CN112022852A - 蝙蝠葛苏林碱在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种蝙蝠葛苏林碱在制备抗肿瘤药物中的应用，蝙蝠葛苏林碱分子式：C₃₇H₄₂N₂O₆，分子量：610.747,CAS号：70553‑76‑3。本发明首次证实了蝙蝠葛苏林碱在体内外均有抑制食管鳞癌增殖的作用。另外，本发明还证实了蝙蝠葛苏林碱能够抑制c‑Jun氨基末端激酶的活性。体外研究结果表明：蝙蝠葛苏林碱能够抑制食管鳞癌细胞KYSE 150、KYSE 450的增殖，锚定非依赖性生长能力。体内研究结果表明：蝙蝠葛苏林碱能够抑制食管鳞癌人源化移植瘤的增殖。由此显示了蝙蝠葛苏林碱对食管鳞癌有显著的抑制作用。因此，蝙蝠葛苏林碱能够作为c‑Jun氨基末端激酶抑制剂对肿瘤的预防及治疗起到一定作用。

Description

蝙蝠葛苏林碱在制备抗肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及蝙蝠葛苏林碱在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

中国国家癌症中心的数据表明，食管癌在中国是第四大致命性癌症。食管鳞状细胞癌是食管癌的主要亚型之一，食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者数占中国食管癌患者总数的90%以上。在过去几十年中，随着诊疗方法的不断进步，ESCC的发病率和死亡率呈下降趋势，但患者的五年生存率仍然较低。目前，食管癌的治疗尚缺乏有效的靶向药物，其主要的治疗方法为手术、放疗和化疗等，但仍存在治疗效果不佳，手术后复发率较高，药物副作用大等多种弊端，亟待寻求疗效更好的药物。

蝙蝠葛苏林碱（Daurisoline）是从中药北豆根中分离而得到的生物碱，已经被报道用于局部缺血/再灌注损伤、心律失常等疾病的治疗，而我们首次发现蝙蝠葛苏林碱能够抑制ESCC在体内外的增殖、亦能够抑制c-Jun氨基末端激酶2的活性。

发明内容

本发明目的在于提供一种化合物蝙蝠葛苏林碱在制备抗肿瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

蝙蝠葛苏林碱（Daurisoline）是一种小分子天然化合物，分子式：C₃₇H₄₂N₂O₆，分子量：610.747，CAS号：70553-76-3，其可以从北豆根中分离纯化得到，也可以直接购买普通市售产品。

本发明提供了一种蝙蝠葛苏林碱在制备抗肿瘤药物中的应用。

具体的，蝙蝠葛苏林碱在制备抑制食管鳞癌细胞增殖药物中的应用，即其对食管鳞癌细胞具有抑制作用。

进一步的，蝙蝠葛苏林碱在浓度为2.5μM-20 μM时能够显著抑制食管鳞癌细胞（如KYSE 150，KYSE 450等）的增殖、克隆形成的数量和大小。同时，蝙蝠葛苏林碱在制备抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤生长药物的应用，蝙蝠葛苏林碱在浓度20 mg/kg/天-40 mg/kg/天时能抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤的生长。

本发明还提供一种蝙蝠葛苏林碱在制备c-Jun氨基末端激酶抑制剂中的应用，也就是发现了蝙蝠葛苏林碱对c-Jun氨基末端激酶的抑制作用。

c-Jun氨基末端激酶2与细胞增殖、肿瘤发生密切相关，抑制c-Jun氨基末端激酶2的活性能够起到预防及治疗肿瘤的作用。本发明的蝙蝠葛苏林碱能够抑制c-Jun氨基末端激酶活性，并能够抑制食管癌增殖、锚定非依赖性生张能力。因此蝙蝠葛苏林碱应用于其他种类的肿瘤（如：胃癌、结肠癌、乳腺癌等）可能也会有抑制肿瘤细胞增殖、锚定非依赖性生长的能力。此外，本发明的蝙蝠葛苏林碱或还可与其它化疗药或激酶抑制剂一起使用，用于肿瘤的预防及治疗。

附图说明

图1为蝙蝠葛苏林碱对食管鳞癌细胞的毒性作用，其中，蝙蝠葛苏林碱在浓度范围为:2.5 μM-40 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE 150，KYSE 450的存活率。

图2为蝙蝠葛苏林碱在对食管鳞癌细胞增殖的抑制作用，其中，蝙蝠葛苏林碱在浓度范围为:2.5 μM-20 μM时能够抑制食管鳞癌细胞KYSE 150，KYSE 450的增殖；图中为加入不同浓度的蝙蝠葛苏林碱在不同时间点的肿瘤细胞增殖曲线。

图3为蝙蝠葛苏林碱抑制食管鳞癌细胞KYSE 150，KYSE 450锚定非依赖性生长能力。其中，随着蝙蝠葛苏林碱浓度的增加，克隆细胞数显著降低，统计结果。（*p <0.05，**p <0.01，***p <0.001）

