata; tumores de próstata; tumores del recto; carcinoma del recto; carcinoma de células renales; retinoblastoma; sarcomas; enfermedad de Schneeberger ; carcinomas de células pequeñas de pulmón; cáncer de intestino delgado; tumores del intestino delgado; tumores de tejidos blandos; espinalioma; carcinoma de células escamosas; cáncer de estómago; cáncer testicular; cáncer . de garganta; timoma; cáncer de tiroides; carcinoma de la tiroides; cáncer de lengua; AML indiferenciada (MO) ; cáncer de la uretra; cáncer uterino; cáncer de la vagina; enfermedad de Von Hippel Lindau; cáncer de vulva; Tumor de Wilms; Xeroderma pigmentoso; etc.

Ya que la señalización JNK también se involucra en muchas trastornos y enfermedades · cardiovasculares , el uso de los inhibidores JNK en el tratamiento de tales enfermedades ya se ha sugerido en el pasado. Los inhibidores de la presente invención pueden usarse en consecuencia, por ejemplo para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares tales como hipertensión arterial; arteriesclerosis; lesiones arterioescleróticas; síndrome de Behcet; bifurcaciones de vasos sanguíneos; hipertrofia cardiaca; hipertrofia cardiovascular; cardiomiopatías, en particular cardiomiopatías inducidas por quimioterapia; isquemia cerebral; enfermedades cardiacas "coronarias; dilatación de la aorta abdominal; isquemia, cerebral focal; isquemia cerebral global; hipertrofia ' cardiaca; hipertensión aneurismo infrarenal; isquemia; infarto al miocardio, en particular infarto al miocardio agudo; miocarditis; reperfusión; restenosis; vasculitis; granulomatosis de Wegener; etc.

Los inhibidores JNK de la presente invención pueden en el contexto de las enfermedades cardiovasculares también usarse complementarios a la cirugía de injerto por revascularización coronaria de arteria coronaria (cirugía CABG) ; angioplástica coronaria transluminal percutánea (PTCA); y/o tratamiento de endoprótesis vascular, por ejemplo para prevenir o tratar hiperplasia íntima que resulta del tratamiento (quirúrgico) .

Las enfermedades del sistema respiratorio y en particular enfermedades pulmonares que pueden tratarse efectivamente con los inhibidores JNK de la. presente invención son por ejemplo síndrome de distensión respiratoria aguda (ARDS) ; asma; enfermedad crónica que involucra el sistema respiratorio; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) ; fibrosis quística; enfermedades inflamatorias pulmonares; neumonía; fibrosis pulmonar; etc.

Similar a los inhibidores en el arte previo los inhibidores de la presente invención también pueden usarse para tratar enfermedad del tracto intestinal, por ejemplo colitis (por ejemplo colitis atípico, colitis química; colitis colagenosa, distal colitis, colitis por desviación; colitis fulminante, ' colitis indeterminado, colitis infecciosa, colitis isquémica, colitis linfocitica, o colitis microscópica), enfermedad de Crohn, gastroenteritis, enfermedad de Hirschsprung, enfermedades digestivas inflamatorias; enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), Morbus Crohn, enfermedades digestivas crónicas o no crónicas, enfermedades digestivas inflamatorias crónicas o no crónicas; enteritis regional; colitis ulcerativa etc.

Los inhibidores JNK- de la presente invención también pueden servir como agente terapéutico para el tratamiento de enfermedades infecciosas que resultan de por ejemplo infección bacteriana o vírica. Los inhibidores JNK como se describe en la presente pueden por ejemplo prevenir o aliviar reacciones inflamatorias provocadas por las infecciones. Los ejemplos para tales estados de las enfermedades, que no so consideran para limitarse, son encefalitis víricas; cánceres inducidas víricas (por ejemplo como se menciona arriba), demencia del virus de inmunodeficiencia humana, meningitis, meningoencefalitis , encefalomielitis , tonsilitis, etc.

Existen muchas otras enfermedades, estados de la enfermedad y trastornos para los cuales los inhibidores JNK de la presente invención pueden usarse como tratamiento, por ejemplo síndrome Aarskog, hepatotoxicidad acetaminofeno ; anomalía Alder-Reilly; alopecia areata; deficiencia alfa-1- antítripsina; anafilaxis; apoptosis; muerte celular apoptótica; síndrome urémico hemolítico atípico; basopenia; basofilia; trastornos bipolares; quemaduras; tensión de corte celular; síndrome Che'dial-Higashi; daño en el ADN debido a los fármacos quimioterapéuticos; colestasis; cromosoma 11, monosomía parcial llq; cromosoma 22, trisomía mosaica; enfermedad granulomatosa crónica; tales como hepatitis crónica o hepatitis fulminante; depresión clínica; hipogamaglobulinemia . variable común; deficiencia C3 congénita; protección de CTL a partir de muerte celular inducida por activación (AICD) ; sordera; depresión y trastornos depresivos (en particular, prevención de trastornos depresivos que se desarrollan en un contexto de comportamiento de la enfermedad inducida por citoquina) , síndrome de Di George; enfermedades causadas por apoptosis defectuosa; enfermedades del hígado; enfermedades de la columna vertebral; enfermedades del útero; estados de enfermedad y síntomas debido a la exposición a agentes que dañan el ADN y/o radiación ionizante y tensión celular resultante; síndrome de Down; distrofia muscular de Duchenne; displasias ectodérmicas ; endometriosis ; eosinopenia; eosinofilia; muerte celular exocitóxica; síndrome de alcoholismo fetal; fibrosis; enfermedad fibrótica; formación de tejido fibroso; radicales libres (que conducen a la tensión celular) ; rechazo del injerto; enfermedad de injerto contra hospedero; pérdida de cabello; síndrome urémico hemolítico; hepatotoxicidad; hiperalgesia, tales como hiperalgesia inducida por diabetes; hipertermia; hipoglucemia; hipotiroidismo; síndrome hipereosinofílico idiopático; nefropatía por IgA; agamaglobulinemia ligada al sexo infantil; dolor inflamatorio; aneirismo infrarrenal; regeneración de los islotes; trasplante de islotes; síndrome de Job (hiper-IgE) ; síndrome · de leucocitos perezosos; deficiencia de deshidrogenasa de leucocitos de glucosa-6-fosfato; leucodistrofia ; leucopenia; leucocitosis linfocítica; linfocitopenia; linfocitosis; depresión mayor; manía; depresión maníaca; síndrome de arfan; mastocitosis ; Anomalía Hegglin Mayo; glomerulonefritis membranoproliferativa Tipo II; monocitopenia; monocitosis; deficiencia benigna mieloperoxidasa; miopatías; neutropenia; neutrofilia; síndrome de Nezelof; trasplante de órganos; lesiones por tensión oxidativa; Pelger-Huet; enfermedades de los ríñones poliquísticos ; síndrome post-diálisis ; síndromes de radiación; radioterapia; enfermedades renales; insuficiencia renal; rescate de CTL a partir de la activación inducida por la muerte celular; enfermedad de inmunodeficiencia combinada severa; rechazo de trasplantes.; trasplante; trisomía; depresión unipolar; lesiones inducidas por UV; Wiskott Aldrich; cicatrización de heridas; etc.

Los inventores de la presente invención consideran el trastorno de la articulación temporomandibular , mucositis, estomatitis, planus de liquen oral (trastorno descamativo) , pénfigo vulgar (trastorno descamativo), periodontitis , periodontitis crónica,' pulpitis, peri-implantitis, uveitis (uveitis anterior, uveitis intermedia, uveitis posterior) , queratoconj untivitis seca (síndrome de ojo seco), cirugía de injerto por revascularización coronaria de la arteria coronaria (cirugía CABG) , infarto al miocardio agudo, prevención de hiperplasia íntima después de la angioplastia coronaria transluminal percutánea. (PTCA) , prevención de hiperplasia íntima después del colocado de endoprótesis vascular, aterosclerosis ,¦ COPD, asma, artritis reumatoide, osteoartritis , enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), psoriasis, diabetes, apoplejía, mal de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, lupus eritematoso sistém co, y vasculitis, en particular granulomatosis de egener, para ser particularmente útil para tratamiento con los inhibidores JNK de la presente invención.

Una persona experimentada en la técnica fácilmente realizará que los trastornos y estados de las enfermedades mencionadas arriba pueden pertenecer a más de una de las clases de la enfermedad mencionada arriba. Por ejemplo, carcinoma bronquial es ciertamente no sólo una enfermedad proliferativa pero debería también pertenecer en el grupo de enfermedades del sistema respiratorio incluyendo enfermedades pulmonares. De esta manera, la clasificación mencionada arriba de las enfermedades individuales no se considera para limitarse o concluirse pero se considera para únicamente naturaleza ejemplar. No se excluye, que los estados de la enfermedad individual recitados en una clase son objetivamente también ejemplos adecuados para la aplicación de los inhibidores JNK de la presente invención como tratamiento en otra clase de los estados de la enfermedad. Una persona experimentada en la técnica fácilmente será capaz de asignar los estados de la enfermedad diferente y trastornos para emparejar las clasificaciones.

Finalmente, como se menciona arriba, la presente invención contempla el uso de un inhibidor JNK como se define en la presente para el tratamiento de varios trastornos y estados de las enfermedades. La presente invención no contempla el uso de los inhibidores JNK como se define en la presente para inmunizar los animales no humanos, por ejemplo para la producción de anticuerpos monoclonales. Tales métodos en la presente no. se consideran para ser métodos para tratamiento del cuerpo animal para terapia.

Todas las referencias citadas en la presente se incorporan en la presente como referencia.

EJEMPLOS En lo siguiente, se presentan ejemplos particulares que ilustran varias modalidades y aspectos de la invención. Sin embargo, la presente invención no deberá limitarse al alcance por las modalidades especificas descritas en la presente. De hecho, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas en la presente se volverán fácilmente aparentes para aquellos experimentados en la técnica de la descripción anterior, figuras acompañantes y los ejemplos a continuación. Todas las modificaciones caen dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 1: Síntesis del inhibidor JNK SEQ ID NO: 172 Como ejemplo ilustrativo, la síntesis del inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se establece a continuación. Una persona experimentada en la técnica conocerá que la síntesis también puede usarse para y fácilmente adaptarse a la síntesis de cualquier otro inhibidor JNK de acuerdo con la presente invención.

El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se fabricó por síntesis de péptido de fase sólida usando la estrategia Fmoc ( 9-fluorenilmetiloxicarbonilo) . El ligador entre el péptido y la resina fue el ligador de amida Rink (ácido p- [Fmoc-2 , 3-dimetoxibencil] -fenoxiacético) . El péptido se sintetizó por ciclos de acoplamiento de aminoácido Fmoc y desprotección Fmoc sucesivos. Al final de la síntesis, el péptido completado se escindió por ácido tri fluoroacético (TFA) directamente para proporcionar la amida de terminal C cruda, que luego se purificó por HPLC de fase inversa preparativa. Las fracciones purificadas se agruparon en un lote homogéneo que se trató por cromatografía de intercambio de iones para obtener sus al de acetato. El péptido luego se secó por congelado. 1.1 Síntesis de fase sólida del péptido Excepto cuando se señale, la fabricación toma lugar a temperatura ambiente (22°C + 7°C) en un ambiente filtrado con aire. La escala de síntesis fue 0.7 mmoles del aminoácido de inicio en la resina, para un rendimiento esperado de alrededor de Ig de péptido purificado. La síntesis se realizó manualmente en un reactor de 30-50 mL equipado con un disco sinterizado con agitación mecánica y/o burbujeo de nitrógeno. 1.2 Preparación de la resina La resina p-metilbenzhidrilamida (MBHA-resina) se lavó primero con diclorometano/ dimetilformamida/ diisoproplietilamina bajo nitrógeno. La resina lavada luego se acopló al ligador de amida Rink (ácido p-[Fmox-2,4-dimetoxibencil] -fénoxiacético) en PyBOB (hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris-pirrolidino-fosfonio) / diisopropil-etilamina/l-hidroxiben.zotriazol para proporcionar resina de amida-MBHA Fmoc-Rink. 1.3 Acoplamiento de Aminoácidos Los aminoácidos se acoplaron a la resina usando el siguiente ciclo: La resina de amida-MBHA Fmoc-Rink se desprotegió al lavar esto en 35% (v/v) de piperidina dimetilformamida, seguido por dimetilformamida . La reacción de desprotección toma aproximadamente 16 minutos. Los aminoácidos protegidos Fmoc (por ejemplo, 2 eq de aminoácido y HOBt (1-hidroxibenzotriazol) en dimetilformamida/diclorometano (50/50) se agregaron a la resina seguido por adición de 2 eq del agente de acoplamiento diisopropilcarbodiimida (DIC). La reacción de acoplamiento toma desde una hora hasta durante la noche dependiendo del aminoácido respectivo que se agrega. Los volúmenes se calcularon en una base de 0.5 mL/lOOmg de péptido-resina y ajustaron después de cada ciclo. Después del acoplamiento, la resina se lavó 3 veces con DMF. La terminación del acoplamiento se probó por la prueba de ninhidrina (o prueba Kaiser 1) en aminas primarias y la prueba cloranilo 2 en aminas secundarias. En algunas ocasiones, la prueba de cloranilo puede asociarse con una prueba de ninhidrina como un control de seguridad. En caso de que la prueba de acoplamiento indique incompletación de la reacción, el acoplamiento se repitió con un exceso inferior (0.5-1 eq) de aminoácido, PYBOP, HOBT en dimetilformamida/diclorometano y diisopropiletilamina . La funcionalidad de la resina se midió y generalmente 0.6-0.2 meq/g, dependiendo de la carga original de la resina. Después de que el último aminoácido se ha acoplado, el péptido-resina se desprotegió como es usual y luego lavó 5 veces con DCM antes de secado en un horno bajo vacio a 30 °C. Después de que el péptido-resina se ha secado, el rendimiento de la síntesis de fase sólida se calculó como la relación del incremento en peso de la resina de péptido comparada con el incremento en peso teórico calculado de la carga inicial de la resina. El rendimiento puede estar cercano hasta 100%. 1.4 Escisión y desprotección El péptido se escindió de la resina en una mezcla de ácido trifluoroacético/1 , 2-etandtiol/ tioanisol/agua/fenol (88/2.2/4.4/4.4/7 v/v) , también nombrado reactive TFA/K, durante 4 horas a temperatura ambiente. El volumen de reacción fue lmL/lOOmg de resina de péptido. Durante la adición de la resina al reactivo, la temperatura de mezcla se reguló para quedarse debajo de 30°C. 1.5 Extracción del péptido de la resina: El péptido se extrajo de la resina por filtración a través de un disco sinterizado. Después de la concentración en un rotoevaporador hasta 1/3 de su volumen, el péptido se precipitó por éter de metilo de t-butilo frió y filtró. El péptido crudo luego se secó bajo vacio a 30°C. 1.6 Purificación HPLC Preparativa: El péptido crudo luego se purificó por HPLC de fase inversa hasta una pureza de =95%. Las fracciones purificadas se concentraron en un rotoevaporador y secado por congelación. 1.7 Cromatografía de intercambio de iones Los grupos secados por congelación concentrados de péptido purificado con la secuencia de la SEQ ID NO: 172 se disolvieron en agua y purificaron por cromatografía de intercambio de iones de acetato de Dowex, resina de malla 50-100.

