DE60027907T2

DE60027907T2 - Therapien für chronische niereninsuffizienz unter verwendung von ein oder mehreren integrinantagonist(en)

Info

Publication number: DE60027907T2
Application number: DE60027907T
Authority: DE
Inventors: Andrew Allen; Charles Pusey; Roy Westwood LOBB
Original assignee: Imperial College of Science Technology and Medicine; Biogen Idec Inc; Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Imperial College of Science Technology and Medicine; Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 1999-09-14
Filing date: 2000-09-14
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2020-09-15
Also published as: CY1105117T1; JP2011116791A; US20140234299A1; ATE325623T1; PT1214091E; ES2263485T3; EP1214091B1; JP5463316B2; US20030007969A1; JP2013116916A; AU7379200A; NZ517781A; JP4975922B2; EP1214091A1; AU783266B2; WO2001019396A1; DK1214091T3; JP2003509380A; US20110305686A1; DE60027907D1

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen medizinische Verwendungen für die Behandlung einer Nierenkrankheit. Insbesondere betrifft die Erfindung medizinische Verwendungen für die Behandlung von Zuständen, die Säuger, einschließlich Menschen, in chronisches Nierenversagen oder das Risiko von chronischem Nierenversagen versetzen. Diese Verwendungen involvieren die Verabreichung von bestimmten Integrinantagonisten.
Hintergrund der Erfindung
Viele physiologische Vorgänge erfordern, dass Zellen in engen Kontakt mit anderen Zellen und/oder der extrazellulären Matrix kommen. Solche Adhäsionsvorgänge können für die Zellaktivierung, Migration (z.B. Leukocyten-Migration), Proliferation und Differenzierung benötigt werden. Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen werden durch einige Familien von Zelladhäsionsmolekülen vermittelt, eine Familie davon schließt die Integrine ein.
Zelladhäsionsmoleküle spielen eine wesentliche Rolle sowohl in normalen als auch pathophysiologischen Vorgängen. Daher ist das Anzielen von spezifischen und relevanten Molekülen bei bestimmten Krankheitszuständen ohne die normalen zellulären Funktionen zu stören, wesentlich für ein wirksames und sicheres Therapeutikum, das die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen inhibiert.
Zum Beispiel ist die Leukocyten-Migration in die Glomeruli eine typische Eigenschaft von menschlicher Glomerulonephritis (GN), und Leukocyten sind die Schlüssel-Vermittler der Nierenschädigung. Eine ähnliche Leukocyten-Migration wird in Tiermodellen der GN gesehen. Siehe Allen et al., Journal of Immunology, 162: 5519-5527 (1999) und die darin zitierten Bezugnahmen. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass die Blockierung des Integrins VLA-4 eine akute nierentoxische Nephritis in einem Rattenmodell dieser Krankheit inhibiert (Allen et al., vorstehend; Tam, F.W.K. et al., Nephrol. Dial. Transplant. 14:1658-1666 (1999).
Obwohl es eine gewisse Information über die Rolle von Integrinen bei akuter Nierenkrankheit gibt, ist nichtsdestotrotz keine derzeitige Information erhältlich, die die Wichtigkeit von Zelladhäsionsmolekülen bei chronischer Nierenkrankheit aufklärt. Man kann nicht a priori voraussetzen, dass die Wichtigkeit eines Zelladhäsionsmoleküls bei akuter Nierenkrankheit notwendigerweise bedeuten wird, dass solche Moleküle bei chronischer Nierenkrankheit wichtig sind (Siehe Beispiel). Chronisches Nierenversagen (CRF) kann als eine fortschreitende, permanente und signifikante Reduzierung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) aufgrund eines signifikanten und kontinuierlichen Verlustes von Nephronen definiert werden. Chronisches Nierenversagen beginnt typischerweise bei einem Punkt, an dem eine chronische Niereninsuffizienz (d.h. ein permanentes Absinken der Nierenfunktion von mindestens 50-60%) aus einer Verletzung des Nierengewebes resultiert ist, die einen signifikanten Verlust von Nephron-Einheiten bewirkt hat. Die ursprüngliche Verletzung kann mit einem Vorfall von akutem Nierenversagen assoziiert gewesen sein oder nicht, oder sie kann mit einer Zahl von Nierenstörungen, einschließlich Nierenkrankheit im Endstadium, chronischer diabetischer Nephropathie, diabetischer Glomerulopathie, diabetischer Nierenhypertrophie, hypertensiver Nephrosklerose, hypertensiver Glomerulosklerose, chronischer Glomerulonephritis, erblich-bedingter Nephritis, Nierendysplasie und chronischer Abstoßung nach einer allogenen Nierentransplantation, aber nicht darauf limitiert, assoziiert sein. Unabhängig vom Wesen der ursprünglichen Verletzung manifestiert ein chronisches Nierenversagen einen „allgemeinen Endweg" von Zeichen und Symptomen, wenn Nephronen fortschreitend verloren werden und die GFR fortschreitend sinkt. Dieser fortschreitende Verfall der Nierenfunktion ist langsam, sich typischerweise auf viele Jahre oder Jahrzehnte bei menschlichen Patienten erstrechend, aber ist scheinbar unausweichlich.
Molina et al., Journal of Immunology, 153:2313-2320 (1994) beschreiben die Verhinderung von Quecksilberchlorid-induzierter Nephritis bei der braunen Norwegischen Ratte durch die Behandlung mit Antikörpern gegen das alpha 4-Integrin. Es wird spekuliert, dass Therapien, die gestaltet wurden, um mit dem VLA4- Integrin zu interferieren, im Behandeln von Autoimmunerkrankungen nützlich sein können.
WO 98/04247 beschreibt verschiedene Verbindungen, die für die Inhibition und Verhinderung der Zelladhäsion und von Zelladhäsions-vermittelten Pathologien nützlich sind und die für die Behandlung von vielen Entzündungs- und Autoimmun-Krankheiten nützlich sein können.
Taylor et al., Blood, 89:4078-4084 (1997) beschreiben einen monoclonalen Antikörper gegen den GPIIb/IIIa-Blutplättchen-Rezeptor, der gegen mikroangiopathische, hämolytische Anämie und mikrovaskuläres, thrombotisches Nierenversagen in Pavianen, die mit Cb4-Bindungsprotein und einer subletalen Infusion von Escherichia coli behandelt wurden, schützt.
Rabb et al., Cell Adhesion and Communication, 6: 13-20 (1998) beschreiben das Expressionsmuster des Leukointegrins alpha d/beta₂ auf der Oberfläche von Zellen von Patienten mit Hämodialyse.
Wenn das chronische Nierenversagen fortschreitet und die GFR weiter auf weniger als 10% vom Normalen (z.B. 5-10 ml/min) sinkt, tritt beim Menschen der Patient in eine Nierenkrankheit im Endstadium (ESRD) ein. Während dieser Phase führt die Unfähigkeit der verbleibenden Nephronen, Abfallstoffe aus dem Blut angemessen zu entfernen, während nützliche Stoffe bewahrt und das Flüssigkeits- und Elektrolytgleichgewicht beibehalten werden, zu einem Verfall, in dem viele Organsysteme und besonders das Herzkreislauf-System schnell beginnen können, zu versagen. Zu diesem Zeitpunkt wird das Nierenversagen schnell zum Tod führen, außer wenn der Patient eine Nierenersatz-Therapie (d.h. chronische Hämodialyse, kontinuierliche peritoneale Dialyse oder Nierentransplantation) erhält.
Ungefähr 600 von einer Million Patienten erhalten in den Vereinigten Staaten jedes Jahr eine chronische Dialyse, wobei sich die Durchschnittskosten $60 000-$80 000 pro Patient pro Jahr annähern. Von den neuen Fällen der Nierenkrankheit im Endstadium pro Jahr erfolgen ungefähr 28-33% aufgrund von diabetischer Nephropathie (oder diabetischer Glomerulopathie oder diabetischer Nierenhypertrophie), 24-29% aufgrund von hypertensiver Nephrosklerose (oder hypertensiver Glomerulosklerose), und 15-22% erfolgen aufgrund einer Glomerulonephritis. Die 5 Jahres-Überlebensrate für alle chronischen Dialyse-Patienten ist ungefähr 40%, aber für Patienten über 65 sinkt die Rate auf ungefähr 20%. Daher besteht eine Notwendigkeit für Behandlungen, die den fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion, der verursacht hat, dass fast 200,000 Patienten in den Vereinigten Staaten allein von chronischer Dialyse abhängig werden und der in vorzeitigen Todesfällen von Zehntausenden jedes Jahr resultiert, verhindern wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben gefunden, dass Zelladhäsionsmoleküle wie die Integrine nicht nur wichtig in der Äthiologie von akuter Nierenkrankheit sind, sondern auch wichtig in der Äthiologie von CRF sind. Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die medizinischen Verwendungen der Mittel, wie in den angefügten Ansprüchen definiert, für die Behandlung von Säuger-Patienten mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen. Die Mittel können auch für die Behandlung von Säuger-Patienten mit dem Risiko eines Bedarfs für einen Nierenersatz in der Therapie nützlich sein. Solche Patienten schließen Patienten ein, die schon von chronischem Nierenversagen geplagt werden oder die schon eine Nierenersatz-Therapie erhalten haben, so wie jeden Patienten, von dem realistischerweise erwartet wird, dass er an fortschreitendem Verlust der Nierenfunktion, der mit dem fortschreitenden Verlust von funktionierenden Nephron-Einheiten assoziiert ist, leidet.
Die Verwendungen, die die Verbindungen dieser Erfindung anwenden, nutzen zum Teil die Entdeckung, dass die Integrin-antagonistischen anti-VLA-4-Antikörper in der Behandlung von Patienten mit einem Risiko, wie hierin definiert, eines chronischen Nierenversagens oder dem Bedarf für eine Nierenersatz-Therapie verwendet werden können.
Die Nieren-Therapeutika der Erfindung können auf jedem Weg der Verabreichung verabreicht werden, der mit dem ausgewählten Mittel kompatibel ist, und können mit jedem pharmazeutisch verträglichen Träger, der für den Weg der Verabreichung geeignet ist, formuliert werden. Bevorzugte Wege der Verabreichung sind parenteral und sind besonders subkutan, intramuskulär, intravenös, intraperitoneal und renal-intrakapsulär. Für die täglichen Dosierungen der Nieren-Therapeutika wird erwartet, dass sie im Bereich von etwa 0,1 – 50 mg/kg Körpergewicht und bevorzugter etwa 1-3 mg/kg Körpergewicht sind, obwohl genaue Dosierungen abhängig von dem bestimmten angewendeten Nieren-Therapeutikum und dem bestimmten medizinischen Zustand und der Geschichte des Patienten variieren werden. Die Dosierungen können einmal oder einige Male pro Woche in Abständen von 1, 2 oder 4 Wochen gegeben werden. Die Behandlungen der vorliegenden Erfindung sind für die Verhinderung, die Inhibition oder das Verzögern des fortschreitenden Verlustes von funktionellen Nephron-Einheiten und des folglichen fortschreitenden Verlustes der Nierenfunktion, der für chronisches Nierenversagen typisch ist, nützlich. Als solche sind sie von großem Wert für das Verhindern oder Verzögern des Bedarfs für chronische Dialyse oder Nierenersatz-Therapie für Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz oder für das Reduzieren der notwendigen Frequenz von chronischer Nierendialyse für Patienten mit einer Nierenkrankheit im Endstadium.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Messungen von Serumkreatinin während der Phase des chronischen Nierenversagens des Tiermodells für Ratten, die einen löslichen TGF-beta-Antagonisten erhalten (ausgefülltes Quadrat), gegenüber Ratten, die die Negativkontrolle erhalten.
2 ist eine Graphik, die die durchschnittlichen % der fibrosierten glomerulären Fläche (Schätzungen für 50 aufeinander folgende Glomeruli) und die Anzahl von glomerulären Quadranten, die von Fibrin besetzt sind, während der Phase des chronischen Nierenversagens des Tiermodells für Ratten, die einen löslichen TGF-beta-Antagonisten erhalten (ausgefülltes Quadrat), gegenüber Ratten, die die Negativkontrolle erhalten.
3 zeigt die Überlebenskurven in der Phase des chronischen Nierenversagens des Tiermodells für Ratten, die die Negativkontrolle erhalten, und Ratten, die den anti-VLA-1-Antikörper erhalten.
4 zeigt die Überlebenskurven in der Phase des chronischen Nierenversagens des Tiermodells für Ratten, die einen anti-VLA-4-Antikörper erhalten (geschlossene Quadrate), und Ratten, die die Negativkontrolle erhalten (offene Kreise).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
1. Definitionen
Um den Gegenstand der beanspruchten Erfindung deutlicher und prägnanter aufzuzeigen, werden die folgenden Definitionen für spezifische Ausdrücke, die in der folgenden geschriebenen Beschreibung und den anhängenden Ansprüchen verwendet werden, bereitgestellt.
Die Überfamilie des sehr späten Integrin-Antigens (VLA) ist aus strukturell und funktionell verwandten Glycoproteinen zusammengesetzt, die aus heterodimeren (alpha- und beta-) Transmembran-Rezeptormolekülen bestehen, die in verschiedenen Kombinationen auf beinahe jedem Säuger-Zelltyp gefunden werden. Die Integrin-Überfamilie setzt sich aus strukturell und funktionell verwandten Glycoproteinen zusammen, die aus heterodimeren alpha- und beta-Transmembran-Rezeptormolekülen bestehen, die in verschiedenen Kombinationen auf beinahe jedem Säuger-Zelltyp gefunden werden. Für Literaturübersichten siehe: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al., „The Pharmacology of the Integrins". Medicinal Research Rev. Bd. 195 (1994) und V. W. Engleman et al., "Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets" in Ann. Rev. Medicinal Chemistry, Bd. 31, J.A. Bristol, Hrsg.; Acad. Press, NY, 1996, S. 191. Integrine der VLA-Familie schließen VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6 ein, in denen jedes der Moleküle eine beta1-Kette umfasst, die nicht-kovalent an eine entsprechende alpha-Kette (alpha1, alpha2, alpha3, alpha4, alpha5, alpha6) gebunden ist.
Insbesondere ist das alpha1-beta1-Integrin ein Zelloberflächenrezeptor für Kollagen I, Kollagen IV, Laminin und möglicherweise andere Liganden (die letzteren Begriffe werden individuell und kollektiv als „alpha1-Integrin-Liganden" oder „VLA-1-Ligand(en)" bezeichnet, obwohl der Begriff „Kollagen" durchwegs verwendet werden wird, um alle solchen alpha1-Integrin-Liganden einzuschließen, wird es von Fachleuten verstanden werden, dass andere Liganden von alpha1-Integrinen existieren und unter Verwendung von konventionellen Verfahren analysiert werden können. Das Integrin alphal-beta1 unterstützt nicht nur die Kollagen-abhängige Adhäsion und Migration, sondern ist wahrscheinlich ein kritischer Kollagen-Rezeptor auf mesenchymal abgeleiteten Zellen, der in eine ECM-Umgestaltung nach einer Verletzung involviert sein kann (Gotswals et al., J. Clin. Invest. 97:2469-2477 (1996)). Die Fähigkeit der Zellen, Kollagen-Matrices zusammenzuziehen und zu organisieren, ist eine kritische Komponente von jeder Wundheilungs-Reaktion. Der Begriff „a1b1-Integrin" (oder „VLA-1" oder „a1b1" oder „a1b1-Integrin", austauschbar verwendet) bezeichnet hierin Polypeptide oder Homologe oder Fragmente davon, die zur Bindung an Mitglieder der extrazellulären Matrixproteine wie Laminin oder Kollagen oder Homologe oder Fragmente von solchen extrazellulären Matrixproteinen fähig sind.
Das alpha4-beta1-Integrin ist ein Zelloberflächen-Rezeptor für VCAM-1, Fibronectin und möglicherweise anderen Liganden (diese Liganden werden individuell und kollektiv als „alpha4-Ligand(en)" bezeichnet). Der Ausdruck „a4b1-Integrin" (oder „VLA-4" oder „a4b1" oder „a4b1-Integrin", austauschbar verwendet) bezeichnet daher hierin Polypeptide oder Homologe oder Fragmente davon, die zur Bindung an VCAM-1 und Mitglieder der extrazellulären Matrixproteine, ganz besonders Fibronectin, oder Homologe oder Fragmente von solchen extrazellulären Matrixproteinen fähig sind, obwohl es von Fachleuten verstanden werden wird, dass andere Liganden für VLA-4 existieren können und unter Verwendung von konventionellen Verfahren analysiert werden können. Nichtsdestotrotz ist es bekannt, dass die alpha4-Untereinheit mit anderen beta-Untereinheiten außer beta1 assoziieren wird, so dass wir den Ausdruck „alpha4-Integrin" als jene Integrine definieren können, deren alpha4-Untereinheit mit einem oder einem anderen der beta-Untereinheiten assoziiert. Ein Beispiel eines „alpha4"-Integrins ist alpha4beta7 (R. Lobb und M. Hemler, J. Clin. Invest. 94:1722-1728 (1994). Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck „Integrin(e)" VLA-1 und/oder VLA-4 so wie Integrine, die eine beta1-, beta7- oder irgendeine andere beta-Untereinheit enthalten.
Ein Integrin-„Antagonist", wie hierin beschrieben, schließt jede Verbindung ein, die Integrine von der Bindung mit einem Integrin-Liganden und/oder -Rezeptor inhibiert. Die Erfindung bezieht sich ausschließlich auf die Verwendungen eines Integrin-antagonistischen anti-VLA4-Antikörpers oder eines Fragments davon, wie in den Ansprüchen definiert. Ein anti-Integrin-Antikörper oder Antikörperhomolog-enthaltende Proteine (unten diskutiert) so wie andere Moleküle wie lösliche Formen der Liganden-Proteine für Integrine sind nützlich. Lösliche Formen der Liganden-Proteine für Integrine schließen die löslichen VCAM-1- oder Kollagen-Peptide, VCAM-1-Fusionsproteine oder bifunktionellen VACM-1-Ig-Fusionsproteine ein. Zum Beispiel kann eine lösliche Form eines Integrin-Liganden oder eines Fragments davon verabreicht werden, um an ein Integrin zu binden und vorzugsweise um für eine Integrin-Bindungsstelle auf Zellen zu konkurrieren, was dadurch zu Wirkungen, ähnlich wie die Verabreichung von Antagonisten wie anti-Integrin (z.B. VLA-1/ und/oder VLA-4)-Antikörpern führt. Insbesondere sind lösliche Integrin-Mutanten, die einen Liganden binden, aber keine Integrin-abhängige Signalgebung hervorrufen, im Rahmen der Erfindung eingeschlossen. Solche Integrin-Mutanten können als kompetitive Inhibitoren des Wildtyp-Integrin-Proteins wirken und werden als „Antagonisten" angesehen. Es werden auch Verwendungen beschrieben, die Moleküle anwenden, die die Wirkung von mehr als einem Integrin antagonisieren, wie kleine Moleküle oder Antikörperhomologe, die sowohl alpha4-Integrine (z.B. VLA-4) als auch VLA-1 oder andere Kombinationen von Integrinen antagonisieren. Es werden auch Verwendungen beschrieben, die eine Kombination von Molekülen anwenden, so dass die Kombination die Wirkung von mehr als einem Integrin antagonisiert, wie Verfahren unter Verwendung von einigen kleinen Molekülen oder Antikörperhomologen, die in Kombination sowohl alpha4-Integrine (z.B. VLA-4) als auch VLA-1 oder andere Kombinationen von Integrinen antagonisieren.
