JP2003517023A - 中枢神経系の虚血性損傷または出血性損傷を、抗α４インテグリンアンタゴニストを用いて処置する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明には、インテグリンを含むα４サブユニットのアンタゴニストを用いて中枢神経損傷を処置するための方法および組成物が、記載される。本発明は、一般的には、急性の中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷の処置方法に関する。詳細には、本発明は、外傷性の脳の損傷、脊髄の損傷、または発作によって生じるＣＮＳの損傷を処置するための、α４インテグリンのアンタゴニストの使用に関する。選択されたα４インテグリンアンタゴニストは、単独で治療薬として、または他の薬学的な試薬と組合せて使用され得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、一般的には、急性の中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷の処置方法に関す
る。詳細には、本発明は、外傷性の脳の損傷、脊髄の損傷、または発作によって
生じるＣＮＳの損傷を処置するための、α４インテグリンのアンタゴニストの使
用に関する。選択されたα４インテグリンアンタゴニストは、単独で治療薬とし
て、または他の薬学的な試薬と組合せて使用され得る。

【０００２】 （発明の背景） 急性の中枢神経系（「ＣＮＳ」）の損傷は、脳および脊髄に対する広範囲の医
学的および外傷性の結果を含む。例えば、発作は、先進国での死亡の第３番目の
主要な原因であり、米国においては約１分間に１件の発作が生じている。死亡率
は約３０％であるが、４００万人以上の発作の生存者が、現在生存している。こ
れらの個体の大部分は種々の程度の障害を残している。虚血性の発作（すなわち
、血餅／血栓の形成に起因する血液の流れの破壊に関連する発作）および脊髄に
おける治療的な神経防御を実証するための臨床試験ななお、行われている。血栓
溶解治療（血栓の溶解または分解を生じる試薬の使用として定義される）は、多
くの限界を有するが、これは、唯一の急性の虚血性の発作のための処置の承認さ
れた形態である。虚血性の脳の損傷を阻害するための臨床的に試験されている現
在のストラテジーは、興奮毒性（ｅｘｃｉｔｏｔｏｘｉｃ）機構、一酸化窒素に
関連する神経の損傷、および虚血に関係するニューロンの細胞膜を標的とする。
前臨床的な研究ストラテジーもまた、抗アポトーシスおよび抗炎症機構を標的化
する。

【０００３】 外傷性の脳の損傷またはＴＢＩ（例えば、とりわけ、頭部の事故、および頭部
の創傷によって引き起こされる脳の損傷）に対する病理生理学的応答は、発作に
対する応答についての多くの局面において同様であり、そして同様のアプローチ
が、ＴＢＩの処置のための治療薬の開発のために行われている。発作が虚血性ま
たは出血性の機構によって引き起こされるか否かは、ＣＡＴスキャンまたはたの
臨床的な手順によって決定され得、そして続く処置の態様は、このスクリーニン
グの結果に依存する。

【０００４】 血管の界面での細胞性の接着およびそれを通過する通行は、急性の脳の損傷の
生理学的プロセスおよび病理生理学的プロセスの両方において必須の役割を果た
す。虚血性の脳の損傷の病理学における特定の目的は、多形核の白血球およびＴ
細胞である。これは、実験的な発作の後での、脳の損傷の発症に関係している（
Ｇａｒｃｉａら、１９９４、Ａｍ．Ｋ．Ｐａｔｈｏｌ．１４４；Ｂｅｃｋｅｒら
、１９９７、ＰＮＡＳ ９４：１０８７３）。脳への細胞性の浸潤は、脳の損傷
の後で生じると考えられ、そして疾患の進行に寄与し得る。従って、二次的な脳
の損傷（例えば、出血性変化、大脳血管痙攣）もまた、被験体における急性の脳
の損傷による結果であり得る。脊髄の損傷（ＳＣＩ）は、ＴＢＩと同様に、若い
健康な集団において生じるが、発作後の脳において生じる変化について多くの病
理学的な類似点を共有する。このような一般的な機構を参照して、発作およびＴ
ＢＩについてのものと同様の治療的なアプローチが、ＳＣＩの処置のために開発
されている。

【０００５】 細胞−細胞または細胞−マトリックス相互作用は、いくつかの細胞接着分子の
ファミリーを通じて媒介される。これらのうちの１つのこのようなファミリーは
、インテグリンを含む。インテグリンは、実質的にあらゆる哺乳動物細胞型につ
いて種々の組合せで見出される、種々のα（α１、α２、から現在はα１１まで
）およびβ（β１およびβ７）ヘテロ二量体膜貫通レセプタードメインから構成
される、構造的および機能的に関係している糖タンパク質である。（概説につい
ては、Ｅ．Ｃ．Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｃｅｌｌ、６７、１０３３（１９９１）；Ｄ．
Ｃｏｘら、「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒ
ｉｎｓ．」、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖ．第１９５巻（１
９９１）およびＶ．Ｗ．Ｅｎｇｌｅｍａｎら、「Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ
Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔａｒｇｅｔｓ」
、Ａｎｎ，Ｒｅｖｓ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３１巻、Ｊ
．Ａ．Ｂｒｉｓｔｏｌ編；Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９６、１９１頁）
を参照のこと）。インテグリンを含有している２つのα４サブユニットが、記載
されており、そしてα４β１（ＶＬＡ−４）およびα４β７と命名されている。

【０００６】 以前の実験は、虚血性の損傷の後で、脳中のα４β１およびα４β７カウンタ
ーレセプターＶＣＡＭ−１のアップレギュレーションを示したが、疾患における
機能的な役割を実証しているデータは報告されていなかった（Ｊａｎｄｅｒら、
１９９６、Ｊ．ＮｅｕｒｏＩｍｍｕｎｏｌ．７０：７５）。ＶＬＡ−４およびα
４β７は、単核の白血球上で発現される（ＬｏｂｂおよびＡｄａｍｓ、１９９４
；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１７２２を参照のこと）。

【０００７】 この状況においては、インテグリンファミリーのメンバーをアンタゴナイズす
る方法を開発することが有用である。さらに、損傷が虚血性であるかまたは出血
性であるかどうかにはかかわらず、有効である発作についての治療形態を開発す
ることが、有用である。

【０００８】 （発明の要旨） 本発明の開示までには、ＣＮＳの損傷（例えば、大脳の虚血）におけるインテ
グリンを含有しているαサブユニットの病理学的役割は、定義されていない。本
発明は、局所的な大脳の虚血のラットモデルにおける、インテグリンを含有して
いる阻害性のα４サブユニットの防御効果に一部関係する。本発明は、α４β１
および／またはα４β７のインヒビターを使用する、発作のようなＣＮＳの損傷
を処置するための方法を記載する。

【０００９】 本発明の１つの局面は、インテグリンアンタゴニストを含有しているα４サブ
ユニットの投与を包含する、このような処置を必要としている患者における急性
のＣＮＳを処置するための方法である。別の局面は、患者に対して薬理学的な試
薬を投与することをさらに包含する方法である。好ましくは、急性のＣＮＳ損傷
は発作、外傷性の脳の損傷、または脊髄の損傷である。いくつかの実施態様にお
いては、発作は、虚血性または出血性である。

【００１０】 薬理学的薬剤は、組織プラスミノーゲン活性化因子またはウロキナーゼのよう
な血栓崩壊剤であり得るか、あるいはこれは、神経保護剤または抗炎症剤であり
得る。本発明の特定の局面においては、神経保護剤は、レセプターのアンタゴニ
ストであり、レセプターは、以下からなる群より選択される：Ｎ−メチル−Ｄア
スパラギンレセプター（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル
−４−イソキサゾールプロピオン酸レセプター（ＡＭＰＡ）、グリシンレセプタ
ー、カルシウムチャンネルレセプター、ブラジキニンＢ２レセプター、およびナ
トリウムチャンネルレセプター。本発明の他の局面においては、抗炎症剤は、イ
ンターロイキン−１、および腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーからなる群より
選択される。神経保護剤はまた、レセプターのアゴニストでもあり得、レセプタ
ーは以下からなる群より選択される：ブラジキニンＢ１レセプター、γ−アミノ
酪酸（ＧＡＢＡ）レセプター、およびアデノシンＡ１レセプター。

【００１１】 本発明はさらに、虚血性の発作によって生じる二次的な脳の損傷を処置を必要
としている患者において、このような処置をするための方法に関する。この方法
は、インテグリンを含有しているα４サブユニットのインヒビターの投与を包含
する。

【００１２】 本発明の１つの目的は、インテグリンα４β１もしくはα４β７を単独で、ま
たは治療薬とともに、あるいは単独でまたは他の治療薬として互いに組合せて含
有している、α４サブユニットのインヒビターを使用して、虚血性または出血性
の発作を処置するための方法を提供することである。

【００１３】 本発明の１つの目的は、インテグリンα４β１もしくはα４β７を単独で、ま
たは治療薬とともに、あるいは単独でまたは他の治療薬として互いに組合せて含
有している、α４サブユニットのインヒビターを使用して、外傷性の脳の損傷を
処置するための方法を提供することである。

【００１４】 本発明の１つの目的は、インテグリンα４β１もしくはα４β７を単独で、ま
たは治療薬とともに、あるいは単独でまたは他の治療薬として互いに組合せて含
有している、α４サブユニットのインヒビターを使用して、脊髄の損傷を処置す
るための方法を提供することである。

【００１５】 本発明のさらなる目的は、インテグリンα４β１もしくはα４β７を単独で、
または治療薬とともに、あるいは単独でまたは他の治療薬として互いに組合せて
含有している、α４サブユニットのインヒビターを使用して、一時的な虚血の発
作の結果として生じる二次的な脳の損傷（例えば、出血性変化、脳血管攣縮）を
処置するための方法を提供することである。

【００１６】 （発明の詳細な説明） （Ｉ．定義） 請求される本発明の検討事項をより明確にそして簡潔に示すために、以下の定
義が、以下に記載される説明および添付される特許請求の範囲において使用され
る特異的な用語について提供される。

【００１７】 本発明は、以下の定義が含まれる以下の詳細な記載を参照して、ここに記載さ
れる： インテグリンの非常に後期の抗原（ＶＬＡ）スーパーファミリーは、ほとんど
全ての哺乳動物細胞型についての種々の組合せにおいて見出される、（αおよび
β）ヘテロ二量体の膜貫通レセプター分子から構成される、構造的および機能的
に関係している糖タンパク質から作成される。（概説については、Ｅ．Ｃ．Ｂｕ
ｔｃｈｅｒ、Ｃｅｌｌ、６７、１０３３（１９９１）；Ｄ．Ｃｏｘら、「Ｔｈｅ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．」、Ｍｅｄ
ｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖ．（１９９４）およびＶ．Ｗ．Ｅｎｇ
ｌｅｍａｎら、「Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ａｓ Ｐ
ｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｔａｒｇｅｔｓ」、Ａｎｎ．Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉ
ｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３１巻、Ｊ．Ａ．Ｂｒｉｓｔ
ｏｌ編；Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９６、１９１頁）を参照のこと）。
ＶＬＡファミリーのインテグリンとして（現在は）、ＶＬＡ−１、−２、−３、
−４、−５、−６、−９、および−１１が挙げられる。ここでは分子のそれぞれ
は、それぞれ、α鎖（α１、α２、α３、α４、α５、α６など）に非共有的に
結合したβ１鎖を含む。

【００１８】 α４β１インテグリンは、ＶＣＡＭ−１フィブロネクチンおよび可能性のある
他のリガンドについての細胞表面レセプターである（後者のリガンドが、個々に
およびまとめて、「α４リガンド（単数または複数）」と呼ばれる）。従って、
用語α４β１インテグリン（互換的に使用される、「ＶＬＡ−４」または「ａ４
ｂ１」または「ａ４ｂ１インテグリン」）は、本明細書中では、ＶＣＡＭ−１お
よび細胞外マトリックスタンパク質のメンバー（最も詳細には、フィブロネクチ
ンまたはそのホモログもしくはフラグメント）に対して結合し得るポリペプチド
をいうが、ＶＬＡ−４についての他のリガンドが存在し得、そして従来の方法を
使用して分析され得ることが、当業者に明らかである。それにもかかわらず、α
４サブユニットは、β１以外の他のベータサブユニットと会合することが公知で
あり、その結果、本発明者らは、用語「α（Ｉ）４インテグリン」または「α（
Ｉ）４サブユニットを含有しているインテグリン」を、そのα４サブユニットが
１つまたは別のβサブユニットと会合するインテグリンであるとして、定義し得
る。ＶＬＡ４以外の「α４」インテグリンの別の例は、α４β７である（Ｌｏｂ
ｂおよびＡｄａｍｓ、前出を参照のこと）。

【００１９】 インテグリン「アンタゴニスト」は、インテグリンリガンドおよび／またはレ
セプターとの結合によってα４サブユニットを含有しているインテグリンを阻害
する任意の化合物を含む。抗インテグリン抗体または抗体−ホモログを含有して
いるタンパク質（下記に議論される）、ならびに他の分子（例えば、インテグリ
ンについてのリガンドタンパク質の可溶性の形態）が、有用である。α４サブユ
ニットを含有しているインテグリンについてのリガンドタンパク質の可溶性の形
態として、可溶性のＶＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１融合タンパク質、または二官能
性のＶＣＡＭ−１／Ｉｇ融合タンパク質が挙げられる。例えば、インテグリンリ
ガンドまたはそのフラグメントの可溶性の形態は、インテグリンに結合するよう
に投与され得、そして好ましくは、細胞上のインテグリン結合部位について競合
し、それによって抗インテグリン（例えば、ＶＬＡ−４）抗体のようなアンタゴ
ニストの投与と同様の効果を導く。詳細には、リガンドに結合するが、インテグ
リン依存性のシグナル伝達は誘発しない可溶性のインテグリン変異体が、本発明
の範囲内に含まれる。このようなインテグリン変異体は、野生型のインテグリン
タンパク質の競合インヒビターとして作用し得、そして「アンタゴニスト」と考
えられる。本発明の方法において使用される他のアンタゴニストは、以下に定義
される「低分子」である。

【００２０】 １つ以上のα４サブユニットを含有しているインテグリンの作用をアンタゴナ
イズする分子（例えば、ＶＬＡ４およびα４β７の両方、またはα４サブユニッ
トを含有しているインテグリンの他の組合せをアンタゴナイズする、低分子また
は抗体ホモログ）を使用する方法もまた、本発明に含まれる。１つ以上のインテ
グリンの作用をアンタゴナイズするような分子の組合せを使用する方法もまた、
本発明の範囲に含まれる。例えば、ＶＬＡ４およびα４β７の両方、またはα４
サブユニットを含有しているインテグリンの他の組合せをアンタゴナイズする組
合せで、いくつかの低分子または抗体ホモログを使用する方法である。