Los reactivos de partida requeridos para la síntesis fueron : Otros Inhibidores' JNK de la presente invención pueden prepararse en manera similar.

Ejemplo 2: Eficacia inhibidora de inhibidores JNK seleccionados de acuerdo con la presente invención En lo siguiente un procedimiento de operación estándar se establecerá, que describe cómo se midió la eficacia inhibidora de los inhibidores JNK de acuerdo con la presente invención. El método permite medir in vitro, en un ensayo estandarizado no reactivo, la capacidad de un compuesto candidato para disminuir la fosforilación del sustrato especifico c-Jun por JNK. Además, se ilustrará cómo determinar el efecto inhibidor (IC50) y el Ki de un compuesto elegido para JNK. El método es adecuado para verificar si un compuesto candidato inhibe o no la actividad JNK. Y una persona experimentada en la técnica ciertamente entenderá cómo adaptar los métodos a continuación para sus propósitos y necesidades especificas. 2.1 Material Placa y reactivo AlfaScreen: His-JNKl (ref 14-327, Upstate, 10 µg en 100 µ? : concentración: 2.2 µ'?) final 5nM His-JNK2 (ref 14-329, Upstate, 10 µ? en 100 µ? : concentración: 2 µ?) final 5nM His-JNK3 (ref 14-501, Upstate, 10 µ-g en 100 µ? : concentración: 1.88 µ?) final 5nM Anti-Fosfo-cJun¦ (ref 06-828, Upstate, lote DAM1503356, concentración: 44.5 µ?) final ???? - Biotin-cJun (29-67) : secuencia: Biotina SNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVG (SEQ ID NO: 198), lote 100509 (mw 4382.11, P 99.28%) disuelto en H20, concentración: 10 mM) final 30nM - ATP (ref AS001A, Invitrogen, lote 50860B, concentración 100 mM) ) final 5 µ? perlas SAD (ref 6760617M, PerkinElmer, lote 540-460-A, concentración 5mg/ml) final 20 µg/ml perlas AprotA (ref 6760617M, PerkinElmer, lote 540- 460-A, concentración 5mg/ml) final 20 pg/ml placa blanca de 384 pozos Optiplate (ref 6007299, PerkinElmer, lote 654280/2008) placa de 96 pozos para dilución de péptido (ref 82.1581, Sarstedt) TopSeals-A (ref 6005185, Perkin Elmer, Lote 65673) lectura de transferencia de energía Bioluminiscente La transferencia de energía bioluminiscente se leyó en el lector de Placa Alfa de Fusión (Perkin Elmer).

Pipeta : Una pipeta EDP3 electrónica 20-300 (Ref 17007243; Rainin) se usó para relleno en la placa con la mezcla de Enzima-Anticuerpo, la mezcla de Susbtrato-ATP y las Perlas.

- Un multicanal PIPETMAN® Ultra 8X20 (Ref 21040; Gilson) se usó para relleno en la placa con los compuestos inhibidores .

Solución amortiguadora y soluciones - Solución amortiguadora de cinasa: Tris-base 20mM pH 7.4, MgCl2 lOm , DT lmM, Na3V04 ???µ?, Tween al 0.01%, (DMSO al 1%) Solución amortiguadora de paro: Tris-base 20mM pH 7.4, NaCl 200mM, EDTA-K 80mM (pH de 8 con KOH en lugar de NaOH) , BSA al 0.3% Solución amortiguadora de cinasa de dilución JNK: Tris-base 50mJ pH 7.4, NaCl 150mM, EGTA O.lmM, Brij-35 0.03%, sacarosa 270mM, ß-mercaptoetanol al 0.1%. 2.2 Método Para evaluar el efecto inhibidor de los péptidos, se realizó un ensayo AlphaScreen estándar (ver por ejemplo Guenat et al. J Biomol' Screen, 2006; 11: páginas 1015-1026). Los diferentes componentes se prepararon y posteriormente mezclaron como se indica. Las placas se sellaron e incubaron como sigue: 5 µ? JNK + Anticuerpo 5 µ? TP cinasa + / - inhibidor Pre-incubación 30 min 5 µ? Biotina-cJun + ATP Incubación 60 min a 24 °C 10 µ? Perlas SAD + A protA Incubación 60 min en la oscuridad a 24°C Para evitar la contaminación, las mezclas se agregaron con la pipeta en la diferente esquina del pozo. Después del llenado de la placa con cada mezcla, la placa se tapó (Mantener un lado fijo y dejar el lado opuesto drena la mesa) para dejar que la mezcla vaya hacia abajo de las paredes de los pozos .

La transferencia de energía bioluminiscente se leyó en el lector de Placa Alfa de Fusión (Perkin Elmer) .

Todos los compuestos deberían al menos probarse por triplicado en 3 experimentos independientes para cada isoforma de JNK. Posiblemente las concentraciones de los compuestos a tratarse fueron 0, 0.03 nM, 0.1 nM, 0.3 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1 µ?, 3?µ?, 10 µ??, 30 µ?, y 100 µ?. Los controles fueron muestras ya sea sin JNK o sin sustrato (c-Jun) .

Preparación de mezcla .

JNK1, JNK2 y JNK3 5nM Biotina-cJun 30 nM ATP 5?µ?; Anti fosfo-cJun (S63) ???? Bille SAD/AprotA 20ü\iq/ l Anticuerpo [final] = ???? (anti Fosfo cJun (S63) ) Parte de detección: [Mezcla] X5 (5 µ? en volumen final de 25 µ?) [Reserva] = 44.5 µ? (ref 06-828, Upstate, Lote DAM1503356) 10 nM -> 50nM en solución amortiguadora de cinasa JNK1, JNK2 y JNK3 [final] = 5nM Parte de reacción: [Mezcla] X3 (5 µ? en volumen final de 15 µ?) [Reserva] = 2.2 µ? para JNK1 (ref 14-327, Upstate, lote D7KN022CU) 2.0 µ? para JNK2 (ref 14-329, Upstate, lote 33221CU) 1.88?µ? para JNK3 (ref 14-501, Upstate, lote D7CN041CU) 5 nM 15nM en solución amortiguadora de anticuerpo Inhibidor: Parte de reacción: [Mezcla] X3 (5 µ? en volumen final de 15 µ?) [Reserva] = 10 mM 100 ?µ? -> 300 ?µ? en solución amortiguadora de cinasa 30 ?µ? -> 90 ?µ? en solución amortiguadora de cinasa 10 ?µ? - 30 ?µ? en . solución amortiguadora de cinasa 0.03 nM -> 0.09 nM en solución amortiguadora de cinasa Y 0 nM Solución amortiguadora de cinasa Se realizaron dos series de diluciones en serie 10 veces en una placa de 96 pozos, uno comienza con 300 µ? hasta 0 nM, el segundo con 90 µ? hasta 0.03 nM. Los péptidos se agregan en las 384 placas con una multipipeta de 8 canales (ref F14401, Gilson, 8X20). · ATP [final] = 5 µ? Parte de la reacción: [Mezcla] X3 (5 µ? en volumen final de 15 µ?) [Reserva] = 100 mM (ref AS001A, Invitrogen, lote 50860B) 5 µ? 15 µ? en solución ámortiguadora de cinasa Biotina c-Jun [final] = 30nM Parte de la reacción: [Mezcla] X3 (5 µ? en volumen final de 15 µ?) [Reserva] = 10 mM 30 nM - 30nM en solución amortiguadora ATP Perlas SAD / A ProtA [final] = 20 µg/ml (sensible a la luz) Parte de la detección: [Mezcla] X 2.5 (10 µ? en volumen final do 25 l) [Reserva] = 5 mg/ml -> 20Dug/ml 50Dug/ml en Solución amortiguadora de paro Mezcla en la habitación oscura (luz verde) o en la oscuridad.

Análisis de las curvas IC50: El análisis se realizó por el software GraphPad Prism4 con la siguiente ecuación: respuesta de dosis Sigmoidal (Sin restricción) .

Y=fondo + (superior-inferior) / (1+10? ( (LogEC50-X) ) ) Los datos atipicos se evitaron usando la prueba de Grugg.

Comparación del IC50: El análisis se realizó por el software GraphPad Prism4 con la siguiente prueba: prueba ANOVA de una vía seguido por una prueba de comparación múltiple de Tukey. P<0.05 se considera como importante.

El Km del ATP para JNK y el Km de péptido especifico biotina-cJun se determinaron en el ensayo de estandarización AlphaScreen de reporte La relación matemática entre Ki y IC50 (Ki = IC50 / (1 + ( [Sustrato] / Km del sustrato) ) puede usarse para calcular los valores Ki .

Ejemplo 3: Análisis y experimentos de internalización 3.1 Materiales y Métodos para experimentos de absorción a) Linea celular : La linea celular usada para este experimento fue HL-60 (Ref CCL-240, ATCC, Lote 116523) b) Placas y medio de cultivo RPMI (Ref 21875-091, Invitrogen, Lote 8296) o DMEM (Ref 41965, Invitrogen, Lote 13481) complementado sobre 05.05.2008 con; FBS al 10% (Ref A64906-0098, PAA, Lote A15-151) : descomplementado a 56°C, 30 min, en 04.04.2008.

Piruvato de sodio lmM (Ref S8.636, Sigma, Lote 56K2386) Penicilina (100 unidad/ml ) /Estreptomicina (100µ?/?t?1) (Ref P4333, Sigma, Lote 106K2321) PBS 10X (Ref 70011, Invitrogen, Lote 8277),: diluido hasta IX con H20 estéril Tripsina-EDTA al 0.05% (Ref L-11660, PAA, Lote L66007- 1194) Placas de cultivo de 6 pozos (Ref 140675, Nunc, Lote 102613) Placas de cultivo de 24 pozos (Ref 142475, Nunc, Lote 095849) Placas de cultivo de 96 pozos (Ref 167008, Nunc, Lote 083310) Placas de 96 pozos para dosificación de proteína ( Ref 82.1581, Sarstedt) Placas de 96 pozos para medición de fluorescencia (Ref 6005279, Perkin Elmer) c) Soluciones Solución de recubrimiento poli-D-lisina (Sigma P9011 Lote 095K5104): 25µ?/???1 final diluida en PBS lx Solución amortiguadora de lavado ácida: Glicina 0.2M, NaCl 0.15M, pH 3.0 Solución amortiguadora de lisis Ripa: NaH2P04 lOmM pH 7.2, NaCl 150mM, Tritón X-100 al 1%, EDTA lmM pH 8.0, Na3V02 200µ?, SDS al 0.1%, cóctel inhibidor de proteasa IX (Ref 11873580001, Roche, Lote 13732700) d) Lector de placa de fluorescencia y microscopía Las células se observaron y contaron usando un microscopio invertido (Axiovert 40 CFL; Zeiss; 20X) .

La fluorescencia se leyó con el lector de placa Alfa de Fusión (Perkin Elmer) . e) Método Se estudió la internalización de péptido marcado FITC en las células de suspensión. Las células se colocaron en placa en platos recubiertos con poli-DL-lisina a una concentración de 1 x 106 células/ml. Las placas luego se incubaron durante 24 h a 37 °C, C02 al 5% y humedad relativa al 100% antes de la adición de una concentración conocida de péptido. Después de la adición de péptido, las células se incubaron 30 min, 1, 6 o 24 h a 37 °C, C02 al 5% y humedad relativa al 100%. Las células luego se lavaron dos veces con una solución amortiguadora ácida (Glicina 0.2 M, NaCl 0.15 M, pH 3.0) con objeto de remover el péptido adsorbido de superficie celular (ver Kameyama et al., (2007), Biopolymers, 88, 98-107). La solución amortiguadora ácida se usó como péptidos ricos en aminoácidos básicos adsorbidos fuertemente en las superficies celulares, que a menudo resultan en sobreestimación de péptido internalizado. El lavado celular usando una solución amortiguadora ácida de esta manera se empleó para remover los péptidos adsorbidos de superficie celular. El lavado ácido se llevó a cabo al determinar la absorción celular de conjugados de péptido que permean la célula/Fab, seguido por dos lavados PBS. Las células se rompieron por la adición de la solución amortiguadora de lisis RIPA. La cantidad relativa de péptido internalizado luego se determinó por fluorescencia después de la sustracción del fondo y normalización del contenido de la proteína..

Las etapas son de esta manera: 1. Cultivo celular 2. Lavado ácido y extractos celulares 3. Análisis de internalización de péptido con un lector de placa de fluorescencia f) Tratamiento de péptido y cultivo celular Las placas de cultivo de 6 pozos se recubren con 3 mi de Poli-D-Lys (Sigma P9011; 25 µ?/ta? en PBS), las placas de 24 pozos con 600 µ? y las placas de 96 pozos con 125 µ? y se incuban durante 4 h a 37 °C, humedad relativa al 5% y 100% de C02.

Después de 4 horas los platos se lavaron dos veces con 3.5ml de PBS, 700¦ µ1 o 150 µ? de PBS para las placas de 6, 24 o 96 pozos, respectivamente.

Las células se colocaron en placas en los platos en medio de 2.4 mi (RPMI) en densidades de placa de l'OOO'OOO células/ml para células de suspensión. Después de la inoculación, las placas se incubaron a 37 °C, C02 al 5 % y humedad relativa al 100% durante 24 horas antes de la adición del péptido. Las células adherentes deberán estar a una densidad de 90-95% el día del tratamiento y se colocaron en DMEM: Las células se trataron con la concentración deseada de péptido etiquetado FITC (solución de reserva en una concentración de 10 mM en H20) .

Después de la adición de péptido, las células se incubaron 0 hasta 24 horas (por ejemplo 30 min, 1, 6 o 24 horas) a 37°C, humedad relativa al 5% y 100% de.C02.

Extractos celulares y lavado ácido: Los extractos se enfriaron en hielo.