Wie hierin diskutiert, können bestimmte Integrinantagonisten zum Beispiel an ein Antikörperhomolog wie ein Immunglobulin oder ein Fragment davon fusioniert oder anderweitig konjugiert sein und sind nicht auf einen bestimmten Typ oder eine bestimmte Struktur eines Integrins oder Liganden oder eines anderen Moleküls beschränkt. Jedes Mittel, das zur Bildung eines Fusionsproteins (wie unten definiert) in der Lage ist und zur Bindung an Integrin-Liganden in der Lage ist und das wirksam ein VLA-1- und/oder alpha4 (z.B. VLA-4)-Integrin blockiert oder bedeckt, wird als ein Äquivalent des hierin beschriebenen Antagonisten angesehen.
Ein „Antikörperhomolog" schließt intakte Antikörper ein, die aus leichten und schweren Ketten von Immunglobulinen bestehen, die durch Disulfid-Bindungen verknüpft sind. Der Ausdruck „Antikörperhomolog" soll auch ein Protein umspannen, das ein oder mehrere Polypeptide umfasst, ausgewählt von leichten Ketten von Immunglobulinen, schweren Ketten von Immunglobulinen und Antigen-Bindungsfragmenten davon, die zur Bindung von einem oder mehreren Antigenen (d.h. Integrin oder Integrin-Ligand) in der Lage sind. Die Bestandteils-Polypeptide eines Antikörperhomologs, das aus mehr als einem Polypeptid zusammengesetzt ist, können wahlweise disulfidgebunden oder auf andere Weise kovalent kreuz-verbunden sein. Dementsprechend schließen daher „Antikörperhomologe" intakte Immunglobuline der Typen IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (sowie Subtypen davon) ein, wobei die leichten Ketten des Immunglobulins die Typen Kappa oder Lambda sein können. „Antikörperhomologe" schließen auch Teile von intakten Antikörpern ein, die eine Antigen-Bindungsspezifität beibehalten, zum Beispiel Fab-Fragmente, Fab'-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, F(v)-Fragmente, Monomere oder Dimere von schweren und leichten Ketten oder Gemische davon.
Ein „humanisiertes Antikörperhomolog" ist ein Antikörperhomolog, das durch rekombinante DNA-Technologie produziert wird und in dem manche oder alle Aminosäuren einer leichten oder schweren Kette eines menschlichen Immunglobulins, die nicht für die Antigen-Bindung benötigt werden, mit den entsprechenden Aminosäuren einer leichten oder schweren Kette eines nicht-menschlichen Säuger-Immunglobulins substituiert worden sind.
Wie hierin verwendet, ist ein „menschliches Antikörperhomolog" ein Antikörperhomolog, das durch rekombinante DNA-Technologie produziert wird und in dem alle Aminosäuren der leichten oder schweren Kette eines Immunglobulins von einer menschlichen Quelle stammen (unabhängig davon, ob solche Aminosäuren für die Antigen-Bindung benötig werden oder nicht).
Eine „Aminosäure" ist eine monomere Einheit eines Peptids, Polypeptids oder Proteins. Es gibt 20 Aminosäuren, die in natürlich vorkommenden Peptiden, Polypeptiden und Proteinen gefunden werden, alle davon sind L-Isomere. Der Ausdruck schließt auch Analoge der Aminosäuren und D-Isomere der Protein-Aminosäuren und ihre Analoge ein.
Der Ausdruck „antagonistische biologische Aktivität" bedeutet, dass die Antagonisten der Erfindung oder die funktionellen Äquivalente oder Varianten davon in der Lage sind, den fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion in einem Standard-Tiermodell von chronischem Nierenversagen signifikant zu verhindern, zu inhibieren, zu verzögern oder zu lindern oder in der Lage sind, eine klinisch signifikante Verbesserung in einem Standard-Marker der Nierenfunktion zu bewirken, wenn sie an einen Säuger mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen verabreicht werden.
„Breiter Abdruck („broad cast") bezeichnet die gebildeten Elemente, die im Urin vorhanden sein können und die seltene zylindrische Massen von agglutinierten Materialien sind, die typischerweise eine Form oder einen „Abdruck" des Lumens eines distalen gewundenen Tubulus oder eines sammelnden Tubulus repräsentieren. Bei CRF-Patienten kann jedoch die Hypertrophie der Tubuli im Vorliegen von „breiten Abdrucken" oder „Nierenversagen-Abdrucken" resultieren, die 2-6- mal den Durchmesser von normalen Abdrucken haben und oft ein homogenes wachsartiges Erscheinen haben. Die mikroskopische Untersuchung des Harnsediments auf das Vorliegen von gebildeten Elementen ist ein Standard-Vorgehen in der Harn-Analyse.
„Bioverfügbarkeit" bezeichnet die Fähigkeit einer Verbindung, nach der Verabreichung durch den Körper absorbiert zu werden. Zum Beispiel hat eine erste Verbindung eine größere Bioverfügbarkeit als eine zweite Verbindung, wenn die erste Verbindung in einem größeren Ausmaß als die zweite Verbindung durch das Blut absorbiert wird, wenn beide in gleichen Mengen verabreicht werden.
„Chronisch" bedeutet persistierend für einen Zeitraum von mindestens drei und mehr bevorzugt mindestens sechs Monaten. Daher ist zum Beispiel ein Patient mit einer gemessenen GFR, die chronisch unter 50% der erwarteten GFR liegt, ein Patient, in dem die GFR in mindestens zwei Messungen, die durch mindestens drei und mehr bevorzugt durch mindestens sechs Monate getrennt sind, gemessen worden ist, wobei gefunden wurde, dass sie unter 50% der erwarteten GFR ist, wobei keinen medizinisch stichhaltigen Grund gibt, anzunehmen, dass die GFR während des dazwischen-liegenden Zeitraums wesentlich (z.B. 10%) höher war. Fachleute werden verstehen, dass in Bezug auf Tiermodelle der Ausdruck „chronisch" unterschiedliche Zeiträume bedeuten kann, die vom Typ des Tiermodells abhängen.
„Kovalent gekoppelt" bedeutet, dass die beschriebenen Einheiten der Erfindung (z.B. Immunglobulinfragment/Integrinantagonist) entweder direkt kovalent aneinander gebunden sind oder andernfalls indirekt kovalent miteinander durch eine dazwischenliegende Einheit oder Einheiten wie eine Brücke, einen Spacer oder eine Verknüpfungseinheit oder -einheiten verbunden sind. Die dazwischen-liegende(n) Einheit oder Einheiten werden eine „Kopplungsgruppe" genannt. Der Ausdruck „konjugiert" wird austauschbar mit "kovalent gekoppelt" verwendet.
Eine „Expressions-Kontrollsequenz" ist eine Sequenz von Polynucleotiden, die die Expression von Genen kontrolliert und reguliert, wenn sie funktionell mit jenen Genen verknüpft ist.
Ein „Expressionsvektor" ist ein Polynucleotid wie ein DNA-Plasmid oder ein Phage (unter anderen üblichen Beispielen), das/der die Expression von mindestens einem Gen ermöglicht, wenn der Expressionsvektor in eine Wirtszelle eingebracht wird. Der Vektor kann in der Lage sein, sich in einer Zelle zu replizieren oder nicht.
Der Ausdruck „extrazelluläres Signalprotein" bedeutet jedes Protein, das entweder von einer Zelle sezerniert wird oder mit der Zellmembran assoziiert ist und bei Bindung an den Rezeptor für jenes Protein auf einer Zielzelle eine Antwort in der Zielzelle auslöst.
Eine „wirksame Menge" eines Agens der Erfindung ist jene Menge, die ein Ergebnis produziert oder einen Einfluss auf den bestimmten Zustand, der behandelt wird, ausübt.
Ein „funktionelle Äquivalent" eines Aminosäure-Rests ist (i) eine Aminosäure, die ähnliche reaktive Eigenschaften wie der Aminosäure-Rest, der durch das funktionelle Äquivalent ersetzt wurde, aufweist; (ii) eine Aminosäure eines Antagonisten der Erfindung, wobei die Aminosäure ähnliche Eigenschaften wie der Aminosäure-Rest, der durch das funktionelle Äquivalent ersetzt wurde, aufweist; (iii) ein nicht-Aminosäure-Molekül, das ähnliche Eigenschaften wie der Aminosäure-Rest, der durch das funktionelle Äquivalent ersetzt wurde, aufweist. Ein erstes Polynucleotid, das einen proteinartigen Antagonisten der Erfindung codiert, ist „funktionell äquivalent" im Vergleich mit einem zweiten Polynucleotid, das das Antagonisten-Protein codiert, wenn es mindestens eine der folgenden Bedingungen erfüllt: 1. das „funktionelle Äquivalent" ist ein erstes Polynucleotid, das an das zweite Polynucleotid unter Standard-Hybridisierungsbedingungen hybridisiert und/oder zu der ersten Polynucleotidsequenz degeneriert ist. Am meisten bevorzugt codiert es ein mutiertes Protein, das die Aktivität eines Integrinantagonisten-Proteins aufweist; 2. Das „funktionelle Äquivalent ist ein erstes Polynucleotid, das bei Expression eine Aminosäuresequenz codiert, die durch das zweite Polynucleotid codiert wird.
Die hierin beschriebenen Integrinantagonisten schließen die hierin aufgelisteten Agenzien sowie ihre funktionellen Äquivalente ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Ausdruck „funktionelles Äquivalent" daher einen Integrinantagonisten oder ein Polynucleotid, das den Integrinantagonisten codiert, der dieselbe oder eine verbesserte günstige Wirkung auf den Empfänger hat wie der Integrinantagonist, von dem es als ein funktionelles Äquivalent erachtet wird. Es wird von einem Fachmann geschätzt werden, dass ein funktionell äquivalentes Protein durch rekombinante Techniken, z.B. durch Exprimieren einer „funktionell äquivalenten DNA" produziert werden kann. Dementsprechend bezieht die vorliegende Erfindung Integrin-Proteine ein, die durch natürlich vorkommende DNAs codiert werden, sowie durch nicht natürlich-vorkommende DNAs, die dasselbe Protein codieren, wie es durch die natürlich vorkommende DNA codiert wird. Aufgrund der Degeneriertheit der codierenden Nucleotid-Sequenzen können andere Polynucleotide verwendet werden, um das Integrin-Protein zu codieren. Diese schließen die gesamten oder Teile der obigen Sequenzen ein, die durch die Substitution von verschiedenen Codons verändert werden, die denselben Aminosäure-Rest innerhalb der Sequenz codieren und so eine stille Änderung produzieren. Solche veränderten Sequenzen werden als Äquivalente von diesen Sequenzen angesehen. Zum Beispiel wird Phe (F) durch zwei Codons, TTC oder TTT, codiert, Tyr (Y) wird durch TAC oder TAT codiert, und His (H) wird durch CAC oder CAT codiert. Auf der anderen Seite wird Trp (W) durch ein einziges Codon, TGG, codiert. Dementsprechend wird es geschätzt werden, dass es für eine gegebene DNA-Sequenz, die ein bestimmtes Integrin codiert, viele degenerierte DNA-Sequenzen geben wird, die es codieren werden. Diese degenerierten DNA-Sequenzen werden als innerhalb des Rahmens dieser Erfindung erachtet.
Der Ausdruck „Fusion" oder „Fusionsprotein" bezeichnet eine co-lineare, kovalente Verknüpfung von zwei oder mehreren Proteinen oder Fragmenten davon durch ihre individuellen Peptid-Rückgrate, am meisten bevorzugt durch genetische Expression eines Polynucleotid-Moleküls, das jene Proteine codiert. Es wird bevorzugt, dass die Proteine oder Fragmente davon von verschiedenen Quellen stammen, so dass dieser Typ von Fusionsprotein ein „chimäres" Molekül genannt wird. Daher sind bevorzugte Fusionsproteine chimäre Proteine, die einen Integrinantagonisten oder ein Fragment, das kovalent an eine zweite Einheit gebunden ist, die kein Integrinantagonist ist, einschließen. Bevorzugte Fusionsproteine der Erfindung können Teile von intakten Antikörpern einschließen, die die Antigen-Bindungsspezifität beibehalten, zum Beispiel Fab-Fragmente, Fab'-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, F(v)-Fragmente, Monomere oder Dimere von schweren Ketten, Monomere oder Dimere von leichten Ketten, Dimere, die aus einer schweren und einer leichten Kette bestehen, und dergleichen.
Es werden auch Fusionsproteine beschrieben, die chimär sind und eine Integrinantagonisten-Einheit umfassen, die mit dem gesamten oder einem Teil des Gelenks und der konstanten Regionen einer leichten Kette, einer schweren Kette oder von beiden eines Immunglobulins fusioniert oder anderweitig verknüpft ist. So beschreibt dieses Patent ein Molekül, das einschließt: (1) eine Integrinantagonisten-Einheit, (2) ein zweites Peptid, z.B. eines, das die Löslichkeit oder die in vivo-Lebensdauer der Integrinantagonisten-Einheit, z.B. eines Mitglieds der Immunglobulin-Überfamilie oder eines Fragments oder eines Teils davon, z.B. eines Teils oder eines Fragments von IgG, z.B. der konstanten Region der schweren Kette des menschlichen IgG1, z.B. CH2, CH3, und von Gelenkregionen erhöht. Insbesondere ist eine „Integrinantagonist/Ig-Fusion" ein Protein, das ein biologisch aktives Integrinantagonisten-Molekül der Erfindung (z.B. einen löslichen VLA-4-Liganden oder ein biologisch aktives Fragment davon) umfasst, das an einen N-Terminus einer Immunglobulin-Kette gebunden ist, wobei ein Teil des N-Terminus des Immunglobulins mit dem Integrinantagonisten ersetzt ist. Eine Art der Integrinantagonist/Ig-Fusion ist eine „Integrin/Fc-Fusion", die ein Protein ist, das einen Integrinantagonisten der Erfindung umfasst, der an mindestens einen Teil der konstanten Domäne eines Immunglobulins gebunden ist. Eine bevorzugte Fe-Fusion umfasst einen Integrinantagonisten der Erfindung, der an ein Fragment eines Antikörpers gebunden ist, der die C-terminale Domäne der schweren Immunglobulin-Ketten umfasst.
Der Ausdruck „Fusionsprotein" bedeutet auch ein Integrinantagonist, der chemisch durch ein mono- oder heterofunktionelles Molekül an eine zweite Einheit gebunden ist, die kein Integrinantagonist ist (was in einem „chimären" Molekül resultiert) und de novo von einem aufgereinigten Protein, wie unten beschrieben, hergestellt wird. Daher kann ein Beispiel von einem chemisch verbundenen, im Gegensatz zu einem rekombinant verbundenen, chimären Molekül, das ein Fusionsprotein ist, umfassen: (1) eine die alpha 4-Integrin-Untereinheit-anzielende Einheit (z.B. eine VCAM-1-Einheit, die zur Bindung an VLA-4 in der Lage ist) auf der Oberfläche von VLA-4-tragenden Zellen; (2) ein zweites Molekül, das die Löslichkeit oder die in vivo-Lebensdauer der anzielenden Einheit erhöht (z.B. ein Polyalkylenglycol-Polymer wie Polyethylenglycol (PEG)). Die alpha4-anzielende Einheit kann jeder natürlich vorkommende alpha4-Ligand oder ein Fragment davon sein, z.B. ein VCAM-1-Peptid oder eine ähnliche, konservativ substituierte Aminosäuresequenz.
Ein „heterologer Promotor", wie hierin verwendet, ist ein Promotor, der nicht natürlicherweise mit einem Gen oder einer aufgereinigten Nucleinsäure assoziiert ist. „Homologie", wie hierin verwendet, ist synonym mit dem Ausdruck „Identität" und betrifft die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptiden, Molekülen oder zwischen zwei Nucleinsäuren. Wenn eine Position in beiden der zwei verglichenen Sequenzen durch dieselbe Base oder Aminosäure-Monomer-Untereinheit besetzt ist (zum Beispiel, wenn eine Position in jedem der zwei DNA-Moleküle durch Adenin besetzt ist oder eine Position in jedem der zwei Polypeptide durch ein Lysin besetzt ist), dann sind die betreffenden Moleküle an jener Position homolog. Der Prozentsatz der Homologie zwischen zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von passenden oder homologen Positionen, die von den zwei Sequenzen geteilt werden, geteilt durch die Anzahl von verglichenen Positionen × 100. Wenn zum Beispiel 6 von 10 Positionen in zwei Sequenzen passend sind oder homolog sind, dann sind die zwei Sequenzen 60% homolog. Als Beispiel, die DNA-Sequenzen CTGACT und CAGGTT teilen 50% Homologie (3 von den insgesamt 6 Positionen sind passend). Im Allgemeinen wird ein Vergleich gemacht, wenn zwei Sequenzen ausgerichtet sind, um maximale Homologie zu ergeben. Solch eine Ausrichtung kann unter Verwendung von zum Beispiel dem Verfahren von Karlin und Altschul, das unten detaillierter beschrieben wird, geliefert werden.
Homologe Sequenzen teilen identische oder ähnliche Aminosäure-Reste, wobei ähnliche Reste konservative Substitutionen für oder „erlaubte Punktmutationen" von entsprechenden Aminosäureresten in einer ausgerichteten Bezugssequenz sind. In dieser Hinsicht sind eine „konservative Substitution" eines Rests in einer Bezugssequenz jene Substitutionen, die physikalisch oder funktionell ähnlich zu den entsprechenden Bezugsresten sind, z.B. jene, die eine ähnliche Größe, Form, elektrische Ladung, chemische Eigenschaften, einschließlich der Fähigkeit, kovalente oder Wasserstoffbindungen zu bilden, und dergleichen aufweisen. Besonders bevorzugte konservative Substitutionen sind jene, die die Kriterien erfüllen, wie sie für eine „akzeptierte Punktmutation" in Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Ergänz. 3, Kapitel 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978) definiert wurden. „Homologie" und „Identität" sind hierin austauschbar, und jedes bezieht sich auf eine Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Polypeptidsequenzen. Homologie und Identität können durch Vergleichen einer Position in jeder Sequenz bestimmt werden, die zum Zweck des Vergleichs ausgerichtet werden kann. Wenn eine Position in der verglichenen Sequenz durch denselben Aminosäurerest besetzt ist, dann können die Polypeptide als identisch an jeder Position bezeichnet werden; wenn die äquivalente Stelle durch dieselbe Aminosäure (z.B. identisch) oder eine ähnliche Aminosäure (z.B. ähnlich in sterischer und/oder elektronischer Weise) besetzt ist, dann können die Moleküle als homolog an jener Position bezeichnet werden. Ein Prozentsatz der Homologie oder Identität zwischen Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl von passenden oder homologen Positionen, die von den Sequenzen geteilt werden. Eine „nicht-verwandte" oder „nicht-homologe" Sequenz teilt weniger als 40 Prozent Identität, obgleich vorzugsweise weniger als 25 Prozent Identität, mit einer Sequenz der vorliegenden Erfindung.
„Prozent-Homologie" von zwei Aminosäuresequenzen oder zwei Nucleinsäuresequenzen wird unter Verwendung des Ausrichtungs-Algorithmus von Karlin und Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264 (1990), wie in Karlin und Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873 (1993) modifiziert, bestimmt. Solch ein Algorithmus ist in die NBLAST- oder XBLAST-Programme von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990) inkorporiert. BLAST-Suchen werden mit dem NBLAST-Programm, Wert = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die homolog zu einer Nucleinsäure der Erfindung sind. BLAST-Proteinsuchen werden mit dem XBLAST-Programm, Wert = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu einem Bezugspolypeptid sind. Um Ausrichtungen mit Aussparungen für Vergleiche zu erhalten, wird Gapped-BLAST, wie in Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997) beschrieben, verwendet. Wenn BLAST und Gapped-BLAST verwendet werden, werden die Standardparameter der betreffenden Programme (XBLAST und NBLAST) verwendet. Siehe http://www/ncbi.nlm.nih.gov.