【００２１】 本明細書中で議論されるように、特定のインテグリンアンタゴニストは、融合
され得るか、またはそうでなければ、例えば、イムノグロブリンもしくはそのフ
ラグメントのような抗体ホモログに対して結合させられ得、そしてこれらは、イ
ンテグリンまたはリガンドまたは他の分子の特定の型または構造には限定されな
い。従って、本発明の、目的のためには、キメラタンパク質（以下に定義される
）を形成し得るそしてインテグリンリガンドに結合し得、そしてＶＬＡ−４（例
えば、ＶＬＡ−４）インテグリンを効果的にブロックまたはコーティングする任
意の試薬は、本明細書中の実施例において使用されるアンタゴニストの等価物と
考えられる。

【００２２】 「抗体ホモログ」として、ジスルフィド結合を通じて連結された、イムノグロ
ブリン軽鎖および重鎖から構成されるインタクトな抗体が挙げられる。用語「抗
体ホモログ」はまた、以下から選択される１つ以上のポリペプチドを含有してい
るタンパク質を含むことが意図される：イムノグロブリン軽鎖、イムノグロブリ
ン重鎖、および１つ以上の抗原（すなわち、インテグリンまたはインテグリンリ
ガンド）に結合し得るそれらの抗原結合フラグメント。１つ以上のポリペプチド
から構成される抗体ホモログの成分ポリペプチドは、必要に応じて、ジスルフィ
ド結合され得るか、またはそうでなければ共有的に架橋され得る。従って、「抗
体ホモログ」は、ＩｇＡ、ｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（ならびにそれらのサ
ブタイプ）のインタクトなイムノグロブリンを含む。ここでは、イムノグロブリ
ンの軽鎖は、κ型またはλ型であり得る。「抗体ホモログ」はまた、抗原結合特
異性を保持しているインタクトな抗体の一部（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ
ａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、重鎖
および軽鎖の単量体または二量体またはそれらの混合物）を含む。

【００２３】 「ヒト化抗体ホモログ」は、組換えＤＮＡ技術によって産生された抗体ホモロ
グである。ここでは、抗原の結合のためには必要とされないヒトのイムノグロブ
リン軽鎖または重鎖のアミノ酸のいくつかまたは全てが、ヒト以外の哺乳動物の
イムノグロブリン軽鎖または重鎖に由来する対応しているアミノ酸について置換
されている。「ヒトの抗体ホモログ」は、イムノグロブリン軽鎖または重鎖の全
てのアミノ酸（それらが抗原結合に必要とされるるかどうかにはかかわらず）が
ヒトの供給源に由来する、抗体ホモログである。

【００２４】 本明細書中で使用される場合には、「ヒトの抗体ホモログ」は、組換えＤＮＡ
技術によって産生される抗体ホモログである。ここでは、イムノグロブリン軽鎖
または重鎖のアミノ酸の全てが、ヒトの供給源に由来する。

【００２５】 インテグリン「アゴニスト」は、インテグリンリガンドを活性化する任意の化
合物を含む。

【００２６】 「アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の単量体のユニ
ットである。天然に存在しているペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質中
には２０個のアミノ酸が見出される。これらの全てが、Ｌ−イソマーである。こ
の用語はまた、アミノ酸のアナログ、およびタンパク質、アミノ酸、およびそれ
らのアナログのＤ−イソマーをも含む。

【００２７】 「共有結合される」は、本発明の特定された部分（例えば、ＰＥＧ化（ペグ化
）（ＰＥＧｙｌａｙｅｄ）されたα４インテグリンアンタゴニスト、イムノグロ
ブリンフラグメント／α４インテグリンアンタゴニスト））が、互いに直接共有
結合されるか、または他に、介入部分（単数または複数）（例えば、スペーサー
部分（単数または複数））を通じて互いに間接的に共有的に連結されるかのいず
れかであることを意味する。介入部分（単数または複数）は、「カップリング基
」と呼ばれる。用語「結合された」は、「共有的にカップリングされた」と互換
的に使用される。これに関して、「スペーサー」は、α４インテグリンアンタゴ
ニストまたはフラグメントのアミノ酸または他の成分と、分子の残りとの間に挿
入され得る部分をいう。スペーサーは、タンパク質機能を妨害することによって
改変を妨げるため、および／またはアミノ酸または他の成分が別の部分と連結す
ることを容易にするように、アミノ酸または他の成分と分子の残りとの間に分離
を提供し得る。

【００２８】 「発現制御配列」は、それらの遺伝子に対して作動可能に連結された場合に、
遺伝子の発現を制御しそして調節するポリヌクレオチドの配列である。

【００２９】 「発現ベクター」は、発現ベクターが宿主細胞中に導入された場合に、少なく
とも１つの遺伝子の発現を可能にする、ＤＮＡプラスミドまたはファージ（他の
一般例の中でも）のようなポリヌクレオチドである。ベクターは、細胞中で複製
し得るか、または複製できない場合もある。

【００３０】 本発明の試薬の「有効量」は、処置される特定の症状に対する結果を生じるか
または影響を発揮する量である。

【００３１】 アミノ酸残基の「機能的な等価物」は、（ｉ）機能的な等価物によって置き換
えられるアミノ酸残基と同様の反応特性を有しているアミノ酸；（ｉｉ）本発明
のアンタゴニストのアミノ酸であって、機能的な等価物によって置き換えられる
アミノ酸残基と同様の特性を有しているアミノ酸；（ｉｉｉ）機能的な等価物に
よって置換されるアミノ酸残基と同様の特性を有している、非アミノ酸である分
子である。

【００３２】 本発明のタンパク質様アンタゴニストをコードする第１のポリヌクレオチドは
、それが以下の条件の少なくとも１つを満たす場合、アンタゴニストタンパク質
をコードする第２のポリヌクレオチドと比較して、「機能的に等価」である： （ａ）「機能的な等価物」は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で第２の
ポリヌクレオチドに対してハイブリダイズする第１のポリヌクレオチドであり、
そして／または第１のポリヌクレオチド配列と縮重している。最も好ましくは、
これは、インテグリンアンタゴニストタンパク質の活性を有している変異体タン
パク質をコードする； （ｂ）「機能的な等価物」は、第２のポリヌクレオチドによってコードされるア
ミノ酸配列についての発現をコードする第１のポリヌクレオチドである。

【００３３】 本発明において使用されるインテグリンアンタゴニストとして、本明細書中に
列挙される因子、ならびにそれらの機能的な等価物が挙げられるがこれらに限定
されない。従って、本明細書中で使用される場合には、用語「機能的な等価物」
は、インテグリンアンタゴニストまたはインテグリンアンタゴニストをコードす
るポリヌクレオチドをいう。インテグリンアンタゴニストをコードするポリヌク
レオチドは、インテグリンアンタゴニストとしてレシピエントに対して同じまた
は改善された有利な効果を有し、機能的な等価物であると考えられる。当業者に
明らかであるように、機能的に等価なタンパク質は、組換え技術によって（例え
ば、「機能的に等価なＤＮＡ」を発現することによって）産生され得る。従って
、本発明は、天然に存在しているＤＮＡによって、ならびに天然に存在している
ＤＮＡによってコードされるものと同じタンパク質をコードする天然には存在し
ていないＤＮＡによってコードされる、インテグリンタンパク質を含む。ヌクレ
オチドコード配列の縮重に起因して、他のポリヌクレオチドが、インテグリンタ
ンパク質をコードするように使用され得る。これらは、配列中の同じアミノ酸残
基をコードする種々のコドンの置換によって変更される上記の配列の全てまたは
一部を含み、従って、サイレントな変異を生じる。このような変更された配列は
、これらの配列の等価物と見なされる。例えば、Ｐｈｅ（Ｆ）は、２つのコドン
ＴＴＣまたはＴＴＴによってコードされ、Ｔｙｒ（Ｙ）はＴＡＣまたはＴＡＴに
よってコードされ、そしてＨｉｓ（Ｈ）はＣＡＣまたはＣＡＴによってコードさ
れる。一方、Ｔｒｐ（Ｗ）は、単一のコドンＴＧＧによってコードされる。従っ
て、特定のインテグリンをコードする所定のＤＮＡ配列について、それをコード
する多くのＤＮＡの縮重配列が存在することが、明らかである。これらの縮重Ｄ
ＮＡ配列は、本発明の範囲内であると考えられる。

【００３４】 用語「キメラ」は、本発明のアンタゴニストに関して言及する場合には、アン
タゴニストが異なる構造を有しているおよび／または異なる起源の供給源を有し
ている２つ以上のタンパク質の連結（化学的な架橋もしくは共有または他のタイ
プ）から構成されることを意味する。従って、キメラα４インテグリンアンタゴ
ニストは、α４インテグリンアンタゴニストまたはフラグメントである１つの部
分、およびα４インテグリンアンタゴニストではない別の部分を含み得る。

【００３５】 「キメラ」タンパク質の種は、「融合」または「融合タンパク質」である。こ
れは、それらの個々のペプチド骨格を通じて（最も好ましくは、それらのタンパ
ク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子の発現を通じて）、２つ以上の
タンパク質またはフラグメントの、同じ直線の共有結合をいう。従って、好まし
い融合タンパク質は、α４インテグリンアンタゴニストではない第２の部分に対
して共有的に連結させられたα４インテグリンアンタゴニストまたはフラグメン
トを含む、キメラタンパク質である。本発明の好ましい融合タンパク質は、抗原
結合特異性を保持しているインタクトな抗体の一部（例えば、（例えば、Ｆａｂ
フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）
フラグメント、重鎖および軽鎖の単量体または二量体またはそれらの混合物など
）を含み得る。

【００３６】 最も好ましい融合タンパク質はキメラであり、そしてイムノグロブリン軽鎖、
重鎖、またはそれらの両方のヒンジおよび定常領域の全てまたは一部に対して融
合させられたかまたはそうでなければ連結させられた、インテグリンアンタゴニ
スト部分を含む。従って、本発明は、以下を含有している分子を特徴とする：（
Ｉ）インテグリンアンタゴニスト部分、（２）第２のペプチド（例えば、インテ
グリンアンタゴニスト部分の可溶性またはインビボでの寿命を増大させるペプチ
ド（例えば、イムノグロブリンスーパーファミリーのメンバー、またはそれらの
フラグメントもしくは一部（例えば、ＩｇＧの一部もしくはフラグメント（例え
ば、ヒトのＩｇＧ１重鎖定常領域（例えば、）ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジ領
域）））。詳細には、「インテグリンアンタゴニスト／Ｉｇ融合体」は、本発明
の生物学的に活性なインテグリンアンタゴニスト分子（例えば、イムノグロブリ
ン鎖のＮ末端に連結させられた可溶性のＶＬＡ−４リガンドまたはその生物学的
に活性なフラグメント、ここでは、イムノグロブリンのＮ末端の一部がインテグ
リンアンタゴニストで置き換えられる）を含有しているタンパク質である。イン
テグリンアンタゴニスト／Ｉｇ融合体の種は、イムノグロブリンの定常ドメイン
の少なくとも一部に対して連結された本発明のインテグリンアンタゴニストを含
有しているタンパク質である「インテグリン／Ｆｃ融合体」である。好ましいＦ
ｃ融合体は、重イムノグロブリン鎖のＣ末端ドメインを含有している抗体のフラ
グメントに対して連結させられた本発明のインテグリンアンタゴニストを含む。

【００３７】 用語「融合タンパク質」はまた、インテグリンアンタゴニストではなく（「キ
メラ分子を生じる」そして以下に記載されているような精製されたタンパク質か
ら新しく作成される、第２の部分に対して、１官能性またはヘテロ官能性分子を
通じて化学的に連結させられたインテグリンアンタゴニストを意味する。従って
、組換えによって連結されたとは反対に、融合タンパク質である、化学的に連結
されたキメラ分子の１つの例は、以下を含み得る：（１）α４インテグリンサブ
ユニット標的化部分（例えば、ＶＬＡ−４を保有している細胞の表面上に結合し
得るＶＣＡＭ−１部分ＶＣＡＭ−１部分）；（２）標的化部分の可溶性またはイ
ンビボでの寿命を増大させる第２の部分（例えば、ポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）のようなポリアルキレングリコールポリマー）。α４標的化部分は、任意
の天然に存在しているα４リガンドまたはそのフラグメント（例えば、ＶＣＡＭ
−１ペプチドまたは同様の保存的に置換されたアミノ酸内列）であり得る。

【００３８】 「異種プロモーター」は、本明細書中で使用される場合には、遺伝子または精
製された核酸と天然においては関係していないプロモーターである。

【００３９】 「相同性」は、本明細書中で使用される場合には、用語「同一性」と類義語で
あり、そして２つのポリペプチドまたは分子間、あるいは２つの核酸の間での配
列類似性をいう。２つの比較される配列の両方における位置が、同じ塩基または
アミノ酸の単量体のサブユニットによって占有される場合には（例えば、２つの
ＤＮＡ分子中のそれぞれの中の１つの位置がアデニンによって占有されるか、ま
たは２つのポリペプチドのそれぞれの中の１つの位置がリジンによって占有され
る場合）、それぞれの分子はその位置で相同である。２つの配列間でのパーセン
ト相同性は、比較される位置の数で割り算された２つの配列によって共有される
適合しているまたは相同である位置の数×１００の関数である。例えば、２つの
配列中の１０個の位置のうちの６個が適合しているかまたは相同である場合には
、２つの配列は６０％相同である。例示の方法によって、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣ
ＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％の相同性を共有する（６個の全位置のうちの３
個が適合している）。一般的には、比較は、２つの配列が最大の相同性を生じる
ようにアラインメントされた場合に作成される。このようなアラインメントは、
例えば、以下により詳細に記載されるコンピュータープログラムによって簡単に
実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４
５３（１９７０）の方法を使用して提供され得る。相同配列は、同一または類似
のアミノ酸残基を共有する。ここでは、類似の残基は、アラインメントされた参
照配列中の対応しているアミノ酸残基似ついての保存的置換または「許容される
点変異」である。これに関して、参照配列中の残基の「保存的置換」は、対応し
ている参照残基に対して物理的または機能的に類似であるそのような置換である
。例えばこれは、同様の大きさ、形状、電荷、化学的な特性（共有結合または水
素結合を形成する能力を含む）などを有する。特に好ましい保存的置換は、Ｄａ
ｙｈｏｆｆら、５：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：補遣３、第２２章：３５４−３５２、Ｎａｔ．
Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ
．（１９７８）の中の、「許容される点変異」について定義された基準を満たす
ものである。

