ES2335643T3 - Metodos de tratamiento de lesion isquemica o hemorragica del sistema nervioso central usando antagonistas anti-integrinas alfa 4. - Google Patents

Abstract

Uso de un anticuerpo anti-α4 o un fragmento de unión a α4 del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones de la médula espinal.

Description

Métodos de tratamiento de lesión isquémica o hemorrágica del sistema nervioso central usando antagonistas anti-integrinas \alpha4.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de un anticuerpo anti-\alpha4 a un fragmento de unión a \alpha4 del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones de la médula espinal. La presente invención divulga en general, el uso de anticuerpos anti-\alpha4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesión aguda del sistema nervioso central (SNC). En particular, la invención divulga el uso de anticuerpos anti-integrinas \alpha4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de daño en el SNC producido por traumatismo craneoencefálico, lesión de la médula espinal o ictus, incluyendo lesiones isquémicas y hemorrágicas. El anticuerpo anti-integrina \alpha4 elegido se puede usar como el único agente terapéutico o en combinación con otros agentes farmacológicos.

Antecedentes de la invención

Las lesiones agudas del sistema nervioso central ("SNC") abarcan una amplia variedad de lesiones médicas y traumáticas al cerebro y la médula espinal. Por ejemplo, el ictus es la tercera causa principal de muerte en el mundo desarrollado, sucediendo un ictus aproximadamente cada minuto en los Estados Unidos. La tasa de mortalidad es alrededor del 30% pero más de 4 millones de supervivientes de ictus están vivos hoy día, la mayoría de estos individuos tienen grados variables de discapacidad. Los ensayos clínicos tienen aún que demostrar neuroprotección en el ictus isquémico (es decir, ictus relacionado con la interrupción del flujo sanguíneo debido a la formación de coagulo/trombo) y médula espinal. La terapia trombolítica (definida como el uso de un agente que produce la disolución o destrucción de un trombo) tiene muchas limitaciones, pero permanece como la única forma aprobada de tratamiento para ictus isquémico agudo. Las estrategias actuales que se están probando en clínica para inhibir la lesión cerebral isquémica se dirigen a mecanismos excitotóxicos, daño neuronal asociado con óxido nítrico y daño en la membrana celular neuronal asociado a isquemia. Las estrategias de investigación preclínica también se dirigen a mecanismos antiapoptóticos y antiinflamatorios.

Las respuestas patofisiológicas al traumatismo craneoencefálico o TCE (por ejemplo, traumatismo cerebral producido por, entre otras cosas accidentes en la cabeza o heridas en la cabeza) son similares en muchos aspectos a las del ictus y se están tomando planteamientos similares para desarrollar agentes terapéuticos para el tratamiento del TCE. Se puede determinar si un ictus está producido o no por mecanismos isquémicos o hemorrágicos mediante un TAC u otros procedimientos clínicos y el modo de tratamiento posterior dependerá de los resultados de este cribado.

La adhesión celular y el tráfico a través de la superficie de contacto vascular desempeñan un papel esencial en procesos tanto fisiológicos como patofisiológicos de la lesión cerebral aguda. De interés particular en la patología de la lesión cerebral isquémica son los leucocitos polimorfonucleares y las células T, que se han implicado en el desarrollo de daño cerebral después de ictus experimental (Garcia et al 1994, Am. J. Pathol. 144:188; Becker et al, 1997 PNAS 94:10873). Se piensa que la infiltración celular en el cerebro se produce después de la lesión cerebral y puede contribuir a la evolución de la enfermedad. De esta manera, una lesión cerebral secundaria (por ejemplo, transformación hemorrágica, vasoespasmo cerebral) también se puede producir a partir de una lesión cerebral aguda en un sujeto. La lesión de la medula espinal (LME), como el TCE se produce en una población joven saludable pero comparte muchas similitudes patológicas con los cambios que se producen en el cerebro después de un ictus. A la luz de tales mecanismos comunes se están desarrollando planteamientos terapéuticos similares a los del ictus y TCE para el tratamiento de la LME.

Las interacciones célula-célula o célula-matriz están mediadas a través de varias familias de moléculas de adhesión celular, una de tales familias incluye las integrinas. Las integrinas son glicoproteínas estructural y funcionalmente relacionadas que consisten en varios dominios de receptores transmembrana heterodiméricos alfa (alfa 1, alfa 2, hasta alfa 11 en la actualidad) y beta (beta 1 y beta 7) encontrados en varios combinaciones en virtualmente cada tipo de célula de mamífero (para revisiones véase: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., "The Pharmacology of the Integrins" Medicinal Research Rev. Vol. 195 (1994) y V. W. Engleman et al., "Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets" en Ann, Revs. Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191). Se han descrito dos integrinas que contienen subunidades alfa4 y se designan alfa4beta1 (VLA-4) y alfa4beta7.

Experimentos previos mostraron el aumento del receptor de alfa4beta1 y alfa4beta7, VCAM-1 en el cerebro después de lesión isquémica, pero no se describieron datos que demuestren un papel funcional en la enfermedad (Jander et al, 1996, J. NeuroImmunol. 70: 75). VLA-4 y alfa4beta7 se expresan en leucocitos mononucleares (véase Lobb y Adams, 1994; J. Clin. Invest. 94:1722).

Soilu-Hanninen et al. (1997, J. Neuroimmunol. 72:95-105) mostraron que la terapia con un anticuerpo monoclonal contra VLA-4 en un modelo de EAE (encefalomielitis alérgica experimental) en ratón disminuyó tanto los signos clínicos como los histopatológicos de EAE, disminuyó la inducción de VCAM-1 en vasos cerebrales y disminuyó la infiltración de células VLA-4^{+} en el cerebro. Yednock et al. (1992, Nature 356:63-66) mostraron que el tratamiento in vivo con anticuerpos contra VLA-4 previno eficazmente la acumulación de leucocitos y el desarrollo de EAE en un modelo en rata, y se menciona que VLA-4 tiene un papel prominente en la adhesión de leucocitos a las vénulas cerebrales inflamadas en un modelo de EAE.

Sería útil desarrollar métodos de miembros antagonizantes de la familia de integrinas en este contexto. Además, sería útil desarrollar una modalidad terapéutica para el ictus que sea eficaz tanto si la lesión es isquémica como hemorrágica.

Compendio de la invención

Hasta la presente divulgación no se había definido el papel patológico de las integrinas que contienen la subunidad alfa4 en la lesión del SNC (por ejemplo, isquemia cerebral).

La presente solicitud se refiere a los siguientes aspectos:

Aspecto 1. Uso de un anticuerpo anti-a4 o un fragmento de unión a a4 del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones de médula espinal.

Aspecto 2. El uso del aspecto 1, en donde la composición farmacéutica comprende además un agente farmacológico.

Aspecto 3. El uso del aspecto 2, en donde el agente es un agente neuroprotector.

Aspecto 4. El uso del aspecto 2, en donde el agente es un agente antiinflamatorio.

Aspecto 5. El uso del aspecto 2, en donde el agente es un esteroide.

Aspecto 6. El uso del aspecto 2, en donde el agente es una citoquina o un factor de crecimiento.

Aspecto 7. El uso del aspecto 3, en donde el agente neuroprotector es un antagonista de un receptor, el receptor seleccionado del grupo que consiste en: receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA), receptor del ácido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), receptor de glicina, receptor canal de calcio, receptor B2 de bradiquinina y receptor canal de sodio.

Aspecto 8. El uso del aspecto 4, en donde el agente antiinflamatorio se selecciona del grupo que consiste en interleuquina-1 y miembros de la familia del factor de necrosis tumoral.

Aspecto 9. El uso del aspecto 3, en donde el agente neuroprotector es un agonista de un receptor, el receptor seleccionado del grupo que consiste en: receptor B1 de bradiquinina, receptor del ácido a-aminobutírico (GABA) y receptor A1 de adenosina.

Aspecto 10. El uso del aspecto 2, en donde el agente farmacológico es un agente trombolítico.

Aspecto 11. El uso del aspecto 10, en donde el agente trombolítico se selecciona del grupo que consiste en activador tisular de plasminógeno y uroquinasa.

Aspecto 12. El uso de cualquiera de los aspectos 1 a 11, en donde el anticuerpo anti-a4 o fragmento de unión a a4 del mismo es un anticuerpo monoclonal anti-a4 o un fragmento de unión a a4 del mismo.

Aspecto 13. El uso de cualquiera de los aspectos 1 a 12, en donde el anticuerpo anti-a4 o fragmento de unión a a4 del mismo es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-a4 o un fragmento de unión a a4 del mismo.

Aspecto 14. El uso de cualquiera de los aspectos 1 a 13, en donde el anticuerpo anti-a4 o fragmento de unión a a4 del mismo es un anticuerpo monoclonal humano anti-a4 o un fragmento de unión a a4 del mismo.

Aspecto 15. El uso de cualquiera de los aspectos 1 a 13, en donde el anticuerpo anti-a4 o fragmento de unión a a4 del mismo es un anticuerpo quimérico anti-a4 o un fragmento de unión a a4 del mismo.

Aspecto 16. El uso de cualquiera de los aspectos 1 a 15, en donde el fragmento de unión a a4 es un fragmento Fab, Fab', F(ab')2 o Fv.

Aspecto 17. El uso de cualquiera de los aspectos 1 a 16, en donde el anticuerpo anti-a4 o fragmento de unión a a4 del mismo es un anticuerpo anti-a4 específico de epítopo B o un fragmento de unión a a4 del mismo.

Aspecto 18. El uso de cualquiera de los aspectos 1 a 17, en donde el anticuerpo anti-a4 o fragmento de unión a a4 del mismo está unido a una molécula polimérica.

La presente invención divulga en parte el efecto protector de inhibir integrinas que contienen la subunidad alfa4 en un modelo de rata de isquemia cerebral focal. La presente invención describe y divulga el uso de inhibidores de alfa4beta1 y/o alfa4beta7 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar lesiones del SNC, tal como ictus.

En un aspecto, la invención divulga el uso de un anticuerpo anti-\alpha4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesión aguda del SNC en un paciente en necesidad de tal tratamiento, que comprende la administración de un antagonista de integrina que contiene la subunidad alfa4. Otro aspecto divulga el uso de un anticuerpo anti-\alpha4 para la preparación de una composición farmacéutica, en donde se va a administrar además un agente farmacológico a un paciente. Preferiblemente, la lesión aguda del SNC es ictus, traumatismo craneoencefálico o lesión de la médula espinal. En algunas formas de realización, el ictus es ictus isquémico o hemorrágico.

El agente farmacológico puede ser un agente trombolítico tal como activador tisular de plasminógeno o uroquinasa o puede ser un agente neuroprotector o un agente antiinflamatorio. En ciertos aspectos de la invención, el agente neuroprotector es un antagonista de un receptor, el receptor se selecciona del grupo del grupo que consiste en: receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA), receptor del ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), receptor de glicina, receptor canal de calcio, receptor B2 de bradiquinina y receptor canal de sodio. En otros aspectos de la invención, el agente antiinflamatorio se selecciona del grupo que consiste en interleuquina-1 y miembros de la familia del factor de necrosis tumoral. El agente neuroprotector también puede ser un agonista de un receptor, el receptor se selecciona del grupo que consiste en: receptor B1 de bradiquinina, receptor del ácido \gamma-aminobutírico (GABA) y receptor A1 de adenosina.

La invención divulga además el uso de un anticuerpo anti-\alpha4 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de daño cerebral secundario resultante de una lesión isquémica en un paciente en necesidad de tal tratamiento, en donde se va a administrar un anticuerpo contra una integrina que contiene una subunidad \alpha4.

En un aspecto, la presente invención divulga el uso de un inhibidor de las integrinas que contienen la subunidad alfa4, alfa4beta1 o alfa4beta7, es decir, un anticuerpo anti-\alpha4, solo o conjuntamente como el agente terapéutico, o solo o conjuntamente en combinación con otros agentes terapéuticos para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de ictus isquémico o hemorrágico.

En otro aspecto, la presente invención divulga el uso de un inhibidor de las integrinas que contienen la subunidad alfa4, alfa4beta1 o alfa4beta7, es decir, un anticuerpo anti-\alpha4, solo o conjuntamente como el agente terapéutico, o solo o conjuntamente en combinación con otros agentes terapéuticos para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de traumatismo craneoencefálico.

La presente invención particularmente proporciona el uso de un inhibidor de las integrinas que contienen la subunidad alfa4, alfa4beta1 o alfa4beta7, es decir, un anticuerpo anti-\alpha4, solo o conjuntamente como el agente terapéutico, o solo o conjuntamente en combinación con otros agentes terapéuticos para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesión de médula espinal.