„Isoliert" (austauschbar mit „im Wesentlichen rein" verwendet)- wenn auf eine Nucleinsäure, d.h. Polynucleotidsequenzen, die Integrinantagonisten codieren, angewendet, bedeutet ein RNA- oder DNA-Polynucleotid, ein Teil eines genomischen Polynucleotids, eine cDNA oder ein synthetisches Polynucleotid, der/die/das aufgrund seines Ursprungs oder von Manipulation: (i) nicht mit einem gesamten Polynucleotid assoziiert ist, mit dem er/sie/es in der Natur assoziiert ist (z.B. in einer Wirtszelle als ein Expressionsvektor oder ein Teil davon vorhanden ist); oder (ii) an eine Nucleinsäure oder eine andere chemische Einheit als jener, an die er/sie/es in der Natur gebunden ist, gebunden ist; oder (iii) nicht in der Natur vorkommt. Mit „isoliert" wird darüber hinaus eine Polynucleotidsequenz gemeint, die: (i) in vitro durch zum Beispiel die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert; (ii) chemisch synthetisiert; (iii) rekombinant durch Clonieren produziert; oder (iv) wie durch Spaltung und Gel-Auftrennung aufgereinigt wird.
Wenn auf Polypeptide angewendet, bedeutet „isoliert" (austauschbar mit „im Wesentlichen rein" verwendet) ein Polypeptid oder ein Teil davon, das/der aufgrund seines Ursprungs oder von Manipulation: (i) in einer Wirtszelle als das Expressionsprodukt eines Teils eines Expressionsvektors vorhanden ist; oder (ii) an ein Protein oder eine andere chemische Einheit als jene, an das/die es/er in der Natur gebunden ist, gebunden ist; oder (iii) nicht in der Natur vorkommt, zum Beispiel ein Protein, das chemisch durch Anhängen oder Zufügen von mindestens einer hydrophoben Einheit an das Protein manipuliert ist, so dass das Protein in einer Form ist, die in der Natur nicht gefunden wird. Mit „isoliert" wird darüber hinaus ein Protein gemeint, das: (i) chemisch synthetisiert; oder (ii) in einer Wirtszelle exprimiert und von assoziierten und kontaminierenden Proteinen weggereinigt wird. Der Ausdruck meint im Allgemeinen ein Polypeptid, das von anderen Proteinen und Nucleinsäuren getrennt worden ist, mit denen es natürlicherweise vorkommt. Vorzugsweise ist das Polypeptid auch von Substanzen wie Antikörpern oder Gel-Matrizen (Polyacrylamid) getrennt, die verwendet werden, um es aufzureinigen.
Ein „multivalenter Proteinkomplex" bezeichnet eine Vielzahl von Integrinantagonisten (d.h. einen oder mehrere). Zum Beispiel kann ein anti-Integrin-Antikörperhomolog oder -Fragment mit einem anderen Antikörperhomolog oder -Fragment kreuz-verbunden oder daran gebunden sein. Jedes Protein kann dasselbe oder verschieden sein, und jedes Antikörperhomolog oder -Fragment kann dasselbe oder verschieden sein.
„Mutante" ist jede Veränderung im genetischen Material eines Organismus, insbesondere jede Veränderung (d.h. Deletion, Substitution, Addition oder Änderung) in einer Wildtyp-Polynucleotidsequenz oder jede Veränderung in einem Wildtyp-Protein. Der Ausdruck „Mutein" wird austauschbar mit „Mutante" verwendet.
„Funktionell verknüpft"- eine Polynucleotidsequenz (DNA, RNA) ist funktionell mit einer Expressions-Kontrollsequenz verknüpft, wenn die Expressions-Kontrollsequenz die Transkription und Translation jener Polynucleotidsequenz kontrolliert und reguliert. Der Ausdruck „funktionell verknüpft" schließt ein geeignetes Startsignal (z.B. ATG) vor der Polynucleotidsequenz, die exprimiert werden soll, und die Aufrechterhaltung des korrekten Leserahmens ein, um die Expression der Polynucleotidsequenz unter der Kontrolle der Expressions-Kontrollsequenz und die Produktion des erwünschten Polypeptids, das durch die Polynucleotidsequenz codiert wird, zu ermöglichen.
„Protein" ist jedes Polymer, das im Wesentlichen aus irgendwelchen der 20 Aminosäuren besteht. Obwohl „Polypeptid" oft in Bezug auf relativ große Polypeptide verwendet wird, und „Peptid" oft in Bezug auf kleine Polypeptide verwendet wird, überlappt die Verwendung dieser Fachausdrücke und variiert. Der Ausdruck „Protein", wie hierin verwendet, bezeichnet Peptide, Proteine und Polypeptide, außer wenn es anderweitig bezeichnet wird. Die Ausdrücke „Peptid(e)", „Protein(e)" und „Polypeptid(e)" werden hierin austauschbar verwendet.
Die Ausdrücke „Polynucleotidsequenz" und „Nucleotidsequenz" werden hierin auch austauschbar verwendet.
„Rekombinant", wie hierin verwendet, bedeutet, dass ein Protein von einem rekombinanten Expressionssystem stammt. Da Integrine weder glycosyliert sind noch Disulfid-Brücken enthalten, können sie in den meisten prokaryontischen und eukaryontischen Expressionssystemen exprimiert werden.
„Kleines Molekül" hat die Definition wie in Sektion IIA2.
„Spacer"-Sequenz bezeichnet eine Einheit, die zwischen eine Aminosäure, die mit einem Antikörperhomolog oder einem Fragment modifiziert werden soll, und den Rest des Proteins inseriert werden kann. Ein Spacer wird gestaltet, um eine Trennung zwischen der Modifizierung und dem Rest des Proteins zu liefern, um zu verhindern, dass die Modifizierung die Proteinfunktion stört und/oder es leichter für die Modifizierung zu machen, sich mit einer Antikörperhomolog-Einheit oder irgendeiner anderen Einheit zu verbinden.
Eine „im Wesentlichen reine Nucleinsäure" ist eine Nucleinsäure, die nicht unmittelbar mit einer oder beiden codierenden Sequenzen fortlaufend ist, mit denen sie normalerweise im natürlich vorkommenden Genom des Organismus, von dem die Nucleinsäure abgeleitet ist, fortlaufend ist. Im Wesentlichen reine DNA schließt auch eine rekombinante DNA ein, die Teil eines Hybrid-Gens ist, das zusätzliche Integrin-Squenzen codiert.
Der Ausdruck „Oberflächen-Aminosäure" bedeutet jede Aminosäure, die einem Lösungsmittel ausgesetzt ist, wenn ein Protein in seiner nativen Form gefaltet ist.
„Hybridisierungsbedingungen" bedeuten im Allgemeinen Salz- und Temperaturbedingungen, die im Wesentlichen äquivalent zu 0,5 × SSC bis etwa 5 × SSC und 65°C für sowohl Hybridisierung als auch Waschen sind. Der Ausdruck „Standard-Hybridisierungsbedingungen", wie hierin verwendet, ist daher eine operative Definition und umspannt einen Bereich von Hybridisierungsbedingungen. Nichtsdestotrotz schießen „hohe Stringenz"-Bedingungen Hybridisieren mit einem Plaque-Screen-Puffer (0,2% Polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll 400; 0,2% Rinderserumalbumin, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1 M NaCl; 0,1% Natriumpyrophosphat; 1 % SDS); 10% Dextransulfat und 100 μg/ml denaturierte, beschallte Lachssperma-DNA bei 65°C für 12-20 Stunden und Waschen mit 75 mM NaCl/7,5 mM Natriumcitrat (0,5 × SSC)/1 % SDS bei 65°C ein. „Niedrige Stringenz"-Bedingungen schließen Hybridisieren mit Plaque-Screen-Puffer, 10% Dextransulfat und 110 μg/ml denaturierte, beschallte Lachssperma-DNA bei 55°C für 12-20 Stunden und Waschen mit 300 mM NaCl/30mM Natriumcitrat (2,0 × SSC)/1 % SDS bei 55°C ein. Siehe auch Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, Abschnitte 6.3.1-6.3.6, (1989).
Für ein "Individuum mit chronischem Nierenversagen oder einem Risiko von chronischem Nierenversagen" kann auch ein Risiko bestehen, eine Nieren-Ersatztherapie (d.h. chronische Hämodialyse, kontinuierliche peritoneale Dialyse oder Nierentransplantation) zu benötigen, wenn das Individuum ein menschlicher Patient ist und realistischerweise angenommen wird, dass es an einem fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion leidet, der mit fortschreitendem Verlust von funktionierenden Nephron-Einheiten assoziiert ist. Ob ein bestimmtes Individuum in einem bestimmten Tiermodell oder einem klinischen Versuch ein chronisches Nierenversagen oder ein Risiko von chronischem Nierenversagen aufweist, ist eine Festestellung, die routinemäßig durch einen medizinischen oder veterinärmedizinischen Fachmann gemacht werden kann. Individuen mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen (oder mit einem Risiko des Bedarfs einer Nierenersatztherapie) schließen die folgenden ein, aber sind nicht darauf beschränkt: Individuen, die als von chronischem Nierenversagen, Nierenkrankheit im Endstadium, chronischer diabetischer Nephropathie, hypertensiver Nephrosklerose, chronischer Glomerulonephritis, erblich-bedingter Nephritis und/oder Nierendysplasie geplagt angesehen werden können; Individuen, die eine Biopsie haben, die auf glomeruläre Hypertrophie, tubuläre Hypertrophie, chronische Glomerulosklerose und/oder chronische tubulointerstitielle Sklerose hinweist; Individuen, die einen Ultraschall, MRI, CAT-Scan oder eine andere, nicht-invasive Untersuchung haben, der/die auf Nierenfibrose oder kleinere Nieren als normal hinweist. Weitere Indikationen von Individuen mit CRF oder einem Risiko von CRF sind Fachleuten wohlbekannt. Zum Beispiel können alle folgenden Zustände Kriterien sein, um festzustellen, ob ein Individuum CRF oder ein Risiko von CRF aufweist: Individuen, die eine ungewöhnliche Zahl von breiten Abdrucken im Harnsediment aufweisen; Individuen, die eine GFR haben, die chronisch weniger als etwa 50% und ganz besonders weniger als etwa 40%, 30% oder 20% der erwarteten GFR für das Individuum ist; menschliche männliche Individuen, die mindestens etwa 50 kg wiegen und eine GFR aufweisen, die chronisch weniger als etwa 50 ml/min und ganz besonders weniger als etwa 40 ml/min, 30 ml/min oder 20 ml/min ist; menschliche weibliche Individuen, die mindestens etwa 40 kg wiegen und eine GFR aufweisen, die chronisch weniger als etwa 40 ml/min und ganz besonders weniger als etwa 30 ml/min, 20 ml/min oder 10 ml/min ist; Individuen, die eine Anzahl von funktionellen Nephron-Einheiten besitzen, die weniger als etwa 50% und ganz besonders weniger als etwa 40%, 30% oder 20% der Zahl der funktionellen Nephron-Einheiten ist, die ein gesundes, aber sonst ähnliches Individuum besitzt; Individuen, die eine einzige Niere haben; und Individuen, die Nierentransplantat-Empfänger sind.
Eine „therapeutische Zusammensetzung", wie hierin verwendet, wird so definiert, dass die Proteine der Erfindung und andere biologisch kompatible Bestandteile umfasst. Die therapeutische Zusammensetzung kann Excipienten wie Wasser, Mineralien und Träger wie Protein enthalten.
Von einem Antagonisten der Erfindung wird gesagt, dass er eine „therapeutische Wirksamkeit" aufweist und eine Menge des Agens wird als „therapeutisch wirksam" bezeichnet, wenn die Verabreichung jener Menge des Agens ausreichend ist, um eine klinisch signifikante Verbesserung in einem Standard-Marker der Nierenfunktion zu bewirken, wenn er an ein Individuum (z.B. ein Tiermodell oder einen menschlichen Patienten) mit chronischem Nierenversagen oder einem Risiko von chronischem Nierenversagen verabreicht wird. Solche Marker der Nierenfunktion sind in der medizinischen Literatur wohlbekannt und schließen die Raten des Anstiegs der BUN-Spiegel, die Raten des Anstiegs von Serumkreatinin, statische Messungen von BUN, statische Messungen von Serumkreatinin, glomeruläre Filtrationsraten (GFR), die Verhältnisse von BUN/Kreatinin, Serumkonzentrationen von Natrium (Na+), Urin/Plasma-Verhältnisse für Kreatinin, Urin/Plasma-Verhältnisse für Harnstoff, Harn-Osmolalität, tägliche Harnausscheidung und dergleichen (siehe zum Beispiel Brenner und Lazarus (1994), in Harrison's Principles of Internal Medicine, 13. Ausg., Isselbacher et al., Hrsg., McGraw Hill Text, New York; Luke und Strom (1994), in Internal Medicine, 4. Ausg., J.H. Stein, Hrsg., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis) ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Glomeruläre Filtrationsrate (GFR). Die „glomeruläre Filtrationsrate" oder „GFR" ist proportional zu der Rate der Clearance einer aus dem Plasma stammenden Substanz, die nicht durch Serumproteine gebunden ist, in den Harn, wird frei über die Glomeruli gefiltert und wird weder sezerniert noch durch die Nierentubuli resorbiert. Daher wird die GFR, wie hierin verwendet, vorzugsweise durch die folgende
wobei U_konz die Harnkonzentration des Markers ist, P_konz die Plasmakonzentration des Markers ist und V die Harn-Flussrate in ml/min ist. Wahlweise wird die GFR um den Körperoberfächen-Bereich korrigiert. So können die GFR-Werte, die hierin verwendet werden, angesehen werden, dass sie in Einheiten von ml/min/1,73 m² vorliegen.
Die bevorzugte Messung der GFR ist die Clearance von Inulin, aber aufgrund der Schwierigkeit des Messens der Konzentration dieser Substanz wird in klinischen Einrichtungen typischerweise die Clearance von Kreatinin verwendet. Zum Beispiel wird für einen normal großen, gesunden Mann (70 kg, 20-40 Jahre) erwartet, dass eine typische GFR, gemessen durch die Kreatinin-Clearance, ungefähr 125 ml/min mit Plasmakonzentrationen des Kreatinins von 0,7-1,5 mg/dl beträgt. Für eine vergleichbare, durchschnittlich große Frau wird erwartet, dass eine typische GFR, die durch die Kreatinin-Clearance gemessen wird, ungefähr 115 ml/min mit Kreatininspiegeln von 0,5-1,3 mg/dl beträgt. Während Zeiten von guter Gesundheit sind die menschlichen GFR-Werte relativ stabil bis etwa zum Alter von 40, wenn die GFR typischerweise beginnt, mit dem Alter zu sinken. Für Individuen, die bis zum Alter von 85 oder 90 überleben, kann die GFR auf 50% der vergleichbaren Werte im Alter von 40 reduziert sein.
Erwartete Glomeruläre Filtrationsrate (GFR_exp). Eine Schätzung der „erwateten GFR" oder „GFR_exp" kann unter Berücksichtigungen des Alters, des Gewichts, des Geschlechts, des Körperoberflächenbereichs und des Grads der Muskulatur eines Individuums und der Plasmakonzentration einer gewissen Markerverbindung (z.B. Kreatinin), die durch einen Bluttest bestimmt wird, geliefert werden. So kann als ein Beispiel eine erwartete GFR oder GFR_exp geschätzt werden als:
Diese Schätzung zieht nicht solche Faktoren wie den Oberflächenbereich, den Grad der Muskulatur oder den Prozentsatz des Körperfetts in Betracht. Nichtsdestotrotz ist diese Formel unter Verwendung des Plasmakreatininspiegels als Marker für Männer als ein kostengünstiges Mittel der Schätzung der GFR angewendet worden. Weil Kreatinin durch die quergestreifte Muskulatur produziert wird, wird die erwartete GFR oder GFR_exp von menschlichen, weiblichen Individuen durch dieselbe Gleichung, multipliziert mit 0,85, um die erwarteten Unterschiede in der Muskelmasse in Betracht zu ziehen, bestimmt. (Siehe Lemann, et al. (1990) Am. J. Kidney Dis. 16(3):236-243.)
„Wildtyp" ist die natürlich vorkommende Polynucleotidsequenz eines Exons eines Proteins oder ein Teil davon oder eine Proteinsequenz beziehungsweise ein Teil davon, wie sie/er normalerweise in vivo existiert.
Die Praxis der vorliegenden Erfindung wird, außer wenn es anderweitig erwähnt ist, konventionelle Techniken der Zellbiologie, Zellkultur, Molekularbiologie, Mikrobiologie, rekombinanten DNA, Proteinchemie und Immunologie anwenden, die innerhalb des Fachkönnens liegen. Solche Techniken sind in der Literatur beschrieben. Außer wenn es anderweitig festgelegt ist, sind alle Bezugnahmen, die in der Detaillierten Beschreibung zitiert sind, hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Allgemein
Die vorliegende Erfindung hängt teilweise von der Entdeckung ab, dass die Wirksamkeit von bestimmten Integrinantagonisten bei Individuen mit akutem Nierenversagen oder einem Risiko von akutem Nierenversagen keine Rückschlüsse auf für die Wirksamkeit bei chronischem Nierenversagen zulässt. Wir fassen diese Erkenntnisse in den Beispielen zusammen. Darüber hinaus haben wir gefunden, dass bestimmte Integrinantagonisten die Mortalitäts- und/oder Morbiditätsraten reduzieren und/oder den fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion, der chronisches Nierenversagen charakterisiert, verhindern, inhibieren, verzögern oder mildern können. Kurz, wir entwickelten ein Tiermodell einer Nierenkrankheit, die zwei Phasen hat – eine erste Phase von immunvermittelter Nierenentzündung (akute aufsteigende Glomerulonephritis), die etwa 10 Tage dauert, gefolgt von einer sekundären tubulointerstitiellen Nephritisphase, die von fortschreitender Glomerulosklerose begleitet wird, die bis zum Tod durch CRF um den Tag 40 dauert. Wir fanden, dass Antagonisten gegen TGFbeta (das ein bekannter Vermittler von Fibrose bei CRF ist und nach dem Tag11 in diesem Modell exprimiert wird) im Tiermodell keine Wirksamkeit während der akuten Phase hatten, aber wirksam in der chronischen Phase waren. Unter Verwendung eines anti-VLA-1-Antikörpers fanden wir eine ähnliche Entkopplung zwischen den akuten und den chronischen Phasen. Daher würde man nicht erwarten, Antagonisten gegen alpha4-Integrine mit einer Wirksamkeit in beiden Phasen zu finden.
A. Integrinantagonisten
Für die Ziele der vorliegenden Beschreibung kann ein Integrinantagonist ein Antagonist jeglicher Wechselwirkung zwischen einem Integrin und seinem verwandten Liganden oder Rezeptor sein. Ein beschriebener Integrinantagonist ist ein Antagonist von Wechselwirkungen von alpha4-Integrinen mit ihren Liganden wie der VCAM-1/VLA-4-Wechselwirkung oder der MadCAM/alpha4beta7-Wechselwirkung (siehe Lobb und Hemler, vorstehend). Dies ist ein Agens, z.B. ein Polypeptid oder ein anderes Molekül, das eine VCAM-1- und/oder VLA-4-vermittelte Bindung inhibieren oder blockieren kann oder das die VCAM-1- und/oder VLA-4-Funktion anderweitig modulieren kann, z.B. durch Inhibieren oder Blockieren der VLA-4-Liganden-vermittelten VLA-4-Signaltransduktion oder der VCAM-1-Liganden-vermittelten VCAM-1-Signaltransduktion, und das wirksam in der Behandlung von chronischem Nierenversagen ist, vorzugsweise auf dieselbe Weise wie es die anti-VLA-4-Antikörper sind. Auf ähnliche Weise ist es ein Agens, z.B. ein Polypeptid oder ein anderes Molekül, das MadCAM- und/oder alpha4beta7-vermittelte Bindung inhibieren oder blockieren kann oder das die MadCAM- und/oder die alpha4beta7-Funktion anderweitig modulieren kann, z.B. durch Inhibieren oder Blockieren der alpha4beta7-Liganden-vermittelten alpha4beta7-Signaltransduktion oder der MadCAM-Liganden-vermittelten MadCAM-Signaltransduktion, und das in der Behandlung von chronischem Nierenversagen wirksam ist.