【００４０】 「相同性」および「同一性」は、２つのポリペプチド配列間での配列類似性を
いい、同一性はよりストリンジェントな比較である。相同性および同一性はそれ
ぞれ、比較の目的のためにアラインメントされ得るそれぞれの配列中の位置を比
較することによって決定され得る。比較される配列中の位置が同じアミノ酸残基
によって占有される場合には、ポリペプチドは、その位置で同一であると言われ
得る；等価な部位が同じアミノ酸（例えば、同一の）または類似のアミノ酸（例
えば、立体的な性質および／もしくは電気的な性質において類似の）によって占
有される場合には、分子は、その位置で相同であると言われ得る。配列間での相
同性または同一性の割合は、配列によって共有される適合している位置または相
同である位置の数の関数である。「関係していない」または「相同ではない」配
列は、本発明のＡＲ配列と、４０パーセント未満の同一性を共有するが、好まし
くは、２５パーセント未満の同一性を共有する。

【００４１】 ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＥＮＴＲＥＺ、ＦＡＳＴＡ，およびＢＬＡＳ
Ｔを含む、種々のアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムが、使
用され得、ＧＣＧ配列分析パッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）の一部として利用可能であり、そして
例えば、デフォルトセッティングを用いて使用され得る。ＥＮＴＲＥＺは、Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏ
ｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ，Ｍｄ．を通じて入手可能である。１つの実施態様においては、２つの配
列のパーセント同一性は、１のギャップ重量を有するＧＣＧプログラムによって
決定され得る。例えば、それぞれのアミノ酸のギャップは、それが２つの配列間
での単一のアミノ酸またはヌクレオチドの不適合である場合に、荷重される。

【００４２】 「単離された」（「実質的に純粋」と互換的に使用される）は、核酸（すなわ
ち、インテグリンアンタゴニストをコードするポリヌクレオチド配列）に対して
適用される場合は、ＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレオ
チドの一部、ｃＤＮＡ、または合成のポリヌクレオチドが、その起源または操作
によって、：（ｉ）それが天然において会合するポリヌクレオチドの全てと会合
しないこと（例えば、発現ベクターまたはその一部として宿主細胞中に存在する
こと）；あるいは（ｉｉ）天然においてそれが連結されるもの以外の核酸または
他の化学的な部分に対して連結されること；あるいは（ｉｉｉ）天然においては
存在しないこと、を意味する。「単離された」によって、さらに、以下であるポ
リヌクレオチド配列が意味される：（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）によってインビトロで増幅される；（ｉｉ）化学的に合成される；（ｉｉｉ
）クローニングによって組換え的に産生される；あるいは（ｉｖ）切断およびゲ
ル分離によって精製される。従って、「実質的に純粋な核酸」は、核酸が由来す
る生物体の天然に存在しているゲノム中においては通常は連続しているコード配
列の１つまたは両方と直接は連続していない核酸である。実質的に純粋なＤＮＡ
はまた、さらなるインテグリン配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部であ
る組換えＤＮＡを含む。

【００４３】 「単離された」（「実質的に純粋」と互換的に使用される）は、ポリペプチド
またはその一部に対して適用される場合には、その起源または操作によって：（
ｉ）発現ベクターの一部の発現産物として宿主細胞中の存在するか；あるいは（
ｉｉ）それが天然において連結されるもの以外のタンパク質または他の化学的な
部分に対して連結されるか；あるいは（ｉｉｉ）天然においては存在しない（例
えば、タンパク質が天然においては見出されない形態で、タンパク質に対して少
なくとも１つの疎水性部分を追加するかまたは付加することによって化学的に操
作されるタンパク質）、ポリペプチドまたはその一部を意味する。「単離された
」によってさらに、（ｉ）化学的に合成されたか；または（ｉｉ）宿主細胞中で
発現させられ、そして付随しているタンパク質および夾雑タンパク質から精製さ
れたタンパク質が意味される。この用語は、一般的には、それが天然において一
緒に存在する他のタンパク質および核酸から分離されているポリペプチドを意味
する。好ましくは、ポリペプチドはまた、ポリペプチドを精製するために使用さ
れる抗体またはゲルマトリックス（ポリアクリルアミド）のような物質から分離
される。

【００４４】 「多価タンパク質複合体」は、複数の（すなわち、１つ以上）インテグリンア
ンタゴニストをいう。抗インテグリン抗体ホモログまたはフラグメントは、別の
抗体ホモログまたはフラグメントに対して架橋され得るかまたはそれらに対して
結合させられ得る。それぞれのタンパク質は、同じであり得るかまたは異なり得
、そしてそれぞれの抗体ホモログまたはフラグメントは同じであり得るかまたは
異なり得る。

【００４５】 「変異」は、生物体の遺伝材料中での任意の変化、特に、野生型のポリヌクレ
オチド中での任意の変化（すなわち、欠失、置換、付加、または変更）あるいは
野生型のタンパク質中での任意の変化である。用語「ムテイン」は、「変異体」
と互換的に使用される。

【００４６】 「作動可能に連結される」−ポリヌクレオチド配列（ＤＮＡ、ＲＮＡ）が、発
現制御配列がポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御しそして調節する場
合に、発現制御配列に対して作動可能に連結される。用語「作動可能に連結され
る」は、発現されるポリヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル（例えば、
ＡＴＧ）を有していること、そして発現制御配列の制御下にポリヌクレオチド配
列の発現、およびこのポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペ
プチドの産生を可能にするための正確なリーディングフレームを維持しているこ
とを含む。

【００４７】 「薬理学的薬剤」は、アンタゴニストの作用に影響を与える、（本発明のアン
タゴニストに加えて）被験体に対して投与される１つ以上の化合物または分子ま
たは他の化学実体として定義される。用語「薬理学的薬剤」は、本明細書中で使
用される場合には、「組合せ治療」の間に投与されるような薬剤（単数または複
数）をいい、ここでは、本発明のアンタゴニストが、１つ以上の薬理学的薬剤の
投与の前に、後に、またはそれと同時に投与される。

【００４８】 「タンパク質」は、本質的に任意の２０個のアミノ酸からなる任意のポリマー
である。「ポリペプチド」はしばしば、比較的大きいポリペプチドを参照して使
用され、そして「ペプチド」はしばしば、小さいポリペプチドを参照して使用さ
れるが、当該分野でのこれらの用語の使用法は重複しており、そして変更される
。用語「タンパク質」は、本明細書中で使用される場合には、他の場所で特に示
されない限りは、ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドをいう。

【００４９】 用語「ペプチド（単数または複数）」、「タンパク質（（単数または複数））
、および「ポリペプチド（単数または複数）」は、本明細書中では互換的に使用
される。用語「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」もまた、本
明細書中で互換的に使用される。

【００５０】 「組換え」は、本明細書中で使用される場合には、タンパク質が組換えの哺乳
動物発現システムに由来することを意味する。インテグリンがグリコシル化され
ていないだけではなくジスルフィド結合も含まないので、インテグリンは、ほと
んどの原核生物および真核生物の発現システムにおいて発現させられ得る。

【００５１】 「低分子」は、ＳｅｃｔｉｏｎＡ２中のような定義を有する。

【００５２】 句「表面アミノ酸」は、タンパク質がそのネイティブな形態で折り畳まれる場
合に、溶媒に対して曝露される任意のアミノ酸を意味する。

【００５３】 「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションおよび
洗浄の両方についての、０．５×ＳＳＣから約５×ＳＳＣまでおよび６５℃と実
質的に等価な塩および温度の条件である。従って、用語「標準的なハイブリダイ
ゼーション条件」は、本明細書中で使用される場合、操作上の定義であり、ハイ
ブリダイゼーション条件の範囲を含む。より高いストリンジェンシーの条件は、
例えば、プラークスクリーニング緩衝液（０．２％のポリビニルピロリドン、０
．２％のＦｉｃｏｌｌ ４００；０．２％のウシ血清アルブミン、５０ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１ＭのＮａＣｌ；０．１％のピロリン酸ナトリ
ウム；１％のＳＤＳ）；１０％のデキストランサルフェート、および１００μｇ
／ｍｌの変性させた超音波処理したサケの精子ＤＮＡでの、６５℃で１２〜２０
時間のハイブリダイゼーション、ならびに７５ｍＭのＮａＣｌ／７．５ｍＭのク
エン酸ナトリウム（０．５×ＳＳＣ）／１％のＳＤＳで６５℃での洗浄を含む。
より低いストリンジェンシーの条件は、例えば、プラークスクリーニング緩衝液
、１０％のデキストランサルフェート、および１１０μｇ／ｍｌの変性させた超
音波処理したサケの精子ＤＮＡでの、５５℃で１２〜２０時間のハイブリダイゼ
ーション、ならびに３００ｍＭのＮａＣｌ／３０ｍＭのクエン酸ナトリウム（２
．０×ＳＳＣ）／１％のＳＤＳで５５℃での洗浄を含み得る。Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎ６．３
．１−６．３．６（１９８９）をもまた参照のこと。

【００５４】 「治療用組成物」は、本明細書中で使用される場合には、本発明のアンタゴニ
ストおよび他の生物学的に適合性である成分を含有しているとして定義される。
治療用組成物は、水、ミネラルのような賦形剤、およびタンパク質のようなキャ
リアを含有し得る。

【００５５】 本発明のアンタゴニスト（およびその治療用組成物）は、「治療有効性」を有
すると言われ、そして薬剤の量は、脳の損傷（例えば、大脳の虚血または発作）
の後で被験体（例えば、動物モデルまたはヒトの患者）に投与された場合に、そ
の薬剤の量が標準的な神経学的な試験（第ＩＶ節）において神経学的な回復の臨
床的に有意な改善を生じるのに十分である場合に、「治療有効量」と言われる。

【００５６】 本発明の実施は、他の場所で特に記載されない限りは、細胞生物学、細胞培養
、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、薬理学、および免疫
学の従来技術を使用し、そしてこれは、当業者の範囲内である。このような技術
は、文献に記載されている。他に特に明記されていない限りは、発明の詳細な説
明において引用される全ての参考文献が、本明細書中で参考として援用される。

【００５７】 （ＩＩ．好ましい実施形態の説明） （概論） 本発明者らは、αインテグリン：α４β１および／またはα４β７の阻害が、
急性の発作によって誘導される損傷に対して脳を防御することを発見した。中央
の大脳動脈の一時的な閉塞によって引き起こされる発作のラットのモデルを使用
して、本発明者らは、α４インテグリンアンタゴニストでの処置の後の脳梗塞に
おいて有意な減少を実証した。発作の動物モデルの関連は、Ｈｕｎｔｅｒら（１
９９６）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ ６：１２３によって概説されている。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（Ｓ
Ｄ）および自発的な高血圧症のラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ Ｈｙｐｅ
ｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｒａｔ（ＳＨＲ））の両方における可逆的な中央の大脳動脈
閉塞のラットモデルは、げっ歯類の発作のモデルのモットの臨床的な関連として
広範囲に考察されている。（Ｈｕｎｔｅｒら（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ
Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６：１２３）。

【００５８】 （Ａ．インテグリンアンタゴニス） 本発明の目的のために、インテグリンアンタゴニストは、インテグリンとその
同族のリガンドとの間またはレセプターとの間での任意の相互作用のアンタゴニ
ストであり得、その結果、リガンド−レセプター相互作用によって誘導される正
常な機能は変更される（すなわち、妨げられるか、または遅延させられるか、ま
たはそうでなければ改変される）。インテグリンアンタゴニストの１つの好まし
い実施形態は、それらのリガンドとのα４インテグリンの相互作用（例えば、Ｖ
ＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用）のアンタゴニストである。これは、ＶＣＡＭ
−１および／またはＶＬＡ−４によって媒介される結合を阻害またはブロックし
得るか、あるいはそうでなければ、ＶＣＡＭ−１および／またはＶＬＡ−４機能
を調節し得（例えば、ＶＬＡ−４−リガンドによって媒介されるＶＬＡ−４シグ
ナル伝達またはＶＣＡＭ−１−リガンドによって媒介されるＶＣＡＭ−１シグナ
ル伝達を阻害またはブロックすることによる）、そして急性の脳の損傷の処置に
おいて有効である（好ましくは、抗ＶＬＡ−４抗体と同じ様式で）因子（例えば
、ポリペプチドまたは他の分子）である。

【００５９】 ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用のアンタゴニストは、以下の特性の１つ以
上を有している因子である：（１）この因子は、ＶＬＡ−４−リガンド／ＶＬＡ
−４相互作用（例えば、ＶＣＭＡ−１／ＶＬＡ−４相互作用）を阻害するための
十分な特異性を有して、ＶＬＡ−４を保有している細胞（例えば、内皮細胞）の
表面上のＶＬＡ−４をコーティングするかまたはこのＶＬＡ−４に対して結合す
る；（２）この因子は、ＶＬＡ−４によって媒介されるシグナルの伝達（例えば
、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１によって媒介されるシグナル伝達）を改変するため
、そして好ましくは、阻害するために十分な特異性を有して、ＶＬＡ−４を保有
している細胞の表面上のＶＬＡ−４をコーティングするかまたはこのＶＬＡ−４
に対して結合する；（３）この因子は、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１の相互作用を
阻害するために十分な特異性を有して内皮細胞上のＶＬＡ−４リガンド（例えば
、ＶＣＭ−１）をコーティングするかまたはこのＶＬＡ−４リガンドに対して結
合する；（４）この因子は、ＶＬＡ−４リガンドによって媒介されるＶＬＡ−４
のシグナルの伝達（例えば、ＶＣＡＭ−１によって媒介されるＶＬＡ−４のシグ
ナル伝達を改変するため、そして好ましくは、阻害するために十分な特異性を有
して、ＶＬＡ−４−リガンドをコーティングするかまたはそれに対して結合する
。好ましい実施形態においては、アンタゴニストは、特性１および２の１つまた
は両方を有する。他の好ましい実施形態においては、アンタゴニストは、特性３
および４の１つまたは両方を有する。さらに、１つより多くのアンタゴニストが
患者に投与され得る。例えば、ＶＬＡ−４に結合する因子は、ＶＣＡＭ−１に結
合する因子と組合せられ得る。

【００６０】 本明細書中で議論されるように、本発明の方法において使用されるアンタゴニ
ストは、分子の特定の型または構造には限定されず、その結果、本発明の目的の
ためには、細胞の表面上のα４インテグリン（例えば、ＶＬＡ−４）またはα４
リガンド（例えば、α４リガンドを保有している細胞の表面上のＶＣＡＭ−１）
を結合し得、そしてα４インテグリン（例えば、ＶＬＡ−４）またはα４インテ
グリンリガンド（例えば、ＶＣＡＭ−１）を効果的にブロックまたはコーティン
グする任意の因子（それぞれ、「αインテグリン結合因子」および「α４インテ
グリンリガンド結合因子」と呼ばれる）は、本明細書中の実施例において使用さ
れるアンタゴニストの等価物であると考えられる。