Las células de suspensión (o células, que no se enlazan bien al plato) : Transferir las células en « Falcon 15 mi ». Recuperar el máximo de células, lavar el plato con 1 mi de PBS.

Cosechar las células 2 min en 2400 rpm max.

Suspender las células en 1 mi de PBS frío.

Transferir las células . en un "tubo Eppendorf" recubierto (recubierto con lml de poli D-Lys durante 4horas y lavado dos veces con lml de PBS) .

Lavar tres veces con 1 mi de solución amortiguadora de lavado de ácido frió y centrifugar 2 min en 2400 rpm max. Tener cuidado con la difusión de las células en el "eppendorf". · Lavar dos veces con 1 mi de PBS frió para neutralizar.

Agregar 50 µ? de solución amortiguadora RIPA de lisis.

Incubar 30 min-lh en hielo con agitación.

Células adhérentes: Lavar tres veces con 3 mi, 1 mi o 200 µ? (para, placas de 6, 24 o 96 pozos, respectivamente) de solución amortiguadora fría de lavado ácida. Tener cuidado de las células que se desprenden del plato.

Lavar dos veces con 1 mi de PBS frió (para placas de 6, 24 o 96 pozos, respectivamente) para neutralizar.

Agregar 50 µ? de solución amortiguadora RIPA.

Incubar 30 min-lh en hielo con agitación.

Descartar las. células con un raspador frió. Las placas de 24 y 96 pozos se centrifugaron directamente en 4000rpm a 4o durante 15min para remover los desechos celulares. Luego los sobrenadantes (100 ? 50ml respectivamente para las placas de 24 o 96 pozos), se transfirieron directamente en una placa de 96 pozos oscura. Las placas se leyeron por un lector de placa de fluorescencia (Fusión Alpha, Perkin Elmer) .

Transferir el lisado en un "eppendorf" recubierto (recubierto con lml de poli D-Lys durante 4horas y lavar dos veces con lml de PBS) .

Las células Usadas luego se centrifugaron 30 min en 10000 g a 4°C para remover los desechos celulares.

Remover el sobrenadante y almacenar esto a -80 °C en un "tubo Eppendorf" recubierto (recubierto con 1 mi de poli D-Lys durante 4 horas y lavado dos veces con 1 mi de PBS) .

Análisis de internalización de péptido con un lector de placa de fluorescencia: El contenido de cada extracto de proteina se determinó por un ensayo BCA estándar (Kit N°23225, Pierce) , siguiendo las instrucciones del fabricante.

La fluorescencia relativa de cada muestra se determina después de la lectura 10 µ? de cada muestra en un lector de placa de fluorescencia (Fusión Alpha, Perkin Elmer) , sustracción de fondo y normalización : por concentración de proteina. 3.2 Experimentos de Absorción La internalización dependiente de tiempo (absorción) de constructos transportadores derivados de TAT etiquetados FITC en células de la linea celular HL-60 se llevó a cabo como se describe usando secuencias de péptidos transportadores de las SEQ ID NOs: 52-96, 43, y 45-47. Estas secuencias se enlistan a continuación en la Tabla 4.

Tabla 4: Secuencia transportadora probada en experimentos de absorción En la tabla de arriba los aminoácidos D se indican por un "d" pequeño antes .del residuo de aminoácido respectivo (por ejemplo dR = D-Arg) .

Para unas pocas secuencias la síntesis cae en el primer enfoque desafortunadamente debido a razones técnicas. Estas secuencias se abrevian en la Figura 6 como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 43, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 85, 86, 87, 88, 89, y 90. Sin embargo, las secuencias restantes se usaron en los experimentos de internalización .

Los resultados se muestran en la Figura 6.

Como puede apreciarse en la Figura 6, después de 24 horas de incubación, todos los transportadores con la secuencia de consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31) muestra una capacidad de internalización superior que el transportador L-TAT (SEQ ID NO: 43) . Las células Hela se incubaron 24horas en placa de 96 pozos con lOmM de los transportadores derivados de r3-L-TAT. Las células luego se lavaron dos veces con una solución amortiguadora' ácida (glicina 0.2M, NaCl 0.15M, pH 3.0) y dos veces con PBS. Las células se rompieron por la adición de solución amortiguadora de lisis RIPA. La cantidad relativa de péptido internalizado luego se determinó al leer la intensidad de fluorescencia (lector de placa Fusión Alpha; PerkinElmer ) de cada extracto seguido por sustracción de fondo'.

Como puede apreciarse en la Figura 6, una posición aparece para ser critica para la actividad transportadora más alta y para cinéticos mejorados de la actividad transportadora: Y en la posición 2 (péptido N°91 correspondiente a la SEQ ID NO: 142) .

La conclusión de este experimento es como sigue: • Después de .24 horas de incubación, todos los transportadores con la secuencia de consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31) (ver Tabla 2 para una selección de secuencias posibles) muestra una capacidad de internalización superior que el transportador L-TAT (SEQ ID NO: 43) (Figura 6) . Aquellos resultados completamente validan la secuencia de consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31).

• Una posición es critica . para la actividad transportadora más alta y (Figura 6): Y en la posición 2 (secuencia 91 correspondiente a SEQ ID NO: 142) .

En consecuencia, tales secuencias derivadas de TAT como se muestra en la Tabla 4 se prefieren, que exhiben una Y en la posición 2, particularmente cuando la secuencia exhibe 9 aa y tiene la secuencia de consenso rXXXrXXXr (SEQ ID NO: 31).

Ejemplo 4: Medición- de citoquina y liberación de quimiocina En lo siguiente el procedimiento se establecerá describiendo cómo se midió la cantidad liberada de diversas citoquinas humanas después de la secreción inducida del ligando de células humanas (Sangre, WBC, PBMC, linfocitos primarias purificados, lineas celulares, ...) .

La técnica usada es un ELISA de intercalado, que permite medir la cantidad de antigeno entre dos capas de anticuerpos (esto es anticuerpo de. detección y captura) . El antigeno para medirse debe contener al menos dos sitios antigénicos capaces de enlazar al anticuerpo, ya que al menos dos anticuerpos actúan en el intercalado. Cualquiera de los anticuerpos monoclonales o policlonales puede usarse como los anticuerpos de detección y captura en los sistemas de ELISA de intercalado. Los anticuerpos monoclonales reconocen un epitopo sencillo que permite cuantificación y detección fina de diferencias pequeñas, en el antigeno. Un policlonal a menudo se usa como el anticuerpo de captura para tirar hacia abajo tanto del antigeno como sea posible. La ventaja de ELISA de intercalado es que la muestra no tiene que purificarse antes del análisis, y el ensayo puede ser muy sensible (hasta 2 hasta 5 veces más sensible que directo o indirecto) .

El método puede usarse para determinar el efecto de los inhibidores JNK de la presente invención in vitro/cultivo celular. En dosis no tóxicas, la eficacia del compuesto se indica por la disminución de los niveles de citoquina (la variación de densidad óptica (absorbancia en 450 nm) ) como se compara con las muestras no tratadas y se monitorea por ELISA. Los resultados se expresan en ng/ml. 4.1 Material Placa de 96 pozos: • Para recolectar los sobrenadantes (Ref 82.1581, Sarstedt) • Para ELISA (F96 maxisorp, Ref 442404, Nunc) • TopSeal-A: sellos de microplaca de 96 pozos (Ref 600585, PerkinElmer) .

Reactivo ELISA Solución amortiguadora ELISA de recubrimiento: NaCarbonato 0.1M pH 9.5 (= 7.13g de NaHC03 (ref 71627, Fluka) + 1.59g de Na2C03 (ref 71345, Fluka) en 1 litro de H20, pH hasta 9.5 con NaOH concentrado) Solución amortiguadora ELISA de lavado: PBS IX + Tween20 al 0.01%. Preparar 1 litro de PBS IX (PBS10X: ref 70011, GIBCO) y agregar lOOul de Tween20 (ref P1379, Sigma) lentamente mientras se mezcla con agitador magnético) Diluyente de ensayo: PBS IX + FBS al 10% (Ref A15-151, PAA, descomplementado a 56°C, 30 min) .

DAKO T B (ref S1599, DAKO) : solución de sustrato comercial Solución de paro: H3PQ4 1M (-> para 200ml = 177ml.de H20 + 23ml. de H3P0 85% (ref 345245, Aldrich) .

Kis ELISA (reactivo para 20 placas) IFN-y: conjunto de IFN-y ELISA Humano, BD OptEIA™ (ref 555142, DB) .

IL-?ß: conjunto de IL-?ß ELISA Humano II, BD OptEIA™ (ref 557953, BD) IL-10 : conjunto IL-10 ELISA humano II, BD OptEIA™ (ref 555157, DB) .

IL-12 : conjunto IL-12 (p70) ELISA humano, BD OptEIA™ (ref 555183, DB) . .

IL-15 : conjunto IL-15 ELISA humano, BD OptEIA™ (ref 559268, DB) .

IL-2: conjunto IL-2 ELISA humano, BD OptEIA™ (ref 555190, DB) .

IL-4 : conjunto IL-4 ELISA humano, BD OptEIA™ (ref 555194, DB) .

IL-5 : conjunto IL-5 ELISA humano, BD OptEIA™ (ref 555202, DB) .

IL-6: conjunto IL-6' ELISA humano I, BD OptEIA™ (ref 555220, DB) .

IL-8: conjunto .IL-8 ELISA humano, BD OptEIA™ (ref 555244, DB) .

MCP-1 : conjunto MCP-1 ELISA humano, BD OptEIA™ (ref 555179, BD) TNF-g : conjunto de Kit TNF ELISA humano, BD OptEIA™ (ref 555212, DB) .

Lectura de absorbancia: La absorbancia se leyó en el lector de placa Fusión Alpha (Perkin Elmer) .

Pipetas de repetición, pipetas digitales o pipetas de canales múltiples. 4.2 Método Preparación de las muestras Las muestras son sobrenadante de medio de cultivo de células humanas cultivadas (típicamente sangre entera, BC, PBMC, subtipo purificado . de WBC, líneas celulares cancerosas). Remover cualquier material en partículas por centrifugación (400g 5min 4°C) y colocar inmediatamente o almacenar las muestras a = -20°C. Evitar ciclos de congelado-descongelado repetidas.

Una hora antes del uso, descongelar las muestras en hielo y centrifugarlas. En la etapa 11, diluir las muestras en el diluyente de ensayo directamente en la placa (agregar primero el diluyente de ensayo, luego las muestras y la pipeta hacia arriba y hacia abajo) : Preparación de estándar Después de calentar el estándar liofilizado a temperatura ambiente, abrir cuidadosamente para evitar la pérdida de material. Reconstituir el estándar liofilizado con el volumen propuesto de agua desionizada para proporcionar un estándar de reserva. Permitir al estándar equilibrarse durante al menos 15 minutos antes de hacer las diluciones. Colocar en vórtices suavemente para mezclar. Después de la reconstitución, inmediatamente el estándar de alícuota se reserva en vial de polipropileno en 50 µ? por vial y congela a -20°C durante hasta 6 meses. Si es necesario, almacenar a 2-8° C durante hasta 8 horas antes de colocar en alícuota/congelación. No dejar el estándar reconstituido a temperatura ambiente.

Inmediatamente antes del uso, preparar una curva estándar de diez puntos usando diluciones en serie 2 veces en el diluyente de reactive. Se recomienda un estándar alto de 4000 pg/ml.

Preparación de la mezcla detectora Incubación de una etapa de. los reactivos Biotina/SAv. Agregar el volumen requerido del Anticuerpo de Detección para el Diluyente de Ensayo. Dentro de 15 minutos antes del uso, agregar la cantidad requerida del Reactivo de Enzima, colocar en vórtice o mezclar bien. Para las diluciones recomendadas, ver el Certificado de Análisis/Instrucción especifico de lote. Descartar cualquier Detector de Trabajo restante después del uso.

Recubrimiento con Anticuerpo de Captura 1. Recubrir los pozos de una placa de microtitulación PVC con 100 µ?_ por pozo del Anticuerpo de Captura diluido en la Solución Amortiguadora de Recubrimiento. Para la dilución de recubrimiento del anticuerpo recomendado, ver el Certificado de Análisis/Instrucción especifico de lote. 2. Cubrir la placa con- un plástico adhesivo e incubar durante la noche a 4°C. 3. Remover la solución de recubrimiento y lavar la placa al rellenar los pozos . con solución amortiguadora de lavado 150µ1. 4. Las soluciones o lavados se remueven al agitar la placa sobre un fregadero. 5. Repetir el proceso dos veces durante un total de tres lavados. 6. Después del último lavado, remover cualquier solución amortiguadora de lavado al aplanar . la placa en una toalla de papel.

Bloqueo 7. Bloquear los sitios enlazados a la proteína restantes en los pozos recubiertos al agregar ???µ? de diluyente de reactivo por pozo. 8. Cubrir la placa con un plástico adhesivo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. 9. Durante la incubación, iniciar la preparación del estándar.

Agregación de muestras 10. Hacer un lavado como en la etapa 3 con 150µ1 de solución amortiguadora de lavado. Las placas ahora están listas para adición de muestra. 11. Agregar 50 µ? de muestras apropiadamente diluidas en el diluyente de ensayo a cada. pozo. Para los resultados cuantitativos exactos, siempre comparar la señal de muestras desconocidas contra aquellas de una curva estándar. Los estándares (triplicados) y el blanco deben correrse con cada citoquina para asegurar precisión. 12. Cubrir la placa con un plástico adhesivo e incubar durante 2 h a temperatura ambiente.

Incubación con el anticuerpo de detección y anticuerpo secundario 13. Lavar la placa cuatro veces con 150µ1 de solución amortiguadora de lavado tipo etapa 3. 14. Agregar 50 µ? de mezcla detectora (anticuerpo de detección + anticuerpo de estreptavidina-HRP secundario en el diluyente de ensayo) para cada pozo en diluciones recomendadas (ver Certificado de Análisis/Instrucción especifico de lote). 15. Cubrir la placa con un plástico adhesivo e incubar durante 1 h a temperatura ambiente protegido de la luz. 16. Lavar la placa seis veces con 150µ1 de solución amortiguadora de lavado como en la etapa 3. 17. Agregar 50 µ? de solución DAKO TMB a cada pozo, incubar durante 15-20 min a temperatura ambiente, en la oscuridad, no sellado. 18. Agregar 50 µ? de solución de paro para cada pozo. Suavemente golpear la placa para asegurar a través de mezclado. 19. Mezclar la placa 5min en 500rpm en un mezclador de placa. 20. Leer la densidad óptica en 450 nm. (Programa: Citoquina_ELISA en el lector de Placa Fusión Alpha) .