Ein Antagonist von zum Beispiel der VCAM-1/VLA-4-Wechselwirkung ist ein Agens, das eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist: (1) es bedeckt oder bindet an VLA-4 auf der Oberfläche einer VLA-4-tragenden Zelle (d.h. eines Lymphocyten) mit ausreichender Spezifität, um eine VLA-4-Liganden/VLA-4-Wechselwirkung, z.B. die VCAM-1/VLA-4-Wechselwirkung, zu inhibieren; (2) es bedeckt oder bindet an VLA-4 auf der Oberfläche einer VLA-4-tragenden Zelle (d.h. eines Lymphocyten) mit einer ausreichenden Spezifität, um die Transduktion eines VLA-4-vermittelten Signals, z.B. die VLA-4/VCAM-1-vermittelte Signalgebung, zu modifizieren und vorzugsweise zu inhibieren; (3) es bedeckt oder bindet an einen VLA-4-Liganden (z.B. VCAM-1) auf endothelialen Zellen mit einer ausreichenden Spezifität, um die VLA-4/VCAM-1-Wechselwirkung zu inhibieren; (4) es bedeckt oder bindet an einen VLA-4-Liganden (z.B. VCAM-1) mit einer ausreichenden Spezifität, um die Transduktion einer VLA-4-Liganden-vermittelten VLA-4-Signalgebung, z.B. die VCAM-1-vermittelte VLA-4-Signalgebung, zu modifizieren und vorzugsweise zu inhibieren. Der beschriebene Antagonist hat eine oder beide der Eigenschaften 1 und 2. In anderen Fällen hat der Antagonist eine oder beide der Eigenschaften 3 und 4. Darüber hinaus können mehr als ein Antagonist an einen Patienten verabreicht werden, z.B. ein Agens, das an VLA-4 bindet, kann mit einem Agens kombiniert werden, das an VCAM-1 bindet.
Wie hierin diskutiert, sind die Antagonisten, die in den hier beschriebenen Verwendungen angewendet werden, nicht auf einen bestimmten Typ oder eine bestimmte Struktur eines Moleküls beschränkt, so dass jedes Mittel, das zur Bindung an alpha4-Integrine (z.B. VLA-4 oder alpha4beta7) auf der Oberfläche von Zellen oder an einen alpha4-Liganden wie VCAM-1 oder MadCAM auf der Oberfläche von alpha4-Liganden-tragenden Zellen fähig ist und das wirksam ein alpha4-Integrin (z.B. VLA-4 oder alpha4beta7) oder einen alpha4-Liganden (z.B. VCAM-1 beziehungsweise MadCAM), ein „alpha4-Integrin-Bindungsagens" beziehungsweise ein „alpha4-Integrin-Liganden-Bindungsagens blockiert oder bedeckt, als ein Äquivalent der Antagonisten, die in den Beispielen hierin verwendet werden, betrachtet wird.
Zum Beispiel sind Antikörper oder Antikörperhomologe (oben diskutiert) so wie lösliche Formen der natürlichen Bindungsproteine für VLA-4 und VCAM-1 nützlich. Lösliche Formen der natürlichen Bindungsproteine für VLA-4 schließen lösliche VCAM-I-Peptide, VCAM-I-Fusionsproteine, bifunktionelle VCAM-1/Ig-Fusionsproteine (z.B. „chimäre" Moleküle, oben diskutiert), Fibronectin, Fibronectin, das ein alternativ gespleißtes, nicht-Typ III-Verbindungsstück hat, und Fibronectin-Peptide, die die Aminosäuresequenz EILDV oder eine ähnliche, konservativ substituierte Aminosäuresequenz enthalten, ein. Lösliche Formen der natürlichen Bindungsproteine für VCAM-1 schließen lösliche VLA-4-Peptide, VLA-4-Fusionsproteine, bifunktionelle VLA-4/Ig-Fusionsproteine und dergleichen ein. Wie hierin verwendet, ist ein „lösliches VLA-4-Peptid" oder ein „lösliches VCAM-1-Peptid" ein VLA-4- oder ein VCAM-1-Polypeptid, das nicht in der Lage ist, sich selbst in einer Membran zu verankern. Solche lösliche Polypeptide schließen zum Beispiel VLA-4- und VCAM-Polypeptide ein, denen ein ausreichender Teil ihrer Membran-umspannenden Domäne fehlt, um das Polypeptid zu verankern, oder sie sind so modifiziert, dass die Membran-umspannende Domäne nicht funktionell ist. Diese Bindungsagenzien können durch Konkurrieren mit dem Zelloberflächen- Bindungsprotein um VLA-4 oder durch anderweitiges Ändern der VLA-4-Funktion wirken. Zum Beispiel kann eine lösliche Form von VCAM-1 (siehe z.B. Osborn et al., 1989, Cell, 59: 1203-1211) oder ein Fragment davon verabreicht werden, um an VLA-4 zu binden und vorzugsweise um eine VLA-4-Bindungsstelle auf VCAM-1-tragenden Zellen zu konkurrieren, wodurch sie/es zu Wirkungen führt, die ähnlich der Verabreichung von Antagonisten wie kleinen Molekülen oder anti-VLA-4-Antikörpern sind.
Der Ausdruck ein „Antagonist der Kollagen/VLA-1-Wechselwirkung" bezeichnet ein Agens, z.B. ein Polypeptid oder ein anderes Molekül, das eine Kollagen- und/oder VLA-1-vermittelte Bindung inhibieren oder blockieren kann oder das die Kollagen- und/oder VLA-1-Funktion anderweitig modulieren kann, z.B. durch Inhibieren oder Blockieren der VLA-1-vermittelten VLA-1-Signaltransduktion oder der Kollagen-vermittelten Kollagen-Signaltransduktion, und das wirksam in der Behandlung von chronischem Nierenversagen ist, vorzugsweise auf dieselbe Weise wie es anti-VLA-1-Antikörper sind. Ein Antagonist der VLA-1-Liganden (z.B. Kollagen)/VLA-1-Wechselwirkung ist ein Agens, das eine oder mehrere der folgende Eigenschaften aufweist: (1) es bedeckt oder bindet an VLA-1 auf der Oberfläche einer VLA-1-tragenden Zelle mit ausreichender Spezifität, um eine Kollagen/VLA-1-Wechselwirkung zu inhibieren; (2) es bedeckt oder bindet an VLA-1 auf der Oberfläche einer VLA-1-tragenden Zelle mit ausreichender Spezifität, um die Transduktion eines VLA-1-vermittelten Signals z.B. einer VLA-1/Kollagen-vermittelten Signalgebung zu modifizieren und vorzugsweise zu inhibieren; (3) es bedeckt oder bindet an einen VLA-1-Liganden (z.B. Kollagen) mit ausreichender Spezifität, um die Kollagen/VLA-1-Wechselwirkung zu inhibieren; (4) es bedeckt oder bindet an Kollagen mit ausreichender Spezifität, um die Transduktion einer Kollagen-vermittelten VLA-1-Signalgebung zu modifizieren und vorzugsweise zu inhibieren. Vorzugsweise hat der beschriebene Antagonist eine oder beide der Eigenschaften 1 und 2. Alternativ wird es bevorzugt, dass der Antagonist eine oder beide der Eigenschaften 3 und 4 aufweist. Darüber hinaus kann mehr als ein Antagonist an einen Patienten verabreicht werden, z.B. ein Agens, das an VLA-1 bindet, kann mit einem Agens kombiniert werden, das an Kollagen bindet. Wie hierin diskutiert, sind die hierin beschriebenen VLA-1-Antagonisten nicht auf einen bestimmten Typ oder eine bestimmte Struktur eines Moleküls beschränkt, so dass für die Ziele der Erfindung jedes Agens, das zur Bindung an VLA-1 auf der Oberfläche von VLA-1-tragenden Zellen (oder an Kollagen) fähig ist und das wirksam VLA-1 oder seine(n) Liganden blockiert oder bedeckt, in Betracht gezogen wird, ein Äquivalent der VLA-1-Antagonisten, die in den Beispielen hierin verwendet werden, zu sein. Zum Beispiel sind Antikörper oder Antikörperhomologe (unten diskutiert) so wie lösliche Formen der natürlichen Bindungsproteine für VLA-1 und ihre entsprechenden Liganden nützlich. Lösliche Formen der natürlichen Bindungsproteine für VLA-1 schließen lösliche Kollagen-Peptide, Kollagen-Fusionsproteine, bifunktionelle Kollagen/Ig-Fusionsproteine oder eine ähnliche, konservativ substituierte Aminosäuresequenz ein. Lösliche Formen der natürlichen Bindungsproteine für Kollagen schließen lösliche VLA-1-Peptide, VLA-1-Fusionsproteine, bifunktionelle VLA-1/Ig-Fusionsproteine und dergleichen ein. Wie hierin verwendet, ist ein „lösliches VLA-1-Peptid" oder ein „lösliches Kollagen-Peptid" ein VLA-1- oder Kollagen-Polypeptid, das nicht in der Lage ist, sich selbst in einer Membran zu verankern. Solche löslichen Polypeptide schließen zum Beispiel VLA-1-Polypeptide ein, denen ein ausreichender Teil ihrer Membran-umspannenden Domäne fehlt, um das Polypeptid zu verankern, oder die so modifiziert sind, dass die Membran-umspannende Domäne nicht funktionell ist. Diese Bindungsagenzien können durch Konkurrieren mit dem Zelloberflächen-Bindungsprotein um VLA-1 oder durch anderweitiges Ändern der VLA-1-Funktion wirken.
In einem anderen beschriebenen Beispiel kann Kollagen oder ein Fragment davon, das zur Bindung an VLA-1 auf der Oberfläche von VLA-1-tragenden Zellen in der Lage ist, an eine zweite Einheit gebunden oder anderweitig fusioniert sein, um ein chimäres VLA-1-Antagonisten-Molekül zu bilden. Die zweite Einheit kann ein Peptid, ein Fragment eines löslichen Peptids, vorzugsweise ein menschliches Peptid, mehr bevorzugt ein Plasmaprotein oder ein Mitglied der Immunglobulin-Überfamilie sein. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist das zweite Peptid ein IgG oder ein Teil oder Fragment davon, z.B. die konstante Region der schweren Kette des menschlichen IgG1, und schließt zumindest das Gelenk, die CH2- und die CH3-Domänen ein.
1. Anti-Integrin-Antikörperhomologe
In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind die Antagonisten, die in den Verwendungen der Erfindungen benützt werden, um an ein Zelloberflächen-alpha4- Integrin (wie VLA-4) und/oder einen Zelloberflächen-Liganden für ein alpha4-Integrin (wie VCAM-1) zu binden, einschließlich blockieren oder bedecken, ein monoclonaler anti-VLA-4- und/oder anti-VCAM-1-Antikörper oder ein Antikörperhomolog, wie vorher definiert. Bevorzugte Antikörper und Homologe für eine Behandlung, insbesondere für eine menschliche Behandlung, schließen menschliche Antikörperhomologe, humanisierte – Antikörperhomologe, chimäre Antikörperhomologe, Fab-, Fab'-, F(ab')2- und F(v)-Antikörperfragmente und Monomere oder Dimere von schweren oder leichten Antikörperketten oder von Gemischen davon ein. Monoclonale Antikörper gegen VLA-4 und/oder VLA-1 sind ein bevorzugtes Bindungsagens im Verfahren der Erfindung.
2. Kleine Molekül-Integrinantagonisten
Der Ausdruck „kleines" Integrinantagonisten-„Molekül" bezeichnet Agenzien, die nicht Teil der Erfindung sind und die die Wirkung von Peptiden (d.h. organischen Molekülen, die Peptidbindungen enthalten können oder nicht), die zum Zerstören der Integrin/Integrinliganden-Wechselwirkung durch zum Beispiel Blockieren von VLA-4 durch Binden von VLA-4-Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen oder Blockieren von VCAM-1 durch Binden von VCAM-1-Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen in der Lage sind, nachahmen. Kleine VLA-4- und VCAM-1 (oder VLA-1 und Kollagen)-Moleküle können selbst Peptide, Semi-Peptid-Verbindungen oder nicht-Peptid-Verbindung wie kleine organische Moleküle sein, die Antagonisten der VCAM-1/VLA-4- und/oder der Kollagen/VLA-1-Wechselwirkung sind. Ein „kleines Molekül", wie hierin definiert, soll nicht einen Antikörper oder ein Antikörperhomolog umspannen. Das Molekulargewicht von beispielhaften kleinen Molekülen ist im Allgemeinen weniger als etwa 2000, obwohl wir nicht beabsichtigen, sie auf einen bestimmten Größenbereich zu beschränken, vorausgesetzt, dass das Molekül der funktionellen Definition entspricht.
Zum Beispiel können kleine Moleküle wie Oligosaccharide, die die Bindungsdomäne eines VLA-4-Liganden nachahmen und der Rezeptor-Domäne von VLA-4 entsprechen, angewendet werden. (Siehe J.J. Devlin et al., 1990, Science 249: 400-406 (1990), J.K. Scott und G.P. Smith, 1990, Science 249: 386-390 und US-Patent 4,833,092 (Geysen). Umgekehrt können kleine Moleküle, die die Bindungsdomäne eines VCAM-1-Liganden nachahmen und der Rezeptordomäne von VCAM-1 entsprechen, angewendet werden.
Beispiele von anderen brauchbaren kleinen Molekülen können in Komoriya et al. („The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CSI) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), S. 15075-79 (1991)) gefunden werden. Sie identifizierten die minimale aktive Aminosäuresequenz, die nötig ist, um VLA-4 zu binden, und synthetisierten basierend auf der Aminosäuresequenz der CS-I-Region (der VLA-4-Bindungsdomäne) einer bestimmten Art von Fibronectin eine Vielzahl von überlappenden Peptiden. Sie identifizierten ein 8-Aminosäuren-Peptid, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, sowie zwei kleinere, überlappende Pentapeptide, Glu-Ile-Leu-Asp-Val und Leu-Asp-Val-Pro-Ser, die eine inhibitorische Aktivität gegen eine Fibronectin-abhängige Zelladhäsion besaßen. Von bestimmten größeren Peptiden, die die LDV-Sequenz enthalten, wurde in der Folge gezeigt, dass sie in vivo aktiv sind (T. A. Ferguson et al., „Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell Mediated Immune Responses In Vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, S. 8072-76 (1991); und S. M. Wahl et al., „Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, S. 655-62 (1994)). Ein cyclisches Pentapeptid, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (worin TPro 4-Thioprolin bedeutet), das sowohl die VLA-4- als auch die VLA-S-Adhäsion an Fibronectin inhibieren kann, ist auch beschrieben worden. (Siehe z.B. D.M. Nowlin et al. „A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Beta1 Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem., 268(27), S. 20352-59 (1993); und die PCT-Veröffentlichung PCT/US91/04862). Dieses Pentapeptid basierte auf der Tripeptid-Sequenz Arg-Gly-Asp von Fibronectin, die als ein allgemeines Motiv in der Erkennungsstelle für einige extrazelluläre Matrixproteine bekannt gewesen war. Von Beispielen von anderen VLA-4-Inhibitoren ist zum Beispiel in Adams et al. „Cell Adhesion Inhibitors", PCT US97/13013 berichtet worden, das lineare Peptidyl-Verbindungen beschreibt, die beta-Aminosäuren enthalten, die eine Zelladhäsions-inhibitorische Aktivität haben. Die internationalen Patentanmeldungen WO 94/15958 und WO 92/00995 beschreiben ein zyklisches Peptid und Peptid-nachahmende Verbindungen mit Zelladhäsions-inhibitorischer Aktivität. Die internationalen Patentveröffentlichungen WO 93/08823 und WO 92/08464 beschreiben Guanidinyl-, Harnstoff- und Thioharnstoff-enthaltende Zelladhäsions-inhibitorische Verbindungen. Patent Nr. 5,260,277 der Vereinigten Staaten beschreibt Guanidinyl-Zelladhäsions-Modulierungsverbindungen. Andere Peptidylantagonisten von VLA-4 sind in D. Y. Jackson et al., „Potent a4beta1peptide antagonists as potential anti-inflammatory agents", J. Med. Chem., 40, 3359 (1997); H. Shroff et al., Small peptide Inhibitors of alpha4beta7 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocytes", Bio. Med. Chem. Lett., 1: 2495 (1996); U.S.-Patent 5,510,332, PCT-Veröffentlichungen WO 98/53814, WO 97/03094, WO 97/02289, WO 96/40781, WO 96/22966, WO 96/20216, WO 96/01644, WO 96106108 und WO 95/15973 beschrieben worden.
Solche kleinen Molekül-Agenzien können durch Synthetisieren einer Vielzahl von Peptiden (z.B. 520 Aminosäuren lange), semi-Peptid-Verbindungen oder organischen nicht-Peptid-Verbindungen und dann Durchmustern jener Verbindungen auf ihre Fähigkeit, die VLA-4/VCAM-Wechselwirkung zu inhibieren, produziert werden. Siehe im Allgemeinen US-Patent Nr. 4,833,092, Scott und Smith, „Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library", Science, 249, S. 386-90 (1990), und Devlin et al., "Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules", Science, 249, S. 40407 (1990).
Verfahren des Herstellens von anti-Integrin-Antikörperhomologen
Die Technologie für das Produzieren von monoclonalen Antikörpern, einschließlich zum Beispiel von monoclonalen anti-Integrin-Antikörpern ist wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Mendrick et al., 1995, Lab. Invest. 72:367-375 (mAKs gegen murines anti-α1β1 und anti-α2β1); Sonnenberg et al. 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAKs gegen murines anti-α6β1); Yao et al. 1996, J. Cell Sci. 1996 109:3139-50 (mAKs gegen murines anti-α7β1); Hemler et al. 1984, J. lmmunol. 132:3011-8 (mAKs gegen menschliches α1β1); Pischel et al. 1987 J. lmmunol. 138:226-33 (mAKs gegen menschliches α2β1); Wayner et al. 1988, J. Cell. Biol. 107:1881-91 (mAKs gegen menschliches α3β1); Hemler et al. 1987 J. Biol. Chem. 262:11478-85 (mAKs gegen menschliches α4β1); Wayner et al. 1988 J. Cell. Biol. 107:1881-91 (mAKs gegen menschliches α5β1); Sonnenberg et al. 1987, J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAKs gegen menschliches α6β1); A Wang et al. 1996 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:664-672 (mAKs gegen menschliches α9β1); Davies et al. 1989 J. Cell. Biol. 109:1817-26 (mAKs gegen menschliches αVβ1); Sanchez-Madrid et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:7489-93 (mAKs gegen menschliches αLβ2); Diamond et al. 1993, J. Cell. Biol. 120:1031-43 (mAKs gegen menschliches αMβ2); Stacker et al. 1991 J. Immunol. 146:648-55 (mAKs gegen menschliches αXβ2); Van der Vieren et al. 1995 Immunity 3:683-90 (mAKs gegen menschliches αDβ2); Bennett et al. 1983 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2417-21 (mAKs gegen menschliches αIIbβ3); Hessle et al. 1984, Differentiation 26:49-54 (mAKs gegen menschliches α6β4); Weinacker et al. 1994 J. Biol. Chem. 269:6940-8 (mAKs gegen menschliches αVβ5); Weinacker et al. 1994 J. Biol. Chem. 269:6940-8 (mAKs gegen menschliches αVβ6); Cerf-Bensussan et al. 1992 Eur. J. Immunol. 22:273-7 (mAKs gegen menschliches αEβ7); Nishimura et al. 1994 J. Biol. Chem. 269:28708-15 (mAKs gegen menschliches αVβ8); Bossy et al. 1991 EMBO J. 10:2375-85 (polyclonale Antiseren gegen menschliches α8β1); Camper et al. 1998 J. Biol. Chem. 273:20383-20389 (polyclonale Antiseren gegen menschliches α10β1).