【００６１】 例えば、抗体または抗体ホモログ（以下で議論される）、ならびにＶＬＡ−４
およびＶＣＡＭ−１に対する可溶性の形態の天然の結合タンパク質が、有用であ
る。ＶＬＡ−４に対する可溶性の形態の天然の結合タンパク質として、可溶性の
ＶＣＡＭ−１ペプチド、ＶＣＡＭ−１融合タンパク質、二官能性のＶＣＡＭ−１
／Ｉｇ融合タンパク質（例えば、上記で議論される「キメラ」分子）、フィブロ
ネクチン、別のスプライシングされた非ＩＩＩ型結合セグメントを有しているフ
ィブロネクチン、およびアミノ酸配列ＥＩＬＤＶを含有しているフィブロネクチ
ンペプチド、または同様の保存的に置換されたアミノ酸配列が挙げられる。ＶＣ
ＡＭ−１に対する可溶性の形態の天然の結合タンパク質として、可溶性のＶＬＡ
−４ペプチド、ＶＬＡ−４融合タンパク質、二官能性のＶＬＡ−４／Ｉｇ融合タ
ンパク質などが挙げられる。本明細書中で使用される場合には、「可溶性のＶＬ
Ａ−４ペプチド」または「可溶性のＶＣＡＭ−１ペプチド」は、膜内で自身を固
定することができない、ＶＬＡ−４またはＶＣＡＭ−１ポリペプチドである。こ
のような可溶性のポリペプチドとして、例えば、別のポリペプチドを固定するた
めの膜貫通ドメイン（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｐａｎｎｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）の
十分な部分を欠失しているか、または膜貫通ドメインが非機能的であるように改
変されている、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭポリペプチドが挙げられる。これらの
結合因子は、ＶＬＡ−４についての細胞表面結合タンパク質と競合することによ
って、またはそうでなければＶＬＡ−４の機能を変更することによって、作用し
得る。例えば、ＶＣＡＭ−１の可溶性の形態（例えば、Ｏｓｂｏｒｎら、１９８
９、Ｃｅｌｌ、５９：１２０３−１２１１）またはそのフラグメントが、ＶＬＡ
−４に結合するために投与され得、そして好ましくは、ＶＣＡＭ−１を保有して
いる細胞上のＶＬＡ−４結合部位と競合し、それによって、低分子または抗ＶＬ
Ａ−４抗体のようなアンタゴニストの投与と同様の効果を導く。

【００６２】 （１．抗インテグリン抗体ホモログ） 他の好ましい実施形態においては、細胞表面のα４インテグリン（例えば、Ｖ
ＬＡ−４またはα４β７）および／またはα４インテグリンに対する細胞表面リ
ガンド（例えば、ＶＣＡＭ−１）に結合する（それらをブロックするかまたはコ
ーティングすることを含む）ために、本発明の方法において使用されるアンタゴ
ニストは、先に定義されているような、抗ＶＬＡ−４および／または抗ＶＣＡＭ
−１モノクローナル抗体あるいは抗体ホモログである。処置のための（特に、ヒ
トの処置のための）好ましい抗体およびホモログとして、ヒトの抗体ホモログ、
ヒト化抗体ホモログ、キメラ抗体ホモログ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２
、およびＦ（ｖ）抗体フラグメント、ならびに抗体重鎖もしくは軽鎖の単量体も
しくは二量体またはこれらの混合物が挙げられる。ＶＬＡ−４に対するモノクロ
ーナル抗体は、本発明の方法における好ましい結合因子である。

【００６３】 （２．低分子のインテグリンアンタゴニスト） 用語「低分子」のインテグリンアンタゴニストは、インテグリン／インテグリ
ンリガンド相互作用を破壊し得る（例えば、細胞の表面上でＶＬＡ−４を結合す
るかまたは細胞の表面でＶＣＡＭ−１を結合することによってＶＬＡ−４／ＶＣ
ＡＭ−１相互作用をブロックすることによる）化学的な因子（すなわち、有機分
子）をいう。このような低分子はまた、それぞれのＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ−
１レセプターを結合し得る。ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ−１低分子インヒビター
は、それら自体がペプチド、半ペプチド化合物、または非ペプチド化合物（例え
ば、ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用のアンタゴニストである小さい有機分子
）であり得る。「低分子」は、本明細書中で定義される場合は、抗体または抗体
ホモログを含むことは意図されない。例示的な低分子の分子量は、一般的には、
１０００未満である。

【００６４】 例えば、ＶＬＡ−４リガンドの結合ドメインを模倣し、そしてＶＬＡ−４のレ
セプタードメインに適合するオリゴサッカライドのような低分子が、使用され得
る。（Ｊ．Ｊ．Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４００−
４０６（１９９０）、Ｊ．Ｋ．ＳｃｏｔｔおよびＧ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，１９９０
、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０、ならびに米国特許第４，８３３，
０９２号（Ｇｅｙｓｅｎ）を参照のこと（これらの全てが、本明細書中で参考と
して援用されている））。反対に、ＶＣＡＭ−１リガンドの結合ドメインを模倣
しそしてＶＣＡＭ−１のレセプタードメインに適合する低分子が、使用され得る
。

【００６５】 本発明において有用である他の低分子の例は、Ｋｏｍｏｒｉｙａら（「Ｔｈｅ
Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ａ Ｍａ
ｊｏｒ Ｃｅｌｌ Ｔｙｐｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｓｉｔｅ
（ＣＳ１）Ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ Ｓｐｌｉｃｅ
ｄ ＴｙｐｅＩＩＩ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ Ｓｅｇｍｅｎｔ Ｄｏｍａｉｎ
ｏｆ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｉｓ Ｌｅｕｃｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔｉｃ Ａ
ｃｉｄ−Ｖａｌｉｎｅ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（２３）、１５０７
５−７９頁（１９９１））において見出され得る。彼らは、ＶＬＡ−４に結合す
るために必須の最少の活性なアミノ酸配列を同定し、そして特定の種のフィブロ
ネクチンのＣＳ−１領域（ＶＬＡ−４結合ドメイン）のアミノ酸配列に基づいて
種々の重複ペプチドを合成した。彼らは、８アミノ酸のペプチドＧｌｕ−Ｉｌｅ
−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ、ならびに２つの比較的小
さい重複ペンタペプチドＧｌｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＶａｌおよびＬｅｕ
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒを、同定した。これらは、フィブロネクチン
依存性の細胞接着の対する阻害活性を有する。ＬＤＶ配列を含有している特定の
大きなペプチドが、続いて、インビボで活性であることが示された（Ｔ．Ａ．Ｆ
ｅｒｇｕｓｏｎら、「Ｔｗｏ Ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｅｐｔｉ
ｄｅｓ Ａｂｒｏｇａｔｅ Ｔ−ｃｅｌｌ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ
Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ Ｉｎ Ｖｉｖｏ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ、８８、８０７２〜７６頁（１９９１）；およびＳ．Ｍ．Ｗａｈｌら
、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｕｐ
ｐｒｅｓｓ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｒａｔｓ ｂｙ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔ
ｉｎｇ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅ
ｎｔ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４、６５５−６２頁（１９９４））。
環状のペンタペプチドＡｒｇ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−ＴＰｒｏ−Ｃｙｓ（ここでは、
ＴＰｒｏは４−チオプロリンを示す）（これは、ＶＬＡ−４およびＶＬＡ−５の
両方のフィブロネクチンに対する接着を阻害し得る）もまた記載されている（例
えば、Ｄ．Ｍ．Ｎｏｗｌｉｎら、「Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｙｃｌｉｃ Ｐｅｎｔａ
ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ａｌｐｈａ４Ｂｅｔａ１ Ｉｎｔｅｇｒｉ
ｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６８（２７）、２０３５２−５９頁（１９９３）；およびＰＣＴ公開ＰＣ
Ｔ／ＵＳ９１／０４８６２号を参照のこと）。このペンタペプチドは、いくつか
の細胞外マトリックスタンパク質についての認識部位中の共通のモチーフとして
公知である、フィブロネクチンに由来するトリペプチド配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐに基づく。他のＶＬＡ−４インヒビターの例が、例えば、Ａｄａｍｓら「Ｃ
ｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」ＰＣＴ ＵＳ９７／１３０
１３号において報告されている。これは、細胞接着阻害活性を有するβアミノ酸
を含有している直鎖状のペプチジル化合物を記載している。国際特許出願ＷＯ９
４／１５９５８およびＷＯ９２／００９９５は、細胞接着阻害活性を有する環状
のペプチドおよびペプチド模倣化合物を記載する。国際特許出願ＷＯ９３／０８
８２３およびＷＯ９２／０８４６４は、グアニジル含有、尿素含有、およびチオ
尿素含有の細胞接着阻害化合物を記載している。米国特許第５，２６０，２７７
号は、グアニジル細胞接着調節化合物を記載している。ＶＬＡ−４の他のペプチ
ジルアンタゴニストが、以下に記載されている：Ｄ．Ｙ．Ｊａｃｋｓｏｎら、「
Ｐｏｔｅｎｔ α４β１ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ａｓ ｐ
ｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ」Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４０、３３５９（１９９７）；Ｈ．Ｓｈｒｏｆｆら、「Ｓ
ｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ α４β７ ｍｅｄｉ
ａｔｅｄ ＭａｄＣＡＭ−１ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｔｏ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
ｓ」、Ｂｉｏ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１、２４９５（１９９６）；米
国特許第５，５１０，３３２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／５３８１４、ＷＯ９７／
０３０９４、ＷＯ９７／０２２８９、ＷＯ９６／４０７８１、ＷＯ９６／２２９
６６、ＷＯ９６／２０２１６、ＷＯ９６／０１６４４、ＷＯ９６１０６１０８、
およびＷＯ９５／１５９７３など。

【００６６】 このような低分子の因子は、複数のペプチド（例えば、５から２０アミノ酸の
長さ）、半ペプチド化合物、または非ペプチド有機化合物を合成することによっ
て、そして次いで、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ相互作用を阻害するそれらの能力につ
いてこれらの化合物をスクリーニングすることによって、産生され得る。一般的
には、米国特許第４，８３３，０９２号、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、「Ｓｅ
ａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｇａｎｄｓ ｗｉｔｈ ａｎ
Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｌｉｂｒａｒｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、３８６−９０頁
（１９９０）、ならびにＤｅｖｌｉｎら「Ｒａｎｄｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉ
ｂｒａｒｉｅｓ：Ａ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、４０４０
７頁（１９９０）を参照のこと。

【００６７】 （Ｂ．抗インテグリン抗体ホモログを作製する方法） 本明細書中で意図される好ましいインテグリンアンタゴニストは、原核生物ま
たは真核生物の宿主細胞中の、インタクトもしくは短縮されたゲノムもしくはｃ
ＤＮＡから、または合成のＤＮＡから発現され得る。二量体タンパク質は、培養
培地から単離され得、そして／または再度折り畳まれ得、そして生物学的に活性
な組成物を形成するようにインビトロで二量体化され得る。ヘテロ二量体は、別
々の異なるポリペプチド鎖を組合せることによって、インビトロで形成され得る
。あるいは、ヘテロ二量体は、別々の異なるポリペプチド鎖をコードする核酸を
同時に発現することによって、単一の細胞中で形成され得る。例えば、いくつか
の例示的な組換えヘテロ二量体タンパク質の産生のプロトコールについては、Ｗ
Ｏ９３／０９２２９号または米国特許第５，４１１，９４１号を参照のこと。現
在好ましい宿主細胞として、原核生物細胞（Ｅ．ｃｏｌｉを含む）または真核生
物細胞（酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、昆虫細胞、または哺乳動物細胞（
例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、またはＢＳＣ細胞）を含む）が挙げられるが
、これらに限定されない。当業者は、他の宿主細胞が有利であるように使用され
得ることを理解する。本発明の実施において有用であるタンパク質の詳細な記載
（軟骨形成活性のためにこれらを作製し、使用し、そして試験するための方法を
含む）が、米国特許第５，２６６，６８３号、および同第５，０１１，６９１号
（これらの開示は本明細書中で参考として援用される）を含む多数の刊行物に開
示されている。

【００６８】 モノクローナル抗体ホモログを産生するための技術は、周知である。簡潔には
、不死細胞株（代表的には、骨髄腫細胞）が、所定の抗原（例えば、ＶＡＬ−４
）を発現する全細胞で免疫化された哺乳動物に由来するリンパ球（代表的には、
脾臓細胞）に融合され、そして得られるハイブリドーマ細胞の培養上清が、抗原
に対する抗体についてスクリーニングされる。一般的には、Ｋｏｈｌｅｒら、１
９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２６５：２９５−２９７を参照のこと。免疫は、標準的
な手順を使用して達成され得る。単位用量および免疫化レジメンは、免疫化され
る哺乳動物の種、その免疫状態、哺乳動物の体重などに依存する。代表的には、
免疫化された哺乳動物は採血され、そしてそれぞれの血液サンプルに由来する血
清が、適切なスクリーニングアッセイを使用して特定の抗体についてアッセイさ
れる。例えば、抗ＶＬＡ−４抗体が、ＶＬＡ−４を発現する細胞に由来する１２
５−Ｉで標識された細胞溶解物の免疫沈降によって同定され得る（Ｓａｎｃｈｅ
ｚ−Ｍａｄｒｉｓら、１９８６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１３４
３−１３４９およびＨｅｍｌｅｒら、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２
６２、１１４７８−１１４８５を参照のこと）。抗ＶＬＡ−４抗体はまた、フロ
ーサイトメトリー（例えば、ＶＬＡ−４を認識すると考えられる抗体とともにイ
ンキュベートしたＲａｍｏｓ細胞の蛍光染色を測定することによって、同定され
得る（Ｅｌｉｃｅｓら、１９９０ Ｃｅｌｌ ６５０：５７７−５８４を参照の
こと）。ハイブリドーマ細胞の産生において使用されるリンパ球は、代表的には
、その血清がこのようなスクリーニングアッセイを使用して抗ＶＬＡ−４抗体の
存在についてポジティブであるとすでに試験された、免疫化された哺乳動物から
単離される。

【００６９】 代表的には、不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳動
物種由来である。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、お
よびチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に対して感受性である、マ
ウスの骨髄腫細胞株である。代表的には、ＨＡＴ感受性マウスの骨髄腫細胞は、
１５００の分子量のポリエチレングリコール（「ＰＥＧ １５００」）を使用し
てマウスの脾臓細胞に融合される。融合によって生じるハイブリドーマ細胞は、
次いで、ＨＡＴ培地を使用して選択される。ＨＡＴ培地は、融合されていない骨
髄腫細胞、および非生産的に融合された骨髄腫細胞を死滅させる（融合されてい
ない脾臓細胞は、それらが形質転換されていないので、数日後に死滅する）。所
望される抗体を産生するハイブリドーマは、ハイブリドーマ培養上清をスクリー
ニングすることによって検出される。例えば、抗ＶＬＡ−４抗体を産生するため
に調製されたハイブリドーマは、組換えのα４サブユニットを発現する細胞株に
結合する能力を有する分泌された抗体について、ハイブリドーマの培養上清を試
験することによってスクリーニングされ得る（Ｅｌｉｃｅｓら、前出を参照のこ
と）。