En un aspecto adicional, esta invención divulga el uso de un inhibidor de las integrinas que contienen la subunidad alfa4, alfa4beta1 o alfa4beta7, es decir, un anticuerpo anti-\alpha4, solo o conjuntamente como el agente terapéutico, o solo o conjuntamente en combinación con otros agentes terapéuticos para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de daño cerebral secundario que se produce como consecuencia de una lesión isquémica primaria (por ejemplo, transformación hemorrágica, vasoespasmo cerebral).

Breve descripción de las figuras

La figura 1A representa un gráfico del volumen de infarto (mm^{3}) en las regiones corticales y subcorticales de los cerebros de ratas Sprague Dawley después del tratamiento con hoe 140 (300 ng/kg/min) y vehículo control.

La figura 1B representa un gráfico del volumen de infarto (mm^{3}) en las regiones corticales y subcorticales de los cerebros de ratas espontáneamente hipertensas después del tratamiento con hoe 140 (300 ng/kg/min) y vehículo control.

La figura 2A representa un gráfico del volumen de infarto (mm^{3}) en las regiones corticales y subcorticales de los cerebros de ratas Sprague Dawley después del tratamiento con anticuerpo anti-alfa4 de rata (TA-2, 2,5 mg/kg) y anticuerpo control de isotipo.

La figura 2B representa un gráfico del volumen de infarto (mm^{3}) en las regiones corticales y subcorticales de los cerebros de ratas espontáneamente hipertensas después del tratamiento con anticuerpo anti-alfa4 de rata (TA-2,

\hbox{2,5 mg/kg)}

y anticuerpo control de isotipo. Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Para señalar de forma más clara y concisa el objeto de la invención reivindicada, se proporcionan las siguientes definiciones para términos específicos usados en la siguiente descripción escrita y reivindicaciones adjuntas.

La invención se describirá ahora con referencia a la siguiente descripción detallada de la que se incluyen las siguientes definiciones:

La superfamilia de integrinas antígeno muy tardío (VLA) está hecha de glicoproteínas estructural y funcionalmente relacionadas que consisten en moléculas de receptores transmembrana heterodiméricas (alfa y beta) encontradas en varias combinaciones en casi cada tipo celular de mamífero (para revisiones véase: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., "The Pharmacology of the Integrins" Medicinal Research Rev. (1994) y V. W. Engleman et al., "Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets" en Ann. Report in Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191). Las integrinas de la familia VLA incluyen (actualmente): VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 y -11, en las que cada una de las moléculas comprende una cadena \beta1 unida de forma no covalente a una cadena alfa (\alpha1, \alpha2, \alpha3, \alpha4, \alpha5, \alpha6 y similares), respectivamente.

La integrina alfa 4 beta 1 (\alpha4\beta1) es un receptor de superficie celular para VCAM-1, fibronectina y posiblemente otros ligandos (los últimos ligando se denominan individual y colectivamente "ligando(s) de alfa4"). El término integrina \alpha4\beta1 ("VLA-4" ó "a4b1" ó "integrina a4b1", usados de forma intercambiable) se refiere aquí de esta manera a polipéptidos que son capaces de unirse a VCAM-1 y miembros de las proteínas de la matriz extracelular, más particularmente fibronectina, u homólogos o fragmentos de la misma, aunque los expertos en la materia apreciarán que pueden existir otros ligandos para VLA-4 y se pueden analizar usando métodos convencionales. Sin embargo, se sabe que la subunidad alfa4 se asociará con otras subunidades beta además de beta1 de modo que se puede definir el término "integrina alfa (I) 4" o "integrina que contienen la subunidad alfa (I) 4" como que son aquellas integrinas cuya subunidad alfa4 se asocia con una u otra de las subunidades beta. Otro ejemplo de una integrina "alfa4" además de VLA4 es alfa4beta7 (Véase Lobb y Adam, supra).

Un "antagonista" de integrina como se describe aquí incluye cualquier compuesto que inhibe la unión de las integrinas que contienen la subunidad alfa4 con un ligando y/o receptor de integrina. Un anticuerpo anti-integrina o proteínas que contienen un homólogo de anticuerpo (discutido más adelante) así como otras moléculas tales como formas solubles de las proteínas ligando para las integrinas son útiles. Las formas solubles de las proteínas ligando para las integrinas que contienen la subunidad alfa4 incluyen VCAM-1 soluble, proteínas de fusión VCAM-1 o proteínas fusión bifuncionales VCAM-1/Ig. Por ejemplo, se puede administrar una forma soluble de un ligando de integrina o un fragmento de la misma para que se una a integrina y preferiblemente compita para un sitio de unión a integrina en células, produciendo de esta manera efectos similares a la administración de antagonistas tales como anticuerpos anti-integrina (por ejemplo, VLA-4). En particular, también se describen en la presente invención mutantes solubles de integrinas que se unen al ligando pero no inducen señalización dependiente de integrina. Tales mutantes de integrina pueden actuar como inhibidores competitivos de la proteína integrina salvaje y se consideran "antagonistas". Otros antagonistas usados en el contexto de la invención son "moléculas pequeñas", como se define posteriormente.

La invención también describe los usos de moléculas que antagonizan la acción de más de una integrina que contiene la subunidad alfa4, tales como moléculas pequeñas u homólogos de anticuerpos que antagonizan tanto VLA-4 como alfa4beta7 u otras combinaciones de integrinas que contienen una subunidad alfa4. La invención también describe los usos de una combinación de moléculas de modo que la combinación antagoniza más de una integrina, tal como los usos de varias moléculas pequeñas u homólogos de anticuerpos que en combinación antagonizan tanto VLA-4 como alfa4beta7 u otras combinaciones de integrinas que contienen subunidades alfa4.

Como se discute aquí, ciertos antagonistas de integrinas se pueden fusionar o conjugar de otras manera a, por ejemplo, un homólogo de anticuerpo tal como una inmunoglobulina o fragmento de la misma y no están limitados a un tipo particular o estructura de una integrina o ligando u otra molécula. De esta manera, para los fines de la invención, cualquier agente capaz de formar una proteína quimérica (como se define más adelante) y capaz de unirse a ligandos de integrina y que bloquee o recubra de forma eficaz la integrina VLA-4 (por ejemplo, VLA-4) se considera que es un equivalente de los antagonistas usados en los ejemplos aquí.

"Homólogo de anticuerpo", como se usa aquí incluye anticuerpos intactos que consisten en cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina unidas mediante puentes disulfuro. El término "homólogo de anticuerpo" también se pretende que abarque una proteína que comprende uno o más polipéptidos seleccionados de cadenas ligeras de inmunoglobulina, cadenas pesadas de inmunoglobulina y fragmentos de unión a antígenos de las mismas que son capaces de unirse a uno o más antígenos (es decir, integrina o ligando de integrina). Los polipéptidos componentes de un homólogo de anticuerpo compuesto de más de un polipéptido pueden opcionalmente estar unidos por puentes disulfuro o de otra manera entrecruzados covalentemente. Según esto, por lo tanto, "homólogos de anticuerpos" incluye inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de las mismas), en donde las cadenas ligeras de las inmunoglobulinas pueden ser de tipo kappa o lambda.

"Homólogos de anticuerpo" como se usa aquí también incluye partes de anticuerpos intactos que mantienen especificidad de unión a antígeno, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadena pesada y ligera o mezclas de los mismos.

"Homólogo de anticuerpo humanizado" como se usa aquí es un homólogo de anticuerpo, producido mediante tecnología de ADN recombinante, en el que alguno o todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina humana que no se requieren para la unión al antígeno se han sustituido por los aminoácidos correspondientes de la cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina de un mamífero no humano. Un "homólogo de anticuerpo humano" es un homólogo de anticuerpo en el que todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (independientemente de si se requieren o no para la unión al antígeno) derivan de una fuente humana.

Como se usa aquí, un "homólogo de anticuerpo humano" es un homólogo de anticuerpo producido mediante tecnología de ADN recombinante, en el que todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina que derivan de una fuente humana.

Un "agonista" de integrina como se describe aquí incluye cualquier compuesto que activa el ligando de integrina.

"Aminoácido" es una unidad monomérica de un péptido, polipéptido o proteína. Hay veinte aminoácidos que se encuentran en los péptidos, polipéptidos y proteínas naturales, todos ellos son isómeros L. El término también incluye análogos de los aminoácidos e isómeros D de los aminoácidos de las proteínas y sus análogos.

"Acoplado covalentemente" significa que los grupos especificados como se divulgan en la invención (por ejemplo, antagonista de integrina alfa4 PEGilado, fragmento de inmunoglobulina/antagonista de integrina alfa4) están unidos directamente de forma covalente entre sí o están unidos indirectamente de forma covalente entre sí mediante un grupo o grupos intermedios, tal como un grupo o grupos espaciador(es). El grupo o grupos intermedios se llaman un "grupo de acoplamiento". El término "conjugado" se usa de forma intercambiable con "acoplado covalentemente". A este respecto, un "espaciador" se refiere a un grupo que se puede insertar entre un aminoácido u otro componente de un antagonista o fragmento de una integrina alfa4 y el resto de la molécula. Un espaciador puede proporcionar separación entre el aminoácido u otro componente y el resto de la molécula de modo que prevenga que la modificación interfiera con la función de la proteína y/o haga más fácil que el aminoácido u otro componente se una con otro grupo.

"Secuencia de control de expresión" significa una secuencia de polinucleótidos que controla y regula la expresión de genes cuando está operativamente unida a esos genes.

"Vector de expresión" significa un polinucleótido, tal como un plásmido de ADN o un fago (entre otros ejemplos comunes) que permite la expresión de al menos un gen cuando el vector de expresión se introduce en una célula huésped. El vector puede, o puede no, ser capaz de replicarse en una célula.

Una "cantidad eficaz" de un agente como se divulga en la invención es esa cantidad que produce un resultado o ejerce una influencia en la afección particular que se trata.

"Equivalente funcional" de un residuo de aminoácido es (i) un aminoácido que tiene propiedades reactivas similares que el residuo de aminoácido que se cambió por el equivalente funcional; (ii) un aminoácido de un antagonista de la invención, el aminoácido que tiene propiedades similares al residuo de aminoácido que se cambió por el equivalente funcional; (iii) una molécula no aminoacídica que tiene propiedades similares que el residuo de aminoácido que se cambió por el equivalente funcional.

Un primer polinucleótido que codifica un antagonista proteico como se describe en la invención es un "equivalente funcional" comparado con un segundo polinucleótido que codifica la proteína antagonista si satisface al menos una de las siguientes condiciones:

(a)

el "equivalente funcional" es un primer polinucleótido que hibrida con el segundo polinucleótido en condiciones estándar de hibridación y/o es degenerado respecto a la secuencia del primer polinucleótido. Lo más preferiblemente, codifica una proteína mutante que tiene la actividad de una proteína antagonista de integrina;

(b)

el "equivalente funcional" es un primer polinucleótido que codifica la expresión de una secuencia de aminoácidos codificada por el segundo polinucleótido.

Los antagonistas de integrina como se describen en la invención incluyen, pero no están limitados a, los agentes enumerados aquí así como sus equivalentes funcionales. Como se usa aquí, el término "equivalente funcional" se refiere por lo tanto a un antagonista de integrina o a un polinucleótido que codifica el antagonista de integrina que tiene el mismo efecto beneficioso o mejorado sobre el receptor que el antagonista de integrina del que se juzga un equivalente funcional. Como apreciará el experto en la materia, se puede producir una proteína funcionalmente equivalente mediante técnicas recombinantes, por ejemplo, expresando un "ADN funcionalmente equivalente". Según esto, la presente invención abarca proteínas integrinas codificadas por ADN naturales, así como por ADN no naturales que codifican la misma proteína que codifica el ADN natural. Debido a la degeneración de las secuencias codificantes de nucleótidos, se pueden usar otros polinucleótidos para codificar la proteína integrina. Éstos incluyen todas, o partes de las secuencias anteriores que se alteran por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácido en la secuencia, produciendo de esta manera un cambio silencioso. Tales secuencias alteradas se consideran equivalentes de estas secuencias. Por ejemplo, Phe (F) está codificada por dos codones, TTC ó TTT, Tyr (Y) está codificada por TAC ó TAT e His (H) está codificada por CAC ó CAT. Por otra parte, Trp (W) está codificado por un único codón, TGG. Según esto, se apreciará que para una secuencia de ADN determinada que codifica una integrina particular habrá muchas secuencias degeneradas de ADN que la codificarán. Estas secuencias de ADN degenerado se divulgan en esta invención.

El término "quimérico" cuando se refiere a un antagonista como se describe en la invención, significa que el antagonista comprende una unión (entrecruzamiento químico o covalente o de otro tipo) de dos o más proteínas que tienen estructuras dispares y/o que tienen fuentes de origen dispares. De esta manera, un antagonista quimérico de una integrina alfa4 puede incluir un grupo que es un antagonista o fragmento de integrina alfa4 y otro grupo que no es un antagonista de integrina alfa4.