Die bevorzugten Integrinantagonisten, die hierin in Betracht gezogen werden, können von intakter oder verkürzter genomischer oder cDNA oder von synthetischen DNAs in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden. Die dimeren Proteine können aus Kulturmedien isoliert und/oder in vitro neugefaltet und dimerisiert werden, um biologisch aktive Zusammensetzungen zu bilden. Heterodimere können in vitro durch Kombinieren von getrennten, verschiedenen Polypeptidketten gebildet werden. Alternativ können Heterodimere in einer einzelnen Zelle durch Co-Exprimieren von Nucleinsäuren, die getrennte, verschiedene Polypeptidketten codieren, gebildet werden. Siehe zum Beispiel WO 93/09229 oder US-Patent Nr. 5,411,941 für einige beispielhafte Protokolle für eine rekombinante Heterodimer-Protein-Produktion. Derzeit bevorzugte Wirtszellen schließen ohne Einschränkung Prokaryonten, einschließlich E. coli, oder Eukaryonten, einschließlich Hefe, Saccharomyces, Insektenzellen oder Säugerzellen wie CHO-, COS- oder BSC-Zellen ein. Ein Fachmann wird abschätzen, dass andere Wirtszellen zum Vorteil verwendet werden können. Detaillierte Beschreibungen der Proteine, die in der Praxis dieser Erfindung nützlich sind, einschließlich, wie man sie herstellt, verwendet und sie auf chodrogene Aktivität testet, sind in zahlreichen Veröffentlichungen, einschließlich US-Patent Nr. 5,266,683 und 5,011,691 offenbart.
Die Technologie für das Produzieren von monoclonalen Antikörperhomologen ist wohlbekannt. Kurz, eine immortale Zelllinie (typischerweise Myelomzellen) wird mit Lymphocyten (typischerweise Splenocyten) von einem Säuger, der mit ganzen Zellen immunisiert wurde, die ein gegebenes Antigen, z.B. VLA-4, exprimieren, fusioniert, und die Kulturüberstände der resultierenden Hybridomzellen werden auf Antikörper gegen das Antigen durchmustert. Siehe im Allgemeinen Köhler et al., 1975, Nature, 265: 295-297. Die Immunisierung kann unter Verwendung von Standardvorgehensweisen erreicht werden. Die Einheitsdosis und das Immunisierungsschema hängen von der Art des immunisierten Säugers, seinem Immunstatus, dem Körpergewicht des Säugers usw. ab. Typischerweise wird den immunisierten Säugern Blut entnommen, und das Serum von jeder Blutprobe wird auf bestimmte Antikörper unter Verwendung von geeigneten Durchmusterungs-Tests getestet. Zum Beispiel können anti-VLA-4-Antikörper durch Immunpräzipitation von 1251-markierten Zelllysaten von VLA-4-exprimierenden Zellen identifiziert werden. (Siehe Sachez-Madrid et al. 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 und Hemler et al. 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). Anti-VLA-4-Antikörper können auch durch Durchflusscytometrie z.B. durch Messen der fluoreszenten Färbung von Ramos-Zellen, die mit einem Antikörper inkubiert wurden, von dem angenommen wird, dass er VLA-4 erkennt, identifiziert werden (siehe Elices et al., 1990, Cell, 60: 577-584). Die in der Produktion von Hybridomzellen verwendeten Lymphocyten werden typischerweise von immunisierten Säugern isoliert, deren Seren bereits unter Verwendung solcher Durchmusterungs-Tests positiv auf das Vorliegen von anti-VLA-4-Antikörpern getestet worden sind.
Typischerweise stammt die immortale Zelllinie (z.B. eine Myelom-Zelllinie) von derselben Säugerart wie die Lymphocyten. Bevorzugte immortale Zelllinien sind Maus-Myelom-Zelllinien, die empfindlich auf Kulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält („HAT-Medium"), sind. Typischerweise werden HAT-empfindliche Maus-Myelomzellen mit Maus-Splenocyten unter Verwendung von Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 1500 („PEG 1500") fusioniert. Hybridomzellen, die aus der Fusion resultieren, werden dann unter Verwendung des HAT-Mediums selektiert, das nicht-fusionierte und nicht-produktiv-fusionierte Myelomzellen tötet (nicht fusionierte Splenocyten sterben nach einigen Tagen, weil sie nicht transformiert sind). Hybridome, die einen gewünschten Antikörper produzieren, werden durch Durchmusterung der Hybridomkultur-Überstände nachgewiesen. Zum Beispiel können Hybridome, die hergestellt wurden, um anti-VLA-4-Antikörper zu produzieren, durch Testen des Hybridomkultur-Überstands auf sezernierte Antikörper, die die Fähigkeit aufweisen, an eine rekombinante, die alpha4-Untereinheit-exprimierende Zellinie zu binden, durchmustert werden (siehe Elices et al., vorstehend).
Um anti-VLA-4- oder -VLA-1-Antikörperhomologe zu produzieren, die intakte Immunglobuline sind, wurden Hybridomzellen, die in solchen Durchmusterungs-Tests positiv getestet wurden, in einem Nährmedium unter Bedingungen und für eine Zeit kultiviert, die ausreichend ist, um den Hybridomzellen zu ermöglichen, die monoclonalen Antikörper in das Kulturmedium zu sezernieren. Gewebekultur-Techniken und Kulturmedien, die für Hybridomzellen geeignet sind, sind wohlbekannt. Der konditionierte Hybridomkultur-Überstand kann gesammelt und die anti-VLA-4- oder -VLA-1-Antikörper können wahlweise weiter durch wohlbekannte Verfahren aufgereinigt werden.
Alternativ kann der erwünschte Antikörper durch Injizieren der Hybridomzellen in die Peritonealhöhle einer nicht-immunisierten Maus produziert werden. Die Hybridomzellen proliferieren in der Peritonealhöhle und sezernieren den Antikörper, der als Aszitesflüssigkeit akkumuliert. Der Antikörper kann durch Entnehmen der Aszitesflüssigkeit aus der Peritonealhöhle mit einer Spritze geerntet werden.
Einige monoclonale anti-VLA-4-Maus-Antikörper sind vor kurzem beschrieben worden. Siehe z.B. Sanchez-Madrid et al., 1986, vorstehend; Hemler et al., 1987, vorstehend; Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245). Diese monoclonalen anti-VLA-4-Antikörper wie HP 1/2 und andere anti-VLA-4-Antikörper (z.B. HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9), die in der Lage sind, die beta-Kette von VLA-4 zu erkennen, werden in den Verfahren der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sein. Anti-VLA-4-Antikörper, die die VLA-4-alpha4-Ketten-Epitope erkennen werden, die in die Bindung an VCAM-1- und Fibronectin-Liganden involviert sind (d.h. Antikörper, die an VLA-4 an einer Stelle, die in die Liganden-Erkennung involviert ist, binden und die VCAM-1- und Fibronectin-Bindung blockieren können), sind bevorzugt. Solche Antikörper sind als B-Epitop-spezifische Antikörper (B1 oder B2) definiert worden (Pulido et al., 1991, vorstehend) und sind gemäß der vorliegenden Erfindung auch anti-VLA-4-Antikörper. Kommerziell erhältliche Antikörperhomologe der Erfindung, die anti-VLA-1-Antikörper sind, sind in U.S. 5,855,888 beschrieben worden.
Vollständig menschliche, monoclonale Antikörperhomologe gegen VLA-4 und/oder VLA-1 sind ein weiteres bevorzugtes Bindungsagens, das VLA-4- und/oder VLA-1-Liganden im Verfahren der Erfindung blockieren oder bedecken kann. In ihrer intakten Form können diese unter Verwendung von in vitro-geprimten, menschlichen Splenocyten hergestellt werden, wie von Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147, 86-95 beschrieben. Alternativ können sie durch Repertoire-Clonieren, wie von Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 oder durch Huang und Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236 beschrieben, hergestellt werden.
US-Patent 5,798,230 (25. Aug. 1998, „Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use") beschreibt die Herstellung von menschlichen monoclonalen Antikörpern von menschlichen B-Zellen. Gemäß diesem Vorgang werden menschliche Antikörper-produzierende B-Zellen durch Infektion mit einem Epstein-Barr-Virus oder einem Derivat davon, das das Epstein-Barr-Virus-Kernantigen 2 (EBNA2) exprimiert, immortalisiert. Die EBNA2-Funktion, die für die Immortalisierung nötig ist, wird in der Folge abgeschaltet, was in einem Anstieg der Antikörperproduktion resultiert.
In noch einem anderen Verfahren zum Produzieren von vollständig menschlichen Antikörpern beschreibt das Patent 5,789,650 der Vereinigten Staaten (4. Aug. 1998, „Transgenic non-human animals for producing Heterologous antibodies") transgene nicht-menschliche Tiere, die zum Produzieren von heterologen Antikörpern in der Lage sind, und transgene nicht-menschliche Tiere, die inaktivierte endogene Immunglobulin-Gene haben. Endogene Immunglobulin-Gene werden durch Antisense-Polynucleotide und/oder durch Antiserum, das gegen die endogenen Immunglobuline gerichtet ist, unterdrückt. Heterologe Antikörper werden durch Immunglobulin-Gene codiert, die normalerweise nicht im Genom jener Art des nicht-menschlichen Tiers gefunden werden. Ein oder mehrere Transgene, die Sequenzen von nicht-reorganisierten, heterologen menschlichen schweren Immunglobulin-Ketten enthalten, werden in ein nicht-menschliches Tier eingebracht, wodurch ein transgenes Tier gebildet wird, das zum funktionellen Reorganisieren der transgenen Immunglobulinsequenzen und zum Produzieren eines Repertoires von Antikörpern von verschiedenen Isotypen, die durch die menschlichen Immunglobulin-Gene codiert werden, in der Lage ist. Solche heterologen menschlichen Antikörper werden in B-Zellen produziert, die danach z.B. durch Fusionieren mit einer immortalisierten Zelllinie wie einem Myelom oder durch Manipulieren von solchen B-Zellen durch andere Techniken immortalisiert werden, um eine Zelllinie aufrechtzuerhalten, die zum Produzieren eines monoclonalen, heterologen vollständig menschlichen Antikörperhomologs in der Lage ist.
Große, nicht-immunisierte menschliche Phagen-Displaybanken können auch verwendet werden, um Antikörper mit hoher Affinität zu isolieren, die unter Verwendung einer Standard-Phagentechnologie als menschliche Therapeutika entwickelt werden können.
Ein noch anderes, bevorzugtes Bindungsagens, das Integrin-Liganden im Verfahren der Erfindung blockieren oder bedecken kann, ist ein humanisiertes, rekombinantes Antikörperhomolog, das eine anti-Integrin-Spezifität aufweist. Den frühen Verfahren für die Herstellung von wahren „chimären Antikörpern" folgend (wo die gesamten konstanten und die gesamten variablen Regionen von unterschiedlichen Quellen stammen), wurde ein neuer Ansatz in EP 0239400 (Winter et al.) beschrieben, bei dem Antikörper durch Substitution (innerhalb einer gegebenen variablen Region) ihrer Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) für eine Art mit jenen von einer anderen verändert werden. Dieser Vorgang kann zum Beispiel verwendet werden, um die CDRs von menschlichen variablen Region-Domänen von schweren und leichten Ketten von Ig mit alternativen CDRs von murinen variablen Region-Domänen zu substituieren. Diese veränderten variablen Regionen von Ig können danach mit konstanten Regionen von menschlichem Ig kombiniert werden, um Antikörper zu bilden, die vollständig menschlich in ihrer Zusammensetzung sind, mit Ausnahme der substituierten murinen CDRs. Von solchen CDR-substituierten Antikörpern würde vorhergesagt werden, dass es weniger wahrscheinlich ist, dass sie eine Immunantwort in Menschen im Vergleich zu wahren chimären Antikörpern hervorrufen, weil die CDR-substituierten Antikörper beträchtlich weniger nicht-menschliche Bestandteile enthalten. Der Vorgang zum Humanisieren von monoclonalen Antikörpern durch CDR-„Grafting" ist „Reshaping" bezeichnet worden. (Riechmann et al., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536).
Typischerweise werden die Komplementaritäts-bestimmenden Regionen (CDRs) eines murinen Antikörpers auf die entsprechenden Regionen in einem menschlichen Antikörper übertragen, da es die CDRs sind (drei in den schweren Antikörperketten, drei in den leichten Ketten), die die Regionen des Maus-Antikörpers sind, die an ein spezifisches Antigen binden. Die Transplantation von CDRs wird durch Gentechnologie erreicht, wodurch die CDR-DNA-Sequenzen durch Clonieren von Gensegmenten der variablen (V) Region von murinen schweren und leichten Ketten bestimmt werden und dann zu den entsprechenden menschlichen V-Regionen durch ortsgerichtete Mutagenese transferiert werden. Im Endstadium des Vorgangs werden Segmente des menschlichen Gens der konstanten Region des erwünschten Isotyps (gewöhnlich gamma I für CH und kappa für CL) angefügt, und die humanisierten Gene der schweren und leichten Kette werden in Säugerzellen co-exprimiert, um lösliche, humanisierte Antikörper zu produzieren.
Der Transfer dieser CDRs auf einen menschlichen Antikörper verleiht diesem Antikörper die Antigen-Bindungseigenschaften des ursprünglichen murinen Antikörpers. Die sechs CDRs im murinen Antikörper werden strukturell in eine V-Region-„Gerüst"-Region eingebaut. Der Grund, dass CDR-Grafting erfolgreich ist, ist, dass Gerüst-Regionen zwischen Maus- und menschlichen Antikörpern sehr ähnliche 3-D-Strukturen mit ähnlichen Punkten der Anlagerung für CDRs haben können, so dass CDRs ausgetauscht werden können. Solche humanisierten Antikörperhomologe können, wie in Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; und Orlandi et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833 beispielhaft dargestellt, hergestellt werden.
Nichtsdestotrotz wird von bestimmten Aminosäuren innerhalb der Gerüst-Regionen angenommen, dass sie mit den CDRs interagieren und die Antigen-Gesamtbindungsaffinität beeinflussen. Der direkte Transfer von CDRs von einem murinen Antikörper, um einen rekombinanten, humanisierten Antikörper ohne jegliche Modifikationen der menschlichen V-Region-Gerüste zu produzieren, resultiert oft in einem teilweisen oder vollständigen Verlust der Bindungsaffinität. In einer Reihe von Fällen scheint es kritisch zu sein, die Reste in den Gerüstregionen des Annahme-Antikörpers zu ändern, um eine Bindungsaktivität zu erhalten.
Queen et al., 1989 (obenstehend) und WO 90/07861 (Protein Design Labs) haben die Herstellung eines humanisierten Antikörpers beschrieben, der modifizierten Reste in den Gerüst-Regionen des Annahme-Antikörpers durch Kombinieren der CDRs eines murinen MAk (anti-Tac) mit dem menschlichen Immunglobulin-Gerüst und konstanten Regionen enthält. Sie haben eine Lösung des Problems des Verlustes der Bindungsaffinität, die oft von direktem CDR-Transfer ohne jegliche Modifikationen der menschlichen V-Region-Gerüst-Reste resultiert, gezeigt; ihre Lösung involviert zwei Schlüsselschritte. Erstens werden die menschlichen V-Gerüst-Regionen durch Computeranalyse für optimale Proteinsequenz-Homologie des V-Region-Gerüsts des ursprünglichen murinen Antikörpers, in diesem Fall des anti-Tac-MAk, ausgewählt. Im zweiten Schritt wird die Tertiärstruktur der murinen V-Region durch Computer modelliert, um sich die Gerüst-Aminosäurereste vorstellen zu können, die wahrscheinlich mit den murinen CDRs interagieren, und diese murinen Aminosäurereste werden dann auf das homologe menschliche Gerüst überlagert. Siehe auch Protein Design Labs US-Patent 5,693,762.
Man kann einen unterschiedlichen Ansatz (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271) verwenden und als einen Standard die V-Region-Gerüste, die von den schweren beziehungsweise leichten Kette von NEWM und REI stammen, für das CDR-Grafting ohne radikales Einbringen von Maus-Resten verwenden. Ein Vorteil der Verwendung des Ansatzes von Tempest et al., um NEWM- und REI-basierende, humanisierte Antikörper zu konstruieren, ist, dass die 3-dimensionalen Strukturen der variablen Regionen von NEWM und REI aus der Röntgen-Kristallographie bekannt sind und so spezifische Wechselwirkungen zwischen CDRs und V-Region-Gerüst-Resten modelliert werden können.
Unabhängig vom gewählten Ansatz haben die Beispiele der bis jetzt hergestellten, anfänglich humanisierten Antikörperhomologe gezeigt, dass es kein geradliniger Vorgang ist. Sogar, wenn man anerkennt, dass solche Gerüständerungen nötig sein können, ist es dennoch nicht möglich, auf Basis des verfügbaren Stands der Technik vorherzusagen, welche Gerüstreste, wenn überhaupt, verändert werden müssen, um funktionelle, humanisierte, rekombinante Antikörper der erwünschten Spezifität zu erhalten. Ergebnisse weisen bis jetzt darauf hin, dass Änderungen, die nötig sind, um die Spezifität und/oder die Affinität zu erhalten, größtenteils einzigartig für einen gegebenen Antikörper sind und nicht basierend auf der Humanisierung eines anderen Antikörpers vorhergesagt werden können.
Bevorzugte VLA-4-Antagonisten, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, schließen chimäre und humanisierte, rekombinante Antikörperhomologe (d.h. intakte Immunglobuline und Teile davon) mit einer B-Epitop-Spezifität ein, die hergestellt worden sind und in PCT US 94/00266, eingereicht am 7. Januar 1994, beschrieben sind. Das Ausgangsmaterial für die Herstellung von chimären (Maus Variabel – menschlich Konstant) und humanisierten anti-Integrin-Antikörperhomologen kann ein muriner monoclonaler anti-Integrin-Antikörper, wie vorher beschrieben, ein monoclonaler anti-Integrin-Antikörper, der kommerziell erhältlich ist (z.B. HP2/1, Amae International, Inc., Westbrook, Maine), oder ein monoclonaler anti-Integrin-Antikörper, der gemäß der Lehre hierin hergestellt wurde, sein. Zum Beispiel sind die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten des anti-VLA-4-Antikörpers HP 1/2 cloniert, sequenziert und in Kombination mit den konstanten Regionen der menschlichen schweren und leichten Immunglobulin-Ketten exprimiert worden. Solch ein HP 1/2-Antikörper ist in der Spezifität und der Potenz ähnlich dem murinen HP 1/2-Antikörper und kann in den Verfahren der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung nützlich sein.