【００７０】 インタクトなイムノグロブリンである抗ＶＬＡ−４抗体ホモログを産生するた
めに、このようなスクリーニングアッセイにおいてポジティブであると試験され
たハイブリドーマ細胞を、このハイブリドーマ細胞が培養培地中にモノクローナ
ル抗体を分泌することを可能にするために十分な条件下で、十分な時間、栄養培
地中で培養する。ハイブリドーマ細胞について適切な組織培養技術および培養培
地は、周知である。馴化されたハイブリドーマ培養上清が回収され得、そして抗
ＶＬＡ−４抗体が、必要に応じて、周知の方法によってさらに精製され得る。

【００７１】 あるいは、所望される抗体は、免疫化されていないマウスの腹膜腔中にハイブ
リドーマ細胞を注入することによって産生され得る。ハイブリドーマ細胞は、腹
膜腔中で増殖し、腹水液として蓄積する抗体を分泌する。抗体が、シリンジを用
いて腹膜腔から腹水液を抜くことによって回収され得る。

【００７２】 いくつかのマウスの抗ＶＬＡ−４モノクローナル抗体は、以前に記載されてい
る。例えば、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｍａｄｒｉｓら、１９８６、前出；Ｈｅｍｌｅｒ
ら、１９８７、前出；Ｐｕｌｉｄｏら、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、
２６６（１６）、１０２４１−１０２４５；ＩｓｓｅｋｕｔｚおよびＷｙｋｒｅ
ｔｏｗｉｃｚ、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１０９（ＴＡ−２
ｍａｂ）を参照のこと。これらの抗ＶＬＡ−４モノクローナル抗体、およびＶＬ
Ａ−４のαおよび／またはβ鎖を認識し得る他の抗ＶＬＡ−４抗体（例えば、米
国特許第５，８８８，５０７号−Ｂｉｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．およびその中で引用さ
れている参考文献）が、本発明に従う処置方法において有用である。ＶＣＡＭ−
１およびフィブロネクチンリガンドに対する結合に関係するＶＬＡ−４ α４鎖
のエピトープを認識する抗ＶＬＡ−４抗体（すなわち、リガンドの認識に関係し
ている部位でＶＬＡ−４に結合し得、そしてＶＣＡＭ−１およびフィブロネクチ
ンの結合をブロックし得る抗体）が、好ましい。このような抗体は、Ｂエピトー
プ特異的抗体（Ｂ１またはＢ２）（Ｐｕｌｉｄｏら、１９９１、前出）として規
定されており、そして本発明に従う抗ＶＬＡ−４抗体でもある。

【００７３】 ＶＬＡ−４に対する完全なヒトモノクローナル抗体ホモログは、本発明の方法
においてＶＬＡ−４リガンドをブロックおよびコーティングし得る、別の好まし
い結合因子である。それらのインタクトな形態において、これらは、Ｂｏｅｒｎ
ｅｒら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７、８６−９５によって記載さ
れるような、インビトロで感作させられたヒトの脾臓細胞を使用して調製され得
る。あるいは、これらは、Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：２４３２−２４３６によって、またはＨｕａ
ｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
１４１、２２７−２３６、米国特許第５，７９８，２３０号（１９９８年８月２
５日、「Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈ
ｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｕｓｅ」）によって記載されるような、レパートリークローニングによって調
製され得、ヒトのＢ細胞由来のヒトモノクローナル抗体の調製を記載する。この
プロセスに従うと、ヒトの抗体を産生するＢ細胞は、エプスタインバーウイルス
、またはエプスタインバーウイルスの核抗原２（ＥＢＮＡ２）を発現するその誘
導体での感染によって不死化させられる。ＥＢＮＡ２の機能（これは、不死化の
ために必要とされる）は、続いて、抗体の産生の増大を生じるシャットオフを必
要とする。

【００７４】 完全なヒト抗体を産生するためのなお別の方法においては、米国特許第５，７
８９，６５０号（１９９８年８月４日、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｎｏｎ−ｈｕ
ｍａｎ ａｎｉｍａｌｓ ｆｏｒ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏ
ｕｓ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」）は、異種抗体を産生し得るトランスジェニック
非ヒト動物、および不活化させた内因性イムノグロブリン遺伝子を有するトラン
スジェニック非ヒト動物を記載する。内因性イムノグロブリン遺伝子は、アンチ
センスポリヌクレオチドによって、および／または内因性イムノグロブリンに対
して指向された抗血清によって、抑制される。異種抗体は、非ヒト動物腫のゲノ
ム中には通常は見出されないイムノグロブリン遺伝子によってコードされる。再
アラインメントされていない異種ヒトイムノグロブリン重鎖の配列を含有する１
つ以上の導入遺伝子が、非ヒト動物中に導入され、これによってトランスジェニ
ックイムノグロブリン配列を機能的に再アラインメントし得るトランスジェニッ
ク動物を形成し、そしてヒトのイムノグロブリン遺伝子によってコードされる種
々のアイソタイプの抗体のレパートリーを産生し得る。このような異種ヒト抗体
は、例えば、骨髄腫のような不死化細胞株と融合することによって、またはモノ
クローナルな異種の完全ヒト抗体のホモログを産生し得る細胞株を永存させるた
めの他の技術によってこのようなＢ細胞を操作することによって、その後に不死
化させられるＢ細胞中で産生される。

【００７５】 大きな非免疫化ヒトファージディスプレイライブラリーもまた、標準的なファ
ージ技術を使用してヒトの治療薬として開発され得る高い親和性の抗体を単離す
るために使用され得る（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６）。

【００７６】 本発明の方法においてインテグリンリガンドをブロックまたはコーティングし
得るなお別の好ましい結合因子は、抗インテグリン特異性を有するヒト化された
組換えの抗体ホモログである。真の「キメラ抗体」の調製のための初期の方法の
後（ここでは、定常領域全体および可変領域全体が、異なる供給源に由来する）
、新しいアプローチが、ＥＰ ０２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒら）に記載された
。ここでは、抗体は、別のものに由来する１つの種についてのそれらの相補性決
定領域（ＣＤＲ）の置換（所定の可変領域内）によって変更される。このプロセ
スを使用して、例えば、ヒトの重鎖および軽鎖のＩｇ可変領域ドメインに由来す
るＣＤＲを、マウスの可変領域ドメインに由来する別のＣＤＲで置換し得る。こ
れらの変更されたＩｇ可変領域は、続いて、置換されたマウスのＣＤＲを除く組
成物中の全体がヒトである作成された抗体に対するヒトのＩｇ定常領域と組合せ
られ得る。このようなＣＤＲで置換された抗体は、ＣＤＲで置換された抗体がヒ
ト以外の成分をあまり含まないと考えられるため、真のキメラ抗体と比較して、
ヒトでの免疫応答をあまり誘発しないと推定される。ＣＤＲ「移植」を介してモ
ノクローナル抗体をヒト化するためのプロセスは、「リシェイピング」と呼ばれ
ている。（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ３３２、３２３−３
２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、１５３４−
１５３６）。

【００７７】 代表的には、マウスの抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ヒトの抗体中の対
応している領域上に移植される。なぜなら、これは、特異的な抗原に対して結合
するマウスの抗体の領域であるＣＤＲ（抗体の重鎖中の３個、軽鎖中の３個）で
あるからである。ＣＤＲの移植は、遺伝子操作によって達成され、それによって
ＣＤＲ ＤＮＡ配列が、マウスの重鎖および軽鎖の可変（Ｖ）領域の遺伝子セグ
メントのクローニングによって決定され、次いで部位特異的変異誘発によって対
応しているヒトのＶ領域に導入させられる。プロセスの最終段階においては、所
望されるアイソタイプのヒトの定常領域の遺伝子セグメント（通常は、ＣＨにつ
いてのγＩであり、そしてＣＬについてはκである）が付加され、そしてヒト化
された重鎖および軽鎖の遺伝子が、可溶性のヒト化抗体を産生するように哺乳動
物細胞中で同時に発現される。

【００７８】 ヒトの抗体へのこれらのＣＤＲの導入によって、この抗体上にもともとのマウ
スの抗体の抗原結合特性を付与する。マウスの抗体中の６個のＣＤＲが、Ｖ領域
「フレームワーク」領域上に構造的に取り付けられる。ＣＤＲ−移植が良好であ
る理由は、マウスとヒトの抗体との間でのフレームワーク領域が、ＣＤＲＳにつ
いての接着の同様の点を有して非常に類似している３次元構造を有し得、その結
果、ＣＤＲが交換され得ることである。このようなヒト化抗体ホモログが、Ｊｏ
ｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１、５２２−５２５；Ｒｉｃｈｍａｎ
、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３２、３２３−３２７；Ｑｕｅｅｎら、１９８９
、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、１００２９；および
Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６、３８３３に説明されているように調製され得る。

【００７９】 それにもかかわらず、フレームワーク領域中の特定のアミノ酸は、ＣＤＲと相
互作用し、そして全体的な抗原結合親和性に影響を与えると考えられる。ヒトの
Ｖ領域のフレームワークのどんな改変も伴わなずに、組換えのヒト化抗体を産生
するための、マウスの抗体に由来するＣＤＲの直接的な導入は、しばしば、結合
親和性の部分的または完全な欠失を生じる。多くの場合において、結合活性を得
るために、アクセプター抗体のフレームワーク領域中の残基を変更することが重
要であるようである。

【００８０】 Ｑｕｅｅｎら、１９８９（前出）および第ＷＯ９０／０７８６１号（Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）は、ヒトの免疫グロブリンフレームワークお
よび定常領域とマウスのＭＡｂ（抗Ｔａｃ）のＣＤＲを組合せることによって、
アクセプター抗体のフレームワーク領域中に改変された残基を含む、ヒト化抗体
の調製を記載した。彼らは、ヒトのＶ領域のフレームワーク残基のどんな改変も
伴わずに、直接的なＣＤＲの導入によってしばしば生じる、結合親和性の欠失の
問題の１つの解決を実証した；これらの解決方法は、２つの重要な工程を包含す
る。第１の工程は、ヒトのＶフレームワーク領域が、もともとのマウスの抗体（
この場合は、抗Ｔａｃ ＭＡｂ）のＶ領域のフレームワークに対して、最適なタ
ンパク質配列相同性のコンピューターによる分析によって選択される。第２の工
程においては、マウスのＶ領域の３次構造が、マウスのＣＤＲとおそらく相互作
用するフレームワークアミノ酸残基を可視化するためにコンピューターによって
モデル化され、そしてこれらのマウスのアミノ酸残基が、次いで、相同なヒトの
フレームワークの上に重ねられる。米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，
６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３０，１０１
号（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）もまた参照のこと。

【００８１】 種々のアプローチ（Ｔｅｍｐｅｓｔら、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ９、２６６−２７１）を使用し得、そして標準として、ＮＥＷＭおよびＲＥ
Ｉ重鎖および軽鎖に由来するＶ領域のフレームワークを、それぞれ、マウスの残
基のラジカルの導入を伴わないＣＤＲの移植のために、利用する。Ｔｅｍｐｅｓ
ｔらの、ＮＥＷＭおよびＲＥＩに基づくヒト化抗体を構築するためのアプローチ
を使用する利点は、ＮＥＷＭおよびＲＥＩの可変領域の３次元構造が、ｘ線結晶
解析によって公知であり、従ってＣＤＲとＶ領域のフレームワークの残基との間
での特異的な相互作用がモデル化され得ることである。

【００８２】 利用されるアプローチにはかかわらず、今日までに調製された最初のヒト化抗
体ホモログの例は、これがまっすぐなプロセスではないことを示した。しかし、
このようなフレームワークの変化が必須であり得ると認めてさえも、利用可能な
先行技術に基づいて、もしあれば、どのフレームワーク残基が所望の特異性を有
する機能的なヒト化組換え抗体を得るために変更される必要があるかを推定する
ことは不可能である。従って、結果は、変化が特異性を保存することが必須であ
り、そして／または親和性は、主として所定の抗体について特有であり、そして
種々の抗体のヒト化に基づいては推定され得ないことを大いに示す。

【００８３】 本発明において有用である特定のα４サブユニットを含有しているインテグリ
ンアンタゴニストとして、米国特許第５，９３２，２１４号において調製されて
おりそしてそこに記載されている、Ｂエピトープ特異性を有しているキメラおよ
びヒト化組換え抗体ホモログ（すなわち、インタクトな免疫グロブリンおよびそ
の一部）（ｍａｂ ＨＰ１／２）が挙げられる。キメラ（マウスの可変−ヒトの
定常）およびヒト化抗インテグリン抗体ホモログの調製のための出発物質は、以
前に記載されているようなマウスのモノクローナル抗インテグリン抗体、市販の
モノクローナル抗インテグリン抗体（例えば、ＨＰ２／１、Ａｍａｅ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，Ｍａｉｎｅ）、または本
明細書中の教示に従って調製されるモノクローナル抗インテグリン抗体であり得
る。他の好ましいヒト化抗ＶＬＡ−４抗体ホモログが、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０１
２１９（１９９５年７月２７日）および米国特許第５，８４０，２９９号中で、
Ａｔｈｅｎａ Ｍｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．によって記載されている
。

【００８４】 これらのヒト化抗ＶＬＡ−４抗体は、ヒト化された軽鎖およびヒト化された重
鎖を含む。ヒト化された軽鎖は、マウスの２１−６免疫グロブリン軽鎖の対応し
ている相補性決定領域に由来するアミノ酸配列を有している、３個の相補性決定
領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、ならびに少なくとも１つの位置
においてアミノ酸位置がマウス２１．６免疫グロブリン軽鎖の可変領域のフレー
ムワークの等価な位置に存在している同じアミノ酸によって占有されていること
を除いて、ヒトのκ軽鎖可変領域のフレームワーク配列に由来する可変領域のフ
レームワークを含む。ヒト化された重鎖は、マウスの２１−６免疫グロブリン重
鎖の対応している相補性決定領域に由来するアミノ酸配列を有している、３個の
相補性決定量領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）、ならびに少なくと
も１つの位置においてアミノ酸位置がマウス２１−６免疫グロブリン重鎖の可変
領域のフレームワークの等価な位置に存在している同じアミノ酸によって占有さ
れていることを除いて、ヒトの重鎖可変領域のフレームワーク配列に由来する可
変領域のフレームワークを含む。