Una especie de proteína "quimérica" es una "fusión" o "proteína de fusión" que se refiere a la unión co-lineal, covalente de dos o más proteínas o fragmentos de las mismas a través de sus esqueletos peptídicos individuales, lo más preferiblemente mediante expresión genética de una molécula de polinucleótido que codifica esas proteínas. De esta manera, las proteínas de fusión preferidas como se describen aquí son proteínas quiméricas que incluyen un antagonista o fragmento de integrina alfa4 covalentemente unido a un segundo grupo que no es un antagonista de integrina alfa4. Las proteínas de fusión preferidas como divulga la invención pueden incluir partes de anticuerpos intactos que mantienen la especificidad de unión a antígeno, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros que consisten en una cadena pesada y otra ligera y similares.

Las proteínas de fusión más preferidas como se divulgan y describen son quiméricas y comprenden un grupo antagonista de integrina fusionado o unido de otra manera a todo o parte de las regiones bisagra y constante de una cadena ligera de una inmunoglobulina, cadena pesada o ambas. De esta manera, esta invención divulga una molécula que incluye: (1) un grupo antagonista de integrina, (2) un segundo péptido, por ejemplo, uno que aumenta la solubilidad o la vida in vivo del grupo antagonista de integrina, por ejemplo, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas o fragmento o parte de la misma, por ejemplo, una parte o fragmento de IgG, por ejemplo, la región constante de la cadena pesada de la IgG1 humana, por ejemplo, CH2, CH3 y las regiones bisagra. Específicamente, una "fusión antagonista de integrina/Ig" es una proteína que comprende una molécula de antagonista de integrina biológicamente activa de la invención (por ejemplo, un ligando VLA-4 soluble, o un fragmento biológicamente activo del mismo unido al extremo N-terminal de una cadena de inmunoglobulina en donde una parte del extremo N-terminal de la inmunoglobulina se cambia por el antagonista de integrina. Una especie de fusión antagonista de integrina/Ig es una "fusión integrina/Fc" que es una proteína que comprende un antagonista de integrina de la invención unido a al menos una parte del dominio constante de una inmunoglobulina. Una fusión de Fc preferida comprende un antagonista de integrina de la invención unido a un fragmento de anticuerpo que contiene el dominio C-terminal de las cadenas pesadas de inmunoglobulina.

El término "proteína de fusión" también significa un antagonista de integrina unido químicamente a través de una molécula mono- o hetero-funcional a un segundo grupo que no es un antagonista de integrina (produciendo una molécula "quimérica") y se hace de novo a partir de proteína purificada como se describe posteriormente. De esta manera, un ejemplo de una molécula quimérica químicamente unida, opuesto a recombinantemente unida, que es una proteína de fusión puede comprender: (1) un grupo de direccionamiento a una subunidad de integrina alfa4, por ejemplo, un grupo VCAM-1 capaz de unirse a VLA-4) en la superficie de células que tienen VLA-4; (2) una segunda molécula que aumenta la solubilidad o la vida in vivo del grupo de direccionamiento, por ejemplo, un polímero de polialquilenglicol tal como polietilenglicol (PEG). El grupo de direccionamiento de alfa4 puede ser cualquier ligando natural de alfa4 o fragmento del mismo, por ejemplo un péptido de VCAM-1 o una secuencia de aminoácidos similar sustituida de forma conservadora.

"Promotor heterólogo" como se usa aquí es un promotor que no está asociado de forma natural con un gen o un ácido nucleico purificado.

"Homología" como se usa aquí es sinónimo con el término "identidad" y se refiere a la similitud de secuencia entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en ambas de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma subunidad monómero base o aminoácido (por ejemplo, si una posición en cada una de las moléculas de ADN está ocupada por adenina, o una posición en cada uno de los dos polipéptidos está ocupado por una lisina), entones las moléculas respectivas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones que se ajustan u homólogas compartidas por las dos secuencias, dividido por el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias se ajustan o son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas al 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten el 50% de homología (3 de las 6 posiciones totales se ajustan). En general, se hace una comparación cuando dos secuencias se alinean para dar la homología máxima. Tal alineamiento se puede proporcionar usando, por ejemplo, el método de Needleman et al., J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970), implementado convenientemente por programas de ordenador descritos en más detalle posteriormente. Las secuencias homólogas comparten residuos de aminoácidos idénticos o similares, donde los residuos similares son sustituciones conservadoras para, o "mutaciones puntuales permitidas" de, residuos de aminoácidos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, una "sustitución conservadora" de un residuo en una secuencia de referencia son aquellas sustituciones que son física o funcionalmente similares a los residuos de referencia correspondientes, por ejemplo, que tienen un tamaño, forma, carga eléctrica, propiedades químicas similares, incluyendo la capacidad de formar enlaces covalentes o de hidrógeno o similares. Sustituciones conservadoras particularmente preferidas son aquellas que cumplen los criterios definidos para una "mutación puntual aceptada" en Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Supl. 3, capítulo 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978).

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"Homología" e "identidad" se refieren cada una a la similitud de secuencia entre dos secuencias de polipéptidos, siendo la identidad una comparación más estricta. Se pueden determinar homología e identidad cada una comparando una posición en cada secuencia que se pueden alinear para fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por el mismo residuo de aminoácido, entonces los polipéptidos se pueden denominar idénticos en esa posición; cuando el sitio equivalente está ocupado por el mismo aminoácido (por ejemplo, idéntico) o un aminoácido similar (por ejemplo, similar en naturaleza estérica y/o eléctrica), entonces las moléculas se pueden denominar homólogas en esa posición. Un porcentaje de homología o identidad entre secuencias es una función del número de posiciones que se ajustan u homólogas compartidas por las secuencias. Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos del 40 por ciento de identidad, aunque preferiblemente menos del 25 por ciento de identidad, con una secuencia AR como se describe en la presente invención.

Se pueden usar varios algoritmos y/o programas de alineamiento, incluyendo FASTA, BLAST o ENTREZ. FASTA y BLAST están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Ws) y se pueden usar con, por ejemplo, ajustes por defecto. ENTREZ está disponible a través del Centro Nacional de Información para Biotecnología, Biblioteca Nacional de Medicina, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. En una forma de realización, se puede determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias mediante el programa GCG con un peso de brecha de 1, por ejemplo, cada brecha de aminoácido se considera como si fuera un desajuste de un único aminoácido o nucleótido entre dos secuencias.

"Aislado" (usado de forma intercambiable con "sustancialmente puro") cuando se aplica a ácido nucleico, es decir, secuencias de polinucleótidos que codifican antagonistas de integrinas, significa un polinucleótido de ADN o ARN, parte de un polinucleótido genómico, ADNc o polinucleótido sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (i) no está asociado con todo un polinucleótido con el que se asocia en la naturaleza (por ejemplo, está presente en una célula huésped como un vector de expresión o una parte del mismo); o (ii) está unido a un ácido nucleico u otro grupo químico diferente de aquel al que se une en la naturaleza; o (iii) no se produce en la naturaleza. Mediante "aislado" se quiere decir además una secuencia de polinucleótidos que se: (i) amplifica in vitro mediante, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) sintetiza químicamente; (iii) produce de forma recombinante mediante clonación; o (iv) purifica, como mediante corte y separación en gel. De esta manera, un "ácido nucleico sustancialmente puro" es un ácido nucleico que no está inmediatamente contiguo con una o ambas de las secuencias codificantes con las que normalmente es contiguo en el genoma natural del organismo del que deriva el ácido nucleico. ADN sustancialmente puro también incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica secuencias adicionales de integrinas.

"Aislado" (usado de forma intercambiable con "sustancialmente puro") cuando se aplica a polipéptidos significa un polipéptido o parte del mismo que, en virtud de su origen o manipulación: (i) está presente en una célula huésped como el producto de expresión de una parte de un vector de expresión; o (ii) está unido a una proteína u otro grupo químico diferente de aquel al que está unido en la naturaleza; o (iii) no se produce en la naturaleza, por ejemplo una proteína que se manipula químicamente adjuntando o añadiendo al menos un grupo hidrofóbico a la proteína de modo que la proteína está en una forma que no se encuentra en la naturaleza. Mediante "aislado" se quiere decir además una proteína que se: (i) sintetiza químicamente; (ii) se expresa en una célula huésped y se purifica de proteínas asociadas y contaminantes. El término en general significa un polipéptido que se ha separado de otras proteínas y ácidos nucleicos con los se produce de forma natural. Preferiblemente, el polipéptido también se separa de sustancias tales como anticuerpos o matrices de geles (poliacrilamida) que se usan para purificarlo.

"Complejo proteico multivalente" se refiere a una pluralidad de antagonistas de integrinas (es decir, uno o más). Se puede entrecruzar o unir un homólogo o fragmento de anticuerpo anti-integrina a otro homólogo o fragmento de anticuerpo. Cada proteína puede ser igual o diferente y cada homólogo o fragmento de anticuerpo puede ser igual o diferente.

"Mutante", cualquier cambio en el material genético de un organismo, en particular cualquier cambio (es decir, deleción, sustitución, adición o alteración) en una secuencia de polinucleótido de tipo salvaje o cualquier cambio en una proteína de tipo salvaje. El término "muteína" se usa de forma intercambiable con "mutante".

"Operativamente unido", una secuencia de polinucleótido (ADN, ARN) está operativamente unida a una secuencia de control de la expresión cuando la secuencia de control de la expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de polinucleótido. El término "operativamente unido" incluye tener una señal de iniciación adecuada (por ejemplo, ATG) delante de la secuencia de polinucleótido a ser expresada y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de polinucleótido bajo el control de la secuencia de control de la expresión, y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleótido.

Un "agente farmacológico", se define como uno o más compuestos o moléculas u otras entidades químicas administradas a un sujeto (además de los antagonistas de la invención) que afecta la acción del antagonista. El término "agente farmacológico" como se usa aquí se refiere a tal(es) agente(s) que se administra(n) durante una "terapia de combinación" donde el antagonista de la invención se administra bien antes, después o simultáneamente con la administración de uno o más agentes farmacológicos.

"Proteína", cualquier polímero que consiste esencialmente en cualquiera de los 20 aminoácidos. Aunque "polipéptido" con frecuencia se usa con referencia a polipéptidos relativamente grandes, y "péptido" con frecuencia se usa con referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica se solapa y varía. El término "proteína" como se usa aquí se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos, a menos que se advierta de otra manera.

Los términos "péptido(s)", "proteína(s)" y "polipéptido(s)" se usan aquí de forma intercambiable. Los términos "secuencia de polinucleótido" y "secuencia de nucleótidos" también se usan de forma intercambiable aquí.

"Recombinante", como se usa aquí, significa que una proteína deriva de sistemas de expresión recombinantes de mamífero. Puesto que la integrina no se glicosila ni contiene puentes disulfuro, se puede expresar en la mayoría de los sistemas de expresión procariotas y eucariotas.

"Molécula pequeña" tiene la misma definición que en la sección A2.

La frase "aminoácido de superficie" significa cualquier aminoácido que está expuesto al solvente cuando una proteína se pliega en su forma nativa.

"Condiciones estándar de hibridación", condiciones de sal y temperatura sustancialmente equivalentes a desde SSC 0,5X hasta alrededor de SSC 5X y 65ºC tanto para hibridación como para lavado. El término "condiciones estándar de hibridación" como se usa aquí es por lo tanto una definición operacional y abarca un intervalo de condiciones de hibridación. Las condiciones más rigurosas de hibridación, por ejemplo, pueden incluir hibridar con tampón de cribado en placa (polivinilpirrolidona al 0,2%; Ficoll 400 al 0,2%; seroalbúmina bovina al 0,2%; Tris-HCl 50 mM (pH 7,5); NaCl 1 M; pirofosfato de sodio al 0,1% y SDS al 1%); sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado, sonicado 100 \mug/ml a 65ºC durante 12-20 horas, y lavar con NaCl 75 mM/citrato de sodio 7,5 mM (SSC 0,5X)/SDS al 1% a 65ºC. Las condiciones menos rigurosas, por ejemplo, pueden incluir hibridar con tampón de cribado en placa, sulfato de dextrano al 10% y ADN de esperma de salmón desnaturalizado, sonicado 110 \mug/ml a 55ºC durante 12-20 horas, y lavar con NaCl 300 mM/citrato de sodio 30 mM (SSC 2,0X)/SDS al 1% a 55ºC. Véase también Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, Secciones 6.3.1-6.3.6, (1989).

Una "composición terapéutica" como se usa aquí se define como que comprende los antagonistas descritos y divulgados en la invención y otros ingredientes biológicamente compatibles. La composición terapéutica puede contener excipientes tales como agua, minerales y soportes tales como proteínas.