图4为蝙蝠葛苏林碱抑制食管鳞癌人源化移植瘤的增殖。其中，随着蝙蝠葛苏林碱浓度的增加，小鼠肿瘤组织明显变小。

图5为蝙蝠葛苏林碱对c-Jun氨基末端激酶2的抑制作用，其中，随着蝙蝠葛苏林碱浓度的增加，抑制作用越来越明显。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。

应用试验

材料与方法

1 材料

1.1试剂

化合物蝙蝠葛苏林碱，购自于鼎瑞化工（上海）有限公司，纯度为98%；c-Jun氨基末端激酶购自Signalchem公司；食管鳞癌细胞KYSE 150、KYSE 450均来自郑州大学基础医学院病理生理学教研室。KYSE150用含有10%胎牛血清（FBS）、0.1%青霉素、0.1%链霉素的RPMI1640培养基培养；KYSE450用含有10%胎牛血清（FBS)、0.1%青霉素、0.1%链霉素的DMEM培养基培养。上述细胞均培养在37℃，含5%二氧化碳的无菌环境中。

1.2仪器与器材

海尔医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；超净工作台（苏州净化有限公司）；In Cell Analyzer 6000高内涵细胞成像分析系统（美国 GE 公司）；干燥 CO₂ 培养箱 （上海一恒科学仪器有限公司）。

2 方法

2.1 细胞毒性实验

食管鳞癌细胞KYSE 150，KYSE 450种于96孔板种，将细胞配成浓度为7×10⁴个/ml的混悬液，待细胞贴壁后，加入不同体积（0 μl, 1 μl,2.5 μl, 5 μl, 10 μl, 20 μl,40μl）的蝙蝠葛苏林碱（用DMSO溶解药物粉末，浓度为0.1mM）溶液使蝙蝠葛苏林碱在培养基中的终浓度为0、1μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM（每个浓度设5个复孔，每孔加入培养基100μL），分别在0小时、24小时、48小时时拿出96孔板倒掉旧培养基，每隔24 h更换一次含药培养基，再加入1×PBS清洗两次，每孔加入100 μl 4%的多聚甲醛固定30 min，然后再用1×PBS清洗两次。再将DAPI溶液用1×PBS稀释成1 μg/ml 的浓度，每孔加入100 μl DAPI溶液，放入37℃培养箱培养20 min，然后用1×PBS清洗两次，每孔加入100 μl 1×PBS保存。DAPI染色时要注意避光。再将96孔板放入In Cell Analyzer 6000高内涵细胞成像分析系统中，对板中细胞进行拍照和计数。计数完成后，求细胞平均数和标准差，绘制成折线图。以横坐标为加药培养时间，纵坐标为细胞数量，绘制折线图，如图1所示。

2.2 细胞增殖实验

食管鳞癌细胞KYSE 150，KYSE 450种于96孔板(KYSE150每孔约3000个细胞，KYSE450每孔约5000个细胞)， 24小时后分别加入不同体积的蝙蝠葛苏林碱溶液（用DMSO溶解药物粉末，浓度为0.1mM）使蝙蝠葛苏林碱在培养基中的终浓度为0、2.5μM、5μM、10μM、20μM（每个浓度设5个复孔，每孔加入培养基100μL），分别在0小时、24小时、48小时、72小时、96小时取出后将96孔板内的液体弃掉，每隔24 h更换一次含药培养基，并用4%多聚甲醛固定30 min，再用稀释后的DAPI（DAPI储存液：1×PBS=1：5000稀释，北京索莱宝科技有限公司）在37℃培养箱环境下染色20 min，使用In Cell Analyzer 6000高内涵细胞成像分析系统下检测细胞增殖情况。

2.3锚定非依赖性生长实验

下层胶为0.6%琼脂粉（Agar），上层胶为0.3% 琼脂粉不同浓度的蝙蝠葛苏林碱（0、2.5μM、5μM、10μM、20μM）以及KYSE 150、KYSE 450细胞（每孔8000个细胞）。一周左右观察细胞克隆的大小，将板拿出后进行统计分析。

2.4 食管鳞癌人源化移植瘤实验

订购免疫缺陷6-8周龄的小鼠，待小鼠体重稳定在16-18 g时，麻醉后背部植入食管鳞癌EG20肿瘤组织（患者，男，46岁，2042083，T2NOMOII，取自河南省肿瘤医院）。待小鼠状态良好，将荷瘤小鼠随机分成3组，第一组为对照组，第二组为蝙蝠葛苏林碱低剂量组（20 mg/kg/天），第三组为蝙蝠葛苏林碱高剂量组(40 mg/kg/天)，按照此分组开始每天皮下注射蝙蝠葛苏林碱(先用DMSO溶解药物粉末，之后用生理盐水稀释至相应浓度)，每周称重两次并测量一次瘤体积。当对照组小鼠瘤组织达到1000 mm³时，处死小鼠并取出瘤组织，进行观察并拍图。