Andere bevorzugte humanisierte anti-VLA-4-Antikörperhomologe werden von Athena Neurosciences, Inc. in PCT/US95/01219 (27. Juli 1995) und dem US-Patent 5,840,299 beschrieben. Diese humanisierten anti-VLA-4-Antikörper umfassen eine humanisierte leichte Kette und eine humanisierte schwere Kette. Die humanisierte leichte Kette umfasst drei Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3), die Aminosäuresequenzen von den entsprechenden Komplementaritäts-bestimmenden Regionen einer leichten Maus-21-6-Immunglobulin-Kette (CDR1: KTSQDINKYMA; CDR2: YTSALQP; CDR3: LQYDNLWT) und ein Gerüst der variablen Region einer menschlichen variablen Region-Gerüstsequenz einer leichten kappa-Kette aufweisen, außer dass die Aminosäureposition in mindestens Position durch dieselbe Aminosäure besetzt ist, die in der äquivalenten Position des variablen Region-Gerüsts der leichten Maus-21.6-Immunglobulinkette vorhanden ist. Die humanisierte schwere Kette umfasst drei Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDR1, CDR2 und CDR3), die Aminosäuresequenzen von den entsprechenden Komplementaritäts-bestimmenden Regionen einer schweren Maus-21-6-Immunglobulinkette (CDR1: DTYIH; CDR2: RIDPANGYTKYDPKFQG; CDR3: EGYYGNYGVYAMDY) und ein Gerüst einer variablen Region von Gerüstsequenz einer variablen Region einer menschlichen schweren Kette aufweisen, außer dass die Aminosäureposition in mindestens einer Position durch dieselbe Aminosäure besetzt ist, die in der äquivalenten Position des Gerüsts der variablen Region der schweren Maus-21-6-Immunglobulinkette vorhanden ist. Siehe auch Leger, O.J. et al., Hum. Antibodies 8:3-16 (1997), das einen humanisierten Antikörper (AN 100226) gegen menschliches alpha4-Integrin beschreibt.
Die Verwendungen der vorliegenden Erfindung können Antagonisten anwenden, die durch jegliche Nucleinsäuresequenzen codiert werden, die unter stringenten Bedingungen an Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, die Antikörper codieren, die gegen alpha4-Untereinheiten-enthaltende Integrine gerichtet sind. Zum Beispiel kann ein Antagonist der vorliegenden Erfindung ein Protein sein, das durch eine Nucleinsäuresequenz codiert wird, die unter hohen Stringenzbedingungen an eine oder mehrere jener Nucleinsäuresequenzen, die in Tabelle 6 des US-Patents 5,840,299 gefunden werden, oder das Komplement einer solchen oder von mehreren solchen Sequenzen hybridisiert. Antagonisten können auch ein Protein sein, das durch Nucleinsäuresequenzen codiert wird, die unter hohen Stringenzbedingungen an eine Nucleinsäure, die SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 codiert, die im US-Patent 5,932,214 gefunden werden, hybridisiert. Darüber hinaus können Antagonisten auch ein Protein sein, das durch Nucleinsäuresequenzen codiert wird, die unter hohen Stringenzbedingungen an eine Nucleinsäure hybridisieren, die eine variable Domäne des Antikörpers codiert, der durch die Zelllinie ATCC CRL 11175 produziert wurde.
Alternativ kann ein Antagonist der vorliegenden Erfindung auch ein Protein sein, das durch eine Nucleinsäuresequenz codiert wird, die unter niedrigen Stringenzbedingungen an eine oder mehrere jener Nucleinsäuresequenz, die in der Tabelle 6 von US-Patent 5,840,299 gefunden wird, oder das Komplement einer solchen oder von mehreren solchen Sequenzen hybridisiert. Antagonisten können auch ein Protein sein, das durch eine Nucleinsäuresequenz codiert wird, die unter niedrigen Stringenzbedingungen an eine Nucleinsäure, die SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:4 codiert, die im US-Patent 5,932,214 gefunden werden, hybridisiert. (Darüber hinaus können Antagonisten auch ein Protein sein, das durch Nucleinsäuresequenzen codiert wird, die unter niedrigen Stringenzbedingungen an eine Nucleinsäure hybridisieren, die eine variable Domäne des Antikörpers codiert, der durch die Zelllinie ATCC CRL 11175 produziert wurde.
Therapeutische Anwendungen
Die Menge des aktiven Bestandteils, der mit den Träger-Materialen kombiniert werden kann, um eine einzelne Dosierungsform zu produzieren, wird abhängig von dem behandelten Wirt und der bestimmten Art der Verabreichung variieren. Es sollte verstanden werden, dass ein spezifisches Dosierungs- und Behandlungsschema für einen bestimmten Patienten jedoch von einer Vielzahl von Faktoren, einschließlich der Aktivität der spezifischen angewendeten Verbindung, dem Alter, dem Körpergewicht, dem allgemeinen Gesundheitszustand, dem Geschlecht, der Ernährung, dem Zeitpunkt der Verabreichung, der Ausscheidungsrate, der Arzneistoff-Kombination und der Bewertung des behandelnden Arztes und der Schwere der bestimmten Krankheit, die behandelt wird, abhängen wird. Die Menge des aktiven Bestandteils kann, wenn überhaupt, auch von dem therapeutischen oder prophylaktischen Mittel, mit dem der Bestandteil zusammen verabreicht wird, abhängen.
Die Dosierungs und Dosierungsrate der Verbindungen dieser Erfindung, die wirksam sind, um die Zelladhäsion zu verhindern, zu unterdrücken oder zu inhibieren, werden von einer Vielzahl von Faktoren wie der Natur des Inhibitors, der Größe des Patienten, dem Ziel der Behandlung, dem Wesen der Krankheit, die behandelt werden soll, dem bestimmten verwendeten Arzneimittel und der Bewertung des behandelnden Arztes abhängen. Dosierungsspiegel von zwischen etwa 0,001 und etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise zwischen etwa 0,1 und etwa 50 mg/kg Körpergewicht der aktiven Bestandteilsverbindung sind nützlich. Am meisten bevorzugt wird das alpha4-Integrin-Bindungsagens, wenn es ein Antikörper oder ein Antikörper-Derivat ist, in einer Dosis im Bereich zwischen etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht und etwa 20 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise im Bereich zwischen etwa 1 mg/kg Körpergewicht und etwa 3 mg/kg Körpergewicht und in Abständen von je 1-14 Tagen verabreicht werden. Für nicht-Antikörper oder kleine Bindungsagenzien-Moleküle sollte der Dosisbereich vorzugsweise zwischen molaren Äquivalent-Mengen dieser Mengen des Antikörpers liegen. Vorzugsweise wird eine Antikörper-Zusammensetzung in einer Menge verabreicht, die wirksam ist, um einen Plasmaspiegel des Antikörpers von mindestens 1 mg/ml zu liefern. Die Optimierung der Dosierungen kann durch die Verabreichung der Bindungsagenzien, gefolgt von der Bewertung der Bedeckung von Integrin-positiven Zellen durch das Agens im Zeitablauf, nachdem es in einer gegebenen Dosis in vivo verabreicht wurde, bestimmt werden.
Das Vorliegen des verabreichten Agens kann in vitro (oder ex vivo) durch die Unfähigkeit oder die verminderte Fähigkeit der Zellen des Individuums, dasselbe Agens zu binden, das selbst markiert worden ist (z.B. durch ein Fluorochrom), nachgewiesen werden. Die bevorzugte Dosis sollte ein nachweisbares Bedecken der weitgehenden Mehrheit von Integrin-positiven Zellen produzieren. Vorzugsweise wird die Bedeckung im Fall eines Antikörperhomologs für einen Zeitraum von 1-14 Tagen aufrechterhalten.
Individuen für die Behandlung
Grundsätzlich können die Verwendungen der vorliegenden Erfindung für jedes Säuger-Individuum mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko für den Bedarf einer Nierenersatztherapie (d.h. chronische Dialyse oder Nierentransplantat) angewendet werden. Säuger-Individuen, die gemäß den Verfahren der Erfindung behandelt werden können, schließen menschliche Individuen oder Patienten ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Zusätzlich kann die Erfindung jedoch in der Behandlung von Haus-Säugetieren angewendet werden, die als menschliche Begleiter gehalten werden (z.B. Hunde, Katzen, Pferde), die einen signifikanten kommerziellen Wert haben (z.B. Milchkühe, Fleischrinder, Sporttiere), die einen signifikanten wissenschaftlichen Wert haben (z.B. gefangene oder frei lebende Exemplare von gefährdeten Tierarten) oder die anderweitig einen Wert haben. Zusätzlich müssen bei den Individuen für die Behandlung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung grundsätzlich keine Indikationen für die Behandlung mit den Nieren-Therapeutika der Erfindung, außer jenen Indikationen, die mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen assoziiert sind, vorliegen. Das heißt, es wird erwartet, dass die Individuen für die Behandlung ansonsten frei von Indikationen für eine Behandlung mit den Agenzien der Erfindung sind. In einer gewissen Zahl von Fällen können die Individuen jedoch andere Symptome vorweisen (z.B. Osteodystrophie), für die die Behandlung mit den Agenzien der vorliegenden Erfindung indiziert sein würde. In solchen Fällen sollte die Behandlung dementsprechend angepasst werden, um eine überschüssige Dosierung zu vermeiden. Ein medizinischer oder veterinärmedizinischer Fachmann ist ausgebildet, um Individuen zu erkennen, die ein wesentliches Risiko von chronischem Nierenversagen oder ein wesentliches Risiko für den Bedarf einer Nierenersatztherapie aufweisen. Insbesondere wird erwartet, dass klinische und nicht-klinische Versuche so wie die gesammelte Erfahrung, die sich auf die vorliegenden offenbarten und andere Verfahren der Behandlung bezieht, den geübten Praktiker hinsichtlich der Entscheidung informieren, ob ein bestimmtes Individuum ein chronisches Nierenversagen oder ein Risiko von chronischem Nierenversagen oder ein Risiko des Bedarfs einer Nierenersatztherapie aufweist und ob irgendeine bestimmte Behandlung, einschließlich der Behandlung gemäß der vorliegenden Erfindung, am Besten für den Bedarf des Individuums passt.
Grundsätzlich kann ein Säuger-Individuum als mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko des Bedarfs einer Nierenersatztherapie angesehen werden, wenn jenes Individuum bereits als davon betroffen diagnostiziert worden ist oder angesehen würde, dass es von einem Zustand betroffen ist, der typischerweise zu fortschreitendem Verlust der Nierenfunktion führt, der mit fortschreitendem Verlust von funktionierenden Nephron-Einheiten assoziiert ist. Solche Zustände schließen Nierenkrankheit im Endstadium, chronische diabetische. Nephropathie, diabetische Glomerulopathie, diabetische Nierenhypertrophie, hypertensive Nephrosklerose, hypertensive Glomerulosklerose, chronische Glomerulonephritis, erblich-bedingte Nephritis, Nierendysplasie und chronische Abstoßung nach allogener Nierentransplantation und dergleichen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Diese und andere Krankheiten und Zustände, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, führen typischerweise zu einem fortschreitenden Verlust von funktionierenden Nephronen und zum Beginn von chronischem Nierenversagen.
Häufig kann ein medizinischer oder veterinärmedizinischer Fachmann eine Prognose, Diagnose oder Behandlungsentscheidung auf eine Untersuchung einer Nierenbiopsie-Probe basieren. Solche Biopsien liefern einen Informationsreichtum, der in der Diagnose von Störungen der Niere nützlich ist, aber aufgrund der Invasivität des Verfahrens und der zusätzlichen Verletzung einer mutmaßlich ungesunden Niere nicht für alle Individuen geeignet sein muss. Nichtsdestotrotz können Individuen mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko für den Bedarf einer Nierenersatztherapie durch histologische Indikationen von Nierenbiopsien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, glomerulärer Hypertrophie, tubulärer Hypertrophie, Glomerulosklerose, tubulointerstitieller Sklerose und dergleichen, erkannt werden.
Weniger invasive Techniken für das Bewerten der Nierenmorphologie schließen MRI, CAT-Scans und Ultraschall-Scans ein. Es sind auch Abtastungstechniken verfügbar, die Kontrast-gebende oder Bild-gebende Agenzien (z.B. radioaktive Farbstoffe) anwenden, aber es sollte bemerkt werden, dass manche von diesen besonders toxisch für Nierengewebe und -Strukturen sind und ihre Verwendung daher in Individuen mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen schlecht angeraten sein kann. Solche nicht-invasiven Abtastungstechniken können angewendet werden, um Zustände wie Nierenfibnose oder Sklerose, fokale Nierennekrose, Nierenzysten und makroskopische Nierenhypertrophie nachzuweisen, die ein Individuum in chronisches Nierenversagen oder ein Risiko von chronischem Nierenversagen oder ein Risiko für den Bedarf einer Nierenersatztherapie versetzen wird.
Häufig basieren die Prognose, Diagnose und/oder Behandlungsentscheidungen auf klinischen Indikationen der Nierenfunktion. Eine solche Indikation ist das Vorliegen einer ungewöhnlichen Zahl von „breiten" oder „Nierenversagen"-Abdrucken im Harnsediment, was hinweisend auf tubuläre Hypertrophie ist und die kompensatorische Nierenhypertrophie nahe legt, die für chronisches Nierenversagen typisch ist. Eine bessere Indikation der Nierenfunktion ist die glomeruläre Flußrate (GFR), die direkt durch Quantifizieren der Clearancerate von bestimmten Markern gemessen werden kann, oder die von indirekten Messungen abgeleitet werden kann.
Die Verwendungen der vorliegenden Erfindung müssen nicht auf Individuen beschränkt werden, die irgendwelche bestimmten Maße der GFR oder irgendeines bestimmten Markers der Nierenfunktion aufweisen. Es ist in der Tat nicht notwendig, dass die GFR eines Individuums oder irgendeines anderen bestimmten Markers der Nierenfunktion vor der Ausübung der Behandlungen der vorliegenden Erfindung bestimmt wird. Nichtsdestotrotz wird die Messung der GFR als ein bevorzugtes Mittel des Bewertens der Nierenfunktion angesehen.
Es ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt, dass die GFR die Clearancerate einer Bezugs- oder Markerverbindung vom Plasma in den Urin reflektiert. Die in Betracht zu ziehende Markerverbindung ist typischerweise eine, die frei durch die Glomeruli gefiltert wird, aber die nicht aktiv sezerniert oder durch die Nierentubuli absorbiert wird, und die nicht signifikant durch zirkulierende Proteine gebunden wird. Die Clearancerate ist typischerweise durch die Formel, die oben präsentiert wurde, die das Volumen des Urins, das in einem 24-Stunden Zeitraum produziert wird, und die relativen Konzentrationen des Markers im Urin und Plasma in Beziehung stellt, definiert. Um genauer zu sein, die GFR sollte auch auf den Körperoberflächenbereich korrigiert werden. Die „goldener Standard"-Bezugsverbindung ist Inulin, wegen seiner Filtrationseigenschaften und dem Fehlen der Serumbindung. Die Konzentration dieser Verbindung ist jedoch schwer im Blut oder Urin zu quantifizieren. Die Clearanceraten von anderen Verbindungen, einschließlich Kreatinin, werden daher oft statt Inulin verwendet. Zusätzlich werden oft verschiedene Formeln angewendet, die versuchen, die Schätzung der tatsächlichen GFR durch Vermeiden der Berücksichtigungen der tatsächlichen Urin-Konzentrationen des Markers, des tatsächlichen täglichen Volumens des produzierten Urins oder der tatsächlichen Körperoberflächenbereiche zu vereinfachen. Diese Werte können durch Schätzungen ersetzt werden, die auf anderen Faktoren basieren, durch Grundlinien-Werte, die für dasselbe Individuum etabliert wurden, oder durch Standardwerte für ähnliche Subjekte. Diese Schätzungen sollten jedoch mit Vorsicht verwendet werden, da sie unpassende Annahmen mit sich bringen können, die auf der Nierenfunktion von normalen oder gesunden Individuen basieren. Zusätzlich wird die Clearance von p-Aminohippurat (PAH) verwendet, um die Nierenclearanceraten zu schätzen.
Verschiedene Verfahren und Formeln sind auf dem Fachgebiet entwickelt worden, die einen erwarteten Wert der GFR für ein gesundes Individuum mit bestimmten Charakteristika beschreiben. Insbesondere sind Formeln verfügbar, die einen erwarteten Wert der GFR basierend auf Plasma-Kreatininspiegeln, Alter, Gewicht und Geschlecht liefern. Andere Formeln können natürlich angewendet werden, und Tabellen von Standardwerten können für Individuen eines gegebenen Alters, Gewichts, Geschlechts und/oder für die Plasma-Kreatininkonzentration produziert werden. Neuere Verfahren der Messung oder Schätzung der GFR (z.B. unter Verwendung der NMR- oder MRI-Technologien sind jetzt auch auf dem Fachgebiet erhältlich und können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,100,646 und 5,335,660).
Grundsätzlich, unabhängig von der Art und Weise, in der die GFR gemessen oder geschätzt wird, kann ein Individuum als mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko für den Bedarf einer Nierenersatztherapie angesehen werden, wenn das Individuum eine GFR aufweist, die chronisch weniger als etwa 50% der erwarteten GFR für jenes Individuum ist. Das Risiko wird als größer angesehen, wenn die GFR niedriger wird. Daher wird ein Individuum steigend mit einem Risiko angesehen, wenn das Individuum eine GFR aufweist, die chronisch weniger als etwa 40%, 30% oder 20% der erwarteten GFR ist. Ein menschliches, männliches Individuum, das mindestens etwa 50 kg wiegt, kann als mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko eines chronischen Nierenversagens oder mit einem Risiko eines Bedarfs einer Nierenersatztherapie angesehen werden, wenn das Subjekt eine GFR aufweist, die chronisch weniger als etwa 50 ml/min ist. Das Risiko wird als größer angesehen, wenn die GFR niedriger wird. Daher wird ein Individuum steigend mit einem Risiko angesehen, wenn das Individuum eine GFR aufweist, die chronisch weniger als etwa 40, 30 oder 20 ml/min ist. Ein menschliches, weibliches Individuum, das mindestens etwa 40 kg wiegt, kann als mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko eines chronischen Nierenversagens oder mit einem Risiko eines Bedarfs einer Nierenersatztherapie angesehen werden, wenn das Subjekt eine GFR aufweist, die chronisch weniger als etwa 40 ml/min ist. Das Risiko wird als größer angesehen, wenn die GFR niedriger wird. Daher wird ein Individuum vermehrt als mit einem Risiko behaftet angesehen, wenn das Individuum eine GFR aufweist, die chronisch weniger als etwa 30, 20 oder 10 ml/min ist. Grundsätzlich kann ein Individuum als mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko eines chronischen Nierenversagens oder mit einem Risiko eines Bedarfs einer Nierenersatztherapie angesehen werden, wenn jenes Individuum eine Zahl von funktionellen Nephron-Einheiten besitzt, die weniger als etwa 50% der Zahl von funktionellen Nephron-Einheiten eines gesunden, aber andernfalls ähnlichen Individuums ist. Wie oben wird das Risiko als größer angesehen, wenn die Zahl der funktionellen Nephronen weiter sinkt. Daher wird ein Individuum zunehmend als mit einem Risiko behaftet angesehen, wenn das Individuum eine Anzahl von funktionellen Nephronen aufweist, die weniger als etwa 40, 30 oder 20% der Zahl für ein ähnliches, aber gesundes Individuum ist.