Se dice que un antagonista de la invención (y su composición terapéutica) tienen "eficacia terapéutica", y se dice que una cantidad del agente es "terapéuticamente eficaz" si la administración de esa cantidad del agente es suficiente para producir una mejora clínicamente significativa en la recuperación neurológica en una prueba neurológica estándar (sección IV) cuando se administra a un sujeto (por ejemplo, un modelo animal o paciente humano) después de daño cerebral (por ejemplo isquemia cerebral o ictus).

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteínas, farmacología e inmunología, que están en la capacidad de la técnica. Tales técnicas se describen en la bibliografía.

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II. Descripción de las formas de realización preferidas General

En el contexto de la presente invención se descubrió que la inhibición de las integrinas \alpha4: \alpha4\beta1 y/o \alpha4\beta7 protege el cerebro contra lesión inducida por una agresión aguda. Usando un modelo de rata de ictus producido por oclusión temporal de la arteria cerebral media se demostró que se producía una reducción significativa en el infarto cerebral después del tratamiento con un antagonista de integrina alfa4. La relevancia de los modelos animales de ictus ha sido revisada por Hunter et al (1996) Trends in Pharmacological Sciences 6:123. El modelo de rata de oclusión reversible en la arteria cerebral media tanto en ratas Sprague Dawley (SD) como en ratas espontáneamente hipertensas (REH) se ve ampliamente como el modelo de ictus en roedores más clínicamente relevante. (Hunter et al (1996) Trends in Pharmacological Sciences 6:123).

A. Antagonistas de integrina

Para los fines de la invención se puede describir un antagonista de integrina como un antagonista de cualquier interacción entre una integrina y su ligando o receptor afín de modo que se altere la función normal inducida por las interacciones ligando-receptor (es decir, se previene o ralentiza o se modifica de otra manera). Una forma de realización preferida de un antagonista de integrina como se describe y divulga aquí es un antagonista de interacciones de integrinas alfa4 con sus ligandos, tal como la interacción VCAM-1/VLA-4. Éste es un agente, por ejemplo un polipéptido u otra molécula, que puede inhibir o bloquear la unión mediada por VCAM-1 y/o VLA-4 o que puede modular de otra manera la función de VCAM-1 y/o VLA-4, por ejemplo inhibiendo o bloqueando la transducción de señales de VLA-4 mediada por el ligando de VLA-4 o la transducción de señales de VCAM-1 mediada por el ligando de VCAM-1 y que es eficaz en el tratamiento de lesión cerebral aguda, preferiblemente de la misma manera que lo son los anticuerpos anti-VLA-4.

Un antagonista de la interacción VCAM-1/VLA-4 es un agente que tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) recubre o se une a VLA-4 en la superficie de una célula que tiene VLA-4 (por ejemplo, una célula endotelial) con especificidad suficiente para inhibir una interacción ligando de VLA-4/VLA-4, por ejemplo, la interacción VCAM-1/VLA-4; (2) recubre o se une a VLA-4 en la superficie de una célula que tiene VLA-4 (por ejemplo, un linfocito) con especificidad suficiente para modificar, y preferiblemente para inhibir, la transducción de una señal mediada por VLA-4, por ejemplo la señalización mediada por VLA-4/VCAM-1; (3) recubre o se une a un ligando de VLA-4 (por ejemplo, VCAM-1) en células endoteliales con especificidad suficiente para inhibir la interacción VLA-4/VCAM-1; (4) recubre o se une a un ligando de VLA-4 (por ejemplo, VCAM-1) con especificidad suficiente para modificar, y preferiblemente para inhibir, la transducción de la señalización de VLA-4 mediada por ligando de VLA-4, por ejemplo la señalización de VLA-4 mediada por VCAM-1. En formas de realización preferidas el antagonista como se describe y divulga aquí tiene una o ambas de las propiedades 1 y 2. En otras formas de realización preferidas el antagonista como se describe y divulga aquí tiene una o ambas de las propiedades 3 y 4.

Además, se puede administrar más de un antagonista a un paciente, por ejemplo, se puede combinar un agente que se une a VLA-4 con un agente que se une a VCAM-1. Como se discute aquí, los antagonistas usados y descritos en el contexto de la invención no están limitados a un tipo o estructura particular de molécula de modo que, para los fines de la invención, cualquier agente capaz de unirse a integrinas alfa4 (por ejemplo, VLA-4) en la superficie de células o a un ligando de alfa4 tal como VCAM-1 en la superficie de células que tienen ligando de alfa4) y que bloquean o recubren de forma eficaz una integrina alfa 4 (por ejemplo, VLA-4) o un ligando de alfa4 (por ejemplo, VCAM-1), denominado un "agente que se une a integrina alfa4" y un "agente que se une a un ligando de integrina alfa4" respectivamente, se considera que es un equivalente de los antagonistas usados en los ejemplos aquí.

Por ejemplo, los anticuerpos u homólogos de anticuerpos (discutidos más adelante) así como las formas solubles de las proteínas de unión naturales para VLA-4 y VCAM-1 son útiles. Las formas solubles de las proteínas naturales de unión para VLA-4 incluyen péptidos solubles de VCAM-1, proteínas de fusión de VCAM-1, proteínas de fusión bifuncionales VCAM-1/Ig (por ejemplo, moléculas "quiméricas", discutidas anteriormente), fibronectina, fibronectina con un segmento de conexión no de tipo III de ayuste alternativo y péptidos de fibronectina que contienen la secuencia de aminoácidos EILDV o una secuencia de aminoácidos similar sustituida de forma conservadora. Las formas solubles de las proteínas naturales de unión para VCAM-1 incluyen péptidos solubles de VLA-4, proteínas de fusión de VLA-4, proteínas de fusión bifuncionales VLA-4/Ig y similares. Como se usa aquí, un "péptido soluble de VLA-4" o un "péptido soluble de VCAM-1" es un polipéptido de VLA-4 o VCAM-1 incapaz de anclarse a sí mismo en una membrana. Tales polipéptidos solubles incluyen, por ejemplo, polipéptidos de VLA-4 y VCAM-1 que carecen de una parte suficiente de su dominio que atraviesa la membrana para anclar el polipéptido o están modificados de modo que el dominio que atraviesa la membrana no es funcional. Estos agentes de unión pueden actuar compitiendo con proteínas de unión a la superficie celular para VLA-4 o alterando de otra manera la función de VLA-4. Por ejemplo, se puede administrar una forma soluble de VCAM-1 (véase, por ejemplo, Osborn et al. 1989, Cell, 59: 1203-1211) o un fragmento de la misma para unirse a VLA-4, y preferiblemente competir por un sitio de unión a VLA-4 en células que expresan VCAM-1, produciendo de esta manera efectos similares a la administración de antagonistas tales como moléculas pequeñas o anticuerpos anti-VLA-4.

1. Homólogos de anticuerpos anti-integrina

En otras formas de realización preferidas, los antagonistas usados y descritos en el contexto de la invención para unirse a, incluyendo bloquear o recubrir, integrina alfa4 de la superficie celular (tal como VLA-4 o alfa4beta7) y/o ligando de la superficie celular para integrina alfa 4 (tal como VCAM-1) es un anticuerpo monoclonal anti-VLA-4 y/o anti-VCAM-1 o un homólogo de anticuerpo, como se ha definido previamente. Los anticuerpos y homólogos preferidos a ser usados para la preparación de una composición farmacéutica en el contexto de la presente invención, en particular para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento humano, incluyen homólogos de anticuerpos humanos, homólogos de anticuerpos humanizados, homólogos de anticuerpos quiméricos, fragmentos de anticuerpos Fab, Fab', F(ab')2 y F(v), y monómeros o dímeros de cadenas ligeras o pesadas de anticuerpos o mezclas de los mismos. Los anticuerpos monoclonales contra VLA-4 son un agente de unión preferido en el contexto de la invención.

2. Antagonistas de integrina de molécula pequeña

El término antagonista de integrina de "molécula pequeña" se refiere a agentes químicos (es decir, moléculas orgánicas) capaces de romper la interacción integrina/ligando de integrina, por ejemplo, bloqueando las interacciones VLA-4/VCAM-1 mediante unión a VLA-4 en la superficie de células o unión a VCAM-1 en la superficie de células. Tales moléculas pequeñas también se pueden unir a los receptores respectivos de VLA-4 y VCAM-1. Los inhibidores de molécula pequeña de VLA-4 y VCAM-1 pueden ser ellos mismos péptidos, compuestos semipeptídicos o compuestos no peptídicos, tales moléculas orgánicas pequeñas que son antagonistas de la interacción VCAM-1/VLA-4. Una "molécula pequeña", como se define aquí, no se pretende que abarque un anticuerpo u homólogo de anticuerpo. El peso molecular de las moléculas pequeñas de ejemplo es en general menos de 1000.

Por ejemplo, aquí se describe que se pueden emplear moléculas pequeñas tales como oligosacáridos que mimetizan el dominio de unión de un ligando de VLA-4 y se ajustan al dominio receptor de VLA-4. (Véase, J. J. Devlin et al., 1990, Science 249: 400-406 (1990), J. K. Scott y G. P. Smith, 1990, Science 249: 386-390 y patente de EE.UU. 4833092 (Geysen).

A la inversa, se describe aquí que se pueden emplear moléculas pequeñas que mimetizan el dominio de unión de un ligando de VCAM-1 y se ajustan al dominio receptor de VCAM-1.

Se pueden encontrar ejemplos de otras moléculas pequeñas útiles en la invención en Komoriya et al. ("The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CS1) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), pp. 15075-79 (1991)). Identificaron la secuencia de aminoácidos mínima activa necesaria para unirse a VLA-4 y sintetizaron una variedad de péptidos solapantes basados en la secuencia de aminoácidos de la región CS-1 (el dominio de unión a VLA-1) de una especie particular de fibronectina. Identificaron un péptido de 8 aminoácidos, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, así como dos pentapéptidos más pequeños solapantes, Glu-Ile-Leu-Asp-Val y Leu-Asp-Val-Pro-Ser, que poseían actividad inhibidora contra la adhesión celular dependiente de fibronectina. Posteriormente se mostró que ciertos péptidos más largos que contenían la secuencia LDV eran activos in vivo (T. A. Ferguson et al., "Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Responses In Vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp. 8072-76 (1991); y S. M. Wahl et al., "Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, pp. 655-62 (1994)). También se ha descrito un pentapéptido cíclico, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (en donde TPro representa 4-tioprolina), que inhibía adhesión tanto de VLA-4 como de VLA-5 a fibronectina (Véase, por ejemplo, D.M. Nowlin et al. "A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Betal Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem., 268(27), pp. 20352-59 (1993); y publicación de PCT WO 92/00995). Este pentapéptido se basaba en la secuencia del tripéptido Arg-Gly-Asp de fibronectina que se había conocido como un motivo común en el sitio de reconocimiento de varias proteínas de la matriz extracelular. Se han descrito ejemplos de otros inhibidores de VLA-4, por ejemplo en Adams et al. "Cell Adhesion Inhibitors", WO 98/04247, que describe compuestos peptidílicos lineales que contienen beta-aminoácidos que tienen actividad inhibidora de la adhesión celular. Las solicitudes internacionales de patente WO 94/15958 y WO 92/00995 describen péptidos cíclicos y compuestos peptidomométicos con actividad inhibidora de la adhesión celular. Las solicitudes internacionales de patente WO 93/08823 y WO 92/08464 describen compuestos inhibidores de la adhesión celular que contienen guanidilo, urea y tiourea. La patente de los Estados Unidos No. 5260277 describe compuestos que modulan la adhesión celular de guanidilo. Se han descrito otros antagonistas peptidílicos de VLA-4 en D. Y. Jackson et al., "Potent \alpha4\beta1 peptide antagonists as potential anti-inflammatory agents", J. Med. Chem., 40, 3359 (1997); H. Shroff et al., "Small peptide inhibitors of \alpha4\beta7 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocytes", Bio. Med. Chem. Lett., 1 2495 (1996); patente de EE.UU. 5510332, publicaciones de PCT WO 98/53814, WO97/03094, WO97/02289, WO96/40781, WO96/22966, WO96/20216, WO96/01644, WO96106108 y WO95/15973, y otras.

Se pueden producir tales agentes de molécula pequeña sintetizando una pluralidad de péptidos (por ejemplo, de 5 a 20 aminoácidos de longitud), compuestos semipeptídicos, compuestos orgánicos no peptídicos, y después cribando la capacidad de esos compuestos para inhibir la interacción VLA-4/VCAM-1. Véase en general la patente de EE.UU. No. 4833092, Scott y Smith, "Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library", Science, 249, pp. 386-90 (1990), y Devlin et al., "Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules", Science, 249, pp. 40407 (1990).