Análisis de Datos Promediar las lecturas en triplicado para cada control estándar y cada muestra. Sustraer la densidad óptica estándar cero promedio (O.D). Crear un trazador de curva estándar el log de la concentración de citoquina contra el log del O.D y la mayor linea fija puede determinarse por análisis de regresión. Si las muestras se han diluido, la lectura de concentración de la curva¦ estándar debe multiplicarse por el factor de dilución. Una curva estándar deberá generarse para cada conjunto de muestras colocadas en ensayo. Los datos atipicos se evitaron usando prueba de Grugg. Luego los datos que no estuvieron en el intervalo de dos veces el SD, se descartaron. Los experimentos independientes se toman en cuenta si el control positivo muestra datos como se observan previamente. Los experimentos independientes se agrupan (N > 3) .

Los datos se presentan en pg/ml de liberación de citoquina o en %, comparado con la condición inducida sin el tratamiento inhibidor.

Ejemplo 5: Diferenciación - estimulación THP1 para liberación de citoquina En lo siguiente el procedimiento se establecerá describiendo cómo se indujo la producción de citoquina de células THP1 diferenciadas PMA humanas desafiadas por LPS durante 6h con objeto de probar la capacidad de los inhibidores JNK de la presente invención, en particular de un inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172, para reducir la liberación de citoquina inducida por estimulación. Las células THP1 se estimularon ex-vivo por ligandos diferentes para la lectura de liberación de citoquina. En dosis no tóxicas, la eficacia del inhibidor JNK se indica por la disminución de los niveles de citoquina como se compara con muestras no tratadas y se monitorea por ELISA. La toxicidad del compuesto Se evalúa por la reducción de una sal de tetrazolio (MTS) para forraazan, dando un color púrpura.

Procedimiento: a. Material · Linea celular: THP-l (Ref TIB-202, ATCC, lote 57731475) • Medio de cultivo, reactivo y placas RPMI (Ref 21875-091, Invitrogen) complementado con: FBS al 10% (Ref A15-151, PAA) : descomplementado a 56°C, 30 min.

Hepes lOmM (Ref H0887, Sigma) 50DM -mercaptoetanol (Ref 63690, Fluka : reserva en 14.3M) : agregar 560 1 de alícuotas 50mM en PBS reservado a -20°C) Piruvato de sodio lmM (Ref S8636, Sigma) Penicilina ( 100unidades/ml ) / Estreptomicina (100 g/ml) (Ref P4333, Sigma) El medio RPMI luego se filtra con un filtro 0.22 M (Ref SCGPU05RE, Millipore) .

PBS 10X (Ref 70011, Invitrogen) : diluido hasta IX con H20 estéril DMSO: Ref 41444, Fluka ??? (13-acetato de farbol 12-miristato, Ref P1585, Sigma, concentración lmM = 616.8ug/ml en DMSO a -20°C) . Usar directamente en una concentración final de ????? en RPMI (luí en 10ml de medio) . · LPS ultrapure (Lipopolisacárido, Ref tlrl-eklps, Invivogen, concentración 5mg/ml) : solución de reserva de LPS: 3 g/ml en PBS a 4°C. Usar directamente para preparar una solución concentrada 4X de 40ng/ml en medio RPMI (min 1800 1 /placa; para 5 placa: 125 1 de LPS 3 g/ml + 9250 1 RPMI).

Placa de 96 pozos: Para cultivo de célula adherente (Ref 167008, Nunc) Para recolectar los sobrenadantes (Ref 82.1581, Sarstedt) Para ELISA (F96 ma-xisorp, Ref 442404, Nunc) Soluciones de recubrimiento: poli-D-lisina (Ref P9011, Sigma) : 25 g/ml final diluida en PBS lx • Kits y reactivo ELISA Solución amortiguadora ELISA de recubrimiento : NaCarbonato 0.1M pH 9.5 (= 7.13g de. NaHC03 (ref 71627, Fluka) + 1.59g de Na2C03 (ref 71345, Fluka) en 1 litro de H20, pH hasta 9.5 con NaOH concentrado) Solución amortiguadora ELISA de lavado: PBS IX + Tween20 al 0.01% (ref P1379, Sigma, lote 094K0052)(= preparar 1 litro de PBS IX y agregar lOOul de Tween20 lentamente mientras se mezcla con agitador magnético) Diluyente de ensayo: PBS IX + FBS al 10% (Ref A15-151, PAA, descomplementado a 56°C, 30 min) .

DAKO TMB (ref S1599, DAKO): solución de sustrato comercial _ Solución de paro: H3P04 1M (-> para 200ml = 177ml de H20 + 23ml de H3P04 85% (ref 345245, Aldrich) .

TNF- : Kit de conjunto TNF ELISA humano, BD OptEIA (ref 555212, DB) .

Medición de citotoxicidad : Reactivo CellTiter 96 (ref G3581, Promega) Compuesto de Control: SP600125 (ref ALX-270-339-M025 , Alexis, concentración: DMSO 20mM) Lectura de absorbancia: La absorbancia se leyó en el lector de Placa Fusión .Alpha (Perkin Elmer) .

Pipetas de repetición, pipetas digitales o pipetas de canales múltiples.

TopSeal-A: sellos de microplaca de 96 pozos (Ref 600585, PerkinElmer) . b. Método . · Recubrimiento de pozo Las placas se han recubierto con 200 1 de poli D-Lisina (lx) e incubaron 2 horas a 37°C, humedad relativa al 5% y 100% de C02.

Colocación en placa de la célula Después de 2 horas los pozos se lavaron dos veces con 200 1 PBS IX (usar inmediatamente o dejar con 200 1 de PBS IX a 37°C hasta el uso, pero no más de 3 días).

Las células se contaron. El número deseado de células se tomó y volvió a suspender en la cantidad de medios necesarios para obtener una dilución de 1' 000' 000 células/ml. ???? de PMA se agregó para inducir la diferenciación del THP1 de los monocitos de suspensión para macrófagos adherentes. Las células se colocaron en placa en los pozos en medio 100 1 en densidades colocadas en placa de 100' 000 células/pozo. Después de la inoculación, las placas se incubaron a 37 °C, C02 al 5% y humedad relativa al 100% 3 días para dejarlas diferenciadas, antes de la adición de fármacos experimentales.

Tratamiento celular Después de 3 días, las células adherentes se observaron con el microscopio. El medio que contiene PMA se aspire y reemplazó por 100 1 de medio RPMI fresco sin PMA (sin la etapa de lavado con PBS IX) .

Los fármacos experimentales se prepararon en la concentración de 10 mM en H20 o DMSO y almacenaron a -80°C. Antes de cada uso diario, una alícuota del inhibidor JNK se descongeló y diluyó para lograr una solución concentrada 4X (120M) en medio RPMI y luego a la concentración deseada en RPMI. El SP600125 se diluyó para lograr una solución concentrada 4X (40M) en medio RPMI y luego a la concentración deseada en RPMI que contiene DMSO al 0.8%.

Las placas se trataron con 501 de medio o una solución de 4X la concentración de fármaco deseada final (0, ?????, 1, 3, 10 o 30 M final para el compuesto JNK o en 0, 10, ?????, 1, 3 o 10M final para el control positivo SP600125) . Después de la adición del fármaco, las placas se incubaron durante lh adicional a 37 °C, C02 al 5% y humedad relativa al 100%.

Después de 1 hora, la secreción de TNF se indujo por la adición de 50 1 de una dilución concentrada 4X de LPS ultrapuro (3ng/ml final) .

Ensayo Después de 6 horas, 1001 del sobrenadante se transfirieron a placas de 96 pozos nuevas. Aquellas placas se sellaron y almacenaron a -20° hasta el análisis por ELISA (por ejemplo ver ejemplo 4) de la secreción de las citoquinas .

El efecto cito.tóxico de los compuestos se evaluó por absorbancia MTS (por ejemplo ver ejemplo 4) y las células se observaron usando un microscopio' invertido (Axiovert 40 CFL; Zeiss; 10X) Análisis de datos Los análisis de los datos se realizan como se indica en el ELISA (ver ejemplo 4). Brevemente, para ELISA: Promedio de las lecturas en triplicado para cada control estándar y cada muestra. Sustraer la densidad óptica estándar cero promedio (O.D) . Crear un trazador de curva estándar el log de la concentración de citoquina contra el log de la O.D y la mayor linea fija puede determinarse por análisis de regresión. Si las muestras se han diluido, la lectura de concentración de la curva estándar debe multiplicarse por el factor de dilución. Una curva estándar deberá generarse para cada conjunto de muestras colocadas en ensayo. Los datos atipicos se evitaron usando prueba de Grugg. Luego los datos que no estuvieron en el intervalo de dos veces el SD, se descartaron. Los experimentos independientes se toman en cuenta si el control positivo muestra datos como se observan previamente. Los experimentos independientes se agrupan (N > 3) .

Para la evaluación el efecto de citotoxicidad: en cada placa de cada experimento independiente tomado en cuenta para el análisis del experimento de liberación de citoquina, el promedio de la absorbancia del medio solo se consideró como el fondo y se sustrajo para cada valor de absorbancia. El promedio de triplicado de las células no tratadas de cada compuesto se considera como- la viabilidad al 100%. El promedio de triplicado de cada compuesto se normalizó por su 100%. Los datos atipicos se evitaron usando prueba de Grugg. Luego los datos que no estuvieron en el intervalo de dos veces el SD, se descartaron.- Los experimentos independientes se agrupan (N > 3) .

Todas las comparaciones estadísticas de las condiciones se realizaron por el software GraphPad Prism4 con la siguiente prueba: prueba ANOVA de una vía seguido por una prueba de comparación múltiple de Tukey. P<0.05 se consideró como importante.

Ejemplo 6: Inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 y liberación TNF en células sanguíneas enteras humanas o de rata primarias La sangre entera se recolecta de voluntarios saludables humanos o rata anestesiados usando una venopunción conectada a un tubo al vacío pre-etiquetado que contiene citrato de sodio. Los tubos se mezclan suavemente por inversión 7-8 veces; y luego se mantienen a TA hasta la estimulación. El inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172_ se prepara 6 veces concentrado en PBS, y 30 µ?/???? de la mezcla se agrega en placa de 96 pozos. La sangre entera se diluye por 1:2 en PBS y 120 µ? de sangre diluida se agrega en cada pozo donde cualquiera PBS solo o inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 se ha agregado previamente. La sangre entera se incuba a 37 °C; 85 rpm (incubadora Stuart Orbital SI500) durante 60 min. Los activadores (LPS) son ' los preparados, 30µ1/???? de LPS, 6 veces concentrado. Después de 60min de incubación, LPS se agrega a la sangre, la sangre se mezcla al pipetear hacia arriba y hacia abajo, y luego se mantiene durante 4h bajo agitación (85rpm), a 37°C. Después de las 4h de incubación, las placas se centrifugan en alrededor de 770g, 4°C durante 15 min en un centrifugo pre-enfriado . Los sobrenadantes se recolectan finalmente y mantienen a -20°C hasta la medición de citoquina. La citoquina (IL-6, IL-2, IFNy y TNF ) luego se midieron usando kits Elisa estándares (por ejemplo de sistemas R&D : DuoSet Elisas; o de BD Biosciences: BD Opteia Set Elisa). Los resultados se expresan como pg/ml de sobrenadante de la citoquina medida.

Un experimento similar se condujo con PMA+ionomicina en lugar de LPS como activador/estimulante.

Ejemplo 7: Vida media de los inhibidores JNK específicos descritos en la presente . Los inhibidores JNK · con la secuencia de la SEQ ID NOs : 196, 197, y 172 (concentración final O.lmM) se digirieron en suero humano (10 y 50% en PBS lx) . El experimento se realizó como se describe por Tugyi et al. (Proc Nati Acad Sci EUA, 2005, 413-418). El péptido intacto restante se cuantificó por UPLC-MS. La estabilidad se evaluó para las SEQ ID NOs : 196, 197, y 172 idénticamente pero en dos ensayos separados. Mientras que el inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 196 se degradó totalmente en los residuos de aminoácidos dentro de 6 horas, el inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 172 se degradó completamente únicamente después de 14 días. El inhibidor JNK con la SEQ ID NO: 197 todavía fue estable después de 30 días.

Ejemplo 8: Inhibición dependiente de dosis por el inhibidor JNK con secuencia de la SEQ ID NO: 172 de liberación IL-2 inducida por CD3/CD28 en células T primarias de rata Se sacrificaron animales de control, los ganglios linfáticos (LN) se cosecharon y mantuvieron en medio RPMI completo. Los LN se reventaron con RPMI completo en filtro 70µp? usando un pistón de 5ml . unas pocas gotas de medio se agregaron para mantener el filtro mojado. Las células se centrifugaron durante 7 min en 450g y 4°c. El peletizado se volvió a suspender en 5 mi de medio fresco. Las células se pasaron de nuevo a través .del filtro celular. Una alícuota de células se contó,, mientras que las células se centrifugaron de Nuevo lOmin en 1400 rpm y 4°c. Las células se volvieron a suspender en solución amortiguadora MACS (80µ1 de solución amortiguadora MACS por células 107) . ??µ? de micro perlas MHC anti-rata se agregaron por 10 millones de células, las células se incubaron durante 15min a 4°-8°c. Las células se lavaron con 15ml de solución amortiguadora MACS y centrifugaron durante 7 min en 700g y 4°C. El peletizado se volvió a suspender en 500µ1 de solución amortiguadora MACS por 108 células. Una columna LS se colocó en placa en el campo magnético del separador MACS por animal. La columna se enjuagó primero con 3 mi de solución amortiguadora MACS. Un tubo se colocó debajo de la columna en hielo para recolectar células = células T (selección negativa asi recolectamos lo que se eluye) . La suspensión celular se agregó y el eluido se recolectó en hielo. La columna se lavó 3 veces con solución amortiguadora MACS 3mL. Las células T eluidas fueron centrífugos durante 7 min en 700g y 4°C. Las células resuspendidas se contaron' y colocaron en placa en densidad do 200000células/pozo en ???µ? de medio completo. Las placas se recubrieron el día antes del experimento con 2pg/mL de anticuerpo CD3, y el día del experimento las placas se lavaron tres veces con PBS. Las células se trataron con ???µ? de (poli-) péptido inhibidor JNK (SEQ ID NO: 172), dos veces concentradas durante lh antes de la activación del ligando. Después de lh de pretratamiento con (poli- ) péptido inhibidor JNK (SEQ ID NO: 172), las células luego se estimularon con 2 g/mL de anticuerpo anti CD28 durante 24h. Después de 24h de estimulación, los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -20°C hasta el análisis. Las citoquinas luego se midieron usando kits ELISA estándar. Los resultados se expresan como pg/ml de sobrenadante de la citoquina medida.