Schließlich sollte bemerkt werden, dass Individuen, die eine einzelne Niere besitzen, unabhängig von der Art des Verlusts der anderen Niere (z.B. physisches Trauma, chirurgisches Entfernen, Geburtsdefekt) prima facie als mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen oder dem Bedarf für eine Nierenersatztherapie angesehen werden kann. Dies trifft insbesondere für jene Individuen zu, in denen aufgrund einer Krankheit oder eines Zustandes, der die verbleibende Niere heimsuchen kann, eine Niere verlorengegangen ist. In ähnlicher Weise können Individuen, die bereits Empfänger eines Nierentransplantats sind oder die bereits chronische Dialyse erhalten (z.B. chronische Hämodialyse oder kontinuierliche, ambulante Peritoneal-Dialyse), als mit einem Risiko eines chronischen Nierenversagens oder eines Bedarfs einer weiteren Nierenersatztherapie angesehen werden.
Formulierungen und Verfahren der Behandlung
Das Integrinantagonisten-Agens der vorliegenden Erfindung kann auf jeglichem Weg verabreicht werden, der mit dem bestimmten, angewendeten Nieren-Therapeutikum kompatibel ist. Daher kann die Verabreichung, wie angemessen, ein oraler oder parenteraler, einschließlich intravenöser, intraperitonealer und renal-intrakapsulärer Weg der Verabreichung sein. Zusätzlich kann die Verabreichung durch periodische Injektionen eines Bolus des/der hierin beschriebenen Agens/Agenzien stattfinden oder kann durch intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung von einem Reservoir, das extern (z.B. ein i.v.-Beutel) oder intern (z.B. ein bioerodierbares Implantat oder eine implantierte Pumpe) ist, kontinuierlicher gemacht werden. In einem Verfahren gemäß der Erfindung werden die Integrinantagonisten vorzugsweise parenteral verabreicht. Der Ausdruck „parenteral", wie hierin verwendet, schließt Aerosol-, subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intra-artikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale, intrahepatische, intraläsionale, und intracraniale Injektions- oder Infusionstechniken ein.
Die Agenzien der Erfindung können an ein Individuum durch alle geeigneten Mittel, vorzugsweise direkt (z.B. lokal wie durch Injektion oder örtliche Verabreichung an eine Gewebestelle) oder systemisch (z.B. parenteral oder oral), geliefert werden. Wo das Agens parenteral wie durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Verabreichung geliefert werden soll, umfasst das Agens vorzugsweise einen Teil einer wässrigen Lösung. Die Lösung ist physiologisch verträglich, so dass die Lösung zusätzlich zur Abgabe des gewünschten Agens an das Individuum den Elektrolyt- und/oder Volumenhaushalt des Individuums nicht anderweitig nachteilig beeinflusst. Das wässrige Medium für das Agens kann daher normale physiologische Kochsalzlösung (z.B. 0,9% NaCl, 0,15M, pH 7-7,4) umfassen.
Die Integrinantagonisten werden vorzugsweise als ein steriles Arzneimittel, das einen pharmazeutisch verträglichen Träger enthält, der jeder der zahlreichen wohlbekannten Träger wie Wasser, Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung, Dextrose, Glycerin, Ethanol und dergleichen oder Kombinationen davon sein kann, verabreicht. Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in der Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen verwendet werden, die von anorganischen oder organischen Säuren und Basen stammen. Eingeschlossen unter solchen sauren Salzen sind die folgenden: Acetat, Adipinat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzolsufonat, Bisulfat, Butyrat, Citrat, Camphorat, Camphorsulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecysulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydrojodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, 2-Naphtalinsulfonat, Nicotinat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrzet, Thiocyanat, Tosylat und Utidecanoat. Basensalze schießen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze wie Natrium- und Kaliumsalze, alkalische Erdmetallsalze wie Calcium- und Magnesiumsalze, Salze mit organischen Basen wie Dicyclohexylaminsalze, N-Methyl-D-Glucamin, Tris(hydroxymethyl)methylamin und Salze mit Aminosäuren wie Aspargin, Lysin und so weiter ein. Die basischen Stickstoff-enthaltenden Gruppen können auch mit solchen Agenzien wie Niederalkyl-Halogeniden wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butyl-Chloriden, -Bromiden und -Jodiden; Dialkylsulfaten wie Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfaten, langkettigen Halogeniden wie Decyl-, Latiryl-, Myristyl- und Stearyl-Chloriden, -Bromiden und -Jodiden, Aralkylhalogeniden wie Benzyl- und Phenethyl-Bromiden und anderen quaternisiert werden. Wasser- oder Öl-lösliche oder dispergierbare Produkte werden dadurch erhalten.
Die hierin beschriebenen Arzneimittel umfassen irgendwelche der Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder pharmazeutisch verträgliche Derivate davon zusammen mit jeglichem pharmazeutisch verträglichen Träger. Der Ausdruck „Träger", wie hierin verwendet, schließt verträgliche Adjuvanzien und Vehikel ein. Pharmazeutisch verträgliche Träger, die in den Arzneimitteln dieser Erfindung verwendet werden können, schließen Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine wie menschliches Serumalbumin, Puffersubstanzen wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, teilweise Glyceridgemische von gesättigten Pflanzen-Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Siliciumdioxid, Magnesiumtrisilikat, Polyvinylpyrrolidon, auf Cellulose-basierende Substanzen, Polyethylenglycol, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyacrylate, Wachse, Polyethylen-Polyoxypropylen-Block-Polymere, Polyethylenglycol und Wollfett ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Die hierin beschriebenen Arzneimittel können in der Form eines sterilen, injizierbaren Präparats, zum Beispiel einer sterilen, injizierbaren, wässrigen oder öligen Suspension vorliegen. Diese Suspension kann gemäß den Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, unter Verwendung von geeigneten dispergierenden oder Netzmitteln und suspendierenden Mitteln formuliert werden. Das sterile, injizierbare Präparat kann auch eine sterile, injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht-toxischen, parenteral-verträglichen Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, zum Beispiel als eine Lösung in 1,3-Butandiol. Unter den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die angewendet werden können, sind Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Kochsalzlösung. Zusätzlich werden sterile fette Öle konventionell als ein Lösungsmittel oder ein suspensierendes Medium angewendet. Zu diesem Zweck kann jedes sanft fette Öl, einschließlich synthetische Mono- oder Diglyceride, angewendet werden. Fettsäuren wie die Ölsäure und ihre Glycerid-Derivate so wie natürliche, pharmazeutisch verträgliche Öle wie Olivenöl oder Kastoröl, insbesondere in ihren polyoxyethylierten Versionen, sind in der Herstellung von injizierbaren Formulierungen nützlich. Diese Öl-Lösungen oder -Suspensionen können auch ein langkettiges Alkohol-Verdünnungsmittel oder ein Dispersionsmittel enthalten.
Die hierin beschriebenen Arzneimittel, besonders die kleinen Integrinantagonisten-Moleküle, können parenteral oder oral verabreicht werden. Wenn oral verabreicht, können sie in jeder oral verträglichen Dosierungsform, einschließlich Kapseln, Tabletten, wässrigen Suspensionen oder Lösungen, aber nicht darauf limitiert, verabreicht werden. Im Fall von Tabletten für die orale Verwendung schließen Träger, die im allgemein verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel wie Magnesiumstearat werden auch typischerweise zugefügt. Für die orale Verabreichung in einer Kapselform schließen nützliche Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein. Wenn wässrige Suspensionen für die orale Verwendung benötigt werden, wird der aktive Bestandteil mit emulgierenden und suspensierenden Mitteln kombiniert. Wenn gewünscht, können auch bestimmte Süß-, Geschmacks- oder Farbstoffe zugefügt werden. Transdermale Pflaster können auch örtlich verwendet werden.
Die hierin beschriebenen Arzneimittel können auch durch nasales Aerosol oder Inhalation durch die Verwendung eines Verneblers, eines Trockenpulver-Inhalators oder eines Messdosierungs-Inhalators verabreicht werden. Solche Zusammensetzungen werden gemäß den Techniken hergestellt, die auf dem Gebiet der pharmazeutischen Formulierung wohlbekannt sind, und können als Lösungen in Kochsalzlösung unter Anwendung von Benzylalkohol oder anderen geeigneten Konservierungsmitteln, Absorptionsförderern, um die Bioverfügbarkeit zu verstärken, Fluorkohlenstoffen und/oder anderen konventionellen Solubilisierungs- und Dispersionsmitteln hergestellt werden. Gemäß einer anderen Ausführungsform können Zusammensetzungen, die eine Verbindung dieser Erfindung enthalten, auch ein zusätzliches Agens umfassen, das von der Gruppe ausgewählt wird, die aus Corticosteroiden, Entzündungshemmern, Immunsuppressoren, anti-Metaboliten und Immunmodulatoren besteht. Verbindungen innerhalb jeder dieser Klassen können von jedem derjenigen ausgewählt werden, die unter den geeigneten Gruppentiteln in „Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, England, S. 970-986 (1990), deren. Offenbarung hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist, aufgelistet sind. Spezifische Verbindungen sind Theophyllin, Sulfasalazin und Aminosalicylate (Entzündungshemmer); Cyclosporin, FK-506 und Rapamycin (Immunsuppressoren); Cyclophosphamid und Methotrexat (anti-Metaboliten); Steroide (inhaliert, oral oder örtlich) und Interferone (Immunmodulatoren).
Nützliche Lösungen für die parenterale Verabreichung können durch jedes der Verfahren hergestellt werden, die auf dem pharmazeutischen Fachgebiet wohlbekannt sind, beschrieben zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A. Hrsg.), Mack Pub., 1990. Wie es von einem Fachmann geschätzt werden wird, enthalten die formulierten Zusammensetzungen therapeutisch wirksame Mengen des Nieren-Therapeutikums. Das heißt, sie enthalten Mengen, die geeignete Konzentrationen des Mittels an die Nierengewebe für einen Zeitraum liefern, der ausreichend ist, um den permanenten oder fortschreitenden Verlust der Nierenfunktion zu verhindern, zu inhibieren, zu verzögern oder zu mildern oder anderweitig eine therapeutische Wirksamkeit zu liefern. Wie durch Fachleute geschätzt werden wird, wird die Konzentration der in einer therapeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verbindungen abhängig von einer Zahl von Faktoren, einschließlich der biologischen Wirksamkeit des ausgewählten Agens, den chemischen Charakteristika (z.B. Hydrophobe) der angewendeten Verbindungen, der Formulierung der Verbindungs-Excipienten, dem Verabreichungsweg und der vorgesehenen Behandlung, einschließlich, ob der aktive Bestandteil direkt in eine Niere oder Nierenkapsel verabreicht werden wird oder ob er systemisch verabreicht werden wird, variieren. Die bevorzugte Dosis, die verabreicht werden soll, ist wahrscheinlich auch abhängig von solchen Variablen wie dem Zustand der Nierengewebe, dem Ausmaß des Nierenfunktionsverlustes und dem gesamten Gesundheitszustand des bestimmten Individuums. Die Dosen können kontinuierlich oder täglich verabreicht werden, aber es wird derzeit bevorzugt, dass die Dosen einmal, zweimal oder dreimal pro Woche für so lange, wie eine befriedigende Antwort andauert (gemessen zum Beispiel durch Stabilisierung und/oder Verbesserung der Nierenfunktion durch geeignete medizinische Marker und/oder der Qualität von Lebenszeichen), verabreicht werden. Weniger häufige Dosen, zum Beispiel monatliche Dosen, können auch angewendet werden. Für Individuen, die andernfalls kontinuierliche Hämodialyse-Sitzungen in zweiwöchigem oder dreiwöchigem Abstand benötigen würden, werden kontinuierliche, intravenöse oder intraperitoneale Infusionen in zweiwöchigem oder dreiwöchigem Abstand nicht als übermäßig unbequem angesehen. Zusätzlich, um häufige Infusionen zu erleichtern, kann eine Implantation eines semi-permanenten Stents (z.B. intravenös, intraperitoneal oder intrakapsulär) empfehlenswert sein.
Die Nieren-Therapeutika der Erfindung können natürlich alleine oder in Kombination mit anderen Molekülen, von denen bekannt ist, dass sie in der Behandlung der hierin beschriebenen Zustände günstig sind, verabreicht werden. Wenn in Kombination mit anderen Agenzien verwendet, kann es empfehlenswert sein, die Dosierungen der Nieren-Therapeutika der vorliegenden Erfindung dementsprechend zu ändern.
Tiermodelle
Die Agenzien der vorliegenden Erfindung können auch in Tiermodellen für chronisches Nierenversagen getestet werden. Säugermodelle für chronisches Nierenversagen zum Beispiel in Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Katzen, Hunden, Schafen, Ziegen, Schweinen, Rindern, Pferden und nicht-menschlichen Primaten können durch Verursachen einer geeigneten, direkten oder indirekten Verletzung oder eines Insults der Nierengewebe des Tiers gebildet werden. Tiermodelle für chronisches Nierenversagen können zum Beispiel durch Ausführen einer teilweisen (z.B. 5/6) Nephrektomie gebildet werden, die die Zahl der funktionierenden Nephron-Einheiten auf einen Spiegel reduziert, der eine kompensatorische Nierenhypertrophie, weiteren Nephron-Verlust und die fortschreitende Abnahme der Nierenfunktion initiiert, durch die das chronische Nierenversagen charakterisiert ist. Schließlich können die Agenzien der vorliegenden Erfindung auf ihre therapeutische Wirksamkeit im Bewirken einer klinisch signifikanten Verbesserung in einem Standardmarker der Nierenfunktion bewertet werden, wenn sie an ein Säuger-Individuum (z.B. einen menschlichen Patienten) mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen verabreicht werden. Solche Marker der Nierenfunktion sind in der medizinischen Literatur wohlbekannt und schließen Geschwindigkeiten des Anstiegs der BUN-Spiegel, Geschwindigkeiten des Anstiegs von Serumkreatinin, statische Messungen von BUN, statische Messungen von Serumkreatinin, glomeruläre Filtrationsraten (GFR), Verhältnisse von BUN/Kreatinin, Serumkonzentrationen von Natrium (Na+), Urin/Plasma-Verhältnisse für Kreatinin, Urin/Plasma-Verhältnisse für Harnstoff, Harn-Osmolalität, tägliche Harnausscheidung und dergleichen ein (siehe zum Beispiel Brenner und Lazarus (1994), in Harrison's Principles of Internal Medicine, 13. Auflage, ohne darauf limitiert zu sein.
Die Ausführung der Erfindung, einschließlich zusätzlicher bevorzugter Aspekte und Ausführungsformen davon, werden durch die folgenden Beispielen, die hierin nur zur Illustration dargelegt sind und nicht als die Erfindung in irgendeiner Weise limitierend ausgelegt werden sollten, noch vollständiger verstanden werden.
Beispiele
Beispiel 1: Tiermodell des Nierenversagens.
Eine intravenöse Injektion von Serum gegen die glomeruläre Basalmembran (GMB) von Ratte (NTS) mit hohem Titer in WKY-Ratten führt zu einer Ablagerung von Kaninchen-IgG auf der Ratten-GBM, wo es als ein eingeschleustes Antigen wirkt und eine starke Entzündungsantwort initiiert, die durch Hochregulierung von pro-inflammatorischen Cytokinen und Adhäsionsmolekülen wie ICAM-1 und VCAM-1 zusammen mit einer Rekrutierung von Leukocyten in die Glomeruli charakterisiert ist. Der Zell-Einstrom ist vorwiegend monocytär, wobei auch CD8+-Zellen vorhanden sind, obwohl diese keine klassischen T-Zellen sind. Manche co-exprimieren CD8 und den Ratten-Monocyten/Macrophagen-Marker ED 1 (CD68-Äquivalent), was nahe legt, dass sie eine Makrophagen-Untergruppe repräsentieren.
Der Zell-Einstrom läuft spätestens am Tag 1 dieses nierentoxischen Nephritis-Modells (NTN), und die glomerulären Leukocyten-Zahlen sind am Tag 3-4 am Höchsten. Eine Nierenverletzung ist in Form von Proteinurie am Tag 4 offensichtlich, und fibrinoide Nekrose und Sichelform-Bildung erfolgt innerhalb der Glomeruli am Tag 7.
Entzündliche interstitielle Infiltrate bilden sich ab dem Tag 11, wenn der entzündliche Vorgang sich von den Glomeruli ausbreitet. Diese „sekundäre" tubulointerstitielle Nephritis wird auch in Menschen mit primärer Glomerulonephritis gesehen und deutet oft eine schlechte Prognose an. Die Kreatinin-Clearance (CNC) beginnt zu sinken, und das Serum-Kreatinin steigt in der dritten Woche des NTN. Die Fibrose innerhalb der Glomeruli und des interstitiellen Kompartments verschlechtert sich fortschreitend, bis der Tod um den Tag 40 durch CRF erfolgt.
Kurz, männliche Wistar-Kyoto (WKY)-Ratten im Alter zwischen 6 und 8 Wochen (Gewicht 200-250 g) werden von Charles River Laboratories erworben und mit Standard-Rattenfutter und Wasser ad libitum gefüttert. Heterologes, nierentoxisches Serum (NTS) wird durch Standardverfahren hergestellt. Zum Beispiel werden Ratten-Glomeruli isoliert, beschallt und lyophilisiert, um eine glomeruläre Ratten-Basalmembran (GBM)-Präparation mit weniger als 5% tubulärer Kontamination zu liefern. Weiße Albino-Neuseeland-Kaninchen werden mit Ratten-GBM in CFA immunisiert, dann erfolgt in monatlichen Abständen mit GBM eine Auffrischung, bis ein anti-GBM-Antiserum mit hohem Titer bei den Test-Blutungen erhalten wird. Insgesamt 0,1 ml NTS werden dann i.v. in die WKY-Ratten injiziert, was zu der Entwicklung einer nierentoxischen Nephritis, wie oben beschrieben, führt. Details von diesem Modell können in Tam, F.W.K. et al., Nephrology Dialysis Transplantation 14: 1658-1666 (1999) gefunden werden.
Bewertung der Nierenkrankheit
Funktionelle Parameter:
Albuminurie/Proteinurie: dies reflektiert ein glomeruläres Auslaufen und zu einem geringeren Grad ein Versagen des tubulären Metabolismus von gefiltertem Protein. Die Interpretation von solchen Daten kann schwer sein, da sie das Produkt von zwei unabhängigen Variablen sind; erhöhte GBM-Permeabilität führt zu einer größeren Proteinurie, aber eine sinkende glomeruläre Filtrationsrate reduziert eine glomeruläre Proteinurie.
Harn wurde in Stoffwechselkäfigen 24 h vor dem Entnehmen gesammelt. Die Harn-Albuminkonzentration wurde durch Raketen-Immunelektrophorese bestimmt. Die Ham-Proteinkonzentration wurde durch Sulphosalicylsäure-Präzipitation bestimmt.
Serum-Kreatinin und Kreatinin-Clearance (CrCl): Peripheres Blut wurde für die Bestimmung der Serum-Kreatininkonzentration unter Verwendung von Olympus-Reagenzien und einem Olympus-AU600-Analysegeräts (Olympus, Eastleigh, GB) entnommen. Die Harn-Kreatininkonzentration wurde auch gemessen (Bayer, RA-XT, Newbury, GB), um die Berechnung der Kreatinin-Clearance zu ermöglichen.
Überleben: Der Schlusspunkt dieser Studien ist entweder ein plötzlicher Tod oder Töten, um das Leiden zu lindern. Die Tiere werden täglich durch einen unbeeinflussten, unabhängigen Beobachter betrachtet, und moribunde Tiere werden getötet, wie es durch einen Dritten als nötig erachtet wird. In der Praxis erreichten etwa die Hälfte der Tiere in den Überlebens-Studien den „Tötungs"-Endpunkt.
Histologische Parameter:
Hämatoxylin- und Eosin-gefärbte Schnitte ermöglichen eine grobe Bewertung der glomerulären Vernarbung, von tubulärem Ausfall, von interstitiellen entzündlichen Infiltraten und interstitieller Fibrose unter Verwendung von willkürlichen Bewertungsskalen.