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B. Métodos de hacer homólogos de anticuerpos anti-integrina

Los antagonistas de integrina preferidos contemplados aquí se pueden expresar de ADN genómico o ADNc intacto o truncado o de ADN sintéticos en células huésped procariotas o eucariotas. Las proteínas diméricas se pueden aislar del medio de cultivo y/o replegar y dimerizar in vitro para formar composiciones biológicamente activas. Se pueden formar los heterodímeros in vitro combinando cadenas de polipéptidos distintas, separadas. De forma alternativa, se pueden formar los heterodímeros en una única célula coexpresando ácidos nucleicos que codifican cadenas de polipéptidos distintas, separadas. Véase, por ejemplo, WO93/09229 o la patente de EE.UU. No. 5411941, para varios protocolos de producción de proteínas heterodiméricas recombinantes de ejemplo. Actualmente las células huésped preferidas como se describe aquí incluyen, sin limitación, procariotas incluyendo E. coli, o eucariotas incluyendo levaduras, Saccharomyces, células de insecto o células de mamífero, tales como células CHO, COS o BSC. El experto en la materia apreciará que se pueden usar otras células huésped con ventaja. Las descripciones detalladas de las proteínas útiles en la práctica de esta invención, incluyendo cómo hacerlas, usarlas y probar su actividad condrogénica, se divulgan en numerosas publicaciones, incluyendo las patentes de EE.UU. Nos. 5266683 y 5011691.

La tecnología para producir homólogos de anticuerpos monoclonales es bien conocida. Brevemente, se fusiona una línea celular inmortal (típicamente células de mieloma) con linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con células enteras que expresan un antígeno determinado, por ejemplo VLA-4, y se criban los sobrenadantes de los cultivos de las células de hibridoma resultantes para anticuerpos contra el antígeno. Véase, en general, Kohler et at., 1975, Nature, 265: 295-297. La inmunización se puede alcanzar usando procedimientos estándar. La dosis unitaria y la pauta de inmunización dependen de la especie de mamífero inmunizada, su estado inmune, el peso corporal del mamífero, etc. Típicamente, los mamíferos inmunizados se sangran y se ensaya el suero de cada muestra de sangre para anticuerpos particulares usando ensayos de cribado apropiados. Por ejemplo, se pueden identificar anticuerpos anti-VLA-4 mediante inmunoprecipitación de lisados celulares marcados con 125I de células que expresan VLA-4. (Véase, Sanchez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 y Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). También se pueden identificar los anticuerpos anti-VLA-4 mediante citometría de flujo, por ejemplo, midiendo la tinción fluorescente de células Ramos incubadas con un anticuerpo que se cree reconoce VLA-4 (véase, Elices et al., 1990 Cell, 60: 577-584). Los linfocitos usados en la producción de células de hibridoma típicamente se aíslan de mamíferos inmunizados cuyo suero ya ha dado positivo para la presencia de anticuerpos anti-VLA-4 usando tales ensayos de cribado.

Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan a esplenocitos de ratón usando polietilenglicol de peso molecular 1500 ("PEG 1500"). Las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan después usando medio HAT, que mata las células de mieloma no fusionadas y fusionadas improductivamente (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días porque no están transformados). Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado se detectan mediante cribado de los sobrenadantes de los cultivos de hibridoma. Por ejemplo, los hibridomas preparados para producir anticuerpos anti-VLA-4 se pueden cribar probando el sobrenadante del cultivo del hibridoma para anticuerpos secretados que tienen la capacidad de unirse a una línea celular que expresa subunidad alfa4 recombinante (véase, Elices et al., supra).

Para producir homólogos de anticuerpo anti-VLA-4 que son inmunoglobulinas intactas, se cultivaron las células de hibridoma que dieron positivas en tales ensayos de cribado en un medio nutriente en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que las células de hibridoma secreten los anticuerpos monoclonales al medio de cultivo. Las técnicas de cultivo de células y los medios de cultivo adecuados para las células de hibridoma son bien conocidos. Se puede recoger el sobrenadante del cultivo de hibridoma condicionado y opcionalmente los anticuerpos anti-VLA-4 se pueden purificar adicionalmente por métodos bien conocidos.

De forma alternativa, se puede producir el anticuerpo deseado inyectando las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón no inmunizado. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal, secretando el anticuerpo que se acumula como líquido ascítico. El anticuerpo se puede recoger retirando el líquido ascítico de la cavidad peritoneal con una jeringuilla.

Se han descrito previamente varios anticuerpos monoclonales anti-VLA-4. Véase, por ejemplo, Sanchez-Madrid et al., 1986, supra; Hemler et al., 1987, supra; Pulido et al., 1991. J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245); Issekutz y Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147: 109 (TA-2 mab). Estos anticuerpos monoclonales anti-VLA-4 y otros anticuerpos anti-VLA-4 (por ejemplo, patente de EE.UU. 5888507 - Biogen, Inc. y referencias citadas allí) capaces de reconocer la cadena alfa y/o beta de VLA-4 serán útiles en el contexto de la presente invención. Los anticuerpos anti-VLA-4 que reconocerán los epítopos de la cadena alfa4 de VLA-4 implicados en la unión a los ligandos VCAM-1 y fibronectina (es decir, anticuerpos que se pueden unir a VLA-4 en un sitio implicado en reconocimiento de ligando y bloquean la unión de VCAM-1 y fibronectina) son preferidos. Tales anticuerpos se han definido como anticuerpos específicos de epítopo B (B1 o B2) (Pulido et al., 1991, supra) y también son anticuerpos anti-VLA-4 como se divulga en la presente invención.

Los homólogos de anticuerpos monoclonales completamente humanos contra VLA-4 son otro agente de unión preferido que puede bloquear o recubrir ligandos de VLA-4 en el contexto de la invención. En su forma intacta éstos se pueden preparar usando esplenocitos humanos cebados in vitro, como describen Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. De forma alternativa, se pueden preparar mediante clonación de repertorio como describen Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 o Huang y Stollar, 1991. J. Immunol. Methods 141, 227-236, patente de EE.UU. 5798230 (25 de agosto de 1998, "Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use") que describen la preparación de anticuerpos monoclonales humanos de células B humanas. Según este proceso, las células B humanas productoras de anticuerpo se inmortalizan mediante infección con un virus de Epstein Barr, o un derivado del mismo, que expresa el antígeno nuclear 2 del virus de Epstein Barr (EBNA2). La función de EBNA2, que se requiere para la inmortalización, se interrumpe posteriormente, lo que produce un aumento en la producción de anticuerpo.

En aún otro método para producir anticuerpos completamente humanos, la patente de EE.UU. 5789650 (4 de agosto de 1998, "Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies") describe animales transgénicos no humanos capaces de producir anticuerpos heterólogos y animales transgénicos no humanos que tienen inactivados los genes endógenos de las inmunoglobulinas. Los genes endógenos de las inmunoglobulinas se suprimen mediante polinucleótidos antisentido y/o mediante antisuero dirigido contra inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos heterólogos están codificados por genes de inmunoglobulinas normalmente no encontrados en el genoma de esa especie de animal no humano. Se introducen uno o más transgenes que contienen secuencias de cadenas pesadas de inmunoglobulinas humanas heterólogas no reorganizadas en un animal transgénico no humano formando de esta manera un animal transgénico capaz de reorganizar funcionalmente secuencias transgénicas de inmunoglobulinas y producir un repertorio de anticuerpos de varios isotipos codificados por genes de inmunoglobulinas humanas. Tales anticuerpos heterólogos humanos se producen en células B que posteriormente se inmortalizan, por ejemplo, fusionándolas con una línea celular inmortalizada tal como un mieloma o manipulando tales células B por otras técnicas para perpetuar una línea celular capaz de producir un homologo de anticuerpo monoclonal heterólogo completamente humano.

También se pueden usar librerías grandes humanas no inmunizadas de presentación en fagos para aislar anticuerpos que se pueden desarrollar como agentes terapéuticos humanos usando tecnología estándar de fagos (Vaughan et al., 1996).

Aún otro agente de unión preferido que puede bloquear o recubrir ligandos de integrina en el contexto de la invención es un homólogo de anticuerpo recombinante humanizado que tiene especificidad anti-integrina. Después de los primeros métodos para la preparación de "anticuerpos quiméricos" verdaderos (donde las regiones constante entera y variable entera derivan de fuentes diferentes), se describió un nuevo planteamiento en EP 0239400 (Winter et al.) mediante el cual los anticuerpos se alteran mediante sustitución (dentro de una región variable determinada) de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) para una especie por aquellos de la otra. Este proceso se puede usar, por ejemplo, para sustituir las CDR de los dominios de la región variable de Ig humana pesada y ligera con CDR alternativas de dominios de la región variable murina. Estas regiones variables de Ig alteradas se pueden combinar posteriormente con regiones constantes de Ig humana para crear anticuerpos que son totalmente humanos en composición excepto por las CDR murinas sustituidas. Se predeciría que sería menos probable que tales anticuerpos con CDR sustituidas indujeran una respuesta inmune en seres humanos comparados con anticuerpos quiméricos verdaderos porque los anticuerpos con CDR sustituidas contienen considerablemente menos componentes no humanos. El proceso de humanización de anticuerpos monoclonales a través de "injerto de CDR" se ha denominado "remodelado" (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536).

Típicamente, se trasplantan las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo murino en las regiones correspondientes en un anticuerpo humano, puesto que las CDR (tres en las cadenas pesadas del anticuerpo, tres en las cadenas ligeras) son las regiones del anticuerpo de ratón que se unen a un antígeno específico. El trasplante de CDR se alcanza mediante ingeniería genética por lo cual las secuencias de ADN de las CDR se determinan mediante clonación de segmentos de genes de la región variable (V) de la cadena pesada y ligera murina, y después se transfieren a las correspondientes regiones V humanas mediante mutagénesis dirigida. En la fase final del proceso, se añaden segmentos de genes de la región constante humana del isotipo deseado (normalmente gamma I para CH y kappa para CL) y los genes de la cadena pesada y ligera humanizadas se coexpresan en células de mamífero para producir un anticuerpo humanizado soluble.

La transferencia de estas CDR a un anticuerpo humano confiere a este anticuerpo las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo murino original. Las seis CDR en el anticuerpo murino se montan estructuralmente en una región "estructural" de la región V. La razón por la que el injerto de CDR tiene éxito es que las regiones estructurales entre los anticuerpos humanos y de ratón pueden tener estructuras tridimensionales muy similares con puntos similares de unión para CDR, de modo que las CDR se pueden intercambiar. Se pueden preparar tales homólogos de anticuerpos humanizados, como se ejemplifica en Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; y Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833.

Sin embargo, se piensa que ciertos aminoácidos en las regiones estructurales interaccionan con las CDR e influyen sobre la afinidad global de unión al antígeno. La transferencia directa de las CDR de un anticuerpo murino para producir un anticuerpo recombinante humanizado sin modificaciones en las regiones estructurales de las regiones V humanas con frecuencia produce una pérdida parcial o completa de afinidad de unión. En ciertos casos, parece ser crítico cambiar residuos en las regiones estructurales del anticuerpo aceptor para obtener actividad de unión.

Queen et al., 1989 (supra) y WO 90/07861 (Protein Design Labs) han descrito la preparación de un anticuerpo humanizado que contiene residuos modificados en las regiones estructurales del anticuerpo aceptor combinando las CDR de un MAb murino (anti-Tac) con regiones estructurales y constantes de inmunoglobulina humana. Han demostrado una solución al problema de la pérdida de afinidad de unión que con frecuencia se produce de la transferencia directa de CDR sin modificaciones de los residuos estructurales en las regiones V humanas; su solución implica dos pasos clave. Primero, se eligen las regiones estructurales de la región V humana mediante análisis por ordenador para homología óptima de secuencia de proteínas para la región estructural de la región V del anticuerpo murino original, en este caso, el MAb anti-Tac. En el segundo paso, se modela por ordenador la estructura terciaria de la región V murina para visualizar los residuos de aminoácidos de la región estructural que es más probable que interaccionen con las CDR murinas y después se superimponen estos residuos de aminoácidos murinos sobre la región estructural humana homóloga. Véase también las patentes de EE.UU. 5693762; 5693761; 5585089 y 5530101 (Protein Design Labs).

Se puede usar un planteamiento diferente (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271) y utilizar, como estándar, las regiones estructurales de la región V derivadas de las cadenas pesada y ligera NEWM y REI respectivamente para injerto de CDR sin introducción radical de residuos de ratón. Una ventaja de usar el planteamiento de Tempest y col. para construir anticuerpos humanizados basados en NEWM y REI es que las estructuras tridimensionales de las regiones variables de NEWM y REI se conocen de cristalografía de rayos X y de esta manera se pueden modelar interacciones específicas entre las CDR y los residuos estructurales de la región V.