En un experimento adicional, se usó esencialmente el mismo protocolo como se establece arriba, pero además para los (poli-) péptido inhibidores JNK con la SEQ ID NO: 172, inhibidores JNK con la secuencia de la SEQ ID NO: 197 y la molécula de fármaco SP600125 también se probaron de esta manera permitiendo comparar los efectos de estos inhibidores en la inhibición de liberación IL-2 inducida por CD3/CD28.

Ejemplo 9: Inhibidor JNK y liberación TNFa/IL-2 en sangre entera humana: La sangre entera de . voluntarios saludables humanos se recolectó usando una venopunción conectada a un tubo al vacío pre-etiquetado que contiene citrato de sodio. Los tubos se mezclan suavemente por inversión 7-8 veces; y luego se mantienen a TA hasta la estimulación. 350µ1 de RPMI + P/S se agregaron en 1.2 mi de placas de 96 pozos. 10 veces concentrados de la SEQ ID NO: 172 se prepare en RP I+P/S (50µ1 por pozo). 50µ1 se agregó en 1.2ral de placas de 96 pozos. 50µ1 de sangre entera luego se agregó en cada pozo donde cualquier medio solo o inhibidor JNK se ha agregado previamente. La sangre entera se incubó a 37°C, C02 al 5% durante 60 min. 50µ1 / pozo de ligandos diluido en RP I+ P/S se preparó, correspondiente a la dilución final 10 veces concentrado. Después de 60min de incubación,., el ligando se agregó; los pozos luego se mezclaron al pipetear hacia arriba y hacia abajo la sangre. La sangre entera se incubó durante 3 días a 37°C (los pozos se mezclan al pipetear cada pozo hacia arriba y hacia abajo una vez por día) . Al final de la incubación, las placas se mezclaron y luego centrifugaron en 2500rpm, 4°C durante 15 min en un centrifugo pre-enfriado . Las citoquinas luego se midieron usando kits Elisa estándares. Los resultados se expresan como pg/ml de sobrenadante de la citoquina medida.

Se llevó a cabo un experimento similar modificaciones ligeras. En el caso de estimulación CD3/CD8, el anticuerpo CD3 se recubrió en 2µg/mL en PBS durante la noche a 4°C. El día del experimento, los pozos se lavaron tres veces con PBS y se dejaron en PBS hasta el uso a 37 °C. El anticuerpo CD28 se agregó lh después de SEQ ID NO: 172 en concentración final de 2µg/mL; los sobrenadantes se recolectaron después de 3 días de estimulación.

Ejemplo 10: Potencia anti-inflamatoria en un modelo de rata de uveitis inducida por endotoxinas (EIU) La potencia anti-inflamatoria del inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 se probó en ratas albinas después de la administración intravenosa (modelo EIU/LPS) . El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de las inyecciones intravenosas sencillas de la SEQ ID NO: 172 (0.015, 0.18, y 1.80 mg/kg) en la respuesta inflamatoria en un modelo de rata albino con uveitis inducida por endotoxinas y para comparar estos afectos con aquellos obtenidos con el inhibidor JNK del arte previo de la SEQ ID NO: 197 (2 mg/kg) . Como un control adicional, sirve la dexametasona sódica de fosfato.

Sesenta (60) ratas Lewis macho se dividieron aleatoriamente en seis (6) grupos de diez (10) animales cada uno. EIU se indujo por . inyección en la almohadilla plantar de lipopolisacárido (LPS, 1 mg/kg). NaCl (0.9%), SEQ ID NO: 197 en 2 mg/kg y SEQ ID NO: 172 en tres concentraciones (1.80 mg/kg, 0.18 mg/kg y 0.015 mg/kg) se administraron por inyección intravenosa. Se administró dexametasona sódica de fosfato (20 g/ojo) por inyección sub-con untival en ambos ojos. 24 horas después de la inyección LPS, la respuesta inflamatoria se evaluó por registro clínico.

La intensidad de la inflamación ocular clínica se registró en una escala desde 0 hasta 4 para cada ojo: Grado 0 sin inflamación Grado 1 iris ligero y vasodilatación conjuntival Grado 2 iris moderado y vasodilatación conjuntival con resplandor Grado 3 iris intenso y vasodilatación conjuntival con resplandor Grado 4 reacción inflamatoria intensa (+1) formación de fibrina y reclusión de las pupilas Veinticuatro horas después de la inducción LPS, los registros clínicos para las ratas tratadas con vehículo fueron 3.6 ± 0.2 (media ± SEM, n = 20) con un medio de 4 (rango, 2-5). Una reducción importante (p < 0.001) en la severidad de la inflamación ocular se detectó 24 horas después de la inducción y tratamiento intravenoso con la SEQ ID NO: 197 (2 mg/kg) (registro medio: 2.2 ± 0.3, mediana: 2), correspondiente a una disminución al 40% de registros EIU comparados con el registro observado en el grupo de vehículo. El tratamiento intravenoso con la SEQ ID NO: 172, en aproximadamente la misma dosis (1.80 mg/kg) reduce también significativamente la severidad de la inflamación ocular por 42% (registro medio: 2,1 ± 0.3, mediana: 2, p = 0.001). Las dosis inferiores (0.18 y 0.015 mg/kg) reducidas por 33% (registro medio: 2.4 ± 0.3, mediana: 2) y 36% (registro medio: 2.3 ± 0.3, mediana: 2) la inflamación, respectivamente. La reducción fue importante con p < 0.001.

Un tratamiento sub-conj untival con dexametasona (20 yg/ojo), usado como fármaco de control positivo también reduce significativamente los registros clínicos al 79% (registro medio: 0.8 ± 0.2, mediana: 0.5, p < 0.001).

Bajo estas condiciones experimentales, puede establecerse que una inyección intravenosa sencilla de la SEQ ID NO: 197 en 2 mg/kg parcialmente previene la inflamación inducida por endotoxina observada en la cámara anterior. En comparación, SEQ ID NO: 172 intravenosamente inyectada en 0.015, 0.18, 1.80 mg/kg también reduce la inflamación inducida por endotoxina en la cámara anterior.

Ejemplo 11: Efectos de respuesta a la dosis después de administración intravenosa de inhibidor JNK después de 14 días en un modelo de rata de artritis de colágeno tipo II establecida crónica La artritis por colágeno de rata es un modelo experimental de poliartritis que se ha usado ampliamente para prueba preclínica de numerosos agentes anti-artríticos que están ya sea bajo investigación clínica o preclínica o se usan actualmente como terapéuticos en esta enfermedad. Las señas de identidad de este modelo son el inicio fiable y progreso de inflamación poliarticular fácilmente medible, robusta, destrucción del cartílago marcado en asociación con formación de queratitis vascular, y resorción del hueso media hasta moderada y proliferación del hueso periosteal.

La eficacia intravenosa (IV) del inhibidor JNK de la SEQ ID NO: 172 administrada diariamente (QD) durante 14 días (artritis dl-14) para inhibición de la inflamación (hinchazón de la pata) , destrucción del cartílago, y resorción ósea que ocurre en artritis de colágeno tipo II establecida en ratas se determine en el modelo experimental.

Los animales (8/grupo para artritis) se anestesiaron con Isoflurano e inyectaron con 300 ul de Adyuvante Incompleto de Freund (Difco, Detroit, MI) que contiene 2 mg/ml de colágeno tipo II de bovino (Elastin Products, Owensville, Missouri) en la base de la cola y 2 sitios en la espalada en los días 0 y 6. En el día 10 del estudio (artritis dO), el comienzo de la artritis ocurre y las ratas se eligieron al azar en grupos de tratamiento. La aleatorización en cada grupo se hizo después de que la hinchazón de la articulación del tobillo se estableció obviamente en al menos uno pata trasera.

Las ratas Lewis hembra con artritis por colágeno tipo II establecida se trataron diariamente (QD) sobre la artritis los dias 1-14 por la ruta intravenosa (IV) con vehículo (NaCl), SEQ ID NO: 112 (0.01, 0.1, 1, o 5 mg/kg) , o la dexametasona del compuesto de referencia (Dex, 0.05 mg/kg). Los animales se terminaron en artritis el día 1 . La evaluación de la eficacia fue con base en los pesos corporales animales, mediciones del calibrador del tobillo diariamente, diámetro del tobillo expresado como área bajo la curva, (AUC) , pesos de ¦ la pata trasera terminales, y evaluación histopatológica de los. tobillos y rodillas de los grupos seleccionados.

El registro de las rodillas y tobillos artríticos con Colágeno de las Articulaciones son registros dados de 0-5 para inflamación, formación de queratitis vascular y resorción ósea de acuerdo con el siguiente criterio: Inflamación del tobillo y/o rodilla 0 Normal 0.5 inflamación focal mínima 1 Infiltración mínima de células inflamatorias en el tejido sinovial/periarticular 2 infiltración media 3 infiltración moderada con edema moderado 4 infiltración marcada con edema marcado 5 infiltración severa con edema severo Queratitis vascular del tobillo 0 Normal 0.5 Infiltración mínima de queratitis vascular en el cartílago y hueso subcondral, afecta únicamente zonas marginales y afecta únicamente unas pocas articulaciones 1 Infiltración mínima de queratitis vascular en el cartílago y hueso subcondral, principalmente afecta zonas marginales 2 infiltración media (<l/4 de tibia o tarsos en zonas marginales) 3 infiltración moderada (1/4 hasta 1/3 de tibia o tarsos pequeños afectados en zonas marginales) 4 infiltración marcada (1/2 hasta 3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales) 5 infiltración severa (>3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales, distorsión severa de arquitectura general) Queratitis vascular de la rodilla 0 Normal ' 0.5 Infiltración mínima de queratitis vascular en el cartílago y hueso subcondral, afecta únicamente zonas marginales y afecta únicamente unas pocas articulaciones 1 Infiltración -mínima de queratitis vascular en el cartílago y hueso subcondral, aproximadamente 1-10% de la superficie del cartílago o hueso 'subcondral afectado 2 Infiltración media (extendida sobre hasta 1/4 de la superficie o área subcondral de tibia o fémur) , aproximadamente 11-25% de la superficie del cartílago o hueso subcondral afectado 3 Infiltración .moderada (extendida sobre >l/4 pero < 1/2 de superficie o área subcondral de tibia o fémur) aproximadamente 26-50% de la superficie del cartílago o hueso subcondral afectado . 4 Infiltración marcada (extendida sobre 1/2 hasta 3/4 de superficie tibial o femoral) aproximadamente 51-75% de la superficie del cartílago o- hueso subcondral afectado 5 Infiltración severa aproximadamente 76-100% de la superficie del cartílago o hueso subcondral afectado Daño al cartílago del tobillo (enfasisis en los tarsos pequeños ) 0 Normal 0.5 Disminución mínima en tinción azul T, afecta únicamente zonas marginales y afecta únicamente unas pocas articulaciones 1 Mínimo = pérdida' mínima hasta suave de tinción azul de toluidina sin pérdida de condrocito obvia o interrupción de colágeno 2 Media = pérdida media de tinción azul de toluidina con pérdida" de condrocito media focal (superficial) y/o interrupción de colágeno 3 Moderada = pérdida moderada de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocito moderada multifocal (zona profunda hasta media) y/o interrupción de colágeno, tarsos más pequeños afectados hasta 1/2 hasta 3/4 de profundidad con áreas raras de pérdida de' grosor completa 4 Marcada = pérdida marcada de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocito marcada multifocal (profundidad hasta zona profunda) y/o interrupción de colágeno, 1 o 2 superficies de tarso pequeñas tienen pérdida de grosor completa de cartílago 5 Severa = pérdida difusa severa de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocito severa multifocal (profundidad hasta la marca de la marea) y/o interrupción ^de colágeno que afecta más de 2 superficies del cartílago Daño del cartílago de la rodilla 0 Normal 0.5 Disminución mínima en tinción azul T, afecta únicamente zonas marginales 1 Mínima = pérdida mínima hasta suave de tinción azul de toluidina sin pérdida de condrocito obvia o interrupción de colágeno 2 Media = pérdida media de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocito media focal (superficial) y/o interrupción de colágeno, puede tener pocas áreas pequeñas de 50% de profundidad de cartílago afectado 3 Moderada = pérdida moderada de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocito multifocal para moderada difusa (profundidad hasta zona .media) y/o interrupción de colágeno, puede tener 1-2 áreas pequeñas de la pérdida del grosor completo que afecta menos de 1/4 del ancho total de una superficie y no más de 25% del ancho total de todas las superficies 4 Marcada = pérdida marcada de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocito multifocal hasta marcada difusa (profundidad hasta zona profunda) y/o interrupción de colágeno o 1 superficie con pérdida cerca y pérdida parcial en otras, pérdida general total menos de 50% de ancho de todas las superficies combinadas ¦ 5 Severa = pérdida difusa severa de tinción azul de toluidina con pérdida de condrocito severa multifocal (profundidad hasta la marca de la marea) y/o interrupción de colágeno en tanto fémures y/o tibias, pérdida general total mayor que 50% de ancho de todas las superficies combinadas Resorción del hueso del tobillo 0 Normal 0.5 Resorción mínima afecta' únicamente zonas marginales y afecta únicamente unas pocas articulaciones 1 Mínima = áreas pequeñas de resorción, sin ser aparente en la magnificación baja, osteoclastos raros 2 Media = más áreas numerosas de resorción, sin ser aparente en la magnificación baja, osteoclastos más numerosos, <l/4 de tibia o tarsos en zonas marginales reabsorbidas 3 Moderada = resorción obvia del hueso cortical y trabecular medular sin defectos del grosor complete en la corteza, pérdida de algunas trabéculas medulares, lesión aparente en la magnificación baja, osteoclastos más numerosos, 1/4 hasta 1/3 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales 4 Marcada = defectos del grosor completes en el hueso cortical, a menudo con .distorsión del perfil de la superficie cortical restante, . pérdida marcada del hueso medular, numerosos osteoclastos, 1/2 hasta 3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales 5 Severa = defectos del grosor completos el hueso cortical, a menos con distorsión del perfil de superficie cortical restante, pérdida marcada del hueso medular, numerosos osteoclastos , >3/4 de tibia o tarsos afectados en zonas marginales, distorsión severa de arquitectura general Resorción del hueso de la rodilla 0 Normal 0.5 Resorción mínima afecta únicamente zonas marginales 1 Mínima = áreas pequeñas de resorción, sin ser aparentes en la magnificación baja, aproximadamente 1-10% de ancho de la articulación total del hueso subcondral afectado 2 Media = más numerosas áreas de resorción, pérdida definida de hueso subcondral, aproximadamente 11-25% de ancho de la articulación total de hueso subcondral afectado 3 Moderado = resorción obvia de hueso subcondral aproximadamente 26-50% del ancho de la articulación total del hueso subcondral afectado 4 Marcado = resorción obvia del hueso subcondral aproximadamente 51-75% de ancho de la articulación total del hueso subcondral afectado 5 Severa = distorsión de la articulación completa debido a la destrucción aproximadamente 76-100% de ancho do la articulación total del hueso subcondral afectada Resultados : Severidad de la enfermedad en el grupo de control de la enfermedad incrementada de los días 1 hasta 5 con el día 4-5 que tiene el incremento diario mayor. Luego los incrementos increméntales fueron más pequeños al pico en el día 7. De tal punto en adelante, la hinchazón aguda generalmente disminuye y las mediciones del calibrador se disminuyeron. Los grupos de tratamiento siguiendo este patrón general también.