Glomeruläre Fibrose: Wir schätzten durch einen Computer die % der Nierenrinden-Bereiche, die durch Masson-Trichom-Histochemie grün gefärbt wurden, was eine Art der Bewertung der Kollagen-„Beladung" innerhalb einer Niere liefert. Individuelle Glomeruli können auch als der Bereich von Interesse ausgewählt werden, um eine spezifische glomeruläre Fibrose zu berechnen. Um die interstitielle Fibrose innerhalb der Glomeruli zu quantifizieren, wurden Paraffin-eingebettete Nierenschnitte unter Verwendung eines Standard-Trichom-Verfahrens (Martius-Gelb, Brilliant-Kristallrot und Anilinblau) gefärbt. Um die glomeruläre Fibrinablagerung zu quantifizieren (z.B. fibrinoide Nekrose), wurden die Paraffin-eingebetteten Nierenschnitte unter Verwendung von Martius-Gelb gefärbt, was Fibrin in einer rot/orangen Farbe färbt. Die Schnitte wurden unter X200 Vergrößerung unter Verwendung eines Olympus BX40-Mikroskops (Olympus Optical, London, GB) mit einer befestigten Photonic-Digitalkamera (Photonic Science, East Sussex, GB) untersucht. Bilder wurden aufgenommen und unter Verwendung der Image-Pro Plus TM-Software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) analysiert.
Die Quantifizierung des Nierenrinden-Bereichs in %, der nach Immunperoxidase-Färbung der Nierenschnitte auf die ED(A)-Domäne von Fibronectin braun gefärbt war, scheint zwischen CRF von unterschiedlich funktioneller Schwere zu unterscheiden. In ähnlicher Weise ermöglicht eine Typ III-Kollagen-Immunhistochemie die Berechnung des gefärbten Nierenrinden-Bereichs in %.
Die Expression von glomerulärem alpha-Actin der glatten Muskulatur (SMA) wurde durch Immunfluoreszenz gemessen. Dieses Protein definiert eine Population von „myofibroblastischen" Zellen innerhalb der Glomeruli, von denen angenommen wird, dass sie eine Schlüsselrolle bei der glomerulären Fibrose haben. Die Quantifizierung der immunfluoreszenten Färbung für alpha-SMA korreliert gut mit den glomerulären Masson-Trichom-Fibrosewerten.
Beispiel 2. TGFbeta-Antagonisten-Wirkungen in akuten vs. chronischen Stadien
TGFbeta spielt eine gut etablierte Rolle in der Pathogenese des Nierenversagens. Wir verwendeten eine löslichen, dimeren Kaninchen-TGFbeta-Rezeptor Typ II auf einem menschlichen Fc-Stamm (siehe Smith, P.D., et al., Circ. Res. 84: 1212-1222 (1999)), um als ein TGFbeta-Antagonist in vivo zu wirken. Der lösliche TGFbeta-Rezeptor als eine Fc-Fusion wurde durch i.p.-Injektion jeden 3. Tag, beginnend am Tag–1, zu 5 mg/kg verabreicht. Die Verabreichung wurde für die Dauer des Experiments mit PBS, das als eine Kontrolle verwendet wurde, fortgesetzt. NTN wurde wie oben bei 12 Ratten am Tag 0 induziert, und die Hälfte der Ratten wurde am Tag 9 getötet, die verbleibenden am Tag 21 getötet. Keine signifikanten Wirkungen auf die Albuminurie oder die Kreatinin-Clearance wurden gesehen, obwohl es zu allen untersuchten Zeitpunkten einen Trend zu weniger fibrinoider Nekrose in den Glomeruli gab. Es wurden keine Unterschiede in den Zahlen von Sichelformen zwischen den Gruppen gesehen. Die Immunhistochemie zeigte, dass der TGFbeta-Antagonist keine signifikanten Wirkungen hatte auf: 1) die zellulären, glomerulären Infiltrate (EDI + Makrophagen oder CD8+-Zellen); 2) die glomeruläre Makrophagen-Aktivierung (induzierbare Stickstoffoxid-Synthetase-Expression); oder 3) die glomeruläre Zellproliferation (Ki67-Expression) (Die Daten sind hier nicht dargelegt).
In der Studie des chronischen Nierenversagens wurde NTN in 12 Ratten induziert, und der lösliche, dimere Kaninchen-TGFbeta-Rezeptor Typ II auf einem menschlichen Fc-Stamm wurde in einer Dosis von 1 mg/kg durch i.p.-Injektion jeden zweiten Tag vom Tag 14 bis Tag 35, wenn die Ratten getötet wurden, verabreicht. Sechs der zwölf Ratten, die mit NTS induziert wurden, dienten als Kontrollen, die menschliches IgG in einer vergleichbaren Dosis erhielten. Das Serum-Kreatinin war in Ratten, die den löslichen TGFbeta-Antagonisten an den Tagen 28 und 35 erhielten, signifikant niedriger (Siehe 1). Das Zählen, ob glomeruläre Sichelformen vorhanden waren oder nicht, ergab keine Unterschiede zwischen den Gruppen, weil die Verzögerung zu Beginn der Behandlung in diesem Experiment bedeutete, dass beinahe alle Glomeruli gewisse Abnormalitäten aufwiesen. In 2 sind die durchschnittlichen % der fibrosierten glomerulären Fläche (Schätzungen für 50 aufeinander folgende Glomeruli) und die Zahl der glomerulären Quadranten, die durch Fibrin besetzt sind, gezeigt.
Beispiel 3: Wirkungen des anti-VLA-1-Antikörperhomologs auf akute versus chronische Stadien
Antikörper gegen VLA-1 wurden in Kurzzeit-Studien, die sich bis Tag 10 erstreckten, bewertet. Ein Hamster-Antikörper (Ha3 1/8) gegen das Ratten-alpha 1-Integrin VLA-1 wurde am Tag -1 und dann an den Tagen 1, 3, 6 und 8 verabreicht. Ein Kontroll-Antikörper (HA4/8) wurde auch verabreicht. Bei einer Dosis von 2,5 mg/kg i.p. gab es keine signifikanten Wirkungen auf die Albuminurie zwischen dem Antagonisten und der Kontrolle. Wir sahen auch mit keinem der Antikörper und bei keiner Dosis Wirkungen auf die glomeruläre, fibrinoide Nekrose oder die Bildung von Sichelformen.
Die chronische Studie folgte einem ähnlichen Protokoll wie die Studie mit dem löslichen TGFbeta-Rezeptor oben, außer dass die Antikörper von den Tagen 14-28 verabreicht wurden. 24 Ratten wurden am Tag 0 mit NTS induziert, zehn erhielten anti-VLA-1 (Ha3 1/8) von den Tagen 14-28, zehn erhielten einen Kontroll-Antikörper (Ha4/8) für denselben Zeitraum. Vier Ratten wurden am Tag 14 für eine Grundlinien-Histologie getötet. Zehn Ratten wurden am Tag 35 für eine Histologie getötet (5 behandelte und 5 Kontrollen). Zehn Ratten verblieben in einem Überlebens-Zweig und starben entweder oder wurden aus humanen Gründen getötet. Eine Ratte in der anti-VLA-1-mAk-Gruppe starb durch die Anästhesie.
Die Geschwindigkeit der Krankheit in diesem Experiment war langsamer als jene, die vorher gesehen wurde, so dass der Tod später als normal erfolgte. Die Überlebenskurven (3) wichen so ab, dass alle Kontrollratten bei etwa 75 Tagen gestorben sind, und alle 4 Ratten in der anti-VLA-1-mAk-Gruppe weiter gesund ausschauten, sogar nach 125 Tagen.
Beispiel 4: Wirkungen des anti-alpha4-Antikörperhomologs auf akute vs. chronische Stadien
In der akuten Phase dieses Modells haben wir vorher gezeigt, dass alpha4-Integrinantagonisten signifikant eine Nierenverletzung abschwächten (Albuminurie, glomeruläre, fibrinoide Nekrose und Bildung von Sichelformen). Siehe Allen, A.R. et al., J. Immunology 162: 5519-5527 (1999).
Um die Rolle der alpha4-Integrinantagonisten im Vermitteln von chronischer, fortschreitender Nierenverletzung in diesem Modell anzusprechen, verwendeten wir ein ähnliches Protokoll wie jenes, das im Beispiel 2 für das lösliche TGFbeta II gezeigt ist. Wir verwendeten den murinen Antikörper TA-2 (ein murines IgG1 anti-Ratten-alpha4-Integrin, erworben von PharMingen (San Diego)), der die VLA-4/alpha4beta7-vermittelte Leukocytenadhäsion blockiert. Die verwendete Dosis war 2,5 mg/kg, von der gefunden wurde, dass sie in akuten Studien wirksam ist, und sie wurde i.p. an jedem zweiten Tag verabreicht. In dieser Studie erhielten 24 Ratten NTS, und 12 wurde zwischen den Tagen 5 und 13 TA-2-Kontroll-mAk gegeben. Die anderen 12 erhielten TA-2 oder den Kontroll-mAk zwischen den Tagen 13 und 21. Alle Ratten wurden am Tag 30 getötet. Auffallenderweise wurde die Albuminurie während der Zeiträume der TA-2-Verabreichung signifikant reduziert, obwohl sich die Gruppen nach Beendigung der Antikörper-Behandlung annäherten. Histologische Verletzungswerte legten eine niedrigere glomeruläre Vernarbung in den 13-21 Tage TA-2-behandelten Ratten im Vergleich zu den Kontrollen nahe (p=0,06). Es gab Trends zu niedrigerem Serum-Kreatinin und höherer CrCl in TA-2-Empfängern.
Auf diese CRF-Studie schlossen wir eine längere an, die auf die Untersuchung des Überlebens und eine spätere Histologie hinzielte, da die CrCl-Kurven am Tag 30 zu divergieren schienen. Wie beim Beispiel 2 wurden 24 Ratten i.v. mit NTS induziert, und 4 wurden am Tag 14 getötet, um eine Grundlinien-Histologie zu liefern. Der anti-alpha4-Antikörper TA-2 wurde an 10 Ratten zwischen den Tagen 14 und 24 verabreicht, und zehn Ratten erhielten einen Isotyp-passenden Kontroll-Antikörper (1E6-anti-menschliches LFA3-IgG1-Antikörper, erhalten von Biogen, Inc.). Fünf Ratten von jeder Gruppe wurden am Tag 35 für eine Histologie getötet, und die verbleibenden traten in eine Überlebens-Studie, wie vorher beschrieben, ein.
Das Überleben war in Ratten, die TA-2 erhielten, signifikant besser (mittleres Überleben 68 gegenüber 49 Tage, log-Rang p=0,01) als in Kontrollen (4). Die Proteinurie war in TA-2-Empfängern vom Tag 35 an größer (vielleicht ein Marker einer besser erhaltenen glomerulären Filtrationsrate), und die CrCl war in diesen Ratten besser erhalten als in Kontrollen (p<0,05 am Tag 35). Die interstitiellen Vernarbungswerte waren in Ratten, die anti-alpha4-mAk erhielten, signifikant weniger als in Kontrollratten (p<0,05), und kleinere Unterschiede wurden in der glomerulären Vernarbung und der Expression des glomerulären alpha-Actins der glatten Muskulatur beobachtet, wenn geeignet gefärbte Schnitte mit der Computer-Bildanalyse-Software bewertet wurden. Unter Verwendung ähnlicher Techniken war auch der Grad der kortikalen ED(A)-Fibronectin-Ablagerung in den anti-alpha4-mAk-Empfängern reduziert, obwohl in der kortikalen Typ M-Kollagen-Ablagerung zwischen den zwei Gruppen keine Unterschiede gesehen wurden. Glomeruläre Leukocyten-Zahlen waren in den anti-alpha4-Empfängern signifikant größer, wahrscheinlich reflektierten sie eine schlimmere Vernarbung in den Kontrollratten (die Daten sind hier nicht dargelegt).

Claims

Verwendung eines Integrin-antagonistischen Anti-VLA4-Antikörpers oder eines Fragments davon, das an ein Integrin bindet, welches eine alpha4-Untereinheit enthält, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugers mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Anti-VLA4-Antikörper ein IgG-Immunglobulin ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Anti-VLA4-Antikörper ein monoclonaler Antikörper, ein humanisierter monoclonaler Antikörper, ein menschlicher monoclonaler Antikörper oder ein chimärer Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Fragment ein Fab-, Fab'-, F(ab')2-, oder ein Fv-Fragment ist.
Verwendung eines Integrin-antagonistischen Anti-VLA4-Antikörpers oder eines Fragments davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein Teil des Antikörpers codiert wird durch (a) eine Nucleinsäuresequenz, umfassend eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäuresequenz hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen: – gatggtgact ctatctccta cagatgcaga cagtgagga; – ctgtaggaga tagagtcacc atcacttgca ag; – aggagctttt ccaggtgtct gttggtacca agccatata; – accaacagac acctggaaaa gctcctaggc tgctcataca t; – gcaggctgct gatggtgaaa gtataatctc tcccagaccc; – actttcacca tcagcagcct gcagcctgaa gatattgcaa ct; – ccgaggatcc actcacgttt gatttccacc ttggtgcctt gaccgaacgt ccacagatt; – ggaaaagctc ctaggctgct catatattac aca; – ccgaggatcc actcacgttt gatttccacc tttgtgcc; – aacccagtgt atataggtgt ctttaatgtt gaaaccgcta gctttacagc t; – aaagacacct atatacactg ggttagacag gcccctggcc aaaggctgga gtggatggga aggattg; – gacccggccc tggaacttcg ggtcat; – gacccgaagt tccagggccg ggtcaccatc accgcagaca cctctgccag caccgcctac atggaa; – ccatagcata gaccccgtag ttaccataat atccctctct ggcgcagtag tagactgcag tgtc; – ggtaactacg gggtctatgc tatggactac tggggtcaag gaacccttgt caccgtctcc tca; – ccagggccgg gtcaccatca ccagagacac ctctgcc; – caggcccctg gccaagggct ggagtgg; – tacgcaaacc gcctctc; – gagtgcacca tatgcggt; oder dem Komplementär der Nucleinsäuresequenzen; oder (b) eine Nucleinsäuresequenz, umfassend eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäuresequenz hybridisiert, welche eine Polypeptidsequenz codiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (i) Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Trp Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser; (ii) Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile; und (iii) einer variablen Domäne des Antikörpers, hergestellt mit der Zelllinie ATCC CRL 11175.
Verwendung eines Integrin-antagonistischen Anti-VLA4-Antikörpers oder eines Fragments davon nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugers mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen, wobei der Antikörper umfasst: (a) eine humanisierte leichte Kette umfassend drei Komplementarität bestimmende Regionen mit Aminosäuresequenzen aus den entsprechenden Komplementarität bestimmenden Regionen einer leichten Kette des Maus-21-6-Immunglobulins, und eine variable Rahmenregion einer variablen Rahmenregion der Sequenz einer menschlichen leichten Kappa-Kette, mit der Ausnahme, dass in mindestens einer Aminosäureposition die Aminosäure durch die gleiche Aminosäure besetzt ist, die in der äquivalenten Position der variablen Rahmenregion der leichten Kette des Maus-21-6-Immunglobulins gegenwärtig ist; und (b) eine humanisierte schwere Kette, umfassend drei Komplementarität bestimmende Regionen mit Aminosäuresequenzen aus den entsprechenden Komplementarität bestimmenden Regionen einer schweren Kette des Maus-21-6-Immunglobulins, und eine variable Rahmenregion einer variablen Rahmenregion der Sequenz einer menschlichen schweren Kette, mit der Ausnahme, dass in mindestens einer Aminosäureposition die Position durch die gleiche Aminosäure besetzt ist, die in der äquivalenten Position der variablen Rahmenregion der schweren Kette des Maus-21-6-Immunglobulin ist.
Verwendung eines Integrin-antagonistischen Anti-VLA4-Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Säugers mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen, wobei der Antikörper der humanisierte Antikörper AN 100226 ist.
Verwendung von zwei oder mehr Integrin-Antagonisten, wobei mindestens zwei der Antagonisten einen ersten Integrin-Antagonisten einschließen, welcher der Wechselwirkung zwischen einer alpha4-enthaltenden Untereinheit und ihrem dazugehörigen Liganden oder Rezeptor entgegenwirkt, und einen zweiten Integrin-Antagonisten, welcher der Wechselwirkung zwischen einer anderen alpha-enthaltenden Untereinheit, welches nicht alpha4 ist, entgegenwirkt, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Säugern mit chronischem Nierenversagen oder mit einem Risiko von chronischem Nierenversagen, wobei die ersten und zweiten Integrin-Antagonisten Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon sind, welche ein Integrin binden, das eine alpha4-Untereinheit enthält.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der erste Integrin-Antagonist ein humanisierter Antikörper ist, wobei die humanisierte leichte und schwere Kette jeweils drei Komplementarität bestimmende Regionen eines Maus-21-6-Immunglobulins umfassen, wobei ein Teil davon durch eine Nucleinsäuresequenz codiert wird, umfassend eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäuresequenz hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen: – gatggtgact ctatctccta cagatgcaga cagtgagga; – ctgtaggaga tagagtcacc atcacttgca ag; – aggagctttt ccaggtgtct gttggtacca agccatata; – accaacagac acctggaaaa gctcctaggc tgctcataca t; – gcaggctgct gatggtgaaa gtataatctc tcccagaccc; – actttcacca tcagcagcct gcagcctgaa gatattgcaa ct; – ccgaggatcc actcacgttt gatttccacc ttggtgcctt gaccgaacgt ccacagatt; – ggaaaagctc ctaggctgct catatattac aca; – ccgaggatcc actcacgttt gatttccacc tttgtgcc; – aacccagtgt atataggtgt ctttaatgtt gaaaccgcta gctttacagc t; – aaagacacct atatacactg ggttagacag gcccctggcc aaaggctgga gtggatggga aggattg; – gacccggccc tggaacttcg ggtcat; – gacccgaagt tccagggceg ggtcaccatc accgcagaca cctctgccag caccgcctac atggaa; – ccatagcata gaccccgtag ttaccataat atccctctct ggcgcagtag tagactgcag tgtc; – ggtaactacg gggtctatgc tatggactac tggggtcaag gaacccttgt caccgtctcc tca; – ccagggccgg gtcaccatca ccagagacac ctctgcc; – caggcccctg gccaagggct ggagtgg; – tacgcaaacc gcctctc; – gagtgcacca tatgcggt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei der erste Integrin-Antagonist ein humanisierter Antikörper ist oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, das an ein Integrin bindet, welches eine alpha4-Untereinheit enthält, wobei ein Teil des Antikörper-Homologs durch eine Nucleinsäuresequenz codiert wird, umfassend eine Nucleinsäure, die mit einer Nucleinsäuresequenz hybridisiert, die eine Polypeptidsequenz codiert, ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus: (a) Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Val Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Trp Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Gly Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Ihr Val Ser Ser; (b) Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile; und (c) einer variablen Domäne des Antikörpers, hergestellt mit der Zelllinie ATCC CRL 11175.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der Säuger unter einem Zustand leidet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus chronischem Nierenversagen, Nierenkrankheit im Endstadium, chronischer diabetischer Nephropathie, diabetischer Glomerulopathie, diabetischer Nierenhypertrophie, hypertensiver Nephrosklerose, hypertensiver Glomerulosklerose, chronischer Glomerulonephritis, erblich-bedingter Nephritis und Nierendysplasie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Säuger menschlich ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Zusammensetzung geeignet ist, parenteral, intravenös, subkutan, intramuskulär, intraperitoneal oder über einen intrakapsulären Weg über die Niere verabreicht zu werden.