【００８５】 （Ｃ．フラグメントおよびアナログの産生） 単離されたα４インテグリンアンタゴニストのフラグメント（例えば、本明細
書中に記載されている抗体ホモログのフラグメント）はまた、組換え方法によっ
て、タンパク質溶解による消化によって、または当業者に公知の方法を使用する
化学合成によっても、効率的に産生され得る。組換え方法においては、ポリペプ
チドの内部または末端のフラグメントは、単離されたハリネズミのポリペプチド
をコードするＤＮＡ配列の一方の末端（末端フラグメントについて）または両方
の末端（内部フラグメントについて）から１つ以上のヌクレオチドを除去するこ
とによって生成され得る。変異させられたＤＮＡの発現によって、ポリペプチド
フラグメントを産生する。「末端を少しかじる（ｅｎｄ−ｎｉｂｂｌｉｎｇ）」
エンドヌクレアーゼでの消化によってもまた、フラグメントの配列（ａｒｒａｙ
）をコードするＤＮＡを生じる。タンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡ
もまた、ランダム剪断、制限消化、またはそれらの組合せもしくは両方によって
生成され得る。タンパク質フラグメントは、インタクトなタンパク質から直接生
成され得る。ペプチドは、プラスミン、トロンビン、トリプシン、キモトリプシ
ンまたはペプシンを含むがこれらに限定されないタンパク質分解性の酵素によっ
て、特異的に切断され得る。これらの酵素のそれぞれが、それが攻撃するペプチ
ド結合のタイプについて特異的である。トリプシンは、カルボニル基が塩基性の
アミノ酸（通常は、アルギニンまたはリジン）に由来するペプチド結合の加水分
解を触媒する。ペプシンおよびキモトリプシンは、トリプトファン、チロシン、
およびフェニルアラニンのような、芳香族アミノ酸に由来するペプチド結合の加
水分解を触媒する。切断されたタンパク質フラグメントの別のセットが、タンパ
ク質分解性の酵素に対して感受性である部位での切断を妨げることによって、生
成される。例えば、中程度の塩基性の溶液中のエチルトリフルオロチオアセテー
トとのリジンのε−アミノ酸基の反応によって、その隣接しているペプチド結合
がトリプシンによる加水分解に対してもはや感受性でないブロックされたアミノ
酸残基を生じる。タンパク質は、タンパク質分解性の酵素に対して感受性である
ペプチド結合を作製するように改変され得る。例えば、β−ハロエチルアミンで
のシステイン残基のアルキル化によって、トリプシンによって加水分解されるペ
プチド結合を生じる（Ｌｉｎｄｌｅｙ、（１９５６）Ｎａｔｕｒｅ １７８、６
４７）。さらに、特異的な残基でペプチド鎖を切断する化学的な試薬が使用され
得る。例えば、臭化シアンは、メチオニン残基でペプチドを切断する（Ｇｒｏｓ
ｓおよびＷｉｔｋｉｐ（１９６１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８３、１５１
０）。従って、改変因子、タンパク質分解性の酵素、および／または化学的な試
薬の種々の組合せを用いてタンパク質を処理することによって、タンパク質は、
フラグメントの重複を有することなく所望される長さのフラグメントに分けられ
得るか、または所望される長さの重複しているフラグメントに分けられ得る。

【００８６】 フラグメントはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相Ｆ ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏ
ｔ化学のような、当該分野で公知の技術を使用して化学的に合成され得る。Ｍｅ
ｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３：４５１（１９６７）。

【００８７】 フラグメントおよびアナログの産生および試験を可能にする先行技術の方法の
例が、以下に議論される。これらまたは同様の方法が、生物学的活性を有するこ
とが示され得る単離されたα４インテグリンアンタゴニストのフラグメントおよ
びアナログを作製しそしてスクリーニングするために使用され得る。α４サブユ
ニットを含有しているインテグリンアンタゴニストのフラグメントおよびアナロ
グが生物学的活性を有するかどうかを試験するための例示的な方法は、第ＩＶ節
および実施例において見出される。

【００８８】 （Ｄ．変更されたＤＮＡおよびペプチド配列の産生：ランダム法） タンパク質のアミノ酸配列変異体が、タンパク質またはその特定の部分をコー
ドするＤＮＡのランダム変異誘発によって調製され得る。有用な方法として、Ｐ
ＣＲ変異誘発および飽和変異誘発が挙げられる。ランダムなアミノ酸配列変異体
のライブラリーもまた、縮重オリゴヌクレオチド配列のセットの合成によって生
成され得る。変更されたＤＮＡおよびペプチドを使用して所定のタンパク質のア
ミノ酸変異体を作成する方法が、当該分野で周知である。このような方法の以下
の例は、本発明の範囲を限定するこをと意図するのではなく、単に、例示的な代
表的な技術を説明するために提供される。当業者は、これに関して、ＰＣＲ変異
誘発、飽和変異誘発、および縮重オリゴヌクレオチド変異誘発（以下で引用され
る参考文献に記載されており、そして本明細書中で参考として援用されている）
のような他の方法もまた有用であることを、認識する。ＰＣＲ変異誘発 ：例えば、Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １
、１１−１５を参照のこと。飽和変異誘発 ：１つの方法が、Ｍａｙｅｒｓら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
２９、２４２に一般的に記載されている。縮重オリゴヌクレオチド変異誘発 ：例えば、Ｈａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３
）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９，３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）、Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３，３２３およびＩｔａｋｕｒａら、Ｒｅｃｏ
ｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｐｒｏｃ．３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏ
ｓｉｕｍ ｏｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２７３−２８９頁（Ａ．Ｇ．
Ｗａｌｔｏｎ編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８１。

【００８９】 （Ｅ．変更されたＤＮＡおよびペプチド配列の産生：直接的な方法） ランダムではない、または指向された変異誘発は、単離されたポリペプチドの
公知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入、または置換を含む変異体を提供するた
めの、単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の特異的な配
列または特異的な部分中の変異を提供する。変異部位は、例えば、以下によって
個々にまたは一連で改変され得る：（１）最初に保存されたアミノ酸で、次いで
達成される結果に依存してさらなるラジカルなもの（ｒａｄｉｃａｌ ｃｈｏｉ
ｃｅｓ）で置換すること；（２）標的の残基を欠失させること；または（３）配
置された部位に隣接している同じまたは種々のクラスの残基を挿入すること、あ
るいは選択肢１〜３の組合せ。

【００９０】 明らかに、このような部位特異的方法は、Ｎ末端のシステイン（または機能的
に同等なもの）が疎水性部分についての接着部位を提供するように所定のポリペ
プチド配列中に導入され得る１つの方法である。部位特異的変異誘発の他の周知
の方法は、本明細書中で参考として援用されている、下記の参考文献において詳
細に記載されている。

【００９１】 アラニンスキャニング変異誘発：ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ（１
９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４、１０８１−１０８５）を参照のこと。

【００９２】 オリゴヌクレオチドによって媒介される変異誘発：例えば、Ａｄｅｌｍａｎら
（１９８３）ＤＮＡ ２、１８３を参照のこと。

【００９３】 カセット変異誘発：Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ ３４、３１５を参照
のこと。

【００９４】 組合せ変異誘発：例えば、Ｌａｄｎｅｒら、第ＷＯ８８／０６６３０号を参照
のこと。

【００９５】 ファージディスプレイストラテジー：例えば、Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：２６７、１６００７−１６０１０（１９９２）による総説
を参照のこと。

【００９６】 （Ｆ．α４インテグリンアンタゴニストの他の変異体） 変異体は、アミノ酸配列において、または配列を含まない様式において、ある
いはそれらの両方において、他のα４インテグリンアンタゴニストとは異なり得
る。本発明の最も好ましいポリペプチドは、インビボまたはインビトロでの（例
えば、それらのＮ末端の）化学的な誘導、ならびにアセチル化、メチル化、リン
酸化、アミド化、カルボキシル化、またはグリコシル化における可能性のある変
化を含む、好ましい配列以外の改変を有する。

【００９７】 他のアナログは、それらの配列が、ＴＡ２、あるいは米国特許第５，８４０，
２９９号または米国特許第５，８８８，５０７号；同第ＵＳ５，９３２，２１４
号またはＰＣＴ ＵＳ／９４／００２６６に見出される配列とは、１つ以上の保
存的なアミノ酸の置換によって、または１つ以上の非保存的なアミノ酸の置換に
よって、または単離されたタンパク質の生物学的活性を廃止しない欠失もしくは
挿入によって異なる、タンパク質またはその生物学的に活性なフラグメントを含
む。保存的な置換は、代表的には、以下のグループ内での置換のような、同様の
特徴を有する別のアミノ酸についての１つのアミノ酸の置換を含む：バリン、ア
ラニンおよびグリシン；ロイシンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグ
ルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびスレオニン；リジン
およびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性の疎水性
アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンがあげられる。極性の天然の
アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アス
パラギン、およびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性の）アミノ酸
として、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（
酸性の）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が上げられる。他
の保存的置換は、当業者に容易に公知であり得る。例えば、アミノ酸アラニンに
ついて、保存的な置換は、Ｄ−アラニン、グリシン、β−アラニン、Ｌ−システ
イン、およびＤ−システインの任意の１つから取り出され得る。リジンについて
は、置換は、Ｄ−リジン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモ−アルギニン、メ
チオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチン、またはＤ−オルニチンの任意の１つで
あり得る。

【００９８】 本発明において使用される他のアナログは、ペプチドの安定性を増大させる改
変を有するものである。このようなアナログは、例えば、ペプチド配列中に１つ
以上の非ペプチド結合（ペプチド結合を置き換える）を含み得る。天然に存在し
ているＬ−アミノ酸以外の残基（例えば、Ｄ−アミノ酸）、または天然には存在
していないかもしくは合成のアミノ酸（例えば、βもしくはγアミノ酸）を含む
アナログおよび環状のアナログもまた、含まれる。単離されたハリネズミポリペ
プチド中でのＬ−アミノ酸の代わりのＤ−アミノ酸の取りこみは、プロテアーゼ
に対するその耐性を増大させ得る。米国特許第５，２１９，９９０号（前出）を
参照のこと。

【００９９】 好ましい抗体ホモログは、ＴＡ２抗体のアミノ酸配列に対して少なくとも６０
％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同であるアミノ酸配列、
あるいは、例えば、米国特許第５，８４０，２９９号（例えば、配列番号１５−
軽鎖可変領域；配列番号１７−重鎖可変領域）；米国特許第５，９３２，２１４
号（例えば、配列番号２および４）；ならびに公開された特許出願番号第ＷＯ９
４／１６０９４号（これらの配列は、細胞株ＡＴＣＣ ＣＲＬ １１１７５の抗
ＶＬＡ４抗体中に見出される）に記載されているアミノ酸配列に対して少なくと
も６０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％相同である配列を含
む：。

【０１００】 （Ｇ．ポリマー結合体の形成） 本発明の広範な範囲内では、単一のポリマー分子は、α４インテグリンアンタ
ゴニストと結合体化することで使用され得るが、１つより多いポリマー分子が十
分に接着され得ることもまた意図される。本発明の結合体化されたα４インテグ
リンアンタゴニスト組成物は、インビボおよびインビボではない適用の両方にお
いて有用性を見出され得る。さらに、結合体化ポリマーは、目的の使用適用のた
めに適切である場合、任意の他の基、部分、または他の結合体化された種を、利
用し得る。例として、いくつかの適用においては、ＵＶ分解の耐性もしくは抗酸
化、またはポリマーに対して他の特性もしくは特徴を与える機能的な部分をポリ
マーに共有結合させることが、有用であり得る。さらなる例として、結合体化さ
れた材料全体の種々の特性または特徴を増強させるために、それを薬物分子に対
して反応性にし、そして架橋することを可能にするように、ポリマーを官能化す
ることが、いくつかの適用において利点であり得る。したがって、ポリマーは、
任意の官能基、反復している基、結合、または他の構成する構造を含み得る。こ
れらは、その意図される目的のために、結合体化されたα４インテグリンアンタ
ゴニスト組成物の効力を妨げない。本発明の他の目的および利点が、続く開示お
よび添付される特許請求の範囲からより完全に明らかである。

【０１０１】 これらの所望される特徴を達成するために有効に使用され得る例示的なポリマ
ーは、例示的な反応スキームにおいて本明細書中の以下に記載される。共有結合
されたアンタゴニスト／ポリマー結合体において、ポリマーは、官能化され得、
次いで不安定な結合を形成するようにアンタゴニストの遊離のアミノ酸にカップ
リングされ得る。

【０１０２】 α４インテグリンアンタゴニストは、最も好ましくは、ポリマー上の末端の反
応性の基を介して結合体化されるが、結合体はまた、非末端の反応性の基から分
岐され得る。反応性の基を有するポリマーは、本明細書中に「活性化されたポリ
マー」として称される。反応性の基は、遊離のアンタゴニスト分子上のアミノ基
または他の反応性の基と選択的に反応する。活性化されたポリマーは、反応し、
その結果、接着が任意の利用可能なα４インテグリンアンタゴニストのアミノ基
（例えば、リジンのαアミノ基またはεアミノ基）で生じ得る。遊離のカルボン
酸基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、酸化され
た炭水化物部分、および（利用可能である場合）α４インテグリンアンタゴニス
トのメルカプト基もまた、接着部位として使用され得る。

【０１０３】 ポリマーは、α４インテグリンアンタゴニスト分子上のどこにでも接着され得
るが、インテグリンアンタゴニスト（詳細には、タンパク質であるもの）に対す
るポリマーのカップリングの他の好ましい部位は、α４インテグリンアンタゴニ
ストのＮ末端である。第２の部位は、Ｃ末端またはその付近であり、そして（た
とえあるとしても）糖部分を介する。従って、本発明は、以下を意図する：（ｉ
）α４インテグリンアンタゴニストのＮ末端にカップリングされたポリマー結合
体；（ｉｉ）α４インテグリンアンタゴニストのＣ末端にカップリングされたポ
リマー結合体；（ｉｉｉ）糖カップリング結合体；ならびに（ｉｖ）α４インテ
グリンアンタゴニストのＮ−、Ｃ−、および糖−カップリングポリマー結合体。

【０１０４】 一般的には、アンタゴニスト濃度に依存して、１モルのアンタゴニストあたり
約１．０〜約１０モルの活性化されたポリマーが使用される。最終的な量は、生
成物の非特異的な改変を最少にしながら、反応の程度を最大にすることと、同時
に、最適な活性を維持する化学的な性質を定義すること、一方、可能な場合、同
時に、アンタゴニストの半減期を最適にすることの間での平衡である。好ましく
は、少なくとも約５０％のアンタゴニストの生物学的活性が保持され、そして最
も好ましくは、１００％が保持される。

【０１０５】 反応は、不活性なポリマーと生物学的に活性な材料とを反応させるために使用
される、任意の適切な当業者によって認識される方法によって行われ得る。一般
的には、このプロセスは、活性化されたポリマー（これは、少なくとも１つの末
端のヒドロキシル基を有し得る）を調製する工程、およびその後、処方のために
適切な可溶性のタンパク質を生じるように活性化されたポリマーとアンタゴニス
トを反応させる工程を含む。上記の改変反応は、１つ以上の工程を包含し得るい
くつかの方法によって行われ得る。