Se observó pérdidá de peso corporal en todos los grupos de enfermedad mientras que el grupo de control normal tiene un incremento en peso. La pérdida de peso corporal fue significativamente (25%, p < 0.05 por A OVA) inhibido para ratas tratadas con 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 como se compara con los controles de la enfermedad tratados con el vehículo. Cuando se compara con los controles de la enfermedad usando una prueba t de Student, la inhibición de la pérdida de peso corporal también fue importante para ratas tratadas con 1 mg/kg SEQ ID NO: 172 (21%, p < 0.05) o Dex (21%, p < 0.05). Los resultados del tratamiento con la SEQ ID NO: 172 fueron en respuesta a la dosis para este parámetro.

Las mediciones del diámetro del tobillo diarias fueron significativamente (p < 0.05 por RM ANOVA de 2 vías) reducidas hacia normales para ratas tratadas con 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (p < 0.05 días 4-12) o Dex (p < 0.05 d3-14) como se compara con controles de la enfermedad.

La AUC de diámetro del tobillo fue significativamente (p < 0.05 por ANOVA) reducido hacia normales para ratas tratados con 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (43% de reducción), 1 mg/kg SEQ ID NO: 172 (27%), o Dex (97%) como se compara con los controles de la enfermedad. Los resultados del tratamiento con la SEQ ID NO: 172 fueron en respuesta a la dosis para este parámetro.

Los pesos de la pata finales fueron significativamente (p < 0.05 por ANOVA) reducidos hacia normales para ratas tratados con 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (26% de reducción) o Dex (114%) como se compara con los controles de la enfermedad. Los resultados del tratamiento con la SEQ ID NO: 172 fueron en respuesta a la dosis para este parámetro.

Los pesos del hígado relativos no fueron significativamente (por ANOVA) afectados para ratas en cualquier grupo de tratamiento como se compara con los controles de la enfermedad.

Los pesos del bazo relativos al cuerpo corporal fueron significativamente (p < 0.05 por ANOVA) reducidos para ratas tratados con Dex como se compara con los controles de la enfermedad. Los pesos del bazo relativos para ratas tratadas con DEx también se redujeron significativamente como se compara con los controles normales. Los pesos del bazo relativos no fueron afectados significativamente para ratas tratadas con la SEQ ID NO: 17-2.

Los pesos del timo relativos con el peso corporal fueron significativamente (p < 0.05 por A OVA) reducidos para ratas tratadas con Dex como se compara con los controles de la enfermedad. Los pesos del timo relativos para ratas tratadas con Dex también fueron significativamente reducidos como se compara con los controles normales. Los pesos del timo relativos no fueron significativamente afectados para ratas tratadas con la SEQ ID NO: 172.

Todos los parámetros de histopatologia del tobillo fueron significativamente (por prueba Mann-Whitney U) reducidos hacia normales para ratas tratadas con 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (25% de reducción de registros sumados) como se compara con los controles de la enfermedad.

Todos los parámetros de histopatologia de la rodilla fueron significativamente (por prueba Mann-Whitney U) reducidos hacia normales para ratas tratadas con 5 mg/kg SEQ ID NO: 172 (73% de · reducción de registros sumados) como se compara con los controles de la enfermedad.

Los resultados de este estudio indican que el tratamiento intravenoso diario con la SEQ ID NO: 172 (5 mg/kg) tiene efecto benéfico importante en los parámetros de histopatologia y clínicos, asociados con artritis por colágeno tipo II establecida en ratas. El tratamiento con la SEQ ID NO: 172 (1 mg/kg) resulta en AUC con diámetro del tobillo significativamente reducido. El efecto benéfico en el diámetro del tobillo se observe hasta el día 12 a pesar de la reducción de la hinchazón después del día 7 en animales de control enfermos. Los resultados del tratamiento con la SEQ ID NO: 172 fueron en respuesta a la dosis.

El tratamiento con la SEQ ID NO: 172 no tiene efecto adverso en los pesos del órgano a diferencia de la dexametasona.

Ejemplo 12: Efecto del JNK D-retro-inverso completo-inhibidor (poli-) péptido de la SEQ ID NO: 197 y el inhibidor JNK (poli-) péptido de la SEQ ID NO: 172 en tres dosis en un modelo inducido por escopolamina de ojo seco en ratones Concepto del estudio El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos de dos diferentes compuestos, el JNK D-retro-inverso completo-inhibidor (poli-) péptido de la SEQ ID NO: 197 y el inhibidor JNK (poli-) péptido de la SEQ ID NO: 172, en tres niveles de dosis en un modelo de ratón de ojo seco inducido por escopolamina .

Los péptidos de la SEQ ID NO: 197 y SEQ ID NO: 172 se probaron para eficacia en este modelo de murino de ojo seco. Los péptidos ambos se probaron en una dosis baja, media y una alta. Para el péptido de la SEQ ID NO: 197 las concentraciones medidas en las muestras de formulación para los niveles de dosis baja, media y alta fueron 0.06% (p/v) , 0.25% (p/v) y 0.6% (p/v), respectivamente, y para SEQ ID NO: 172 las concentraciones medidas en las muestras de la formulación para los niveles de dosis baja, media y alta, fueron 0.05% (p/v), ,0.2% (p/v) y 0.6% (p/v), respectivamente. El vehículo, que también sirve como e-.l control negativo, fue cloruro de sodio al 0.9% para inyección USP.

El estudio consiste de un total de 9 grupos de ratones C57BL/6 hembra, que comprenden 8 grupos de 12 ratones cada uno y un grupo adicional de. 4 ratones. El ojo seco de termino corto bilateral se indujo por una combinación de bromhidruro de escopolamina ( Sigma-Aldrich Corp., St . Louis, O) inyección (subcutánea (SC) , cuatro veces al día, 0.5 mg/dosis, días 0-21) y al exponer a ratones al ambiente de secado de corriente.de aire constantes. Partiendo en el día 1, los ratones de Grupos 1-8 se trataron tres veces diariamente (TID) durante 21 días con administración ocular tópica bilateral (óculo uterque; OU) (5 L/ojo/dosis ) de vehículo (solución salina estéril al 0.9%; artículo de control negativo); el péptido. de la SEQ ID NO: 197 (0.06%, 0.25% y 0.6%), el péptido de la SEQ ID NO: 172 (0.05%, 0.2% y 0.6%); o ciclosporina (0.05%; control positivo, un fármaco inmunosupresor usado para reducir la actividad del sistema inmunitario) . Los ratones del Grupo 9 se mantuvieron como controles, no tratados (sin ojo seco), no inducidos.

Durante el periodo en vida (tratamiento), las observaciones clinicas.se registraron una vez al día; examen con lámpara de hendidura (SLE) con tinción de fluoresceina corneal, Prueba de tiempo de ruptura lagrimal (TBUT) , y prueba de hijo rojo de fenol (PRTT) se realizaron tres veces por semana. Las necropsias se realizaron en el día 22; ojos, párpados, conjuntivas, y glándulas lagrimales se recolectaron de ambos ojos de cada animal. Los tejidos de los ojos derechos (óculo dexter, OD)' se fijaron y luego evaluaron microscópicamente. Los tejidos de los ojos izquierdos (óculo siniestro; OS) se congelaron por destello en nitrógeno liquido y almacenaron congelados a -80°C para análisis posterior posible.

Tabla 5: Diseño Experimental * Ciclosporina Métodos 1. Preparación de dosis El (poli-) péptido de la SEQ ID NO: 197 se obtuvo de Polypeptide Laboratories (Francia) como un vial de microfuga de plástico transparente de 1.5 mL que contiene 300.65 mg de polvo seco.

El (poli-) péptido de la SEQ ID NO: 172 se obtuvo de Polypeptide Laboratories (Francia) como un vial de microfuga de plástico transparente de 1.5 mL que contiene 302.7 mg de polvo seco.

Antes del inicio del estudio, los (poli- ) péptidos de la SEQ ID NO: 172 y de SEQ ID NO: 197 se formularon en solución salina estéril (vehículo) . Las soluciones de dosificación en cada concentración se esterilizaron usando filtros de 0.2-µ??, alícuotas para viales pre-etiquetados múltiples, y congelaron a -20 °C. Las concentraciones, medidas en las muestras de formulación para el péptido de la SEQ ID NO: 197 fueron 0.058%, 0.25% y 0.624%, redondeados hasta 0.06%, 0.25% y 0.6%. Las concentraciones medidas en las muestras de formulación para el péptido de la SEQ ID NO: 172 donde 0.053%, 0.217% y 0.562%, redondeados hasta 0.05, 0.2% y 0.6%.

En cada día de dosificación, un conjunto de soluciones de dosificación se descongeló y usó para tales administraciones de dosis al día. Los controles (vehículo, ciclosporina) se proporcionaron ya para la dosis; no fue la preparación de la dosis, 2. Exámenes con lámpara de hendidura (SLE) Antes de la entrada en el estudio, cada animal se sometió a SLE y examen oftálmico indirecto usando fluoresceina aplicada tópicamente. Los hallazgos oculares se registraron usando el registro ocular de escala Draize. Los registros SLE y Draize se repitieron tres veces una semana durante el periodo en vida. 3. Prueba de tiempo de ruptura lagrimal (TBUT) y evaluación corneal posterior La prueba TBUT se condujo .tres veces semanalmente al medir el tiempo transcurrido en segundos entre un parpadeo complete después de la aplicación de fluoresceina a la córnea y la aparición del primer punto seco aleatorio en la película de la lágrima. Para realizar el TBUT, la fluoresceina de sodio líquida al 0.1% se dejó caer en el saco conjuntival, los párpados se cerraron manualmente tres veces y luego se mantuvieron abiertos revelando una película de lágrima que contiene fluoresceina continua que cubre la córnea, y se registró el tiempo (en segundos) requerido para la película para la rotura (aparición de un- mancha o punto seco) . Al menos noventa segundos después, el daño epitelial corneal se graduó usando una lámpara de hendidura con un filtro azul cobalto después de otra gota de fluoresceina al 0.1% se volvió a aplicar a la córnea; la córnea luego se registró por la escala ocular D aize. 4. Prueba de lágrima de hilo rojo de fenol (PRTT) La producción de lágrimas se midió tres veces a la semana en ambos ojos usando tiras de prueba PRTT (Zone-Quick; Menicon, Nagoya, Japón) . Antes- del primer tratamiento del día, un hilo se aplicó al canto lateral del fondo del saco conjuntival de cada ojo durante 30 segundos bajo biomicroscopía de lámpara de hendidura. La migración de la lágrima hacia el rodamiento (esto es, la longitud del hilo de algodón húmedo) se midió usando una escala de milímetro. 5. Necropsia y patología En la necropsia en el día 22, ambos ojos de cada animal, incluyendo los globos, glándulas lagrimales, párpados, y conjuntivas, se escindieron. El ojo derecho y tejidos asociados se fijaron por sumersión durante la noche en solución de Davidson modificada seguido por transferencia hasta formalina amortiguada neutral al 10% (NBF) . Los tejidos fijos del ojo derecho se deshidrataron, incrustaron en parafina, seccionaron en 3 hasta 5 µta. de grosor, y tejidos montados de deslizamiento se tiñeron con hematoxilina y eosina (H y E) . Los deslizamientos teñidos se evaluaron por medio de microscopía de luz. La evaluación histopatológica complete y detallada se condujo en todas las partes del ojo, con al menos dos niveles de sección siendo examinadas histopatológicamente para cada ojo derecho. La atención especial se pagó a la córnea, epitelios (incluyendo células caliciformes) de la conjuntiva y córnea, así como la glándula lagrimal. Estos tejidos se registraron para lesión con base en una escala 0-4, con 0 siendo normal, 1 siendo mínima, 2 siendo media, 3 siendo moderada, y 4 siendo severa. Para cada córnea, los registros fueron con base el grosor del epitelio corneal, e inflamación corneal. Las conjuntivas se registraron para erosión e inflamación asi como presencia o ausencia de células caliciformes.

RESULTADOS Cuatro veces al dia la administración SC de escopolamina ( 0.5mg/dosis ) induce un síndrome del ojo seco en ratones C57BL/6 hembra caracterizados por una disminución en el volumen de producción de lágrima acusa y cambios en las propiedades fisicoquímicas de las lágrimas que las hace menos capaces de mantener una película de lágrima estable capaz de lubricar efectivamente y proteger el ojo. 1. Prueba de tiempo de ruptura lagrimal (TBUT) y examen corneal Las pruebas de tiempo de ruptura lagrimal (TBÜTs) se realizaron antes de la inducción del ojo seco, y de nuevo en los días 2, 4, 7, 9, 11, 14, .16, 18 y 21 después de inducción del ojo seco. Después del inicio de la dosificación con escopolamina (inducción del ojo seco) los valores medios TBUT comienzan a disminuir en todos los animales, pero aparecen para disminuir más lentamente en el Grupo 6 (dosis media de la SEQ ID NO: 172) . El nadir medio TBUT para los Grupos 5, 6, 7 (dosis baja, media y alta del péptido de la SEQ ID NO: 172), y Grupo 8 (ciclosporina) ocurre en el dia 7, logrando valores similares (6.6 ± 0.4, 6.7 ± 0.4, 6.7 + 0.3, y 6.4 ± 0.4 s, respectivamente). Posteriormente, los medios TBUT de estos grupos incrementan a un pico en el dia 9. Los grupos 6 y 7 (SEQ ID NO: 172 grupos de dosis medios y altos) medios TBUT aumentan a valores superiores (10.0 ± 0.7 s y 9.9 ± 0.8 s, respectivamente) que el Grupo 8, el grupo de ciclosporina (8.5 ± 0.3 s), mientras que el medio TBUT pico del Grupo 5, la dosis baja de la SEQ ID NO: 172 (8.0 ± 0.4 s) estuvo ligeramente debajo de aquel del Grupo 8 (ciclosporina). Los medios TBUT para ña dosis media y alta de animales tratados con SEQ ID NO: 197, Grupos 3 y 4, continúan para disminuirse después del comienzo de la dosificación, alcanzando un nadir en el dia 9, mientras que el Grupo 2 de dosis baja incrementa en el dia 9. Los medios TBUT de dosis baja, media y alta de animales tratados con' SEQ ID NO: 172 (Grupos 2, 3 y 4, respectivamente) estuvieron arriba del grupo de vehículo y generalmente debajo del medio del grupo de dosis baja, media y alta de animales, tratados con SEQ ID NO: 172.