Independientemente del planteamiento seguido, los ejemplos de los homólogos de anticuerpos humanizados iniciales preparados hasta la fecha han mostrado que no es un proceso directo. Sin embargo, incluso reconociendo que tales cambios en la región estructural pueden ser necesarios, no es posible predecir, en base a la técnica anterior de la que se dispone, qué residuos estructurales, si hace falta alguno, se necesitará cambiar para obtener anticuerpos recombinantes humanizados funcionales de la especificidad deseada. Los resultados hasta ahora indican que los cambios necesarios para conservar la especificidad y/o afinidad son en la mayor parte únicos para un anticuerpo determinado y no se pueden predecir basados en la humanización de un anticuerpo diferente.

Ciertos antagonistas de integrinas que contienen subunidades alfa4 como se describe y divulga en la presente invención incluyen homólogos de anticuerpos recombinantes quiméricos y humanizados (es decir, inmunoglobulinas intactas y partes de las mismas) con especificidad de epítopo B que se han preparado y se describen en la patente de EE.UU. 5932214 (mab HP1/2). El material de partida para la preparación de homólogos de anticuerpos anti-integrina quiméricos (variable de ratón-constante humana) y humanizados puede ser un anticuerpo monoclonal anti-integrina murino como se ha descrito previamente, un anticuerpo monoclonal anti-integrina comercialmente disponible (por ejemplo, HP2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine) o un anticuerpo monoclonal anti-integrina preparado según la enseñanza de aquí. Otros homólogos de anticuerpo anti-VLA4 humanizados los describe Athena Neurosciences, Inc. en WO 95/19790 (27 Julio de 1995) y patente de EE.UU. 5840299.

Estos anticuerpos anti-VLA-4 humanizados comprenden una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada. La cadena ligera humanizada comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad correspondientes de una cadena ligera de inmunoglobulina de ratón 21-6, y una región estructural de la región variable de una secuencia estructural de la región variable de la cadena ligera kappa humana excepto en que en al menos una posición la posición de aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente de la región estructural de la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina de ratón 21.6. La cadena pesada humanizada comprende tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad correspondientes de una cadena pesada de inmunoglobulina de ratón 21-6, y una región estructural de la región variable de una secuencia estructural de la región variable de la cadena pesada humana excepto en que en al menos una posición la posición de aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente de la región estructural de la región variable de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón 21-6.

C. Producción de fragmentos y análogos

También se pueden producir eficazmente fragmentos de un antagonista de integrina alfa4 aislado (por ejemplo, los fragmentos de homólogos de anticuerpo descritos anteriormente) por métodos recombinantes, por digestión proteolítica o por síntesis química usando métodos que conocen los expertos en la materia. En los métodos recombinantes, se pueden generar fragmentos internos o terminales de un polipéptido eliminando uno o más nucleótidos de un extremo (para un fragmento terminal) o de ambos extremos (para un fragmento interno) de una secuencia de ADN que codifica el polipéptido hedgehog aislado. La expresión del ADN mutagenizado produce fragmentos de polipéptidos. La digestión con endonucleasas "mordedoras de los extremos" también puede generar ADN que codifica una colección de fragmentos. También se pueden generar ADN que codifican fragmentos de una proteína por cizallamiento al azar, digestión de restricción o una combinación o ambos. Los fragmentos de proteína se pueden generar directamente a partir de proteínas intactas. Los péptidos se pueden cortar específicamente por enzimas proteolíticas, incluyendo, pero no limitadas a plasmina, trombina, tripsina, quimotripsina o pepsina. Cada una de estas enzimas es específica para el tipo de enlace peptídico que ataca. La tripsina cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos en los que el grupo carbonilo es de un aminoácido básico, normalmente arginina o lisina. La pepsina y quimotripsina catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos de aminoácidos aromáticos, tales como triptófano, tirosina y fenilalanina. Se generan conjuntos alternativos de fragmentos proteicos cortados previniendo el corte en un sitio que es susceptible a una enzima proteolítica. Por ejemplo, la reacción del grupo \varepsilon-aminoácido de la lisina con trifluorotioacetato de etilo en una solución moderadamente ácida produce residuos de aminoácidos bloqueados cuyo enlace peptídico adyacente ya no es susceptible a la hidrólisis por tripsina. Las proteínas se pueden modificar para crear enlaces peptídicos que sean susceptibles a enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la alquilación de residuos de cisteína con \beta-haloetilaminas produce enlaces peptídicos que se hidrolizan por tripsina (Lindley, (1956) Nature 178, 647). Además, se pueden usar reactivos químicos que cortan las cadenas peptídicas en residuos específicos. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno corta péptidos en residuos de metionina (Gross y Witkip, (1961) J. Am. Chem. Soc. 83, 1510). De esta manera, tratando las proteínas con varias combinaciones de modificadores, enzimas proteolíticas y/o reactivos químicos, las proteínas se pueden dividir en fragmentos de una longitud deseada sin solapamiento de los fragmentos, o dividir en fragmentos que se solapan de una longitud deseada.

Los fragmentos también se pueden sintetizar químicamente usando métodos conocidos en la técnica tal como la química de fase sólida Fmoc o t-Boc de Merrifield. Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23: 451 (1967):

Los ejemplos de los métodos en la técnica anterior que permiten la producción y ensayo de fragmentos y análogos se describen posteriormente. Se pueden usar éstos, o métodos análogos, para hacer y cribar fragmentos y análogos a un antagonista de integrina alfa4 aislado que se puede mostrar que tiene una actividad biológica. Un método ejemplar para probar si los fragmentos y análogos de antagonistas de integrina que contiene subunidad alfa 4 tienen actividad biológica se encuentra en la sección IV y los ejemplos.

D. Producción de secuencias de ADN y péptidos alteradas: Métodos al azar

Se pueden preparar variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína mediante mutagénesis al azar del ADN que codifica la proteína o un parte particular de la misma. Los métodos útiles incluyen mutagénesis por PCR y mutagénesis de saturación. También se puede generar una librería de variantes de secuencias de aminoácidos al azar mediante la síntesis de una serie de secuencias de oligonucleótidos degeneradas. Los métodos de generar variantes de secuencias de aminoácidos de una proteína determinada usando ADN y péptidos alterados se conocen bien en la técnica. Los siguientes ejemplos de tales métodos no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención, sino que únicamente sirvan para ilustrar técnicas representativas. Los expertos en la materia reconocerán que otros métodos también son útiles a este respecto, tales como mutación por PCR, mutagénesis de saturación y mutagénesis por oligonucleótidos degenerados, como se describe en las referencias citadas más adelante.

Mutagénesis por PCR: Véase, por ejemplo, Leung et al., (1989) Technique 1, 11-15.

Mutagénesis de saturación: Se describe un método en general, en Mayers et al., (1989) Science 229, 242.

Mutagénesis con oligonucleótidos degenerados: Véase por ejemplo, Harang, S.A., (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura et al., (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 e Itakura et al., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, pp. 273-289 (A.G. Walton, ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981.

E. Producción de secuencias de ADN y péptidos alteradas: Métodos dirigidos

La mutagénesis no al azar o dirigida proporciona secuencias o mutaciones específicas en partes específicas de una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido aislado, para proporcionar variantes que incluyen deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de la secuencia de aminoácidos conocida del polipéptido aislado. Los sitios de mutación se pueden modificar individualmente o en series, por ejemplo: (1) sustituyendo primero con aminoácidos conservados y después con elecciones más radicales dependiendo de los resultados alcanzados; (2) delecionando el residuo diana; o (3) insertando residuos de la misma clase o una diferente adyacentes al sitio localizado, o combinaciones de las opciones 1-3.

Claramente tales métodos dirigidos son una manera en la que se puede introducir una cisteína N-terminal (o un equivalente funcional) en una secuencia polipeptídica determinada para proporcionar el sitio de unión para un grupo hidrofóbico. Otros métodos bien conocidos de mutagénesis dirigida se detallan en las referencias citadas a continuación.

Mutagénesis por barrido de alanina: Véase Cunningham y Wells, (1989) Science 244, 1081-1085).

Mutagénesis mediada por oligonucleótidos: Véase, por ejemplo, Adelman et al., (1983) DNA 2, 183.

Mutagénesis por inserción de un casete: Véase Wells et al., (1985) Gene 34, 315

Mutagénesis combinatoria: Véase, por ejemplo, Ladner et al., WO 88/06630

Estrategias de presentación en fagos: Véase, por ejemplo la revisión de Marks et al., J. Biol. Chemistry: 267 16007-16010 (1992).

F. Otras variantes de los antagonistas de integrinas alfa 4

Las variantes se pueden diferenciar de otros antagonistas de integrinas alfa 4 en la secuencia de aminoácidos o en modos que no implican la secuencia o ambos. Los polipéptidos más preferidos de la invención tienen modificaciones preferidas no de secuencia que incluyen derivación química in vivo o in vitro (por ejemplo, de su extremo N-terminal), así como posibles cambios en acetilación, metilación, fosforilación, amidación, carboxilación o glicosilación.

Otros análogos incluyen una proteína o sus fragmentos biológicamente activos cuyas secuencias difieren de TA2 o las encontradas en las patentes de EE.UU. 5840299 o US 5888507; US 5932214 o WO 94/16094 por una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos o por una o más sustituciones no conservadoras de aminoácidos, o por deleciones o inserciones que no anulan la actividad biológica de la proteína aislada. Las sustituciones conservadoras típicamente incluyen la sustitución de un aminoácido por otro con características similares tales como sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparragina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrofóbicos no polares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparragina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. El experto en la materia puede conocer fácilmente otras sustituciones conservadoras. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, se puede tomar una sustitución conservadora de cualquiera de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para la lisina, un cambio puede ser cualquiera de D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina ornitina o D-ornitina.

Otros análogos descritos y divulgados en la invención son aquellos con modificaciones que aumentan la estabilidad del péptido. Tales análogos pueden contener, por ejemplo, uno o más enlaces no peptídicos (que reemplazan los enlaces peptídicos) en la secuencia peptídica. También se incluyen: análogos que incluyen residuos diferentes de L-aminoácidos naturales, tales como D-aminoácidos o aminoácidos no naturales o sintéticos tales como beta o gamma aminoácidos y análogos cíclicos. La incorporación de D-aminoácidos en lugar de L-aminoácidos en el polipéptido hedgehog aislado puede aumentar su resistencia a proteasas. Véase, la patente de EE.UU. 5219990, supra.

Los homólogos de anticuerpos preferidos como se describen y divulgan aquí incluyen una secuencia de aminoácidos al menos el 60%, el 80%, el 90%, el 95%, el 98% o el 99% homóloga a una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo TA2 o una secuencia al menos el 60%, el 80%, el 90%, el 95%, el 98% o el 99% homóloga a secuencias de aminoácidos descritas en, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5840299 (por ejemplo, SEQ ID NO 15, región variable de la cadena ligera; SEQ ID NO 17, región variable de la cadena pesada); patente de EE.UU. 5932214 (por ejemplo, SEQ ID NOS: 2 y 4) y la solicitud de patente publicada WO94/16094 (esas secuencias encontradas en el anticuerpo anti-VLA4 de la línea celular ATCC CRL 11175).

G. Formas conjugadas a polímeros

La presente invención también describe que, se puede emplear una única molécula de polímero para conjugación con un antagonista de integrina alfa4, aunque también se describe aquí, que se pueden unir asimismo más de una molécula de polímero.

Las composiciones de antagonistas de integrinas alfa4 conjugados como se describen en el contexto de la invención pueden encontrar utilidad tanto en aplicaciones in vivo como in vitro. Además, se reconocerá que el polímero que se conjuga puede utilizar cualquier otro grupo, parte u otra especie conjugada, como sea apropiado para la aplicación final de uso. A modo de ejemplo, en algunas aplicaciones puede ser útil unir de forma covalente al polímero un grupo funcional que de resistencia a la degradación por UV, o antioxidación u otras propiedades o características al polímero. Como ejemplo adicional, en algunas aplicaciones puede ser ventajoso funcionalizar el polímero para hacerlo reactivo y permitir que se entrecruce con una molécula de fármaco, para aumentar varias propiedades o características del material conjugado global. Según esto, el polímero puede contener cualquier funcionalidad, grupos que se repiten, uniones u otras estructuras constituyentes que no excluyan la eficacia de la composición del antagonista de integrina alfa4 conjugado para el propósito deseado. Otros objetivos y ventajas como se describen y divulgan en la presente invención serán más completamente aparentes a partir de divulgación subsiguiente y las reclamaciones adjuntas.

Los polímeros ilustrativos que se pueden emplear útilmente para alcanzar estas características deseables se describen aquí más adelante en esquemas de reacciones ejemplares. En conjugados antagonista/polímero unidos covalentemente, el polímero se puede funcionalizar y después acoplar a aminoácido(s) libre(s) del antagonista para formar enlaces lábiles.