【０１０６】 上記のように、本発明の特定の実施形態は、ポリマーに対する連結のように、
α４インテグリンアンタゴニストのＮ末端を使用する。適切な従来の方法が、Ｎ
末端を改変されたα４インテグリンアンタゴニストを選択的に得るために利用可
能である。１つの方法は、減少アルキル化方法によって例示される。これは、適
切なα４インテグリンアンタゴニスト上での誘導のために利用可能な種々のタイ
プの第１級アミノ基（リジン上のεアミノ基対Ｎ末端のメチオニン上のアミノ基
）の異なる反応性を利用する。適切な選択条件下で、カルボニル基を含有するポ
リマーでの、そのＮ末端に適切なα４インテグリンアンタゴニストの実質的に選
択的な誘導が、達成され得る。反応は、リジン残基のεアミノ基と、α４インテ
グリンアンタゴニストのＮ末端残基のαアミノ基のものとの間でのｐＫａの差異
を利用することを可能にするｐＨで行われる。このタイプの化学反応は、当業者
に周知である。

【０１０７】 α４インテグリンアンタゴニスト（例えば、タンパク質）のＣ末端に対するＰ
ＥＧのようなポリアルキレングリコールポリマーを標的化するためのストラテジ
ーは、化学的な接着であるか、またはポリマー部分を標的化するために使用され
得る部位の遺伝的な操作である。例えば、タンパク質のＣ末端またはその付近の
部位でのＣｙｓの取り込みは、当該分野で認識されているマレイミド、ビニルス
ルホン、またはハロ酢酸によって活性化されたポリアルキレングリコール（例え
ば、ＰＥＧ）の誘導体を使用する特異的な改変を可能にする。これらの誘導体が
、Ｃｙｓについてのこれらの試薬の高い選択性に起因して、操作されたシステイ
ンの改変について特異的に使用され得る。標的化され得るヒスチジンタグ（Ｆａ
ｎｃｙら（１９９６）Ｃｈｅｍ．＆ Ｂｉｏｌ．３：５５１）またはタンパク質
上のさらなるグリコシル化部位の取り込みのような他のストラテジーは、α４イ
ンテグリンアンタゴニストのＣ末端を改変するための他の代替方法を示す。

【０１０８】 化学的な改変のために部位として糖を標的化するための方法もまた周知であり
、そしてしたがって、ポリアルキレングリコールポリマーが、直接および特異的
に、（たとえあるとしても）α４インテグリンアンタゴニスト上の糖に対して付
加され得るようである。これは、酸化を介して活性化されている。例えば、ポリ
エチレングリコールヒドラジドが、作成され得る。これは、アルデヒドおよびケ
トンとの縮合によって比較的安定なヒドラゾン結合を形成する。この特性は、酸
化されたオリゴ糖結合を介するタンパク質の改変のために使用されている。Ａｎ
ｄｒｅｓｚ，Ｈ．ら（１９７８）、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０
１を参照のこと。詳細には、ＰＥＧカルボキシメチルヒドラジドの硝酸での処理
は、ＰＥＧカルボキシメチルアジドを生じる。これは、アミノ基に対して反応性
である、求電子性の活性基である。この反応は、ポリアルキレングリコールによ
って改変されたタンパク質を十分に調製するために使用され得る。米国特許第４
，１０１，３８０号および同第４，１７９，３３７号を参照のこと。

【０１０９】 当業者は、多価のα４インテグリンアンタゴニスト組成物を形成するために、
タンパク質の架橋をさらに促進するための、チオールリンカーによって媒介され
る化学反応を認識される技術を使用し得る。詳細には、当業者は、過ヨウ素酸ナ
トリウムを用いて炭水化物部分に反応性のアルデヒドを作成し得、これによって
アルデヒドを介してシスタミン結合体を形成し得、そしてシスタミン上のチオー
ル基を介する架橋を誘導し得る。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ，Ｂ．ら（１９９１）、Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１８２４４−１８２４９およびＣｈｅｎ，Ｌ．
Ｌ．ら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１８２３７−１８２４
３を参照のこと。従って、このタイプの化学反応はまた、ポリアルキレングリコ
ールポリマーを用いる改変のためにも適切であり、ここではリンカーは、糖中に
取りこまれ、そしてポリアルキレングリコールポリマーがリンカーに対して付着
される。アミノチオールまたはヒドラジンを含有しているリンカーは、単一のポ
リマー基の付加を可能にするが、リンカーの構造は変化し得、その結果、複数の
ポリマーが付加されそして／またはα４インテグリンアンタゴニストに関するポ
リマーの空間的な方向が変更される。

【０１１０】 本発明の実施においては、Ｃ１〜Ｃ４アルキルポリアルキレングリコール（好
ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））残基、またはこのようなグリコ
ールのポリ（オキシ）アルキレングリコール残基が、目的のポリマーシステム中
に有利に取りこまれる。従って、タンパク質が付着されるポリマーは、ポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）のホモポリマーであり得るか、または全ての場合にお
いてポリマーが室温で水中に可溶性である場合、ポリオキシエチル化されたポリ
オールである。このようなポリマーの限定的ではない例として、ポリアルキレン
オキサイドホモポリマー（例えば、ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、
ポリオキシエチレン化グリコール、それらのコポリマー、およびブロックコポリ
マーの水可溶性が維持される場合、それらのブロックコポリマーが挙げられる。
ポリエチル化されたポリオールの例として、例えば、ポリオキシエチル化された
グリセロール、ポリオキシエチル化されたソルビトール、ポリオキシエチル化さ
れたグルコースなどが挙げられる。ポリオキシエチル化されたグリセロールのグ
リセロール骨格は、例えば、動物およびヒトにおいてモノ−、ジ−、およびトリ
グリセリドで天然に存在している同じ骨格である。従って、この分岐は、身体に
おいて外来因子としては、必ずしも見られない。

【０１１１】 ポリアルキレンオキサイドの代替として、デキストラン、ポリビニルピロリド
ン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、炭水化物に基づくポリマーな
どが、使用され得る。当業者は、上記のリストが単に例示であり、そして本明細
書中に記載されている品質を有している全てのポリマー材料が意図されることを
認識している。

【０１１２】 ポリマーは、任意の特定の分子量を有する必要はないが、分子量が約３００か
ら１００，０００の間が好ましい、より好ましくは、１０，０００から４０，０
００の間の分子量である。詳細には、２０，０００以上のサイズが、腎臓での濾
過に起因する産物の損失を妨げる点で最良である。

【０１１３】 ポリアルキレングリコール誘導体は、ポリアルキレングリコール誘導体の以下
の特性に関係している、本発明の実施においてポリマー−α４インテグリンアン
タゴニスト結合体の処方において多数の有利な特性を有する：抗原性または免疫
原性の応答を同時に誘発する間の水可溶性の改善；高い程度の生体適合性；ポリ
アルキレングリコール誘導体のインビボでの生体分解の非存在；および生存して
いる生物体による排泄の容易さ。

【０１１４】 さらに、本発明の別の局面においては、当業者は、結合体の性質が切断可能な
共有的な化学結合に関する、ポリマー成分に共有結合されたα４インテグリンア
ンタゴニストを利用し得る。これによって、ポリマーがα４インテグリンアンタ
ゴニストから切断され得る時間経過に関する制御を可能にする。α４インテグリ
ンアンタゴニストとポリマーとの間のこの共有結合は、化学的または酵素的反応
によって切断され得る。ポリマー−α４インテグリンアンタゴニスト産物は、受
容可能な量の活性を保持している。結果として、ポリエチレングリコールの一部
は、高い水可溶性および延長された血液の循環能力を有するポリマー−α４イン
テグリンアンタゴニスト結合体を与えるために、結合体化ポリマー中に存在する
。これらの改善された特徴の結果として、本発明は、活性なポリマー−α４イン
テグリンアンタゴニスト種、続くインビボでの適用におけるα４インテグリンア
ンタゴニスト自体の加水分解による切断、生体利用可能性の両方の、非経口的、
鼻腔による、および経口による送達を意図する。

【０１１５】 本明細書中に記載されている反応模式図が、説明の目的だけのために提供され
、そして例えば、非経口および経口投与のための可溶性、安定性、ならびに細胞
膜の親和性を達成するために、α４インテグリンアンタゴニストの改変において
利用され得ることが、理解されるべきである。α４インテグリンアンタゴニスト
結合体の活性および安定性は、いくつかの方法において、異なる分子サイズのポ
リマーを使用することによって、変更され得る。結合体の可溶性は、ポリマー組
成物中に組み込まれるポリエチレングリコールフラグメントの割合および大きさ
を変化させることによって、変更され得る。

【０１１６】 （ＩＩＩ．治療適用） 単位投与量形態を生ずるようにキャリア物質と混合され得る有効成分の量は、
処置される宿主、および特定の投与の形態に依存して変化する。しかし、任意の
特定の患者についての特別な投与量および処置レジメンは、使用される特異的な
化合物の活性、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、排出速
度、薬物の組合せ、および処置する医師の判断、ならびに処置される特定の疾患
の重篤度を含む、種々の因子に依存することが、理解されるべきである。有効成
分の量はまた、任意の場合、成分が同時に投与される治療薬または予防薬に依存
し得る。

【０１１７】 細胞の接着を妨げる、抑制する、または阻害するために有効である本発明の化
合物の投与量および用量の割合は、種々の因子（例えば、インヒビターの性質、
患者の大きさ、処置の目的、処置される病因の性質、使用される特異的な薬学的
組成物、および処置する医師の判断に依存する。１日あたり約０．００１から約
１００ｍｇ／ｋｇ体重の間、好ましくは、１日あたり約０．１から約５０ｍｇ／
ｋｇ体重の間の有効成分化合物の投与量レベルが、有用である。最も好ましくは
、ＶＬＡ−４結合剤は、抗体または抗体誘導体の場合、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重
／日から約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日の間、好ましくは、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重
／日から約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の用量の範囲で、そして１から１４日ご
との間隔で、投与される。非抗体または低分子の結合剤については、用量の範囲
は、好ましくは、等モル量からこれらの抗体の量までの間であるはずであり。好
ましくは、抗体組成物は、少なくとも１ｍｇ／ｍｌの抗体の血漿レベルを提供す
るために有効な量で投与される。投与量の最適化は、結合剤の投与、続くインビ
ボで所定の用量で投与された後、経時的なこの薬剤によるインテグリン陽性細胞
のコーティングの評価によって、決定され得る。

【０１１８】 投与された因子の存在は、それ自体が標識されている（例えば、蛍光によって
標識されている）、同じ因子に対して結合する個々の細胞の不能性または減少し
た能力によって、インビトロ（またはエキソビボ）で検出され得る。好ましい投
与量は、インテグリン陽性細胞のほぼ大部分の検出可能なコーティングを生じる
。好ましくは、抗体ホモログの場合において、コーティングは、１〜１４日間維
持される。

【０１１９】 アンタゴニストを導入するための別の好ましい形態は、薬理学的薬剤との併用
治療を通じたものである。薬理学的薬剤は、好ましくは、急性の脳の損傷を処置
することにおいて、ある程度の治療効果を有する薬剤である。このような薬剤と
して、血栓崩壊因子（例えば、プラスミノーゲン、またはウロキナーゼ）、Ｓｅ
ｌｆｏｔｅｌ ｔｍまたはＡｐｔｉｇａｎｅｌ ｔｍのような興奮毒性の機構を
標的化する薬剤、Ｌｕｂｅｌｕｚｏｌｅ ｔｍのような、ニューロンの損傷に関
係している酸化窒素を標的化する薬剤、Ｔｉｒｉｌｉｚａｄ ｔｍのような、虚
血に関係しているニューロンの細胞膜の損傷を標的化する薬剤、Ｅｎｌｉｍｏｍ
ａｂ ｔｍのような抗炎症機構を標的化する薬剤が挙げられるが、これらに限定
されない。薬剤は、アンタゴニストの投与の前、その間、またはその後のいずれ
かで、本発明のα４インテグリンアンタゴニスト組み合わせられ得る。

【０１２０】 （ＩＶ．処置のための処方物および方法） 本発明に基く処置方法は、活性な化合物の有効量を被験体に対して内部的にま
たは局所的に投与することを含む。本発明の方法における活性な化合物の用量は
、有効であり、非毒性である量である。慣用的な臨床試験を利用する当業者は、
処置される特定の病気についての最適な用量を決定することが可能である。

【０１２１】 神経学的な回復のための標準的な試験（例えば、ＮＩＨ Ｓｔｒｏｋｅ Ｓｃ
ａｌｅ、Ｂａｒｔｈｅｌ Ｉｎｄｅｘ，改変されたＲａｎｋｉｎ Ｓｃａｌｅ，
Ｇｌａｓｇｏｗ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｓｃａｌｅ）が当業者によって用いられ、効
果を決定する。所望される用量が、１日に１回以上、静脈内で、経口的に、直腸
的に、非経口的に、鼻腔内に、局所的に、または吸入によって、被験体に対して
投与される。所望される用量はまた、連続的な静脈注入によっても与えられ得る
。

【０１２２】 本発明に基くα４インテグリンインヒビターの非経口的な投与においては、化
合物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬などを含み得る、注射用水溶液中に処方され
得る。即興的な注射溶液は、物質が実験する当業者に全て周知である希釈剤、分
散および表面の活性化剤、結合剤、および潤滑剤を含み得る、滅菌の丸剤、顆粒
剤、または錠剤から調製され得る。

【０１２３】 経口投与の場合においては、化合物の細かい散剤または顆粒剤が、希釈剤、な
らびに分散および表面の活性化因子とともに処方され得、そして水中またはシロ
ップ中に、乾燥状態でカプセルまたはカシェ剤中に、あるいは懸濁剤が含まれ得
る非水性の懸濁液中に調製され得る。化合物はまた、最適な結合剤および潤滑剤
とともに錠剤の形態でも投与され得るか、あるいは水またはシロップもしくは油
中に、あるいは水／油エマルジョン中の懸濁液で投与され得、そして香味剤、保
存料、懸濁剤、増量剤、および乳濁剤を含み得る。経口投与のための顆粒剤また
は錠剤はコーティングされ得るか、または薬学分野の当業者に周知である他の薬
学的に受容可能な薬剤および処方物が利用され得る。

【０１２４】 固体キャリアおよび液体キャリアもまた使用され得る。固体のキャリアとして
、デンプン、ラクトース、カルシウム、硫酸ニ水和物、白土、スクロース、タル
ク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、および
ステアリン酸が挙げられる。液体のキャリアとして、シロップ、ピーナッツ油、
オリーブ油、生理食塩水、および水が挙げられる。軟膏およびクリーム剤が、所
望される放出特性を提供するように選択された種々のアクリルベースのポリマー
のような、公知のポリマー物質を使用して調製される。坐剤が、ポリエチレング
リコールおよびココアバターのような標準的な基剤から調製される。