2.5 体外激酶实验

（1） 首先根据目的条带的分子量，配制 10%的下层胶， 5%的上层胶，下层胶

放置 1 h 后再配制上层胶，一般上层胶配制结束后放置 30 min，胶体凝固后可以使用（注意检查装置有无漏液情况）。

（2） 药物准备：称量化合物，根据其分子量加入相应的DMSO，使其终浓度分别为（0 μM, 2.5 μM， 5 μM, 10 μM, 20 μM）。

（3） 配制激酶实验体系：分为两部分，第一部分体系加入激酶（100 ng） 1 μL，各个浓度的化合物各 1 μL，最后再加入 13 μL 蛋白激酶缓冲液补足至 15μL，均加入至 500μL 的 EP 管中，冰上放至 15 min。第二部分体系加入 STAT3蛋白(500 ng)2.5 μL，而后加入蛋白激酶缓冲液 5.5 μL，最后快速加入 ATP（200 mM） 2 μL 使第二部分体系补足至 10μL。

（4） 将配好的 25 μL体系加入 5 μL 6×loading buffer 放于水浴锅 95℃， 10min，取出后放置冰上 2 min，瞬时离心后等待上样，在胶板上做好标记，记住上样顺序，此次上样体积为 20 μl，剩余步骤均同蛋白质免疫印迹实验。

实验结果

1）使用不同浓度的蝙蝠葛苏林碱处理KYSE 150和KYSE 450细胞。结果显示，蝙蝠葛苏林碱对KYSE 150（图1A）和KYSE 450 （图1B）细胞具有明显的毒性作用，且随着蝙蝠葛苏林碱浓度的增加，细胞的存活率均有明显的下降。

2）用不同浓度的蝙蝠葛苏林碱（0 μM，2.5 μM，5 μM，10 μM，20 μM）处理KYSE 150和KYSE 450细胞，放入5% CO2, 37℃的培养箱，培养0 h，24 h，48 h，72 h或96 h，观察两种食管鳞癌细胞的增殖情况，结果见图2。由图2可知，蝙蝠葛苏林碱对KYSE 150细胞（图2A）和KYSE 450细胞（图2B）的增殖均有抑制作用，并且随着孵育时间的延长和蝙蝠葛苏林碱浓度的增加，其对食管鳞癌细胞的增殖作用逐渐增强。具体地，蝙蝠葛苏林碱在浓度为10μM、20μM时，培养72h后，对KYSE 150细胞的增殖抑制效果显著，在浓度为10μM、20μM时，培养48h后，对KYSE450细胞的增殖抑制效果显著。

3）用不同浓度的蝙蝠葛苏林碱（0 μM，2.5 μM，5 μM，10 μM，20 μM）处理KYSE 150和KYSE 450细胞，放入5% CO₂, 37℃的培养箱，观察两种食管鳞癌细胞克隆形成情况，待克隆大小符合要求，将板取出并拍照。如（图3A）所示，与对照组相比，随着蝙蝠葛苏林碱浓度的增加，食管鳞癌细胞克隆大小逐渐减小，克隆数量也逐渐减少。进一步对KYSE 150和KYSE450细胞的克隆数目进行统计学分析，结果如（图3B）所示，经过高浓度（10 μM，20 μM）的蝙蝠葛苏林碱处理的KYSE 150和KYSE 450细胞的克隆数目显著减少。以上结果提示，蝙蝠葛苏林碱对KYSE 150和KYSE 450细胞的锚定非依赖性生长具有抑制作用。

4）小鼠接种食管鳞癌肿瘤组织并且给予皮下注射蝙蝠葛苏林碱，将小鼠随机分为3组，

分别为对照组，低剂量组（20 mg/kg），高剂量组(40 mg/kg)，经过实验发现经蝙蝠葛苏林碱处理组的小鼠瘤重和瘤体积均有降低，差异具有明显的统计学意义，且高剂量的效果优于低剂量组，由此表明蝙蝠葛苏林碱在体内可抑制食管鳞癌的增殖。

5）加入不同浓度的蝙蝠葛苏林碱（0 μM，2.5 μM，5 μM，10 μM，20 μM），由结果可知，蝙蝠葛苏林碱能够抑制c-Jun氨基末端激酶2的生物学活性。

综上可以看出：本发明经研究发现蝙蝠葛苏林碱能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150，KYSE 450的增殖及锚定非依赖性生长能力，亦能够抑制c-Jun氨基末端激酶2的活性，是一种c-Jun氨基末端激酶2的抑制剂。

以上实施案例仅用于说明本发明的优选实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在所述领域普通技术人员所具备的知识范围内，本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替代及改进等，均应视为本申请的保护范围。

Claims (7)

1.蝙蝠葛苏林碱在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为治疗食管癌的药物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，蝙蝠葛苏林碱在制备抑制食管鳞癌细胞增殖药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，蝙蝠葛苏林碱在浓度为2.5μM~20μM时能够抑制食管鳞癌细胞的增殖及克隆形成的数量和大小。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述食管鳞癌细胞为KYSE150细胞和/或KYSE450细胞。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，蝙蝠葛苏林碱在制备抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤生长药物的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，蝙蝠葛苏林碱在浓度20 mg/kg/天-40 mg/kg/天时能抑制人源性食管鳞癌移植瘤模型中小鼠肿瘤的生长。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，蝙蝠葛苏林碱在制备c-Jun氨基末端激酶抑制剂中的应用。

Images