Los antagonistas de integrinas alfa4 se conjugan lo más preferiblemente a través de un grupo reactivo terminal en el polímero aunque la conjugación también puede ser ramificada a partir de grupos reactivos no terminales. El polímero con el/los grupo(s) reactivo(s) se designa aquí "polímero activado". El grupo reactivo reacciona selectivamente con los grupos reactivos amino u otros libres en la molécula de antagonista. El polímero activado se hace reaccionar de modo que se pueda producir la unión en cualquier grupo amino del antagonista de integrina alfa4 disponible tales como los grupos alfa amino o los grupos épsilon amino de las lisinas. También se pueden usar como sitios de unión grupos carboxílico libres, grupos carbonilo activados de forma adecuada, grupos hidroxilo, guanidilo, grupos carbohidrato oxidados y grupos mercapto del antagonista de integrina alfa4 (si están disponibles).

Aunque el polímero se puede unir en cualquier lugar en la molécula de antagonista de integrina alfa4, un sitio preferido para el acoplamiento del polímero a los antagonistas de integrina (particularmente aquellos que son proteínas) es el extremo N del antagonista de integrina alfa4. Los sitios secundarios están en o cerca del extremo C y a través de grupos de azúcar (si hay alguno). De esta manera, la invención contempla: (i) conjugados de polímero acoplados en el N-terminal de los antagonistas de integrina alfa4; (ii) conjugados de polímero acoplados en el C-terminal de antagonistas de integrina alfa4; (iii) conjugados acoplados mediante azúcar, (iv) así como conjugados de polímeros acoplados en N- C- y azúcar de antagonistas de integrina alfa4.

En general se emplean desde alrededor de 1,0 hasta alrededor de 10 moles de polímero activado por mol de antagonista, dependiendo de la concentración de antagonista. La cantidad final es un balance entre maximizar el nivel de la reacción mientras se minimizan las modificaciones no específicas del producto y, al mismo tiempo, se definen químicas que mantendrán la actividad óptima, mientras que al mismo tiempo se optimiza, si es posible, la vida media del antagonista. Preferiblemente, se mantiene al menos alrededor del 50% de la actividad biológica del antagonista, y lo más preferiblemente se mantiene el 100%.

Las reacciones pueden tener lugar mediante cualquier método adecuado reconocido por la técnica usado para hacer reaccionar materiales biológicamente activos con polímeros inertes. En general, el proceso implica preparar un polímero activado (que puede tener al menos un grupo hidroxilo terminal) y posteriormente hacer reaccionar el antagonista con el polímero activado para producir la proteína soluble adecuada para la formulación. La reacción de modificación anterior se puede realizar mediante varios métodos, que pueden implicar uno o más pasos.

Como se ha mencionado anteriormente, ciertas formas de realización de la invención describen y divulgan el extremo N-terminal de un antagonista de integrina alfa4 como la unión al polímero. Los métodos convencionales adecuados están disponibles para obtener de forma selectiva un antagonista de integrina alfa4 modificado en el N-terminal. Se ejemplifica un método mediante un método de alquilación reductora que explota la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (los grupos épsilon amino en la lisina frente a los grupos amino en un metionina N-terminal) disponibles para derivar en un antagonista de integrina alfa4. En las condiciones adecuadas de selección, se puede alcanzar sustancialmente la derivación selectiva de un antagonista de integrina alfa4 adecuado en el N-terminal del mismo con un polímero que contiene un grupo carbonilo. La reacción se realiza a un pH que permita tomar ventaja de las diferencias de pKa entre los grupos épsilon amino de los residuos de lisina y el del grupo alfa amino de un residuo N-terminal de un antagonista de integrina alfa4. El experto en la materia conoce bien este tipo de química.

Una estrategia para dirigir un polímero de polialquilenglicol tal como PEG al extremo C-terminal de un antagonista de integrina alfa4 (por ejemplo, como una proteína) sería unir químicamente o manipular genéticamente un sitio que se pueda usar para atacar el grupo polimérico. Por ejemplo, la incorporación de una Cys en un sitio que está en o cerca del C-terminal de una proteína permitiría la modificación específica usando derivados de polialquilenglicol (por ejemplo, PEG) activados con maleimida, vinilsulfona o haloacetato reconocidos en la técnica. Estos derivados se pueden usar específicamente para la modificación de las cisteínas manipuladas debido a la alta selectividad de estos reactivos por Cys. Otras estrategias, tales como la incorporación de una etiqueta de histidina que puede ser una diana (Fancy et. al., (1996) Chem. & Biol. 3: 551) o un sitio adicional de glicosilación en una proteína, representan otras alternativas para modificar el C-terminal de un antagonista de integrina alfa4.

Los métodos para atacar azúcares como sitios para la modificación química también son bien conocidos y por lo tanto es probable que se pueda añadir directa y específicamente un polímero de polialquilenglicol a azúcares (si los hay) en un antagonista de integrina alfa4 que se hayan activado mediante oxidación. Por ejemplo, se puede generar un polietilenglicol-hidrazida que forma enlaces hidrazona relativamente estables mediante condensación con aldehídos y cetonas. Se ha usado esta propiedad para la modificación de proteínas mediante enlaces de oligosacáridos oxidados. Véase Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179: 301. En particular, el tratamiento de PEG-carboximetilhidrazida con nitrito produce PEG-carboximetil-azida que es un grupo electrofílicamente activo reactivo hacia los grupos amino. Esta reacción se puede usar para preparar también proteínas modificadas con polialquilenglicol. Véase las patentes de EE.UU. 4101380 y 4179337.

Se puede usar la química mediada por enlazadores tiol reconocida en la técnica para facilitar adicionalmente el entrecruzamiento de proteínas para formar composiciones de antagonistas de integrinas alfa4 multivalentes. En particular, se pueden generar aldehídos reactivos en grupos de hidratos de carbono con peryodato de sodio, formando conjugados de cistamina a través de los aldehídos e induciendo el entrecruzamiento a través de los grupos tiol en las cistaminas. Véase, Pepinsky, B. et al., (1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249 y Chen, L.L. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237-18243. Por lo tanto, este tipo de química también sería apropiado para la modificación con polímeros de polialquilenglicol donde se incorpora un enlazador en el azúcar y el polímero de polialquilenglicol se une al enlazador. Mientras que los enlazadores que contienen aminotiol o hidracina permitirán la adición de un grupo polimérico único, la estructura del enlazador puede variar de modo que se añadan polímeros múltiples y/o que cambie la orientación espacial del polímero con respecto al antagonista de integrina alfa4.

En la práctica de la presente invención, se incorporan residuos de polialquilenglicol de polialquilenglicol de alquilo de C1-C4, preferiblemente polietilenglicol o residuos de poli(oxi)alquilenglicol de tales glicoles de forma ventajosa en los sistemas poliméricos de interés. De esta manera, el polímero al que se une la proteína puede ser un homopolímero de polietilenglicol (PEG) o es un poliol polioxietilado, siempre que en todos los casos el polímero sea soluble en agua a temperatura ambiente. Ejemplos no limitantes de tales polímeros incluyen homopolímeros de óxido de polialquileno tales como PEG o polipropilenglicoles, glicoles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros en bloque de los mismos, siempre que la solubilidad en agua del copolímero en bloque se mantenga. Los ejemplos de polioles polioxietilados incluyen, por ejemplo, glicerol polioxietilado, sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada o similares. El esqueleto de glicerol del glicerol polioxietilado es el mismo esqueleto que se da de forma natural en, por ejemplo, mono-, di- y triglicéridos animales y humanos. Por lo tanto, esta ramificación no se vería necesariamente como un agente extraño en el cuerpo.

Como alternativa a los óxidos de polialquileno se pueden usar polímeros basados en polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, alcoholes polivinílicos, hidratos de carbono y similares. Los expertos en la materia reconocerán que la lista anterior es solamente ilustrativa y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas aquí.

El polímero no necesita tener un peso molecular particular, pero se prefiere que el peso molecular esté entre alrededor de 300 y 100.000, más preferiblemente entre 10.000 y 40.000. En particular, tamaños de 20.000 o más son los mejores para prevenir pérdida del producto debido a la filtración en los riñones.

La derivación de polialquilenglicol tiene un número de propiedades ventajosas en la formulación de conjugados polímero-antagonista de integrina alfa4 en la práctica de la presente invención, asociadas con las siguientes propiedades de los derivados de polialquilenglicol: mejora de la solubilidad acuosa, mientras que al mismo tiempo no inducen respuesta antigénica o inmunogénica; altos grados de biocompatibilidad; ausencia de biodegradación in vivo de los derivados de polialquilenglicol y facilidad de excreción por los organismos vivos.

Además, otro aspecto de la invención describe que se puede utilizar un antagonista de integrina alfa4 unido covalentemente al componente polimérico en el que la naturaleza de la conjugación implica enlaces químicos covalentes rompibles. Esto permite el control en términos de evolución temporal durante el que el polímero puede ser cortado del antagonista de integrina alfa4. Este enlace covalente entre el antagonista de integrina alfa4 y el polímero se puede romper mediante una reacción química o enzimática. El producto polímero-antagonista de integrina alfa4 mantiene una cantidad aceptable de actividad. Al mismo tiempo, partes del polietilenglicol están presentes en el polímero de conjugación para dotar al conjugado polímero-antagonista de integrina alfa4 con alta solubilidad acuosa y capacidad de circulación sanguínea prolongada. Como resultado de estas características mejoradas la invención contempla la administración parenteral, nasal y oral tanto de la especie activa del polímero-antagonista de integrina alfa4 y, después del corte hidrolítico, biodisponibilidad del antagonista de integrina alfa4 por si, en aplicaciones in vivo.

Se debe entender que los esquemas de reacción descritos aquí se proporcionan con fines de ilustración sólo y no deben ser limitantes con respecto a las reacciones y estructuras que se pueden utilizar en la modificación del antagonista de integrina alfa4, por ejemplo, para alcanzar solubilidad, estabilización y afinidad por la membrana celular para la administración parenteral y oral. La actividad y estabilidad de los conjugados de antagonista de integrina alfa4 puede variar de varias maneras, usando un polímero de diferente tamaño molecular. Las solubilidades de los conjugados pueden variar cambiando la proporción y tamaño del fragmento de polietilenglicol incorporado en la composición polimérica.

III. Aplicaciones terapéuticas

La cantidad de principio activo que se puede combinar con los materiales soporte para producir una forma posológica individual variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. Se debe entender, sin embargo, que una dosis y pauta de tratamiento específicos para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, tasa de excreción, combinación de fármacos y el juicio del médico y la gravedad de la enfermedad particular que se trata. La cantidad de principio activo también puede depender del agente terapéutico o profiláctico, si hay alguno, con el que el ingrediente se coadministra.

La dosis y tasa de dosis de los compuestos de esta invención eficaces para prevenir, suprimir o inhibir la adhesión celular dependerán de varios factores, tales como la naturaleza del inhibidor, el tamaño del paciente, el fin del tratamiento, la naturaleza de la patología a ser tratada, la composición farmacéutica específica usada y el juicio del médico. Son útiles niveles de dosificación entre alrededor de 0,001 y alrededor de 100 mg/kg de peso corporal por día, preferiblemente entre alrededor de 0,1 y alrededor de 50 mg/kg de peso corporal por día del compuesto principio activo. Lo más preferiblemente, el agente de unión a VLA-4, si es un anticuerpo o derivado de anticuerpo, se administrará a una dosis que varía entre alrededor de 0,1 mg/kg de peso corporal/día y alrededor de 20 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente entre alrededor de 0,1 mg/kg de peso corporal/día y alrededor de 10 mg/peso corporal/día y a intervalos de cada 1-14 días. Para agentes de unión no anticuerpos o de molécula pequeña, el intervalo de dosis estaría preferiblemente entre cantidades equivalentes molares de esas cantidades de anticuerpo. Preferiblemente, una composición de anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para proporcionar un nivel plasmático de anticuerpo de al menos 1 mg/ml. La optimización de las dosis se puede determinar mediante la administración de los agentes de unión, seguido por evaluación del recubrimiento de células positivas para integrina por el agente a lo largo del tiempo después de administrado a una dosis determinada in vivo.

La presencia del agente administrado se puede detectar in vitro (o ex vivo) mediante la incapacidad o capacidad disminuida de las células del individuo de unir el mismo agente que se ha marcado (por ejemplo, mediante un fluorocromo). La dosis preferida debería producir recubrimiento detectable de la gran mayoría de células positivas para integrina. Preferiblemente, el recubrimiento continúa en el caso de un homólogo de anticuerpo durante un periodo de 1-14 días.