【０１２５】 本発明によって提供される処置方法は、患者のＣＮＳに対する損傷を処置する
ための方法に関する。この方法は、α４インテグリンを投与する工程を包含する
。他の実施形態においては、この方法は、患者に対する薬理学的薬剤の投与をさ
らに包含する。好ましい実施形態においては、薬理学的薬剤は血栓崩壊剤、神経
保護剤、抗炎症剤、ステロイド、サイトカイン、成長因子である。本発明におい
て使用される血栓崩壊剤は、好ましくは、組織プラスミノーゲン活性化因子また
はウロキナーゼである。本発明において使用される神経保護剤は、好ましくは、
以下からなる群より選択されるレセプター：Ｎ−メチル−Ｄアスパラギンレセプ
ター（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサゾ
ールプロピオン酸レセプター（ＡＭＰＡ）、グリシンレセプター、カルシウムチ
ャンネルレセプター、ブラジキニンＢ２レセプター、およびナトリウムチャネル
レセプター、あるいは以下からなる群より選択されるレセプター：ブラジキニン
Ｂ１レセプター、α−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）レセプター、およびアデノシンＡ
１レセプター、に対するアゴニストである。本発明において使用される抗炎症剤
は、インターロイキン−１および腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーを含む。

【０１２６】 本発明によって意図されるように、この処置方法において使用されるα４イン
テグリンアンタゴニストは、抗体ホモログであり得、そして好ましくは、ヒト化
抗体ホモログまたは抗体ホモログのフラグメントであり得る。他の実施形態にお
いては、抗体ホモログは、ポリマー分子に連結され得る。あるいは、本発明の方
法において、α４インテグリンアンタゴニストは、単一のα４サブユニットを含
有するインテグリン、または１つ以上のαサブユニットを含有するインテグリン
をアンタゴナイズし得る。

【０１２７】 （実施例） （実施例１：ラットにおける可逆的な中大脳動脈の閉塞についてのプロトコー
ル） 雄性のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）または自然発生的な高血圧のラ
ット（ＳＨＲＳ）を、イソフルランを使用して麻酔し、そして右側中大脳動脈（
ＭＣＡＯ）を、内頚動脈から中大脳動脈（ＭＣＡ）の起点まで、４−０のナイロ
ンモノフィラメントの挿入によって閉塞させた（Ｚｅａ Ｌｏｎｇａら、１９８
９ Ｓｔｒｏｋｅ ２０：８４）。１時間後、フィラメントを回収し、虚血性の
領域を再潅流し、そして動物を回復させた。２４時間後に、ラットを屠殺し、そ
の時点で、脳を取りだし、そして梗塞の容量を定量するために組織学的に分析し
た。

【０１２８】 動物のグループを、浸透圧ミニポンプを介した連続的な皮下注入によって、ビ
ヒクル（ＰＢＳ）またはブラジキニンＢ_２レセプターアンタゴニストＨｏｅ １
４０（Ｈｏｅｃｈｓｔ）のいずれかで処置した。準備したミニ浸透圧ポンプ（Ａ
ｌｚａ Ｃｏｒｐ．，）を、脳虚血の誘導の直前に、頚部の首筋で皮下の空間に
移植した。ポンプを、３００ｎｇ／ｋｇ／分のＨｏｅ １４０を放出するように
充填し、そして８μｌ／ｈの速度で化合物またはビヒクルを送達した。

【０１２９】 別々の実験において、動物のグループを、ビヒクル（滅菌等張生理食塩水）、
ＴＡ２（マウス抗ラットＶＬＡ４；Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎ
ｃ．）、またはアイソタイプコントロール抗体（マウス抗ヒトＬＦＡ３；Ｂｉｏ
ｇｅｎ，Ｉｎｃ．から得た）のいずれかで処置した。全ての処置を、手術の２４
時間前に静脈投与した（２．５ｍｇ／ｋｇまたは適切な容量のビヒクル）。

【０１３０】 （実施例２：可逆的な中大脳動脈の梗塞のモデルの結果） ＭＣＡＯを受けたビヒクル処置コントロールラットは、脳の皮質から皮質下の
領域にわたる広範囲の病変を維持した。虚血性の脳半球は、顕著に腫大し、そし
て有意な挙動の欠乏が観察された（例えば、順間および手足の衰弱を生じる半身
麻痺）。自然発生的な高血圧のラットは、同じ外科手術手順に供したＳｐｒａｇ
ｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットより顕著で再現性のある脳梗塞を維持した。梗塞の容
量は、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．で示す。統計学的な分析を、不対のスチューデント
ｔテスト（^＊は、ｐ＜０．０５を示し、^＊＊はｐ＜０．０１を示す）を使用して
行った。

【０１３１】 ブラジキニンＢ_２レセプターアンタゴニストＨｏｅ １４０（ｎ＝９）による
処置は、ＳＨＲ中の脳虚血の誘導の２４時間後に測定したビヒクル処置コントロ
ール（ｎ＝８）と比較して、総量、皮質および皮質下の梗塞の容量を、それぞれ
、３７％、４３％、および１７％、有意に減少させた。ＳＤラットにおいて、同
じ容量のＨｏｅ １４０（ｎ＝６）での処置は、脳虚血の誘導の２４時間後に測
定したビヒクル処置コントロール（ｎ＝７）と比較して、総量、皮質および皮質
下の梗塞の容量を、それぞれ、５７％、９３％、および２４％に減少させた。こ
れらのデータは、以前の知見（Ｒｅｌｔｏｎら、１９９７ Ｓｔｒｏｋｅ ２８
：１４３０）と一致しており、そしてポジティブコントロールとして得られた。

【０１３２】 抗α４抗体でのＳＨＲの前処置においては、大脳の虚血の誘導の２４時間前の
ＴＡ−２（２．５ｍｇ／ｋｇのｉｖ、ｎ＝１０）は、脳虚血の誘導の２４時間後
に測定した同じ用量のアイソタイプコントロール抗体で処置した動物（ｎ＝１５
）と比較して、総量、皮質および皮質下の梗塞の容量を、それぞれ、４３％、４
７％、および３３％、減少させた。同じプロトコルを使用するＤＥラットにおい
ては、総量、皮質および皮質下の梗塞の容量は、それぞれ、６４％、６５％、お
よび３８％、減少した。

【０１３３】 図１Ａおよび１Ｂのグラフは、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙおよび自然発生
的な高血圧のラットにおいて、６０分間のＭＣＡＯの２４時間後の梗塞の大きさ
に対するｈｏｅ１４０の影響を示す。図は、ビヒクル処置コントロール動物と比
較した、連続的な皮下注射による、ｈｏｅ １４０（３００ｎｇ／ｋｇ／分）で
の処置後の脳梗塞の阻害を示す。梗塞の大きさは、ラットの両方の株において脳
の皮質および皮質下の領域において減少した。

【０１３４】 図２Ａおよび２Ｂのグラフは、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙおよび自然発生
的な高血圧のラットにおいて、６０分間のＭＣＡＯの２４時間後の梗塞の大きさ
に対するラットのα４抗体（ＴＡ−２、２．５ｍｇ／ｋｇ）の影響を示す。図は
、アイソタイプコントロール抗体で処置した動物と比較した、ＴＡ−２抗体での
静脈内での前処置後の脳梗塞の有意な阻害を示す。脳の損傷に対する防御が、ラ
ットの両方の株において観察された。

【０１３５】 これらのデータは、ラットの可逆的な限局的な脳虚血のモデルにおけるαイン
テグリンの阻害の防御効果を示す。このモデルの病理学は、ヒトの発作の状態の
臨床的な表現であり、α４サブユニットを含有するインテグリンのインヒビター
が、これおよび他の虚血に関係する障害の処置において大きな利益を有し得るこ
とを示す。

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】 図１Ａは、ｈｏｅ １４０（３００ｎｇ／ｋｇ／分）およびビヒクルコントロ
ールでの処置の後の、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの脳の皮質および皮
質下の領域での梗塞の容量（ｍｍ^３）のグラフを示す。

【図１Ｂ】 図１Ｂは、ｈｏｅ １４０（３００ｎｇ／ｋｇ／分）およびビヒクルコントロ
ールでの処置の後の、高血圧易発症性のラットの脳の皮質および皮質下の領域で
の梗塞の容量（ｍｍ^３）のグラフを示す。

【図２Ａ】 図２Ａは、抗ラットα４抗体（ＴＡ−２、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびイソ型コ
ントロール抗体での処置の後の、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの脳の皮
質および皮質下の領域での梗塞の容量（ｍｍ^３）のグラフを示す。

【図２Ｂ】 図２Ｂは、抗ラットα４抗体（ＴＡ−２、２．５ｍｇ／ｋｇ）およびイソ型コ
ントロール抗体での処置の後の、自然発生による高血圧症のラットの脳の皮質お
よび皮質下の領域での梗塞の容量（ｍｍ^３）のグラフを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｐ 9/10 17/02 45/06 25/00 Ａ６１Ｐ 9/00 29/00 9/10 Ａ６１Ｋ 37/02 17/02 37/36 25/00 37/24 29/00 37/547 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ロブ， ロイ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02090， ウエストウッド， キャントン ストリート 569 (72)発明者 ホエーリー， エリック アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01845， ノース アンドーバー， カー ルトン レーン 224 (72)発明者 アダムス， スティーブ アメリカ合衆国 マサチューセッツ 01810， アンドーバー， バークレー レーン 12 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA17 AA20 BA01 BA08 BA44 CA62 DA01 DA13 DA25 DB22 DC05 MA02 ZA021 ZA022 ZA361 ZA362 ZA891 ZA892 4C085 AA13 AA14 AA21 AA23 AA24 BB33 BB34 BB35 BB36 BB37 BB41 BB43 EE01 EE03

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 中枢神経系損傷を処置する必要のある患者において中枢神経
   系損傷を処置する方法であって、該方法は、α４インテグリンアンタゴニストの
   投与を包含する、方法。
2. 【請求項２】 前記投与工程が、前記患者に薬理学的薬剤をさらに投与する
   工程を包含する、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記中枢神経系損傷が、発作、外傷性脳損傷、または外傷性
   脊髄損傷である、請求項１または２に記載の方法。
4. 【請求項４】 前記損傷が、虚血性または出血性である、請求項３に記載の
   方法。
5. 【請求項５】 前記薬剤が、血栓崩壊性である、請求項２に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記血栓崩壊性薬剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子お
   よびウロキナーゼからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
7. 【請求項７】 前記薬剤が、神経保護剤である、請求項２に記載の方法。
8. 【請求項８】 前記薬剤が、抗炎症剤である、請求項２に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記薬剤が、ステロイドである、請求項２に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記薬剤が、サイトカインまたは成長因子である、請求項
    ２に記載の方法。
11. 【請求項１１】 請求項７に記載の方法であって、前記神経保護剤が、レセ
    プターのアンタゴニストであり、該レセプターは、以下： Ｎ−メチル−Ｄアスパラギン酸レセプター（ＮＭＤＡ）、α−アミノ−３−ヒド
    ロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾールプロピオン酸レセプター（ＡＭＰＡ
    ）、グリシンレセプター、カルシウムチャネルレセプター、ブラジキニンＢ２レ
    セプター、およびナトリウムチャネルレセプター、 からなる群より選択される、方法。
12. 【請求項１２】 請求項８に記載の方法であって、前記抗炎症剤が、インタ
    ーロイキン−１、および腫瘍壊死因子ファミリーメンバーからなる群より選択さ
    れる、方法。
13. 【請求項１３】 請求項７に記載の方法であって、前記神経保護剤が、レセ
    プターのアゴニストであり、該レセプターは、以下： ブラジキニンＢ１レセプター、α−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）レセプター、および
    アデノシンＡ１レセプター、 からなる群より選択される、方法。
14. 【請求項１４】 前記損傷が、虚血である、請求項４に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記薬学的薬剤が、血栓崩壊剤である、請求項１４に記載
    の方法。
16. 【請求項１６】 前記血栓崩壊剤が、組織プラスミノーゲン活性化因子およ
    びウロキナーゼからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記薬剤が、神経保護剤である、請求項１４に記載の方法
    。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法であって、前記薬剤が、レセプタ
    ーのアンタゴニストであり、該レセプターは、以下： ＮＭＤＡレセプター、ＡＭＰＡレセプター、グリシンレセプター、カルシウムチ
    ャネルレセプター、ナトリウムチャネルレセプター、およびブラジキニンＢ２レ
    セプター、 からなる群より選択される、方法。
19. 【請求項１９】 前記薬剤が、抗炎症剤である、請求項１４に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記抗炎症剤が、インターロイキン−１、および腫瘍壊死
    因子ファミリーからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
21. 【請求項２１】 請求項１７に記載の方法であって、前記神経保護剤が、レ
    セプターのアゴニストであり、該レセプターは、以下： ブラジキニンＢ１レセプター、ＧＡＢＡレセプター、およびアデノシンＡ１レセ
    プター、 からなる群より選択される、方法。
22. 【請求項２２】 続発性中枢神経系損傷を処置する必要のある患者において
    、虚血性発作に起因する続発性中枢神経系損傷を処置する方法であって、該方法
    は、α４インテグリンアンタゴニストの投与を包含する、方法。
23. 【請求項２３】 前記中枢神経系損傷が、発作、外傷性脳損傷、および外傷
    性脊髄損傷である、請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記発作が、虚血性発作または出血性発作である、請求項
    ２２に記載の方法。
25. 【請求項２５】 前記続発性脳損傷が、出血性変化（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉ
    ｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）または大脳血管痙攣（ｃｅｒｅｂｒａｌ
    ｖａｓｏｓｐａｓｍ）である、請求項２２に記載の方法。
26. 【請求項２６】 前記α４インテグリンアンタゴニストが、抗体ホモログで
    ある、請求項１または２２に記載の方法。
27. 【請求項２７】 前記抗体ホモログが、ヒト化抗体ホモログである、請求項
    ２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 前記抗体ホモログが、抗体ホモログのフラグメントである
    、請求項２６に記載の方法。
29. 【請求項２９】 前記抗体ホモログが、ポリマー分子に連結される、請求項
    ２６に記載の方法。
30. 【請求項３０】 前記α４インテグリンアンタゴニストが、単一のα４サブ
    ユニットを含むインテグリンをアンタゴナイズし得る、請求項１または２２に記
    載の方法。
31. 【請求項３１】 前記α４インテグリンアンタゴニストが、１を超えるα４
    サブユニットを含むインテグリンをアンタゴナイズし得る、請求項１または２２
    に記載の方法。