Cuando el área bajo la curva (AUC) para valores TBUT del día 7 hasta el día 21 se usó para comparar los varios tratamientos con el control de vehículo, el tratamiento con dosis media, baja y alta del péptido de la SEQ ID NO: 172 (0.05%, 0.2% y 0.6%, respectivamente), los Grupos 5, 6, y 7, asi como los animales tratados con ciclosporina (0.05%), Grupo 8, muestran incrementos importantes en el TBUT AUC (Kruskal-Wallis ANOVA no paramétrico) . El péptido de la SEQ ID NO: 172 aparece para producir un incremento dependiente de dosis en TBUT, con las dosis medias y altas a menudo producen efectos similares. Adicionalmente, no existieron diferencias importantes en TBUT AUC entre el grupo tratado con ciclosporina, los grupos tratados con tres niveles de dosis de la SEQ ID NO: 172 y el grupo no inducido (Grupos 5, 6, 7, 8, y 9). Este hallazgo sugiere que las tres dosis del péptido de la SEQ ID NO: 172 y ciclosporina fueron aproximadamente de igual manera efectivas al mejorar o revertir los cambios oftalmológicos que subyacen de los cambios TBUT en este modelo de ojo seco.

Los grupos tratados con niveles de dosis bajos, medios y altos del péptido de la SEQ ID NO: 197 (Grupos 2-4) muestran ligeramente de forma general incrementos dependientes de dosis en TBUT que inicia para incrementar aproximadamente dos días más tarde que los animales tratados con la SEQ ID NO: 172 o ciclosporina.

Tabla 6: Valores TBUT fíUC calculados medios: 2. Prueba de lágrima de hilo rojo de fenol (PRTT) Las pruebas PRTT se realizaron antes de la inducción del ojo seco, y de Nuevo en los dias 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18 y 21. Los valores PRTT del dia 0 hasta el día 4 disminuyen en todos los ratones que tienen ojo seco inducido, indicando una disminución en la producción de lágrima después de la administración de escopolamina y exposición para un ambiente de secado de corriente de aire incrementada creada por los sopladores. El nadir en . PRTT en la mayoría de los grupos ocurren en aproximadamente el dia 7. PRT mantiene la disminución en el grupo de control vehículo (Grupo 1) alcanzando un nadir en el día 14. Después del nadir, hubo un incremento en los grupos del ojo seco. Estos hallazgos indican que el inicio del tratamiento escopolamina un día antes del inicio del tratamiento del compuesto fue suficiente para iniciar los cambios fisiológicos en el ojo asociado con el síndrome del ojo seco. Aún el grupo tratado con ciclosporina muestra una disminución en PRTT similar a otros grupos a través de aproximadamente el día 7, luego incrementa hasta un pico en los días 11-14, seguido por una disminución ligera. En la última prueba PRTT (día 21) ciclosporina (Grupo 8), y Grupos 6 y 7 todos tienen valores PRTT similares sugiriendo que tanto la dosis media como alta del péptido de los tratamientos SEQ ID NO: 172 tienen efectos terapéuticos similares a ciclosporina al incrementar la producción de lágrima acuosa en este modelo de ojo seco de murino.

Los animales tratados con la dosis baja, medía o alta del péptido de la SEQ ID NO: 172 producen significativamente lágrimas más acuosas comparadas con animales tratados con vehículo. De esta manera, similar a TBUT, el péptido de la SEQ ID NO: 172 produce generalmente incrementos importantes relacionadas con dosis en la producción de lágrimas acuosas en este modelo.

Los grupos tratados con niveles de dosis bajas, medias y altas del péptido de la SEQ ID NO: 197 (0.06%, 0.25% y 0.6%, Grupos 2, 3 y 4, respectivamente) muestran incrementos dependientes de la dosis generalmente en PRTT.

Tabla 7: Valores PRTT AUC medios 3. Histopatologia En este estudio los cambios histológicos generalmente se confirmaron para la córnea. Los hallazgos en la córnea consisten de queratinización incrementada de la superficie epitelial corneal, grosor incrementado del epitelio corneal, celularidad incrementada del epitelio corneal, incidencia incrementada levemente de mitosis de la capa epitelial basal consistente con el volumen celular epitelial incrementado. Estos hallazgos son indicativos de una respuesta adaptiva fisiológica para el secado corneal e irritación de la superficie corneal. La ulceración de la superficie, edema estromal corneal e infiltrado inflamatoria en la córnea no se observaron en este estudio. Los ojos en el Grupo 9, el grupo no tratado (ratones normales, sin tratamiento de escopolamina) , estuvieron dentro de los limites normales. Hubo alguna inflamación no supurativa mínima de los párpados disperses o todos los grupos, pero la conjuntiva, retina, glándulas lagrimales y .otras partes del ojo estuvieron dentro de los límites normales. Las células calciformes aparecen para estar dentro de los límites en todos los grupos. Las células calciformas son un productor primario de mucina que ayuda a que las lágrimas formen una película más adhesiva más fuerte .

Los cambios corneales medios hasta moderados se señalaron en todos los grupos excepto el grupo del ojo normal no tratado (Grupo 9) y fueron ligeramente más severas en el Grupo 1, el grupo tratado con vehículo y el Grupo 2, la dosis baja del péptido de la .SEQ ID NO: 197, en comparación con los otros grupos de tratamiento. Estos hallazgos fueron consistentes con los efectos benéficos positivos de producción de lágrima incrementada en la córnea.

Cuando los registros histológicos de los varios grupos de tratamiento se compararon con los registros histológicos en el grupo de grupo ciclosporina para determinar si cualquiera de otros tratamientos producidos "reducciones de registro similares" para ciclosporina, Grupos 4, 6, y 7 se encontraron para no ser significativamente diferentes que los registros del grupo de ciclosporina. De esta manera, estos tres tratamientos, dosis media y alta del péptido de la SEQ ID NO: 172 y la dosis alta del péptido de la SEQ ID NO: 197, donde la más efectiva, después de ciclosporina , al reducir/ aliviar los cambios corneales asociados con este modelo de ojo seco de murino.

Claims (66)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito' la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor JNK, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: a) un inhibidor JNK, que comprende una secuencia de (poli-) péptido inhibidora. de acuerdo con la siguiente fórmula general : X1-X2-X3-R-X4-X5-X6-L-X7-L-X8 (SEQ ID NO: 1), en donde XI es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, Q y r, en donde X2 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos R, P, G y r, en donde X3 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos K, R, k y r, en donde X4 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos P y K, en donde X5 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, a, s, q,' k o está ausente, en donde X6 es un aminoácido seleccionado de los aminoácidos T, D y A, en donde X7 es · un aminoácido seleccionado de los aminoácidos N, n, r y K; y en donde X8 es un aminoácido seleccionado de F, f y w, y en donde un residuo de aminoácido dado en letras mayúsculas indica un aminoácido L, mientras que un residuo de aminoácido dado en letras minúsculas indica un residuo de aminoácido D, con la condición de que al menos uno de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de XI, X2, X3, X5, X7 y X8 son los aminoácidos D, y b) un inhibidor- JNK que comprende una secuencia de (poli- ) péptido inhibidora que comparte al menos al menos 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 como se define en a) , con la condición de que con respecto a SEQ ID NO: 1 tal secuencia de (poli- ) péptido inhibidora que comparte la identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 mantiene el residuo de L-arginina (R) de la SEQ ID NO: 1 en la posición 4 y los dos residuos de L-leucina (-L) de la SEQ ID NO: 1 en las posiciones 8 y 10 y que. al menos uno de los aminoácidos restantes en la secuencia que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 es un aminoácido D, para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal para terapia.

2. El inhibidor JNK para uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque al menos uno de los aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de X3, X5, X7 y X8 son los aminoácidos D.

3. El inhibidor JNK para uso de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inhibidor JNK comprende una secuencia de (poli-) péptido inhibidora que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de cualquiera de una de las SEQ ID NOs: 2-27.

4. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora se selecciona de cualquiera de una de las SEQ ID NOs: 2-27.

5. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el inhibidor JNK comprende SEQ ID NO: 8 o una secuencia de (poli-) péptido inhibidora que comparte al menos 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8.

6. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el inhibidor JNK comprende una secuencia transportadora.

7. El inhibidor JNK para uso de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la secuencia de (poli-)péptido inhibidora y la secuencia transportadora se traslapan.

8. El inhibidor JNK para uso de conformidad con la reivindicación o l, caracterizado porque la secuencia transportadora comprende una secuencia para alterar aminoácidos D y L de acuerdo con cualquiera de una de las SEQ ID NOs: 28-30.

9. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 6-8, caracterizado porque la secuencia transportadora se selecciona de cualquiera de una de las SEQ ID NOs: 31-170.

10. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 6-9, caracterizado porque la secuencia transportadora se selecciona de cualquiera de una de las SEQ ID NOs: 31-34, 46, 47 y 52-151.

11. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 6-10, caracterizado porque la secuencia transportadora está posiciona directamente en la terminal N o directamente en la terminal C de la secuencia de (poli- ) péptido inhibidora.

12. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 6-11, caracterizado porque el inhibidor JNK comprende a) una secuencia de acuerdo con cualquiera de una de las SEQ ID NOs: 171-190, o b) una secuencia que comparte al menos 50% de identidad de secuencia con al menos una de las SEQ ID NOs: 171-190, con la condición de .que la secuencia que comparte la identidad de secuencia con cualquiera de una de las SEQ ID NOs: 171-190: i) mantener el residuo L-arginina (R) en la posición 4 en su tramo de secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, ii) mantener las dos L-leucina (L) en su tramo de secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, y iii) exhibir al menos uno aminoácido D en las posiciones XI, X2, X3, X5, X7 o X8 en su tramo de secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1.

13. El inhibidor JNK . para uso de conformidad con cualquiera de una de. las reivindicaciones 6-12, caracterizado porque el inhibidor JNK comprende a) la secuencia de lá SEQ ID NO: 172 o b) una secuencia que comparte 50% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 172, con la condición de que la secuencia comparta 50% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 172 i) mantener el residuo de L-arginina (R) en la posición 4 en su tramo de secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, ii) mantener las' dos L-leucinas (L) en su tramo de secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1, y iii) exhibir al menos uno aminoácido D en las posiciones XI, X2 , X3, X5, X7 o X8 en su tramo de secuencia correspondiente a la SEQ ID NO: 1.

14. Un inhibidor JNK caracterizado porque comprende: a) un (poli-) péptido inhibidor que comprende una secuencia seleccionada del grupo de secuencias que consiste de RPTTLNLF (SEQ ID NO: . 191) , KRPTTLNLF (SEQ ID NO: 192), RRPTTLNLF y/o RPKRPTTLNLF (SEQ ID NO: 193), y b) una secuencia transportadora seleccionada de las SEQ ID NOs: 31-34 y 46-151, para uso en un método para tratamiento del cuerpo humano o animal para terapia.

15. Un inhibidor JNK caracterizado porque comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 194 o 195 para uso en un método para tratamiento del cuerpo humano o animal para terapia.

16. Un inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 61, caracterizado porque el método es para tratamiento del cuerpo humano por terapia.

17. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 61, caracterizado porque ' el inhibidor JNK se administra intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intradérmicamente, . transdérmicamente, entéricamente, oralmente, rectalmente, tópicamente, nasalmente, localmente, intranasalmente, epidérmicamente, por suministro con parche, por instilación, intravitra, subconj untivalmente y/o intratimpánicamente .

18. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el . método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de enfermedades inflamatorias, enfermedades de los ojos, enfermedades de los huesos, enfermedades neurales, enfermedades neuronales, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades de la piel, enfermedades inmunitarias y/o autoinmunitarias , enfermedades de los ojos, enfermedades de la boca, enfermedades metabólicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades proliferativas, enfermedades del oído, enfermedades del intestino, y/o enfermedades del sistema respiratorio.

19. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de enfermedades inflamatorias, inflamación aguda, inflamación crónica, inflamación en el ojo, inflamación en la boca, inflamación del sistema respiratorio, .inflamación del pulmón, inflamación de la piel, inflamación dentro del sistema cardiovascular, inflamación del cerebro, inflamación del oido, mucositis, estomatitis, peri-implantitis , retinitis, corioiditis, queratoconj untivit.is seca, enfermedades inflamatorias del intestino (IBD), uveitis, uveitis anterior, uveitis intermedia, uveitis posterior, periodontitis, COPD, asma, pulpitis, artritis reumatoide, osteoartritis , enfermedad de Crohn, artritis psoriática, vasculitis, cistitis intersticial; inflamación aguda en un sitio de infección o herida, meningitis, encefalitis, neumonía, faringitis, tonsilitis, otitis, otitis media, vasculitis, sinovitis, enteritis, enfermedad de Crohn, ulcerativa colitis y rechazo de injerto.

20. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de enfermedades del oído, enfermedades del oído interno, pérdida de la audición, pérdida de la audición aguda, estereocilios de las células vellosas dañadas, apoptosis de célula de pelo, trauma del ruido, otitis y otitis media.

21. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de trastornos metabólicos, diabetes, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, enfermedad de Fabry, enfermedad de Gaucher, hipotermia, hipertermia, hipoxia, histiocitosis de lipido, lipidosis, leucodistrofia metacromática, mucopolisacaridosis, enfermedad de Niemann Pick, obesidad, y enfermedad de Wolman.

22. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos . seleccionados de enfermedad de Alexander, enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , apoplejía, Ataxia Telangiectasia, corte o de otra manera axones interrumpidos, axotomia, lesiones cerebrales, CMT (Charcot-Marie-Tooth) , degradación corticobasal, demencia, enfermedades o trastornos del sistema nervioso, distonia, epilepsia, enfermedad de Farber, ataxia de Friedreich (SCA) , gangliosidosis, síndrome de Guillain-Barré, paraplejia espástica hereditaria, enfermedad de Hirschsprung, demencia por virus de inmunodeficiencia humana, enfermedad de Huntington, infarto del cerebro, apoplejía isquémica, enfermedad de Krabbe, síndrome de Lennox Gastaut, lisencefalia, esclerosis múltiple, síndromes mielodisplásticos , . mielopatía, enfermedades neurodegenerativas relacionadas con SIDA, neurofibromatosis tipo 2 (NF-2), neurolatierisma, apoptosis neuronal, muerte neuronal, dolor neuropático, neuropatía, neuropatía inducida por quimioterapia, neuropatía inducida por diabetes, neurotoxicidad inducida por NMDÁ, dolor, mal de Parkinson, parkinsonismo, enfermedad de Pick, polineuropatía, parálisis supranuclear progresiva, enfermedad de Sandhoff, espina bifida, apoplejía, Tay Sachs, TBI (lesión axonal difusa), tratamiento de neurona oscura inducida por ejemplo por un dolor inflamatorio, síndrome de West y atrofia muscular espinal .

23. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una ¦ de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de enfermedades autoinmunitarias del SNC, auto-enfermedades inflamatorias, enfermedad celíaca; síndrome de Sjogren y lupus eritematoso sistémico .

24. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de artritis, hernia de disco, fibrodisplasia osificante progresiva (FOP) , osteoartritis , osteopetrosis, osteoporosis, osteoporosis inducida por diabetes, enfermedad de Paget y artritis reumatoide .

25. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos- seleccionados de psoriasis y lupus eritematoso.

26. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de degeneración macula relacionada con la edad (AMD); estrias angioides; neuropatía óptica isquémica anterior; uveitis anterior; catarata, en particular catarata relacionada con la edad; coriorretinopatía exudativa central; coriorretinopatía seria central; chalazión; coroideremia; corioiditis; esclerosis coroidal; conjuntivitis; ciclifis; retinopatía diabética; síndrome del ojo seco; endoftalmitis ; epiescleritis ; infección en los ojos; albipunctatus fundus; atrofia girada de la coroides y retina; orzuelo; enfermedades inflamatorias del blefara; enfermedades inflamatorias de la coroides; enfermedades inflamatorias del cuerpo ciliar; enfermedades inflamatorias de la conjuntiva; enfermedades inflamatorias de la córnea; enfermedades inflamatorias del iris; enfermedades inflamatorias de la glándula lagrimal; enfermedades inflamatorias del hueso orbital; enfermedades inflamatorias de la esclerótica; enfermedades inflamatorias del cuerpo vitreo; enfermedades inflamatorias de la úvea; enfermedades inflamatorias de la retina; uveitis intermedia; irititis; queratitis; síndrome de Leber; coroiditis multifocal; miositis del músculo ocular; maculopatía neovascular (por ejemplo causada por la miopía alta, síndrome de disco inclinado, osteoma coroideo o similares) ; retinotoxicidad inducida por NMDA; enfermedades inflamatorias del ojo crónicas o no crónicas; enfermedad de Oguchi; enfermedad del nervio óptico; flemón orbitario; panoftalmitis ; panuveitis; opacificación de cápsula posterior; opacificación de la cápsula posterior (PCO) (una complicación después de la cirugía de cataratas);' uveitis posterior; vitreoretinopatia proliferativa; oclusión arterial retinal; desprendimiento retinal, enfermedades retínales; lesiones retínales; macroaneurisma retina; desprendimiento del epitelio pigmentario retinal; oclusión venosa de la retina; retinitis; retinitis pigmentosa;. retinitis albescens punctata; retinopatía, en particular, retinopatía de la retinopatía diabética y premadura; escleritis; enfermedad de Stargardt; tratamiento de heridas inflamadas oculares y/o bordes de la herida oculares; tratamiento de inflamación infraocular después de la cirugía ocular o trauma; uveítis; y distrofia macular viteliforme.

27. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de periodontitis , en particular periodontitis crónica; mucositis, trastornos descamativos orales, planus de liquen oral, pénfigo vulgar, peri-implantitis , pulpitis; estomatitis; y trastorno de la articulación temporomandibular.

28. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de cáncer y enfermedades de tumor, carcinomas pulmonares de neurinoma acústico; leucemia linfocítico aguda (Ll,. L2, L3); leucemia linfoide aguda (ALL ) ; leucemia mielógena aguda (AML) ; adenocarcinomas ; carcinoma anal; carcinoma bronquial ; carcinoma cervical; cáncer cervical; astrocitoma; basalioma; cáncer con la transformación de Bcr-Abl; cáncer de vejiga; blastomas; cáncer de hueso; metástasis cerebrales; tumores cerebrales; cáncer de mama; linfoma de Burkitt; carcinoides; cáncer de cuello uterino; leucemia linfocítica crónica (CLL) ; leucemia mieloide crónica (CML) ; cáncer de colon; carcinoma de colon; carcinoma corpus; craniofaringeomas ; síndrome de COPA; tumores inducidos por virus; VEB inducida por el linfoma de células B; carcinoma de endometrio; eritoleucemia (M6) ; cáncer de esófago; cáncer de vesícula biliar; cáncer gastrointestinal; tumores del estroma gastrointestinal; tumores gastrointestinales; cáncer genitourinario; glaucoma; glioblastoma; gliomas; tumores de cabeza / cuello; tumores inducidos por la hepatitis B; carcinomas hepatocelulares ; hepatomas; tumores inducidos por virus del herpes; síndrome de Hodgkin; linfornas inducidos por HTLV-1; Linfornas inducidos por HTLV-2; insulinomas; cáncer intestinal; sarcoma de Kaposi; cáncer del riñon; carcinomas renales; cáncer de la laringe; leucemia; tumor de tapa; cáncer de hígado; metástasis hepáticas; cáncer de pulmón; cáncer de linfoide; linfornas; melanomas malignos; carcinomas de mama; linfoma de células del manto; meduloblastoma ; leucemia megacarioblástica (M7); melanoma, en particular, el melanoma maligno; meningioma; mesotelioma; leucemia monocítica (MS) ; mieloma múltiple; micosis fungoide; leucemia mieloblástica (MI); leucemia mieloblástica (M2); leucemia mielomonocítica (M4); neurinoma; linfomas no Hodgkin; carcinoma de células no pequeñas; carcinoma de célula no pequeña de pulmón; cáncer de esófago; carcinoma de esófago; oligodendroglioma; cáncer de ovario; carcinoma de ovario; cáncer de páncreas; carcinoma de páncreas; carcinomas inducidos por virus del papiloma; cáncer de pene; tumor de la ¦ hipófisis; plasmocitoma ; leucemia promielocitica (M3) ; cáncer de próstata; tumores de próstata; tumores del recto; carcinoma del recto; carcinoma de células renales; retinoblastoma; sarcomas; enfermedad de Schneeberger ; carcinomas de pulmón de células pequeñas; cáncer de intestino delgado; pequeños tumores del intestino delgado; tumores de tejidos blandos; espinalioma; carcinoma de células escamosas; cáncer de estómago; cáncer testicular; cáncer de garganta; timoma; cáncer de tiroides; carcinoma de la tiroides; cáncer de lengua; AML indiferenciada (MO) ; cáncer de la uretra; cáncer uterino; cáncer de la vagina; Von Hippel Lindau enfermedad;, cáncer de vulva; Tumor de Wilms; y xeroderma pigmentosa.

29. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de la hipertensión arterial; arteriosclerosis ; lesiones arterioscleróticas ; Síndrome de Behcet; bifurcaciones de los vasos sanguíneos; hipertrofia cardiaca; hipertrofia cardiovascular; míocardiopatías, en cardiomiopatias inducidas por quimioterapia en particular; isquemia cerebral; enfermedades coronarias; la dilatación de' la aorta abdominal; la isquemia cerebral focal; isquemia cerebral global; hipertrofia cardiaca; hipertensión aneurisma infrarrenal; isquemia; infarto de miocardio/ en particular, infarto agudo de miocardio; miocarditis; reperfusión; reestenosis; vasculitis; y granulomatosis de Wegener.

30. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el inhibidor JNK se usa complementario a la cirugía de injerto por revascularización coronaria de la arteria coronaria (cirugía ' CABG) ; angioplastia coronaria transluminal percut nea (PTCA) ; y/o tratamiento endoprótesis vascular.

31. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS) ; asma; enfermedades crónicas que involucran el sistema respiratorio; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) ; fibrosis quística; enfermedades pulmonares; enfermedades inflamatorias pulmonares; neumonía; fibrosis pulmonar; etc.

32. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una dé las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es : para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de colitis, colitis atipico, colitis química; colitis colagenosa, colitis distal, colitis de desvio; colitis fulminante, colitis indeterminada, colitis infecciosa, colitis isquémica, colitis linfocítica, colitis microscópica, enfermedad de Crohn, gastroenteritis, enfermedad de Hirschsprung, enfermedades inflamatorias digestivas; enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , Morbus Crohn, enfermedades digestivas crónicas o no crónicas, enfermedades inflamatorias digestivas crónicas o no crónicas; enteritis regional y colitis ulcerativa.

33. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de enfermedades infecciosas bacterianas, enfermedades infecciosas víricas, encefalitis víricas; tumores y cánceres inducidos víricos, demencia del virus de inmunodefici-encia humana, meningitis, meningoencefalitis, encefalomielitis y tonsilitis.

34. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedades y/o trastornos seleccionados de síndrome Aarskog, hepatotoxicidad acetaminofeno; anomalía Alder-Reilly; alopecia areata; deficiencia de alfa-l-antitripsina ; anafilaxis; apoptosis; muerte celular apoptótica; síndrome urémico hemolítico atípico; basopenia; basofilia; trastornos bipolares; quemaduras; tensión de corte celular; síndrome de Chedial-Higashi ; daño de ADN debido a fármacos quimoterapéuticos ; colestasis; cromosoma 11, monosomia parcial llq; cromosoma 22, trisomia mosaica; enfermedad granulomatosa crónica; hepatitis, tales como hepatitis crónica o fulminante; depresión clínica; hipogamaglobulinemia variable común; deficiencia C3 congenital; protección CTL de muerte celular inducida por activación (AICD) ; sordera; depresión y trastornos depresivos (en particular prevención de trastornos depresivos se desarrollan en un contexto del comportamiento de la enfermedad inducida por citoquina) , síndrome de DiGeorge; enfermedades provocadas por apoptosis defectuosa; enfermedades del hígado; enfermedades de la espina; enfermedades del útero; estados de las enfermedades síntomas debido a la exposición para agentes que dañan el ADN y/o radiación ionizante y tensión celular resultante; síndrome de Down; distrofia muscular Duchenne; displasias ectodermal; endometriosis ; eosinopenia; eosinofilia; muerte celular exocitóxica; síndrome de alcohol fetal; fibrosis; enfermedad fibrótica; formación de tejido fibroso; radicales libres (llevando a tensión celular) ; rechazo de injerte-enfermedad de injerto contra hospedero; pérdida de cabello; síndrome urémico hemolítico; hepatotoxicidad; hiperalgesia, tales como hiperalgesia inducida por diabetes; hipertermia; hipoglicemia; hipotiroidismo; síndrome hipereosinofilico idiopático; nefropatía IgA; agammaglobulinemia ligada al sexo infantil; dolor inflamatorio; aneirismo infrarrenal ; regeneración de los islotes; trasplante de islotes; síndrome de Job (hiper-IgE) ; síndrome de leucocitos perezosos; deficiencia de deshidrogenasa de leucocitos de glucosa-6-fosfato; leucodistrofia; leucopenia; leucocitosis linfocítica; linfocitopenia; linfocitosis; depresión mayor; manía; depG?d??? insniSCS; síndrome de Marfan; mastocitosis ; Anomalía Hegglin de Mayo; glomerulonefritis membranoproliferativa -Tipo II; monocitopenia ; monocitosis; deficiencia benigna mieloperoxidasa; miopatías; neutropenia; neutrofilia; síndrome de Nezelof; trasplante de órganos; lesiones por estrés oxidativo; Pelger-Huet; enfermedades de los ríñones poliquísticos ; síndrome post-diálisis ; síndromes de radiación; radioterapia; enfermedades renales; insuficiencia renal; rescate de CTL de la activación inducida por la muerte celular; enfermedad de inmunodeficiencia combinada severa; rechazo de trasplantes; trasplante; trisomía; depresión unipolar; Lesiones inducidas por UV; El síndrome de Wiskott Aldrich y la cicatrización de heridas.

35. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque . el método es para tratamiento de trastorno de la articulación temporomandibular.

36. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de mucositis.

37. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las ¦ reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de estomatitis .

38. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de peri-implantitis.

39. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de planus de liquen oral .

40. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de Pénfigo vulgar.

41. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de periodontitis .

42. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de periodontitis crónica.

43. El inhibidor JNK para uso . de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de pulpitis.

44. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de uveitis, en particular de uveitis anterior, uveitis intermedia y/o uveitis posterior.

45. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una dé las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de síndrome de ojo seco.

46. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, en donde el inhibidor JNK se administra en contexto de la cirugía de injerto por revascularización coronaria de la arteria coronaria.

47. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, en donde el inhibidor JNK se administra en el contexto de angioplastía coronaria transluminal percutánea (PTCA).

48. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, en donde el inhibidor JNK se administra en el contexto de la colocación de endoprótesis vascular.

49. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de infarto al miocardio agudo.

50. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de aterosclerosis .

51. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de COPD.

52. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de asma.

53. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de artritis reumatoide.

54. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de osteoartritis .

55. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedad de Crohn.

56. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) .

57. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el . método es para tratamiento de psoriasis.

58. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de diabetes, en particular diabetes tipo 1.

59. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de apoplejía.

60. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una dé las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de mal de Parkinson.

61. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de enfermedad de Alzheimer.

62. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de lupus eritematoso sistémico.

63. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de vasculitis, en particular granulomatosis de Wegener.

64. El' inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 17, caracterizado porque el método es para tratamiento de pérdida de la audición aguda.

65. El inhibidor JNK para uso de conformidad con cualquiera de una de las- reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el inhibidor JNK consiste de la secuencia de la SEQ ID NO: 172.

66. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el inhibidor JNK de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 1 hasta 15 y un portador farmacéuticamente aceptable.