Otra modalidad preferida para introducir el antagonista en el contexto de los usos proporcionados aquí es mediante terapia de combinación con un agente farmacológico. El agente farmacológico es preferiblemente un agente con algún grado de eficacia terapéutica en el tratamiento de lesión cerebral aguda. Tales agentes pueden incluir, pero no están limitados a, agentes trombolíticos tales como plasminógeno o uroquinasa, agentes dirigidos a mecanismos excitotóxicos tales como selfotel^{TM} y aptiganel^{TM}, agentes dirigidos a daño neuronal asociado con óxido nítrico tal como lubeluzol^{TM}, agentes dirigidos al daño en la membrana celular neuronal asociado a isquemia tal como tirilizad^{TM}, agentes dirigidos a mecanismos antiinflamatorios tal como enlimomab^{TM}. En el contexto de los usos proporcionados aquí, el agente se puede combinar con los antagonistas de integrina alfa4 divulgados por la invención bien antes de, durante o después de la administración de los antagonistas.

IV. Formulaciones y usos para la preparación de composiciones farmacéuticas para tratamiento

En el contexto de los usos según esta invención se va a administrar una cantidad eficaz de principio activo por vía interna o tópica al sujeto. Las dosis de principios activos en los usos inventivos son una cantidad eficaz no tóxica. Los expertos en la materia de usar pruebas clínicas de rutina son capaces de determinar las dosis óptimas para la dolencia que se trata.

Los expertos en la materia emplearán pruebas estándar para la recuperación neurológica (por ejemplo, escala de ictus de los NIH, índice de Barthel, escala de Rankin modificada, escala pronóstica de Glasgow) para determinar la eficacia. La dosis deseada se administra a un sujeto una o más veces al día, por vía intravenosa, oral, rectal, parenteral, intranasal, tópica o mediante inhalación. La dosis deseada también se puede dar mediante infusión intravenosa continua.

En la administración parenteral de los inhibidores de integrinas alfa4 en el contexto de los usos de esta invención, los compuestos se pueden formular en solución de inyección acuosa que puede contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, etc. Las soluciones de inyección extemporáneas se pueden preparar a partir de píldoras, gránulos o comprimidos estériles que pueden contener diluyentes, agentes dispersantes y tensoactivos, aglutinantes y lubricantes, materiales que conoce bien el experto en la materia.

En el caso de administración oral se pueden formular polvos o gránulos finos del compuesto con diluyentes y agentes dispersantes y tensoactivos, y se puede preparar en agua o en un jarabe, en cápsulas o sellos en estado seco o en una suspensión no acuosa donde se puede incluir un agente suspensor. En el contexto de los usos proporcionados aquí, los compuestos también se pueden administrar en forma de comprimido junto con aglutinantes y lubricantes opcionales, o en una suspensión en agua o jarabe o un aceite o en una emulsión de agua en aceite y pueden incluir agentes saborizantes, conservantes, suspensores, espesantes y emulsionantes. Los gránulos o comprimidos para la administración oral pueden estar recubiertos o se pueden utilizar otros agentes y formulaciones farmacéuticamente aceptables, todos bien conocidos para el experto en la materia.

También se pueden usar soportes sólidos o líquidos. Los soportes sólidos incluyen almidón, lactosa, sulfato de calcio dihidrato, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato de magnesio y ácido esteárico. Los soportes líquidos incluyen jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, solución salina y agua. Las pomadas y cremas se preparan usando materiales poliméricos conocidos tales como varios polímeros acrílicos seleccionados para proporcionar las características de liberación deseadas. Los supositorios se preparan de bases estándar tales como polietilenglicol y manteca de cacao.

Los usos proporcionados por la presente invención divulgan la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones al SNC de un paciente, mediante los cuales se describe que se va a administrar una integrina alfa4. En otras formas de realización, en el contexto de los usos, se va administrar además al paciente un agente farmacológico.

En formas de realización preferidas, el agente farmacológico es un agente trombolítico, un agente neuroprotector, un agente antiinflamatorio, un esteroide, una citoquina o un factor de crecimiento. El agente trombolítico usado en la presente invención es preferiblemente activador tisular de plasminógeno o uroquinasa. El agente neuroprotector usado en la presente invención es por ejemplo, un antagonista de un receptor seleccionado del grupo que consiste en: un receptor de N-metil D-aspartato (NMDA), un receptor de ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), un receptor canal de calcio, un receptor B2 de bradiquinina y un receptor canal de sodio, o un agonista seleccionado del grupo que consiste en: un receptor B1 de bradiquinina, receptor de ácido \gamma-aminobutírico (GABA) y un receptor A1 de adenosina. Los agentes antiinflamatorios para su uso en la presente invención incluyen interleuquina-1 y miembros de la familia del factor de necrosis tumoral.

Como contempla la presente invención, el antagonista de integrina alfa4 usado puede ser un homólogo de anticuerpo y preferiblemente un homólogo de anticuerpo humanizado o un fragmento de un homólogo de anticuerpo. En otras formas de realización el homólogo de anticuerpo puede estar unido a una molécula de polímero. En la presente invención, también se describe y divulga que el antagonista de integrina alfa4 puede ser de forma alternativa capaz de antagonizar una única integrina que contiene una subunidad alfa4 o más de una integrina que contiene una subunidad alfa4.

Ejemplos Ejemplo 1 Protocolo para la oclusión reversible de la arteria cerebral media en rata

Se anestesiaron ratas macho Sprague Dawley (SD) o espontáneamente hipertensas (REH) usando isofluorano y se ocluyó la arteria cerebral media derecha (MCAO) mediante inserción de un monofilamento de nailon 4-0 hacia arriba de la arteria carótida interna hasta el origen de la arteria cerebral media (MCA) (Zea Longa et al, 1989 Stroke 20:84). Después de 1 hora el filamento se retiró, la zona isquémica se reperfundió y se dejó que el animal se recuperara. Después de 24 horas se sacrificaron las ratas, tiempo al que se retiraron los cerebros y se analizaron histológicamente para cuantificar el volumen del infarto.

Se trataron grupos de animales bien con vehículo (PBS) o el antagonista del receptor B_{2} de bradiquinina Hoe 140 (Hoechst) mediante infusión subcutánea continua a través de minibombas osmóticas. Se implantaron minibombas osmóticas cebadas (Alza Corp.) en el espacio subcutáneo del pescuezo inmediatamente antes de la inducción de la isquemia cerebral. Las bombas se cargaron para liberar 300 ng/kg/min de Hoe 140 y distribuyeron el compuesto o vehículo a una velocidad de 8 \mul/h.

En un experimento separado se trataron grupos de animales con vehículo (solución salina isotónica estéril), TA2 (anti-VLA4 de rata de ratón; Seikagaku America Inc.) o un anticuerpo control de isotipo (anti-LFA3 humano de ratón; obtenido de Biogen, Inc.). Todos los tratamientos se administraron 24 horas antes de la cirugía por vía intravenosa (2,5 mg/kg o un volumen apropiado de vehículo).

Ejemplo 2 Resultados del modelo de oclusión reversible de la arteria cerebral media

Las ratas tratadas con vehículo control que se sometieron a MCAO sufrieron lesiones extensas en las regiones cortical y subcortical del cerebro enteras. El hemisferio isquémico se hinchó marcadamente y se observaron deficiencias de comportamiento significativas (por ejemplo, hemiparesia que produjo debilidad en rotación y extremidades). Las ratas espontáneamente hipertensas sufrieron infartos cerebrales más extensos y reproducibles que las ratas Sprague Dawley sometidas al mismo procedimiento quirúrgico. Los volúmenes de infarto se expresan como valores medios +/- e.e.m. Se realizó el análisis estadístico usando la prueba t de Student independiente (* representa p<0,05, ** representa p<0,01).

El tratamiento con el antagonista del receptor B_{2} de bradiquinina Hoe 140 (n=9) redujo significativamente el volumen de infarto total, cortical y subcortical, en un 37%, un 43% y un 17% respectivamente, comparado con controles tratados con vehículo (n=8) medido 24 horas después de la inducción de isquemia cerebral en REH. En ratas SD el tratamiento con la misma dosis de Hoe 140 (n=6) redujo el volumen de infarto total, cortical y subcortical, en un 57%, un 93% y un 24% respectivamente, comparado con controles tratados con vehículo (n=7) medido 24 horas después de la inducción de isquemia cerebral. Estos datos son consistentes con descubrimientos anteriores (Relton et. al, 1997 Stroke 28:1430) y se tomaron como un control positivo.

En REH el pre-tratamiento con el anticuerpo anti-\alpha4, TA-2 (2,5 mg/kg iv, n=10), 24 horas antes de la inducción de la isquemia cerebral redujo significativamente los volúmenes de infarto total, cortical y subcortical, en un 43%, un 47% y un 35% respectivamente, comprados con animales tratados con la misma dosis de un anticuerpo control de isotipo (n=15) medido 24 horas después de la inducción de isquemia cerebral. En ratas SD, usando el mismo protocolo, el volumen de infarto total, cortical y subcortical se redujo significativamente en un 64%, un 65% y un 38%, respectivamente.

Las gráficas en las figuras 1A y 1B muestran el efecto de Hoe 140 en el tamaño del infarto 24 horas después de MCAO de 60 minutos en ratas Sprague Dawley y espontáneamente hipertensas. Las figuras muestran la inhibición del infarto cerebral después del tratamiento con Hoe 140 (300 ng/kg/min) mediante infusión subcutánea continua comparada con animales control tratados con vehículo. El tamaño del infarto se reduce en las regiones cortical y subcortical del cerebro en ambas cepas de ratas.

Las gráficas mostradas en las figuras 2A y 2B muestran el efecto de anticuerpo anti-alfa4 de rata (TA-2, 2,5 mg/kg) en el tamaño del infarto 24 horas después de MCAO de 60 minutos en ratas Sprague Dawley y espontáneamente hipertensas. Las figuras muestran la inhibición significativa del infarto cerebral después del pre-tratamiento intravenoso con anticuerpo TA-2 comparado con animales tratados con un anticuerpo control de isotipo. Se observó protección contra el daño cerebral en ambas cepas de ratas.

Estos datos demuestran el efecto protector de la inhibición de integrinas \alpha4 en un modelo de isquemia cerebral focal reversible en rata. La patología de este modelo es clínicamente representativa de la afección humana del ictus y los datos presentes sugieren que los inhibidores de integrinas que contienen subunidades alfa4 pueden tener un beneficio significativo en el tratamiento de este y otros trastornos relacionados con isquemia.

Claims (18)

1. Uso de un anticuerpo anti-\alpha4 o un fragmento de unión a \alpha4 del mismo para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de lesiones de la médula espinal.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde la composición farmacéutica comprende además un agente farmacológico.

3. El uso de la reivindicación 2, en donde el agente es un agente neuroprotector.

4. El uso de la reivindicación 2, en donde el agente es un agente antiinflamatorio.

5. El uso de la reivindicación 2, en donde el agente es un esteroide.

6. El uso de la reivindicación 2, en donde el agente es una citoquina o un factor de crecimiento.

7. El uso de la reivindicación 3, en donde el agente neuroprotector es un antagonista de un receptor, el receptor seleccionado del grupo que consiste en: receptor N-metil-D-aspartato (NMDA), receptor de ácido \alpha-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico (AMPA), receptor de glicina, receptor canal de calcio, receptor B2 de bradiquinina y receptor canal de sodio.

8. El uso de la reivindicación 4, en donde el agente antiinflamatorio se selecciona del grupo que consiste en interleuquina-1 y miembros de la familia del factor de necrosis tumoral.

9. El uso de la reivindicación 3, en donde el agente neuroprotector es un agonista de un receptor, el receptor seleccionado del grupo que consiste en: el receptor B1 de bradiquinina, receptor de ácido \gamma-aminobutírico (GABA) y receptor A1 de adenosina.

10. El uso de la reivindicación 2, en donde el agente farmacológico es un agente trombolítico.

11. El uso de la reivindicación 10, en donde el agente trombolítico se selecciona del grupo que consiste en activador tisular de plasminógeno y uroquinasa.

12. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el anticuerpo anti-\alpha4 o el fragmento de unión a \alpha4 del mismo es un anticuerpo monoclonal anti-\alpha4 o un fragmento de unión a \alpha4 del mismo.

13. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el anticuerpo anti-\alpha4 o el fragmento de unión a \alpha4 del mismo es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-\alpha4 o un fragmento de unión a \alpha4 del mismo.

14. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el anticuerpo anti-\alpha4 o el fragmento de unión a \alpha4 del mismo es un anticuerpo monoclonal humano anti-\alpha4 o un fragmento de unión a \alpha4 del mismo.

15. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el anticuerpo anti-\alpha4 o el fragmento de unión a \alpha4 del mismo es un anticuerpo quimérico anti-\alpha4 o un fragmento de unión a \alpha4 del mismo.

16. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde el fragmento de unión a \alpha4 es un fragmento Fab, Fab', F(ab')2 o Fv.

17. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el anticuerpo anti-\alpha4 o el fragmento de unión a \alpha4 del mismo es un anticuerpo anti-\alpha4 específico de epítopo B o un fragmento de unión a \alpha4 del mismo.

18. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde el anticuerpo anti-\alpha4 o el fragmento de unión a \alpha4 del mismo está unido a una molécula de polímero.